ES2270141T3 - Polisacarido de echinacea angustifolia. - Google Patents

Polisacarido de echinacea angustifolia. Download PDF

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ES2270141T3 ES03783988T ES03783988T ES2270141T3 ES 2270141 T3 ES2270141 T3 ES 2270141T3 ES 03783988 T ES03783988 T ES 03783988T ES 03783988 T ES03783988 T ES 03783988T ES 2270141 T3 ES2270141 T3 ES 2270141T3
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Abstract

Polisacárido de las raíces de Echinacea angustifolia que tiene un peso molecular de 1, 3 x 105 Da y que consta de ramnosa, arabinosa, galactosa y ácido galacturónico en una proporción de 0, 5:2, 5:1, 75:10, 25.

Description

Polisacárido de Echinacea angustifolia.
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de los polisacáridos, en particular, a un polisacárido de Echinacea angustifolia y a un procedimiento para la preparación del mismo. El polisacárido se puede usar en el tratamiento de estados patológicos en los que es deseable fortalecer las defensas inmunes.
Antecedentes de la invención
Echinacea es una planta originaria de Norteamérica y Méjico; sus propiedades terapéuticas eran bien conocidas por los nativos americanos, que la usaban para curar heridas. Debido al hecho de que se consideró que Echinacea era capaz de aumentar la resistencia a infecciones, durante los primeros años del pasado siglo llegó a extenderse su uso en el tratamiento de infecciones locales y generalizadas. Actualmente Echinacea, en particular, Echinacea angustifolia esta altamente recomendada para el tratamiento de los síndromes de la gripe y en particular para el tratamiento del resfriado, para curar heridas y para el tratamiento de la micosis.
La acción general se debe aparentemente a la estimulación específica del sistema inmune y a la sensibilización de gérmenes y patógenos a agentes quimioterapéuticos y antibióticos. Las propiedades cicatrizantes parecen atribuibles a la capacidad de estabilizar ácidos hialurónicos por inhibición de la hialuronidasa ejercida por uno de los principios activos contenidos en la planta, es decir, equinacósido, y a la activación masiva de los macrófagos inducida por los polisacáridos. De esta manera cualquier foco de infección se mantiene localizado y se favorece la acumulación de mucopolisacáridos y material histoplástico necesario para los procesos de reparación.
Una gran parte de los polisacáridos de Echinacea constan de inulina, que no puede considerarse responsable de las propiedades citadas anteriormente.
El documento DE-A-32 17 214 describe polisacáridos de Echinacea purpurea y angustifolia que tienen propiedades inmunoestimulantes y actividad anti-inflamatoria. Estos polisacáridos tienen un peso molecular que varía de 35.000 a 500.000 y contienen como componente principal un ramnoarabinogalactano que comprende ramnosa, arabinosa, xilosa, manosa, galactosa, glucosa y ácido glucurónico en una proporción molar de 0,6-1,0:0,4-0,8:0,1-0,4:0,0-0,2:0,8-1,2:0,1-0,5:0,4-0,8, un heteroxilano que comprende ramnosa, arabinosa, xilosa, galactosa, glucosa y ácido 4-O-metil-glucurónico en una proporción molar de 0,2-0,4:0,8-1,2:4,5-5,3-0,7-1,1:0,2-0,6:0,7-1,1 y un arabinogalactano que comprende ramnosa, arabinosa, xilosa, galactosa y ácido glucurónico en una proporción molar de 0,0-0,2:0,8-1,2:0,0-0,2:0,9-1,3:0,3-0,6.
Descripción detallada de la invención
El objeto de la presente invención es un polisacárido de las raíces de Echinacea angustifolia (de aquí en adelante mencionado como "el polisacárido"), que tiene un peso molecular de 1,3 x 10^{5} Da y que consta de ramnosa, arabinosa, galactosa y ácido galacturónico en una proporción de 0,5:2,5:1,75:10,25. El polisacárido de la invención se puede usar en el tratamiento de estados patológicos en los que es deseable fortalecer las defensas inmunes. En el esqueleto del polisacárido, alternan partes lineales y ramificadas, constando las partes lineales de restos de ácido galacturónico parcialmente acetilado (9%) y metilado (35%) unidos por un enlace \alpha-(1-4) y constando las partes ramificadas de una alternancia de ácido galacturónico y ramnosa, a las que están unidas cadenas laterales que contienen arabinosa y galactosa en una proporción de 2,5:1,75. El polisacárido está caracterizado por los espectros ^{1}H-RMN, ^{13}C-RMN y el perfil GPC presentados en las figuras 1-3.
