ES2080717T5 - Hibridomas productores de anticuerpos monoclonales para nuevos epitopos de mucina. - Google Patents

Abstract

NUEVAS LINEAS DE CELULAS DE HIBRIDOMAS QUE PRODUCEN ANTICUERPOS MONOCLONALES REACTIVOS CON ANTIGENOS DE MUCINA PURIFICADOS A PARTIR DE FUENTES NORMALES Y TUMORALES. SE GENERAN EMPLEANDO MUCINAS, INCLUYENDO MUCINAS PURIFICADAS A PARTIR DE FUENTES TUMORALES. SE DEMUESTRA QUE LOS EPITOPES SOBRE ANTIGENOS DE MUCINA DE FUENTES NORMALES Y TUMORALES, SON DISTINTOS, UTILIZANDO ESTOS NUEVOS ANTICUERPOS. LOS ANTICUERPOS PUEDEN SER UTILES SOLOS O EN COMBINACION, EN EL DIAGNOSTICO Y TRATAMIENTO DEL CANCER INCLUYENDO TUMORES MALIGNOS DEL PECHO Y PULMONES.

Description

Hibridomas productores de anticuerpos monoclonales para nuevos epítopos de mucina.

Ambito de la invención

Esta invención se refiere a líneas de células de hibridomas que producen nuevos anticuerpos monoclonales reactivos con mucinas, particularmente a mucinas purificadas y, más particularmente, a anticuerpos monoclonales que son capaces de reconocer preferencialmente nuevos epítopos en mucinas asociadas con tejido maligno, útiles para la detección y tratamiento de cánceres humanos, particularmente cáncer de pecho.

Fundamentos de la invención

Las mucinas son glucoproteínas de alto peso molecular, fuertemente glucosiladas, con un contenido en carbohidrato de hasta el 80%, que son secretadas por los tejidos seroviscosos de la boca, pulmones, cervix e intestino. Las mucinas han sido identificadas como antígenos asociados a tumores y han sido aisladas a partir del suero y del fluido ascitis de pacientes con cáncer, incluyendo cáncer de pecho.

Los glóbulos de grasa de la leche humana están contenidos en una membrana particular derivada de la membrana del plasma de las superficies apicales de células lácteas. El interés por esta membrana, conocida como membrana del glóbulo de grasa de leche (denominada en adelante MFGM), ha aumentado con la demostración de que algunos de los antígenos encontrados dentro de la MFGM son del tipo mucina y están asociados a tumores, en particular, con carcinomas de pecho. Se han obtenido anticuerpos dirigidos a epítopos en antígenos de mucina asociados con el cáncer de pecho procedentes de ratones inmunizados con fragmentos de glóbulos de grasa de leche humana (HMFG). Estos anticuerpos son prometedores para la diagnósis de los tumores de pecho. Son de particular interés los anticuerpos dirigidos contra los componentes del tipo de mucina de alto peso molecular (superior a 200.000) de la MFGM. Se han usado con éxito anticuerpos de antígenos del tipo de mucina para la diagnosis de micro-metástasis en biopsias, como un indicador de prognosis de tumor para la radio-localización de tumores, y para ensayos de suero para controlar la progresión de tumores. (Véase Linsley y otros, Cancer Research, vol. 46, págs. 5444-5450, (1986), el cual se incorpora como referencia).

Se ha encontrado que la mayoría de los antígenos de mucina anteriormente caracterizados estaban presentes en los tejidos normales además de en el tejido del tumor. Las variaciones en los antígenos del tipo mucina a partir de fuentes normales y con tumor han sido estudiadas por Burchell y otros, J. Immunol., vol. 131, pág. 508, (1983), el cual encontró diferencias en las relaciones de los determinantes reconocidos por dos anticuerpos monoclonales (HMFG-1) y (HMFG-2) en células epiteliales de pecho humano normal y en líneas de células de tumor de pecho. Estos investigadores mostraron que los niveles relativos de unión de HMFG-1 y HMFG-2 variaron entre las líneas de células procedentes de epitelio de pecho normal y maligno, estando el epítope HMFG-2 mucho más fuertemente expresado sobre las líneas de células de tumor. Sekine y otros, en J. Immumol., vol. 135, pág. 3610, (1985), compararon antígenos del tipo de mucina reactivos con el anticuerpo monoclonal DF3 (Kufe y otros, Hybridoma, vol. 3, pág. 223, (1984)), procedentes de leche y de fluidos de efusión pleural de pacientes con cáncer de pecho. Estos estudios sugieren que las mucinas son complejos antigénicos que expresan una variedad de epítopos en tejidos tanto normal como con tumor, y también indican que las mucinas pueden variar en la expresión de epítopos entre diferentes fuentes de tejidos. Se han descrito también anticuerpos que reaccionan con epítopos en antígenos del tipo de mucina que se han encontrado a niveles elevados en sueros procedentes de pacientes de cáncer de pecho (Linsley y otros, véase cita anterior, y Frankel y otros, J. Biol. Response Modifiers, vol. 4, pág. 273, (1985)). Uno de estos anticuerpos, el W1, es reactivo con epítopos en un antígeno de mucina asociado con células de cáncer de pecho. El anticuerpo W1 ha sido usado en un ensayo para detectar la presencia de antígeno a niveles elevados en sueros procedentes de pacientes con cáncer de pecho (Linsley y otros, véase cita anterior). Además del epítopo W1, otros epítopos, tales como los epítopos de mucina T (Thomsen-Friedenreich) y Tn, que se sabe que están asociados con carcinomas, pueden detectarse en un ensayo usando anticuerpos monoclonales. (Springer y Desai, Molecular Immunology, vol. 22, págs. 1303-1310, (1985); y Springer, Science, vol. 224, págs. 1198-1206, (1984)).

Linsley y otros (Cancer Res., vol. 46, págs. 6380-6386, (1986)) estudió el mecanismo de la variabilidad en la expresión de epítopos en un antígeno del tipo mucina definido por los anticuerpos monoclonales W1, W5 y W9 en la línea de células de carcinoma de pulmón Calu-1. En los experimentos de inmunotransferencia, la unión de los tres anticuerpos a una glucoproteína del tipo mucina de alto peso molecular se realizó mediante tratamiento con peryodato sódico y/o neuraminidasa, lo que sugiere que los anticuerpos reconocen los epítopos de carbohidrato.

El documento EP-A-0 160 446, describe dos anticuerpos monoclonales 21DD5 y 21DD7 que están dirigidos a un antígeno en células epiteliales de pecho. Los resultados presentados indican que el antígeno se produce tanto en membranas de células normales como en células de carcinoma.

La patente WO 86/02735, describe anticuerpos monoclonales reactivos con antígenos de carcinoma de pulmón de células no pequeñas humanas, teniendo dichos antígenos pesos moleculares de 135.000 daltons o menos.

Johnson y otros (Cancer Res., vol. 46, (Nº 2), págs. 850-857, (1986)) describe el anticuerpo monoclonal B72.3 que se une a una glucoproteína asociada con tumor de alto peso molecular identificada como TAG-72. Este antígeno de glucoproteína se encontró en el volu men de exclusión de un homogenato de la línea de células de carcinoma humano LS-174T durante el fraccionamiento sobre una columna de cromatografía Sapharose CL-4B.

Swallow y otros (Dis. Markers, vol. 4, (Nº 4), págs. 247-254, (1986)) describe anticuerpos dirigidos a glucoproteínas del tipo mucina que se han encontrado en la orina humana normal. Estas glucoproteínas han sido anteriormente detectadas mediante la unión a lecitinas.

Papsidero y otros (Mol. Immunol. vol. 21, (Nº 10), págs. 955-960, (1984)) describe un anticuerpo monoclonal F36/22, el cual se une a un antígeno encontrado en la circulación de pacientes con cáncer. Este antígeno tiene un peso molecular superior a 669.000 daltons, determinado mediante cromatografía de filtracion por gel en una columna de Sepharose CL-4B.

El documento EP-A-0 200 464, describe un antígeno asociado a tumor expresado mediante el carcinoma de colon y un anticuerpo monoclonal CCKO61 dirigido a dicho antígeno, estando caracterizado el antígeno por un peso molecular desde aproximadamente 820.000 hasta aproximadamente 960.000 daltons.

Sería deseable desarrollar nuevos anticuerpos que demostraran especificidad incrementada en ensayos para antígenos asociados a tumores presentes en muestras procedentes de sujetos humanos. Óptimamente, dichos anticuerpos deberían ser capaces de identificar epítopos específicos en un antígeno de mucina asociado a tumor, cuyos epítopos se encontraran a niveles grandemente reducidos, o enmascarados en antígeno derivado a partir de tejidos normales. Dichos anticuerpos podrían usarse a continuación para realizar ensayos más sensibles para la detección de la presencia de cáncer mediante la reacción, preferencialmente con antígenos asociados a tumor, en sueros procedentes de pacientes con cáncer.

Resumen de la invención

De acuerdo con ello, la presente invención proporciona nuevas líneas de células de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales para antígenos de mucina purificados procedentes de fuentes de tejidos normales (sin tumor) o con tumor. Algunos de los hibridomas se generan usando protocolos que incluyen el antígeno de mucina purificado como el inmunógeno. Los anticuerpos monoclonales de esta invención pueden usarse para realizar ensayos de suero para detectar la presencia de antígenos de mucina asociados a tumores. Además, usando estos anticuerpos pueden realizarse ensayos para detectar antígenos de mucina en muestras biológicas, incluyendo muestras de esputo, de cauterizaciones bronquiales y de lavados. Como tales, los anticuerpos producidos por las líneas de células de hibridoma de esta invención pueden promover la diagnósis y el tratamiento del cáncer humano, incluyendo malignidades de pecho y pulmón.

Al menos uno de los nuevos anticuerpos monoclonales producidos usando antígeno de mucina de tumor purificado, el anticuerpo monoclonal Onc-M26, demuestra un reconocimiento preferencial del antígeno de mucina asociado a tumor en comparación con el antígeno derivado de fuentes normales. El anticuerpo Onc-M26 tiene reactividad sustancialmente reducida con antígeno aislado procedente de fuentes normales. Además, el anticuerpo monoclonal M38 muestra alta especificidad para un único epítopo en antígenos de mucina.

