DK175635B1 - Hybridomacellelinier, der producerer monoklonale antistoffer, som reagerer med nye mucinepitoper - Google Patents

Description

DK 175635 B1

Den foreliggende opfindelse angår hybridomacellelinier, der producerer hidtil ukendte monoklonale antistoffer, som reagerer med muciner, oprensede muci-ner og monoklonale antistoffer, som er i stand til fortrinsvis at genkende nye epitoper på muciner, der er forbundet med maligne væv, hvilke antistoffer er 5 nyttige til påvisning og behandling af human cancer, især brystcancer.

Muciner er stærkt glycosylerede, højmolekylære glycoproteiner med et carbo-hydratindhold på op til 80% og udskilles af seroviskose væv i mund, lunger, cervix og tarme. Muciner er blevet identificeret som tumorforbundne antigener 10 og er blevet isoleret fra serum og ascitesvæske fra cancerpatienter, herunder fra patienter med brystcancer.

Fedtdråberne i human mælk er omgivet af en særlig membran, der stammer fra plasmamembranen fra apikaloverflademe af mælkedannende celler. Interessen 15 for denne membran, der er kendt som mælkefedtdråbemembranen, (i det følgende MFGM) er blevet forøget som følge af påvisningen af, at nogle af de antigener, der findes inden i MFGM, er mucin-lignende og er tumorforbundne især med carcinomer i brystet. Antistoffer, der er rettet imod epitoper på muci-nantigener, der er forbundet med brystcancer, er opnået fra mus immuniseret 20 med fragmenter af humane mælkefedtperler (i det følgende benævnt HMFG).

Disse antistoffer synes lovende med hensyn til diagnose af brysttumorer. Af særlig interesse er antistoffer rettet imod højmolekylære (Mr større end 200.000) mucin-lignende komponenter af MFGM. Antistoffer til mucin-lignende antigener har været anvendt med succes til diagnose af mikro-metastaser med 25 biopsier, som en tumorprognoseindikator til radiolokalisering af tumorer og til serumanalyse til overvågning af tumorudvikling. Der henvises til Linsley et al.,

Cancer Research. 46, side 5444-5450, (1986).

De fleste af tidligere karakteriserede mudnantigener har vist sig at være til ste-30 de i normalt væv foruden i tumorvæv. Variationer i mucin-lignende antigener fra normale og fra tumorkilder har været undersøgt af Burchell et al., J. Immunol..

131, side 508 (1983), som fandt forskelle i forholdet mellem determinanter, der genkendtes af to monoklonale antistoffer (HMFG-1) og (HMFG-2) i normale

DK 175635 B1 I

humane brystepithelceller, og i brysttumor-cellelinier. Disse undersøgelser vi- I

ste, at det relative bindingsniveau for HMFG-1 og HMFG-2 varierede mellem I

cellelinier fra normalt og malignt brystepithel, idet HMFG-2 epitopen var stær- I

kere udtrykt på tumorcellelinierne. Sekine et al., i J. Immunol.. 135, side 3610 I

5 (1985) sammenlignede mucin-lignende antigener, der reagerede med det mo- I

noklonale DF3 antistof. Kufe et al.. Hvbridoma. 3. side 223 (1984). fra mælk oo - I

pleurale effusionsvæsker fra brystcancerpatienter. Disse undersøgelser anty- I

der, at muciner er antigent sammensatte, idet de udtrykker et antal forskellige I

epitoper både på normalt væv og på tumorvæv og antyder også, at muciner I

10 med hensyn til udtrykkelse af epitoper kan variere imellem forskellige vævskil- I

der. Antistoffer, som reagerer med epitoper på mucin-lignende antigener, der

findes i forhøjede koncentrationer i serum fra brystcancerpatienter, er også be- I

skrevet (Linsley et al., ovenfor og Franke! et al., J. Bio!. Response Modifiers. 4, I

side 273 (1985)). Et af disse antistoffer W1 er reaktivt med epitoper på et muci- I

15 nantigen, der er forbundet med brystcancerceller. W1 antistoffet har været an- I

vendt ved en prøve til påvisning af nærværelsen af antigen i forhøjede koncen- I

trationer i serum fra brystcancerpatienter (Linsley et al., ovenfor). Foruden W1 I

epitopen kan sekundære epitoper såsom T (Thomsen-Friedenreich) og Tn mu- I

cinepitopeme, som vides at være forbundet med carcinomer, påvises ved en I

20 prøve under anvendelse af monoklonale antistoffer. Der henvises til Springer I

og Desai, Molecular Immunology. 22, side 1303-1310 (1985) og Springer, I

Science 224, side 1198-1206(1984). I

Linsley et al. (Cancer Res. 46, pp. 6380 - 6386 (1986)) har undersøgt meka- I

25 nismen for variation i udtrykkelse af epitoper på et mucin-lignende antigen defi- I

neret af de monoklonale antistoffer W1, W5 og W9 i lungecancercellelinien I

Calu-1.1 immunblotting-forsøg blev bindingen af alle tre antistoffer til et højmo- I

lekylærvægt-mucin-lignende glycoprotein påvirket af natriumperiodat og/elier I

neuraminidase-behandling, hvilket tyder på, at antistofferne genkender kulhy- I

30 drat-epitoper. I

DK 175635 B1 3 EP A O 160 446 angår to monoklonale antistoffer 21 DD5 og 21 DD7, som er rettet mod et antigen på brystepithelceller. De fremlagte resultater viser, at antigenet optræder såvel på normale som på carcinome cellemembraner.

5 WO 86/02735 angår monoklonale antistoffer, som reagerer med humane 'non-small cell' lungecarcinomantigener, hvor antigenerne har en molekylær vægt på 135000 Dalton eller mindre.

Johnson et al. (Cancer Res. 46(2), pp. 850 - 857 (1986)) beskriver det mo- 10 noklonale antistof B72.3, som binder sig til et tumorassocieret glycoprotein med høj molekylevægt identificeret som TAG-72. Dette glycoprotein-antigen blev fundet i eksklusionsvolumenen af en homogenat af den menneskelige carcinome cellelinie LS-174 T efter fraktionering på en Sapharose CL-4B kromatografisøjle.

15

Swallow et al. (Dis. Markers 4 (4), pp. 247-254 (1986)) beskriver antistoffer rettet mod mucinlignende glycoproteiner, som findes i normal, menneskelig urin. Disse glycoproteiner var tidligere blevet detekteret ved binding til lektiner.

20 Papsidero et al. (Mol. Immunol. 21 (10), pp. 955-960 (1984)) beskriver et mo-noklonalt antistof F36/22, som binder til et antigen fundet i cancerpatienters kredsløb. Antigenet har en molekylær vægt på mere end 669000 Dalton, bestemt ved gelfiltreringskromatografi på en Sepharose CL-4B-søjle.

25 EP A 0 200 464 beskriver et tumorassocieret antigen udtrykt ved kolon- carcinom og et monoklonalt antistof CCK061 rettet mod dette antigen, og hvor antigenet er kendetegnet ved en molekylær vægt på ca. 820000 til ca. 960000 Dalton.

30 Det ville være ønskværdigt at udvikle nye antistoffer, som udviser forøget specificitet ved prøver for tumorforbundne antigener, som findes i prøver fra humane individer. Sådanne antistoffer bør optimalt være i stand til at identificeres ved specifikke epitoper på et tumorassocieret mucinantigen, hvilke epitoper i

I DK 175635 B1 I

I I

I findes i stærkt formindskede niveauer på eller er skjult på antigen stammende I

I fra normalt væv. Sådanne antistoffer kunne så anvendes til at udføre mere føl- I

I somme prøver til påvisning af nærværelsen af cancer ved fortrinsvis at reagere I

I med tumorforbundne antigener i serum fra patienter med cancer. I

I 5 I

I Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes hidtil ukendte hybridomacelle- I

I linier, der producerer monoklonale antistoffer til mucinantigener, der er opren- I

I set fra normale (ikke-tumor) væv eller tumorvævskilder. Visse af hybridoma- I

I cellelinierne opnås under anvendelse af metoder, hvor oprenset mucinantigen I

I 10 indgår som immunogen. De monoklonale antistoffer ifølge den foreliggende I

I opfindelse kan anvendes til at undersøge serum med henblik på påvisning af I

I nærværelsen af tumorforbundne mucinantigener. Hertil kommer, at undersø- I

I gelser til påvisning af mucinantigener i biologiske prøver inklusive opspyt og I

I bronkiale afstrygninger samt udskylningsprøver kan udføres under anvendelse I

I 15 af disse antistoffer. Som sådan kan de af hybridomacellelinierne ifølge opfin- I

I delsen producerede antistoffer fremskynde diagnosen og behandlingen af hu- I

I man cancer, herunder bryst- og lungecancer. I

I Mindst et af de under anvendelse af oprenset tumormucinantigen fremstillede I

I 20 hidtil ukendte monoklonale antistoffer, nemlig det monoklonale antistof One-

I M26, udviser en fortrinsvis genkendelse af tumorassocieret mucinantigen i I

I sammenligning med antigen stammende fra normale kilder. Onc-M26 antistof- I

I fet besidder en væsentligt formindsket reaktivitet over for antigen isoleret ffa I

I normale kilder. Desuden udviser det monoklonale antistof M38 høj specificitet i I

I 25 forhold til en unik epitop på mucinantigener. I

I Fjorten sekundære hidtil ukendte monoklonale antistoffer, som er beskrevet i I

I det foreliggende, reagerer ligeledes med tumorassocieret mucinantigen. Des- I

I uden viste disse antistoffer sig reaktive med antigener stammende fra normale I

I 30 individer. Adskillige af disse hidtil ukendte monoklonale antistoffer synes at re- I

I agere med sekundære epitoper på W1 antigenet end tidligere identificerede I

I epitoper.

DK 175635 B1 5

Især tilvejebringer den foreliggende opfindelse hybridomacellelinier, som producerer et monoklonalt antistof som defineret i krav 1, såvel som et monoklo-nalt antistof produceret afen hvilken som helst af disse hybridomacellelinier.

Det monoklonale antistof kan være koblet til en påviselig markør udvalgt fra 5 gruppen bestående af enzymer, chromophorer, fluorophorer, coenzymer, che-miluminescente materialer, enzyminhibitorer, paramagnetiske metaller og radi-onuklider.

Den foreliggende opfindelse angår desuden et testudstyr til anvendelse ved 10 analyse for nærværelsen af cancer, omfattende mindst ét monoklonalt antistof produceret af en hybridomacellelinie udvalgt fra gruppen bestående af ATCC nr. HB 9209, HB 9244, HB 9245, HB 9246, HB 9247, HB 9216, HB 9248, HB 9249, HB 9250, HB 9217, HB 9212, HB 9210, HB 9211 og HB 9365. Testudstyret kan desuden omfatte analysereagenser og et fast underlag til udførelse 15 af antigen-antistofbinding, hvor antistoffet er adhæreret til det faste underlag til opfangning af antigen i en prøve.

Testudstyret kan desuden omfatte et andet antistof til påvisning af antigen bundet til det adhærerende antistof. Dette andet antistof kan være et monoklonalt 20 antistof produceret af en hydridomacellelinie udvalgt fra gruppen bestående af ATCC nr. HB 9209, HB 9244, HB 9245, HB 9246, HB 9247, HB 9216, HB 9248, HB 9249, HB 9250, HB 9217, HB 9212, HB 9210, HB 9211 og HB 9365.

Det andet monoklonale påvisningsantistof kan være koblet til en påviselig markør, som er udvalgt fra gruppen bestående af enzymer, chromophorer, fluorop-25 horer, coenzymer, chemiluminescente materialer, enzyminhibitorer, paramag-nestiske metaller og radionuklider.

Særligt tilvejebringes et testudstyr til anvendelse ved analyse for nærværelsen af cancer, omfattende mindst ét monoklonalt antistof produceret af hybridoma-30 cellelinien HB 9212 og et andet monoklonalt antistof produceret af hydridoma-cellelinien HB 9365; eller omfattende et første monoklonalt antistof produceret af hybridomacellelinien HB 9210 og et andet monoklonalt antistof produceret af hydridomacellelinien HB 9365; eller omfattende et første monoklonalt antistof

I DK 175635 B1 I

I 6 I

I produceret af hybridomacellelinien HB 9212, et andet monoklonalt antistof pro- I

I duceret af hydridomacellelinien HB 9210 og et tredje monoklonalt antistof pro- I

I duceret af hydridomacellelinien HB 9365.1 en foretrukket udførelsesform kan I

I testudstyret yderligere omfatte analysereagenser og et fast underlag til udførel- I

I 5 se af antigen-antistofbinding. - I

I H

I Derudover tilvejebringes en fremgangsmåde til påvisning af cancer ved be- I

I stemmelse af nærværelsen af et mucinantigen, der forekommer i en prøve fra I

I et pattedyr, omfattende anvendelse af det monoklonale antistof, der er produ- I

I 10 ceret af en hvilken som helst af hydridomacellelihierne som defineret i krav 1 til I

I at reagere med mucinantigenet, som forekommer i prøven. Prøven kan være I

I en biologisk væske udvalgt fra gruppen bestående af blod, serum, plasma, I

I spyt, pleurale effusioner, mælk, bronchiale afstrygninger og bronchiale udskyl-

I ninger. I

I 15 I

I Derforuden angår den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til påvisning I

I af cancer ved bestemmelse af nærværelsen af mucinantigen, der forekommer i I

I en prøve fra et pattedyr, omfattende at man I

I (a) bringer en prøve fra et pattedyr i kontakt med et indfangningsantistof, I

I 20 produceret af en hydridomacellelinie udvalgt fra gruppen bestående af ATCC

I nr. HB 9248, HB 9210, HB 9212 og HB 9365, hvilket antistof er adhæreret til et I

I substrat, for at binde mucinantigen, som eventuelt forefindes i legemsvæsken I

I til indfangningsantistoffet, I

I (b) sætter et påvisningsantistof, produceret af en hydridomacellelinie ud- I

I 25 valgt fra gruppen bestående af ATCC nr. HB 9209, HB 9244, HB 9245, HB I

I 9246, HB 9247, HB 9216, HB 9248, HB 9249, HB 9250, HB 9217, HB 9212, . I

I HB 9210, HB 9211 og HB 9365 til substratet til reaktion med mucinantigen, der I

I er bundet til indfangningsantistoffet og

I (c) påviser det bundne påvisningsantistof. I

I 30 I

I I særlige udførelsesformer er mucinantigenet tumorassocieret; det monoklonale I

I antistof er koblet til en påviselig markør, som er udvalgt fra gruppen bestående I

I af enzymer, chromophorer, fluorophorer, coenzymer, chemiluminescente mate- I

DK 175635 B1 7 haler, enzyminhibitorer, paramagnetiske metaller og radionuklider; prøven omfatter cellulært eller biologisk materiale udvalgt fra gruppen bestående af blod, serum, plasma, spyt, pleurale effusioner, mælk, bronchiale afstrygninger og bronchiale udskylningen eller påvisningstrinnet omfatter anvendelse af et indi-5 rekte enzym-immunoassay.

Derudover angår den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til at skelne mellem normalt og abnormalt humant væv, omfattende at man bringer en prøve fra et menneske indeholdende cellulært materiale i kontakt med to eller flere 10 af de monoklonale antistoffer produceret af hybridomacellelinieme ifølge krav 1, således at tilstedeværelse af abnormalitet i menneskeprøven kan påvises. I en foretrukket udførelsesform er det humane væv brystepithelvæv eller lungevæv.

15 Den foreliggende opfindelse angår yderligere en fremgangsmåde til påvisning af tumor-associeret mucinantigen i en patient, omfattende at man bringer en prøve indeholdende celleulært materiale fra patienten i kontakt med to eller flere monoklonale antistoffer produceret af hybridomacellelinieme ifølge krav 1, således at forekomsten af tumorer i patienten kan påvises. I foretrukne udførel-20 sesformer omfatter prøven et biologisk materiale udvalgt fra gruppen bestående af blod, serum, plasma, spyt, pleurale effusioner og mælk; eller prøven er brystepithelceller; eller prøven er udvalgt fra gruppen bestående af bronchiale afstrygninger, udskylningsmaterialer og expektoreret spyt.

25 Den foreliggende opfindelse angår desuden en fremgangsmåde til påvisning af lungecarcinom og carcinomer metastatiske for lungen, omfattende at en prøve, som er udvalgt fra gruppen bestående af bronchiale afstrygninger, udskylningsmaterialer og expektoreret spyt reageres med mindst et monoklonalt antistof produceret af en hybridomacellelinie udvalgt fra gruppen bestående af 30 ATCC nr. HB 9209, HB 9244, HB 9245, HB 9246, HB 9247, HB 9216, HB 9248, HB 9249, HB 9250, HB 9217, HB 9212, HB 9210, HB 9211 og HB 9365.

