ES2240973T3 - Desbloqueo de la ruta comun de sintesis de aminoacidos aromaticos. - Google Patents

Abstract

LA EFICACIA MEJORADA DE PRODUCCION DE COMPUESTOS AROMATICOS A TRAVES DE LA TRAYECTORIA COMUN, COMO SE MUESTRA EN LA FIGURA 1, DE UNA CELULA HUESPED SE LLEVA A CABO MEDIANTE EL AUMENTO DE LA EXPRESION DE ESPECIES DE ENZIMA QUE ACTUAN SOBRE INTERMEDIARIOS DE SUSTRATO EN PASOS DE REACCION CON LIMITE DE VELOCIDAD IDENTIFICADOS EN LA TRAYECTORIA. SE DESCRIBEN TRANSFORMANTES DE CELULAS PROCARIOTICAS QUE COMPRENDEN SECUENCIAS DE ADN EXOGENOS QUE CODIFICAN LAS ESPECIES DE ENZIMAS, SINTASA 3-DEHIDROQUINATO, QUINASA SHIKIMATE, SINTASA 5-ENOLPYRUVOYLO-SHIKIMATE-3-FOSFATO Y SINTASA DE CLORISMATO. ESTOS TRANSFORMANTES PUEDEN ADEMAS SER TRANSFORMADOS CON SECUENCIAS DE ADN EXOGENAS QUE CODIFICAN LAS ESPECIES DE ENZIMAS SINTASA TRANSQUETOLASA Y DAHP. EN UNA REALIZACION DE LA PRESENTE INVENCION, SE INCORPORAN UNA O MAS SECUENCIAS DE ADN QUE CODIFICAN LAS ESPECIES DE ENZIMAS AL GENOMA DEL TRANSFORMANTE.

Description

Desbloqueo de la ruta común de síntesis de aminoácidos aromáticos.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a la mejora de la eficacia de reacciones biosintéticas. Más particularmente, esta invención se dirige a un procedimiento para aumentar la biosíntesis de compuestos aromáticos en la ruta común en una célula huésped, mediante ingeniería genética de la célula huésped para eliminar eficazmente las etapas limitantes de la velocidad de la ruta.

Antecedentes y sumario de la invención

La ruta común de biosíntesis de aminoácidos aromáticos, conocida también como la ruta del siquimato, produce los aminoácidos aromáticos fenilalanina, tirosina y triptófano en bacterias y plantas. La ruta de los aminoácidos aromáticos consiste en una ruta común que finaliza en el punto de ramificación de la molécula de corismato, que posteriormente es convertida en fenilalanina, tirosina y triptófano por tres rutas terminales separadas. Los aminoácidos aromáticos son complementos esenciales en la alimentación de los seres humanos y animales que no tienen la capacidad de sintetizar estos compuestos. También son precursores para muchas moléculas interesantes y comercialmente importantes tales como el aspartamo, un edulcorante sintético, índigo, un colorante habitual y L-DOPA, un fármaco usado para combatir los efectos de la enfermedad de Parkinson, por nombrar algunos.

El éxito de cualquier ruta biocatalítica para producir en exceso los aminoácidos aromáticos o sus derivados a partir de una fuente de carbono fácilmente disponible tal como glucosa u otros azúcares, depende de la capacidad de dirigir una carga de carbono a lo largo de la ruta del organismo huésped. Los bloqueos que se encuentran en la ruta pueden afectar al posterior rendimiento y pureza de los productos producidos por la conversión biocatalítica.

Los primeros enfoques para aumentar la eficacia de la producción de la ruta común de la biosíntesis aromática se han descrito en la patente US nº 5.186.056, expedida el 1 de diciembre, 1992, en la solicitud US serie nº 07/652.933, presentada el 8 de febrero, 1991. Esta patente describe una invención relacionada dirigida a aumentar el flujo de carbono en la ruta aumentando la actividad catalítica in vivo de la 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato sintasa y la transcetolasa. Aunque la patente mencionada enseña el aumento del flujo de carbono en la ruta común, se ha encontrado que el mayor flujo de carbono dirigido a la ruta común se pierde si hay una o más enzimas de la ruta que no pueden catalizar la conversión de los sustratos intermedios en productos a velocidades comparables a la velocidad a la que son producidos esos sustratos intermedios. Por lo tanto, en la ruta biosintética hay algunas etapas limitantes de la velocidad que trabajan para impedir el avance de las etapas de reacción a lo largo de la ruta. La presente invención elimina estos impedimentos.

El análisis de los líquidos sobrenadantes de los cultivos de la cepa de Escherichia coli D2704 (pheA-, tyrA-, \DeltatrpE-C) usando espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) ha identificado a la 3-deshidroquinato sintasa, siquimato quinasa, 5-enolpiruvoilsiquimato-3-fosfato sintasa y corismato sintasa como enzimas limitantes de la velocidad en la ruta común de la biosíntesis de aminoácidos aromáticos. La transformación de la cepa de Escherichia coli D2704 con secuencias de ADN exógeno que codifican las especies enzimáticas de la ruta común 3-deshidroquinato sintasa (aroB), siquimato quinasa (aroL), 5-enolpiruvoilsiquimato-3-fosfato sintasa (aroA) y corismato sintasa (aroC) da como resultado un aumento significativo de la producción del producto final.

Dell K.A. y Frost J.W. (J. Am. Chem. Soc., Vol 115, 1 dic. 1993, páginas 11581-11589) describen un procedimiento biocatalítico para obtener aminoácidos aromáticos aumentando el flujo de la fuente de carbono usando una célula procariota transformada, la cepa D2704. El documento EP-A-0190921 (Engenics Inc.) describe un procedimiento para sobreexpresar un aminoácido en un microorganismo alterando su ADN cromosómico.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 ilustra la ruta común de la biosíntesis de los aminoácidos aromáticos.

La Fig. 2 presenta mapas de los plásmidos pKD130A y pKD136.

Las Figs. 3a y 3b son gráficos de barras que representan la concentración de los productos intermedios de la ruta común de las cepas D2704 de E. coli y las concentraciones medias de fenilalanina y ácido fenil-láctico para estas cepas.

La Fig. 4 ilustra la construcción del plásmido pKD28 a partir de los plásmidos pIA321 y pSU18.

La Fig. 5 es similar a la Fig. 4 y muestra la construcción del plásmido pKAD31.

Las Figs. 6a y 6b ilustran la preparación del plásmido con aroEaroL pKAD34.

Las Figs. 7-13 son similares a las Figs. 4-7 y muestran la construcción de los plásmidos pKAD38, pKAD43, pKAD39, pKAD50, pKAD44, pKAD51 y pKAD42, respectivamente.

La Fig. 14 es un gráfico que ilustra la acumulación total de fenilalanina, ácido fenilacético y ácido prefénico en el medio de cultivo de las E. coli transformadas de esta invención.

La Fig. 15 ilustra la construcción del plásmido pAB18B a partir de los plásmidos pKAD38, pKAD39, pMU377 y pGM107.

La Fig. 16 ilustra el diseño del casete sintético.

La Fig. 17 ilustra la ruta biosintética de la serina.

La Fig. 18 ilustra la construcción del plásmido pKAD77A.

Las Figs. 19 y 20 resumen los datos de acumulación del producto final de la ruta común para diferentes E. coli transformadas.

La Fig. 21 ilustra la localización de promotores y secuencias de terminación en el casete sintético.

Las Figs. 22-31 muestran la construcción de los plásmidos pKAD69, pKAD70, pKAD68, pKAD49, pKAD62A, pKAD73, pKAD74, pKAD72A, pKAD72B, pKAD76A y pKAD80A, respectivamente.

Descripción detallada de la invención

De acuerdo con esta invención se proporciona un procedimiento para aumentar la producción de un compuesto aromático en una célula huésped por la ruta común de biosíntesis de aminoácidos aromáticos (la ruta común) endógena de la célula huésped. En esta ruta, una fuente de carbono metabolizable se convierte en compuestos aromáticos intermedios en una secuencia de reacciones de múltiples etapas caracterizada por las especies enzimáticas que actúan en los sustratos intermedios.

Se ha descrito que el aumento de la expresión de todas las enzimas de la ruta común disminuye la producción de los productos finales de la ruta común. Sin embargo, los solicitantes han descubierto que el aumento de la expresión de un subconjunto de enzimas de la ruta, da como resultado el aumento significativo de la producción de los productos finales de la ruta. Más específicamente, los solicitantes han identificado las etapas limitantes de la velocidad en la ruta y han descubierto que el aumento de la expresión de las especies enzimáticas que catalizan las etapas limitantes de la velocidad (3-deshidroquinato sintasa, siquimato quinasa, 5-enolpiruvoilsiquimato-3-fosfato sintasa (EPSP sintasa) y corismato sintasa) aumenta significativamente la producción de los productos finales de la ruta.

En una realización, la biosíntesis de los compuestos aromáticos es aumentada transformando una célula huésped con ADN recombinante que comprende secuencias de ADN exógeno que codifican las especies enzimáticas de la ruta común, consistiendo esencialmente dichas enzimas en la 3-deshidroquinato sintasa, siquimato quinasa, 5-enolpiruvoilsiquimato-3-fosfato sintasa y corismato sintasa y cultivando la célula transformada en un medio que contiene una fuente de carbono metabolizable. Alternativamente, la mayor expresión de las especies enzimáticas implicadas en las etapas limitantes de la velocidad se puede lograr mediante ingeniería genética de la célula huésped para que sobreexprese genes endógenos para dichas especies de enzimas, modificando las secuencias de control endógeno o afectando a la desrepresión de las secuencias de control de la expresión existentes, utilizando procedimientos aceptados en la técnica.

Sin tener en cuenta el mecanismo exacto usado para aumentar la expresión de las especies enzimáticas limitantes de la velocidad, se contempla que esto típicamente se realiza o es mediado por la transferencia de elementos genéticos recombinantes a la célula huésped. Los elementos genéticos, tal como se definen en esta memoria, incluyen ácidos nucleicos (generalmente ADN o ARN) que tienen secuencias codificantes expresables para productos tales como proteínas, específicamente enzimas, apoproteínas o ARN antisentido, que expresan o regulan la expresión de las enzimas limitantes de la velocidad en la ruta común. Las proteínas expresadas pueden funcionar como enzimas, reprimir o desreprimir la actividad enzimática o controlar la expresión de enzimas. El ADN recombinante que codifica estas secuencias expresables puede ser cromosómico (integrado en el cromosoma de la célula huésped, por ejemplo, por recombinación homóloga) o extracromosómico (por ejemplo, transportado por plásmidos, cósmidos y otros vectores que pueden realizar la transformación objetivo). Se entiende que el ADN recombinante usado para transformar la célula huésped de acuerdo con esta invención, puede incluir, además de los genes estructurales, secuencias de control de la expresión incluyendo promotores, represores y potenciadores que actúan para controlar la expresión o desrepresión de secuencias codificantes de proteínas, apoproteínas o ARN antisentido. Por ejemplo, dichas secuencias de control se pueden insertar en células huésped naturales para promover la sobreexpresión de enzimas seleccionadas ya codificadas en el genoma de la célula huésped o alternativamente, se pueden usar para controlar la síntesis de enzimas codificadas extracromosómicamente.

