EP0904404A2 - Verwendung extrem thermophiler dna-polymerasen - Google Patents

Verwendung extrem thermophiler dna-polymerasen

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EP0904404A2
EP0904404A2 EP97915455A EP97915455A EP0904404A2 EP 0904404 A2 EP0904404 A2 EP 0904404A2 EP 97915455 A EP97915455 A EP 97915455A EP 97915455 A EP97915455 A EP 97915455A EP 0904404 A2 EP0904404 A2 EP 0904404A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dna polymerase
dna
chain extension
temperature
primer
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP97915455A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Jürgen BLUSCH
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Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Original Assignee
Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH filed Critical Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Publication of EP0904404A2 publication Critical patent/EP0904404A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Definitions

  • the invention relates to a method for cycle sequencing of DNA with a marker substituted dideoxynucleotides using extremely thermophilic DNA polymerases and a new use of extremely thermophilic DNA polymerases.
  • the sequence analysis of DNA has meanwhile become an indispensable tool for basic research as well as for laboratory diagnostics and is routinely used.
  • the sequencing protocols are based almost exclusively on the Sanger chain termination method using radioactive or fluorescent markers to label the DNA chains. Different companies offer a variety of different sequencing protocols.
  • the Applied Biosystems (ABI) protocol is used particularly frequently for non-radioactive sequencing using dye-labeled dideoxy terminators (dye-dideoxy terminators).
  • the DNA polymerases When sequencing using dye-dideoxy terminators, the DNA polymerases copy the DNA template to be sequenced in a primer-dependent manner.
  • the chain termination is achieved by incorporating ddNTPs, each of which is labeled with a different fluorescent dye (dye).
  • ddNTPs each of which is labeled with a different fluorescent dye (dye).
  • This enables the DNA sequence to be separated into a single lane, while, according to Sanger's classic DNA sequencing method, which uses unlabeled ddNTPs and which carries out chain labeling by incorporating radioactively labeled ⁇ -dATP or fluorescent primers Four-lane system and for single-lane analysis
  • thermolabile DNA polymerases for example the T7 DNA polymerase
  • T7 DNA polymerase thermolabile DNA polymerases
  • This protocol gives excellent results for many applications; however, it is disadvantageous that large amounts of template DNA (about 5 ⁇ g plasmid DNA per reaction) are necessary. This disadvantage is particularly evident in the direct sequencing of PCR products. Insurmountable difficulties often arise when sequencing GC-rich templates. In contrast, less than 1/5 of template DNA is required for cycle sequencing using DNA polymerases from extremely thermophilic organisms. This method comprises various cycles of denaturation, annealing of the sequencing primer and chain extension with subsequent incorporation of the ddNTPs.
  • this last-mentioned step is carried out at 60 ° C., which leads to significantly better results when sequencing GC-rich DNA sequences and DNA with secondary structures than the protocols which use a single cycle at 37 ° C. .
  • the temperature of 60 ° C. used in the protocols according to the prior art is far below the optimal synthesis temperature of extremely thermostable DNA polymers.
  • dye primer protocols can use the optimal chain extension temperature of 72 ° C.
  • they require the costly special synthesis of fluorescence-labeled primers: in the case of a 4-lane method, 1 primer, for carrying out 1-lane analysis, even 4 primers.
  • 1 primer for carrying out 1-lane analysis, even 4 primers.
  • 4 parallel reactions with one ddNTP each have to be set up, which additionally increases the time and cost.
  • Protocols for dye primer sequencing "described nen companies for different, extremely thermostable DNA polyvinyl lymerasen Examples of such protocols are the ABI / Perkin Elmer, the AmpliTaq.” From various - ver ⁇ turns and AmpliTaqFS “of Amersham using Thermosequenase "or from Epicenter using Sequitherm R -DNA polymerase.
  • the present invention provides a new use of extremely thermostable DNA polymerases. Preferred embodiments are characterized in more detail in the subclaims.
  • the extremely thermostable DNA polymerases that can be used according to the invention are DNA deoxynucleotidyl transferases, EC2.7.7.7.
  • the following extremely thermostable DNA polymerases can preferably be used:
  • AmpliTaq R Perkin Elmer: strain Thermus aquaticus YT1; Taq R DNA polymerase (Gibco): isolated from Thermus aquati ⁇ cus. Strain YT1;
  • Tth DNA polymerase (Boehringer): E.C.2.7.7.7, isolated from Thermus thermophilus HB8;
  • Pwo R -DNA polymerase (Boehringer): EC2.7.7.7, from Pyrococcus woesei;
  • Deep Vent R DNA polymerase DNA polymerase gene from Pyrococcus species, isolate GB-D, expressed in E. coli;
  • Vent R exo ⁇ DNA polymerase (New England Biolabs): exo " DNA polymerase gene from Thermococcus litoralis expressed in E. coli;
  • Replitherm R -DNA polymerase (Epicenter): not from T. aqua ⁇ ticus;
  • Tf1 DNA polymerase (Epicenter): isolated from Thermus flavus;
  • Pfu DNA polymerase (Stratagene): from Pyrococcus furiosus, expressed in E. coli, strong 3 '-5' exonuclease;
  • DNA polymerase without 5 * -3 'exonuclease.
  • Sequences longer than 500 bases were with Sequitherm R -DNA polymerase for the standard primer / template pair pS71JB / "ß-gal forward" after improvement of the dNTP / dyeddNTP ratio at a chain extension temperature of 72 "C for 2 minutes
  • a total of 21 ⁇ l final volume were combined: 0.5 ⁇ g template, 10 pmol primer, 2 ⁇ l 5xTACS buffer, 1 ⁇ l 30 mM MgCl 2 , 0.1 ⁇ l 6 mM dITP / each 2 mM dATP / dTTP / dCTP / dGTP, 1 ⁇ l ABI nucleotide mix, 0.5 ⁇ l DyeddA / DyeddG / DyeddT, 0.25 ⁇ l DyeddC, 2.5 U enzyme and water to a final volume of 21 ⁇ l.
  • the PCR protocol SeqT580 was used Elongation conditions of 72 ° C for 2 minutes.
  • FIGURE 2 is a diagrammatic representation of FIGURE 1
  • Sequences of over 500 bases could be obtained with Tth-DNA polymerase for the standard primer / template pair pS71JB / " ⁇ -gal forward" at a chain extension temperature of 72 ° C for 2 minutes.
  • a total of 21 ⁇ l final volume was combined: 0.5 ⁇ g template, 10 pmol primer, 4 ⁇ l 5xTACS buffer, 1 ⁇ l 30 mM MgCl 2 , 2 ⁇ l each 500 ⁇ M dITP / dATP / dTTP / dCTP / 100 ⁇ M dGTP, 1 ul ABI nucleotide mix, 0.5 ul DyeddA / Dyeddg, 0.25 ⁇ lDyeddC, "2.5 U enzyme and water to a final volume of 21 ul.
  • the SequiTherm R DNA polymerase was PCR Protocol Modified SeqT580 to elongation conditions of 72 ° C for 2 minutes.
  • FIGURE 3 is a diagrammatic representation of FIGURE 3
  • FIGURE 4
  • FIGURE 5
  • Fig. 5a the result of the reaction when using the PCR protocol SeqT580 with 2 minutes at 72 ° C
  • Fig. 5b when using the protocol proposed by ABI at a chain extension temperature of 60 ° C for 4 minutes (25 Zy ⁇ klen 15 sec. 95 ° C / 15 sec. 50 ° C / 4 min. 60 ° C).
  • FIGURE 6 is a diagrammatic representation of FIGURE 6
  • Parameters for transferring the sequencing protocols to other primer / template pairs by adapting the transfer from the annealing to the chain extension temperature a) longer annealing times at a lower temperature.
  • the temperature and the duration of the primer annealing step were changed from 15 seconds at 50 ° C. to 30 seconds at 45 ° C.
  • reaction mixture was then purified by pheol extraction or CTAB precipitation.
  • the PCR cycle used for the subsequent experiments was designated SeqT580 and consists of 5 cycles 95 ° C-15 seconds / 50 ° C-15 seconds / 80 ° C-7 seconds / 30 cycles at 95 ° C-15 Sec / 50 ° C - 15 sec / 70 ° C-2 min.
  • cycle sequencing using dye terminators with the Sequitherm R -DNA polymerase was also possible according to the invention even at chain extension temperatures above 60 ° C.