El polisacárido se recupera de las raíces de Echinacea angustifolia espontánea o cultivada por medio de un procedimiento que comprende las siguientes etapas:
a) retirar los componentes no polisacáridos de los raíces por extracción con disolvente;
b) extraer la fracción de polisacáridos de las raíces obtenida directamente en la etapa precedente;
c) aislar el polisacárido por cromatografía de la fracción de polisacáridos.
El propósito de la etapa a) es retirar los componente no polisacáridos de las raíces, principalmente equinacósido y análogos del mismo, así como el gran grupo de alquilamidas que son también componentes característicos de Echinacea angustifolia (R. Bauer y col., Phytochemistry 28, 505, 1989; Planta Med. 55, 367, 1989). Por consiguiente, las raíces se extraen con un disolvente seleccionado entre acetona o un alcohol de uno a tres átomos de carbono, opcionalmente en mezcla con agua, a una temperatura q1ue varía de 20ºC a la temperatura de ebullición, preferiblemente en reflujo. El contenido en agua del disolvente no debe exceder el 40% (v/v). El disolvente preferido es etanol a una concentración entre el 80 y el 95% (v/v).
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El propósito de la etapa b) es extraer la mezcla de los componentes polisacáridos de las raíces. La extracción se realiza con agua, acetona o un alcohol de uno a tres átomos de carbono, en mezcla con agua, a una temperatura que varía de 20ºC a la temperatura de ebullición del disolvente, preferiblemente de 40 a 70ºC. Cuando se usan mezclas de disolventes, el contenido en agua será del 60% o superior, preferiblemente del 85% (v/v). De acuerdo con una realización preferida de la invención, el disolvente es etanol al 15% (v/v).
La etapa c) proporciona el fraccionamiento del extracto de la etapa b) y la separación del polisacárido de otros componentes polares del extracto. Esta etapa consta preferiblemente de cromatografía por exclusión de tamaño o cromatografía de intercambio iónico.
En el primer caso, el polisacárido se purifica en base a sus dimensiones moleculares: de hecho, el polisacárido tiene una masa característica, que es diferente de la de todos los demás componentes. Una resina reticulada adecuadamente puede separar especies químicas que tienen dimensiones diferentes; el procesamiento el extracto de la etapa b) a través de una resina de este tipo (por ejemplo, Toyopearl HW-65S y Superdex®200HR) permite purificar el polisacárido de la invención.
La purificación del polisacárido por cromatografía de intercambio iónico se basa en el carácter ácido del polisacárido, debido a la presencia de funciones carboxi en las unidades de ácido galacturónico. El procesamiento del extracto de la etapa b) a través de una resina de intercambio aniónico permite retener sólo el polisacárido y cualquier otro componente ácido (que esté presente en cantidades pequeñas) y retirar todos los componentes neutros y básicos. La resina se lava con una solución acuosa salina ó ácida para recuperar las moléculas atrapadas por la resina. Las sales o ácidos de la solución purificada se retiran después por medio de diálisis de ultrafiltración. Se selecciona un límite suficientemente alto (por ejemplo, 10.000 o 100.000 Da) para retirar también las impurezas ácidas del extracto de partida y retenidas por la resina aniónica.
Las resinas de intercambio aniónico preferidas son resinas de intercambio iónico fuertes, tales como Diaion HPA 25 y Q Sepharose®Fast Flow.
La solución purificada de polisacárido obtenida de acuerdo con uno de los procedimientos cromatográficos descritos en la etapa c) se concentra después y se seca al vacío o se seca por congelación. El polisacárido es un polvo de color marfil.
La etapa c) también puede comprender etapas de purificación preliminares, útiles para hacer la cromatografía más fácil. Aunque no son indispensables, estas etapas permiten retirar una primera alícuota de impurezas del extracto de la etapa b) y reducir la cantidad de resina.
Los tratamientos preliminares se seleccionan entre:
c1) concentración del extracto de la etapa b) a presión reducida y posterior purificación por tratamiento con una mezcla de agua y acetona o agua y un alcohol de uno a tres átomos de carbono, preferiblemente etanol. La mezcla contendrá el 50-70%, preferiblemente el 66,5% de alcohol o acetona. De acuerdo con una realización preferida de la invención, el residuo resultante de la concentración del extracto se disuelve a temperatura ambiente con tres partes de agua y se diluye en agitación con 7 volúmenes de etanol al 95%. La fracción precipitada, que contiene el polisacárido, se recoge por filtración, se lava con etanol a una concentración del 50 al 70% y se somete a purificación cromatográfica.