I en foretrukket udførelsesform reageres prøven med det første antistof produceret af hybridomacellelinie HB 9212 og et andet antistof produceret af hybri-

I DK 175635 B1 I

I 8 I

I domacellelinie HB 9365.1 yderligere en foretrukket udførelsesform reageres I

I prøven med et første antistof produceret af hybridomacellelinie HB 9210 og et I

I andet antistof produceret af hybridomacellelinie HB 9365. I

I 5 Derudover tilvejebringes en fremgangsmåde til skelnen mellem normale og I

I kræftramte humane celler, omfattende at bringe en prøve med cellulært mate- I

I riale fra et menneske i kontakt med mindst to forskellige monoklonale antistof- I

I fer produceret af hybridomacellelinier som defineret i krav 1 og påvise tilstede- I

I værelsen eller fraværet af immunkompleksdannelse med antistofferne, hvilket I

I 10 indikerer tilstedeværelsen eller fraværet af kræftceller i prøven. I en særlig ud- I

I førelsesform er det humane, cellulære materiale brystepithelceller. Foretrukket I

I er en af hybridomacellelinieme ATCC nr. HB 9212. I

I Den foreliggende opfindelse beskrives i det følgende nærmere under henvis- I

I 15 ning til tegningen, hvor I

I fig. 1 afbilleder W1 antistof, der bindes til fraktioner fra CsCI massefylde- I

I gradientrensede mælkemuciner, I

I fig. 2 er et fotografi af en SDS-PAGE gel fra CsCI massefyldegradientren- I

I sede mælkemuciner, I

I 20 fig. 3 er et fotografi af SDS-PAGE gelanalyse af affinitetschromatografisk I

I rensede muciner fra mælk (spor 2 til 5) og tumorvæv (spor 6 = prøve nr. H3300 I

I brysttumormucin fra peritoneal effusionsvæske, spor 7 = prøve nr. H3415 I

I brysttumormucin fra pleural effusion og spor 8 = brysttumormucinblanding), I

I fig. 4 viser dosis-responskurveme for binding af monoklonale antistoffer til I

I 25 rensede muciner under anvendelse af den i det foreliggende beskrevne lectin- I

I mucinindfangningsprøve (4A: mælkemucin, 4B: mucin fra pleural effusion), og I

I fig. 5 er en grafisk afbildning, der viser de mucinantigen-epitopkoncentra- I

I tioner, der påvises ved dobbelt determinant-immunoundersøgeise (DDIA) ise- I

I rumanalyser fra brystcancerpatienter og patienter med godartede brystlidelser I

I 30 under anvendelse af monoklonale antistoffer ifølge den foreliggende opfinde!- I

I se. I

DK 175635 B1 9

Hybridomacellelinierne, der frembringer de monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen, opnås ved hjælp af de almene metoder, som er beskrevet af Kohier og Milstein, Nature. 256, side 495 (1975), hvortil der henvises. I overensstemmelse med disse metoder fremstilles hybridomacellelinier ved sammensmelt-5 ning af antistofproducerende celler (typisk miltceller fra mus, som forud er blevet immuniseret med en mucinantigen kilde) med celler fra en udødelig tumorcellelinie under anvendelse af somatiske cellehybridiseringsmetoder. De til immunisering af dyr anvendte midler ("immunogener"), som inducerer frembringelsen af antistoffer til mucine antigener, har typisk bestået af levende humane 10 cancerceller, for eksempel brystcancerceller eller MFGM eller cancercelle-membranekstrakter. Der kan foretages inokuleringer med mere end en type immunogen, idet for eksempel cancerceller og MFGM kan indføres ved separate immuniseringer. Udover MFGM og humane cancercellelinier anvendes ifølge opfindelsen rensede muciner, herunder muciner opnået fra tumorkilder 15 som beskrevet nedenfor som immunogener. Anvendelsen af rensede tumorforbundne muciner som immunogen kan forbedre chancerne for frembringelse af antistoffer til særskilte tumorforbundne epitoper.

De hidtil ukendte monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen blev frembragt ved 20 at immunisere mus med cancercellelinier, MFGM præparater eller muciner oprenset fra mælk eller fra pleurale effusioner fra cancerpatienter som sammenfattet i tabel III nedenfor. Til immunisering med renset mucin inokuleres dyrene intraperitonealt og/eller subkutant mindst én gang med 100 enheder immunogen eller mere. Der kan foretages inokuleringer med mere end en type immu-25 nogen, for eksempel med cancerceller og med MFGM. Immuniseringen af dyrene forstærkes to eller tre gange med immunogen. Miltene fjernes fra dyrene adskillige dage efter sidste forstærkningsimmunisering, og en miltcellesuspen-sion fremstilles til sammensmeltning med murine myelome celler under anvendelse af kendte sammensmeltningsmetoder.

De fra sammensmeltningsprocessen opnåede hybridomacellelinier får lov at vokse. Derefter screenes de resulterende supematanter under anvendelse af immunoanalysemetoder for i supematanterne at påvise nærværelsen af anti- 30

10 I

DK 175635 B1 I

stoffer, der er i stand til at bindes til de specifikke antigener. I nogle tilfælde an- I

vendtes en lectin-indfangningsprøve (WGA) beskrevet nedenfor som en indle-

dende screening til påvisning i supematanteme af nærværelsen af monoklo- I

nåle antistoffer, som kunne bindes til rensede antistoffer stammende fra mælk

5 og pleurale effusioner eller kunne bindes til mucinantigener i serum tilvejebragt I

fra mennesker med og uden cancer. I andre tilfælde screenedes supematanter

med hensyn til evnen til at binde dyrkede cancerceller eller MFGM. En enzy- I

mimmunoanalyse (ELISA) anvendtes til påvisning af binding af antistof til lecti- I

nadhæreret renset mucinantigen, til cancerceller eller til MFGM. Yderligere I

10 screeningstyper udførtes på hybridomasupematanteme herunder kompetitive I

bindingsanalyser og iagttagelser af fluorescente bindingsmønstre som beskre- I

vet i eksemplerne. I

En dobbelt determinantimmunoanalyse (DDIA) (Linsley et al., ovenfor), hvorved I

15 antistofbindingen til epitoper på mucinantigenet, såsom W1 epitopen afprøve- I

des, anvendtes til analyse af funktionen af de hidtil ukendte monoklonale anti- I

stoffer ved human serumanalyse til påvisning af tumorassocieret mucinantigen I

og til at sammenligne de hidtil ukendte antistoffer med W1 antistoffet og ved I

analyser af bronkial afstrygninger opnået under bronkoskopi på mennesker. I

20 Ved DDIA anvendes et antistof, fortrinsvis et monoklonalt antistof ("indfang- I

nings"-antistof), som er immobiliseret på et substrat, såsom en plaststruktur I

eller en kolonne til indfangning af antigen, der forefindes i en væskeprøve så- I

som blodserum fra en cancerpatient. (Serum fra en patient uden cancer an- I

vendes som kontrol). Et andet antistof, som også fortrinsvis er et monoklonalt I

25 antistof, og som kan være mærket til påvisning, for eksempel med et radionu- I

klid såsom jod-125 (1251) eller med peberrodsperoxidase (HRP) ("påvisnings"- I

antistoffet), tilsættes. Det mærkede antistof vil bindes til eventuelt indfanget I

antigen, hvilket tillader påvisning og mængdebestemmelse af mucinantigen, I

som forefindes i sera. I nogle tilfælde, hvor et antigen indeholder epitopgenta- I

30 gelser såsom W1 epitopen, kan det andet antistof være det samme som det I

første antistof, idet for eksempel begge er W1 antistof (homolog DDIA). Ved I

ikke-gentagede epitoper kan det være nødvendigt at anvende et andet antistof, I

som kan bindes til en afvigende epitop på antigenet, fordi for eksempel en epi- I

DK 175635 B1 11 top er blokeret ved binding til det første antistof. Sidstnævnte betegnes som en heterolog DDIA, og hver analyse benævnes i overensstemmelse med det antistof, der anvendes som indfangningsantistof, der angives først og det antistof, der anvendes som konjugat ved påvisningen. Ved "M26/M29"-analysen anven-5 des således M26 som indfangningsantistof og HRP-M29 som konjugeret påvisningsantistof.

Optimalt er det ønskværdigt at identificere nye epitoper på tumorforbundne antigener for at muliggøre fremstillingen af monoklonale antistoffer, som kan 10 anvendes ved udøvelsen af en immunoanalyse under udvisning af forøget følsomhed og specificitet, det vil sige tilvejebringelse af en analyse, som er bedre i stand til at skelne prøver fra personer med cancer fra prøver opnået fra personer uden cancer ved at formindske forekomsten af falske positive resultater.

Falske positive resultater forekommer, når analysen indikerer forekomst af 15 cancer hos en patient, som ikke har cancer, fordi antistoffet binder til epitoper på mucinantigen fra normale kilder. Hertil kommer at en analyses følsomhed kan forøges ved at anvende antistoffer med højere specificitet for mucinantige-ner især for epitoper på tumorforbundne antigener, idet små mængder af antigen vil blive bundet således, at tidlige stadier af cancer hos patienter kan påvi-20 ses.

Opfindelsen belyses i det følgende i forbindelse med eksempler, som kan hjælpe fagmanden under udøvelse heraf. Eksemplerne er på ingen måde begrænsende for opfindelsens område og beskyttelsesomfanget som patentet giver.

25

Eksempel 1

Oprensning af mucinantiaener fra tumorkilder og normale kilder

Kilder for mucinantigen 30

Kilder for mucin, der anvendtes ved frembringelsen af de monoklonale antistoffer ifølge den foreliggende opfindelse, udvalgtes ved at undersøge et antal forskellige prøver opnået ud fra mælk, pleurale effusionsvæsker og tumorer fra

I DK 175635 B1 I

I 12 I

I mennesker for antigenaktivitet. Antigenaktivitet påvistes under anvendelse af

I en kompetitiv cellebindingsanalyse som beskrevet hos Linsley et al., ovenfor. I

I Denne analyse anvendtes også til overvågning af mucinoprensningen som be- I

I skrevet nedenfor. Ved udvælgelsesmetoden testedes i korthed prøver med I

I 5 hensyn til evnen deraf til at inhibere bindingen af 1251-mærket eller HRP- I

I konjugeret W1 antistof til W5-6 celler. W5-6 er en cellelinie, der er beriget med I

I hensyn til mucinantigener, hvilken cellelinie opnåedes fra Calu-1 lungecarci- I

I nomaceller som beskrevet nedenfor. En enhed inhibitorisk aktivitet defineredes I

I som den mængde materiale, der bevirkede en 50% reduktion af bindingen af I

I 10 1251-mærket eller HRP-konjugeret W1 antistof (tilsat i en koncentration på 0,4

I pg/ml) til 3 x 104 W5-6 celler. Bindingen af 1251-mærket W1 antistof påvistes I

I under anvendelse af en gammatæller, og bundet HRP-konjugeret W1 antistof I

I påvistes under anvendelse af en ELISA analyse. HRP konjugeredes direkte til I

I W1 antistoffet ved hjælp af en modifikation af den af Nakani og Kawoi, J. Histo- I

I 15 chem. Cvtochem.. 22. side 1084 (19741 omhandlede metode. Koniuaatet be- I

I sad et molært forhold mellem HRP og antistof på ca. 1:1. Bundne HRP-W1 I

I antistofkonjugater påvistes ved tilsætning af en opløsning af ortho- I

I phenylendiamin (OPD) (100 pi), (0,5 pg/ml) (Zymed Laboratories, Inc., San I

I Francisco, CA) i 100 mM natriumcitrat ved pH 5,0, hvilken opløsning yderligere I

I 20 indeholdt 0,0075% (volumen/volumen) H202. En gul farve fra reaktionen mel- I

I lem substrat og enzym fik lov at udvikle sig, indtil der opnåedes en maksimal I

I absorbans på 0,4-1,5 (optisk tæthedsenheder eller O.D.) ved 490 nm ifølge I

I bestemmelse med et spektrofotometer. (Disse værdier ligger indenfor det opti- I

I male område for ELISA). Enzymsubstratfarvereaktionerne afsluttedes ved til- I

I 25 sætning af 5011,3 N H2S04, og absorbansen ved 490 nm måltes under an- I

I vendelse af en "Microtiter,"-pladeaflæser (Genetic Systems Corp., Seattle, I

I WA). W1 antistoffet anvendtes som følge af dets kendte reaktivitet med muci- I

I nantigener. I det væsentlige identiske værdier opnåedes under anvendelse af I

I de to analysemetoder. I

I 30 I

I Under anvendelse af de ovenfor anførte metoder viste det sig, at normal hu- I

I man mælk indeholdende proteiner stammende fra brystepithel så vel som effu- I

I sionsvæsker stammende fra cancerpatienter indeholdt høje niveauer af W1 I

DK 175635 B1 13 inhibitorisk aktivitet (større end 1000 enheder/ml). På grund af muligheden for individuelle variationer, som ikke var relateret til den maligne tilstand mellem prøverne, oprensedes muciner fra fire forskellige mælkeprøver og to pleurale effusionsprøver. En blanding af syre-ethanolekstraherede brysttumorer fra et 5 stort antal individer anvendtes også som kilde til oprensning af muciner. Oprensningen af muciner fra disse kilder er beskrevet nedenfor.

Opsamling af mælk og pleurale effusionsvæsker 10 Mælk opnåedes fra fire cancer-frie donorer og betegnedes som prøve Milk 1,

Milk 2, Milk 7 og Milk 11. Prøverne blev nedfrosset indenfor 5 til 10 minutter efter opsamling. Først blev både opløselige og MFGM-associerede former af W1-bindende muciner fundet i mælkeprøverne. For at maksimere det totale udbytte af opnået mucin begrænsedes analysen ikke til den MFGM-15 associerede form af antigenet fra mælk.

De anvendte effusioner indeholdt overvejende en opløselig form af mucin.

Pleurale effusioner opnåedes fra brystcancerpatienter på Virginia Mason Hospital i Seattle, WA. En prøve (nr. H3300) blev sammensat af peritoneal væske 20 fra en patient med diagnostiseret metastatisk lobulær brystcancer. Prøve nr.

H3422 var en pleural effusionsvæske fra en patient, som oprindeligt fik diagnostiseret inflammatorisk brystcancer og som derpå udviklede moderat til veldifferentieret infiltrerende duktal adenocarcinom. En anden prøve (nr. H3415) bestod af pleural effusionsvæske fra patienter med diagnostiseret inflammatorisk 25 brystcancer. Effusionsvæskerne opbevaredes i frossen tilstand ved -20°C.

Isolering af muciner opnået fra mælk oo fra effusionsvæsker

Den præliminære metode, som anvendtes til oprensning af muciner fra mælk 30 og fra effusionsvæsker, var eri modification som beskrevet af Linsley et al. ovenfor af den af Creeth et al., Biochem. J.. 167, side 557 (1977) omhandlede fremgangsmåde, hvortil der henvises. Denne fremgangsmåde tillod præliminær oprensning af både MFGM-associerede og opløselige muciner og modvirkede

I DK 175635 B1 I

I 14 I

I overbelastning af de til den endelige rensning anvendte chromatografiske affi- I

I nitetskolonner. I korthed optøedes fuldmælken og effusionsvæskeme, og gua- I

I nidin HCI (United States Biochemical Corp., Cleveland, OH) tilsattes til opnåel- I

I se af en slutkoncentration på 6 M. Blandingen omrørtes, indtil den var klar. Li- I

I 5 gevægtssedimentation ved hjælp af cæsiumchlorid-massefyldegradienter ud- I

I førtes så. Cæsiumchlorid (CsCI) (Bethesda Research Laboratories, Gaithers- I

I burg, MD) tilsattes til opnåelse en koncentration på 0,6 g/ml (oprindeligt volu- I

I men), og massefylden indstilledes til 1,33-1,35 g/ml ifølge gravimetrisk måling. I

I Prøverne centrifugeredes så under anvendelse af en "Beckman 50.2"-rotor ved I

I 10 40.000 opm (i gennemsnit 145.500 x G) i 60 til 65 timer ved 21 °C. Fraktioner I

I opsamledes fra bunden af centrifugeglasset, og massefylder måltes. Fraktio- I

I nerne dialyseredes imod H20 og analyseredes derefter med hensyn til W1- I

I inhibitorisk aktivitet som beskrevet ovenfor. Med hensyn til muciner stammende I

I fra effusionsvæsker forenedes topfraktioner og underkastedes en yderligere I

I 15 centrifugering under anvendelse af en CsCI gradient indeholdende 0,2 M gua- I

I nidin-HCI. I

I Affinitetschromatoorafi I

I 20 Til den endelige rensning af muciner anvendtes affinitetschromatografi. Top- I

I fraktioner med W1-inhibitorisk aktivitet fra CsCI gradienter blandedes med anti- I

I stof W9 (Dr. D. Ring, Cetus Corp., Emeryville, CA) konjugeret til Sepharose, 4B I

I (Sigma Chemical Company, St. Lousi, MO) i forhold på 200-3500 enheder/mg I

antistof i en 50 mM NaCI opløsning, som var pufferindstillet til pH 6,5 med 20 I

25 mM HEPES. W9 antistoffet valgtes, fordi W9 epitoper er fundet på samme I

molekyle som W1 epitoper, og fordi eluering af bundet mucin opnåedes ved en I

lavere pH-værdi ved anvendelse af W9 antistof end ved anvendelse af W1 I

antistof. Bundet antigen elueredes som beskrevet ovenfor af Linsley et al., Bio; I

chemistry. 25, side 2978 (1986), hvortil henvises i det foreliggende. Protein- I

30 koncentrationer bestemtes som beskrevet af Markwell et al., Anal. Biochem.. I

87, side 206 (1979), hvortil henvises i det foreliggende. I

DK 175635 B1 15

Tumorafledt mucinblandinq

Blandinger af tumorafledt mucin oprensede fra syre-ethanolekstraherede brysttumorer opnået fra Dr. J. Rowe (Oncogen, Seattle, WA). Kirurgiske prøver, 5 hvoraf hovedparten var brysttumorvæv med forskellig histologisk klassifikation blandedes og opbevaredes i frossen tilstand ved -700C. Tumorvævprøver (45 g hver) optøedes i et volumen bestående 250 ml ekstraktionspuffer (95% ethanol, 100 mM HCI, phenylmethylsulfonylfluorid (32 pg/ml), aprotinin (2 mg/ml)), og blandingen omrørtes så i 16 timer ved 40C. Uopløseligt materiale opsamle-10 des ved sedimentation ved 40C ved 10.000 x G i 30 minutter, resuspenderedes i H20 til opnåelse af en koncentration på ca. 4 g/ml (vægt/volumen) og guani-din, HCI tilsattes straks til opnåelse af en slutkoncentration på 6 M. Blandingen hvirveledes kraftigt op og fik lov at henstå natten over ved 40C, hvorefter den sedimenteredes ved 1000 x G i 10 minutter og supernatanten opsamledes så 15 efter fjernelse af lipidfasen. CsCI-massefyldegradientcentrifugering og affinitetsrensning udførtes som beskrevet ovenfor.