  • the reaction conditions can be optimized by routine tests so that the amount of template and concentration of dye terminators normally used can be reduced by half. Rapid CTAB purification is made possible by reducing the amount of dye terminators.
  • the dye terminator concentrations for both DNA polymerases can be drastically reduced if the dNTP concentration and the PCR cycle have been coordinated.
  • sequences with more than 500 bases were obtained when 1 ⁇ l ABI dNTP mix (0.75 mM dITP, each 0.15 mM dATP / dTTP / dCTP) / 0.1 ⁇ l 6 mM dITP / 0.5 mM dATP / dTTP / dCTP / 0.1 mM dGTP together with 0.5 ⁇ l of dye-AGT / 0.25 ⁇ l of DyeC were added.
  • the corresponding concentrations for the first test series are approximately 64 ⁇ M for dITP / 17 ⁇ M dATP / -dCTP / dTTP / 0.48 ⁇ M dGTP; for the second test series 178.5 ⁇ M for dITP / 54.75 ⁇ M for dATP / dCTP / dTTP / 2, 4 ⁇ M dGTP and for the third experimental series 321.4 ⁇ M for dITP / 102.3 ⁇ M for dATP / dCTP / dTTP / 4, 8 ⁇ M dGTP).
  • the Mg 2 * requirement was systematically tested for the Sequitherm R -DNA polymerase. 0.5, 1, 2, 3, 5 and 10 ul 30 mM MgCl 2 (final concentrations of about 2, 3.4, 4.85, 6.3 and 9.1 mM, respectively) were added, with the rest of the basic Protocol remained unchanged. The best results were obtained in the range of 1-5 ⁇ l 30 mM MgCl 2 , with only a slight deterioration being obtained when 0.5 ⁇ l 30 mM MgCl 2 was added. For the Tth polymerase, the reaction was successful even in experiments with 1 and 10 ⁇ l 30 mM MgCl 2 and even without MgCl 2 .
  • both polymerases tolerated broad magnesium chloride concentrations under the given reaction conditions.
  • the optimum here is about 2.5 mM, for the AmpliTaq "- and the Tth-DNA polymerase at ⁇ 2 mM MgCl 2 .
  • thermophilic DNA polymerases thus show similar temperature optima as for PCR, but without achieving the reaction rate of classic PCR.
  • the detergents Tween “20 and TritonX R and the" co-solvents "DMSO and glycerin were used to improve the PCR and the DNA sequencing, whereby the thermal stability of the template DNA double helix is partially influenced DNA sequencing with AmpliTaq R -DNA polymerase additives used at 60 ° C were also tested for the Sequitherm "and Tth-DNA polymerase at 72 ° C. The results show that the additives usually used do not further improve the sequencing result with the Sequitherm "and Tth DNA polymerases for the primer / template pair used.
  • thermostable DNA polymerases during cycle sequencing with dye terminators also at chain extension temperatures of over 60 ° C., in particular at temperatures in the range from 70 ° C. to 75 ° C, optimally at 72 ° C, can be used.
  • the Sequitherm and Tth DNA polymerase are particularly preferably used according to the invention.
  • other extremely thermophilic DNA polymerases known per se can also be used.
  • the test conditions for cycle sequencing with dye terminators can be optimized in the usual way. These are routine changes known to the person skilled in the art of the cycle sequencing method with dye terminators, wherein according to the invention temperatures of over 60 ° C. are used for the chain extension.
  • Concentration of the extremely thermophilic DNA polymerase PCR conditions in particular the conditions for primer annealing and the transition conditions from primer annealing to the chain extension temperature, which are always above 60 ° C., preferably in the optimal range from 70 ° C. to 75 ° C. appropriate selection of additives for stimulating primer annealing, chain extension and enzyme activity, for example by adding PEG and stabilizers of the DNA structure such as spermidine.
  • the present invention shows for the first time that extremely thermostable DNA polymerases are generally capable of incorporating modified dideoxy nucleotides such as the dye terminators at temperatures> 60 ° C.
  • modified dideoxy nucleotides such as the dye terminators at temperatures> 60 ° C.
  • the results obtained make it clear that the transferability of the previous protocols, which can only work at 60 ° C., must be optimized by adapting the reaction conditions for the respective primer / template pair used.
  • the experiments with pS71JB2 / Primer 4612 at 60 ° C and 72 ° C show that a crucial point lies in the transition from annealing to chain extension.
  • thermosequenase R -DNA polymerase to the new cycle sequencing kit from ABI, which is offered with greatly reduced dye terminator concentrations using the AmpliTaqFS ".
  • additives such as Spermidine was even able to obtain sequences with the "AmpliTaq R DNA polymerase” detached from the Ampli Taq FS R.
  • easily transferable 60 ° C. protocols could be obtained with a reduced dye terminator requirement compared to the AmpliTaq "by simply adding Magnesium for Tth R - and Sequitherm "- DNA polymerases are established; As already indicated above, the reaction conditions for the AmpliTaq R DNA polymerase can also be greatly improved.
  • the invention describes parameters and additives for establishing and optimizing protocols using extremely thermophilic DNA polymerases and substituted nucleotides.
  • a finding which is particularly important in accordance with the invention and which is decisive for the implementation of the invention is that the following parameters have to be set in dependence on one another in order to sequence DNA sequencing with dideoxy nucleotides substituted with a marker at a temperature> 60 ° C. perform. These parameters are:
  • Reaction buffer Deoxy nucleotides; dideoxynucleotides substituted with a marker; Primer and template DNA; Additives;

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Abstract

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Zyklus-Sequenzierung von DNA mit Dye-Terminatoren offenbart, wobei extrem thermophile DNA-Polymerasen bei einer Kettenverlängerungstemperatur im Bereich von > 60 °C bis 80 °C verwendet werden. Weiterhin wird eine Verwendung extrem thermophiler DNA-Polymerasen bei Temperatur im Bereich von > 60 °C bis 80 °C offenbart.

Description

Verwendung extrem thermophiler DNA-Polymerasen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Zyklus-Sequenzierung von DNA mit einem Marker substituierten Didesoxynukleotiden unter Verwendung von extrem thermophilen DNA-Polymerasen sowie eine neue Verwendung extrem thermophiler DNA-Polymerasen.
Die Sequenzanalyse von DNA ist zwischenzeitlich zu einem uner¬ setzlichen Werkzeug sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die Labordiagnostik geworden und wird routinemäßig angewandt. Die Sequenzierungsprotokolle basieren dabei fast ausschließlich auf der Kettenabbruchsmethode von Sanger unter Verwendung von radioaktiven oder fluoreszierenden Markern zur Markierung der DNA-Ketten. Verschiedene Firmen bieten eine Vielzahl von unterschiedlichen Sequenzierungsprotokollen an. Besonders häufig wird das Protokoll der Fa. Applied Biosystems (ABI) zur nicht-radioaktiven Sequenzierung unter Verwendung von mit Farbstoffen markierten Didesoxyterminatoren (Dye-Di- desoxy-Terminatoren) angewandt.
Bei der Sequenzierung unter Verwendung von Dye-Didesoxy-Termi- natoren kopieren die DNA-Polymerasen die zu sequenzierende DNA-Matrize in einer primer-abhängigen Weise. Der Kettenab¬ bruch wird durch Einbau von ddNTPs erreicht, von denen jedes mit einem unterschiedlich fluoreszierenden Farbstoff (Dye) markiert ist. Hierdurch wird die Auftrennung der DNA-Sequenz in einer einzigen Spur ermöglicht, während nach der klassi¬ schen DNA-Sequenziermethode von Sanger, die unmarkierte ddNTPs verwendet und die die Kettenmarkierung durch den Einbau von radioaktiv markierten α-dATP- oder fluoreszierenden Primern durchführt, ein Vierspursystem und für die Einspuranalyse ein
ERSATZBLAH(REGEL26) aufwendiges 4-Primer-Verfahren notwendig ist.