El ADN recombinante se puede introducir en la célula huésped mediante plásmidos, cósmidos, fagos, cromosomas artificiales de levaduras u otros vectores que median la transferencia de elementos genéticos a una célula huésped. Estos vectores pueden incluir un origen de replicación junto con elementos de control que actúan en cis que controlan la replicación del vector y de los elementos genéticos que lleva el vector. En el vector puede haber marcadores seleccionables para ayudar a identificar las células huésped en las que se han introducido los elementos genéticos. Los ejemplos de dichos marcadores seleccionables son genes que confieren resistencia a antibióticos particulares tales como tetraciclina, ampicilina, cloranfenicol, kanamicina o neomicina.

Un medio preferido para introducir elementos genéticos en una célula huésped utiliza un vector plasmídico de múltiples copias, extracromosómico, en el que se han insertado elementos genéticos de acuerdo con la presente invención. La introducción del plásmido que porta el elemento genético en las células huésped implica una escisión inicial de un vector plasmídico con una enzima de restricción, seguido de la unión del plásmido y los elementos genéticos que codifican las especias enzimáticas objetivo de acuerdo con la invención. Después de volver a hacer circular el plásmido recombinante unido, se usa la infección (por ejemplo, empaquetamiento en fago lambda) u otro mecanismo para la transferencia del plásmido (por ejemplo, electroporación, permeabilización de membrana, microinyección, etcétera) para transferir el plásmido a la célula huésped. Los plásmidos adecuados para insertar elementos genéticos en la célula huésped incluyen pBR322 y sus derivados tales como pAT153, pXf3, pBR325 y pBR327, vectores pUC y sus derivados, pACYC y sus derivados, pSC101 y sus derivados y ColE1, pero no se limitan a los mismos.

Las células huésped adecuadas para usar en la presente invención son miembros de los géneros que se pueden usar para la producción biosintética industrial de los compuestos aromáticos deseados. Estas incluyen cualquiera de las células eubacterianas no fotosintéticas incluyendo procariotas que pertenecen al género Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter, Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Staphylococcus o Serratia. Más preferentemente, las células procariotas se seleccionan del género Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium, más preferentemente del género Escherichia. También se pueden usar células huésped eucariotas, con levaduras del género Saccharomyces o Schizosaccharomyces.

Más específicamente, las células huésped procariotas se obtienen de especies que incluyen Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium herculis, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lichenformis, Bacillus megaterium, Bacillus mesentericus, Bacillus pumilis, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas angulata, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas tabaci, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, Streptomyces kasugensis, Streptomyces lavendulae, Streptomyces lipmanii, Streptomyces lividans, Staphylococcus epidermis, Staphylococcus saprophyticus o Serratia marcescens, pero no se limitan a las mismas. Las células huésped eucariotas preferida incluyen Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces carlsbergensis.

Para la producción industrial de metabolitos primarios derivados del corismato (tales como aminoácidos aromáticos) se prefieren cepas mutantes desreguladas de las especies antes citadas que carecen de inhibición por retroalimentación de una o más enzimas en la ruta biosintética metabólica. Dichas enzimas se pueden crear por mutagénesis aleatoria o dirigida o están disponibles en el comercio. Se describen ejemplos de cepas de E. coli que tienen inhibición por retroalimentación de la DAHP sintasa, prefenato deshidratasa o corismato mutasa, en la patente US 4.681.852 de Tribe y en la patente US 4.753.883 de Backman et al.

La siquimato quinasa es una enzima de la ruta común cuya actividad catalítica in vivo se puede aumentar por mutación de un locus genómico. La secuencia aroL que codifica la siquimato quinasa es una parte del operón aroL aroM que es controlado por el regulón tyrR y la transcripción es reprimida en presencia de la proteína represora TyrR y tirosina o triptófano. La represión transcripcional puede conducir a una reducción de la actividad de la siquimato quinasa de 6,9 veces cuando las células se hacen crecer en presencia tanto de tirosina como de triptófano. Se han construido tres mutantes de tyrR de la cepa de E. coli D2704 (KAD26B, KAD27C y KAD29B) que no producen la proteína represora de TryR. Estas líneas celulares mutantes se pueden usar como un procedimiento para aumentar la expresión de la siquimato quinasa. Preferentemente, se usan las cepas tyrR- KAD27C y KAD29B y más preferentemente se usa KAD29B como célula huésped tyrR- que posteriormente se manipula para eliminar el resto de las etapas limitantes de la velocidad de la ruta común.

Aunque una mutación tyrR no aumenta los niveles de flujo de carbono a lo largo de la ruta común aumentando la expresión de la siquimato quinasa, se debe evaluar el efecto de la mutación tyrR en otros aspectos de los procesos metabólicos de la célula. Además del operón aroL aroM, otras ocho unidades transcripcionales implicadas en la biosíntesis o transporte de aminoácidos aromáticos son controladas por el regulón tyrR. La unidad transcripcional aroF tyrA, que codifica la isozima sensible a la tirosina de la DAHP sintasa y la enzima bifuncional corismato mutasa-prefenato deshidrogenasa y aroG que codifica la isozima sensible a la fenilalanina de la DAHP sintasa, son reprimidas transcripcionalmente en presencia de tirosina y fenilalanina, respectivamente. Recientemente, se ha mostrado que la transcripción del locus que codifica la tercera isozima de la DAHP sintasa, aroH, está controlada por el regulón tyrR. La unidad transcripcional mtr, que codifica una enzima implicada en el transporte específico de triptófano, es regulada por inducción mediada por la proteína TyrR, mientras que tyrP, que codifica una enzima implicada en el transporte específico de tirosina, es regulado tanto por represión como inducción en presencia de tirosina y fenilalanina, respectivamente. Además, el regulón tyrR regula la transcripción de tyrB, que codifica la (amino aromático)-transferasa, aroP, que codifica una enzima implicada en el transporte general y tyrR, que codifica la proteína represora TyrR. De los informes surge el problema adicional de que el operón de la tirosina, aroF tyrA, es inestable en plásmidos de múltiples copias en mutantes tyrR. Los plásmidos que contienen el operón aroF tyrA entero, cuando son transformados en un mutante tyrR, son modificados mediante mutaciones de inserción y deleción de modo que disminuya el nivel de expresión del operón. La inestabilidad de las múltiples copias de los plásmidos que contienen aroF es preocupante, dado que la expresión amplificada de la DAHP sintasa, codificada por este locus, es esencial para aumentar el flujo de carbono dirigido en la ruta común.

En realizaciones preferidas de la presente invención, la mayor expresión de las especies enzimáticas limitantes de la velocidad en la célula huésped se logra transformando la célula huésped con un vector plasmídico que comprende ADN que codifica las especies enzimáticas 3-deshidroquinato sintasa, siquimato quinasa, 5-enolpiruvoilsiquimato-3-fosfato sintasa (EPSP sintasa) y corismato sintasa. En una realización preferida de la presente invención, una célula procariota se transforma con ADN recombinante para producir una célula procariota transformada caracterizada por la expresión de genes estructurales exógenos que codifican las especies enzimáticas transcetolasa (tkt), 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato sintasa (DAHP sintasa), 3-deshidroquinato sintasa (DHQ sintasa), siquimato quinasa, 5-enolpiruvoilsiquimato-3-fosfato sintasa y corismato sintasa. Típicamente, los genes estructurales exógenos se introducen en la célula huésped como parte de uno o más vectores plasmídicos recombinantes que comprenden el ADN que codifica las especies enzimáticas.

Otras realizaciones de la presente invención incluyen células transformadas preparadas de acuerdo con esta invención y un procedimiento que usa dichas células transformadas para producir un compuesto aromático de forma biocatalítica a partir de una fuente de carbono. El procedimiento comprende la etapa de cultivar una célula procariota transformada en un medio que contiene una fuente de carbono asimilable, comprendiendo dicha célula transformada secuencias de ADN exógeno que codifican especies enzimáticas de la ruta común, consistiendo esencialmente dichas especies enzimáticas en las enzimas 3-deshidroquinato sintasa, siquimato quinasa, 5-enolpiruvoilsiquimato-3-fosfato sintasa y corismato sintasa. La célula transformada se cultiva en condiciones que conducen a la asimilación de la fuente de carbono, en las que la fuente de carbono es absorbida por la célula y utilizada en la ruta común. Así, la invención de los solicitantes es una mejora de su trabajo precedente descrito en la patente US nº 5.186.056 que describe el aumento del flujo de carbono en la ruta común sobreexpresando las enzimas transcetolasa, 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato sintasa (DAHP sintasa). Como se describe en la presente solicitud, el mayor flujo de carbono dirigido a la ruta común por la sobreexpresión de la transcetolasa y DAHP sintasa, se pierde salvo que se eliminen las etapas limitantes de la velocidad de la ruta. La invención de los solicitantes se dirige a la identificación y eliminación de estas etapas limitantes de la velocidad aumentando la expresión de las enzimas de la ruta común que consisten esencialmente en la 3-deshidroquinato sintasa, siquimato quinasa, 5-enolpiruvoilsiquimato-3-fosfato sintasa y corismato sintasa.

Otras realizaciones de la presente invención incluyen construcciones de plásmidos que comprenden genes estructurales que codifican las enzimas limitantes de la velocidad de la ruta biosintética aromática común. Por ejemplo, una construcción preferida comprende genes estructurales para la 3-deshidroquinato sintasa, EPSP sintasa y corismato sintasa. Más preferentemente, la construcción de plásmido comprende genes estructurales para especies enzimáticas de la ruta común y dichas especies están restringidas a las enzimas limitantes de la velocidad 3-deshidroquinato sintasa, siquimato quinasa, 5-enolpiruvoilsiquimato-3-fosfato sintasa y corismato sintasa. Una célula procariota transformada con dichas construcciones de plásmidos es todavía otra realización contemplada en la presente invención.

Como se ha mencionado antes, se habían hecho esfuerzos anteriormente para aumentar la producción biosintética de compuestos derivados de la ruta común en una célula huésped, aumentando la expresión de proteínas que catalizan reacciones en la ruta. La presente invención proporciona una mejora significativa de la eficacia de producción de compuestos aromáticos en células huésped por la ruta común. Aunque los informes anteriores han enseñado que el flujo de carbono se puede aumentar en el extremo superior (las secuencias de reacciones iniciales) de la ruta, aumentando sólo las concentraciones de transcetolasa o combinado con otras enzimas en la ruta común, por ejemplo, DAHP sintasa, DHQ sintasa e incluso siquimato quinasa, estos antecedente no enseñan o sugieren la identificación y eliminación de todas las etapas limitantes de la velocidad de la ruta común. Los solicitantes han llevado a cabo la eliminación de las etapas limitantes de la velocidad y por lo tanto han aumentado la eficacia del flujo de carbono a lo largo de toda la ruta, transformando la célula huésped con secuencias de ADN exógeno que codifican las especies enzimáticas limitantes de la velocidad 3-deshidroquinato sintasa (DHQ), siquimato quinasa, 5-enolpiruvoilsiquimato-3-fosfato sintasa y corismato sintasa, para aumentar la expresión de esas enzimas en la célula huésped.