Natriumdodecvlsulfat-polvacrvlamidaelelektroforese (SDS-PAGE) 20 Til vurdering af renhed udførtes SDS-PAGE på aliquoter af CsCI- gradientfraktioner af muciner, som viste sig at besidde W1-inhiberende aktivitet. Ved denne fremgangsmåde anvendtes polyacrylamidgeler med en 5-20% gradient sammen med 4% stablingsgeler, som beskrevet af Linsley et al., Biochemistry. ovenfor. Prøverne analyseredes under reducerende betingelser.

25 Gelerne farvedes ved anvendelse af Coomassie Brilliant Blue, affarvedes, behandledes med 0,2% periodsyre i 40 minutter ved 40C, og farvedes atter under anvendelse af Schiffs reagens (Sigma Chemical Co.) i 40 minutter ved 40C.

Aminosvreanalvse

Aminosyreanalysen af de som beskrevet ovenfor opnåede affinitetsrensede muciner udførtes under anvendelse af standardmetoder beskrevet af Lowell H.

30

16 I

DK 175635 B1 I

Ericson (AAA Laboratories, Seattle, WA) efter hydrolyse i 20 timer i 6 N HCI I

ved 1150C. I

Resultater I

5 Biokemisk analyse af rensede muciner I

Muciner stammende fra mælk og i stand til at bindes til W1-antistof (fig. 1) gav I

ved CsCI-gradientsedimentation som et gennemsnit af 7 forsøg et bånd ved en I

ligevægtsmassefylde på 1,38 ± 0,01 (standardafvigelse). Dette resulterede i en I

10 ca. 10-foldig mucinoprensning med et udbytte på ca. 40%. CsCI- I

massefyldegradientoprensningen af muciner opnået fra human mælk i over- I

ensstemmelse med ovennævnte fremgangsmåder fremgår af fig. 2. Muciner fra

mælk danner bånd ved en højere ligevægtsmassefylde end hovedparten af I

andre mælkeproteiner således som det fremgår af SDS-PAGE-elektroforese. I

15 Tilsvarende rensning opnåedes med mucciner af pleurale effusionsvæsker og I

de blandede syre-ethanolekstrakter fra brysttumorer. I

Affinitetsrensning af mucin fra mælk resulterede i at ca. 52% af den antigene

mucinaktivitet i de blandede CsCI-fraktioner (4 forsøg) genvandtes i eluatet, og I

20 der opnåedes en ca. 400-foldig oprensning af aktivitet i forhold til fuld mælk. I

Med hensyn til pleurale effusioner opnåedes tilsvarende aktivitetsprocenter i I

affinitetskolonneeluatet, hvilket førte til en samlet resning på ca. 2300-gange I

under opnåelse af et samlet udbytte på ca. 26%. I

25 SDS-PAGE elektroforeseanalyser af affinitetsrensede mucin præparater opnået I

fra mælk eller tumorer (prøve nr. H3300 effusion, prøve nr. H3415 effusion og I

blandede ekstrakter fra brysttumorer) fremgår af fig. 3. De overvejende be- I

standdele i alle mucinpraeparater var af langsomt migrerende PAS-farvende I

art, og bandtes til W1-antistof ved immunoblotting-forsøg. Hertil kommer at alle I

30 præparater indeholdt lavmolekylære kontaminanter i varierende mængder og I

med varierende molekylvægte, hvoraf ingen reagerede med W1-antistoffet. I

Muciner stammende fra alle tre tumorkilder indeholdt komponenenttyper, som I

migreredes som diffuse bånd med ca. Mr = 400.000 (anførte molekylvægte må DK 175635 B1 17 betragtes som estimater, da de ligger udenfor intervallet af de anvendte standarder og på grund af den høje glycosyleringsgrad af disse molekyler). Præparater fra prøve H3300 og tumorblandingen blev hver især adskilt i to komponenter med hhv. Mr = 350.000 og 420.000 og 370.000 og 435.000. Muciner 5 fremstillet ud fra forskellige mælkeprøver udviser betragtelig variation med hensyn til migrering under SDS-PAGE. De forskellige komponenter fra disse mælkepræparater, som migrerede med disse forskellige hastigheder udviste ingen signifikante forskelle med hensyn til immunoreaktivitet overfor nogen af de i det foreliggende omhandlede antistoffer.

10 Mælkepræparater nr. 2 og 7 indeholdt to diffuse fraktionstyper med den relative molekylvægt, Mr = 335.000 og 480.000 for præparat nr. 2 og 400.000 og 500.000 for præparat nr. 7. Præparat nr. 1 og 11 indeholdt hver især kun enkelte diffuse fraktionstyper med hhv. Mr = 450.000 og 380.000. Der jagttogs 15 ingen signifikante forskelle med hensyn til immunoreaktivitet hos de hurtigere eller langsommere migrerende komponenter overfor nogen af de anvendte antistoffer.

Aminosyresammensætningen for muciner oprenset fra mælk (præparat nr. 2) 20 og effusioner (prøve nr. H3300, H3415 og H3422) fremgår af tabel I. Aminosyresammensætningen af glycoproteinet PAS-O beskrevet af Shimizu et al., J.

Biochem. Tokyo, 91, side 515 (1982) indgår i tabel I til sammenligning. (Værdierne bestemt for serin og threonin korrigeredes med hhv. 10% og 5% til kompensering for destruktion under hydrolyse).

I DK 175635 B1 I

I 18 I

I Tabel I I

I Aminosvresammensætninqer af rensede mucin er I

I 5 I

I AMINO Milk 2 H3300 H3415 H3422 PAS-O I

I syre I

(Mol %)_:____ I

I Ala 10.9 14,5 16.8 17.6 13,0 I

10 Arg 3,2 314 5,2 515 3,9 I

Asp 7,4 4,4 5,6 6,0 6,4 I

Cys ND ND ND ND 015 I

I Glu 9,0 5,7 5,5 6,0 8,3 I

Gly 13,9 9,2 9,8 11,8 12,2 I

His 3,4 2,9 3'9 2,9 3,8 I

Ile 217 0,9 1,2 1,6 1,9 I

Leu 5,2 1,9 3,2 3,6 317 I

I -.ς Lys 3,?1 . 316 2,4 2,3 2,2 I

Met ND 0,4 0,4 0,0 0,8 I

Phe 1,9 0,7 1,2 1'4 i:7 I

Pro 1512 18,6 15,9 14,1 1210 I

Ser 911 8,1 10,7 10,3 13,1 I

Thr 9,5 14,6 11,2 10,8 918 I

Tyr 1,7 0,5 1,2 1,0 1,6 I

Val 5J4 - 10,3 5,8 6,5 5;3 I

I 20 I

I ND = Ikke bestemt. I

I 25 Af tabel I fremgår det, at skønt nogle forskelle med hensyn til sammensætning I

I jagttoges, stemte de generelle aminosyresammensætninger af begge præpa- I

I rater godt overens og stemte også godt overens med sammensætningen af I

I PAS-O. Aminosyrerne, alanin, glycin, prolin, serin og threonin udgjorde 59 og I

I 66% af den samlede mængde aminosyrer i hhv. mælkepræparat nr. 2 og effu- I

I 30 sionsprøve nr. H3300. Dette stemmer overens med 65% for de samme amino- I

I syrer i PAS-O. I

I 1 I

DK 175635 B1 19

Eksempel 2

Frembringelse af monoklonale antistoffer til muciner 5 Rensede muciner opnået som beskrevet ovenfor anvendtes til frembringelse af hybridomacellelinier til fremstilling af monoklonale antistoffer til muciner og til karakterisering af mucineme.

Celler 10

Forskellige humane cancercellelinier anvendtes også som immunogener til frembringelse af monoklonale antistoffer med reaktivitet overfor muciner. Calu-1-lungecarcinomaceller, som producerer mucinatigener (tilgængelige fra American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, nr. HTB54) har vist sig at 15 udvise et karakteristisk heterogent farvningsmønster, når fluorescentmærkedé antistoffer, som genkender mucinantigen bindes til cellerne. Calu-1-celler anvendtes til opnåelse af med hensyn til mucinantigen-berigede hidtil ukendte klonale cellelinier W5-6 samt US-5, der som beskrevet af Linsley et al., Cancer Research, ovenfor, giver lave mængder mucinantigen. I korthed opbevaredes 20 Calu-1-cellerne i Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium ("DMEM", GIBCO,

Grand Island, N.Y.) suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS). Cellekloning udførtes ved begrænsningsfortynding i mikrotestbrønde. Med omhyggelighed udvalgtes kloner stammende fra brønde, som kun indeholdt enkeltceller ifølge fasekontrastmikroskopi. De opnåede cellelinier udviste samme isozymphenoty-25 per, som Calu-1-cellelinier, som bestemt af Cell Culture Laboratory, (Children's Hospital, Detroit Medical Centre, Detroit, Ml). Det monoklonale antistof W5 (beskrevet af Frankel et al., ovenfor) anvendtes til at isolere derivater af Calu-1-celler fra kloning ved fluorescent farvningsmetoder under anvendelse af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). Celler, der var farvet som følge af binding 30 af W5-antistoffet sorteredes så ved analysering af celler under anvendelse af FACS og sterilopsamling af de klareste celler (ca. 10% af 100-500.000 celler). W5-6-cellelinien (klon 6) opnåedes ved begrænsningsfortyndingsanalyse af W5S2-celler, der var en cellepopulation, som opnåedes ved 2 gange at sortere

I DK 175635 B1 I

20 I

I celler opnået fra Calu-1-celler, der farvedes som reaktion på binding af W5- I

I antistof. US-5-cellelinien opnåedes fra usorterede Calu-1-celler (uberigede). I

I W5-6-cellelinien udviste en forhøjet grad af W1-, W5- og W9-antistofbinding i I

I forhold til evnen hos Calu-1-stampopulationen til at bindes til disse antistoffer. I

I 5 Den i det foreliggende beskrevne W5-6-ce!lelinie er således beriget med hen- I

I syn til mucinantigen. I modsætning hertil udviste US5-cellelinien en stærkt for- I

I mindsket grad af W1-, W5- og W9-antistofbinding i sammenligning med W5-6- I

I cellelinien eller Calu-1-stampopulationen. Omhandlede W5-6-cellelinie er de- I

I poneret ved ATCC under accessionsnr. CRL 9267. US-5-cellelinien anvendtes I

I 10 ifølge opfindelsen som immunogen i et forsøg på at gøre mus tolerante overfor I

I nonmucinatigener og for at forøge reaktiviteten af de omhandlede monoklonale I

I antistoffer overfor mucinantigener. I

H

I MCF-7, en brystcarcinomacellelinie, tilvejebragtes fra Dr. Marc Lippman (Nati- I

I 15 onal Institute of Health, Bethesda, MD) og anvendtes til frembringelse af mo- I

I noklonale antistoffer med reaktivitet overfor brystvævsassocierede mucinanti- I

I gener. I

I Monoklonale antistoffer I

I 20 I

I Udover de omhandlede hidtil ukendte monoklonale antistoffer anvendtes også I

I tidligere beskrevne monoklonale antistoffer ved følgende procedurer for sam- I

I menligning med de hidtil ukendte monoklonale antistoffer. Disse antistoffer I

I valgtes på grund af tilgængelighed og tidligere påvist reaktivitet med muciner I

I 25 fra brysttumorer eller andre maligne væv. Disse antistoffer er anført i tabel II. I

DK 175635 B1 21

Tabel II

Tidligere beskrevne monoklonale antistoffer 5 Antistofnavn_Antiaen/epitop W1 Mucin W9 Mucin HMFG-1 Mucin HMFG-2 Mucin 10 B72.3 Mucin DUPAN-2 Mucin CA19-9 Sialyeret Lewis a CO-51.4 Lewis a CO-30.1 Lewis b 15 L15 Lewis y L17 Lewis x C6 l DF3 Mucin 20 Antistofferne W1 og W9 (Linsley et al.( Cancer Research, ovenfor) benævntes tidligere 2G3 og 245E7 af Frankel et al., J.'Biol. Response Modifiers. 4, side 273-286 (1985) opnåedes fra Dr. David Ring (Cetus Corporation, Emeryville, CA). Antistof HMFG-1 og HMFG-2 (Taylor-Papadimitriou et al.. Int. J. Cancer.

28, side 17 (1981) skaffedes fra Unipath Limited (Bedford, England). Antistof 25 B72:3 (Colcher et al., PNAS. (USA), 78, side 3199 (1981)) og DUPAN-2 (Metzgar et al., PNAS (USA), 81, side 5242 (1984)) tilvejebragtes hhv. fra Dr.

Jeffrey Schlomm (NIH) og Dr. Richard Metzgar (Duke University, Raleigh, NC). Antistoffet CA 19-9 (Koprowski et al., Somatic Cell Genetics.. 5, side 957 (1979), antistoffet CO-51.4 (Blaszczyk et al., Hvbridoma. 2, sode 240 (1983)) 30 og antistoffet CO-30.1 (]d.) opnåedes alle fra ATCC. Antistof L15 og L17 (Hell-strom et al., Cancer Research. 46, side 3917-3921 (1986) opnåedes fra Dr. I.

Hellstrom (Oncogen, Seattle, WA). Antistof C6 (Fenderson et al„ Mol. Immunology. 23, side 747 (1986) opnåedes fra Dr. Bruce Fenderson og Dr. S. Ha-

I DK 175635 B1 I

I I

I 22 I

I komori (Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC), Seattle, WA). I

I Antistof DF3 opnåedes fra Dr. D. Kufe (Harvard University, Cambridge, MA). I

I Antistof B72.3 og DUPAN-2 anvendtes som ascitesvæske. Antistof CA19-9 og I

I 5 C6 anvendtes som dyrkningssupernatanter. Alle andre antistoffer var oprenset I

I fra ascitesvæske. I

I i

I Hidtil ukendte monoklonale antistoffer I

I 10 Hidtil ukendte hybridomacellelinier, som frembringer monoklonale antistoffer, I

I der udviser reaktivitet med oprensede muciner og som producerer mindst ét I

I antistof, som fortrinsvis genkender tumorafledte muciner udvikledes under an- I

I vendelse af forskellige immuniseringsmetoder og screeninger, som beskrevet I

I nedenfor. I

I 15 I

I Mus, der anvendtes til immuniseringer tilvejebragtes fra FHCRC eller Jackson I

I Laboratories, Bar Harbour, Maine, US. Efter intraperitoneal (i.p.) eller subkutan I

I (s.c.) immunisering med MFGM, MCF-7, W5-6-celler, US-5-celler eller opren- I

I sede muciner som beskrevet nedenfor, modtog musene en booster, og 3 dage I

I 20 senere fjernedes miltcelleme fra musene. Miltcellerne høstedes og sammen- I

I smeltedes med NS-1-myelomaceller (Genetic Systems, Seattle, WA) under I

I anvendelse af kendte sammensmeltningsmetoder til dannelse af en hybrido- I

I macellelinie. Alle hybridomacellelinier klonedes med begrænsningsfortynding. I I

I nogle tilfælde udførtes subcloning til opnåelse af mere stabile hybridomacelier. I

I 25 Hybridomacellelinieme deponeredes ved ATCC og tildeltes de nedenfor i tabel I

I III angivne accessionsnumre. I

I Immunise rinqsmetoder I

I Hybridomacellelinier, der producerer monoklonalt antistof/Onc-M8 I

I 30 I

I Balb/c mus immuniseredes i.p. og s.c. ved injektion af 225 pg MFGM sammen I

I med komplet Freund's adjuvans (CFA). 2 uger senere injiceredes 270 pg I

I MFGM i.p. uden adjuvans. 20 dage senere injiceredes 135 pg MFGM s.c. med I

DK 175635 B1 23 ukomplet Freund's adjuvans (IFA). 2 måneder senere injiceredes 200 pg MFGM i.p. uden adjuvans. 8 dage senere blev immuniserede mus indgivet en booster bestående af 900 enheder renset mælkemucin.

5 Hvbridomacellelinie. der producerer monoklonale antistoffer Onc-M10. Qnc-M11. Onc-M12 oa Onc-M15

Balb/c mus immuniseredes i.p. med 1,2 x 107 MCF-7-celler under anvendelse af CFA. 28 dage senere injiceredes 1,2 x 10 MCF-7-celler i.p. unden adjuvans.

10 14 dage senere injiceredes 1,3 x 107 MCF-7-celler i.p. uden adjuvans. 24 dage senere injiceredes 1,2 x 107 MCF-7-celler i.p. uden adjuvans. Ca. 4 måneder senere før udførelse af cellesammensmeltning modtog de immuniseredes mus en i.p. booster bestående af 4 x 106 MCF-7-celler og 100 pg MFGM.

15 Hybridomacellelinie. der producerer monoklonalt antostof Onc-M16. Qnc-M21 og Onc-M25 (C57-B1/6 x Balb/c)F1-hybridmus (Onc-M16 og Onc-M25 opnåedes fra samme mus, og Onc-M21 opnåedes fra en separat immuniseret mus) immuniseredes 20 i.p. og s.c. med 107 W5-6-celler (Oncogen, Seattle, WA) uden adjuvans. 17 dage senere injiceredes yderligere i.p. og s.c. 5 x106 W5-6-celler uden adjuvans. 33 dage senere injiceredes så i.p. og s.c. uden adjuvans 5 x 106 W5-6-celler. Immuniserede mus modtog 34 dage efter den sidste injektion en i.p. booster bestående af MCF-7-celler og 100 pg MFGM uden adjuvans.

25

Hvbridomacellelinie. der producerer monoklonalt antistof Onc-M22 og Onc-M23

Balb/c mus immuniseredes i.p. med 6,5 x 106 MCF-7-celler under anvendelse 30 af CFA. 20 dage senere injiceredes i.p. 3,5 x 106 MCF-7-celler under anvendelse af IFA og 125 pg MFGM. 18 dage senere injiceredes i.p. 5 x 106 MCF-7-celler uden adjuvans. Før udførelse af cellesammensmeltning modtog de immuniserede mus en i.p. booster bestående af 160 pg MFGM-celler.