Falls die Sequenzierungsreaktion in einem einzigen Zyklus bei 37°C durchgeführt wird, werden üblicherweise thermolabile DNA- Polymerasen, beispielsweise die T7-DNA-Polymerase, verwendet. Für viele Anwendungen ergibt dieses Protokoll ausgezeichnete Ergebnisse; es ist jedoch nachteilig, daß große Mengen von Template-DNA (etwa 5 μg Plasmid-DNA pro Reaktion) notwendig sind. Dieser Nachteil wird besonders deutlich bei der Direkt¬ sequenzierung von PCR-Produkten. Unüberwindbare Schwierigkei¬ ten ergeben sich häufig bei der Sequenzierung GC-reicher Tem¬ plates. Im Gegensatz dazu wird weniger als 1/5 an Template-DNA bei der Zyklus-Sequenzierung unter Verwendung von DNA-Polyme¬ rasen aus extrem thermophilen Organismen benötigt. Diese Me¬ thode umfaßt verschiedene Zyklen der Denaturierung, Annealing des Sequenzierungs-Primers und Kettenverlängerung mit an¬ schließendem Einbau der ddNTPs. Gemäß dem Stand der Technik wird dieser zuletzt genannte Schritt bei 60°C durchgeführt, was bei der Sequenzierung von GC-reichen DNA-Sequenzen und von DNA mit Sekundärstrukturen zu wesentlich besseren Ergebnissen führt als die Protokolle, die einen einzigen Zyklus bei 37°C benutzen. Die bei den Protokollen gemäß dem Stand der Technik benutzte Temperatur von 60°C liegt jedoch weit unterhalb der optimalen Synthesetemperatur extrem thermostabiler DNA-Polyme¬ rasen.
Im Gegensatz dazu können Dye-Primer-Protokolle die optimale Kettenverlängerungstemperatur von 72°C verwenden. Sie erfor¬ dern jedoch die kostspielige Sonder-Synthese fluoreszenzmar¬ kierter Primer: im Falle eines 4-Spurverfahrens von 1 Primer, für die Durchführung einer 1-Spuranalyse sogar von 4 Primern. In beiden Fällen müssen im Gegnsatz zur Dye-Terminatorsequen- zierung, die in nur einem Ansatz durchgeführt wird, 4 paralle¬ le Reaktionen mit jeweils einem ddNTP angesetzt werden, was den Zeit- und Kostenaufwand zusätzlich erhöht. Protokolle zur Dye-Primer-Sequenzierung werden von verschiede-" nen Firmen für unterschiedliche, extrem thermostabile DNA-Po¬ lymerasen beschrieben. Beispiele für solche Protokolle sind die von ABI/Perkin Eimer, das AmpliTaq"- und AmpliTaqFS" ver¬ wendet, von Amersham, das Thermosequenase" verwendet, oder von Epicentre, das SequithermR-DNA-Polymerase verwendet.
Bei Verwendung der Dye-Primer-Sequenzierung als 1-Spur-Technik ist es notwendig, vier verschiedene Primer mit unterschiedli¬ chen Farbmarkierungen zu versehen. Dies erhöht den Zeit- und Kostenaufwand der Sequenzierung jedoch entsprechend.
Aus dem Stand der Technik ist eine erfolgreiche Zyklus-Sequen¬ zierung unter Verwendung von Dye-Terminatoren bisher nur mit einer Kettenverlängerungstemperatur von 60°C bekannt, und zwar für die Enzyme AmpliTaq", AmpliTaqFSR, Thermosequenase", Sequi- therm" und Tfil-DNA-Polymerase. Protokolle für Temperaturen von über 60°C wurden für die Zyklus-Sequenzierung unter Verwendung von Dye-Terminatoren bisher nicht beschrieben.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Ver¬ fahren zur Zyklus-Sequenzierung von DNA unter Verwendung von Dye-Terminatoren bereitzustellen, das auch bei GC-reichen Se¬ quenzen einsetzbar ist und das bei oder nahe bei der optimalen Kettenverlängerungstemperatur arbeitet.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die im Anspruch 7 nä¬ her gekennzeichneten Merkmale gelöst. Bevorzugte Ausführungs¬ formen des Verfahrens gemäß Anspruch 7 sind in den Unteran¬ sprüchen gekennzeichnet.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung gemäß Anspruch 1 eine neue Verwendung extrem thermostabiler DNA-Polymerasen be¬ reit. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen näher gekennzeichnet. Die erfindungsgemäß einsetzbaren, extrem thermostabilen DNA- Polymerasen sind DNA-Desoxynukleotidyl-Transferasen, E.C.2.7.7.7. Bevorzugt sind die nachfolgenden extrem thermo¬ stabilen DNA-Polymerasen verwendbar:
AmpliTaqR (Perkin Eimer): Stamm Thermus aquaticus YT1; TaqR DNA-Polymerase (Gibco): isoliert aus Thermus aquati¬ cus. Stamm YT1;
SequithermR-DNA-Polymerase (Epicentre): speziell für das Zyklus-Sequenzieren entwickelte DNA-Polymerase; Tth-DNA-Polymerase (Epicentre): isoliert aus Thermus thermophilus;
Tth-DNA-Polymerase (Boehringer): E.C.2.7.7.7, isoliert aus Thermus thermophilus HB8;
Expand" High Fidelity (Boehringer): Mischung aus TaqR- und PwoR-DNA-Polymerase, E.C.2.7.7.7;
PwoR-DNA-Polymerase (Boehringer): E.C.2.7.7.7, aus Pyro- coccus woesei;
Deep VentR-DNA-Polymerase (New England Biolabs): DNA-Poly- merasegen aus Pyrococcus species, Isolat GB-D, exprimiert in E. coli;
9°N DNA-Polymerase (New England Biolabs): Thermococcus species, Stamm 9°N-7;
VentR exo~-DNA-Polymerase (New England Biolabs): exo"-DNA- Polymerasegen von Thermococcus litoralis exprimiert in E. coli;
ReplithermR-DNA-Polymerase (Epicentre): nicht aus T. aqua¬ ticus;
Goldstar" (Eurogentec) : DNA-Polymerasegen aus einer neuen Thermus-Species, exprimiert in E. coli;
Tf1-DNA-Polymerase (Epicentre): isoliert aus Thermus fla- vus;
Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene): aus Pyrococcus furiosus, exprimiert in E. coli, starke 3 ' -5' -Exonuklease;
Thermosequenase" (Amersham) : speziell für die Zyklusse¬ quenzierung entwickelte extrem thermostabile DNA-Polyme- rase;
AmpliTaq FSR (Perkin Eimer): mutierte Form von AmpliTaq"-
DNA-Polymerase, ohne 5 * -3' -Exonuklease.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugt werden die Sequitherm"- und TTh-DNA-Polymerase. Die Vorteile der Verwendung dieser Polyme- rasen bei der Zyklus-Sequenzierung unter Verwendung von Dye- Terminatoren sind u.a. wie folgt:
geringerer Bedarf an Template-DNA im Vergleich zum Ampli- taqR-DNA-Polymerase-Protokoll von ABI; geringere Enzymkosten durch Senkung der Enzymmenge; kürzere Reaktionszeiten und damit höherer Probendurch¬ satz; höhere Synthesetemperaturen bis 75°C, wodurch ein Arbei¬ ten mit höherer Spezifität und eine "optimale" Denaturie¬ rung der Template-DNA ermöglicht wird; bessere Ausnützung der Sequenzierungschemikalien und da¬ mit Senkung der Kosten.
Aus dem Stand der Technik ist bekannt, daß mitunter extrem Ge¬ reiche Sequenzen nicht in der PCR amplifiziert werden können und noch weniger der Sequenzanalyse zugänglich sind. Experi¬ mentell bedeutsam wurde in diesem Zusammenhang der Unterschied in der Kettenverlängerungstemperatur zwischen PCR und Zyklus¬ sequenzierung. Im Rahmen eines Forschungsprojekts konnte ein bestimmter Bereich aus dem menschlichen S71-Locus wohl in der PCR amplifiziert, aber die erhaltenen Fragmente nicht sequen¬ ziert werden. Ein Grund hierfür lag offensichtlich in der Ket¬ tenverlängerungstemperatur, die im Falle der PCR bei 72°C, in der Zyklussequenzierung hingegen bei 60°C liegt. Experimentell kann die thermische Stabilität bestimmter DNA-Sequenzen da¬ durch herabgesetzt werden, daß G- und C-Basen durch die weni¬ ger fest interagierenden Analoga 7-Deaza-G und 5-Methyl-C er¬ setzt werden. Der Versuch, mittels PCR Fragmente herzustellen, in denen alle G- und C-Positionen durch die Analoga ausge¬ tauscht sind, scheiterte am Einbau von 7-Deaza-dGTP. U.a. das Sequitherm-DNA-Polymerase-Protokoll verwendet jedoch dieses G-" Analogon in Nicht-Dye-Terminator-Reaktionen als alleinigen G- Baustein bei einer Kettenverlängerungstemperatur von 72°C, um Kompressionen auf Sequenzgelen zu unterdrücken.