Otros catorce nuevos anticuerpos monoclonales tal como aquí se describen, reaccionan también con antígeno de mucina asociado a tumor. Adicionalmente, estos anticuerpos fueron reactivos con antígenos derivados de individuos normales. Algunos de estos nuevos anticuerpos monoclonales parecen reaccionar con diferentes epítopos en el antígeno W1 que previamente identificó epítopos.

En particular, la presente invención proporciona líneas de células de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal como se define en la reivindicación 1, así como un anticuerpo monoclonal producido por cualquiera de dichas líneas de células de hibridoma. Dicho anticuerpo monoclonal puede acoplarse a un marcador detectable seleccionado entre el grupo formado por enzimas, cromóforos, fluoróforos, coenzimas, materiales quimioluminiscentes, inhibidores de enzima, metales paramagnéticos y radionúclidos.

Además, la presente invención está dirigida a un juego de ensayo útil para la determinación de la presencia de cáncer, que comprende: al menos un anticuerpo monoclonal producido por una línea de células de hibridoma seleccionada entre el grupo formado por los ATCC Nos. HB 9209; HB 9244; HB 9245; HB 9246; HB 9247; HB 9216; HB 9248; HB 9249; HB 9250; HB 9217; HB 9212; HB 9210; HB 9211; y HB 9365. Dicho juego de ensayo puede comprender además reactivos de ensayo y un soporte sólido para la realización de la unión antígeno-anticuerpo, en el cual dicho anticuerpo puede adherirse al soporte sólido para capturar el antígeno en una muestra.

El juego de ensayo puede comprender además un segundo anticuerpo para la detección del antígeno unido a dicho anticuerpo adherido. Dicho segundo anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal producido por una línea de células de hibridoma seleccionada entre el grupo formado por los ATCC Nos.: HB 9209; HB 9244; HB 9245; HB 9246; HB 9247; HB 9216; HB 9248; HB 9249; HB 9250; HB 9217; HB 9212; HB 9210; HB 9211; y HB 9365. Dicho segundo anticuerpo monoclonal de detección puede acoplarse a un marcador detectable, el cual puede seleccionarse entre el grupo formado por enzimas, cromóforos, fluoróforos, coenzimas, materiales quimioluminiscentes, inhibidores de enzima, materiales paramagnéticos y radionúclidos.

En particular, se proporciona un juego de ensayo para comprobar la presencia de cáncer que incluye un primer anticuerpo monoclonal producido por la línea de células de hibridoma HB 9212 y un segundo anticuerpo monoclonal producido por la línea de células de hibridoma HB 9365; o que incluye un primer anticuerpo monoclonal producido por la línea de células de hibridoma HB 9210 y un segundo anticuerpo monoclonal producido por la línea de células de hibridoma HB 9365; o que incluye un primer anticuerpo monoclonal producido por la línea de células de hibridoma HB 9212, un segundo anticuerpo monoclonal producido por la línea de células de hibridoma HB 9210 y un tercer anticuerpo monoclonal producido por la línea de células de hibridoma HB 9365. En una realización preferida del mismo, dicho juego de ensayo puede comprender además reactivos de ensayo y un soporte sólido para la realización de la unión antígeno-anticuerpo.

Además, se proporciona un procedimiento para la detección de cáncer mediante la determinación de la presencia de un antígeno de mucina presente en una muestra de un mamífero. En este procedimiento, el anticuerpo monoclonal que se produce mediante cualquiera de las líneas de células de hibridoma como se define en la reivindicación 1, se usa para reaccionar con antígeno de mucina presente en la muestra. Dicha muestra puede ser un fluido biológico seleccinado entre el grupo formado por sangre, suero, plasma, esputo, efusión pleural, leche, cauterizaciones bronquiales y lavados bronquiales.

Adicionalmente, la presente invención está dirigida a un procedimiento para la detección de cáncer mediante la determinación de la presencia de antígeno de mucina presente en una muestra procedente de un mamífero, que comprende:

(a) el contacto de una muestra procedente de un mamífero con un anticuerpo de captura, producido por una línea de células de hibridoma seleccinada entre el grupo formado por los ATCC Nos.: HB9248; HB 9212; HB 9210; y HB 9365, estando dicho anticuerpo adherido a un sustrato, para unir cualquier anticuerpo de mucina presente en el fluido corporal al anticuerpo de captura;

(b) la adición de un anticuerpo de detección, producido por una línea de células de hibridoma seleccionada entre el grupo formado por los ATCC Nos.: HB 9209; HB 9244; HB 9245; HB 9246; HB 9247; HB 9216; HB 9248; HB 9249; HB 9250; HB 9217; HB 9212; HB 9210; HB 9211; y HB 9365, a dicho sustrato para reaccionar con cualquier antígeno de mucina unido a dicho anticuerpo de captura; y

(c) la detección de dicho anticuerpo de detección, unido.

En las realizaciones específicas del mismo, dicho antígeno de mucina está asociado a un tumor; dicho anticuerpo monoclonal está acoplado a un marcador detectable, el cual puede estar seleccionado entre el grupo formado por enzimas, cromóforos, fluoróforos, coenzimas, materiales quimioluminiscentes, inhibidores de enzima, metales paramagnéticos y radionúclidos; dicha muestra comprende material celular o una muestra biológica seleccionada entre el grupo formado por sangre, suero, plasma, esputo, efusión pleural, leche, cauterizaciones bronquiales y lavados bronquiales; o dicha etapa de detección comprende el uso de un inmunoensayo de enzima indirecto.

Además, la presente invención está relacionada con un procedimiento para la diferenciación entre tejido humano normal y anormal que comprende el contacto de una muestra que contiene material celular procedente de un humano con dos o más de los anticuerpos monoclonales producidos por la línea de células de hibridoma como se define en la reivindicación 1, mediante cuyo procedimiento puede detectarse la presencia de anormalidad en el humano. En una realización preferida del mismo, dicho tejido humano es tejido epitelial de pecho o tejido de pulmón.

Además, la presente invención está dirigida a un procedimiento para la detección de antígeno de mucina asociado a tumor en un paciente, que comprende el contacto de una muestra que contiene material celular procedente de un paciente con dos o más de los anticuerpos monoclonales producidos por la línea de células de hibridoma como se define en la reivindicación 1, mediante cuyo procedimiento puede detectarse la presencia de tumores en el paciente. En las realizaciones preferidas del mismo, dichas muestras comprenden una muestra biológica seleccionada entre el grupo formado por sangre, suero, plasma, esputo, efusión pleural y leche; o dicha muestra son células epiteliales de pecho; o dicha muestra está seleccionada entre el grupo formado por cauterizaciones bronquiales, muestras de lavado y esputo expectorado.

La presente invención proporciona además un procedimiento para la detección de carcinoma de pulmón y carcinomas metastáticos para el pulmón que comprende la reacción de una muestra seleccionada entre el grupo formado por cauterizaciones bronquiales, fluido de lavado y esputo expectorado con al menos un anticuerpo monoclonal producido por la línea de células de hibridoma seleccionada entre el grupo formado por los ATCC Nos.: HB 9209; HB 9244; HB 9245; HB 9246; HB 9247; HB 9216; HB 9248; HB 9249; HB9250; HB9217; HB9212; HB9210; HB 9211; y HB 9365. En una realización preferida del mismo, dicha muestra reacciona con el primer anticuerpo producido por la línea de células de hibridoma HB 9212 y un segundo anticuerpo producido por la línea de células de hibridoma HB 9365. En una realización preferida adicional del mismo, dicha muestra reacciona con un primer anticuerpo producido por la línea de células de hibridoma HB 9210 y un segundo anticuerpo producido por la línea de células de hibridoma HB 9365.

Además, se proporciona un procedimiento para la diferenciación entre células humanas normales y tumorales que comprende el contacto de una muestra que contiene material celular procedente de un humano con al menos dos anticuerpos monoclonales diferentes producidos por líneas de células de hibridoma como se define en la reivindicación 1, e indicando la presencia o ausencia de células tumorales en dicha muestra. En una realización específica del mismo, dicho material celular humano son células epiteliales de pecho. Preferiblemente, una de las líneas de células de hibridoma es el ATCC Nº HB 9212.

Breve descripción de los dibujos

Los detalles de las realizaciones típicas de la presente invención se describirán en relación con los dibujos adjuntos, en los cuales:

la Figura 1 representa la unión del anticuerpo W1 a fracciones procedentes de una purificación mediante gradiente de densidad de CsCl de mucinas de leche;

la Figura 2 es un fotografía de un gel de SDS-PAGE procedente de la purificación mediante gradientes de densidad de CsCl de mucinas de leche;

la Figura 3 es una fotografía del análisis mediante gel de SDS-PAGE de mucinas purificadas mediante cromatografía de afinidad procedentes de leche (bandas 2 a 5) y tejidos de tumores (banda 6 = muestra número H3300 de mucina de tumor de pecho procedente de fluido de efusión peritoneal; banda 7 = muestra número H3415 de mucina de tumor de pecho procedente de efusión pleural; y banda 8 = mucina procedente de mezclas de tumor de pecho);

la Figura 4 muestra las curvas de dosis-respuesta para la unión de anticuerpos monoclonales a mucinas purificadas usando el ensayo de captura de lectina-mucina descrito en la presente invención (4A: mucina de leche, 4B: mucina de efusión pleural); y

la Figura 5 es un gráfico que muestra los niveles de epítopos de antígeno de mucina detectados mediante DDIA en ensayos de suero procedente de pacientes con cáncer de pecho y pacientes con enfermedad de pecho benigna usando los anticuerpos monoclonales de esta invención.