c2) tratamiento de la fracción de polisacárido de la etapa b), o de la fracción enriquecida de la etapa 1c), con agua a temperatura ambiente. De esta manera, el polisacárido de la invención, que es altamente soluble en agua, se separa de otros polisacáridos moderadamente solubles. El extracto resultante de la etapa b) (o la fracción enriquecida en polisacáridos de la etapa c1)) se suspende en agua a temperatura ambiente y se agita para promover la disolución. El residuo insoluble se separa y la solución acuosa se somete a cromatografía.
c3) tratamiento enzimático, útil para hidrolizar oligosacáridos y polisacáridos tipo inulina, que representan una de las principales impurezas del extracto de la etapa b). Se trata el extracto (o uno de los productos parcialmente purificados de las etapas c1) o c2)), en solución acuosa, con una cantidad catalítica de inulinasa durante 10-24 horas. La enzima se inactiva después con calor o tripsina y los fragmentos de carbohidrato formados después de la hidrólisis se retiran por diálisis (ultrafiltración tangencial con límite mayor de 10.000 Da, preferiblemente 100.000 Da). El producto retenido obtenido de este modo se somete después a cromatografía.
c4) ultrafiltración de límite alto (límite mayor de 10.000 Da, preferiblemente 100.000 Da) para retirar impurezas de bajo peso molecular. En este caso, el extracto de la etapa b) (o uno de los productos parcialmente purificados de las etapas c1) o c2)) se disuelve en agua, preferiblemente en 10 ó 20 volúmenes, y se dializa. El producto retenido, que contiene el polisacárido de la invención, se somete después a cromatografía.
El polisacárido de la invención mostró propiedades inmunoestimulantes en ratones, en particular, demostró ser capaz de estimular la activación de los linfocitos T y contrarrestar el efecto de la ciclosporina A, reduciendo de este modo la mortalidad debida a infección por Candida albicans. El polisacárido de la invención puede usarse, por lo tanto, para la preparación de medicamentos, suplementos alimenticios o composiciones nutraceúticas para administrarse en situaciones en las que es deseable un aumento de las defensas corporales del sistema inmune.
El polisacárido puede formularse de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo, de acuerdo con las descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook, XVII ed. Mack Pub., N.Y., U.S.A.
La presente invención se ilustra a continuación por medio de algunos ejemplos.
Ejemplos
En todos los ejemplos siguientes, la determinación del título HPLC del polisacárido se realiza con una columna TosoHaas TSK-Gel G 5000 PWXL eluida con agua que contiene un 0,5% de trietilamina en condiciones isocráticas a un caudal de 0,5 ml/min. Durante el análisis, que dura 30 minutos, la columna se mantiene a 50ºC. El volumen de inyección es 50 \mul. Se acopla a la columna un detector de evaporación ELSD (Detector de Dispersión de Luz por Evaporación) Sedex mod. 75 (S. E. D. E. R. E.) - cuyo nebulizador se mantiene a 60ºC con una presión del gas de 2,2 bares.
Ejemplo 1 Extracción de raíces de Echinacea angustifolia (etapas a) y b))
Se extraen 600 gramos de raíces molidas de Echinacea angustifolia a reflujo durante cuatro horas con 2,5 l de etanol al 90% (v/v). El percolado se recoge y se realizan siete extracciones adicionales con el mismo disolvente (etapa a)). El extracto resultante se desecha. Las raíces se extraen después siete veces a 70ºC con etanol al 15% (v/v), durando cada extracción cuatro horas. Los percolados combinados se filtran y se concentran al vacío, proporcionando 170 g de residuo marrón (extracto de polisacáridos completo, etapa b)).
Ejemplo 2 Recuperación del polisacárido por pre-purificación con disolventes y cromatografía de intercambio aniónico
Se disuelven 170 g del extracto de polisacáridos completo de la etapa b) del ejemplo 1 en 570 ml de agua y después se añaden 1,13 l de etanol. La mezcla se agita durante aproximadamente una hora, el precipitado se decanta durante aproximadamente 20 minutos, se filtra, se lava son 850 ml de etanol al 66,5% (v/v) y se seca a 55ºC al vacío durante 48 horas, proporcionando 140 g de un sólido de color avellana. El sólido se recoge con 2,1 l de agua y la suspensión resultante se deja en agitación durante 20 minutos, después se separa del residuo insoluble (que se desecha).