24 I

DK 175635 B1 I

Hvbridomacellelinie, der producerer monoklonait antistof Onc-M26 I

Balb/c mus immuniseredes i.p. med 250 enheder CsCI-gradientisoleret pleuralt I

5 effusionsmucin, og 25 dage senere med 150 enheder i.p, og s.c. affinitetsren- I

set pleuralt effusionsmucin fra en patient med brystcancer (prøve nr. H3300). I

Desuden injiceredes s.c. 8 x 106 W5-6-celler 33 dage efter de første to pleurale I

effusionsinjektioner. CFA anvendtes i forbindelse med den første injektion af I

pleuralt effusionsmucin, og IFA anvendtes i forbindelse med de efterfølgende I

10 injektioner af pleuralt effusionsmucin. Der anvendtes ikke adjuvans ved injekti- I

on af W5-6-celler. Immuniserede mus modtog 30 dage senere en i.p. booster I

bestående af 1000 enheder SDS-PAGE-gelrenset pleuralt effusionsmucin (mu- I

cinbåndet var udskåret fra en polyacrylamidgel til injektion) med IFA, derpå 24 I

dage senere 500 enheder af CsCI-gradientisoleret mucin og yderligere 25 dage I

15 senere 1000 enheder CsCI-renset mucin. I

Hvbridomacellelinie. der producerer monoklonait antistof Onc-M27 I

NZB-mus immuniseredes i.p. og s.c. uden adjuvans med 3 injektioner beståen- I

20 de af 8,5 x 106 til 107 W5-6-celler hver 3. uge. En i.p. og s.c. booster beståen- de af 3 x 106 W5-6-celler og 200 pg MFGM uden adjuvans blevet indgivet efter

23 dage. I

Hvbridomacellelinie. der producerer monoklonait antistof Onc-M29 oq Qnc-M30 I

25 . I

Neonatal Balb/c mus (fra Balb/c mus opnået fra FHCRC) immuniseredes i.p. I

uden adjuvans med én injektion bestående af 107 US-5-celler, derpå med en I

uges mellemrum i.p. med 107 til 2 x 107 W5-6-celler uden adjuvans efterfulgt 2 I

1/2 måned senere af en i.p. injektion af 107 W5-6-celler uden adjuvans og en I

30 s.c. injektion af 310 enheder CsCI-gradientrenset mælkemucin. 55 dage sene- I

re, før udførelse af cellesammensmeltning blev der indgivet en i.p. og s.c.

booster injektion bestående af 5 x 106 W5-6-celler og 1000 enheder CsCI- I

gradientrenset mælkemucin. I

DK 175635 B1 25

Hvbridoma. der producerer monoklonalt antistof Onc-M38

Balb/c mus immuniseredes s.c. 3 gange med 3-ugers intervaller under anven-5 delse af 800 enheder affinitetsrenset pleuralt effusionsmucin fra en patient med brystcancer (prøve nr. H3415). Mucinet var bundet til poly-L-lysin-overtrukne kiselsyreanhydridperier (0,007 μ, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) før injektion i musene. 18 dage efter den tredie immunisering med affinitetsrenset effusionsmucin modtog musene en i.p. booster bestående af 4000 enheder 10 affinitetsrenset mucin.

Hybridomacellelinierne, der producerer disse hidtil ukendte monoklonale antistoffer, som er anført i tabel III, er deponeret ved ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, 20851 MD, USA. De til fremstilling af omhandlede, hidtil ukendte 15 antistoffer udviklede immuniseringsmetoder, som er beskrevet ovenfor, opsummeres i tabel III. De deponerede hybridomacellelinier og de monoklonale antistoffer, som produceres deraf, fremgår desuden af tabel III.

-

26 I

DK 175635 B1 I

Tabel 111 I

Beskrivelse af hidtil ukendte antistoffer I

Monoklonalt Antigen- I

5 antistof Isotype1 Immunogen2 identifikation3 ATCC nr. I

Onc-M8 lgGI MFGM, mælkeafledt IP, IB, DDIA HB9209 I

mucin I

Onc-M10 lgGI MCF-7-celler, MFGM IP, IB, DDIA HB 9244 I

10 Onc-M11 lgGI MCF-7-celler, MFGM IP, IB, DDIA HB9245 I

Onc-M12 lgGI MCF-7-celler, MFGM IP, IB, DDIA HB 9246 I

Onc-M15 lgGI MCF-7-celler, MFGM IP, IB, DDIA HB9247 I

Onc-M16 lgGI W5-6-celler, MCF-7- IP, IB, DDIA HB9216 I

celler, MFGM I

15 Onc-M21 lgGI W5-6-celler, MCF-7- IP, DDIA HB 9248 I

celler, MFGM I

Onc-M22 lgGI MCF-7-celler, MFGM IP, IB, DDIA HB9249 I

Onc-M23 lgGI MCF-7-ce(ler, MFGM IP, IB, DDIA HB 9250 I

Onc-M25 lgGI W5-6-celler, MCF-7- IP, IB, DDIA HB9217 I

20 celler, MFGM I

Onc-M26 IgM H3300 mucin, W5-6- IB, DDIA HB9212 I

celler I

Onc-M27 lgG2a W5-6-celler, MFGM IB, DDIA HB 9229 I

Onc-M294 lgGI US-5-celler, W5-6- IP, DDIA HB92435 I

25 o celler, mælkeafledt HB 9210 I

mucin I

Onc-M30 lgGI US-5-celler, W5-6- DDIA HB9211 I

celler, mælkeafledt I

mucin I

30 One M38 lgGI mucin IP, IB, DDIA HB 9365 I

DK 175635 B1 27 1/ Isotyper bestemtes ved hjælp af ELISA under anvendelse af klassespecifikke antistoffer.

2/ Mus immuniseredes med MFGM, MCF-7, W5-6-celler og US-5 eller rensede mucinpræparater som beskrevet ovenfor.

5 31 Antigener, som genkendtes af omhandlede, hidtil ukendte monoklonale antistoffer identificeredes ved hjælp af følgende metoder: immunfældning (IP), im-munblotting (IB) eller dobbelt determinantimmunanalyse (DDIA) som beskrevet i eksempel 2.

4/ De i eksempel 2 anførte data opnåedes fra en klon, hybridomacelletinie Onc-10 M29.41 (ATCC nr, HB 9243). Subclon, Onc-M29 (ATCC nr. HB 9210) stammede fra en søsterklon til Onc-M29.41 og karakteriseredes tilsvarende.

5/ HB 9229 og HB 9243 udgør ikke en del af opfindelsen.

I DK 175635 B1 I

I 28 I

I Screening I

I Forskellige screeningsmetoder anvendtes til isolering af hybridomacellelinier, I

I som producerede monoklonale antistoffer, der var i stand til at bindes til rense- I

I 5 de mucinantigener. I

I Til påvisning af antistoffer, som var til stede i hybridomacelleliniesupematanter I

I og som var i stand til at bindes til rensede muciner opnået som beskrevet I

I ovenfor, udvikledes en WGA-infangningsanalyse. Ved denne metode immobili- I

I 10 seredes rensede muciner fra pleural effusion eller mælk på fladbundede poly- I

I styren "Mikrotiter,"-plader (Immunolon II, Dynatech Laboratories, Inc., Alexan- I

I dria, VA) med 96 brønde under anvendelse af Tritium vulgaris lectin (hvedeki- I

I magglutinin "WGA" fra Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). "Mikrotiter,"- I

I pladerne præparareredes ved at tilsætte 50 μΙ/brønd af en 20 pg/ml opløsning

I 15 af WGA i 50 mM tris-HCI indeholdende CaCI2 og 10 mM MgCI2 ved pH 8,0. I

I Efter inkubation ved 250C i 2 timer til overtrækning af pladerne med WGA fjer- I

I nedes opløsningen ved opsugning. Efter affinitetschromatografi tilsattes så I

I rensede muciner (1,0 inhibitorisk enhed (inhibering af W1-antistofbinding til I

I W1-antigen) pr. brønd medmindre andet et angivet) i 50 mM tris-HCI ved pH 8 I

I 20 og indeholdende 1 mM CaCI2 og 1 mM MgCI2. Pladerne inkuberedes så i et I

I tidsrum fra 1 til 4 timer ved 250C og vaskedes under anvendelse af PBS-puffer I

I og 2% FCS. I

I Til udførelse af analysen tilsattes forud identificerede monoklonale antistoffer i I

I 25 mætningskoncentrationer (1 pg/ml) for rensede antistoffer eller i fortyndinger på

I 1:50 for ascitesvæsker. Til analyse af hidtil ukendte antistoffer sattes superna- I

I tanter fra hybridomacelleliniekulturer ufortyndet til pladerne. I

I Udførelsen af WGA-analysen testedes med stigende mængder renset mælke- I

I 30 og effusionsmucin ved et forsøg vist i fig. 1. Dosis-responskurven for binding af I

I W1-antistoffet var lineært over mere end et ti-foldigt interval for inhibitoriske I

enheder pr. brønd både for mælk og blandede tumorafledte muciner, men kur- I

ven for den tumorafledte prøve skiftede til højre og blev stejlere. Andre afprø- I

DK 175635 B1 29 vede antistoffer udviste en dosis-responskurve som var parallel med kurverne for W1-antistoffer, men hvis relative positioner skiftede i afhængighed af den særlige mucinkiide. Disse resultater indikerer, at epitoper, som genkendes af antistofferne, er udtrykt med forskellige relative tætheder på muciner fra nor-5 male og fra tumorkilder.

En indirekte enzymimmunoanalyse (ELISA) anvendtes til påvisning af antistofbinding ved hjælp af WGA-immobiliserede, rensede mucinantigener. (Denne metode benævnes i det følgende som "WGA indfangsningsprøve"). I korthed 10 måles bindingen af de som beskrevet ovenfor fremstillede, hidtil ukendte mo-noklonale antistoffer ved tilsætning af peberrodsperoxidase (HRP)-konjugeret gede-antimus-immunoglubolin (CAPPEL, Malvern, PA) (HRP) eller ved anvendelse af IgG-specifikt gede-antimus-anstistof (Southern Biotek, Birmingham, AL) til reduktion af det opnåede antal IgG-antistof.

15

Til præliminær screening af Onc-M8-hybridomacellelinien testedes susperna-tanter 9 dage efter sammensmeltning med hensyn til binding til renset pleuralt effusionsmucin under anvende Ise af den ovenfor beskrevne WGA indfangningsanalyse. Hybridomacellelinier, der viste sig positive ved bindingtesten, 20 underkastedes en anden kompetitiv bindingsanalyse under anvendelse af blandinger af normalt serum og tumorserum.

Onc-M10, Onc-M11, Onc-M12 og Onc-M15 hybridomacelleliniesupernatanter screenedes først ved en test i form af en ELISA-analyse for binding til levende 25 (ufikserede) MCF-7-celler. Hybridomacelleliniesupematanter, der var positive ved tests, underkastedes to sekundære screeninger. Først udførtes en kompe-tiv bindingsanalyse under anvendelse af levende MCF-7-celler, hvor hver hy-bridomacelleliniesupernatant testedes med hensyn til antistof, som var i stand til at bindes til cellerne. Derpå screenedes supematanter under anvendelse af 30 polyiysin til påvisning af binding til renset mælkmucin bundet til plader.

Til præliminær screening af Onc-M16 og Onc-M25 hybridomacelleliniesuper-natanter fra sammensmeltning af myelomaceller med miltceller fra immunise- I DK 175635 B1 I 30 I rede mus testedes bindingen til paraformaldehydfikserede W5-6-celler. Bindin- I gensanalysen udførtes på paraformaldehydfikserede cellemonolag som be- I skrevet af Linsley et al., i Biochemistry, ovenfor. Hybridomacellelinier, som viste I sig positive ved testen underkastedes en sekundær screening ved at iagttage I 5 det fiuorescente farvningsmønster for bindingen af antistof til Calu-1-celler.

Onc-M21-hybridomacellelinien screenedes præliminært ved at teste bindingen

I overfor polylysinbundet MFGM under anvendelse af ELISA. Hybridomacelleli- I

I nier, der viste sig positive ved testen underkastedes en sekundær screening I

10 ved brug af WGA indfangsningsprøven til påvisning af binding under anvendel- I

' se af tumorserum og normalt serum. I

I Onc-M22 og Onc-M23 hybridomacelleliniesupematanterfra sammensmeltning I

I af myelomaceller med miltceller fra immuniserede mus screenedes prælimi- I

15 nært 11 og 13 dage efter sammensmeltningen. WGA indfangningsprøven an- I

vendtes til i hybridomacelleliniesupematanten at påvise tilstedeværende anti- I

I stof, der var i stand til fortrinsvis at bindes til tumorserumprøver, fremfor til nor- I

I male serumprøver. I

I 20 Onc-M26 hybridomacelleliniesupematanten fra sammensmeltningen af myelo- I

I maceller med miltceller fra immuniserede mus testedes preliminært 7 dage ef- I

ter cellesammensmeltningen ved binding til renset pleuralt effusionsmucin ind- I

I fanget af lectin under anvendelse af WGA bindingsanalysen. Hvor binding på- I

I vistes anvendtes WGA-ELISA-analysen så til at sammenligne bindingsevnen I

I 25 hos hybridoamcelleliniesupematanten overfor WGA-indfanget mucin ud fra se- I

I rum opnået fra patienter med tumorer i forhold til WGA-indfanget mucin fra I

I normalt serum. I

I Onc-M27, Onc-M29 og Onc-M30 hybridmacelleliniesupematanterne testedes 7 I

I 30 dage efter sammensmeltningen ved binding til CsCI-renset mælkemucin opnå- I

I et som beskrevet ovenfor under anvendelse af WGA-indfangningsanalysen. I

I Hybridomacelleliniesupernatanter, der udviste positive testresultater genanaly- I

I seredes på affinitetsrenset mælkemucin under anvendelse af WGA-ELISA- I

DK 175635 B1 31 analysen. Hybridomacelleliniesupematanterne screenedes også ved sammen-ligningsbinding til IgG og IgM-specifikke gede-antimus-antistoffer, idet su'per-natanter, der viste sig specifikke overfor IgG udvalgtes til yderligere karakterisering.

5

Onc-M38 hybridomacelleliniesupematanten screenedes for nærværelse af antistof ved binding til gradientrenset pléuralt effusionsmucin indfanget af lectin under anvendelse af WGA-bindingsanalysen. De hybridomacelleliniesuperna-tanter, der viste sig positive ved testen, testedes atter ved WGA-10 bindingsanalysen under anvendelse af gradient- og affinitetsrenset pléuralt ef-fusionsmucin.

Hybridomacelleliniesupematanter, der producerede monoklonale antistoffer, som udviste binding til mucinantigen (renset antigen eller celle-associeret) som 15 beskrevet ovenfor, injiceredes i pristan-behandlede mus til frembringelse af ascitesvæske, hvorfra de monoklonale antistoffer oprensedes under anvendelse af kendte oprensningsmetoder. Efter ammoniumsulfatrensning rensedes IgG-antistoffer ved ionbytning på "DEAE Sephacer-kolonner (Pharmacia,

Uppsala, Sweden) og IgM-antistoffet (M26) rensedes under anvendelse af stør-20 relsesfraktionering på en "Sephacryl S-300"-kolonne (Pharmacia). Isotyper (immunoglobulin underklasser af antistofferne) af rensede antistoffer bestemtes ved en enzymimmUnoanalyse (beskrevet nedenfor) under anvendelse af klassespecifikke antistoffer (Southern Biotek).

25 Eksempel 3

Karakterisering af omhandlede hidtil ukendte monoklonale antistoffer

Evnen hos de som beskrevet ovenfor isolerede hidtil ukendte antistoffer til at bindes til alle de oprensede muciner under anvendelse af den ovenfor be-30 skrevne WGA-indfangningsanalyse testedes. Der anvendtes en enkeltkoncentration på 1 i5 inhibitoriske enheder antigen pr. brønd og mætningskoncentrationer af antistof (1 pg/ml). Substratinkubationen standsedes ved opnåelse afen maksimal O.D.-værdi for hver prøve i intervallet fra 0,4 til 1,4.