Por lo tanto, la presente invención se puede ver como una mejora de los esfuerzos precedentes para aumentar la producción biosintética de compuestos derivados de la ruta común, comprendiendo la mejora las etapas de (1) identificar las etapas de la reacción limitantes de la velocidad en dicha ruta y (2) aumentar la expresión de las proteínas que catalizan las etapas limitantes de la velocidad identificadas en la ruta, que da como resultado la eliminación de las etapas limitantes de la velocidad. Otra vez, el aumento de expresión se logra preferentemente de acuerdo con esta invención, transformando la célula huésped para que exprese genes exógenos que codifican dichos catalizadores proteicos (enzimas) para aumentar la concentración de las proteínas en la célula huésped. Una célula procariota transformada preferida se caracteriza por la mayor expresión de los genes estructurales de la 3-deshidroquinato sintasa, siquimato quinasa, 5-enolpiruvoilsiquimato-3-fosfato sintasa y corismato sintasa, en la que la célula comprende ADN exógeno que codifica al menos una de las especies enzimáticas. La mayor producción enzimática de compuestos aromáticos de la ruta común se ha mostrado particularmente cuando la célula huésped es una cepa de E. coli transformada para expresar genes estructurales exógenos que comprende los genes para la 3-deshidroquinato sintasa, siquimato sintasa, EPSP sintasa y corismato sintasa. (Véase la Tabla 1). En realizaciones preferidas la E. coli transformada comprende además secuencias de ADN exógeno que codifican las especies enzimáticas transcetolasa y DAHP sintasa.

D2704, una cepa de Escherichia coli que es pheA-, tyrA- y \DeltatrpE-C, en teoría sólo debería ser capaz de producir ácido corísmico porque las rutas terminales que conducen a la fenilalanina, tirosina y triptófano están respectivamente bloqueadas (Figura 1). Usando esta cepa se esperaba que se pudiera determinar el desbloqueo de la ruta común de la biosíntesis de aminoácidos aromáticos en E. coli, cuando se comprometía una mayor carga de carbono en la ruta, midiendo la mayor acumulación de corismato. Sin embargo, el crecimiento de células D2704 en un medio rico seguido de la resuspensión en un medio con acumulación mínima de sales no dio nada o muy poca acumulación de corismato, si no que dio niveles significativos de fenilalanina. La producción de fenilalanina se puede explicar por la transposición de Claisen no enzimática del ácido corísmico al ácido prefénico seguido de deshidratación para producir ácido fenilpirúvico. Aunque la enzima corismato mutasa acelera la conversión del corismato en prefenato en 2x10^{6} a 37ºC, la reacción se puede producir en ausencia de la enzima. Se ha descrito que el ácido prefénico produce fenilpiruvato de forma no enzimática en condiciones ácidas suaves tales como las producidas durante el cultivo normal de células. Con la producción de ácido fenilpirúvico, el microbio podría sintetizar fenilalanina usando la amino transferasa codificada por tyrB. Sin embargo, se observaron cantidades significativas de fenil-lactato en algunos líquidos sobrenadantes de los cultivos.

La (amino aromático)-transferasa codificada por tyrB transamina el ceto-ácido aromático usando glutamato como donador de nitrógeno y piridoxal-fosfato como coenzima. [Mavrides, C. In Methods in Enzymology; Academic: San Diego, 1987, 142, pp. 253-267] . La producción de ácido fenil-láctico puede deberse a los suministros insuficientes de glutamato en la célula para transaminar completamente todo el ácido fenilpirúvico. Debe producirse la reducción del ácido fenilpirúvico a fenil-lactato para regenerar un suministro de NAD^{+} dentro de la célula. Se sabe que se produce una reducción análoga de piruvato a ácido láctico catalizada por la enzima lactato deshidrogenasa [Holbrook, J.J.; Liljas, A.; Steindel, S.S.; Rossmann, M.G. In The Enzymes; Boyer, P.D., Ed. ; Academic Press: New York, 1975; Vol. 11, Chap. 4] en condiciones anaerobias, para regenerar un suministro de NAD^{+} para el funcionamiento continuado de la glucolisis.

La actividad de la (amino aromático)-transferasa también se podría limitar por la presencia de la mutación pheA en D2704. Se ha mostrado que la enzima bifuncional corismato mutasa-prefenato deshidratasa codificada por pheA interacciona con la (amino aromático)-transferasa en presencia de fenilpiruvato para formar un complejo en E. coli [Powell, J.T.; Morrison, J.F.; Biochem. Biophys. Acta, 1979, 568, 467-474]. Puesto que D2704 es pheA-, no debería poder producir la enzima corismato mutasa-prefenato deshidratasa necesaria para la formación del complejo. Aunque no se ha determinado el papel de la interacción enzima-enzima, es posible que la incapacidad para formar el complejo pueda afectar a la actividad de aminotransferasa dando como resultado la acumulación de ácido fenilpirúvico dentro de la célula. Aunque las teorías anteriores son plausibles, todavía hay que determinar experimentalmente la razón de la acumulación del fenil-lactato. Sin embargo, es seguro suponer que la acumulación de fenil-lactato representa equivalentes de glucosa desbloqueados en la ruta común. Por lo tanto, se midió la eliminación satisfactoria de los bloqueos metabólicos de la ruta común de la biosíntesis de aminoácidos aromáticos, mediante la acumulación total combinada de fenilalanina y ácido fenil-láctico en el siguiente estudio. La acumulación de los productos intermedios de la ruta común en el líquido sobrenadante de los cultivos se usó para identificar enzimas que eran etapas limitantes de la velocidad en el flujo de carbono en la ruta común, usando la idea de que al producto intermedio acumulado era el sustrato de una enzima limitante de la velocidad.

Se hicieron crecer cinco mililitros de cultivos iniciadores de cada cepa en un medio LB que contenía los fármacos adecuados, durante diez horas. Los cultivos iniciadores se usaron para inocular cultivos de un litro de LB en matraces erlenmeyer de cuatro litros, con adición de isopropil-B-D-tiogalactopiranósido (IPTG) (0,2 mM), cloranfenicol (20 mg/L) y ampicilina (50 mg/L) cuando fuera necesario. Los cultivos de un litro se hicieron crecer durante 12 horas a 37ºC con agitación (250 rpm). Las células se recogieron (3.000 g; 5 minutos; 4ºC) y se lavaron tres veces con sales M9 [las sales M9 contienen (por litro): 6 g de Na_{2}HPO_{4}, 3 g de KH_{2}PO_{4}, 0,5 g de NaCl, 1 g de NH_{4}Cl] (lavado con 300 ml para cada muestra). Los sedimentos celulares se volvieron a suspender en un litro de un medio de acumulación con M9 en un matraz erlenmeyer de cuatro litros que contenía glucosa (10 g), MgSO_{4} (1 mM) y tiamina (30 mg) con la adición de cloranfenicol, ampicilina e IPTG, cuando fuera necesario. Las células se incubaron durante 48 horas adicionales en el medio de acumulación a 37ºC con agitación (250 rpm). Se separaron partes alícuotas (25 ml) a intervalos de 24 y 48 horas y se centrifugaron (6.000 g; 5 min; 4ºC). Se recogieron diez mililitros de líquido sobrenadante de cada muestra y se separó el agua al vacío. Las muestras se intercambiaron dos veces con D_{2}O y se analizaron por RMN ^{1}H. Se usó como patrón interno la sal de sodio del ácido 3-(trimetilsilil)-propiónico-2,2,3,3-d_{4} para cuantificar los productos intermedios y productos finales producidos en la acumulación. Todos los cultivos se hicieron crecer por triplicado, de modo que se podían obtener los valores medios de las moléculas acumuladas así como sus desviaciones típicas.

Para crear una carga de carbono a lo largo de la ruta común de la biosíntesis de aminoácidos aromáticos, se usó un plásmido que contenía transcetolasa, tkt y la isozima sensible a la tirosina de la 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato sintasa (DAHP sintasa), aroF. Se ha mostrado que la transcetolasa aumenta los niveles de eritrosa-4-fosfato disponibles en la célula, para usar en la producción de aminoácidos aromáticos, mientras que la DAHP sintasa es la primera etapa irreversible de la ruta. La célula huésped D2704 transformada con el plásmido con tkt, aroF pKD130A (Figura 2), un derivado de pBR325 con el gen de resistencia a la ampicilina intacto y un origen de replicación pMB1, acumulaba los productos intermedios de la ruta común 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato sintasa (DAHP), 3-deshidrosiquimato (DHS), siquimato y siquimato-3-fosfato con una acumulación total de fenilalanina y fenil-lactato de 5,6 \pm 0,7 mM (Figura 3). La Figura 3 representa los datos en forma de dos gráficos de barras: la Figura 3A representa los productos intermedios de la ruta común acumulados en las cepas D2704 después de 24 horas de crecimiento en un medio mínimo; la Figura 3B ilustra la acumulación total de fenilalanina y fenil-lactato después de 24 y 48 horas de crecimiento en un medio mínimo. Tanto para la Figura 3A como la 3B, las cepas estudiadas incluyen: 1) D2704/pKD130A; 2) D2704/pKD136; 3) D2704/pKD136/pKD28; 4) D2704/pKD136/pKAD34; 5) D2704/pKD136/pKAD31; 6) D2704/pKD136/pKAD38; 7) D2704/pKD136/pKAD43; 8) D2704/pKD136/pKAD39; 9) D2704/pKD136/pKAD51; 10) D2704/pKD136/pKAD44; 11) D2704/pKD136/pKAD50.

Después de incubar durante 48 horas, las resonancias de los espectros de RMN ^{1}H de la DAHP en la cepa de E. coli D2704/pKD130A se encuentran en \delta 1,79 (dd, 13, 13 Hz, 1 H), \delta 2,20 (dd, 13, 5 Hz, 1 H), \delta 3,46 (dd, 9, 9 Hz, 1 H) y \delta 3.83 (m, 2 H). La presencia de siquimato en el medio de cultivo se muestra por las resonancias a \delta 4,41 (dd, 4, 4 Hz, 1 H) y \delta 6,47 (m, 1 H). Se encuentra una resonancia para el siquimato-fosfato a \delta 6,47 (m, 1 H) . Las resonancias para la fenilalanina se encuentran a \delta 3,14 (dd, 14, 8 Hz, 1 H), \delta 3,29 (dd, 14, 5 Hz, 1 H) y \delta 7,30 - 7,49 (m, 5 H). Se encuentran resonancias observables para el ácido fenil-láctico a \delta 4,27 (dd, 8, 4 Hz, 1 H) y \delta 7,30 - 7,49 (m, 5 H). La DHS desaparece del medio de acumulación después de entre 24 y 48 horas.