Erfindungsgemäß wurde deshalb der Einbau von Dye-Terminatoren bei erhöhten Kettenverlängerungstemperaturen, d.h. bei Tempe¬ raturen > 60°C, versucht, wobei anfangs beispielhaft die Se- quithermR-DNA-Polymerase ausgewählt wurde.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Abbildungen näher erläutert. Die Abbildungen zeigen:
ABBILDUNG 1:
Optimiertes Protokoll für die Zyklussequenzierunq mit Sequi- thermR-DNA-Polymerase:
Sequenzen länger als 500 Basen wurden mit SequithermR-DNA-Poly- merase für das Standard Primer/Template-Paar pS71JB/"ß-gal forward" nach Verbesserung des dNTP/dyeddNTP-Verhältnisses bei einer Kettenverlängerungstemperatur von 72"C für 2 Minuten er¬ reicht. Hierbei wurden ad 21 μl Endvolumen vereint: 0,5 μg Template, 10 pMol Primer, 2 μl 5xTACS-Puffer, 1 μl 30 mM MgCl2, 0,1 μl 6 mM dITP / je 2 mM dATP/dTTP/dCTP/dGTP, 1 μl ABI-Nukleotid-Mix, je 0,5 μl DyeddA/DyeddG/DyeddT, 0,25 μl DyeddC, 2,5 U Enzym und Wasser zu einem Endvolumen von 21 μl. Verwendet wurde das PCR-Protokoll SeqT580 bei Elongationsbe- dingungen von 72°C für 2 Minuten.
ABBILDUNG 2:
Optimiertes Protokoll für die Zyklussequenzierunq mit Tth-DNA- Polymerase:
Sequenzen von über 500 Basen konnten mit Tth-DNA-Polymerase für das Standard Primer/Template-Paar pS71JB/"ß-gal forward" bei einer Kettenverlängerungstemperatur von 72°C für 2 Minuten erhalten werden. Hierbei wurden ad 21 μl Endvolumen vereint: 0,5 μg Template, 10 pMol Primer, 4 μl 5xTACS-Puffer, 1 μl 30 mM MgCl2, 2 μl je 500 μM dITP/dATP/dTTP/dCTP / 100 μM dGTP, 1 μl ABI-Nukleotid-Mix, je 0,5 μl DyeddA/Dyeddg, 0,25 μlDyeddC, " 2,5 U Enzym und Wasser zu einem Endvolumen von 21 μl. Wie für die SequithermR-DNA-Polymerase wurde das PCR-Protokoll SeqT580 auf Elongationsbedingungen von 72°C für 2 Minuten abgewandelt.
ABBILDUNG 3:
Standardzyklussequenzierung ohne (a) und mit (b) Zusatz von
Magnesium am Beispiel der ReplithermR-DNA-Polymerase:
Unter Verwendung der ermittelten Standardbedingungen (0,5 μg Template, 10 pMol Primer, 1/2 ABI Prämix, 0,5 μl je 500 μM dITP/dATP/dTTP/dCTP / 100 μM dGTP, 2,5 U Enzym, Wasser zu ei¬ nem Endvolumen von 21 μl, PCR-Protokoll SeqT580 mit 70°C Elon- gationstemperatur) wurde die ReplithermR-DNA-Polymerase ohne (a) und mit (b) Zusatz von 1 μl 30 mM MgCl2 für das Standard Primer/Template-Paar pS71JBl/"ß-gal forward" getestet.
ABBILDUNG 4:
Standardzyklussequenzierunq ohne (a) und mit (b) Zusatz von
Magnesium am Beispiel der Tf1-DNA-Polyτnerase:
Unter Verwendung der ermittelten Standardbedingung (0,5 μg Template, 10 pMol Primer, 1/2 ABI Prämix, 0,5 μl je 500 μM dITP/dATP/dTTP/dCTP / 100 μM dGTP, 2,5 U Enzym, Wasser zu ei¬ nem Endvolumen von 21 μl, PCR-Protokoll SeqT580 mit 70°C Elon- gationstemperatur) wurde die TF1-DNA-Polymerase ohne (a) und mit (b) Zusatz von 1 μl 30 mM MgCl2 für das Standard Primer/- Template-Paar pS71JBl/"ß-gal forward" getestet.
ABBILDUNG 5:
Standard-SequithermR-Zyklussequenzierunq mit Template-Primer¬ paar pS71JB2/Primer 4612 bei Elonqationstemperaturen von a) 72°C und b) 60"C:
Standard-Sequithermzyklussequenzierung mit Template-Primerpaar pS71JB2/Primer 4612 bei Elongationstemperaturen von a) 72°C und b) 60°C. Beide Reaktionen wurden nach dem erarbeiteten Standardprotokoll angesetzt (0,5 μg Template, 10 pMol Primer, 1/2 ABI Prämix, 0,5 μl je 500 μM dITP/dATP/dTTP/dCTP / 100 μM dGTP, 1 μl 30 mM MgCl2, 2,5 U SequithermR-DNA-Polymerase, Was- ser zu einem Endvolumen von 21 μl ) .
In Abb. 5a) ist das Ergebnis der Reaktion bei Verwendung des PCR-Protokolls SeqT580 mit 2 Minuten bei 72°C, in Abb. 5b) bei Verwendung des von ABI vorgeschlagenen Protokolls bei einer Kettenverlängerungstemperatur von 60°C für 4 Minuten (25 Zy¬ klen 15 Sek. 95°C/15 Sek. 50°C/4 Min. 60°C) gezeigt.
ABBILDUNG 6:
Parameter zur Übertragung der Sequenzierunqsprotokolle auf an¬ dere Primer/Template-Paare durch Anpassung des Überqans von der Annealinq- zur Kettenverlänqerunqstemperatur: a) längere Annealing-Zeiten bei niedrigerer Temperatur. In Abwandlung zum Standardprotokoll, beschrieben z. B. unter Abb. 5, wurden die Temperatur und die Dauer des Primerannealingschrittes von 15 Sek. bei 50°C auf 30 Sek. bei 45°C verändert.
b) Vorschaltung eines 60°C-Schrittes vor der Elongation.
Um den Übergang zwischen Annealing und Kettenverlängerung zu verlangsamen, wurde ein 10 Sek. 60°C-Schritt unter Beibehaltung aller anderer Parameter zwischengeschaltet.
c) Zugabe von Spermidin.
Im Unterschied zum Standardprotokoll wurde zur Unterstüt¬ zung der Primer/Template-Interaktion dem Reaktionsansatz 1/10 Vol. 30 mM Spermidin zugesetzt.
Zyklus-Sequenzierung bei Kettenverlänqerunqstemperaturen über 60°C:
I. Festlegung eines Basisprotokolls
Bei den ersten Versuchen wurde die SequithermR-DNA-Polymerase auf ihre Notwendigkeit für Magnesiumionen untersucht, um über¬ haupt Dye-Terminatoren bei der üblicherweise verwendeten Tem¬ peratur von 60°C einzubauen, wenn diese Polymerase mit dem ABI-Prämix kombiniert wurde. Es ist bekannt, daß Magnesiumio- " nen für DNA-Polymerasen essentiell sind. Zu diesem Zweck wurde das nachfolgende Sequenzierungsprotokoll von ABI durchgeführt und im folgenden abgewandelt:
Ad 21 μl Endvolumen werden vereint:
9 μl ABI Prämix (4 μl 5xTACS-Puffer / je 1 μl ABI-dNTP-Mix, DyeA,G,C,T)
10 pMol Primer
Template-DNA (1 μg Plasmid, < 0,5 μg PCR-Produkte) anstatt 0,25 μl AmpliTaqR-DNA-Polymerase wurden 0,5 μl Sequi- thermR-DNA-Polymerase verwendet.