Descripción detallada de la invención

Los hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales de la presente invención se han producido siguiendo los procedimientos generales descritos por Kohler y Milstein, en Nature, vol. 256, pág. 455, (1975), los cuales se incorporan aquí como referencias. En dicho procedimiento, los hibridomas se prepararon mediante la fusión de células que producen anticuerpos (típicamente células de bazo de ratones previamente inmunizados con una fuente de antígeno de mucina) con células procedentes de una línea de células de tumor inmortales usando procedimientos de hibridación de células somáticas. Los agentes usados para la inmunización de los animales ("inmunógenos") para inducir la producción de anticuerpos para antígenos de mucina, han consistido típicamente en células de cáncer de humanos vivos, por ejemplo, células de cáncer de pecho, o MFGM, o extractos de membranas de células de cáncer. Pueden administrarse inoculaciones de más de un tipo de inmunógenos, por ejemplo, células de cáncer, y la MFGM puede introducirse en inmunizaciones separadas. Además de la MFGM, y de las líneas de células de cáncer humas, la presente invención usa mucinas purificadas como inmunógenos incluyendo mucinas obtenidas a partir de fuentes de tumores, tal como se describe más adelante. El uso de mucinas asociadas a tumores purificadas como inmunógeno puede incrementar las oportunidades de generar anticuerpos para distinguir epítopos asociados a tumores.

Los nuevos anticuerpos monoclonales descritos en la presente invención se generaron mediante la inmunización de ratones con líneas de células de cáncer, con preparación de MFGM, o con mucinas purificadas procedentes de leche o de efusiones pleurales procedentes de pacientes con cáncer, tal como se describe en la Tabla 3 más adelante. Para la inmunización con mucina purificada, los animales se inocularon intraperitonealmente y/o subcutáneamente al menos una vez con 100 unidades o más de inmunógeno. Pueden administrarse inoculaciones de más de un tipo de inmunógeno, por ejemplo, células de cáncer y MFGM. A continuación, los animales se reforzaron dos o más veces con inmunógeno. Los bazos se extrajeron de los animales varios días después del último refuerzo, y se preparó una suspensión de células de bazo para la fusión usando técnicas de fusión conocidas con células de mieloma de múridos.

Los hibridomas resultantes del procedimiento de fusión se dejaron desarrollar. Después de ello, los sobrenadantes resultantes se rastrearon usando procedimientos de inmunoensayo para detectar los anticuerpos presentes en los sobrenadantes capaces de unión a los antígenos específicos. En algunos casos, se usó un ensayo de captura de lecitina (WGA), descrito más adelante, como un rastreo preliminar para detectar anticuerpos monoclonales presentes en los sobrenadantes capaces de unirse a leche purificada y a antígenos derivados de efusión pleural, o capaces de unión a antígenos de mucina en sueros obtenidos a partir de sujetos humanos con y sin cáncer. En otros casos, los sobrenadantes se rastrearon para determinar su capacidad de unión a células de cáncer cultivadas o MFGM. Se usó un inmunoensayo de enzima (ELISA) para detectar la unión del anticuerpo a antígeno de mucina purificado adherido a lecitina, a células de cáncer o a MFGM. Se realizaron tipos adicionales de rastreo sobre los sobrenadantes de hibridoma, incluyendo ensayos de unión de competencia y observaciones de patrones de unión fluorescentes, tal como se describe en los ejemplos.

Se usó un inmunoensayo de determinante doble (DDIA) (Linsley y otros, véase cita anterior), el cual comprueba la unión del anticuerpo a epítopos sobre antígeno de mucina, tal como el epítopo W1, para analizar las características de los nuevos anticuerpos monoclonales en los ensayos de suero humano para detectar antígeno de mucina asociado a tumor y para comparar los nuevos anticuerpos con el anticuerpo W1, y en ensayos de cauterizaciones bronquiales obtenidas durante la broncoscopia de sujetos humanos. El DDIA usa un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal (anticuerpo de "captura") inmovilizado sobre un sustrato, tal como un soporte o columna de plástico, para capturar el antígeno presente en una muestra de fluido, tal como suero de sangre, procedente de un paciente con cáncer. (Como control, se usó suero procedente de un paciente sin cáncer). Se agregó un segundo anticuerpo, también preferiblemente un anticuerpo monoclonal, que puede marcarse para detección, por ejemplo, con radionúclido, tal como yodo-125 (^{125}I) o con peroxidasa de rábano picante (HRP) (el anticuerpo de "detección"). El anticuerpo marcado se une a cualquier antígeno capturado para permitir la detección y la cuantificación del antígeno de mucina presente en los sueros. En algunas situaciones en las cuales un antígeno tiene epítopos repetidos, tal como el epítopo W1, el segundo anticuerpo puede ser el mismo que el primer anticuerpo, por ejemplo, ambos son el anticuerpo W1 (DDIA homólogo). Para epítopos no repetidos puede ser necesario usar un segundo anticuerpo capaz de unión a un epítopo diferente sobre el antígeno, debido, por ejemplo, a que un epítopo esté bloqueado por la unión con el primer anticuerpo. A este último se le denomina como DDIA heterólogo, y cada ensayo se denomina de acuerdo con el anticuerpo usado como anticuerpo de captura, el cual se cita en primer lugar, y el anticuerpo usado como un conjugado para la detección. Así, el ensayo "M26/M29" usa el M26 como el anticuerpo de captura y el HRP-M29 como el conjugado de anticuerpo de detección.

Óptimamente, es deseable identificar nuevos epítopos sobre antígenos asociados a tumor con el fin de facilitar la producción de anticuerpos monoclonales que sean capaces de llevar a cabo un inmunoensayo con sensibilidad y especificidad incrementadas, es decir, que den como resultado un ensayo que sea más capaz de distinguir entre muestras procedentes de personas que tienen cáncer y muestras obtenidas a partir de personas sin cáncer, y que reduzcan la incidencia de resultados positivos falsos. Los resultados positivos falsos se producen cuando el ensayo indica la presencia de cáncer aún cuando no está presente en el paciente, debido a que el anticuerpo se une a epítopos en el antígeno de mucina procedentes de fuentes normales. Además, la sensibilidad de un ensayo puede potenciarse usando anticuerpos con una mayor especificidad para antígenos de mucina, en particular, para epítopos en ensayos asociados a tumor. Las cantidades de antígeno a unirse son pequeñas, de forma que puede detectarse fases precoces de cáncer en los pacientes.

Los ejemplos siguientes se presentan para ilustrar la presente invención y para ayudar a un experto normal en la realización y uso de la misma. Los ejemplos no están destinados a limitar de ninguna forma el alcance de la descripción o la protección concedida sobre este punto por el Título.

Ejemplo 1 Purificación de antígenos de mucina procedentes de fuentes de tumor y normales Fuentes de antígeno de mucina

Las fuentes de mucina usadas en la generación de anticuerpos monoclonales de la presente invención se seleccionaron mediante el ensayo de una diversidad de muestras obtenidas a partir de leche, fluidos de efusión pleural y tumores procedentes de sujetos humanos para determinar la actividad antigénica. La actividad antigénica se detectó usando un ensayo de unión de célula competente, tal como se describe por Linsley y otros, véase cita anterior. Este ensayo se usó también para controlar la purificación de mucina tal como se describe más adelante. En resumen, en el procedimiento de selección, las muestras se ensayaron para determinar su capacidad para inhibir la unión de anticuerpo W1 conjugado a HRP o marcado con ^{125}I a células W5-6. La W5-6 es una línea de células enriquecida en antígenos de mucina, y derivada de células de carcinoma de pulmón Calu-1, tal como se describe más adelante. Una unidad de actividad inhibidora se la definió como la cantidad de material que ocasiona una reducción del 50% en la unión del anticuerpo W1 conjugado con HRP o marcado con ^{125}I (agregado a una concentración de 0,4 \mug/ml) a 3 x 10^{4} células W5-6. La unión del anticuerpo W1 marcado con ^{125}I se detectó usando un contador gamma, y el anticuerpo W1 conjugado con HRP se detectó usando un ensayo ELISA. El HRP se conjugó directamente al anticuerpo W1 mediante una modificación del procedimiento de Nakani y Kawoi, J. Histochem. Cytochem., vol. 22, pág. 1084, (1974). El conjugado tenía una relación molar de HRP a anticuerpo de aproximadamente 1:1. Los conjugados de anticuerpo W1-HRP unido se detectaron mediante la adición de una solución de orto-fenilenodiamina (OPD) (100 \mul) (Zymed Laboratories, Inc., San Francisco, CA) a una concentración de 0,5 \mug/ml, en citrato sódico 100 mM a pH 5,0, que contenía 0,0075% de H_{2}O_{2} (volumen/volumen). Se dejó desarrollar un color amarillo procedente de la reacción del sustrato con la enzima hasta que se alcanzaron unas absorbencias máximas de 0,4-1,5 (unidades de densidad óptica o O.D.) a 490 nm, tal como se determinó usando un espectrofotómetro. (Estos valores están dentro del intervalo óptimo para el ELISA). Las reacciones de color enzima-sustrato se terminaron mediante la adición de 50 \mul de H_{2}SO_{4} 1,3 N, y la absorbancia a 490 nm se midió usando un lector de placa Microtiter® (Genetic Systems Corp., Seattle, WA). El anticuerpo W1 se usó debido a su reactividad conocida con antígenos de lisina. Se obtuvieron valores esencialmente idénticos usando ambos ensayos.

Siguiendo los anteriores procedimientos, se encontró que la leche humana normal que contenía proteínas derivadas del epitelio del pecho, así como los fluidos de efusión derivados de pacientes con cáncer, contenían niveles elevados de actividad inhibidora W1 (superiores a 1000 unidades/ml). Debido a la posibilidad de variaciones individuales entre muestras no relacionadas con el estado maligno, se purificaron mucinas procedentes de cuatro muestras de leche diferentes y de dos muestras de efusión pleural. Igualmente, se usó una mezcla de tumores de pecho extraídos en ácido-etanol procedentes de un gran número de individuos como una fuente para la purificación de mucinas. La purificación de mucinas procedentes de estas fuentes se describe a continuación.