La acumulación de DAHP, DHS, siquimato y siquimato-3-fosfato en el líquido sobrenadante del cultivo de la cepa de E. coli D2704/pKD130A conduce a la asignación de la 3-deshidroquinato sintasa (DHQ sintasa), siquimato deshidrogenasa, siquimato quinasa y 5-enolpiruvoilsiquimato-3-fosfato sintasa (EPSP sintasa) respectivamente, como enzimas limitantes de la velocidad. Aunque se han identificado previamente la DHQ sintasa y siquimato deshidrogenasa como etapas limitantes de la velocidad en la ruta común [Draths, K.M.; Frost, J.W.; J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 9360-9632; Draths, K.M., Ph.D. Dissertation, Stanford University, June 1991], la identificación de la siquimato quinasa y la EPSP sintasa como etapas limitantes de la velocidad no se ha descrito en la bibliografía.

Para eliminar la acumulación de DAHP en el líquido sobrenadante del cultivo, se introdujo un plásmido con tkt, aroF, aroB pKD136 (Figura 2) en D2704. Usando pKD136, se eliminó satisfactoriamente la DAHP del líquido sobrenadante del cultivo dando como resultado una mayor acumulación de DHS, siquimato y siquimato-3-fosfato, pero no un aumento de fenilalanina y fenil-lactato (Figura 3). Por lo tanto, incluso aunque se hubiera eliminado una etapa determinante de la velocidad de la ruta, no se observó aumento de la acumulación de producto final.

La falta de sitios de restricción únicos convenientes para insertar aroE en pKD136 dio como resultado el uso de un sistema de dos plásmidos para el resto de los experimentos de desbloqueo. El sistema consistía en pKD136 y los plásmidos derivados de pSU2718/pSU2719 [Martinez, E.; Bartolome, B.; de la Cruz, F. Gene, 1988, 68, 159-162] pSU18 y pSU19, que tienen resistencia al cloranfenicol, un promotor lac y un origen de replicación p15A, en el que se insertaron el resto de los genes desbloqueantes. Se creó un plásmido con aroE basado en pSU18, pKD28 [Draths, K.M., Ph.D. Dissertation, Stanford University, June 1991] aislando el fragmento de 1,6 kb que contenía el promotor tac y el gen aroE de pIA321 [Anton, I.A.; Coggins, J.R. Biochem. J., 1988, 249, 319-326] seguido de la unión en pSU18 como se muestra en la Figura 4. Aunque D2704/pKD136/pKD28 reduce el nivel de acumulación de DHS, no elimina completamente el producto intermedio del líquido sobrenadante del cultivo. Todavía se encontraba siquimato y siquimato-3-fosfato en el caldo de cultivo. La producción total de fenilalanina y fenil-lactato se redujo a 2,1 \pm 0,9 mM después de 48 horas de crecimiento (Figura 3, cepa 3) implicando que el mayor flujo de carbono por el desbloqueo en aroE no dio como resultado la acumulación adicional de productos finales.

Para eliminar las características limitantes de la velocidad de la siquimato quinasa, se construyeron plásmidos tanto con aroL como aroEaroL. El aroL está situado en una unidad transcripcional con aroM, un gen cuya función se desconoce [DeFeyter, R.C.; Pittard, J.; J. Bacteriol., 1986, 165, 226-232]. Previamente se ha aislado un fragmento de 2,7 kb que contiene la unidad transcripcional y se ha clonado en pBR322 para formar el plásmido pMU371 [DeFeyter, R.C.; Pittard, J. J. Bacteriol., 1986, 165, 226-232]. Se aisló un fragmento un kb que contenía aroL del plásmido pMU371 y se insertó en el vector pSU19 creando el plásmido con aroL pKAD31 de 3,3 kb (Figura 5). El plásmido con aroEaroL pKAD34 de 4,9 kb se obtuvo por manipulación de los sitios de restricción que flanquean el gen aroE de pKD28 seguido de su aislamiento y unión en los sitios únicos Xbal y BamHI de pKAD31 (Figura 6).

La construcción con aroEaroL D2704/pKD136/pKAD34 (Figura 3, cepa 4) era capaz de eliminar completamente la DHS y el siquimato del líquido sobrenadante del cultivo dejando sólo siquimato-3-fosfato como producto intermedio acumulado de la ruta común. La producción total de fenilalanina y fenil-lactato era 3,4 \pm 0,2 mM, un pequeño aumento de la producción del producto final respecto a D2704/pKD136/pKD28 pero todavía significativamente menor que las concentraciones de fenilalanina y fenil-lactato observadas tanto con D2704/pKD130A como D2704/pKD136 (Figura 3, cepas 1 y 2).

La construcción con aroL D2704/pKD136/pKAD31 también podía eliminar completamente la DHS y el siquimato del caldo de cultivo aliviando así las características limitantes de la velocidad tanto de la siquimato deshidrogenasa como de la siquimato quinasa con sólo la sobreproducción de un gen. Por lo tanto, parece que el carácter limitante de la velocidad de la siquimato deshidrogenasa es un producto de la acumulación de siquimato. La importancia de eliminar el siquimato del medio de cultivo en la características limitantes de la velocidad de la siquimato deshidrogenasa sugiere que el siquimato puede tener algún efecto inhibidor en la enzima. Todavía se observaba la acumulación del siquimato-3-fosfato y se encontró que la producción total de fenilalanina y fenil-lactato era 5,6 \pm 0,5 mM, el nivel de producción de producto final observado inicialmente con D2704/pKD130A y D2704/pKD136 (Figura 3). Por lo tanto, después de eliminar los bloqueos metabólicos de la DHQ sintasa, siquimato deshidrogenasa y siquimato quinasa, la acumulación total de los productos finales de la ruta no aumentó significativamente, faltando todavía los equivalentes de glucosa desbloqueados.

Se ha descrito que el EPSP [Duncan, K.; Lewendon, A.; Coggins, J.R. FEBS Lett., 1984, 165, 121-127] es un inhibidor de la reacción anterior de la EPSP sintasa, sugiriendo una posible explicación de que se observen las características limitantes de la velocidad de la enzima. Para eliminar el siquimato-3-fosfato del líquido sobrenadante del cultivo, se construyeron tanto plásmidos con aroA como aroAaroL. El gen aroA se encuentra en un operón con serC el cual codifica la 3-fosfoserina-aminotransferasa, una enzima de la ruta biosintética de la serina. Se ha aislado y secuenciado el fragmento de 4,7 kb que codifica el operón serCaroA [Duncan, K.; Coggins, J.R.; Biochem. J., 1986, 234, 49-57; Duncan, K.; Lewendon, A.; Coggins, J.R. FEBS Lett., 1984, 170, 59-63]. Para crear el plásmido con aroA pKAD38 de 4,7 kb, se aisló un fragmento con aroA de 2,4 kb del plásmido pKD501 [Duncan, K.; Coggins, J.R.; Biochem. J., 1986, 234, 49-57] y se unió al vector pSU18 directamente detrás del promotor externo lac (Figura 7). Para la eliminación de aroA de la unidad transcripcional de serCaroA es necesario que esté situada detrás de un promotor externo para la expresión. Un terminador de la transcripción independiente de rho que está situado entre los genes serC y aroA y que se cree que atenúa naturalmente la expresión de aroA, permanece intacto en el fragmento aroA de 2,4 kb, ya que no había ningún sitio de restricción conveniente para su eliminación. La colocación del gen aroA truncado con el terminador de la transcripción detrás de un promotor lac externo, debería proporcionar todavía algún nivel de sobreexpresión de la EPSP sintasa. El plásmido con aroAaroL de 5,7 kb, pKAD43 (Figura 8) se creó aislando el gen aroA de 2,4 kb con extremo PstI flanqueando y extremo romo y unión en un vector pKAD31 que se ha manipulado para que tenga sitios equivalentes.

La evaluación de la cepa D2704/pKD136/pKAD38 puso de manifiesto un aumento significativo de la producción total de fenilalanina y fenil-lactato, produciendo 7,9 \pm 1,3 mM después de 48 horas de acumulación (Figura 3, cepa 6). Los productos intermedios de la ruta acumulados en el líquido sobrenadante eran DHS, siquimato y siquimato-3-fosfato. La cepa D2704/pKD136/pKAD43 producía 9,7 \pm 0,3 mM de fenilalanina y fenil-lactato acumulándose sólo un producto intermedio de la ruta común, el siquimato-3-fosfato (Figura 3, cepa 7). Los plásmidos con aroA dieron la primera señal de la conversión satisfactoria de los equivalentes de glucosa desbloqueados en los productos finales. La incapacidad del gen aroA para eliminar completamente la acumulación de siquimato-3-fosfato puede dar como resultado la reversibilidad de la reacción catalizada por la EPSP sintasa.

Se ha sugerido que la corismato sintasa es una enzima tanto irreversible como posiblemente limitante de la velocidad [Pittard, A.J. In Escherichia coli and Salmonella typhimurium; Neidhardt, F.C., Inhgraham, J.L., Low, K.B., Magasanik, B., Schaechter, M., Umbarger, H.E., Eds.; American Society for Microbiology: Washington, DC 1987; Vol. 1, capítulo 24]. Las características limitantes de la velocidad de la corismato sintasa pueden dar como resultado la presencia continuada de siquimato-3-fosfato si las acumulaciones de EPSP posteriormente son convertidas en siquimato-3-fosfato por la EPSP sintasa. En un intento de eliminar completamente la siquimato-3-fosfato del líquido sobrenadante del cultivo, se construyó un plásmido con aroAaroCaroL. Primero se construyó un plásmido con aroC aislando el fragmento con aroC flanqueado por SalI y con sitios con extremos romos de pGM602 [White, P.J.; Millar, G.; Coggins, J.R.; Biochem. J., 1988, 251, 313-322], un plásmido que contiene un fragmento de 1,69 kb que codifica la corismato sintasa. La unión en los sitios únicos SalI y SmaI de pSU19 creó el plásmido pKAD39 de 4 kb (Figura 9). Para crear el plásmido con aroAaroCaroL pKAD50 de 7,4 kb, se aisló el fragmento aroC de 1,69 kb de pKAD39 como un fragmento SalI/extremo romo y se unió a un vector pKAD43 que se había manipulado para que contuviera los extremos equivalentes (Figura 10).