Wasser ad 20 oder 21 μl
PCR-Zyklus in PE 9600 PCR-Maschine ohne Öl: Denaturieren 96°C 15 s Annealing 50°C 15 s
Kettenverlängerung 60°C 4 Min. 25 Zyklen
Anschließend wurde der Reaktionsansatz durch Pheolextraktion oder CTAB-Präzipitation gereinigt.
Das oben beschriebene Protokoll ergab jedoch nur unzureichende Ergebnisse.
Im Unterschied zu dem obigen Protokoll wurden nunmehr unter¬ schiedliche Magnesiumchloridkonzentrationen zugegeben. Paral¬ lel hierzu wurde der 10xSequithermR-Reaktionspuffer zusammen mit den Dye-Terminatoren und Nukleotiden des ABI-Kits gete¬ stet. Zufällig ausgewählte Plasmid-Templates, pS71JBl und pS71JB2, die Teile des S71-Locus enthalten, und ein künstlich hergestelltes 22 mer "ß-gal-forward" (CAGCTATGACCATGATTACGCC, Schmelztemperatur 53,9°C), das sich für auf pUC basierende Vektoren als Sequenzierungsprimer eignet, wurden als Modell¬ systeme ausgewählt. In diesen grundlegenden Experimenten wurde gefunden, daß die Zugabe von 1 μl 30 mM Magnesiumchlorid zum ABI-Prämix (in End¬ konzentration: 3,43 mM MgCl2) bei Verwendung der Sequitherm"- DNA-Polymerase den Einbau von Dye-Terminatoren bei einer Ket¬ tenverlängerungstemperatur von 60°C ermöglichte. Diese Versu¬ che wurden bei 65°C und 70°C wiederholt; bei einer Kettenver¬ längerungstemperatur von über 60°C wurde jedoch vermehrt ein vorzeitiger Kettenabbruch sichtbar. Die hierdurch beobachteten "überhöhten, abgeschnittenen" Peaks können auf eine große Men¬ ge an Template, ein ungeeignetes dNTP/Terminator-Verhältnis und/oder einen falschen PCR-Zyklus zurückzuführen sein. Durch Halbierung der Template-Menge (auf 0,5 μg Plasmid-Template) in Kombination mit 1/2, 1/3 und sogar 1/4 der Dye-Terminatoren wurden im Prinzip die gleichen Ergebnisse erhalten. Schlie߬ lich wurden stabile Ergebnisse dadurch erhalten, daß das dNTP/Dye-Terminator-Verhältnis austitriert wurde, wobei gefun¬ den wurde, daß sich dieses Verhältnis mit der Dauer der Ket¬ tenverlängerung ändert. Der für die nachfolgenden Versuche angewandte PCR-Zyklus wurde als SeqT580 bezeichnet und besteht aus 5 Zyklen 95°C-15 Sek./50°C-15 Sek./80°C-7 Sek./30 Zyklen bei 95°C-15 Sek./50°C-15 Sek.-/70°C-2 Min.. Zu diesem Zeitpunkt wurde der Einfachheit halber nicht die Konzentration jedes einzelnen Dye-Terminators titriert, sondern der gesamte ABI-Prämix. Um dies auszugleichen, wurden 5 Zyklen mit 7 Se¬ kunden mit einer Kettenverlängerungstemperatur von 80°C durch¬ geführt, um den weiterhin hohen Einbau der sehr hoch konzen¬ trierten DyeT- und DyeC-Terminatoren zu vermindern.
Aufgrund dieser Vorversuche wird das nachfolgende grundlegende Protokoll erstellt, das für die weiteren Optimierungen benutzt wurde:
Die nachfolgenden Bestandteile wurden zu einem Endvolumen von 21 μl vereinigt und dem obigen PCR-Zyklus unterzogen:
0,5 μg Plasmid-DNA als Template (am besten in Wasser re¬ suspendiert) , 10 pMol Primer,
4,5 μl ABI-Prämix (2 μl 5xTACS-Puffer, 0,5 μl eines jeden Dyes ddA/T/G/C, 0,5 μl ABI dNTP-Mix, der 750 μM dITP und je 150 μM dATP, dTTP, dGTP und dCTP enthält), 0,5 μl 500 μM von je dITP/dATP/dTTP/dCTP/100 μM dGTP, 1 μl 30 mM MgCl2,
0,5 μl SequithermR-DNA-Polymerase (5U) oder eine andere thermostabile DNA-Polymerase, dH20 ad 21 μl. PCR-Zyklus SeqT580 - wie oben beschrieben.
ABI-Prämix: 5xTACS-Puffer:
1 μl ddA* 400 mM Tris-HCl
1 μl ddG* 10 mM MgCl2
1 μl ddC* 100 mM (NH4)2 S04, ph 9,0
1 μl ddT*
1 μl dNTP-Mix
4 μl 5xTACS-Puffer
Nach Einstellung der Magnesiumionenkonzentration war erfin¬ dungsgemäß eine Zyklus-Sequenzierung mit Dye-Terminatoren mit der SequithermR-DNA-Polymerase auch bei Kettenverlängerungstem¬ peraturen über 60°C durchführbar. Die Reaktionsbedingungen sind durch Routineversuche so optimierbar, daß die üblicher¬ weise verwendeten Template-Menge und Konzentration an Dye-Ter¬ minatoren auf die Hälfte reduzierbar ist. Durch die Verringe¬ rung der Dye-Terminatoren-Menge wird eine schnelle CTAB-Auf- reinigung ermöglicht.
II. Optimierung der Verfahrensparameter
Die nachfolgenden Parameter wurden systematisch daraufhin ge¬ testet, in welcher Weise sie das Reaktionsgeschehen beeinflus¬ sen: Template/Primer-Paar pS71JBl/ß-gal-forward für SequithermR-, teilweise auch für Tth- und AmpliTaqR-DNA-Polymerasen: TACS, MgCl2, dNTP und Dye-Terminatoren-Erfordernis. Ergebnisse für optimierte Protokolle für Sequitherm*- und Tth-DNA-Polymerase sind in den Abbildungen 1 und 2 dargestellt.
TACS-Erfordernis
Ausgehend vom oben beschriebenen grundlegenden Protokoll, d.h. bei unveränderten PCR-Zyklus, Dye-Terminatoren, dNTP und Mg2*- Konzentration wurden unterschiedliche Konzentrationen an 5x TACS-Puffer von ABI getestet: Für die SequithermR-DNA-Polyme- rase eine Reihe von 0,5, 2, 3, 4, 6, 7 μl TACS bei einer Ket¬ tenverlängerungstemperatur von 70°C, für Tth-DNA-Polymerase bei einer Kettenverlängerungstemperatur von 72°C mit 0,5, 1, 2, 4, 7 μl TACS pro 21 μl Endvolumen (in Konzentrationen von 0,125x, 0,5x, 0,75x, lx, 1, 5x bzw. l,75x). Die besten Ergeb¬ nisse wurden für die Sequitherm-DNA-Polymerase zwischen 1 und 5 μl 5xTACS-Puffer erhalten; im Gegensatz dazu arbeitete die Tth-DNA-Polymerase über den gesamten Bereich an TACS-Konzen- trationen ohne merkliche Unterschiede.
Zusammenfassend tolerieren unter den gegebenen Versuchsbedin¬ gungen beide DNA-Polymerasen einen relativ breiten Bereich an 5xTACS-Puffer.
Dye-Terminatoren
In dieser Versuchsreihe wurde die Menge an Dye-Terminatoren bestimmt, die erforderlich ist, um eine zufriedenstellende Se¬ quenz zu erhalten. Die Versuche wurden mit SequithermR-DNA-Po- lymerase durchgeführt. Zunächst wurde im obenbeschriebenen grundlegenden Protokoll 1/2, 1/3 und 1/4 des ABI-Prämix ver¬ wendet. Sogar mit 1/4 des Prämix konnte eine lesbare Sequenz erhalten werden. Überraschenderweise erschienen die C- und T- Peaks - ihre entsprechenden Dye-Terminatoren sind im ABI-Prä- " mix hochkonzentriert - weiterhin als "überhöht und abgeschnit¬ ten", was auf eine zu hohe Konzentration hindeutet. Deshalb wurden die Versuche mit einer höheren dNTP-Konzentration ( 1 μl ABI dNTP-Mix plus 1 μl 0,5 mM dITP/dATP7dCTP/dTTP/0, 1 mM dGTP) und mit 0,5 und 2 μl-Zugabe von 5xTACS-Puffer und nur 25% Dye- T-, Dye-C-Terminatoren oder beiden Terminatoren zusammen durchgeführt. Sehr gute Ergebnisse konnten mit einer vermin¬ derten Dye-C-Konzentration erreicht werden. Im Gegensatz dazu wurde ohne zusätzlich Zugabe von Nukleotiden nur eine sehr mäßige Sequenzqualität erreicht, und zwar auch dann, wenn die verringerte Menge sowohl an Dye-C als auch Dye-T verwendet wurde. Die halbe Menge des ABI-Prämix wurde als Standardwert ermittelt.