Recogida de leche y de fluidos de efusión pleural

La leche se obtuvo a partir de cuatro donantes exentos de cáncer y se designaron como muestras de Leche 1, Leche 2, Leche 7 y Leche 11. Las muestras se congelaron dentro de los cinco a diez minutos después de su recogida. Inicialmente, se encontraron en las muestras de leche tanto formas solubles como asociadas a MFGM de mucinas de unión con W1. Para maximizar el rendimiento general de la mucina obtenida, los análisis no se restringieron a la forma asociada a MFGM del antígeno procedente de la leche.

Las efusiones usadas contenían predominantemente una forma soluble de mucina. Las efusiones pleurales se obtuvieron de pacientes con cáncer de pecho del Virginia Mason Hospital en Seattle, WA. Una muestra (Nº H3300) estaba compuesta por fluido peritoneal extraído de un paciente diagnosticado con cáncer de pecho lobular metastático. La muestra Nº H3422 era fluido de efusión pleural procedente de un paciente originalmente diagnosticado con cáncer de pecho inflamatorio y que posteriormente desarrollo un adenocarcinoma ductal infiltrante de moderado a bien diferenciado. Otra muestra (Nº H3415) estaba formada por fluido de efusión pleural procedente de pacientes diagnosticados con cáncer de pecho inflamatorio. Los fluidos de efusión se almacenaron congelados a -20ºC.

Aislamiento de mucinas obtenidas a partir de leche y de fluidos de efusión

La técnica preliminar usada para purificar las mucinas procedentes de la leche y de los fluidos de efusión fue una modificación de los procedimientos de Creeth y otros, Biochem. J., vol. 167, pág. 557, (1977), incorporados aquí como referencias, tal como se describen por Linsley y otros, véase cita anterior. Este procedimiento permitió la purificación preliminar tanto de las mucinas asociadas a MFGM como solubles y previno la sobrecarga de las columnas de cromatografía de afinidad usadas para la purificación final. En resumen, se descongeló leche entera y fluidos de efusión, y se agregó guanidina-HCl (United States Biochemical Corp. Cleveland, OH) hasta una concentración final de 6 M. La mezcla se agitó hasta que quedó transparente. A continuación, se realizó la sedimentación en equilibrio en gradientes de densidad de cloruro de cesio (CsCl). El CsCl (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) se agregó a una concentración de 0,6 g/ml (volumen original) y la densidad se ajustó a 1,33-1,35 g/ml, medida gradimétricamente. A continuación, las muestras se centrifugaron en un rotor Beckman 50.2 a 40000 rpm (145.500 x g de promedio) durante 60 a 65 horas a 21ºC. Las fracciones se recogieron del fondo del tubo y se midieron las densidades. Las fracciones se dializaron frente a H_{2}O y, a continuación, se ensayaron para determinar la actividad inhibitoria a W1 tal como se ha descrito anteriormente. En el caso de las mucinas derivadas de fluidos de efusión, las fracciones pico se mezclaron y se sometieron a una segunda centrifugación en un gradiente de CsCl que contenía guanidina-HCl 0,2 M.

Cromatografía de afinidad

Para la purificación final de las mucinas, se usó cromatografía de afinidad. Las fracciones pico de la actividad inhibitoria del W1 procedente de los gradientes de CsCl se mezclaron con anticuerpo W9 (Dr. D. Ring, Cetus Corp., Emeryville, CA) conjugado con Sepharose 4B (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), en unas proporciones de 200-3500 unidades/mg de anticuerpo en una solución de NaCl 50 mM taponada con HEPES 20 mM a pH 6,5. El anticuerpo W9 se seleccionó debido a que se habían encontrado epítopos de W9 sobre la misma molécula que los epítopos de W1 y debido a que la lución de la mucina unida se realizó a un pH inferior usando W9, que con el anticuerpo W1. El antígeno unido se efluyó tal como ha sido anteriormente descrito por Linsley y otros, en Biochemistry, vol. 25, pág. 2978, (1986), el cual se incorpora aquí como referencia. Las concentraciones de proteína se determinaron tal como se describe por Markwell y otros, en Anal. Biochem., vol. 87, pág. 206, (1979), el cual se incorpora aquí como referencia.

Mucina derivada de mezclas de tumor

Se purificaron mezclas de mucina derivada de tumores procedentes de tumores de pecho extraídos con ácido-etanol proporcionados por el Dr. J. Rowe (Oncogen, Seattle,WA). Las muestras quirúrgicas, cuya mayor parte de las mismas eran tejidos de tumores de pecho de una diversidad de clasificaciones histológicas, se mezclaron y se almacenaron congeladas a -70ºC. Las muestras de tejidos de tumores (de 45 g cada una de ellas) se descongelaron en un volumen de 250 ml de tampón de extracción (95% de etanol, HCl 100 mM, fluoruro de fenil metil sulfonilo (32 \mug/ml) y Aprotinina (2 mg/ml)) y, a continuación, la mezcla se agitó durante 16 horas a 4ºC. El material insoluble se recogió mediante sedimentación a 10000 x g durante 30 minutos a 4ºC, se resuspendió en H_{2}O a una concentración de aproximadamente 4 g/ml (peso/volumen) e inmediatamente se agregó guanidina-HCl hasta una concentración final de 6 M. La mezcla se batió vigorosamente y se dejó reposar durante una noche a 4ºC; a continuación, se sedimentó a 1000 x g durante 4 minutos y, a continuación, el sobrenadante se recogió, después de eliminar la fase lípida. La centrifugación en gradiente de densidad de CsCl y la purificación de afinidad se realizaron tal como se describió anteriormente.

Electroforésis de dodecil sulfato de sodio-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

Para confirmar la pureza, se realizó un ensayo SDS-PAGE sobre partes alícuotas de las fraccione de gradiente de CsCl de mucinas que se habían encontrado que mostraban actividad de inhibición de W1. En este procedimiento, se usaron geles de poliacrilamida con gradientes del 5-20% conjuntamente con geles de compactación al 4%, tal como se describen por Linsley y otros, en Biochemistry, véase cita anterior. Las muestras se analizaron bajo condiciones reductoras. Los geles se tiñeron usando azul brillante Coomassie, se decoloraron, se trataron con ácido peryódico al 0,2% durante 40 minutos a 4ºC y, a continuación, se tiñeron de nuevo usando reactivo Schiff (Sigma Chemical Co.) durante 40 minutos a 4ºC.

Análisis de aminoácidos

Los análisis de los aminoácidos de las mucinas purificadas mediante afinidad, obtenidos tal como se ha descrito anteriormente, se realizó usando técnicas estándar por Lowell H. Ericison (AAA Laboratories, Seattle, WA) después de una hidrólisis durante 20 horas en HCl 6 N a 115ºC.

Resultados Análisis bioquímico de las mucinas purificadas

Las mucinas derivadas de la leche y capaces de unión al anticuerpo W1 (Figura 1) se agruparon en gradientes de CsCl a una densidad de equilibrio de 1,38\pm0,01 (desviación estándar), procedentes de un total de siete experimentos. Esto dió como resultado una purificación de la mucina de aproximadamente 10 veces, con un rendimiento de aproximadamente el 40%. La purificación mediante gradiente de densidad de CsCl de las mucinas obtenidas a partir de leche humana, de acuerdo con los procedimientos anteriores, se muestra en la Figura 2. Las mucinas derivadas de leche se agrupan en una banda con una densidad de equilibrio más elevada que la mayoría de las otras proteínas de leche, tal como se observa mediante electroforésis de SDS-PAGE. Una purificación similar se realizó con las mucinas derivadas de fluidos de efusión pleural y con los extractos de ácido-etanol mezclados procedentes de tumores de pecho.

La purificación por afinidad de la mucina procedente de leche produjo aproximadamente el 52% de la actividad antigénica de la mucina en las fracciones de CsCl mezcladas (4 experimentos) que habían sido recuperadas en el eluato; aproximadamente, una purificación de 400 veces con respecto a la actividad relativa de la leche entera. En el caso de las efusiones pleurales, se recuperaron porcentajes similares de actividad en el eluato de la columna de afinidad, lo que condujo a una purificación general de aproximadamente 2300 veces, con un rendimiento general de aproximadamente el 26%.

El análisis mediante electroforésis de SDS-PAGE de las preparaciones de mucina purificadas mediante afinidad obtenidas a partir de leche o de tumores (muestra de efusión Nº H3300, muestra de efusión Nº H3415 y extractos mezclados de tumores de pecho) se muestra en la Figura 3. Los componentes predominantes en todas las preparaciones de mucina fueron especies teñidas con PAS, de lenta migración, que se unieron al anticuerpo W1 en experimentos de inmunotrasferencia. Además, todas las preparaciones contenían contaminantes de bajo peso molecular en proporciones y pesos moleculares variables, ninguno de los cuales reaccionó con el anticuerpo W1. Las mucinas procedentes de las tres fuentes derivadas de tumor contenían especies que migraron como bandas difusas de aproximadamente un Mr = 400.000. (Los pesos moleculares dados deben considerarse como estimados ya que se encuentran fuera del intervalo de los estándares usados y por el alto grado de glucosidación de estas moléculas). Las preparaciones procedentes de la muestra H3300 y del tumor mezclado se resolvieron cada una de ellas en dos componentes de Mr = 350.000 y 420.000, y 370.000 y 435.000, respectivamente. Las mucinas preparadas a partir de muestras de leche diferentes muestran considerable variabilidad en su migración durante el SDS-PAGE. Los diversos componentes de estas preparaciones de leche que migraron a estas velocidades variables no mostraron diferencias significativas en cuanto a la inmunoreactividad con ninguno de los anticuerpos aquí usados.

Las preparaciones de leche Nos. 2 y 7 contenían dos especies difusas de peso molecular relativo, Mr = 335.000 y 480.000 para la preparación Nº 2, y 400.000 y 500.000 para la preparación Nº 7. Las preparaciones Nº 1 y 11 contenían cada una de ellas únicamente especies difusas sencillas de Mr = 450.000 y 380.000, respectivamente. No se observaron diferencias significativas en cuanto a la inmunoreactividad de los componentes de migración más rápidos o más lentos con ninguno de los anticuerpos usados.