I DK 175635 B1 I

I 32 I

I Forskellige yderligere metoder anvendtes til at demonstrere, atomhandlede, I

I hidtil ukendte antistoffer genkendte mucinantigen som også blev bundet til W1- I

I antistof. Disse metoder var immunfældning (IP) fra fra tumorcelleekstrakter I

I 5 mærket med enten 3H-glucosamin eller 3H-threonin, og immunoblotting (IB) på I

I rensede muciner eller cellemembranpræparater som beskrevet af Linsley et al., I

I Biochemistry. 25, side 2978 (1986). Der anvendtes også en dobbelt determi- I

I nant immunoanalyse (DDIA), hvorved antistoffernes evne til at indfange muci- I

I ner, som bandt til HRP-konjugeretW1-antistof (tabel III) testedes. I

I 10 I

I De omhandlede, hidtil ukendte antistoffer testedes også med hensyn til binding I

I til paraformaldehydfikserede, dyrkede W5-6-cellelinier som beskrevet i Linsley I

I et al.. Biochemistry. 25. side 2978 (1986V I

I 15 Resultater I

I Antistofbindinq til renset mucinantigen I

I De i det foreliggende producerede monoklonale antistoffer reagerer med muci- I

I ner fra human mælk, tumorcellelinier, pleurale effusionsvæsker og tumorer iføl- I

I 20 ge de ovenfor beskrevne WGA-indfangningsanalyser og DDIA- I

I bindingsanalyser. De fleste af de i det foreliggende beskrevne, hidtil ukendte I

I antistoffer reagerede ved mere end en metode med muciner, idet dog DDIA- I

I metoden alene anvendtes i forbindelse med antistoffet Onc-M30. Da de opren- I

I sede muciner indeholder W1-epitop (se tabel IV) reagerer omhandlede, hidtil I

I 25 ukendte antistoffer derfor enten med W1-epitopen eller med, hvad der synes at I

I være hidtil ukendte epitoper på mucinantigener. Disse antistoffer kan også bin- I

I des til yderligere epitoper på mucinantigener, såsom T- og Tn-epitopeme. I

DK 175635 B1 33

Tabel IV

Antistofbindino til rensede muciner1

Mucinkilde: Brysttumorer 5

Antisto'f H3300 H3415 Turrorer MILK 1 MILK 2 MILK 7 MILK li

Intet 0.0L1* 0.028 0.008 0.010 07θ12 0.013 0.049 10 Tidligere beskrevne antistoffer

Wl 0-891 0,959 0,408 0,767 0-629 0,815 0,983 W9 0*289 0^53 0,099 0,609 0,566 0,635 0.840 HMFG-I 0,036 0-177 0,052 0,520 0,492 0,597 0,796 HMFG-2 0,020 0,158 0,030 0,420 0,327 0,328 0,533 C6 0,017 0,050 0,021 0,538 0,418 0,483 0,S29 C0-51.4 0,012 0,033 0,013 0,160 0,016 0,128 *0,393 L-17 0,012 0,030 0,013 0,1S0 0,013 0.136 0,246 15 B72.3 0,032 0,088 0,041 0,022 0,022 0,022 0,051 DUPAN-2 0,052 0,102 0,058 oJo35 0,03S 0,029 0,059 CA 19-9 0,013 0,034 0,013 0,020 0,021 0,020 0,045 C0-30.1 0,011 0,028 0,012 0,027 0,013 0,050 0,047 L15 0,011 0,034 0,012 0,012 0,011 0,014 0,044

Hidtil ukendte' antistoffer 0nc-M8 0,079 0,671 0,140 1,050 1,048 1,031 1,318 20 One-M10 0,071 0,122 0,057 0,031 0,028 0,031 0,062

One-Mil .0,014 0,051 0,020* 0,011 0,013 0,015 0,043 0nc-M12 '0,030 0,141 0,088 0,020 0,016 0,020 0,053 0nc-M15 0,013 07118 -0,015 1,086 0,610 0,888 * 1,093 0nc-M16 0,273 0,355 0,199 .1,180. 0,871 0,978 .1,135 0nc-M21 . 0,012 0,033 0,014 0,050 0,024' 0,030 " 0,116 0nc-M22 0,011 0,070 0,014 1,286 0,825 1,071 1,380

Onc-M23 0,014 0,206 0-024 1,404 0,707 1,054 1,334

One-M25 0,071 0,094 θ(θ67 0,937 0,671 0,890 0,902- 25 0nc-M26 0,402 0,047 0-023 0,034 0,023 0,019 0,055

Onc-M27 0,029 0,091 0,015 0,370 0,246 0,209 0,283

Onc-M29 0,014 0,031 0,013 0,065 0,022 0,040 0,159

One-M30 0,013 0,031 0,012 0,053 0,021 0,036 0,156 1/ Målinger er angivet i absorbanceenheder, O.D.490.

30

34 I

DK 175635 B1 I

Som det fremgår af tabel IV gav nogle monoklonale antistoffer (Onc-M8, One- I

M16, W1 og W9) høje absorbansværdier (_0,1) ved binding til hovedparten af I

prøver fra mælk- og tumorkilder, visse antistoffer (Onc-M15, Onc-M22, One- fl

5 M23,m Onc-M25, Onc-M27, HMFG-1 og HMFG-2) høje absorbansværdier - I

(_0,1) ved binding til hovedparten af mælkemueiner, men ikke til tumorafledte I

prøver, og andre antistoffer (Onc-M10, Onc-M11, Onc-M12, Onc-M21, One- I

M29, Onc-M30, B72.3, DUPAN-2 og Cal9-9) absorbansværdier på <0,1 som I

følger af manglende binding til hovedparten af prøverne fra enten mælke- eller I

10 tumorkilder. Antistof Onc-M25 udviste en stærk binding til pleural effusionsmu-

cin (prøve H3300), men svag binding til alle mælkeafledte mueinprøver. Be- I

mærk at, skønt visse antistoffer ikke bandt signifikant til pleurale effusions- eller I

brysttumormueiner ved den direkte bindingsanalyse, påvistes binding af alle I

antistoffer til mueinepitoper på den pleurale effusionsmueinprøve H3300 ved

15 den mere følsomme DDIA-analyse. Onc-M38 blev ikke testet ved denne analy- I

se, men gav ved et separat forsøg høje absorbansværdier for binding til mælk I

og effusionsmuein. I

Muciner oprenset fra mælk fra et antal donorer viste sig at være antigent ens, 20 hvilket antyder at de testede antistoffer ikke påviser polymorfe antigendetermi- nanter, såsom blodgruppeantigener (f.eks. ABO og Lewis). Skønt 80% af be-

folkningen er Lewis-positive (og 2 af mælkedonorerne, 1 og 7, ved salivatest I

vistes at være Lewis-positive), besad ingen af de tumorafledte muciner ved I

bindingsanalysen påviselige niveauer af Lewis-antigener. Ingen af mælkemu- I

25 cinpræparaterne (inklusive prøve 1 og prøve 7) besad påviselige niveauer af I

Lews b (antistof Co-30.1) eller Lewis y (antistof L15), medens 3 af præparater- ne (inklusive prøve 1 og 7) besad påviselige, omend lave, niveauer af Lewis a Η

(antistof CO-51.4) og Lewis x (antistof L17). Dette antyder at Lewis-antigener I

kun udtrykkes svagt i mælkemuein og i meget ringe grad, om muligt slet ikke, i I

30 mucin stammende fra brystcarcinomer. I modsætning hertil er disse epitoper I

blevet påvist på muein-antigener af tyktarmscarcinomer. Der henvises til Mag- I

nani et al., Cancer Research. 43, side 5489 (1983), og Johnson et al., Cancer I

Research. 46. side 850 (1986). I

DK 175635 B1 35

Ved sammenligning med mælkemuciner udviser de tumorafledte muciner ganske afvigende antistofbindingsprofiler. Værdierne antyder, at monoklonale antistoffer, der genkender hidtil ukendte mucinepitoper identificeredes under an-5 vendelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen. W1-antistof bandt i relativt højere grad end andre testede antistoffer til alle tumorafledte prøver, hvilket vil sige at bindingen af alle andre antistoffer var reduceret i forhold til W1.

Ét af de i det foreliggende beskrevne, hidtil ukendte antistoffer, Onc-M26, pro-10 duceret af hybridomacellelinie ATCC nr. HB 9212, påviste den mest "tumor-specifikke" epitop. Denne epitop påvistes også på andre tumorafledte prøver, når højere koncentrationer af muciner anvendtes ved analysen, men i et langt lavere niveau på muciner fra mælkeprøver. Onc-M26 synes således at være et monoklonalt antistof, som er i stand til at skelne mellem nærværelsen af nor-15 male og cancervævsforbundne muciner i serum fra mennesker ved analyser til påvisning af cancer.

Disse data fastslår, at de fleste af de omhandlede, hidtil ukendte antistoffer udviser specificiteter, som afviger af specificiteten af tidligere beskrevne antistof-20 fer. Epitoper på antistof Onc-M21 og Onc-M29 kunne imidlertid på basis af disse data ikke skelnes fra epitoper på andre antistoffer, såsom B72.3 og DUPAN 2, da de ikke bandt signifikant til de rensede mucinkilder ved analysen. W5-6-cellebindingsforsøgene viser at Onc-M21 og Onc-M29 sammenlignet med de tidligere kendte antistoffer fortrinsvis bindes til W5-6-cellelinien, hvilket påviser 25 at disse antistoffer besidder en unik specificitet.

Disse resultater påviser at rensede muciner stammende fra tumorkilder ved anvendelse af omhandlede fremgangsmåder adskiller sig immunologisk fra muciner fra normalt brystepithel, der findes i mælk. Omhandlede data antyder 30 også, at antigene epitoper, der findes på muciner fra normalt brystepithelvæv kan være skjult af andre determinanter eller kan forefindes i formindsket grad på muciner opnået fra tumorer. Dette antyder på sin side, at tumormuciner kan indeholde epitoper, som ikke findes på muciner fra normale kilder. Derfor kan

I DK 175635 B1 I

I 36 I

I rensede muciner inklusive tumorafledte muciner tilvejebringe et forbedret im- I

I munogen til udvikling af monoklonale antistoffer, der er i stand til at genkende I

I mucinantigen, især sådanne antistoffer, der fortrinsvis er i stand til at reagere I

I med tumorafledte muciner fremfor muciner fra normale kilder. I

I 5 I

I Eksempel 4 I

I Serumanalvse under anvendelse af monokolonalt antistof M26 οα M29 I

I For at demonstrere anvendeligheden af de omhandlede monoklonale antistof- I

I 10 fer udførtes en DDIA under brug af de ovenfor i eksempel 2 opnåede monoklo- I

I nåle antistoffer Onc-M26 og Onc-M29. W1-antistoffet anvendtes til sammenlig- I

I ning. I

I Immunolon Il-plader inkuberedes med 50 μΙ/brønd af 10 μΙ/ml Onc-M26 eller I

I 15 Onc-M29-antistof i 50 mM tris-puffer, pH 8,0, i 1 time til overtrækning af plader- I

I ne med antistof ("indfangningsantistof"). Væsken sugedes bort og pladerne I

I blokkeredes under anvendelse af 350 μΙ/brønd blokkeringspuffer (0,5% I

I kvægserumalbumin (BSA), 5% saccharose og 5% tris-puffer) i et tidsrum fra 1 I

I time til natten over. Pladerne sugedes igen tørre natten over under anvendelse I

I 20 af papirhåndklæder. Pladerne opbevaredes tørt i plastfolie ved stuetemperatur. I

I Serum stammende fra patienter med diagnostiseret cancer og kontrolserum I

I (fra normale patienter) fortyndedes under anvendelse af føtalt kalveserum I

I (FCS). Når analysen til påvisning af indfangningsantistof udførtes under an- I

I vendelse af det monoklonale antistof Onc-M26 og W1 -antistoffet, fortyndedes I

I 25 både serum og kontrolserum i et forhold på 1:8. Ved anvendelse af det mo- I

I noklonale antistof M29 og W1-antistoffet til analyse, fortyndedes serum og

I kontrolserum i et forhold på 1:50. Absorbansstandarderne for det monoklonale I

I antistof Onc-M26 fremstilledes ved volumetrisk fortynding af en som beskrevet I

I ovenfor opnået pleural effusionsprøve (H3375) i en blanding bestående af I

I 30 blandet serum og FCS. Absorbansstandarder for Onc-M29-antistoffet fremstil- I

I ledes ved fortynding af prøve nr. H3375 i FCS. Absorbansstandarder kalibrere- I

I des ved at tildele blandingen af serum en værdi på 20 absorbansenheder pr. I

I ml. Kontrolprøver bestod af serumblandinger opnået fra ansatte ved Oncogen I

DK 175635 B1 37 og to pleurale brysteffusionsprøver. Både standardopløsninger og kontrolopløsninger blev opdelt i portioner og opbevaret ved -700C.

50 pi fortyndet serum, kohtrolopløsninger og standardopløsninger udpipettere-5 des in dubio in overtrukne brønde. Brøndene forsegledes med en pladeforseglingsanordning og inkuberedes ved stuetemperatur i 1 time. Pladerne skylledes derefter manuelt to gange under anvendelse af 2% FCS i phosphatpuffer-holdigt saltvand, (PBS)-puffer. 50 μΙ af en passende fortynding af W1-HRP konjugeret antistof sattes til pladerne. Til M26-analysen anvendtes en koncen-10 tration på 0,5 pg/ml W1-HRP. Til M29-analysen viste det sig, at en koncentration på 0,1 μΙ/ml W1-HRP-konjugat var optimal. Alle konjugater fortyndedes i 2% FCS og PBS. Pladerne forsegledes så igen og inkuberedes i 1 time ved stuetemperatur. Pladerne skylledes derefter manuelt 3 gange under anvendelse af PBS-puffer. 100 μΙ OPD-substrat sattes til pladerne, som inkuberedes i 1 time i 15 mørke. Reaktionerne blev afbrudt ved anvendelse af 50 μΙ 1,5 N svovlsyre. Ab-sorbansen aflæstes ved 490 nm. Dobbeltbestemmelser med en absorbans, der indbyrdes afveg mere end 10 enheder/ml (eller 2 enheder/ml, hvis absorban-sen er mindre end 10 enheder/ml) gentoges. Prøver, som gav høje resultater fortyndedes og gentoges. Analyserne sammenlignedes med hensyn til evnen til 20 at skelne mellem de to grupper af patienter (med og uden cancer). Afskæringsværdier (enheder/ml) udvalgtes således, at en specificitet på ca. 90% (dvs.

90% af kontrolgruppen gav negativt resultat) opnåedes. Resultatet fremgår ag tabel V.

I DK 175635 B1 I

I 38 I

I Tabel V I

I Serumanalvse i % over afskaerinasværdi I

I 5 — i * > · * r-^r I

I heder/ml) _ I

I Wlb 115 3,1 6,8 11,4 57,8 0,5 2,9 7,2 4,0 I

I M26 95 4?3 5,7 11,4 43,1 0,0 0,0 1,1 0,5 I

I 10 ' ' ~~ I

I M29 60 5,5 11,4 18,2 66,4 1,5 IJ. 6,8 4,0

I M26 95(M26) 8,0 14:8 22.7 75,0 1;5 2,2 7,6 4,3 I

I M29c 60(M29) '

I 15 I

I 3 Kode for Beskrivelse Antal prøver I

I afprøvet serum I

I 0 Ingen tegn på sygdom 163 I

I 1 Primær 88 I

I 2 Regional 88 I

I 3 Metastatisk 116 I

I '4 Sund 202 I

I 5 Brystsygdom 138 I

I 6 Godartet sygdom 264 I

I ^ Testnavn Immobil i seret indfang- HRP-mærket I

I ningsantistof andet påvisnings- I

I antistof I

I W1 W1 Wl-HRP I

I M26 0nc-M26 Wl-HRP I

I M29 0nc-M29 Wl-HRP I

I c Disse værdier angiver det procentvise antal prøver, som viste sig po- I

I sitive enten ved M26 eller M29 testen.

DK 175635 B1 I

39 I

Af tabel V fremgår resultaterne af DDIA-analysen på serum fra cancerpatienter I

under anvendelse af det monoklonale antistof W1 og omhandlede hidtil I

ukendte monoklonale antistoffer Onc-M26 og Onc-M29. Testkolonnen angiver I

hvilke monoklonale antistoffer, der anvendtes sammen med det monoklonale I

5 W1 -antistof ved den ovenfor beskrevne DDIA-analyse. Ved W1 -testen (homo- I

log DDIA) immobiliseredes det monoklane W1-antistof som indfangningsanti- I

stof til binding af det i serum fra mennesker tilstedeværende mucinantigen. Det I

andet påvisningsantistof, som anvendtes ved disse tester var W1-antistof kon- I

jugeret med HRP. Ved M26-testen var det immobiiiserede antistof Onc-M26 og I

10 ved M29-testen immobiliseredes Onc-M29-antistoffet. Tallene i afskærings- I

værdikolonnen, der følger efter antistofbetegnelsen angiver antigenniveauet i I

enheder/ml over hvilket det bestemtes, at analysen var positiv med hensyn til I

I nærværelse af tumor-associeret mucin. Kolonnerne 0-6 angiver for den pågæl- I

I dende cancertype det procentvise antal patienter, der under anvendelse af de I

I 15 angivne antistoffer viste sig at have et W1-epitopniveau, der oversteg det i af- I

I skæringsværdikolonnen angivne niveau. Kontrolkolonnen angiver det procent- I

I vise antal analyser af kontrolserum (fra patienter uden cancer) med en positiv I

I reaktion (dvs. påvisning af det i afskæringsværdikolonnen angivne antigenni- I . veau, såkaldte "falske positive" resultater). Antallet af patienter i hver serum- I 20 kategori (0-6) og den hos disse patienter tilstedeværende cancertype er også I angivet i tabel V. Når Onc-M26 var opfangningsantistoffet diagnostiseredes I cancer ved et antigenafskæringsværdiniveau på over 95 enheder/ml hos ca.

I 43% af de 116 patienter med metastatisk cancer, idet Onc-M26 opfangnings- I antistoffet og W1-påvisningsantistoffet anvendtes ved analysen. Kun hos 0,5% I 25 af kontrolpatienterne blev der fejlagtigt diagnostiseret cancer (falske positiver).

I Anvendelse af Onc-M29-antistoffet resulterede i korrekt diagnostisering hos I 66% af patienterne, idet Onc-M29-antistoffet samtidigt gav 4% falske positive I resultater. Når W1-antistoffet anvendtes som det primære og andet antistof ved I analysen diagnostiseredes cancer hos 58% af de 166 patienter, idet W1- I 30 antistoffet dog samtidigt gav 4% falske positive resultater.