La solución acuosa, enriquecida en el polisacárido de la invención, da un residuo seco de 38,7 g. La solución se carga en una columna cromatográfica que contiene 0,9 l de resina Diaion HPA 25 acondicionada con tampón AcOH/AcNH_{4} a pH 6,1. La resina se lava con 5,4 l de solución de tampón AcOH/AcNH_{4} a pH 6,1 y la fracción que contiene el polisacárido se eluye con 5,4 l de una solución acuosa de AcNH_{4} 0,5 M. El eluido se concentra a 0,3 l a presión reducida. La solución concentrada se somete a diálisis por ultrafiltración tangencial con 6 l de agua purificada, usando una membrana enrollada en espiral con un límite de 10.000 Da en polietersulfona.
El producto retenido se recupera y se concentra en presión reducida y el residuo se seca por calor al vacío, proporcionando 7,1 g de un polvo de color marfil (título HPLC del polisacárido: 96%).
El polisacárido tiene un peso molecular promedio de 1,3 x 10^{5} Da (s=5365), con <Mn 14320 (s=2180), que es coherente con una determinación por medio de LALLS (Dispersión de Luz Láser de Ángulo Bajo) y consta de ácido galacturónico, galactosa, arabinosa y ramnosa en proporción 10,25:1,75:2,5:0,5 (análisis HPAEC). El polisacárido tiene espectros ^{1}H-RMN, ^{13}C-RMN y un perfil GPC característicos, presentados en las figuras 1-3 respectivamente.
Ejemplo 3 Recuperación del polisacárido por pre-purificación de ultrafiltración y cromatografía por exclusión de tamaño
Se disuelven 170 g del extracto de polisacáridos completo de la etapa b) del ejemplo 1 en 850 ml de agua purificada. Esta solución de dializa por ultrafiltración tangencial con 10 l de agua purificada, usando una membrana enrollada en espiral con un límite de 50.000 Da en polietersulfona.
El producto retenido, que contiene 110,5 g de extracto purificado, se recupera y se carga en una columna cromatográfica mantenida a presión media y que contiene 22 l de resina Toyopearl HW-65S acondicionada con agua. La elución se realiza con agua purificada, dividiendo los eluidos en fracciones de 200 ml cada una. Se analiza el GPC de las fracciones y se combinan las que contienen polisacárido suficientemente puro.
Las fracciones combinadas se concentran después a presión reducida y el residuo se seca por calor al vacío, proporcionando 5,7 g de polvo de color marfil (título HPLC del polisacárido: 95%).
Ejemplo 4 Recuperación del polisacárido por pre-purificación enzimática y cromatografía de intercambio aniónico
Se disuelven 170 g del extracto de polisacáridos completo de la etapa b) del ejemplo 1 en 3230 ml de agua purificada y se añaden 850 mg de enzima inulinasa. La mezcla se deja en agitación suave a 40ºC durante 24 horas, después se inactiva la enzima con 80 mg de tripsina, agitando durante 2 horas a 36ºC. La solución se calienta a 85ºC durante 2 horas y se concentra a presión reducida a 1,7 l.
La solución concentrada se somete a diálisis por ultrafiltración tangencial con 17 l de agua purificada, usando una membrana enrollada en espiral con un límite de 100.000 Da en polietersulfona. El producto retenido (que contiene 11,5 g de extracto purificado) se recupera y se carga en una columna cromatográfica que contiene 0,8 l de resina Diaion HPA 25 acondicionada con tampón AcOH/AcNH_{4} a pH 6,1. La resina se lava con 4,8 l de solución de tampón AcOH/AcNH_{4} a pH 6,1, y la fracción que contiene el polisacárido se eluye con 4,8 l de una solución acuosa de AcNH_{4} 0,5 M. El eluido se concentra a 150 ml en presión reducida y el concentrado se dializa por ultrafiltración tangencial con 1,5 l de agua purificada, usando una membrana enrollada en espiral con un límite de 50.000 Da en polietersulfona.
El producto retenido se concentra a presión reducida y el residuo se seca por calor al vacío, obteniendo 6,9 g de polvo de color marfil (título HPLC del polisacárido: 97%).
Parte biológica
Experimento 1
Análisis para la producción de interferón-\gamma en linfocitos T (Zucca M. y col, New Microbiol. 1996, 19, 39-46)
Se cultivaron linfocitos T murinos obtenidos por separación de esplenocitos en columna de nylon-lana, en medio 1640 RPMI con suero fetal de ternera al 4% en placas de microtitulación opcionalmente pre-incubadas con \alpha-CD3 (anticuerpo monoclonal anti-CD3 como activador de la función celular responsable de la producción de interferón). Las sustancias a ensayar se añadieron a los pocillos y después de 48 horas se evaluó el interferón-\gamma liberado en el medio de incubación.