La cepa D2704/pKD136/pKAD50 producía 12,3 \pm 2,2 mM de fenilalanina y fenil-lactato (Figura 3, cepa 11), un aumento significativo de la producción de producto final frente a D2704/pKD136/pKAD43. Aunque D2704/pKD136/
pKAD50 todavía acumulaba algo de siquimato-3-fosfato, la cantidad total acumulada era menor que en D2704/pKD
136/pKAD43. La RMN de la acumulación de D2704/pKD136/pKAD50 a las 48 horas indica la presencia de fenilalanina por resonancias a \delta 3,29 (dd, 14, 5 Hz, 1 H), \delta 4,0 (dd, 8, 5 Hz, 1 H) y \delta 7,25 - 7,49 (m, 5 H). Las resonancias para el ácido fenil-láctico se encuentran a \delta 2,88 (dd, 14, 8 Hz, 1 H), \delta 4,27 (dd, 8, 4 Hz, 1 H) y \delta 7,25 - 7,49 (m, 5 H). También se encuentra una pequeña cantidad de DHS en el caldo de cultivo como indica la presencia de una resonancia a \delta 6,4 (d, 3 Hz, 1 H). El aumento observado de la producción de producto final tras la adición de aroC al plásmido desbloqueante, ha conducido a la asignación de la corismato sintasa como una enzima limitante de la velocidad, suponiendo que la acumulación de EPSP se debe convertir en siquimato-3-fosfato.

Para entender mejor el papel de la corismato sintasa, se construyeron plásmidos que contenían aroC (pKAD39; Figura 9), aroAaroC y aroCaroL y se evaluaron en la cepa D2704/pKD136. El plásmido pKAD44 con aroCaroA de 6,39 kb (Figura 11) se creó aislando un fragmento aroA con sitios con extremo flanqueador PstI y extremo romo, seguido de la unión en un vector pKAD39 que se había manipulado para que contuviera los sitios con extremos romos equivalentes. El plásmido pKAD51 con aroCaroL de 5 kb (Figura 12) se construyó aislando aroC como un fragmento con extremo romo y SalI que se unió a un vector pKAD31 que se había manipulado para que contuviera sitios equivalentes. Como puede verse en la Figura 3, pKAD39, pKAD51 y pKAD44 (cepas 8, 9 y 10 respectivamente) no logran los niveles de acumulación de producto final que lograba el plásmido pKAD50 con aroAaroCaroL tras la inserción en D2704/pKD136. Por lo tanto, se determinó que la cepa D2704/pKD136/pKAD50 era la cepa óptima para la producción máxima de producto final.

Para determinar el papel de la transcetolasa en la cepa óptima D2704/pKD136/pKAD50, se eliminó el gen del plásmido pKD136 por digestión con BamHI seguido de reasociación creando el plásmido pKAD42 (Figura 13). El cultivo de la cepa D2704/pKAD42/pKAD50 dio como resultado la acumulación de grandes cantidades de acetato y lactato dando como resultado la muerte de la célula. Para aliviar este problema, se siguió el pH del medio de acumulación durante las 48 horas de incubación y se neutralizó con NaOH 5 N cuando fue necesario. El mantenimiento de un pH neutro dio como resultado grandes acumulaciones de ácido prefénico en periodos de tiempo tanto de 24 como de 48 horas de D2704/pKAD42/pKAD50 posiblemente debido a la menor capacidad de la molécula de transponerse al fenilpiruvato a pH neutro. Por lo tanto, para comparar la cantidad de flujo de carbono suministrando satisfactoriamente al final de la ruta común entre las cepas D2704/pKAD42/pKAD50 y D2704/pKD136/pKAD50, se tuvieron en cuenta las cantidades totales de fenilalanina, ácido fenil-láctico y ácido prefénico.

La Figura 14 ilustra la acumulación total de fenilalanina, ácido fenil-láctico y ácido prefénico en las cepas de E. coli D2704/pKAD42/pKAD50 y D2704/pKD136/pKAD50 después de 24 y 48 horas, hechas crecer en un medio mínimo. Como se muestra en la Figura 14, la cantidad de productos finales producidos por la cepa D2704/pKD136/pKAD50 era significativamente mayor que la producida por la cepa D2704/pKAD42/pKAD50. Este resultado muestra que para dirigir satisfactoriamente una mayor carga de carbono a los aminoácidos aromáticos y sus derivados, se pueden incluir copias adicionales de transcetolasa para aumentar los niveles de carbono disponibles en la ruta común, así como copias adicionales de los genes que codifican la DAHP sintasa, DHQ sintasa, siquimato quinasa, EPSP sintasa y corismato sintasa.

Los solicitantes han identificado la DHQ sintasa, siquimato quinasa, EPSP sintasa y corismato sintasa como bloques metabólicos en la ruta común de la biosíntesis de los aminoácidos aromáticos. Se cree que la identificación previa de la siquimato deshidrogenasa como un bloque metabólico era producto de la acumulación de siquimato en el medio de cultivo. Se construyó el plásmido pAB18B a partir de los plásmidos pKAD38, pKAD39, pMU377 y pGM107, que contiene cada uno de los genes que codifican las enzimas limitantes de la velocidad (véase la Figura 15). La construcción de los plásmidos pKAD38 y pKAD39, que proporcionan la fuente de los genes aroA y aroC respectivamente se ha descrito antes. La construcción de los plásmidos pMU377 y pGM107, que proporcionan la fuente de los genes aroL y aroB respectivamente, se describe en los antecedentes DeFeyter and Pittard, Journal of Bacteriology, 1986, 165, 226-232 and Millar and Coggins, FEBS Lett., 1986, 200, 11-17, respectivamente.

Se puede aumentar tanto el rendimiento como la pureza de los aminoácidos aromáticos y sus derivados producidos por procesos biocatalíticos, mediante el uso del plásmido pAB18B o mediante el uso de un sistema de dos plásmidos en E. coli. En el sistema de dos plásmidos, el plásmido pKD136 o un equivalente funcional es esencial para enviar un mayor flujo de carbono a la ruta común de la biosíntesis de los aminoácidos aromáticos, mientras que el plásmido pKAD50 o sus equivalentes funcionales, es esencial para dirigir satisfactoriamente la carga de carbono al final de la ruta común. La mayor pureza de los productos finales observada tras la introducción de los genes desbloqueantes aroB, aroL, aroA y aroC se observa fácilmente en los espectros de RMN de D2704/pKD130A y D2704/pKD136/pKAD50. En la Tabla 1 se muestra un resumen de los datos que muestran el aumento satisfactorio de los solicitantes en la producción de aminoácidos aromáticos por la ruta común.

TABLA 1 Resumen de los datos experimentales

La cepa de E. coli D2704 se transformó con las siguientes combinaciones de plásmidos y se midió la acumulación total de fenilalanina, ácido fenil-láctico y ácido prefénico después de 48 horas de crecimiento en un medio mínimo.

Plásmidos	Genes sobreexpresados	Producto Acumulado
pKD130A	tkt, AroF	5,6 \pm 0,7 mM
PKD136	tkt, aroF, aroB	5,6 \pm 0,7 mM
pKD136 + pKAD34	tkt, aroF, aroB, aroE, aroL	3,4 \pm 0,2 mM
pKD136 + pKAD38	tkt, aroF, aroB, aroA,	7,9 \pm 1,3 mM
pKD136 + pKAD43	tkt, aroF, aroB, aroA, aroL	9,7 \pm 0,3 mM
pKAD42 + pKAD50	aroB, aroF, aroA, aroL, aroC	8,1 \pm 0,5 mM
pKD136 + pKAD50	tkt, aroF, aroB, aroA, aroL, aroC	12,3 \pm 2,2 mM

Con frecuencia, en la síntesis biocatalítica es conveniente sustituir la expresión basada en plásmidos por las estrategias basadas en genoma para aumentar la expresión de enzimas in vivo. La reducción del contenido de plásmido en una célula disminuye la carga metabólica asociada con la expresión de genes codificados por las copias múltiples de plásmidos. La carga metabólica se puede traducir en menores rendimientos del producto e inestabilidad de la construcción de plásmido. Las inserciones genómicas también proporcionan más espacio para insertar nuevos genes que llevan los plásmidos en una célula. En una realización, se construye una E. coli transformada, en la que la E. coli se caracteriza por la mayor expresión de los genes estructurales que codifican las enzimas 3-deshidroquinato sintasa, siquimato quinasa, 5-enolpiruvoilsiquimato-3-fosfato sintasa y corismato sintasa. Esta E. coli transformada comprende secuencias de ADN exógeno que codifican al menos una de les especies enzimáticas. En una realización, las secuencias de ADN exógeno están integradas en el genoma de la célula. Esta célula transformada, se puede transformar adicionalmente con secuencias de ADN exógeno que codifican la transcetolasa y DAHP sintasa.

Existen muchos procedimientos para las inserciones genómicas de secuencias genéticas en células bacterianas. Se han llevado a cabo inserciones satisfactorias usando plásmidos circulares, fragmentos de ADN lineales y transposones como vehículos transportadores.

Aunque los plásmidos se mantienen en las bacterias como extracromosómicos, se encuentra que alguna vez se producen sucesos recombinacionales de circularización de ADN, de modo que el ADN del plásmido es integrado en el cromosoma de la célula huésped. El aprovechamiento de este suceso raro proporciona un procedimiento para la inserción sencilla y específica de un gen flanqueado por secuencias homólogas a la región de inserción deseada en el genoma. La identificación de células con el ADN del plásmido integrado es difícil, puesto que tanto los plásmidos que se replican libremente como los integrados expresan la resistencia a los fármacos codificados por los marcadores del plásmido. El uso de un plásmido no replicativo permite la selección exclusiva del ADN plasmídico integrado, puesto que las células tendrán resistencia al fármaco sólo si el plásmido reside en el genoma.

Para las inserciones genómicas son convenientes los plásmidos cuya replicación se puede activar y desactivar a voluntad. Se puede realizar la clonación y preparación normal del plásmido con replicación con funcionamiento completo, mientras que las inserciones genómicas se pueden llevar a cabo en condiciones en las que la maquinaria de la replicación está inactiva. Los plásmidos que tienen un replicón sensible a la temperatura pueden ser manipulados de este modo. El plásmido pMAK705 contiene dicho replicón pSC101 sensible a la temperatura, un marcador de cloranfenicol acetiltransferasa (cm) que le confiere resistencia al cloranfenicol y un sitio de clonación múltiple conveniente. El plásmido se puede replicar normalmente cuando la célula huésped se hace crecer a 30ºC, pero no se puede replicar cuando la célula huésped se cultiva a 44ºC. Por lo tanto, la manipulación genética de los plásmidos se lleva a cabo a 30ºC mientras que la integración del plásmido en el genoma se puede seleccionar a
44ºC.