Zusammenfassend können somit die Dye-Terminator-Konzentratio- nen für beide DNA-Polymerasen drastisch verringert werden, wenn die dNTP-Konzentration und der PCR-Zyklus aufeinander abgestimmt wurden.
Nukleotid-Erfordernis
Die nachfolgenden Versuche wurden mit SequithermR- und Tth-DNA- Polymerasen durchgeführt. Auf der Grundlage des oben beschrie¬ benen Protokolls wurden dann Sequenzen mit mehr als 500 Basen erhalten, wenn 1 μl ABI dNTP-Mix (0,75 mM dITP, je 0,15 mM dATP/dTTP/dCTP)/0, 1 μl 6 mM dITP/0,5 mM dATP/dTTP/dCTP/0, 1 mM dGTP zusammen mit je 0,5 μl Dye-AGT/0,25 μl DyeC zugegeben wurden. Bei Zugabe von 0,5 μl letzter Nukleotidmischung konn¬ ten weiterhin sehr lange Sequenzen erzeugt werden, wobei je¬ doch bei etwa den ersten 50 Basen die G-Termination unzurei¬ chend war, während mit 1 μl keine Sequenz-Leiter erhalten wur¬ de. (Die entsprechenden Konzentrationen sind für die erste Versuchsreihe etwa 64 μM für dITP/17 μM dATP/-dCTP/dTTP/0,48 μM dGTP; für die zweite Versuchsreihe 178,5 μM für dITP/54,75 μM für dATP/dCTP/dTTP/2, 4 μM dGTP und für die dritte Versuchs- reihe 321,4 μM für dITP/102,3 μM für dATP/dCTP/dTTP/4, 8 μM dGTP) .
Für die Tth-DNA-Polymerase wurde im Gegensatz zu dem oben be¬ schriebenen grundlegenden Protokoll 1 μl ABI dNTP-Mix mit un¬ terschiedlichen Mengen (1, 2 und 5 μl ) 1. 0,5 mM dlTP/dATP/- dTTP/dCTP (Endkonzentrationen von etwa 1,59 μl dITP/30,9 μM dATP/dTTP/dCTP), 2. 93,3 μM dITP/64,75 μM dATP/dTTP/dCTP, 3. 154,7 μM dITP/126,1 μM dATP/dTTP/dCTP in 4 μl 5xTACS-Puffer getestet. Mit den zuletzt genannten zwei Konzentrationen wur¬ den Sequenzen mit bis zu 400 Basen erhalten. Man erhielt Ket¬ tenlängen von über 500 Basen, wenn 1 oder 2 μl einer dNTP-Mi- schung, bestehend aus 0,5 mM dITP/dATP/dCTP/0, 1 mM dGTP (End¬ konzentrationen von dGTP von 4,8, 9,6 bzw. 24 μM) , zugegeben wurden.
Zusammenfassend ergab die entsprechende Einstellung des dNTP/- Dye-ddNTP-Verhältnisses Sequenzlängen, die so hoch waren, daß die Aulösungsgrenze des verwendeten 6% Polyacrylamidgels er¬ reicht wurde. Im allgemeinen ergaben dNTP-Mischungen, die dITP zur Signalkompression in Polyacrylamidgelen verwendeten, bes¬ sere Ergebnisse als gleichmäßig konzentrierte Mischungen mit 7-Deaza-dGTP.
Magnesium-Erfordernis
Für die SequithermR-DNA-Polymerase wurde das Mg2*-Erfordernis systematisch getestet. 0,5, 1, 2, 3, 5 und 10 μl 30 mM MgCl2 (Endkonzentrationen von etwa 2, 3,4, 4,85, 6,3 bzw. 9,1 mM) wurden hinzugegeben, wobei der Rest des grundlegenden Proto¬ kolls unverändert blieb. Die besten Ergebnisse wurden im Be¬ reich von 1-5 μl 30 mM MgCl2 erhalten, wobei bei Zugabe von 0,5 μl 30 mM MgCl2 nur eine geringfügige Verschlechterung er¬ halten wurde. Für die Tth-Polymerase war die Reaktion sogar bei Versuchen mit 1 und 10 μl 30 mM MgCl2 und sogar ohne MgCl2 erfolgreich. Zusammenfassend tolerierten beide Polymerasen unter der gege- - benen Reaktionsbedingungen breite Magnesiumchlorid-Konzentra¬ tionen. Für die SequithermR-DNA-Polymerase liegt das Optimum hier bei etwa 2,5 mM, für die AmpliTaq"- und die Tth-DNA-Poly¬ merase bei < 2 mM MgCl2.
Zyklus-Bedingungen mit unterschiedlichen Parametern
Bei gleichbleibender Magnesiumionen-Konzentration wurden ver¬ schiedene Parameter in einem Versuch verändert. Bei einer Ket¬ tenverlängerungszeit von nur 1 Min. wurden nicht zufrieden¬ stellende Ergebnisse erhalten, insbesondere dann, wenn eine Reihe von 1, 2, 3 μl TACS mit Zugabe von 1 μl ABI-Nukleotidmix oder 1 μl 15 μM dNTP getestet wurde. Wenn die Kettenverlänge¬ rungszeit auf 90 Sekunden verlängert wurde, konnten sowohl bei den unterschiedlichen TACS-Zugabemengen als auch bei der dNTP- Zugabe klare Wirkungen erkannt werden (1 μl ABI dNTP-Mix, End¬ konzentration 35,71 μM dITP/7,14 μM dATP/dTTP/dCTP) . Schlie߬ lich konnten drastische Unterschiede festgestellt werden, wenn die SequithermR-DNA-Polymerase mit der oben beschriebenen "lan¬ gen Sequenz" dNTP-Konzentration (1 μl ABI dNTP plus 0,1 μl 6 mM dITP/0,5 mM dATP/dTTP/dCTP/O, 1 mM dGTP) in Amplifizierungs- zyklen mit einer Verlängerungszeit von 2 Min. bei 72°C im Ver¬ gleich zu 3 Min. bei 70°C getestet wurde. Beim ersten Fall konnten Sequenzleitern von mehr als 500 Basen erhalten werden, während beim zweiten Fall nur 200 Basen erhalten wurden, wo¬ durch die Verbindung zwischen dem PCR-Zyklus und der dNTP-Kon¬ zentration unterstrichen wird. Weiterhin wurden für die Tth- DNA-Polymerase mit 2 μl 0,5 mM dITP/dATP/dTTP/dCTP/0, 1 mM dGTP (Endkonzentration 57,6 μM dATP/dTTP/dCTP/9, 6 μM dGTP) noch bessere Ergebnisse (> 500 Basensequenzlänge) bei einer Ketten¬ verlängerungszeit von 2 Minuten bei 72°C erhalten im Vergleich zu 3 Minunten bei 70°C.
Diese Versuche machen deutlich, daß die Polymerasen niemals die "Standardgeschwindigkeit" der PCR von 1 Kb pro Minute in einem Zyklus-Sequenzierungsprotokoll unter Verwendung von Dye-" Terminatoren erreichen. Aus der PCR ist bekannt, daß die Magnesium-ionen-Konzentration und die dNTP-Gesamtkonzentration miteinander in Beziehung stehen; hier konnte gezeigt werden, daß es weiterhin eine Wechselwirkung zwischen der Kettenver¬ längerungszeit und dem Dye-Terminator/dNTP-Verhältnis gibt.
Kettenverlänqerunqstemperatur
Ein sehr guter Einbau von Dye-Terminatoren wurde auch dann ge¬ funden, wenn das obenbeschriebene grundlegende Protokoll bei einer Kettenverlängerungstemperatur von 72°C durchgeführt wur¬ de. Die Sequitherm- und insbesondere die TtH-DNA-Polymerasen arbeiteten auch bei 75°C sehr gut. Jedoch wurden bei einer Kettenverlängerungstemperatur von 80°C deutlisch schlechtere Ergebnisse erhalten.