TABLA 1
Tratamiento Interferón-\gamma pg/ml
Medio 4,5 \pm 0.5
\alpha-CD3 149,5 \pm 25,0
\alpha-CD3 + Polisacárido 0,1 \mug/ml 410,0 \pm 45,7
\alpha-CD3 + Polisacárido 1,0 \mug/ml 466,3 \pm 71,8
\alpha-CD3 + Polisacárido 10,0 \mug/ml 690,5 \pm 95,5
Experimento 2
Efecto sobre la mortalidad inducida por Candida albicans en ratones (Microbiology, 2000, 146,1881-9)
Se cultivaron levaduras en medio agarizado de Sabouraud y se inocularon por vía intravenosa a una concentración de 2,9 x 10^{5} en ratones inmuno-deprimidos con 1 mg/kg ip de ciclosporina A (CsA). Los ratones se trataron diariamente con 5 y 10 mg/kg i. p. del polisacárido de la invención hasta la muerte de todos los ratones control (no tratados). Los resultados se evaluaron como animales supervivientes en los grupos tratados.
TABLA 2
Tratamiento % de Animales supervivientes
Candida albicans (CA) + CsA 0
CA + CsA + polisacárido 5 mg/kg 30
CA + CsA + polisacárido 10 mg/kg 50

Claims (21)

1. Polisacárido de las raíces de Echinacea angustifolia que tiene un peso molecular de 1,3 x 10^{5} Da y que consta de ramnosa, arabinosa, galactosa y ácido galacturónico en una proporción de 0,5:2,5:1,75:10,25.
2. Polisacárido de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado por un esqueleto con partes lineales y ramificadas alternas, constando las partes lineales de restos de ácido galacturónico parcialmente acetilado y metilado unidos por un enlace \alpha-(1-4) y constando las partes ramificadas de una alternancia de ácido galacturónico y ramnosa, a las que están unidas cadenas laterales que contienen arabinosa y galactosa en una proporción 2,5:1,75.
3. Un procedimiento para la preparación del polisacárido de las reivindicaciones 1 ó 2, que comprende las siguientes etapas:
a) retirar los componentes no polisacáridos de las raíces por extracción con disolvente;
b) extraer con disolvente la fracción de polisacáridos de las raíces obtenidas directamente de la etapa precedente;
c) aislar el polisacárido por cromatografía de la fracción de polisacáridos.
4. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el disolvente usado en la etapa a) es acetona o alcohol de uno a tres átomos de carbono.
5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el disolvente está mezclado con agua.
6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el contenido en agua del disolvente no es mayor del 40%.
7. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en el que el disolvente es etanol con una concentración que varía del 80 al 95%.
8. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en el que la temperatura de extracción varía de 20ºC a la temperatura de ebullición del solvente.
9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el disolvente usado en la etapa b) es agua o una mezcla de agua y acetona o agua y alcohol de uno a tres átomos de carbono.
10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el contenido en agua de la mezcla de disolvente es del 60% o mayor.
11. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, en el que el disolvente es etanol al 15%.
12. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en el que la extracción se realiza a una temperatura que varía de 20ºC a la temperatura de ebullición del disolvente.
13. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la cromatografía de la etapa c) es una cromatografía por exclusión de tamaño o una cromatografía de intercambio iónico.
14. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3 en el que, antes de la cromatografía de la etapa c), la fracción de polisacárido de la etapa b) se somete a uno o más tratamientos de purificación preliminares.
15. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que los tratamientos de purificación preliminares se seleccionan entre:
c1) precipitación y aislamiento de una fracción enriquecida en polisacáridos por disolución en una mezcla de agua y acetona al 50-70% o agua y un alcohol de uno a tres átomos de carbono al 50-70%;
c2) retirada de la fracción de polisacáridos insoluble por tratamiento con agua;
c3) tratamiento con inulinasa;
c4) ultrafiltración con un límite de 10.000 Da o mayor.
16. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, en el que se realizan los tratamientos de purificación preliminares c1) y c2).
17. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, en el que se realiza el tratamiento de purificación preliminar c3), opcionalmente precedido de uno o los dos tratamientos de purificación c1) y c2).
18. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, en el que se realiza el tratamiento de purificación preliminar c4), opcionalmente precedido de uno o los dos tratamientos c1) y c2).
19. Polisacárido de Echinacea angustifolia obtenible con el procedimiento de una cualquiera las reivindicaciones 3-18.
20. Polisacárido de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 19 para su uso como medicamento.
21. Composiciones farmacéuticas y nutracéuticas y suplementos alimenticios que contienen el polisacárido de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 19.
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