Se diseñó un casete sintético de modo que se amplificaran las actividades catalíticas in vivo de las enzimas limitantes de la velocidad, EPSP sintasa, corismato sintasa y DHQ sintasa, con una sola inserción genómica de aroA, aroC y aroB. En este conjunto de experimentos, la célula huésped era una E. coli mutante tyrR-, que, por lo tanto, tiene niveles intracelulares elevados de siquimato quinasa. El casete se construyó a partir de un fragmento que contiene un promotor externo, secuencias codificantes de aroA, aroC y aroB y un segundo fragmento que codificaba una enzima que le confiere resistencia a un antibiótico (Figura 16). Se eligió el promotor fuerte, tac, como el promotor externo para asegurar suficiente transcripción de aroA que carece de un promotor nativo. Se eligió el gen que codifica la aminoglicósido 3-fosfotransferasa, que confiere resistencia a la kanamicina, como marcador de fármaco seleccionable para insertar el casete sintético en el genoma. Se planeó la inserción del casete en el genoma en serA, un locus que codifica la 3-fosfoglicerato deshidrogenasa, con el fin de crear un auxótrofo para la serina. La Figura 17 ilustra la ruta biosintética de la serina (los locus genéticos serA, serC y serB codifican las enzimas 3-fosfoglicerato deshidrogenasa, 3-fosfoserina aminotransferasa y 3-fosfoserina fosfatasa, respectivamente). Esta auxotrofía también se puede usar para seleccionar la inserción satisfactoria del casete sintético en el genoma.

Cuando se analiza la eliminación de las etapas limitantes de la velocidad de la ruta común en los auxótrofos para serA, el complemento de serina al auxótrofo no es necesario porque el crecimiento inicial de la cepa se lleva a cabo en un medio rico que contiene serina. La posterior resuspensión de las células crecidas en el medio mínimo usado para la acumulación del producto orgánico final no crea un entorno en el que sea necesaria la serina, puesto que las células simplemente están metabolizando glucosa para formar fenilalanina. Sin embargo, en las células auxótrofas debe estar presente el locus de serA, si las células auxótrofas se hacen crecer en un medio mínimo, como es el caso para la síntesis biocatalítica a gran escala de productos químicos médicos e industriales. La inserción del locus de serA en un plásmido y la transformación de un huésped que es serA- asegura el mantenimiento del plásmido siempre que las células se hagan crecer en un medio mínimo (es decir, que carece de complemento de aminoácidos). Este enfoque es más económico para la biocatálisis a gran escala que los antibióticos y la resistencia codificada por el plásmido a estos antibióticos, usado para mantener los plásmidos durante la síntesis biocatalítica a menor escala de los
solicitantes.

El casete sintético se insertó en el genoma de KAD29B (un mutante tyrR-) usando recombinación homóloga en serA para generar líneas celulares KAD1D y KAD11D. KAD1D y KAD11D se replicaron en placa en placas mínimas con y sin serina para verificar que la inserción genómica del casete sintético interrumpía el gen serA (Tabla 2). Ninguna de las dos colonias podía crecer sin complemento de serina, lo cual significaba que se había producido la inserción específica en serA. Como comparación, se replicaron en placa las cepas de control JC158, un auxótrofo para serA y cepas de partida KAD29B.

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TABLA 2 Selección en placa para la caracterización de cepas con inserción genómica

Las placas con M9 también contenían fenilalanina, triptófano y ácido p-hidroxifenilpirúvico para satisfacer los requisitos de crecimiento de las cepas KAD29B, KAD1D y KAD11D.

Cepa	M9/glucosa serina	M9/glucosa/	LB/Cm	LB/Kan
JC158 ser A-	-	+	-	-
KAD29B	+	+	-	-
KAD1D	-	+	-	+
KAD11D	-	+	-	+

Se midieron las actividades catalíticas in vivo de aroB, aroL, aroA y aroC para determinar el nivel de expresión de las enzimas limitantes de la velocidad, en las cepas KAD29B y KAD1D (Tabla 3).

TABLA 3 Relaciones de las actividades específicas de las enzimas limitantes de la velocidad en cepas con inserción genómica respecto a la cepa de control D2704

Los valores de actividad enzimática de D2704 (unidades mg-1) son los siguientes: DHQ sintasa, 0,0023; siquimato quinasa, 0,0023; EPSP sintasa 0,0099; corismato sintasa, 0,0017. Una unidad se define como un \mumol de producto formado por min.

Cepa	DHQ sintasa	Siquimato quinasa	EPSP sintasa	Corismato sintasa
D2704	1,0	1,0	1,0	1,0
KAD29B	1,2	52	4,1	1,1
KAD1D	4,8	7,4	10	4,9
KAD1D + IPTG	3,6	6,5	11	6,5

La inserción del casete sintético en serA, formando KAD1D, amplifica la expresión de la DHQ sintasa 3,6 veces, la EPSP sintasa 11 veces y la corismato sintasa 6,5 veces, cuando se añade IPTG al medio para inducir el promotor tac. La alta actividad de la siquimato quinasa observada en la cepa KAD29B se reduce cuando se inserta el casete sintético en el genoma de la cepa, probablemente debido a una carga metabólica asociada con el aumento de las actividades de otras enzimas limitantes de la velocidad.

Para evaluar la eficacia del casete sintético en la expresión de las enzimas limitantes de la velocidad y en la eliminación de las etapas limitantes de la velocidad de la ruta común, los solicitantes usaron un sistema que mimetiza la inserción genómica de un plásmido mediante el uso de un plásmido de bajo número de copias. Se eligió el vector pCL1920 ya que contiene aproximadamente cinco copias por célula y tiene un promotor lac que se puede eliminar. Por lo tanto, la inserción del casete en pCL1920 sin su promotor proporcionaría un vector de bajo número de copias en el que la única transcripción iniciada sería desde el promotor tac en el casete. El casete sintético se sacó como un fragmento EcoR I de 5,5 kb de pKAD72A y se unió a un fragmento de 4,3 kb de pCL1920, en el que se había escindido previamente el promotor, formando el plásmido de bajo número de copias de 9,8 kb pKAD77A (Figura 18).

La cepa KAD29B/pKD130A/pKAD77A sintetizó una concentración de 9,9 \pm 1,1 mM de producto final después de 48 h de incubación. Debido a que se observó que el pH del líquido sobrenadante del cultivo disminuía a pH 5 después de 24 h de cultivo, la viabilidad celular era un problema probable. Se llevó a cabo una segunda acumulación en la que se siguió el pH durante las primeras 24 h de incubación y se neutralizó cuando fue necesario (Figura 19). La Figura 19a ilustra la acumulación de los productos intermedios DHS y S3P de la ruta, mientras que la Figura 19b ilustra la acumulación combinada de los productos finales fenilalanina, ácido fenil-láctico y ácido prefénico en la cepa 1 de E. coli (D2704/pKD136/pKAD50) y cepa 2 (KAD29B/pKD130A/pKAD77A). En condiciones de pH controladas (el pH se siguió durante las primeras 24 horas de cultivo y se neutralizó cuando fue necesario) KAD29B/pKD130A/pKAD77A produjo una concentración de productos finales de 12,4 \pm 1,4 mM después de 24 h de incubación (Figura 19b, cepa 2), un valor comparable a la acumulación observada con D2407/pKD136/pKAD50 (Figura 19b, cepa 1). Toda la glucosa en el líquido sobrenadante del cultivo fue metabolizada durante las primeras 24 h de incubación en un medio mínimo y el único producto intermedio acumulado de la ruta común en el líquido sobrenadante del cultivo a las 24 h era DHS (Figura 19a, cepa 2).

Las cepas KAD1D/pKD130A y KAD11D/pKD130A tienen secuencias exógenas que codifican las especies enzimáticas 3-deshidroquinato, EPSP sintasa y corismato sintasa integradas en el genoma de la célula. Se pueden construir cepas adicionales de E. coli en las que se hayan integrado en el genoma de la célula secuencias de ADN exógeno que codifican las especies enzimáticas transcetolasa, DAHP sintasa, 3-deshidroquinato sintasa, EPSP sintasa y corismato sintasa. Las cepas KAD1D/pKD130A y KAD11D/pKD130A se construyeron para ensayar la capacidad de la inserción genómica de eliminar las acumulaciones de sustratos de las enzimas limitantes de la velocidad y aumentar las acumulaciones de los productos finales. La Figura 20a ilustra la acumulación de la DHS intermedia de la ruta, mientras que la Figura 20b ilustra la acumulación combinada de los productos finales, ácido prefénico, ácido fenil-láctico y fenilalanina en la cepa 1 de E. coli (KAD29B/pKD130A/pKAD77A), cepa 2 (KAD1D/pKD130A) y cepa 3 (KAD11D/pKD130A). Se siguió el pH de todas las cepas durante las primeras 24 horas de cultivo en un medio mínimo y se neutralizó cuando fue necesario. La cepa KAD1D/pKD130A acumuló 9,3 \pm 0,6 mM (Figura 20b, cepa 2) mientras que KAD11D/pKD130A acumuló 10,5 \pm 0,8 mM de los productos finales (Figura 20b, cepa 3) después de 24 h de incubación en un medio mínimo. No se observó un aumento significativo de producto final entre las 24 y 48 h para cada cepa. El único producto intermedio de la ruta común que se acumulaba en los líquidos sobrenadantes de los cultivos de KAD1D/pKD130A y KAD11D/pKDS130A era DHS. Ambas cepas metabolizaron toda su glucosa en las primeras 24 h de incubación y produjeron ligeramente menos producto final que la concentración de 12,4 \pm 1,4 mM observada en KAD29B/pKD130A/pKAD77A (Figura 20b, cepa 1).

La comparación de las actividades catalíticas in vivo de las enzimas limitantes de la velocidad en las cepas KAD1D y KAD1D/pKD130A puso de manifiesto una disminución significativa de la actividad tras la transformación de KAD1D con pKD130A (Tabla 4). Se observó una disminución mínima de dos veces para las actividades de aroB, aroA y aroC.

TABLA 4 Relaciones de las actividades específicas de las enzimas limitantes de la velocidad en cepas con inserción genómica comparadas con la de D2704

Los valores de actividad enzimática de D2704 (unidades mg-1) son los siguientes: DHQ sintasa, 0,023; siquimato quinasa, 0,0023; EPSP sintasa 0,0099; corismato sintasa, 0,0017. Una unidad se define como un \mumol de producto formado por min.

Cepa	DHQ sintasa	Siquimato quinasa	EPSP sintasa	Corismato sintasa
D2704	1,0	1,0	1,0	1,0
KAD1D + IPTG	3,6	6,5	11	6,5
KAD1D/pKD130A	1,7	4,1	2,4	3,1
KAD29B/pKD130A/pKAD77A	12	4,0	12	25
D2704/pKD136/pKAD50	2,0	41	8,3	4,2

La comparación de las actividades de las cepas KAD29B/pKD130A/pKAD77A, que contienen el casete sintético basado en plásmido de bajo número de copias, con KAD1D/pKD130A, que contiene la inserción genómica, puso de manifiesto que KAD29B/pKD130A/pKAD77A tiene mayores actividades de aroB, aroA y aroC, lo cual explica posiblemente los mayores valores de acumulación observados cuando se cultiva esta cepa.