Bei der Zyklus-Sequenzierung mit Dye-Terminatoren zeigen somit die extrem thermophilen DNA-Polymerasen ähnliche Temperatur- Optima wie für PCR, jedoch ohne die Reaktionsgeschwindigkeit der klassischen PCR zu erreichen.
Zugabe "katalytischer Mengen" anderer DNA-Polymerasen, teil¬ weise mit Proofreadinq-Aktivität
Für "lange PCRs" ist bekannt, daß die vorzeitige Kettentermi- nation durch falsch eingebaute Nukleotide verursacht wird. Deshalb wurde die Zugabe einer "katalytisch" aktiven Menge von DNA-Polymerasen mit geringer (AmpliTaq") und vollständig funk¬ tionierender 3', 5 ' -Exonuclease-Aktivität ausgeteεtet. In Ver¬ suchen mit nur einminütiger Verlängerungszeit ergaben "kataly¬ tische" Mengen von 0,5 U Pfu oder 0,5 U AmpliTaq" bessere Se¬ quenzen als 1/1-Mischungen. Durch die Verwendung von Enzymmi¬ schungen können deshalb die Sequenzprotokolle optimiert wer¬ den. Additive
Die Detergenzien Tween" 20 und TritonXR und die "Co-Lösungsmit- tel" DMSO und Glyzerin wurden zur Verbesserung der PCR und der DNA-Sequenzierung verwendet, wobei teilweise die thermische Stabilität der Template-DNA-Doppelhelix beeinflußt wird. Die zur Verbesserung der DNA-Sequenzierung mit AmpliTaqR-DNA-Poly- merase bei 60°C verwendeten Additivzugaben wurden auch für die Sequitherm"- und die Tth-DNA-Polymerase bei 72°C getestet. Die Ergebnisse zeigen, daß die üblicherweise eingesetzten Additive das Sequenzierungsergebnis mit den Sequitherm"- und Tth-DNA- Polymerasen für das verwendete Primer/Template-Paar nicht noch weiter verbessern lassen.
III . Verwendung weiterer, extrem thermophiler DNA-Polymerasen bei Kettenverlänqerunqstemperaturen von über 60°C
Bei den nachfolgenden Versuchen wurde überprüft, ob außer der SequithermR-DNA-Polymerase auch andere extrem thermophile DNA- Polymerasen zur Zyklus-Sequenzierung mit Dye-Didesoxy-Termina- toren bei Kettenverlängerungstemperaturen von über 60 °C ver¬ wendbar sind.
Unter Verwendung des oben beschriebenen grundlegenden Sequen¬ zierungsprotokolls (PCR-Zyklus SeqT580, pS71JBl als Template, ß-gal-forward als Primer) wurden die nachfolgenden extrem thermophilen DNA-Polymerasen auf ihre Fähigkeit zum Einbau von Dye-Terminatoren bei einer Kettenverlängerungstemperatur von 70"C mit und ohne Zugabe von 1 μl 30 mM MgCl2 getestet. Es wur¬ de gefunden, daß die nachfolgenden extrem thermophilen DNA- Polymerasen nach Zugabe von 1 μl 30 mM MgCl2 bei einer Ketten¬ verlängerungstemperatur von 70°C arbeiten: Sequitherm (Epicen¬ tre), Tth (Epicentre, Boehringer), TaqPlus (Stratagene), Ex- pand HIFI (Boehringer), Tfl (Epicentre), Replitherm (Epicen¬ tre) und Goldstar (Eurogentec) . Trotz schlechterer Gesamter¬ gebnisse sind auch Deep Vent, Vent-exo" und 9°N-DNA-Polymerasen grundsätzlich durch MgCl2-Zugabe bei einer Kettenverlängerungs^ temperatur von 70°C einsetzbar. Überraschenderweise wurde so¬ gar gefunden, daß die nachfolgenden extrem thermophilen DNA- Polymerasen sogar ohne Zugabe von 1 μl 30 mM MgCl2, d.h. mit der bereits im Ausgangsprotokoll verwendeten MgCl2-Menge, bei Kettenverlängerungstemperaturen > 60°C einsetzbar sind: Gold¬ star", Boehringer HIFI, TaqPlus", Tth, TF1 und AmpliTaq". Dies zeigt, daß viele DNA-Polymerasen aus extrem thermophilen Orga¬ nismen generell Dye-Terminatoren bei der Zyklus-Sequenzierung einbauen können.
Für das untersuchte Primer/Template-Paar wurde somit gefunden, daß alle untersuchten DNA-Polymerasen in der Lage sind, Dye- Terminatoren bei einer Kettenverlängerungstemperatur von 70°C einzubauen. Diese Befunde werden beispielhaft anhand der Re- plitherm"- und Tf1-DNA-Polymerasen in Abbildungen 3 und 4 dar¬ gestellt.
IV. Übertragung der Ergebnisse auf weitere Primer-Template- Paare
Um festzustellen, daß die Verwendung extrem thermophiler DNA- Polymerasen bei der Zyklus-Sequenzierung mit Dye-Terminatoren bei Temperaturen über 60°C auch bei anderen Primer-Template- Paaren funktioniert, wurden Versuche mit pS71JB2 und dem Pri¬ mer ß-gal for und mit pS71JB4 mit dem S71-spezifischen Primer 4935 durchgeführt. Es zeigte sich, daß insbesondere der Über¬ gang vom Primer-Annealing zur Kettenverlängerung für das er¬ findungsgemäße Verfahren kritisch ist. U.a. die Zugabe von Spermidin beeinflußte das erfindungsgemäße Verfahren positiv.
Erfindungsgemäß wurde somit festgestellt, daß extrem thermo¬ stabile DNA-Polymerasen bei der Zyklus-Sequenzierung mit Dye- Terminatoren auch bei Kettenverlängerungstemperaturen von über 60°C, insbesondere bei Temperaturen im Bereich von 70°C bis 75°C, optimalerweise bei 72°C, verwendbar sind. Besonders be- " vorzugt werden die Sequitherm" und Tth-DNA-Polymerase erfin¬ dungsgemäß eingesetzt. Aber auch andere, an sich bekannte, ex¬ trem thermophile DNA-Polymerasen sind einsetzbar. In Abhängig¬ keit vom verwendeten Primer-Template-Paar und der verwendeten DNA-Polymerase sind die Versuchsbedingungen für die Zyklus-Se¬ quenzierung mit Dye-Terminatoren in üblicher Weise zu optimie¬ ren. Es handelt sich hierbei um routinemäßige, dem Fachmann bekannte Abänderungen des Zyklus-Sequenzierungs-Verfahrens mit Dye-Terminatoren, wobei erfindungsgemäß für die Kettenverlän¬ gerung Temperaturen von über 60°C eingesetzt werden.
Insbesondere sollten bei der Optimierung der Zyklus-Sequenzie¬ rung die nachfolgenden Bedingungen in Abhängigkeit vom benutz¬ ten Primer-Template-Paar und der verwendeten DNA-Polymerase aufeinander eingestellt und optimiert werden:
Magnesiumionen-Konzentration, PufferZusammensetzung,
Ersatz der Magnesiumionen durch andere Metallionen, Nukleotid-Konzentration,
Konzentration der extrem thermophilen DNA-Polymerase PCR-Bedingungen, insbesondere die Bedingungen zum Primer- Annealing und die Übergangsbedingungen von Primer-Annea- ling zur Kettenverlängerungstemperatur, die immer über 60°C, bevorzugt im optimalen Bereich von 70°C-75°C, liegt, geeignete Auswahl von Additiven zur Stimulierung des Pri¬ mer-Annealings, der Kettenverlängerung und der Enzymakti¬ vität, beispielsweise durch Zugabe von PEG und von Stabi¬ lisatoren der DNA-Struktur wie Spermidin.