I Anvendelsen af Onc-M29-antistoffet ved DDIA-analysen diagnostiserede såle- I des korrekt cancer hos en større andel af cancerpatienter end W1-antistoffet,

I DK 175635 B1 I

I 40 I

I hvilket indikerer en større følsomhed hos Onc-M29 som indfangningsantistof I

end hos W1 -antistoffet. Anvendelsen af Onc-M26-antistof resulterer i en noget I

I lavere følsomhed ved analysen end anvendelsen Onc-M29-antistoffet. Sam- I

I menlignet med W1 -antistoffet iagttages imidlertid et meget lavt antal falske po- I

I 5 sitive resultater (0,5%) og analysen er således mere specifik. En bedømmelse I

af de positive resultater for M26- eller M29-testen giver en mere følsom diag- I

nostisering af cancer end blot alene at anvende resultaterne af enten W26- el- I

ler M29-testen (diagnosen for 75% af patienterne med metastatisk cancer er I

I således positiv). Disse resultater påviser den potentielle nytte af de monoklo- I

I 10 nåle antistoffer Onc-M26 og Onc-M29 ved påvisningen af cancer i human se- I

I rum. I

I Eksempel 5 I

I Krvds-kompetitiv analyse af mucinantistofbindina I

1 15 I

I De monoklonale antistoffer ifølge den foreliggende opfindelse er yderligere ble- I

I vet karakteriseret ved kryds-kompetitive analyser, hvis resultater er anført i ta- I

I bel VI nedenfor. Ved disse analyser konstateredes, hvilken koncentration af I

I umærket mucinantistof; der resulterede i halvdelen (50%) af den maksimale I

I 20 inhibering af bindingen af en standardkoncentration (0,5 pg/ml) af 1251-mærket I

mucinantistof. En kryds-kompetitiv analyse udførtes mellem hvert af de mær- I

I kede (1251) antistoffer angivet i tabel V! og hvert af de umærkede antistoffer I

angivet ovenover kolonnerne i tabel VI. Den kompetitive binding af antistofferne I

I M8, M15, M16, M22, M23, M25, M27, W1, W9 og M38 måltes på CsCI-renset I

I 25 mælkeafledt mucin, hvorimod bindingen af antistofferne M10, M11 og M12 be- I

I stemtes med hensyn til MCF7-cellelinien. Bindingen af Onc-M21 og Onc-M29 I

I bestemtes med hensyn til W5-6-cellelinien. Binding af 1251-mærket antistof ved I

I en koncentration på 0,5 pg/ml måltes i nærvær af stigende mængder umærke- I

I de antistoffer, op til 50 pg/ml. (M26-antistoffet indgik ikke i denne analyse, da I

I 30 det efter radiomærkning bandtes dårligt til immobiliseret mucin). I

I I tabel VI betegner"++++" at halvdelen af den maksimale inhibering forekom I

I ved en koncentration af umærket antistof på mindre end 3,2 pg/ml, H+++" at I

DK 175635 B1 41 halvdelen af den maksimale inhibering krævede en koncentration af umærket antistof på mellem 3,2 og 15,8 pg/ml, "++" at halvdelen af den maksimale inhibering krævede en koncentration af umærket antistof på mellem 16 og 31 pg/ml,"+" at halvdelen af den maksimale inhibering krævede en koncentration 5 af umærket antistof på mellem 32 og 50 pg/ml ogat halvdelen af den maksimale inhibering krævede en koncentration af umærket antistof, der oversteg 50 pg/ml.

Tabel VI

10 Krvds-kompetitiv analyse af mucinantistofbindina

Umærket antistof W1 W9 M8 M10 Mil M12 M15 M16 M21 M22 M23 M25 M27 M29 L2Si antistof W1 +++ - - - - - - - - - - - wg - +++ +++ - - - - +-*-+ — - - ++ - M3 3 - ' - - - - - - - - M8 - ++ +++ - - - - ♦+ + - - + - · - M16 - - +++ - - - - ++++ - - - +* - - M2 5 - ++ +++ - - - - ++++ - - - ♦++ - M15 ♦+♦ - — - - - ++++ - - ++++ +++ ++ M22 +♦+ - - - - - ++ - - +++ ♦++ - - - M23 +++ ++++ +++ - +++* +++ - +++ - M27 +++ - - - - - ++.--·- +++ +++ - + M10 +++4- - +♦++ . +++ - - - +++ - - - - -

Mil ++++ - - ++++ ++++ - - - - - - M12 ++++ - - +++ ++++ - - - - - - - M21 - -- -- - - - ++++ - - +-++ M2 9 - - - - - - ++++ - - *—+

I DK 175635 B1 I

I 42 I

I Med hensyn til resultaterne af den kryds-kompetitive analyse, der fremgår af I

I tabel VI, udviste adskillige antistoffer et unikt kryds-kompetitivt mønster, hvilket I

I antyder at disse antistoffer bindes til særlige epitoper. Det mest unike kryds- I

I 5 kompetitive mønster udvistes af antistofferne M21 og M29, som indbyrdes kon- I

I kurrerede om binding, men hverken blev udsat for konkurrence eller selv kon- I

I kurrerede med andre af de afprøvede antistoffer. Disse antistoffer genkender I

I derfor enten de samme eller rummeligt beslægtede epitoper, som afviger fra . I

I epitoper, der genkendes af de andre antistoffer. I

I 10 I

I Antistofferne W1 og M38 blev ikke udsat for konkurrence fra nogen af de andre I

I antistoffer, men konkurrerede selv med mange andre antistoffer med hensyn til I

I binding. Dette antyder at disse antistoffer bindes til særlige epitoper, som enten I

I svarer strukturelt til eller er rummeligt beslægtede med epitopeme for andre , I

I 15 antistoffer. Antistof M10 blev udsat for konkurrence fra adskillige andre anti- I

I stoffer, men konkurrerede med hensyn til binding på sin side kun med 1251- I

I M10, hvilket antyder, at dette antistof ligeledes binder til en særsklit epitop, som I

I er strukturelt eller rummeligt beslægtet med epitopeme for antistof W1, M8, I

I M16 og M38. Anstistof M10 konkurrerede imidlertid med hensyn til binding ikke I

I 20 signifikant med anstistof W1 ved afprøvning på MCF7-celler, hvortil dette anti- I

I stof bindes bedst. I

I De resterende antistoffer udviste et kryds-kompetitivt mønster, som antydede I

I strukturelle eller rummelige relationer imellem disse antistoffers respektive I

I 25 epitoper. For eksempel synes epitopeme for antistofferne W9, M8, M16 og M25 I

I at være beslægtede ligeså vel som epitopeme for M11 og M12. I

I Antistofferne M15, M22, M23 og M27 udviste også tilsvarende kryds- I

I kompetitive mønstre, skønt der iagttoges nogle forskelle. I almindelighed bin- I

I 30 des disse antistoffer til epitoper, som synes at være indbyrdes strukturelt eller I

I rummeligt beslægtede. Biokemiske data antyder, at disse antistoffer genkender I

I kemeproteinepitoper (se nedenfor). Baseret på kryds-kompetitive data er epi- I

I toper for disse fire antistoffer beslægtede med epitopen for antistof W1, og I

DK 175635 B1 43 epitoperne for antistofferne M22 og M23 er også beslægtede med epitopen for M38.

Sammenfattet indikerer de kryds-kompetitive mønstre mellem de hidtil ukendte 5 antistoffer og W1 og W9 nærværelsen af adskillige epitoper på mucinmolekyler.

Antistofferne M21 og M29 genkender epitoper, som enten er identiske eller nært beslægtede og som adskiller sig fra epitoperne, der genkendes af andre antistoffer. Alle andre antistoffer genkender epitoper, som deler strukturelle træk eller er sterisk beslægetde med epitoper for andre antistoffer. Antistoffer-10 ne W1, M10 og M38 genkender epitoper, som er beslægtede med, men ikke identiske med epitoperne for andre antistoffer. Antistofferne M11 og M12 genkender et eller flere nært beslægtede epitoper, som heller ikke er identisk eller identiske med epitoper genkendt af andre antistoffer. Det monoklonale antistof M38 identificerer en hidtil ukendt epitop, som ikke genkendes af de andre hidtil 15 ukendte monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen eller af W1 eller W9 antistofferne. Af det ovenstående fremgår, at det monoklonale antistof M38 udviser høj specificitet overfor en unik epitop på mucinantigener og således kan tjene en vigtig funktion, ikke blot i forbindelse med analyse til diagnostisering af tumorer hos patienter, men også i forbindelse med behandlingen af sådanne tu-20 morer under anvendelse af de ovenfor omhandlede metoder og fremgangsmåder.

Eksempel 6

Biokemisk karakterisering af epitoper

25 I

i

For at bestemme den biokemiske natur af de omhandlede hidtil ukendte anti- j stoffer undersøgtes indvirkningen af forskellige behandlinger på antistofbindingen til muciner.

30 Til bestemmelse af, hvorvidt carbohydratstruktureme krævedes for at binde antistofferne undersøgtes virkningen af natriumperiodat8-behandling på antistofbindingen (tabel VII). Muciner immobiliseredes på mikrotiterplader ved hjælp af WGA som beskrevet ovenfor og behandledes med natriumperiodat

I DK 175635 B1 I

I 44 I

I (Nal04) i koncentrationer fra 0,2 til 100 mM i en puffer af 50 mM natriumacetat, I

I pH 4,5, i et tidsrum på 30 minutter ved 370C. Den Milk 2-afledte mucinprøve I

I affmitetsrensedes under anvendelse af antistof W9 og den H3300-afledte mu- I

I cinprøve CsCI-rensedes. Muciner fra MCF7 og W5-6-cellemembraner solubili- I

I 5 seredés med en ikke-ionisk detergentopløsning (TNEN, Linsley et al., Biochem. I

I 25:2778-2986 (1986)) og separeredes fra detergentuopløseligt materiale ved I

I hjælp af centrifugering (390.000 x G) før immobilisering. Brøndene vaskedes I

I grundigt med PBS og behandledes med NaBH4 (100 mM i PBS) i yderligere 30 I

I minutter ved 370C. Efter behandlingerne blokkeredes brøndene med en 10% I

I 10 FCS-holdig bindingspuffer som beskrevet af Linsley et el., Biochem. 25:2978- I

I 2986 (1986), hvortil der henvises i det foreliggende, og antistofbindingen teste- I

I des ved indirekte ELISA. Den til 50% reduktion af bindingen krævede koncen- I

I tration af Nal04 bestemtes ved interpolering ud fra bestemte værdier. I

H -

I 15 Bindingen af et kontrolantistof (C6) til en defineret carbohydratepitop (l-struktur) I

I var følsom overfor periodatbehandlingen, idet 50% af den maksimale inhibering I

I af bindingen forekom ved 1 mM. Antistofferne W1 og W9 og M26 var mere føl- I

I somme overfor periodatbehandling end kontrolantistoffet, idet denne følsomhed I

I hos W1 og W9 tidligere var blevet påvist og antydede, at carbohydrat er nød- I

I 20 vendigt til binding af disse antistoffer. Fem andre antistoffer (M10, M11, M12, I M21 og M29) var periodatfølsomme, men krævede signifikant højere koncen-

I trationer end kontrolantistoffet. De resterende 8 antistoffer var ufølsomme I

I overfor periodatbehandling, selv ved ekstremt høje koncentrationer (0,1 Μ).

I Epitoperne for alle de omhandlede hidtil ukendte antistoffer, bortset fra M26, I

I 25 var således mindre følsomme overfor periodatoxidation end antistofferne W1 I

I og W9 samt kontrolantistoffer C6. I

DK 175635 B1 45

Tabel VII

Virkning af periodatbehandlina på binding af antistof g Nødvendig koncentration til 50% reduktion af maksimal binding (mM)

Antistof_Mucin_______

Kontrdl C5 MILK 2 1

Jfecjet følsan — —RI- MILK 2 0,2 10 W9 MILK 2 <0'2 M26 H3300 <0'2

Middel-følsom M10 MCF7 4 * Mil MCF7 51

Ml 2 MCF7 78 M21 WS-6 10 M29 W5-6 64 15 .Resistent M8 MILK 2 >100

Ml5 MILK 2 >100

Ml6 MILK 2 >100 M22 MILK 2 >100 M23 MILK' 2 >100 M25 MILK 2 >100 - M27 . . MILK 2 - >100 20 M38 MILK 2 - >100 ' 25

Til afprøvning af, hvorvidt sialsyre var nødvendig for antistofbinding afprøvedes antistofferne med hensyn til sensitivitet overfor neuraminidase ved det i tabel VIII sammenfattede eksperiment. Muciner immobiliseredes på mikrotiterplader 30 ved hjælp af WGA og behandledes med neuraminidase fra Vibrio cholera som beskrevet af Linsley et al., Cancer Res. 46, ovenfor. Neuraminidase (4,5 m-enheder/brønd) tilsattes i 150 mM NaCI, 50 mM natriumacetat, pH 5,5 og 0,1%

CaCI2 i 1 time ved 370C. Brøndene blokkeredes så med bindingspuffer inde-

I DK 175635 B1 I

I 46 I

I holdende 10% FCS og testedes med hensyn til antistofbinding ved indirekte I

I ELISA. I

I Tabel VIII I

I 5 Virkning af neuraminidase-behandlina på antistofbinding I

I _Absorbaps^__ I

| _ ubehandlet behandlet I

Antistoi Muc in ’ ' - |

I Kontrol- · ' “ ' I

I 10 C6 H3300 5 440 I

Følsom I

W1 H3300 1071 226 I

W9 H3300 412 2 I

M26 H3300 568 0 I

I Forøget binding I

I M8 H3300 43 569 I

15 Ml 6 H3300 472 751 I

M25 H3300 57 249 I

M21 W5-6 129 246 I

M27 MILK-2 232 598 I

M29 W5-6 176 276 I

I Resistent- |

I M10 MCF7 756 837 I

I Mil MCF7 · 515. 584 I

20 Ml2 MCF7 1178 ' H88 I

Ml5 MILK-2 962 · 1278 I

M22 MILK-2 . 1282 1315 I

M23 MILK-2 1192 1282 I

M38 H3300 1228 1146 I

25 I

1 Absorbans ved 490 nm x 1000 I

30 I

DK 175635 B1 47

Bindingen af kontrolantistoffet (C6) forøgedes ved behandlingen i overensstemmelse med kendte bindingspræferencer for dette antistof til ikke-sialylerede strukturer. Bindingen af antistoffet M8, M16, M25, M21, M27 og M29 til H3300-afledt mucin forøgedes også ved neuraminidase-behandling, 5 hvilket antydede, at epitopeme for disse antistoffer afmaskedes ved fjernelse af sialsyren. I modsætning hertil var bindingen af disse samme antistoffer til mælke-afledte muciner upåvirket af neuraminidase-behandling.

Bindingen af antistoffer W1 og W9 var neuraminidase-følsomt som tidligere 10 påvist. Bindingen af antistof M26 var også neuraminidase-følsom, hvilket antydede, at sialsyren er nødvendig til binding af dette antistof. Bindingen af de resterende 7 antistoffer var upåvirket af neuraminidase-behandling.

Da epitoperne for de fleste antistoffer ikke var periodat- eller neuraminidase-15 følsomme var det muligt, at nogle af disse ville genkende proteinkemeepitoper.

Til afprøvning af denne mulighed undersøgtes bindingen af visse antistoffer til renset mælkeafledt mucin, der var blevet deglycosyleret ved behandling af vandfrit hydrogenfluorid (HF). Mælkeafledt mucin rensedes til homogenitet ved affinitetschromatografi og størrelsesudelukkelseschromatografi som beskrevet 20 ovenfor udførtes. 200 pg oprenset protein (bestemt ved hjælp af aminosyre-sammensætning) deglycosyleredes under anvendelse af vandfrit HF som beskrevet af Mort og Lamport, Anal. Biochem. 82:289-309 (1977), hvortil henvises i det foreliggende. Efter behandling i 4 timer ved 230C solubiliseredes prøven i 50% eddikesyre, dialyseredes imod 20 mM ammoniumacetat og lyophilisere-25 des. Prøver af ubehandlet (3 ng protein/brønd) og deglycosyleret (10 ng/brønd) absorberedes direkte på polystyren-mikrotestbrønde og testedes for antistofbinding ved indirekte ELISA.

Til bekræftelse af at oligosaccharider var fjernet ved behandlingen underkaste-30 des prøver aminosyre- og hexosaminanalyse (AA Laboratories, Seattle, WA).

Skønt aminosyresammensætningerne af begge prøver var identiske, besad det HF-behandlede mucin et indhold af hexosamin (glucosamin + galactosamin) på mindre end 2% af indholdet i ubehandlet mucin. Denne behandling resulterere- ---------

I DK 175635 B1 I

I 48 I

I de i fjernelse af mere end 98% af en N-acetylglucosamin og en N- I

I acetylgalactosamin fra det rensede præparat, men påvirkede ikke signifikant I

I aminosyresammensætningen deraf. I

I 5 Tabel IX I

I Binding af antistof til dealvcosvleret mælkeafledt mucin I

I __Absorbans1 | I Antistof _ ubehandl et i tat1 |

io _ ' ---- ~ I

Kontrol- I

I C6 819 5 I

I Følscan ' _ I

I W1 1756 0 I

W9 1101 0 I

M8 2013 35 I

Ml6 1703 8 I

I 15 M2 5 934 15 I

M38 2380 13 I

I Fes is ten t- I

I Ml5 1556 1525 I

M22 1655 384 I

M23 1609 2005 I

M27 316 547 I

I 20 ~' : ; :—:—“ I

I 1 Absorbans ved 490 nm x 1000. I

I 25 I

I Som det fremgår af tabel XI ophæver deglycosylering bindingen af kontrolanti- I

I stoffet og 6 ud af 10 antistoffer, som bandtes stærkt til ubehandlet mucin. I I

I modsætning hertil bandtes antistof M15, M23 og M27 stærkt til immobiliseret I

I deglycosyleret mucin, hvilket antyder at disse antistoffer bindes til epitoper på I

I 30 proteinkemen. Bindingen af antistof M22 reduceredes ved HF-behandling, men I

I bindingen var stadig signifikant. Antistof M10, M11, M12, M21 og M29 testedes I

I ikke med hensyn til binding til proteinkemeepitoper, da disse antistoffer band- I

I tes dårligt til mælkeafledt mucin (tabel IV). I

DK 175635 B1 49

Som det fremgår af dette eksperiment bandtes adskillige antistoffer (M15, M22, M23 og M27) til epitoper, som var resistente overfor HF-behandlingen, der fjernede det meste carbohydrat fra proteinkemen. Epitoper for disse antistoffer er 5 således mest sandsynligt nøgent protein.