Ejemplo 1 Construcción de mutantes tyrR de D2704

La introducción del alelo tyrR- en D2704 dependía de la transducción del fago P1. Se preparó un lisato de P1 a partir de la cepa JB5 que es un derivado de una cepa, JP2312, que tiene una mutación en el alelo tyrR370. Se infectó D2704 con este lisato de fago y se seleccionaron las colonias que tenían la mutación tyrR según su capacidad para crecer en presencia del análogo de tirosina, m-D,L-fluorotirosina. Debido a la represión del regulón tyrR por la proteína TyrR en presencia de m-D,L-fluorotirosina, las colonias que son tyrR^{+} no pueden biosintetizar tirosina evitando así su crecimiento en un medio no complementado. El crecimiento de las colonias que son tyrR- no se ve afectado por la presencia de m-D,L-fluorotirosina, ya que esas colonias no producen la proteína represora TyrR. La transducción de tyrR en D2704 es complicada por el fenotipo de esta cepa (tyrA-, pheA-, \DeltatrpE-C) que requiere formalmente complemento con fenilalanina, triptófano y tirosina. La adición de tirosina al medio de crecimiento anularía la selección necesaria para la transducción de tyrR. Este problema se evitó sustituyendo la tirosina como complemento de crecimiento por p-hidroxifenilpiruvato, un producto intermedio que precede directamente a la tirosina en la ruta terminal de la tirosina. El complemento con p-hidroxifenilpiruvato requiere que la variante D2704 lleve a cabo una etapa de transaminación antes de sintetizar la tirosina. La transaminasa, codificada por tyrB es reprimida por la proteína TyrR en presencia de m-D,L-fluorotirosina. Por lo tanto, las colonias que son tyrR^{+} no serán capaces de transaminar el p-hidroxifenilpiruvato en presencia de m-D,L-fluorotirosina. Las colonias de tyrR- deseadas podrán crecer puesto que la ausencia de la proteína TyrR excluye la represión de la transcripción de
tyrB.

Las colonias que eran capaces de crecer en m-D,L-fluorotirosina se replicaron en placa, en placas con y sin el análogo con el fin de verificar la selección inicial de cepas que tuvieran la mutación tyrR. También se ensayó el crecimiento en ausencia de triptófano, tirosina y fenilalanina para verificar la presencia continua de las mutaciones tyrA, pheA, \DeltatrpE-C. Se aislaron tres mutantes tyrR, KAD26B, KAD27C y KAD29B, junto con una cepa, KAD25A, que ya no requería complemento de tirosina para crecer.

Las actividades de las cepas mutantes tyrR se compararon con la cepa de control D2704 (Tabla 5) para determinar los niveles de desrepresión después de eliminar la regulación.

TABLA 5 Actividades de la siquimato quinasa de las cepas tyrR respecto a D2704

Actividad de la siquimato quinasa de D2704 = 0,0023 unidades mg^{-1}. Una unidad se define como un \mumol de producto formado por min.

Cepa	Siquimato quinasa
D2704 (tyrR+)	1
KAD27C (tyrR-)	39
KAD29B (tyrR-)	52

Se encontró que KAD27C y KAD29B eran 39 veces y 52 veces desreprimidos respectivamente cuando se comparaban con D2704. Se eligió KAD29B como la cepa para uso posterior ya que tiene la actividad de siquimato quinasa in vivo más alta de los aislados tyrR-.

Ejemplo 2 Construcción de plásmidos que codifican aroA, aroC y aroB

Las secuencias de aroA, aroC y aroB se analizaron mediante el programa de ordenador PC Gene, para encontrar los sitios de restricción que se podían usar para flanquear los genes individuales. Se eligieron los sitios de corte de enzimas de restricción que flanquean para evitar la digestión con la enzima de restricción de los genes estructurales que codifican aroA, aroC y aroB. Se eligió EcoR I como el sitio para flanquear el casete entero ya que dentro de serA hay un EcoR I natural. Primero se puso el promotor tac en el casete, directamente delante del fragmento aroA, ya que carece de un promotor nativo. La secuencia que codifica aroC se puso la segunda después de aroB y el marcador de resistencia de la kanamicina.

Se usó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para montar el casete sintético. Los cebadores se diseñaron para que tuvieran una secuencia de reasociación de 19-20 bases con el gen que se iba a amplificar. Se unieron bases adicionales al extremo 5' de cada cebador para proporcionar los sitios de restricción convenientes para construir el casete sintético (Tabla 6).

Los cebadores se usaron para amplificar las regiones más cortas posibles que contuvieran todavía a los promotores, sitios de unión del ribosoma y secuencias de terminación de la transcripción naturales en los extremos de los genes. En la Figura 21 se muestra la situación de los promotores nativos y paradas transcripcionales en el casete.

TABLA 6 Cebadores PCT

Gen	Cebador nº	Secuencia
aroA	914	Xbal
(cabeza)	ID SEC Nº: 1	5' GCTCTAGAGCTATTTCTGTTGTAGAGAGTT3'
aroA	915	Kpnl
(cola)	ID SEC Nº: 2	5' GTGGTACCCCATTTATTGCCCGTTGTTCAT3'
aroC	916	Kpnl
(cabeza)	ID SEC Nº: 3	5' GTGGTACCCCGAACAATATCCGGATGTTCC3'
aroC	917	Ascl
(cola)	ID SEC Nº: 4	5' GGCGCGCCCCGGCACAGGTTGGGTTAT3'
aroB	925	Ascl
(cabeza)	ID SEC Nº: 5	5' GGCGCGCCACGAATCCGCTGTATGAAGA3'
aroB	926	SalI
(cola)	ID SEC Nº: 6	5' CACCGTCGACACCATTAACACCCCACTAAA3'

Amplificación de aroA

Se usó el plásmido pKD501, un derivado de pAT153, como fuente del gen aroA. Se diseñaron los cebadores 914 (ID SEC Nº: 1, pares de bases que se extienden de 1465 a 1484) (Tabla 6) y 915 (ID SEC Nº: 2, pares de bases que se extienden de 2775 a 2794) para amplificar un fragmento de 1329 pares de bases que contiene la secuencia que codifica aroA. Se añadieron regiones flanqueadoras del ADN a los cebadores para incorporar los sitios de restricción Xba I y kpn I en la cabeza y la cola del gen respectivamente. Puesto que forma parte de un operón con serC, la transcripción de aroA va desde el promotor de serC situado 1250 bases corriente arriba de aroA. Como resultado, el fragmento de la PCR de aroA amplificado no contenía un promotor nativo. Hay una secuencia de terminación independiente de rho directamente entre el extremo de la secuencia que codifica serC y el inicio del gen aroA (pares de bases 1440 a 1464). Usando la PCR, se puede eliminar la secuencia de terminación. La PCR usando pKD501 como molde circular y los cebadores descritos, dio como resultado una banda de 1,3 kb tras el análisis por electroforesis en gel de agarosa. La secuencia codificante de aroA se aisló de la mezcla de reacción bruta de la PCR insertando el fragmento aroA de 1,3 kb en el sitio Xba 1/Kpn I del vector pSU19 formando el plásmido pKAD69 (Figura 22).

Amplificación de aroC

La búsqueda corriente arriba de la secuencia que codifica aroC no ha permitido identificar ninguna correspondencia exacta de las secuencias de consenso del promotor de E. coli -35 y -10. Sin embargo se han identificado dos secuencias putativas con homología limitada. Puesto que no se ha verificado ninguna de las secuencias experimentalmente, los cebadores de la PCR se diseñaron para incluir ambas secuencias. Se diseñaron los cebadores 916 (ID SEC Nº: 3, pares de bases que se extienden de 335 a 355) (Tabla 6) y 917 (ID SEC Nº: 4, pares de bases que se extienden de 1658 a 1676) para amplificar un fragmento aroC de 1341 pares de bases del plásmido pGM602, un derivado de pAT153 de 4,8 kb. Este fragmento aroC incluía una potencial repetición invertida (pares de bases de 1601 a 1629) característica de una secuencia de terminación independiente de rho. Se añadieron las secuencias flanqueadoras del ADN a los cebadores para incorporar los sitios de restricción Kpn I y Asc I en la cabeza y cola del gen, respectivamente. Varios intentos para amplificar aroC directamente del molde de pGM602 circular no dieron la banda de 1,3 kb esperada tras análisis por electroforesis en gel de agarosa. El uso de la PCR usando un molde aroC de 1,7 kb, aislado de pGM602 usando una doble digestión con EcoR I/Sal I, dio como resultado la banda esperada de 1,3 kb.

La clonación del fragmento de PCR aroC se complica por el hecho de que Asc I no es un sitio de restricción en ninguno de los vectores disponibles en el comercio. Este problema se evitó aprovechando los extremos romos que típicamente tienen los productos de la PCR. Específicamente, la digestión del producto de la PCR aroC sólo con Kpn I dio un fragmento con un extremo Kpn I y un extremo romo. Después este fragmento se unió al extremo Kpn I/extremo romo del vector linearizado pBluescript KS^{+} para generar pKAD70 (Figura 23).

Amplificación de aroB

Se diseñaron los cebadores 925 (ID SEC Nº: 5, pares de bases que se extienden de 295 a 314) (Tabla 6) y 926 (ID SEC Nº: 6, pares de bases que se extienden de 1619 a 1638) para amplificar un fragmento con aroB de 1343 pares de bases del plásmido pJB14, un derivado de pKK223-3 de 6,5 kb. Este fragmento incluía el promotor nativo y una repetición invertida corriente abajo del gen aroB capaz de formar una estructura de tallo-lazo característica del terminador independiente de rho. Se añadieron secuencias flanqueadoras a los cebadores para incorporar los sitios de restricción Asc I y Sal I en la cabeza y cola del gen, respectivamente. La amplificación de aroB usando los cebadores de la PCR descritos dio como resultado la banda de 1,3 kb esperada tras análisis por electroforesis en gel de agarosa.

Igual que aroC, la clonación del fragmento con aroB se complica por el hecho de que Asc I no es un sitio de restricción en ninguno de los vectores disponibles en el comercio. Para clonar satisfactoriamente el producto de la PCR aroB, el sitio Asc I de aroB se unió al sitio Asc I de aroC de pKAD70 (Figura 24), formando un fragmento Kpn I/extremo romo. El fragmento con aroCaroB se clonó en los sitios Kpn I/Sma I de pBluescript KS^{+} para formar pKAD68 (página 24).

Los plásmidos que contenían los productos aislados de la PCR se transformaron en las correspondientes cepas mutantes auxótrofas y se comprobó su capacidad para crecer en glucosa sin complemento aromático. El plásmido pKAD68 que contenía el inserto aroC aroB, se transformó tanto en AB2849aroC como AB2847aroB. El plásmido pKAD69, que llevaba un inserto aroA, se transformó en AB2829aroA. El plásmido pKAD70, que tenía el locus de aroC, se transformó en AB2829aroC. Todos los plásmidos complementaron satisfactoriamente su correspondiente cepa auxótrofa permitiéndoles crecer en placas con M9/glucosa que carecen de complemento de aminoácidos.