La composición de los aminoácidos de las mucinas purificadas procedentes de leche (preparación Nº 2) y de efusiones (muestras Nos. H3300, H3415 y H3422) se presentan en la Tabla 1). La composición de aminoácidos de la glucoproteína PAS-O descrita por Shimizu y otros, en J. Biochem. Tokyo, vol. 91, pág. 515, (1982), se incluyó en la Tabla 1 a efectos comparativos (los valores determinados para la serina y la treonina se corrigieron en un 10% y un 5% respectivamente, para compensar la destrucción durante la hidrólisis).

TABLA 1 Composiciones de los aminoacidos de las mucinas purificadas

\vskip1.000000\baselineskip

1

\vskip1.000000\baselineskip

Tal como se muestra en la Tabla 1, aunque se observaron algunas diferencias en la composición, las composiciones de los aminoácidos totales de ambas preparaciones fueron muy similares unas con otras y con la composición del PAS-O. Los aminoácidos alanina, glicina, prolina, serina y treonina, constituyeron el 59 y el 66% del total de la preparación de leche Nº 2 y de la muestra de efusión Nº H3300, respectivamente. Esto es comparable con el 65% para los mismos aminoácidos determinados para PAS-O.

Ejemplo II Generación de anticuerpos monoclonales para mucinas

Las mucinas purificadas tal como se ha descrito anteriormente se usaron para generar hibridomas para la producción de anticuerpos monoclonales para las mucinas, y para la caracterización de mucinas.

Células

Igualmente, se usaron diversas líneas de células de cáncer humano como inmunógenos para generar anticuerpos monoclonales reactivos con mucinas. Las células de carcinoma de pulmón Calu-1, que producen antígenos de mucina (disponibles del American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, con el Nº HTB54), se ha encontrado que muestran un patrón de teñido heterogéneo, característico, cuando los anticuerpos marcados fluorescentemente que reconocen al antígeno de mucina están unidos a las células. Las células Calu-1 se usaron para derivar nuevas líneas de células clonales W5-6, enriquecidas para antígeno de mucina y para US-5, que producen bajas cantidades de antígeno de mucina, tal como se describe por Linsley y otros, en Cancer Research, véase cita anterior. En resumen, las células Calu-1 se mantuvieron en Dulbecco's Modified Eagle's Medium ("DMEM", Gibco, Grand Island, NY) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FCS). La clonación de las células se realizó limitando la dilución en cavidades de microensayo. Se tuvo cuidado de seleccionar clones derivados de cavidades que contenían solamente células sencillas tal como se comprobó usando microscopía de contraste de fase. Las líneas de células derivadas muestran los mismos fenotipos isozima que las líneas de células Calu-1, tal como se determinó por el Cell Culture Laboratory (Children's Hospital, Detroit Medical Center, Detroit, MI). El anticuerpo monoclonal W5 (descrito por Frankel y otros, véase cita anterior) se usó para aislar derivados de células Calu-1 procedentes de la clonación mediante técnicas de teñido fluorescentes usando un clasificador de células activadas fluorescentes (FACS). Las células que se tiñeron debido a la unión con el anticuerpo W5, se clasificaron, a continuación, mediante el análisis de células usando el FACS y la recogida de manera estéril de las células más brillantes (aproximadamente el 10% de 100-500.000 células). La línea de células W5-6 (Clon 6) se derivó limitando el análisis de dilución de las células W5S2, una población de células obtenidas mediante clasificación por duplicado de las células derivadas de células Calu-1 que se tiñeron en respuesta a la unión del anticuerpo W5. la línea de células US-5 se derivó a partir de células Calu-1 no clasificadas (no enriquecidas). La línea de células W5-6 demostró niveles elevados de unión de anticuerpo W1, W5 y W9 con relación a la capacidad de la población parenteral Calu-1 para unirse a estos anticuerpos. De acuerdo con ello, la línea de células W5-6 está enriquecida en antígeno de mucina. Por el contrario, la línea de células US-5 mostró una gran disminución de unión a los anticuerpos W1, W5 y W9 en comparación con la W5-6 o la población parenteral Calu-1. La línea de células W5-6 aquí descrita ha sido depositada en el ATCC, con el Nº de Registro CRL 9267. Las células US-5 se usaron en la presente invención como inmunógeno en un intento de hacer tolerable a los ratones los antígenos de no-mucina y para potenciar la reactividad de los anticuerpos monoclonales aquí producidos por los antígenos de mucina.

La MCF-7, una línea de células de carcinomas de pecho, se obtuvo del Dr. Marc Liepman (National Institute of Health, Bethesda, MD) y se usó para generar anticuerpos monoclonales reactivos con antígenos de mucina asociados a tejido de pecho.

Anticuerpos monoclonales

Además de los nuevos anticuerpos monoclonales aquí descritos, se usaron también anticuerpos monoclonales previamente descritos en los procedimientos siguientes para comparación con los nuevos anticuerpos monoclonales. Estos anticuerpos se seleccionaron debido a su disponibilidad y a su reactividad previamente demostrada con mucinas procedentes de tumor de pecho o de otros tejidos malignos. En la Tabla 2 se indican estos anticuerpos.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2 Anticuerpos monoclonales previamente descritos

Nombre del anticuerpo	Antígeno/epítopo
W1	Mucina
W9	Mucina
HMFG-1	Mucina
HMFG-2	Mucina
B72.3	Mucina
DUPAN-2	Mucina
CA 19-9	Lewis a sialiado
CO-51.4	Lewis a
CO-30.1	Lewis b
L15	Lewis y
L17	Lewis x
C6	I
DF3	Mucina

Los anticuerpos W1 y W9 (Linsley y otros, Cancer Research, véase cita anterior, y los previamente mencionados como 2G3 y 245 E7 por Frankel y otros, en J. Biol. Response Modifiers, vol. 4, págs. 273-286, (1985)), fueron proporcionados por el Dr. David Ring (Cetus Corporation, Emeryville, PA). Los anticuerpos HMFG-1 y HMFG-2 (Taylor-Papadimitriou y otros, Int. J. Cancer, vol. 28, pág. 17, (1981)) se adquirieron a la Unipath Limited (Bedford, Inglaterra). Los anticuerpos B72:3 (Colcher y otros, PNAS (USA), vol. 78, pág. 3199, (1981)) y DUPAN-2 (Metzgar y otros, PNAS (USA), vol. 81, pág. 5242, (1984)), se obtuvieron de los Drs. Jeffrey Schlom (NIH) y Richard Metzgar (Duke University, Raleigh, NC), respectivamente. El anticuerpo CA 19-9 (Koprowski y otros, Somatic Cell Genetics, vol. 5, pág. 957, (1979)), el anticuerpo CO-51.4 (Blaszczyk y otros, Hybridona, vol. 2, pág. 240, (1983)) y el anticuerpo CO-30.1 (idem) se obtuvieron todos ellos del ATCC. Los anticuerpos L15 y L17 (Hellstrom y otros, Cancer Research, vol. 46, págs. 3917-3923, (1986)) fueron proporcionados por el Dr. I. Hellstrom (Oncogen, Seattle, WA). El anticuerpo E6 (Fenderson y otros, Mol. Immunology, vol. 23, pág. 747, (1986)) fue proporcionado por los Drs. Bruce Fenderson y S. Hakomori (Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC), Seattle, WA). El anticuerpo DF3 fue suministrado por Dr. D. Kufe (Harvard University Cambridge, MA).

Los anticuerpos B72.3 y DUPAN-2 se usaron como fluido ascitis. Los anticuerpos CA 19-9 y C6 se usaron como sobrenadantes de cultivo. Todos los restantes anticuerpos se purificaron a partir del fluido ascitis.

Nuevos anticuerpos monoclonales

Usando diversos protocolos de inmunización y de rastreo descritos a continuación, se desarrollaron nuevos hibridomas productores de anticuerpos monoclonales reactivos con las mucinas purificadas, así como la producción de al menos un anticuerpo capaz de reconocer preferencialmente a mucinas derivadas de tumores.

Los ratones usados para las inmunizaciones se obtuvieron del FHCRC o de los Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine. Después de inmunizaciones intraperitoneales (i.p.) o subcutáneas (s.c.) con MFGM, MCF-7, células W5-6, células US-5 o con mucinas purificadas tal como se describe más adelante, los ratones se reforzaron y tres dias después del refuerzo, se extrajeron las células del bazo de los ratones. Las células del bazo se recolectaron y se fundieron con células de mieloma NS-1 (Genetic Systems, Seattle, WA) usando procedimientos de fusión conocidos para formar el hibridoma. Todos los hibridomas se clonaron mediante dilución limitante. En algunos casos, con el fin de obtener células de hibridoma más estable, se realizó la subclonación. Los hibridomas se depositaron en el ATCC a los cuales se les asignaron los números de registros mostrados en la Tabla 3 más adelante.

Protocolos de inmunización Hibridoma productor del anticuerpo monoclonal Onc-N8

Se inmunizaron ratones Balb/c i.p. y s.c. con una inyección de 225 \mug de MFGM con adyuvante completo de Freund (CFA). Dos semanas después, se inyectaron i.p. sin adyuvante 270 \mug de MFGM. Veinte dias después, se inyectaron s.c. con adyuvante incompleto de Freund (IFA) 135 \mug de MFGM. Dos meses después, se inyectaron i.p., sin adyuvante, 200 \mug de MFMG. Los ratones inmunizados se reforzaron con 900 unidades de mucina de leche purificada i.p. ocho días después.

Hibridomas productores de los anticuerpos monoclonales Onc-M10, Onc-M11, Onc-M12 y Onc-M15

Se inmunizaron ratones Balb/c i.p. con 1,2 x 10^{7} células MCF-7 usando CFA. Veintiocho días después, se inyectaron i.p. sin adyuvante 1,2 x 10^{7} células MCF-7. Catorce días después, se inyectaron i.p. sin adyuvante 1,3 x 10^{7} células FCF-7. Veinticuatro días después, se inyectaron i.p. sin adyuvante 1,2 x 10^{7} células FCF-7. Los ratones inmunizados se reforzaron antes de la fusión aproximadamente cuatro meses después con 4 x 10^{6} células MCF-7 y 100 \mug de MFGM i.p..