Mit der vorliegenden Erfindung wird erstmals gezeigt, daß ex¬ trem thermostabile DNA-Polymerasen generell zum Einbau modifi¬ zierter Didesoxy-Nukleotide wie zum Beispiel der Dye-Termina¬ toren bei Temperaturen > 60°C fähig sind. Dieser Befund hat weitreichende Konsequenzen für die Optimierung von Sequenzie- rungs- und Amplifizierungsprotokolllen, die solche Nukleotida- naloga verwenden wollen. So machen die erhaltenen Ergebnisse deutlich, daß die Übertragbarkeit der bisherigen Protokolle, die nur bei 60°C arbeiten können, über Anpassung der Reak¬ tionsbedingungen für das jeweilig verwendete Primer/Template- Paar optimiert werden müssen. So zeigen gerade die Versuche mit pS71JB2/Primer 4612 bei 60°C und 72°C, daß ein entschei¬ dender Punkt im Übergang vom Annealing zur Kettenverlängerung liegt.
Unterstützt wird dieser Befund dadurch, daß die Abwandlung des PCR-Zyklusses auf tiefere Annealing-Temperaturen (45°C statt 50°C) bei verlängerten Annealing-Zeiten (30 Sek. statt 15 Sek. ) sowie die Zwischenschaltung eines 10 Sek. Schrittes bei 60°C zwischen Annealing bei 50°C und Extension bei 72°C zu stark verbesserten Ergebnissen führen. Unterstützt man die Primer/Template-Interaktion durch Additive wie Spermidin, wer¬ den im Vergleich zum 72°C Basis-Protokoll ebenso stark verbes¬ serte Ergebnisse erhalten. Besonders die Verwendung von Sper¬ midin ist eine weitere Neuheit der vorliegenden Erfindung. Es wurde beispielsweise zur Unterstützung von Restriktionsverdaus und DNA-Protein-Interaktionen bei Gelshift-Experimenten einge¬ setzt, aber niemals als Hilfsmittel für die DNA-Sequenzierung mit Dye-Terminatoren.
Eine Anwendung dieser Forschung zeigte z.T. bereits sehr gute Erfolge bei der Anpassung der ThermosequenaseR-DNA-Polymerase an den neuen Zyklussequenzierungskit der Firma ABI, der mit stark verminderten Dye-Terminatorkonzentrationen unter Verwen¬ dung der AmpliTaqFS" angeboten wird. Durch Zugabe von Additiven wie Spermidin konnten sogar Sequenzen mit der durch die Ampli¬ Taq FSR "abgelösten" AmpliTaqR-DNA-Polymerase erhalten werden. Gut übertragbare 60°C-Protokolle konnten des weiteren bei im Vergleich zur AmpliTaq" vermindertem Dye-Terminatorbedarf durch die einfache Zugabe von Magnesium für TthR- und Sequitherm"- DNA-Polymerasen etabliert werden; wie bereits oben angedeutet, können die Reaktionsbedingungen für die AmpliTaqR-DNA-Polymera- se auch noch stark verbessert werden.
Zusammenfassend beschreibt die Erfindung neben einer neuen Verwendung extrem thermophiler DNA-Polymerasen Parameter und Additive zur Etablierung und Optimierung von Protokollen unter Verwendung extrem thermophiler DNA-Polymerasen und substitu¬ ierter Nukleotide. Eine erfindungsgemäß besonders wichtige und für die Durchführung der Erfindung entscheidende Erkenntnis liegt darin, daß die nachfolgenden Parameter in Abhängigkeit voneinander eingestellt werden müssen, um die Zyklus-Sequen¬ zierung von DNA mit mit einem Marker substituierten Didesox- ynukleotiden bei einer Temperatur > 60°C durchzuführen. Diese Parameter sind:
Reaktionspuffer; Desoxy-Nukleotide; mit einem Marker substituierte Didesoxynukleotide; Primer- und Template-DNA; Additive;
Ramping-Zeit zwischen den einzelnen Temperaturstufen in Abhängigkeit von der verwendeten DNA-Polymerase, vom Tem¬ plate/Primer-Paar und vom Reaktionspuffer.

Claims

P A T E N T A N S P R Ü C H E
1. Verwendung von extrem thermostabilen DNA-Polymerasen (E.C.2.7.7.7. ) bei der Zyklus-Sequenzierung mit mit einem Farbstoff als Marker substituierten Didesoxynukleotiden bei einer Kettenverlängerungstemperatur im Bereich von > 60°C bis 80°C.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kettenverlängerungstemperatur im Bereich von 65°C bis 75°C liegt.
3. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kettenverlängerungstemperatur im Bereich von 68°C bis 73°C liegt.
4. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Polymerase ausgewählt wird aus mindestens ei¬ nem Element der Gruppe, umfassend die nachfolgenden DNA- Polymerasen: AmpliTaq-DNA-Polymerase; Taq-DNA-Polymerase; Sequitherm-DNA-Polymerase; Tth-DNA-Polymerase; Expand- High-Fidelity-DNA-Polymerase; Pwo-DNA-Polymerase; Deep Vent-DNA-Polymerase; 9°N-DNA-Polymerase; Vent Exo"-DNA- Polymerase; Replitherm-DNA-Polymerase; Goldstar-DNA-Poly- merase; Tf1-DNA-Polymerase; Thermosequenase; AmpliTaq FS- DNA-Polymerase; Pfu-DNA-Polymerase.
5. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Didesoxynukleotide mit einem fluoreszierenden Farbstoff als Marker substituiert sind.
6. Verfahren zur Zyklus-Sequenzierung von DNA mit mit einem Farbstoff als Marker substituierten Didesoxynukleotiden mit den nachfolgenden Schritten: a) Vermischen von mindestens einem Reaktionspuffer, der Desoxy-Nukleotide, der mit einem Marker substituier¬ ten Didesoxy-Nukleσtide, der Primer- und Template- DNA, Wasser und gegebenenfalls weiteren Additiven und Einstellen ihrer Konzentration in Abhängigkeit voneinander; b) Zugabe mindestens einer extrem thermostabilen DNA- Polymerase; c) Durchführen der PCR-Sequenzierungs-Zyklen mit minde¬ stens den nachfolgenden Schritten:
Denaturierung der Template-DNA bei einer geeig¬ neten Temperatur;
Annealing des Primers bei einer geeigneten Tem¬ peratur;
Kettenverlängerung bei einer geeigneten Tempe¬ ratur;
Einstellen der Ramping-Zeit zwischen den ein¬ zelnen Temperaturstufen in Abhängigkeit von der verwendeten DNA-Polymerase, vom Template/Pri¬ mer-Paar und vom Reaktionspuffer; d) Reinigung des Reaktionsansatzes; e) Auftrennung der DNA-Ketten und Detektion zur Bestim¬ mung der DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt c) die Kettenverlängerung bei einer Tempe¬ ratur von > 60°C bis 80°C durchgeführt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt a) Additive zur Stimulierung des Primer- Annealings, der Kettenverlängerung, zur Beeinflußung der DNA-Struktur und/oder der Enzymaktivität zugegeben wer¬ den.
8. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden An¬ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt b) die DNA-Polymerase aus mindestens einem Element der nachfolgenden Gruppe ausgewählt wird: AmpliTaq-DNA-Polymerase; Taq-DNA-Polymerase; Sequitherm- DNA-Polymerase; Tth-DNA-Polymerase; Expand-High-Fidelity- DNA-Polymerase; Pwo-DNA-Polymerase; Deep Vent-DNA-Polyme- rase; 9°N-DNA-Polymerase; Vent Exo'-DNA-Polymerase; Repli- therm-DNA-Polymerase; Goldstar-DNA-Polymerase; Tfl-DNA- Polymerase; Thermosequenase; AmpliTaq FS-DNA-Polymerase; Pfu-DNA-Polymerase.
9. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden An¬ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer Alkalimetallionen oder Erdalkalimetallio¬ nen enthält.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Erdalkimetallionen Magnesiumionen verwendet wer¬ den.
11. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden An¬ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt c) die Kettenverlängerung bei einer Tempe¬ ratur im Bereich von 68°C bis 73°C durchgeführt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt c) die Kettenverlangerung bei einer Tempe¬ ratur im Bereich von 70°C bis 72°C durchgeführt wird.
13. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden An¬ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt a) PEG und/oder Stabilisatoren der DNA- Struktur zugegeben werden.
14. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mit einem fluoreszierenden Farbstoff als Marker sub¬ stituierte Didesoxynukleotide verwendet werden.
15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß als Stabilisator der DNA-Struktur Spermidin zugegeben wird.
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