Aunque la complementación de los mutantes auxótrofos por los plásmidos aislados de la PCR sugería que se habían clonado los genes funcionales, se midieron las actividades enzimáticas de cada cepa huésped D2704 transformada con el respectivo plásmido y se comparó con la actividad enzimática de la cepa huésped para verificar la sobreexpresión. Se encontró que todos los plásmidos sobreexpresaban significativamente sus actividades enzimáticas comparado con la cepa de control D2704. Los plásmidos pKAD68 y pKAD70 se clonan en pBluescript KS^{+} de alto número de copias, un derivado de los plásmidos pUC, dando como resultado una sobreexpresión muy alta de las enzimas codificadas.

Ejemplo 3 Síntesis del casete

La clonación de los productos de la PCR produjo los plásmidos pKAD69, que contenía aroA y pKAD68 que contenía un fragmento aroC aroB. El aroA y los fragmentos aroB aroC se unieron secuencialmente a una secuencia promotora tac y un fragmento que codifica kan para montar el casete sintético completo (Figura 21).

Para flanquear el promotor tac con los sitios de restricción EcoR I y Xba I necesarios requeridos para su colocación en el casete, se aisló un promotor tac de 0,3 kb del plásmido pDR540 como un fragmento EcoR I BamH I y se unió en los sitios EcoR I BamH I de pSU18 para formar pKAD49 (Figura 25).

El plásmido pMB2190 se usó como fuente del gen marcador que expresaba la aminoglicósido 3'-fosfotransferasa (kan), que le confería resistencia a la kanamicina. Debido a que el plásmido pMB2190 contiene kan en un fragmento Pst I, fue necesaria una serie de pasos para flanquear el locus kan con los sitios Sal I y EcoR I. Se preparó el plásmido pTRC99A-E modificando el sitio EcoR I de pTRC99A por digestión con EcoR I, tratamiento del fragmento linearizado con nucleasa de judía mungo y posterior unión con ligasa T4. Se llevó a cabo la reinserción de un sitio EcoR I en pTRC99A-E en el extremo opuesto del sitio de clonación múltiple mediante digestión del plásmido con Hind III, formación de extremo romo con nucleasa de judía mungo y unión de los conectores de EcoR I sintéticos para formar pKAD61. El gen marcador kan se quitó del plásmido pMB2190 como un fragmento Pst I y se unió al sitio único de Pst I de pKAD61 formando pKAD62A (Figura 26). El fragmento kan en pKAD62A ahora estaba flanqueado por los sitios Sal I y EcoR I necesarios para la construcción del casete sintético.

Se construyó un plásmido que contenía un fragmento tac aroA eliminando tac de pKAD49 en forma de un fragmento EcoR I Xba I y aroA de pKAD69 en forma de un fragmento Xba I Kpn I. Los dos genes se unieron en los sitios EcoR I Kpn I de pSU18 formando el plásmido pKAD73 de 3,9 kb (Figura 27).

Se construyó un plásmido que contenía un fragmento aroC aroB kan eliminando el fragmento aroC aroB de pKAD68 en forma de un fragmento Kpn I Sal I y kan de pKAD62 en forma de un fragmento Sal I EcoR I. Los dos fragmentos se unieron en los sitios Kpn I EcoR I de pSU19 formando pKAD74 (Figura 28).

El casete entero se reconstruyó quitando el fragmento tac aroA de pKAD73 usando una digestión con EcoR I Kpn I y el fragmento aroC aroB kan de pKAD74 usando una digestión con Kpn I EcoR I. La unión de los fragmentos en el sitio EcoR I de pSU18 dio los plásmidos pKAD72A y pKAD72B (Figura 29).

Ejemplo 4 Inserción del casete sintético en el genoma

La inserción prevista del casete sintético en la copia genómica de serA en la cepa KAD29B requería la construcción de un plásmido que contuviera el casete sintético flanqueado por el ADN de serA. Se aisló el gen para serA del plásmido pD2625, obtenido de Genencor International, en forma de un fragmento EcoR V/Dra I de 1,9 kb. Ambas enzimas de restricción dieron como resultado extremos romos que permiten introducir el fragmento en el sitio Sma I de extremo romo del vector p34E^{27} para formar el plásmido pKAD63. El fragmento serA se sacó de pKAD63 en forma de un fragmento Sph I y se unió en el sitio Sph I del plásmido pMAK705 sensible a la temperatura, formando pKAD76A (Figura 30).

La clonación del casete sintético en el sitio EcoR I de SerA en pKAD76A era complicada por el hecho de que hay otros dos sitios EcoR I en el plásmido (Figura 31). Por lo tanto, se llevó a cabo una digestión parcial de pKAD76A con EcoR I, creando un fragmento lineal de 7,4 kb, en el que se unió el casete sintético, aislado de pKAD72A en forma de un fragmento EcoR I. El plásmido resultante de 12,9 kb, pKAD80A (Figura 31), contenía el casete sintético flanqueado por porciones del gen serA en un vector huésped que contenía un replicón sensible a la temperatura.

El casete sintético se insertó en el genoma de KAD29B usando recombinación homóloga en serA. Las células competentes KAD29B se transformaron en pKAD80A y la integración del plásmido en el genoma se seleccionó a 44ºC. Se aislaron once cointegrados de esta forma después de una serie de transformaciones. La escisión del plásmido del genoma se llevó a cabo haciendo crecer cointegrados a 30ºC en un medio LB sin fármacos. Se llevaron a cabo dos ciclos más de crecimiento a 30ºC, diluyendo los cultivos (1:20.000) en un medio LB reciente sin antibióticos. El crecimiento de la cepa cointegrada a una temperatura que permitía la replicación del plásmido (30ºC) crea un entorno inestable para el plásmido integrado y se produce un segundo suceso de recombinación que permite la escisión del plásmido del genoma. Se produce recombinación tal que el plásmido es escindido con su inserto de casete sintético original o con una secuencia de serA intacta. El crecimiento posterior en cultivo líquido a 44ºC dio como resultado la pérdida de plásmidos escindidos de la progenie.

Finalmente, las colonias se seleccionaron de acuerdo con la resistencia a la kanamicina y sensibilidad al cloranfenicol a 44ºC para identificar las células que habían retenido el marcador kan y escindido el marcador plasmídico cm del genoma. Se identificaron dos de dichas colonias (KAD1D y KAD11D) y se caracterizaron mejor. Las preparaciones de ADN plasmídico confirmaron que no permanecía ADN plasmídico en las cepas KAD1D y KAD11D.

Para confirmar que el casete se había insertado en el genoma de la cepa KAD29B en serA, se llevó a cabo una hibridación Southern. Se preparó el ADN genómico a partir de las cepas KAD29B, KAD1D y KAD11D y la digestión de las muestras de ADN se sometió a electroforesis en gel de agarosa. El ADN del gel se transfirió a una membrana Nytran y se trató con una sonda marcada con ^{32}P del fragmento de serA Pvu II/Kpn I de 1,1 kb. Los fragmentos marcados resultantes observados en la autorradiografía confirmaron que la inserción genómica específica del casete sintético se produjo en serA en KAD1D. Una banda extra observada en la digestión triple con Kpn I/Pvu II/Asc I del ADN genómico de KAD11D corresponde al ADN digerido de forma incompleta en el que se insertó el casete sintético en serA. Puesto que todas las demás digestiones de KAD11D eran correctas, se supuso que el casete sintético se había insertado en el gen serA de KAD11D. Sin embargo, debido a la banda extra en la muestra de KAD11D, el análisis de las cepas con inserción genómica se centró en la cepa KAD1D.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Frost, John W.

\hskip3.9cm

Snell, Kristi D.

\hskip3.9cm

Frost, Karen M.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Desbloqueo de las rutas comunes de la síntesis de aminoácidos aromáticos

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 6

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Barnes & Thornburg

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 11 South Meridian St.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Indianápolis

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Indiana

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 46204

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA DE LECTURA EN EL ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC compatible IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: Desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: adjunta

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Lammerts, Steven R.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 27653

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 3220-25621

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (317) 231-7258

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: (317) 231-7433

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTCTAGAGC TATTTCTGTT GTAGAGAGTT

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(3) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGGTACCCC ATTTATTGCC CGTTGTTCAT

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(4) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGGTACCCC GAACAATATC CGGATGTTCC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(5) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCGCGCCCC GGCACAGGTT GGGTTAT

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(6) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCGCGCCAC GAATCCGCTG TATGAAGA

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(7) INFORMACIÓN PARA EL ID SEC Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACCGTCGAC ACCATTAACA CCCCACTAAA

\hfill

30

Claims (7)

1. Un procedimiento para producir un compuesto aromático de forma biocatalítica en una célula procariota transformada por la ruta común de la biosíntesis de aminoácidos aromáticos endógena de una célula transformada tyrR^{-}, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de

cultivar la célula transformada tyrR^{-} en un medio que contiene una fuente de carbono asimilable en condiciones que conducen a la asimilación de dicha fuente de carbono, comprendiendo dicha célula transformada tyrR- secuencias de ADN exógeno, integradas en el genoma de la célula y que codifican especies enzimáticas de la ruta común, consistiendo esencialmente dichas especies enzimáticas en las enzimas 3-deshidroquinato sintasa, siquimato quinasa, 5-enolpiruvoilsiquimato-3-fosfato sintasa y corismato sintasa.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la célula transformada comprende además secuencias de ADN exógeno que codifican la enzima transcetolasa y 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato sintasa.

3. Una E. coli tyrR- transformada caracterizada por la expresión de genes estructurales exógenos que codifican las especies enzimáticas 3-deshidroquinato sintasa, siquimato quinasa, 5-enolpiruvoilsiquimato-3-fosfato sintasa y corismato sintasa, en la que dichas secuencias de ADN exógeno son integradas en el genoma de la célula.

4. La E. coli transformada de la reivindicación 3, que se caracteriza además por la mayor expresión de las especies enzimáticas transcetolasa y 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato sintasa.

5. Un procedimiento para producir un compuesto aromático de forma biocatalítica a partir de una fuente de carbono, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de cultivar la célula transformada de la reivindicación 4 en un medio que contiene una fuente de carbono asimilable en condiciones que conducen a la asimilación de dicha fuente de carbono.

6. Un procedimiento para producir un compuesto aromático de forma biocatalítica en una célula procariota transformada tyrR- que tiene una mayor expresión de la siquimato quinasa, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de

cultivar la célula transformada en un medio que contiene una fuente de carbono asimilable en condiciones que conducen a la asimilación de dicha fuente de carbono, comprendiendo dicha célula transformada secuencias de ADN exógeno, integradas en el genoma de la célula y que codifican especies enzimáticas de la ruta común, consistiendo esencialmente dichas especies enzimáticas en las enzimas 3-deshidroquinato sintasa, 5-enolpiruvoilsiquimato-3-fosfato sintasa y corismato sintasa.

7. Una E. coli tyrR- transformada que se caracteriza por la expresión de genes estructurales exógenos que codifican las especies enzimáticas 3-deshidroquinato sintasa, 5-enolpiruvoilsiquimato-3-fosfato sintasa y corismato sintasa, en la que dichas secuencias de ADN exógeno se integran en el genoma de la célula.