Hibridomas productores de los anticuerpos monoclonales Onc-M16, Onc-M21 y Onc-M25

Se inmunizaron ratones híbridos F1 (C57-B1/6 x Balb/c) (el Onc-M16 y el Onc-M25 se obtuvieron del mismo ratón; el Ocn-M21 se obtuvo de un ratón inmunizado por separado) i.p. y s.c. con 10^{7} células W5-6 (Oncogen, Seattle, WA) sin adyuvante. Diecisiete días después, se administró i.p. y s.c. sin adyuvante, otra inyección de 5 x 10^{6} células W5-6. Posteriormente, treinta y tres días después, se inyectaron i.p. y s.c., sin adyuvante, 5 x 10^{6} células W5-6. Los ratones inmunizados se reforzaron con 10^{7} células MCF-7 y 100 \mug de MFGM, i.p., sin adyuvante, treinta y cuatro dias después de la última inyección.

Hibridomas productores de los anticuerpos monoclonales Onc-M22 y Onc-M23

Se inmunizaron ratones Balb/c i.p. con 6,5 x 10^{6} células MCF-7 usando CFA. Veinte dias después, se inyectaron i.p. 3,5 x 10^{6} células MCF-7, usando IFA y 125 \mug de MFGM. Dieciocho dias después, se inyectaron i.p., sin adyuvante, 5 x 10^{6} células MCF-7. Los ratones inmunizados se reforzaron antes de su fusión con 160 \mug de células MFGM i.p.

Hibridoma productor del anticuerpo monoclonal Onc-M26

Se inmunizaron ratones Balb/c i.p. con 250 unidades de mucina de efusión pleural de gradiente de CsCl y veinticinco dias después con 150 unidades i.p. y s.c. de mucina de efusión pleural purificada por afinidad procedente de un paciente con cáncer de pecho (muestra Nº H 3300. Además, se administró una inyección s.c. de 8 x 10^{6} células W5-6 treinta y tres dias después de la primera de las dos inyecciones de efusión pleural. Se usó CFA con la primera inyección de mucina de efusión pleural y se usó IFA con las posteriores inyecciones de mucina de efusión pleural. No se usó adyuvante para la inyección de células W5-6. Los ratones inmunizados se reforzaron treinta dias después con 1000 unidades de mucina de efusión pleural modificada mediante gel SDS-PAGE i.p. (la banda de mucina se escindió a partir de un gel de poliacrilamida para inyección) con IFA, a continuación, con 500 unidades de mucina de gradiente de CsCl veinticuatro dias después, seguido de 1000 unidades de mucina purificada con CsCl i.p. veinticinco dias después.

Hibridoma productor del anticuerpo monoclonal Onc-M27

Se inmunizaron ratones NZB i.p y s.c. sin adyuvante, con tres inyecciones de 8,5 x 10^{6} a 10^{7} células W5-6 cada tres semanas. Se administró un refuerzo después de veintitres dias de 3 x 10^{6} células W5-6 y 200 \mug de MFGM i.p. y s.c., sin adyuvante.

Hibridomas productores de los anticuerpos monoclonales Onc-M29 y Onc-M30

Se inmunizaron ratones Balb/c neonatos (procedentes de ratones Balb/c obtenidos del FHCRC) i.p. sin adyuvante, con una inyección de 10^{7} células US-5, a continuación tres inyecciones de 10^{7} a 2 x 10^{7} células W5-6 i.p. sin adyuvante, cada inyección con una semana de separación seguido, dos meses y medio después, por una inyección de 10^{7} células W5-6 i.p., sin adyuvante, y 310 unidades de mucina de leche purificada mediante gradiente de CsCl, s.c. Cincuenta y cinco dias después, se administró una inyección de refuerzo de 5 x 10^{6} células W5-6 y 1000 unidades de mucina de leche purificada mediante gradiente de CsCl, antes de la fusión, i.p. y s.c.

Hibridoma productor del anticuerpo monoclonal Onc-M38

Se inmunizaron ratones Balb/c s.c. tres veces, con intervalos de tres semanas, con 800 unidades de mucina de efusión pleural purificada por afinidad procedente de un paciente con cáncer de pecho (muestra Nº H3415). La mucina se unió a esférulas de sílice recubiertas con poli-L-lisina (0,007 \mu Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) antes de la inyección a los ratones. Dieciocho dias después de la tercera inmunización de mucina de efusión purificada mediante afinidad, los ratones se reforzaron con 4000 unidades de mucina purificada mediante afinidad administrada i.p.

Los hibridomas productores de estos nuevos anticuerpos monoclonales, enumerados en la Tabla 3, han sido depositados en el ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA 20851. Los protocolos de inmunización para los nuevos anticuerpos desarrollados en la presente invención y descritos anteriormente están resumidos en la Tabla 3. Además, en la Tabla 3 se muestran las líneas de células de hibridoma depositadas y los anticuerpos monoclonales por ellas producidos.

TABLA 3

\vskip1.000000\baselineskip

Descripción de nuevos anticuerpos

\vskip1.000000\baselineskip

2

3

\vskip1.000000\baselineskip

1. Los isocitos se determinaron mediante ELISA usando anticuerpos de clase especificada.

2. Los ratones se inmunizaron con MFGM, MCF-7, células W5-6 y US-5 o preparaciones de mucina purificadas tal como se ha descrito anteriormente.

3. Los antígenos reconocidos por los nuevos anticuerpos monoclonales se identificaron mediante los procedimientos siguientes: inmunoprecipitación (IP), inmunotrasferencia (IB), o inmunoensayos de determinante doble (DDIA) tal como se describió en el Ejemplo II.

4. Los datos presentados en el Ejemplo II se obtuvieron a partir de un clon, el hibridoma Onc-M29.41 (ATCC Nº. HB 9243). El subclon Onc-M29 (ATCC Nº. HB 9210) se derivó de un clon hermano del Onc-M29.41 y se caracterizó de manera similar.

5. HB9229 y HB 9243 no forman parte de la invención.

Rastreo

Se usaron diversos procedimientos de rastreo para aislar los hibridomas que produjeron los anticuerpos monoclonales capaces de unión a los antígenos de mucina purificada.

Para la detección de los anticuerpos presentes en los hibridomas sobrenadantes y capaces de unión a las mucinas purificadas obtenidas tal como se ha descrito anteriormente, se desarrolló un ensayo de captura WGA. En este procedimiento, las mucinas purificadas procedentes de efusión pleural o de leche se inmovilizaron sobre placas de Microtiter® de poliestireno, de 96 cavidades, de fondo plano (Imnulon II, Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, VA) usando lectina de Tritium vulgaris (Aglutinina de germen de trigo "WGA" de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Las placas Microtiter® se prepararon mediante la adición de 50 \mul/cavidad de una solución de 20 \mug/ml de WGA en Tris-HCl 50 mM que contenía CaCl_{2} y MgCl_{2} 10 mM a pH 8,0. Después de dos horas de incubación a 25ºC para recubrir las placas con WGA, la solución se eliminó por aspiración. Después de cromatografía de afinidad, se agregaron a continuación mucinas purificadas (1,0 unidades inhibitorias (inhibición de la unión de anticuerpo W1 a antígeno W1) por cavidad, a menos que se indique lo contrario, en Tris-HCl 50 mM a pH 8, que contenía CaCl_{2} 1 mM y MgCl_{2} 1 mM. A continuación, las placas se incubaron durante un periodo de 1 a 4 horas a 25ºC y se lavaron usando PBS tamponado y FCS al 2%.

Para realizar el ensayo, se agregaron anticuerpos monoclonales previamente identificados a concentraciones de saturación (1 \mug/ml) para los anticuerpos purificados, o a unas diluciones de 1:50 para los fluidos de ascitis. Para el ensayo de los nuevos anticuerpos, se agregaron sobrenadantes procedentes de cultivos de hibridoma sin diluir a las placas.

Las características del ensayo WGA se determinaron con cantidades crecientes de leche purificada y de mucina de efusión en un experimiento mostrado en la Figura 4. Las curvas de dosis-respuesta para la unión del anticuerpo W1 se mantuvieron lineales a lo largo de más de diez veces el intervalo de unidades inhibitorias por cavidad, tanto para mucinas derivadas de leche como derivadas de mezclas de tumores, pero la curva para la muestra derivada de tumores se desplazó a la derecha y aumentó su pendiente. Otros anticuerpos ensayados mostraron curvas de dosis-respuesta que fueron paralelas a las curvas para el anticuerpo W1, pero cuyas posiciones relativas se desplazaron dependiendo de la fuente de mucina particular. Los resultados indican que los epítopos reconocidos por los anticuerpos se expresaron en densidades relativas diferentes sobre mucinas procedentes de fuentes normales y de tumores.

Para detectar la unión de anticuerpos a antígenos de mucina purificada inmovilizada usando el WGA, se usó un inmunoensayo de enzima indirecto (ELISA). (En adelante, a este procedimiento se le denomina como "ensayo de captura de WGA"). En resumen, la unión de los nuevos anticuerpos monoclonales producidos tal como se ha descrito anteriormente se midió mediante la adición de inmunoglobulina anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) (CAPPEL, Malvern, PA) o mediante el uso de anticuerpo anti-ratón de cabra específico IgG (Southern Biotek, Birminghan, AL) para reducir el número de anticuerpos IgM obtenidos.

Para el rastreo preliminar del hibridoma Onc-M8, los sobrenadantes se ensayaron nueve dias después de la fusión para la unión a la mucina de efusión pleural purificada usando el ensayo de captura de WGA anteriormente descrito. Para los hibridomas que dieron positivo en la unión, se realizó un ensayo de unión de competencia secundario usando mezclas de suero normal y de tumor.