Ovennævnte tests afslører at slægtskaber baseret på kryds-kompetitive analyser mellem epitoper, der genkendes af antistofferne ifølge opfindelsen bør betragtes i lyset af andre behandlinger, såsom periodatbehandling, neuraminida-10 se-behandling og deglycosylering. Antistofferne W9 og M8 udviser således tilsvarende mønstre ved kryds-kompetitiv analyse (tabel VI), men epitopeme for disse antistoffer kan skelnes fra hinanden på basis af antistofferne følsomhed overfor periodat- og neuraminidase-behandlinger (tabel Vil og VIII).

15 Eksempel 7

Serumanalvse under anvendelse af monoklonalt antistof M23. M26. M29 og M38

En DDIA-analyse udførtes under anvendelse af de ifølge eksempel 2 ovenfor 20 opnåede monoklonale antistoffer Onc-M29 og Onc-M38 samt Onc-M26 og Onc-M38. Der udførtes også en homolog analyse med Onc-M23. En test med et handelsmæssigt præparat CA 15-3 (Centocor, Malvern, PA) og en homolog analyse med W1-antistof anvendtes til sammenligning. Analyserne udførtes under anvendelse af et panel af serum omfattende 72 prøver fra patienter med 25 metastatisk brystcancer (M) og 94 prøver fra patienter med godartet brystlidelse (B), idet prøverne analyseredes for antigenniveauer, der påvistes ved hjælp af DDIA-analyse, som beskrevet i eksempel 4, bortset fra at antistof Onc-M29 anvendtes som indfangningsantistof med Onc-M38 som påvisningsantistof (M29/M38 "DDIA"), og Onc-M26 anvendtes som indfangsningsantistof med 30 Onc-M38 som påvisningsantistof (M26/M38 "DDIA"). Resultaterne af disse analyser sammenlignedes med resultaterne fra den homologe W1-analyse og fra CA 15.3-testen ved det i fig. 5 afbillede forsøg. Analyserne sammenlignedes med hensyn til evnen til at skelne mellem de to grupper patienter, idet afskæ-

I DK 175635 B1 I

I 50 I

I ringsværdieme udvalgtes således, at der opnåedes en specificitet på ca. 90% I

I (dvs. 90% af kontrolgruppen gav negativt resultat). I

I De opnåede værdier afsattes således, at kontrolgruppens median ved hver test I

I 5 anbragtes ved ca. den 10. inddeling på en lineær skala med ialt 100 inddelin- - I

I ger. Den punkterede linie antyder værdien, som giver hver test en specificitet . I

I på 90%. N er antallet af testede prøver. I

I Denne bearbejdelse af resultater viste at den heterologe M29/M38-analyse gav I

I 10 det bedste resultat, idet metastatisk brystcancer påvistes hos 93% af patienter-

I ne {93% følsomhed). Til sammenligning påviste W1-, M23-, M26/M38- og CA I

I 15.3-analyseme metatisk brystcancer hos hhv. 67%, 60%, 60% og 83% af pa- I

I tienterne. Forskellige tests gav således forskellige resultater, idet M29/M38- og I

I CA 15.3-testen gav bedre resultater end den homologe W1-analyse og M23-

I 15 og M26/M38-analyseme, som giver ens eller dårligere resultater. I

I Blandt 5 tumorpatient-serumprøver, som gav negativt resultat ved M29/M38- I

I testen gav 2 prøver positivt resultat ved W1-, M23- og C 15.3-testene, og én af H

I disse prøver gav et positivt resultat ved M26/M38-testån. Ved således at kom- I

I 20 binere M29/M38 testresultaterne med en yderligere test gav 69/72 (95%) af I

I tumorpatientserum positivt testresultat.

Testene evalueredes også med hensyn til evnen til at bekræfte resultater op- I

nået ved M29/M38-analysen. Et antal tumorpatienter besad serumantigen nive- I

25 auer svarende til eller over den i fig. 5 anvendte afskæringsværdi, men indenfor H

kontrolintervallet af værdierne. Fortolkning af disse bestemmelser er derfor un- H

derkastet usikkerhed på grund af overlapningen med værdier bestemt for kon- H

trolprøver. En forbedret påvisning i forbindelse med disse patienter ville såle- H

des forøge den kliniske nytte af M29/M38-analysen. H

30 M

Den mest lovende analyse til dette formål var M26/M38-analysen (tabel X). Ialt H

24 ud af 72 serumprøver fra brystcancerpatienter gav M29/M38-værdier, som H

var positive, men under den højeste værdi bestemt for kontrolprøven (_35 en- I

51 DK 175635 B1 heder/ml). Af disse 24 prøver gav 8 M26/M38-værdier, som lå udenfor det normale område (_79 énheder/ml). 3 af disser prøver gav M26/M38-niveauer, som lå mere end 3 gange over den højest bestemte værdi for kontrolgruppen. I modsætning hertil udviste 0/24, 0/24 og 3/24-serumprøverne niveauer udenfor 5 det normale interval for W1-, M23- og CA 15.3-analysen, idet forhøjelsen med hensyn til sidstnævnte analyse i alle tilfælde var mindre end 2-foldig. Medens M26/M38-analysen således giver færre positive resultater end de andre tester er de opnåede niveauer tilstrækkeligt høje til, at denne test kan anvendes til posisitvt at identificere cancerpatienter, som ikke udviser stærkt forhøjede vær-10 dier ved andre tester.

Tabel X

Epitopniveauer påvist ved forskellige tester i serum fra patienter med metasta-tisk brvstcarcinoma 15 ___TEST niveauer (enheder/ml)_ TEST_M29/M38 W1 ' M23 M26/M38 CA15-3 SERUM_____ 9n 1 18 152 203 . 2140 61 c 2 19 121 86 1360 62 3 19 45 21 142 21 4 20 71 108 298 31 5 22 54 39 81 30 6 23 67 56 86 22 7 29 113 67 88 38 8 33 73 73 97 50 .

25 30

I DK 175635 B1 I

I 52 i

I Eksempel 8 I

I Specificitet af OnoM38-antistof I

I For yderligere at påvise specificiteten af det monoklonale antistof Onc-M38 I

I ifølge opfindelsen udførtes immunohistologiske tester under anvendelse af hu- I

I 5 mant cancervæv og normalt væv som beskrevet af Hellstrom et al., Cancer I

I Research 46, side 3917-3923 (1986), hvortil henvises i det foreliggende. I

I Carcinoma i bryst, lunge (ikke-småcellet lungecarcinoma (NSCLC)) og tyktarm, I

I og prøver af forskelligt normalt væv opnåedes ved kirurgi (Swedish Hospital I

I 10 Medical Center, the Virginia Mason Hospital, og Harborview Hospital, Seattle, I

I WA) enten i form af biopsiprøver fjernet ved kirurgi eller i form af pleurale effu- I

I sioner. I

I Straks efter fjernelse fra patienter blev prøver af tumorer og normalt væv ned- I

I 15 frosset i flydende nitrogen, hvorefter prøverne opbevaredes ved-700C eller i I

I flydende nitrogen indtil anvendelse. I

I Frosne sektioner med en tykkelse på ca. 5 pm til 6pm fremstilledes og lufttør- I

I redes i mindst 2 timer. Efter behandling med acetone ved I

I 20 -200C i 10 minutter tørredes de hurtigt i en luftstrøm. Sektioner, der skulle an- I

I vendes til immunohistologisk farvning præinkuberedes i 30 minutter med nor- I

I mal humant serum fortyndet 1:5 med PBS. Parallelle frosne sektioner præpare- I

I redes og farvedes med hematoxylin:eosin med henblik på histologisk vurde- I

I ring. Til en række eksperimenter præpareredes paraffinsektioner fra væv, der I

I 25 var blevet fikseret i Carnoy's opløsning umiddelbart efter fjernelse fra patienter- I

I ne, indlejret i paraffin og opdelt i sektioner, idet disse sektioner farvedes på I

I samme måde som de frosne sektioner. I

I Immunohistologisk farvning udførtes under anvendelse af PAP teknikken ifølge I

I 30 Stemberger (In Immunocytochemistry, side 104-169, New. York, John Wiley & I

I Sons (1979)) med de af Garrigues et al., Int. J. Cancer. 29, side 511-515 I

I (1982) og Hellstrom et al., J, Immunol.. 130, side 1467-1472 (1983) omhandle- I

I de modifikationer, idet der med hensyn til den nærmere udførelse af omhand- I

DK 175635 B1 53 > lede farvning henvises til de nævnte referencer. Onc-M38, kanin-anti-mus- immunoglobulin og muse-PAP {Stemberger Meyer Cytoimmunochemicals, Inc. Jarrettsville, MD) fortyndes i en opløsning af 10% normal museserum og 3% kaninserum i PBS. Farvningsmetoden bestod af følgende trin: (a) behandling i 5 1 time af sektioner enten med specifik antistofsupernatant eller kontrolantistof-supematant (f.eks. myelomaprotein (p117) fortyndet 1:2 med ovennævnte serumblanding), (b) applikation af kanin-anti-mus-immunoglobulin fortyndet 1:30, og (c) eksponering for muse-PAP-kompleks fortyndet 1:80. Al antiserum inkuberedes med sektioner i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter antistofbehand-10 lingen skylledes præparaterne let med en PBS-strøm og vaskedes så 2 gange i PBS.

Den immunokemiske reaktion fremkaldtes i løbet af 8 minutter ved tilsætning af frisk fremstillet 0,05% 3,3'-diaminobenzidin,tetrahydrochlorid og 0,01% hydro-15 genperoxid i 0,0% M tris-puffer, pH 7,6. Yderligere eksponering overfor en 1%

Os04 opløsning i 15 minutter forstærkede reaktionen. Sektionerne skylledes kort med vand, førtes gennem alkohol i stigende koncentrationer efterfulgt af xylen og monteredes med dækglas.

20 Alle præparater aflæstes af samme forsker, som ikke kendte deres oprindelse. Farvningsgraden for tumorceller eller normale celler vurderedes fra "+" (meget svag) til "4+" (meget stærk). En farvning vurderet til "2+” eller mere betragtedes som "positiv" og en farvning vurderet til"+" eller mindre som "negativ".

25 Tabel XI sammenfatter de immunohistologiske data opnået ved anvendelse af tumorvæv og normalt væv. Som det fremgår af tabellen blev Onc-M38 bundet til mindst 50% af de undersøgte tumorvævsprøver (med en intensitet på mindst 2+), men blev ikke bundet til nogle af de normale væv.

I DK 175635 B1 I

I 54 I

I Tabel XI I

I ImmunohistoloQi på frosne vævssektioner I

I Antistofbindina 1/ I

I 5 Cancervæv I

I Brystcancer 6/11 I

I Lungecancer 2/4 I

I Tyktarmscancer 3/3 I

I 10 Normalt væv I

I Milt 0/3 I

I Nyre 0/7 I

I Lever 0/4 I

I Lymphocyt pellet 0/3 I

I 15 Hud 0/3 I

I Hjerne 0/3 I

I Tyktarm 0/1 I

I Bryst 0/1 I

I Skjoldbruskkirtel 0/1 I

I 20 I

I 1/ Antistofbinding til den angivne vævstype, som antal af positive (2+ eller me- I

I re) tumorer/samlet antal testede tumorer. I

I 25 De data, der fremgår af tabel XI viser, at Onc-M38 relativt genkender tumor- I

I specifikke celleoverfladeantigener på forskellige carcinoma. Da selektiv lokali- I

I sering af tumorer med monokloanlt antistof er nødvendig af hensyn til terapi I

I synes evnen hos Onc-M38 til at bindes til mere end én tumorvævtype, at være I

I tegn på dette antistofs anvendelighed til tumorterapi, enten alene eller sammen I

I 30 med andre monoklonale antistoffer ifølge den foreliggende opfindelse. I

55 DK 175635 Bl

Eksempel 9

Analyse til påvisning af malign lungelidelse under anvendelse af monoklonalt antistof M26. M29 oq M38.

5 Evnen hos de monoklonale mucinantistoffer ifølge den foreliggende opfindelse til påvisning af mucinepitoper forbundet med sygt lungevæv påvistes på følgende måde ved anvendelse af bronchoskopiprøver og serum fra mennesker.

Bronchiale afstrygninger tilvejebragtes af Dr. Steve Springmeyer, Virginia Ma-10 son Hospital,.Seattle, WA, i løbet af en seks måneders periode i 1987 ved bronchoskopiske undersøgelser af 27 patienter med lunge-relaterede sygdomme. Afstrygningerne blev taget fra venstre og højre lunge fra hver patient i overensstemmelse med standardmetoden for bronchoskopi og analyseredes under anvendelse af standardhistologiske metoder. Resultaterne af den bron-15 choskopiske undersøgelse og den histologiske test sammen med yderligere information, herunder røntgenundersøgelse af brystkasse og CT-scanninger, anvendtes til at opdele patienterne i tre grupper: 17 individer med godartede lidelser (ingen påvist malign lungesygdom), 7 individer med ikke-småcellet lun-gecarcinom (NSCLC) og 3 patienter med andre cancertyper (SCLL, prostata-20 carcinoma og tyktarmscarcinoma). Den sidste gruppe vil ikke blive diskuteret yderligere.

Til sammenligning med de histologiske resultater udførtes en DDIA-analyse under anvendelse af de monoklonale antistoffer Onc-M29 og Onc-M38 samt 25 Onc-M26 og Onc-M38 til påvisning af mucinantigenniveauer som beskrevet i eksempel 2 og 7. Hver bronchial afstrygningsprøve anbragtes i 0,5 ml PBS-saltvand og opbevaredes i frossen tilstand ved -700C indtil anvendelse. Prøven optøedes så ved stuetemperatur og mikrocentrifugeredes i 10 minutter ved 40C. Hver prøve fortyndedes så i et forhold på 1:11 (50pl prøve og 500 pi prø-30 vefortyndingsmiddel). Foruden DDIA-analyser på bronchialprøver udførtes disse analyser også på blodserum fra hver patient.

I DK 175635 B1 I

I 56 I

I Epitopniveauerne påvist ved DDlA-analyse er angivet i tabel XII for branch iale I

afstrygninger og serum fra patienterne, idet det i dé enkelte tilfælde på basis af I

den bronchoskopiske undersøgelse og histologiske test er angivet, om tilstan- I

den er godartet eller om der er påvist NSCLC. I

I 5 I

I Tabel XII I

I Epitopniveauer påvist ved DDlA-analvse af bronchiale prøver og serum fra I

I normale individer oq individer med formodet lungesygdom I

I ^ Involveret I

Individ' Diagnose lunge M26/M38 DDIA M29/K38 ODIA I

(enheder/ml) < erheder/ml) I

I l R S1 L R s I

1 Godartet 16 20 32 .2 1 20 I

I 2 _ " 17 32 3 2 3 11 I

I 3 23 9 14 1 0 43 I

I 4 1/ . 43 55 16 0 1 15 I

15 5 ,1 35 33 17 3 2 16 I

6 -I 57 49 · 24 2 1 19 I

I 7 tf 40 47 0 1 2 19 I

I 8 t‘ 100 100 18 2 2 9 I

I 9 ·> 35 39 20 0 0 13 I

I 10 17 18 11 1 1 8 I

I 11 4 54 17 0 0 13 I

I 12 il 43 27 23 2 1 22 I

I 13 51 65 0 1 1 11 I

I 20 14 11 8 16 13 0 . 0 10 I

I Carcinoid2 I

I 15 u 24 23 0 0 0 42 I

16 il 77 27 19 6 1 24 I

17 ti 25 46 29 1 1 12 I

18 NSCLC (R) 13 29 15 0 3 11 I

19 NSCLC (L) 3 720 72 610 24 2 104 I

liver met I

20 NSCLC (L) 347 51 1754 12 1 115 I

25 21 NSCLC (R) . . 192 142 96 1 1 14 I

22 NSCLC (L)· 706 130 . 5 . 7 1. 19 I

23 NSCLC (R) 8 7 17 0 0 13. I

24 NSCLC (L) 12 13 12 1 64 I

30 1. Forkortelser: L = venstre lunge, R = højre lunge og S = serum I

2. Angiver godartet tumor i bronchus I

3. Metastaser I

DK 175635 B1 57

For de 17 individer, derved den histologiske undersøgelse ikke har fået påvist en malign lidelse, indikerer som det fremgår af tabel XII M26/M38-DDIA-analysen på bronchiale afstrygninger fra begge lunger epitopniveauer på 100 enheder/ml eller mindre. Resultatet af M29/M38-DDIA-analysen var 6 enhe-5 der/ml eller mindre. For de 7 individer med diagnostiseret NSCLC påvistes ved M26/M38-DDIA-analysen signifikant forhøjede epitopniveauer i den involverede lunge hos 4 patienter, idet M29/M38-DDIA-analysen indikerede forhøjede epitopniveauer i den involverede lunge hos 3 individer med malign lungetilstand.

Hos 2 patienter (nr. 21 og 22) var M26/M38-niveauerne forhøjet i den ikke-10 involverede lunge.

Disse resultater antyder, at en signifikant procentdel af de patienter, som underkastes tidlige diagnostiske undersøgelser for formodet lungecancer besidder forhøjede niveauer af mucinepitopmarkører, der kan påvises ved hjælp af 15 antistofferne ifølge den foreliggende opfindelse. Analyser under anvendelse af disse antistoffer kan således vise sig nyttige til tidlig påvisning af lungecarcino-ma og andre metastatiske lungecarcinomatyper, der kan undslippe påvisning ved histologiske metoder.