Los sobrenadantes de los hibridomas Onc-M10, Onc-M11, Onc-M12 y Onc-M15 se rastrearon en primer lugar mediante un ensayo ELISA para determinar la unión a células MCF-7 (sin fijar) vivas. Para los sobrenadantes de los hibridomas que dieron positivo en el ensayo, se realizaron dos rastreos secundarios. En primer lugar, se realizó un ensayo de unión de competencia usando células MCF-7 vivas, en el cual cada sobrenadante de hibridoma se ensayó para determinar el anticuerpo capaz de unión a las células. En segundo lugar, los sobrenadantes se rastrearon para detectar la unión a mucina de leche purificada unida a placas usando polilisina.

Para un rastreo preliminar de los hibridomas Onc-M16 y Onc-M25, los sobrenadantes procedentes de la fusión de células de mieloma con células de bazo procedentes de ratones inmunizados se ensayaron para determinar la unión a células W5-6 fijadas con paraformaldehido. El ensayo de unión se realizó sobre monocapas de células fijadas con paraformaldehido tal como se describe por Linsley y otros, en Biochemistry, véase cita anterior. Para los hibridomas que dieron positivos en el ensayo, se realizó un rastreo secundario mediante la observación del patrón de teñido fluorescente de unión del anticuerpo a las células Calu-1.

El hibridoma Onc-M21 se rastreó preliminarmente mediante el ensayo para determinar la unión frente a MFGM adherido con polilisina usando el ensayo ELISA. Para los hibridomas que dieron positivo en el ensayo, se realizó un rastreo secundario usando el ensayo de captura de WGA para detectar la unión, usando sueros de tumores y normales.

Para los sobrenadantes de los hibridomas Onc-M22 y Onc-M23 procedentes de la fusión de células de mieloma con células de bazo procedentes de ratones inmunizados, se rastrearon preliminarmente once y trece días después de la fusión. Se usó el ensayo de captura de WGA para detectar cualquier anticuerpo presente en el sobrenadante de hibridoma capaz de unirse preferencialmente a muestras de sueros de tumor en lugar de a muestras de sueros normales.

Para el sobrenadante de hibridoma Onc-M26 procedente de la fusión de células de mieloma con células de bazo procedentes de ratones inmunizados, se ensayaron preliminarmente siete dias después de la fusión mediante la unión a mucina de efusión pleural purificada capturada mediante lecitina, usando el ensayo de unión a WGA. En los casos en que se detectó unión, se usó, a continuación, el ensayo WGA-ELISA para comparar la capacidad del sobrenadante del hibridoma para unirse a mucina capturada con WGA presente en el suero obtenido de pacientes con tumores en comparación con el suero normal.

Los sobrenadantes de los hibridomas Onc-M27, Onc-M29 y Onc-M30 se ensayaron siete dias después de la fusión mediante la unión a mucina de leche purificada mediante CsCl derivada, tal como se ha descrito anteriormente, usando el ensayo de captura de WGA. Los sobrenadantes de los hibridomas que dieron positivos en el ensayo se volvieron a ensayar sobre mucina de leche purificada por afinidad usando el ensayo WGA-ELISA. Igualmente, los sobrenadantes de los hibridomas se rastrearon comparando la unión a anticuerpo anti-ratón de cabra IgM e IgG; generalmente, los que se encontraron que eran específicos para IgG se seleccionaron para una posterior caracterización.

El sobrenadante de hibridoma Onc-M38 se rastreó para determinar la presencia de anticuerpo mediante la unión a mucina de efusión pleural purificada con gradiente capturada mediante lectina, usando el ensayo de unión a WGA. Los sobrenadantes de los hibridomas que dieron positivos en el ensayo se volvieron a ensayar en un ensayo de unión a WGA usando mucina de efusión pleural purificada por afinidad y mediante gradiente.

Los sobrenadantes de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales que se unen a antígeno de mucina (antígeno purificado o asociado a células) tal como se han descrito anteriormente, se inyectaron en ratones cebados con pristano para producir fluido ascitis, a partir del cual, los anticuerpos monoclonales se purificaron usando procedimientos de purificación conocidos. Después de precipitación con sulfato amónico, los anticuerpos IgG se purificaron mediante intercambio iónico sobre columnas Sephacel DEAE (Pharmacia, Uppsala, Suecia) y el anticuerpo IgM (M26) se purificó usando fraccionamiento de tamaño sobre una columna Sephacryl S-300 (Pharmacia). Los isotipos (subclases de inmunoglobulina de los anticuerpos) de los anticuerpos purificados se determinaron mediante un inmunoensayo de enzima (descrito más adelante) usando anticuerpos específicos de la clase (Southern Biotek).

Ejemplo III Caracterización de nuevos anticuerpos monoclonales

Los nuevos anticuerpos aislados tal como se ha descrito anteriormente, se ensayaron para determinar sus capacidades para unirse a todas las mucinas purificadas, usando el ensayo de captura de WGA anteriormente descrito. Se usó una concentración única de 1,5 unidades inhibitorias de antígeno por cavidad, y se usaron concentraciones saturantes de anticuerpo (1 \mug/ml). La incubación del sustrato se interrumpió cuando los valores de O.D. máximos para cada muestra estuvieron dentro de intervalo de 0,4 a 1,4.

Se usaron diversos procedimientos adicionales para demostrar que los nuevos anticuerpos reconocían al antígeno de mucina que también se une al anticuerpo W1. Estos procedimientos fueron la inmunoprecipitación (IP) a partir de extractos de células de tumores marcados bien con ^{3}H-glucosamina o bien con ^{3}H-treonina; e inmunotransferencias (IB) en mucinas purificadas o en preparaciones de membranas de células tal como se ha descrito por Linsley y otros, en Biochemistry, vol. 25, pág. 2978, (1986). Igualmente, se usó un inmunoensayo de determinante doble (DDIA), en el cual, los anticuerpos se ensayaron para determinar su capacidad para capturar mucinas que se unen al anticuerpo W1 conjugado con HRP (Tabla 3).

Igualmente, los nuevos anticuerpos se ensayaron para determinar la unión a líneas de células W5-6 cultivadas fijadas con paraformaldehido tal como se ha descrito por Linsley y otros, en Biochemistry, vol. 25, pág. 2978, (1986).

Resultados Unión de anticuerpo a antígeno de mucina purificado

Los anticuerpos monoclonales producidos de acuerdo con la presente ivención reaccionan con mucinas procedentes de leche humana, líneas de células de tumores, fluidos de efusión pleural y tumores, tal como se ha determinado mediante el ensayo de captura de WGA y los ensayos de unión a DDIA descritos anteriormente. La mayoría de los nuevos anticuerpos descritos en la presente invención reaccionaron con mucinas tal como se determinó usando más de un procedimiento; sin embargo, el procedimiento DDIA solo se usó para el anticuerpo Onc-M30. Dado que las mucinas purificadas contienen el epítopo W1 (véase Tabla 4), los nuevos anticuerpos reaccionan o bien con el epítopo W1 o bien con los que parecen ser nuevos epítopos en antígenos de mucina. Igualmente, estos anticuerpos pueden unirse a epítopos adicionales en antígenos de mucina, tal como los epítopos T y Tn.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 4 Unión de anticuerpo a mucinas purificadas^{1}

\vskip1.000000\baselineskip

4

5

Tal como puede observarse de la Tabla 4, algunos anticuerpos monoclonales (Onc-M8, Onc-M16, W1 y W9) dieron valores de absorbancia elevados (>0,1), uniéndose a la mayoría de las muestras procedentes de fuentes de leche y de tumores; algunos anticuerpos (Onc-M15, Onc-M22, Onc-M23, Onc-M25 y Onc-M27, HMFG-1 HMFG-2), dieron valores de absorbancia elevados (>0,1) uniéndose a la mayoría de las mucinas de leche, pero no a las muestras derivadas de tumores; y otros anticuerpos (Onc-M10, Onc-M11, Onc-M12, Onc-M21, Onc-M29, Onc-30 y B72.3, DUPAN-2, CA19-9), dieron valores de absorbancia <0,1 dejando de unirse a la mayoría de las muestras, tanto de fuentes de leche como de tumores. El anticuerpo Onc-M26, se une fuertemente a la mucina de efusión pleural (H3300) pero se une débilmente a todas las muestras de mucina derivadas de leche. Se señala que aunque ciertos anticuerpos no se unen significativamente a las mucinas de efusión pleural o de tumor de pecho en el ensayo de unión directo, se detectó la unión de todos los anticuerpos a epítopos de mucina en la muestra de mucina de efusión pleural H3300 mediante el ensayo DDIA más sensible. El Onc-M38 no se comprobó mediante este ensayo, pero un experimento separado dió valores de absorbencia elevados para la unión tanto a mucina de leche como de efusión.

Se ha encontrado que las mucinas purificadas procedentes de la leche de diversos donantes son antigénicamente similares, lo que sugiere que los anticuerpos ensayados no detectan determinantes antigénicos polimórficos, tal como los antígenos del grupo sanguíneo (p. ej., ABO y Lewis). Aunque el 80% de la población son Lewis-positivos (y dos de los donantes de leche, el uno y el siete, mostraron mediante el ensayo de la saliva que eran Lewis-positivos), ninguna de las mucinas derivadas de tumores tenían niveles de antígenos de Lewis detectables mediante el ensayo de unión. Ninguna de las preparaciones de mucina de leche (incluyendo las muestras 1 y 7) tenían niveles detectables de Lewis b (anticuerpo CO-30.1) o Lewis y (anticuerpo L15), aunque tres de ellas (incluyendo las muestras 1 y 7) tenían niveles bajos, aunque detectables, de Lewis a (anticuerpo CO-51.4) y Lewis x (anticuerpo L17). Esto sugiere que los antígenos de Lewis están expresados únicamente débilmente en la mucina de leche y muy poco, si es que lo están en alguna medida, en la mucina derivada de carcinomas de pecho. Por el contrario, estos epítopos han sido detectados en antígenos de mucina procedentes de carcinoma de colon. (Magnani y otros, Cancer Research, vol. 43, pág. 5489, (1983) y Johnson y otros, Cancer Research, vol. 46, pág. 850, (1986)).