20 Med hensyn til serumresultater lå epitopniveauer hos individer med godartede lidelser på 54 enheder/ml eller derunder ved M26/M38-DDIA-analyse og på 43 enheder/ml eller derunder ved M29/M38-DDIA-analyse. Med hensyn til de 7 individer med diagnostiseret NSCLC udviste M26/M38-DDIA-analyse forøjede antigenniveauer hos 3 individer og M29/M38-DDIA-analyse forhøjede antigen-25 niveauer ligeledes hos 3 individer. En relativ høj andel af individer med lungecancer besad således høje niveauer af disse antigener i serum, hvilket antyder at antistofferne ifølge opfindelsen kan være nyttige til tidlig påvisning af lungecancer under anvendelse af sådanne serumanalyser.

30 Foruden påvisning af mucinepitoper forbundet med lungecancer i bronchiale afstrygninger kan andre prøver testes ved analyse ved mucinepitopniveauer under anvendelse af de monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen og andre

I DK 175635 B1 I

I 58 I

I antistoffer. For eksempel kan bronchiale udskylningsprøver og expektoreret I

I spyt fortyndes og på tilsvarende måde testes ved en analyse. I

I De i det foreliggende identificerede hidtil ukendte epitoper kan tjene som tu- I

I 5 mormarkører til påvisning af tumorer hos patienter. Hertil kommer at de hidtil · I

I ukendte epitoper på de i det foreliggende beskrevne rensede tumorforbundne I

I mucinantigener, som er immunologisk reaktive med de omhandlede hidtil I

I ukendte monoklonale antistoffer, kan fremme udviklingen af mere følsomme I

I monoklonale antistoffer til forbedrede immunoanalyser. Især kan de monoklo- I

I 10 nåle antistoffer, der fremkaldes overfor tumorassocieret mucinantigen under I

I anvendelse af renset mucin (Onc-M8, Onc-M26, Onc-M29, Onc-M30 og One- I

I M38) vise sig nyttige ved den tidligere påvisning af cancer og til gennemførelse I

I af cancerbehandlinger. De monoklonale antistoffer Onc-M26 og Onc-M38 sy- I

I nes at udvise større specificitet overfor epitoper på mucinantigen stammende I

I 15 fra tumorkilder end mucinantigen stammende normale kilder. Tumorforbundet I

I mucinantigen kan påvises i blodserumprøver eller i andre legemsvæsker, så- I

I som spyt, pleurale effusioner og mælk, under anvendelse af immunoanalyser, I

I hvorved det monoklonale antistof Onc-M26 eller Onc-M38 anvendes alene eller I

I i kombination med ethvert af de i det foreliggende beskrevne andre monoklo- I

I 20 nåle antistoffer, foruden monoklonale antistoffer, der er udviklet under anven- I

I delse af renset mucinantigen som immunogen såvel som med kendte antistof- I

I fer, såsom W1 eller W9. Antistofferne ifølge den foreliggende opfindelse kan I

I anvendes ved histologiske metoder til påvisning af nærværelse af tumorasso- I

I cieret mucinantigen på celler fra et pattedyr såvel som til bestemmelse af mu- I

25 cin, der forefindes i væskeprøver, såsom serum. Ved at gentage disse histolo- I

giske metoder over et tidsrum kan forløbet af cancer hos en patient overvåges. I

De i det foreliggende beskrevne antistoffer kan f.eks. testes med hensyn til bin- I

ding til brystepithelceller opnået fra en patient til påvisning af nærværelse af I

tumorassocieret mucinantigen, hvorved der kan opnås en indikation for nærvæ- I

30 relse af cancerceller. I

Det monoklonale antistof Onc-M26 så vel som de omhandlede andre hidtil I

ukendte antistoffer kan indgå alene eller to eller flere af antistofferne kan an- I

DK 175635 B1 59 vendes i kombination i diagnostiske testudstyr ved passende instruktioner til analyse af serum eller andre biologiske prøver med henblik på påvisning af tumorforbundne mucinantigener. Et testudstyr til udførelse af en DDlA-analyse under anvendelse af de monoklonale antistoffer Onc-M26 og Onc-M29 kan 5 f.eks. indeholde en fast støtteanordning, f.eks. et mikrobrønd-pladeholder (Nunc, Newbury Park, CA) med forseglingsanordning og indeholdende 1x8 rækker med multiple brønde. Hver brønd i rækkerne er overtrukket med mo-noklonalt antistof. I testudstyret indgår også analysereagenser, såsom standarder indeholdende humant antigen, f.eks. antigen fra brystcancer-pleural effusi-10 on fortyndet i en passende opløsning. Standarderne kan bestå af varierende koncentrationer af antigen, idet f.eks. en første standard til Onc-M29 kan bestå 4 enheder M29 antigen/ml og en anden standard af 10 enheder/ml. Til Onc-M26 kan en første standard bestå af 30 enheder M26-antigen/ml og en anden standard af 75 enheder/ml. Kontrolprøver indgår i testudstyret og kan bestå af 15 det humane antigen fortyndet i normalt humant serum (10% opløsning af M26-antigen og 11% opløsning af M29-antigen) med de antimikrobielle midler.

Hvis en prøve indeholder antigen i niveauer, der overstiger 825 enheder/ml for M26 og 110 enheder/ml for M29 (overstiger den højeste standard) ved et første 20 analyseforsøg, kan prøven i nogle tilfælde yderligere fortyndes med en passende mængde prøvefortyndingsmiddel. Fortyndinger kan fremstilles som følger: 1:11 - 50 μΙ testprøve + 500 μΙ prøvefortyndingsmiddel 25 1:55 - 50 μ11:11 fortynding + 200 μΙ prøvefortyndingsmiddel 1:275 - 50 μ11:55 fortynding + 200 μΙ prøvefortyndingsmiddel.

Konjugeret antistof indgår også i testudstyret. Antistof konjugeret med enzymet HRP indgår f.eks. i en separat beholder indeholdende passende fortyndings-30 middel. I testudstyret indgår et enzymsubstrat, f.eks. citratpufferholdigt hydro-genperoxid og 3,3’,5,5-tetramethylbenzidin i dimethylsulfoxid (TMB chromo-gen), hvis enzymmærket er HRP, i en separat beholder til anvendelse ved påvisningen af det bundede konjugerede antistof. Prøvefortyndingsmidler og re-

I DK 175635 B1 I

I 60 I

I aktionsafsluttende reagenser, såsom 1 N svovlsyre, kan indgå som yderligere I

komponenter i testudstyret. En vaskeopløsning (f.eks. 10 x PBS) kan også ind- I

I gå. Vaskeopløsningen og afslutningsreagenset opbevares ved stuetemperatur. I

I Alle andre reagenser opbevares fortrinsvis ved 40C, men bringes op på stue- I

5 temperatur til anvendelse. Det foretrækkes at standardprøver og kontrolprøver I

I foretages in dubio. I

I Til immunoterapi kan ethvert antistof udvalgt blandt de i det foreliggende be- I

I skrevne kobles til et radionuklid eller et andet påviseligt mærke og indføres i I

I 10 kroppen af et pattedyr til afbildning af cancerceller eller til udøvelse af radiote- I

I rapi. Det valgte antistof kan således kobles til et radionuklid eller et antitumor- I

I lægemiddel og indføres i et pattedyr under anvendelse af en hvilken som helst I

passende udførelsesmetode, herunder intravenøs injektion, til aflevering af ra- I

I dionuklidet eller lægemidlet i tumorvævet indeholdende antigen, der er reaktivt I

I 15 med antistoffet. Det påviselige mærke kan være udvalgt blandt fluorophorer, I

I enzymer, chromophorer, coenzymer, chemiluminescente materialer, enzymin- I

I hibitorer, paramagnestiske metaller, såsom gadolinium, og radionuklider, der er I

I kendt i teknikken. I

I 20 Da den foreliggende opfindelse er blevet beskrevet i sammenhæng med fore- I

I trukne udførelsesformer, vil en almindelig fagmand efter at have læst den fore- I

I gående beskrivelse være i stand til at effektuere forskellige ændringer, udskift- I

I ninger af ækvivalenter, og forandringer i de kompositioner og fremgangsmåder, I

I der angives heri. I

Claims (36)

1. Hybridomacellelinie, der producerer monoklonalt antistof, KENDETEGNET ved en immunologisk binding til et mucinantigen udvalgt fra gruppen 5 bestående af ATCC nr. HB 9248, HB 9212, HB 9210 og HB 9365.

2. Monoklonalt antistof, KENDETEGNET ved, at det er produceret af en hvilken som helst af hybridomacellelinieme ifølge krav 1.

3. Testudstyr til anvendelse ved analyse for nærværelsen af cancer, KENDETEGNET ved, at det omfatter mindst ét monoklonalt antistof produceret af en hybridomacellelinie udvalgt fra gruppen bestående af ATCC nr. HB 9209, HB 9244, HB 9245, HB 9246, HB 9216, HB 9248, HB 9249, HB 9250, HB 9217, HB 9212, HB 9210, HB 9211 og HB 9365. 15

4. Testudstyr ifølge krav 3, KENDETEGNET ved, at det yderligere omfatter analysereagenser og et fast underlag til udførelse af antigen-antistofbinding.

5. Testudstyr ifølge krav 4, KENDETEGNET ved, at antistoffet er adhæ- reret til det faste underlag til opfangning af antigen i en prøve.

6. Testudstyr ifølge krav 5, KENDETEGNET ved, at det yderligere omfatter et andet antistof til påvisning af antigen bundet til det adhærerede anti- 25 stof.

7. Testudstyr ifølge krav 6, KENDETEGNET ved, at det andet antistof er et monoklonalt antistof produceret af en hydridomacéllelinie udvalgt fra gruppen bestående af ATCC nr. HB 9209, HB 9244, HB 9245, HB 9246, HB 9247,

30 HB 9216, HB 9248, HB 9249, HB 9250, HB 9217, HB 9212, HB 9210, HB 9211 og HB 9365. _______ I DK 175635 B1 I I 62 I

8. Testudstyr ifølge krav 7, KENDETEGNET ved, at det andet mono- I I klonale påvisningsantistof er koblet til en påviselig markør. I

9. Testudstyr ifølge krav 8, KENDETEGNET ved, at den påviselige mar- I I 5 kør er .udvalgt fra gruppen bestående af enzymer, chromophorer, fluorophorer, · I I coenzymer, chemiluminescente materialer, enzyminhibitorer, paramagnestiske I I metaller og radionuklider. I

10. Monoklonalt antistof, ifølge krav 2, KENDETEGNET ved, at det er I I 10 koblet til en påviselig markør udvalgt fra gruppen bestående af enzymer, chro- I I mophorer, fluorophorer, coenzymer, chemiluminescente materialer, enzyminhi- I I bitorer, paramagnestiske metaller og radionuklider. I

11. Fremgangsmåde til påvisning af cancer ved bestemmelse af nærvæ- I I 15 reisen af mucinatigen, der forekommer i en prøve fra et pattedyr, KENDETEG- I I NET ved, at man anvender det monoklonale antistof ifølge krav 2 til at reagere I I med mucinantigenet, som forekommer i prøven. I

12. Fremgangsmåde ifølge krav 11, KENDETEGNET ved, at prøven er I I 20 en biologisk væske udvalgt fra gruppen bestående af blod, serum, plasma, I I spyt, pleurale effusioner, mælk, bronchiale afstrygninger og bronchiale udskyl- I I ninger. I

13. Fremgangsmåde til påvisning af cancer ved bestemmelse af nærvæ- I I 25 reisen af mucinantigen, der forekommer i en prøve fra et pattedyr, KENDE- I I TEGNET ved, at man I I (a) bringer en prøve fra et pattedyr i kontakt med et indfangningsantistof, I I produceret af en hydridomacellelinie udvalgt fra gruppen bestående af ATCC I I nr. HB 9248, HB 9210, HB 9212 og HB 9365, hvilket antistof er adhæreret til et I I 30 substrat, for at binde mucinantigen, som eventuelt forefindes i legemsvæsken I I til indfangningsantistoffet, I I (b) sætter et påvisningsantistof, produceret af en hydridomacellelinie ud- I I valgt fra gruppen bestående af ATCC nr. HB 9209, HB 9244, HB 9245, HB I DK 175635 B1 9246, HB 9247, HB 9216, HB 9248, HB 9249, HB 9250, HB 9217, HB 9212, HB 9210, HB 9211 og HB 9365 til substratet til reaktion med mucinantigen, der er bundet til indfangningsantistoffet og (c) påviser det bundne påvisningsantistof. 5

14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, KENDETEGNET ved, at mucinanti-genet er tumorassocieret.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 13, KENDETEGNET ved, at det mo- 10 noklonale antistof er koblet til en påviselig markør.

16. Fremgangsmåde ifølge krav 15, KENDETEGNET ved, at den påviselige markør er udvalgt fra gruppen bestående af enzymer, chromophorer, fluorophorer, coenzymer, chemiluminescente materialer, enzyminhibitorer, para- 15 magnetiske metaller og radionu klider.

17. Fremgangsmåde ifølge krav 13, KENDETEGNET ved, at prøven omfatter biologisk materiale udvalgt fra gruppen bestående af blod, serum, plasma, spyt, pleurale effusioner, mælk, bronchiale afstrygninger og bronchiale 20 udskylninger.

18. Fremgangsmåde ifølge krav 13, KENDETEGNET ved, at prøven omfatter cellulært materiale.

19. Fremgangsmåde ifølge krav 13, KENDETEGNET ved, at påvisnings- trinnet omfatter anvendelse af en indirekte enzym-immunoassay.

20. Fremgangsmåde til at skelne mellem normalt og abnormalt humant væv, KENDETEGNET ved, at man bringer en prøve fra et menneske indehol- 30 dende cellulært materiale i kontakt med to eller flere af de monoklonale antistoffer produceret af hybridomacellelinierne ifølge krav 1, således at tilstedeværelse af abnormalitet i mennesket kan påvises. I DK 175635 B1 I I 64 I

21. Fremgangsmåde ifølge krav 20, KENDETEGNET ved, at det humane I I væv er brystepithelvæv. I

22. Fremgangsmåde ifølge krav 20, KENDETEGNET ved, at det humane I I 5 væv er lungevæv. I

23. Fremgangsmåde til påvisning af tumor-associeret mucinantigen i en I I patient, KENDETEGNET ved, at man bringer en prøve indeholdende cellulært I I materiale fra patienten i kontakt med to eller flere monoklonale antistoffer pro- I I 10 duceret af hybridomacellelinierne ifølge krav 1, således at forekomsten af tu- I I morer i patienten kan påvises. I

24. Fremgangsmåde ifølge krav 23, KENDETEGNET ved, at prøven I I omfatter et biologisk materiale udvalgt fra gruppen bestående af blod, serum, I I 15 plasma, spyt, pleurale effusioner og mælk. I

25. Fremgangsmåde ifølge krav 23, KENDETEGNET ved, at prøven er I I brystepithefceller. I I 20 26. Fremgangsmåde ifølge krav 23, KENDETEGNET ved, at prøven er I I udvalgt fra gruppen bestående af bronchiale afstrygninger, udskylningsmateri- I I aler og expektoreret spyt. I

27. Testudstyr til analyse for nærværelse af cancer, KENDETEGNET I I 25 ved, at det omfatter et første monoklonalt antistof fremstillet af hybridomacelle- I I linie HB 9212 og et andet monoklonalt antistof fremstillet af hybridomacelle linie I I HB 9365. I

28. Testudstyr til analyse for nærværelse af cancer, KENDETEGNET I I 30 ved, at det omfatter et første monoklonalt antistof fremstillet af hybridomacelle- I I linie HB 9210 og et andet monoklonalt antistof fremstillet af hybridomacellelinie I I HB 9365. I DK 175635 B1

29. Testudstyr til analyse for nærværelse af cancer, KENDETEGNET ved, at det omfatter et første monoklonalt antistof fremstillet af hybridomacelle-linie HB 9212, et andet monoklonalt antistof fremstillet af hybridomacellelinie HB 9210 og et tredie monoklonalt antistof fremstillet af hybridomacellelinie HB 5 9365.

30. Testudstyr ifølge krav 27, 28 eller 29, KENDETEGNET ved, at det yderligere omfatter analysereagenser og et fast underlag til udførelse af anti-gen-antistofbinding. 10

31. Fremgangsmåde til påvisning af lungecarcinoma og carcinoma, der metastatisk udbredes til lunger, KENDETEGNET ved, at man omsætteren prøve udvalgt fra gruppen bestående af branchiate afstrygninger, udskylningsvæsker og expektoreret spyt med mindst ét monoklonalt antistof fremstillet af 15 en hybridomacellelinie udvalgt fra gruppen bestående af ATCC nr. HB 9209, HB 9244, HB 9245, HB 9246, HB 9247, HB 9216, HB 9248, HB 9249, HB 9250, HB 9217, HB 9212, HB 9210, HB 9211 og HB 9365.

32. Fremgangsmåde ifølge krav 31, KENDETEGNET ved, at prøven rea- 20 geres med et første antistof fremstillet af hybridomacellelinie HB 9212 og et andet antistof fremstillet af hybridomacellelinie HB 9365.

33. Fremgangsmåde ifølge krav 31, KENDETEGNET ved, at prøven reageres med et første antistof fremstillet af hybridomacellelinie HB 9210 og et 25 andet antistof fremstillet af hybridomacellelinie HB 9365.

34. Fremgangsmåde til at skelne mellem normalt og abnormalt humant væv, KENDETEGNET ved, at man bringer en prøve fra et menneske indeholdende cellulært materiale i kontakt med to eller flere af de monoklonale anti- 30 stoffer produceret af hybridomacellelinierne ifølge krav 1 og påviser tilstedeværelsen eller fraværet af immunkompleksdannelse med antistofferne, hvorved tilstedeværelsen eller fraværet af tumorceller i prøven påvises. I DK 175635 B1 I I 66 I

35. Fremgangsmåde ifølge krav 34, KENDETEGNET ved, at det menne- I I skelige, cellulære materiale er brystepithelceller. I

36. Fremgangsmåde ifølge krav 34, KENDETEGNET ved, at en af hybri- I I 5 domacellelinieme er ATCC nr. HB 9212. I