Cuando se comparan con las mucinas de leche, las mucinas derivadas de tumores muestran perfiles de unión de anticuerpo completamente diferentes. Los datos sugieren que los anticuerpos monoclonales que reconocen los nuevos epítopos de mucina se identificaron usando el procedimiento de la presente invención. El anticuerpo W1 se unió a todas las muestras derivadas de tumores, con un grado relativamente más elevado que los otros anticuerpos ensayados; es decir, con relación al W1, la unión con todos los anticuerpos restantes fue reducida.

Uno de los nuevos anticuerpos descritos en la presente invención, el Onc-M26, producido mediante la línea de células de hibridoma ATCC Nº. HB 9212, detectó al epítopo más "específico del tumor". Igualmente, este epítpo se detectó en las otras muestras derivadas de tumores cuando se usaron en el ensayo concentraciones más elevadas de mucinas, pero a una concentración mucho menor en mucinas procedentes de muestras de leche. De acuerdo con ello, el Onc-M26 muestra expectativas como un anticuerpo monoclonal capaz de distinguir entre la presencia de mucinas normales y asociadas a tejido de cáncer en suero procedente de un sujeto normal, en ensayos para detectar el cáncer.

Estos datos establecen que las especificidades de la mayor parte de los nuevos anticuerpos son diferentes de las de los anticuerpos previamente descritos. Sin embargo, los epítopos en los anticuerpos Onc-M21 y Onc-M29 no pudieron distinguirse de las de los otros anticuerpos tales como B72.3 y DUPAN 2 en base a estos datos, debido a que no se unen significativamente a las fuentes de mucina purificadas en este ensayo. Los experimentos de unión a la célula W5-6 mostraron que el Onc-M21 y el Onc-M29 se unen preferencialmente a la línea de células W5-6, en comparación con los anticuerpos previamente conocidos, lo que demuestra la especificidad única de estos anticuerpos.

Estos resultados demuestran que las mucinas purificadas derivadas de fuentes de tumores usando los procedimientos descritos en la presente invención son inmunológicamente diferentes de las mucinas procedentes del epitelio de pecho normal presente en la leche. Igualmente, los datos sugieren que los epítopos antigénicos presentes en mucinas procedentes de tejido de epitelio de pecho normal pueden enmascararse mediante otros determinantes, o pueden estar presentes a niveles reducidos en mucinas obtenidas a partir de tumores. A su vez, esto indica que las mucinas de tumores pueden contener epítopos no encontrados en mucinas procedentes de fuentes normales. Por ello, las mucinas purificadas que incluyen mucinas derivadas de tumores pueden proporcionar un inmunógeno mejorado para el desarrollo de anticuerpos monoclonales capaces de reconocer antígeno de mucina, en particular, los anticuerpos capaces de reaccionar preferencialmente con mucinas derivadas de tumores, en comparación con mucinas procedentes de fuentes normales.

Ejemplo IV Ensayo de suero usando anticuerpos monoclonales M26 y M29

Para demostrar la utilidad de los anticuerpos monoclonales descritos en la presente invención, se realizó un DDIA usando los anticuerpos monoclonales Onc-M26 y Onc-M29 obtenidos tal como se ha descrito en el Ejemplo II. El anticuerpo W1 se usó con fines comparativos.

Se incubaron placas de Immulon II con 50 \mul/cavidad de 10 \mug/ml de anticuerpo Onc-M26 o Onc-M29, en tampón Tris 50 mM, pH 8,0, durante 1 hora para recubrir las placas con anticuerpo ("anticuerpo de captura"). A continuación, las placas se aspiraron y se bloquearon usando 350 \mul/cavidad de tampón de bloqueo (albúmina de suero bovino al 0,5% (BSA), sacarosa al 5% y tampón Tris) y se dejaron reposar durante una noche. Las placas se aspiraron nuevamente y se transfirieron usando rollos de papel, durante una noche. Las placas se almacenaron secas envueltas en plástico a temperatura ambiente. Los sueros procedentes de pacientes diagnosticados como poseedores de cáncer y los sueros de control (procedentes de pacientes normales) se diluyeron usando suero vacuno fetal (FCS). Cuando el ensayo se realizó usando el anticuerpo monoclonal Onc-M26 y el anticuerpo W1 para la detección del anticuerpo de captura, tanto el suero como los controles se diluyeron en una relación de 1:8. Para el ensayo en el que se usa el anticuerpo monoclonal M29 y el anticuerpo W1, el suero y los controles se diluyeron en una relación de 1:50. Los estándares de absorbancia para el anticuerpo monoclonal Onc-M26 se obtuvieron diluyendo volumétricamente una muestra de efusión pleural (Nº. H3375), preparada tal como se ha descrito anteriormente, en una mezcla de sueros mezclados y de FCS. Los estándares de absorbancia para el anticuerpo Onc-M29 se obtuvieron diluyendo la muestra Nº. H3375 en FCS. Los estándares de absorbancia se calibraron asignando a las mezclas de sueros un valor de 20 unidades de absorbancia por ml. Los controles estaban formados por sueros mezclados procedentes de empleados de Oncogen, y dos muestras de efusión pleural de pecho. Tanto los estándares como los controles se repartieron en partes alícuotas y se almacenaron a -70ºC.

Se pipetearon 50 \mul de sueros diluidos, controles y estándares en cavidades recubiertas por duplicado. Las cavidades se sellaron con sellador de placa y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, las placas se lavaron manualmente por duplicado usando FCS al 2% en tampón de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se agregó a las placas 50 \mul de una dilución apropiada del anticuerpo conjugado W1-HRP. Para el ensayo del M26, se usó una concentración de 0,5 \mug/ml de W1-HRP. Para el ensayo del M29, se encontró que era óptimo 0,1 \mug/ml del conjugado W1-HRP. Todos los conjugados se diluyeron en FCS al 2% y PBS. A continuación, las placas se volvieron a sellar y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Posteriormente, las placas se lavaron manualmente tres veces usando tampón PBS. Se agregaron a las placas 100 \mul de sustrato OPD, las cuales se incubaron, a continuación, en la oscuridad durante una hora. Las reacciones se interrumpieron usando 50 \mul de ácido sulfúrico 1,5 N. Se midió la absorbancia a 490 nm. Los duplicados que se separaran más de 10 unidades/ml (o 2 unidades/ml si era menos de diez unidades/ml) se repitieron. Las muestras que proporcionaron resultados elevados se diluyeron y se volvieron a ensayar. Los ensayos se compararon en cuanto a su capacidad para discriminar entre los dos grupos de pacientes (con y sin cáncer). Los valores de corte (unidades/ml) se seleccionaron para dar aproximadamente un 90% de especificidad (es decir, 90% del grupo de control ensayado negativo). Los resultados se representan en la Tabla 5.

\newpage

TABLA 5

\vskip1.000000\baselineskip

Ensayo de suero % por debajo del suero

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

La Tabla 5 muestra los resultados del ensayo DDIA usando sueros procedentes de pacientes con cáncer con el anticuerpo monoclonal W1, y los nuevos anticuerpos monoclonales Onc-M26 y Onc-M29. La columna de ensayo indica el tipo de anticuerpo monoclonal usado con el anticuerpo monoclonal W1 en el ensayo DDIA tal como se ha descrito anteriormente. En el ensayo W1 (DDIA homólogo) el anticuerpo monoclonal W1 se inmovilizó como anticuerpo captura para unir el antígeno de mucina presente en el suero procedente del sujeto humano. El anticuerpo de detección secundario usado en estos ensayos fue el anticuerpo W1 conjugado con HRP. En el ensayo M26, el anticuerpo inmovilizado fue Onc-M26 y, en el ensayo M29, se inmovilizó el anticuerpo Onc-M29. Los números que siguen a la designación del anticuerpo en la columna de corte indican el nivel de antígeno en unidades/ml por encima de la cual se determinó que el ensayo era positivo para la presencia de mucina asociada a tumor. Las columnas 0-6 indican el porcentaje de pacientes para los cuales el tipo de cáncer se encontró que tenía un nivel de epítopo W1 por encima del nivel indicado en la columna de corte, tal como se determinó usando los anticuerpos indicados. La columna de control indica un porcentaje de ensayos de sueros de control (procedentes de pacientes sin cáncer) que tienen una reacción positiva (es decir, que detectan el nivel de antígeno indicado en la columna de corte, denominados por ello resultados "positivos falsos"). El número de pacientes en cada categoría de sueros (0-6) y el tipo de cáncer presente en estos pacientes se indica también en la Tabla 5. De acuerdo con ello, en los casos en que el Onc-M26 fue el anticuerpo de captura, con un nivel de corte de antígeno superior a 95 unidades/ml, aproximadamente, el 43% de los 116 pacientes que tenian cáncer metastático se identificaron como que tenían cáncer usando el anticuerpo de captura Ocn-M26 y el anticuerpo de detección W1 en el ensayo. Unicamente el 0,5% de los controles fueron detectados erróneamente como que tenían cáncer (positivos falsos). El uso del anticuerpo Onc-M29 dió como resultado un 66% de los pacientes identificados correctamente con 4% de identificación positiva falsa. Cuando el anticuerpo W1 se usó como el anticuerpo primario y secundario en el ensayo, aproximadamente el 58% de los 116 pacientes se identificaron como que tenían cáncer, pero con un 4% de identificación positiva falsa.

De acuerdo con ello, el uso del anticuerpo Onc-M29 en el ensayo DDIA identifica correctamente la presencia de cáncer en una fracción mayor de pacientes con cáncer de lo que lo hace el antcuerpo W1, lo que indica una sensibilidad incrementada del Onc-M29 usado como un anticuerpo de captura, sobre el anticuerpo W1. El uso del anticuerpo Onc-M26 da como resultado un ensayo algo menos sensible que cuando se usa el anticuerpo Onc-M29. Sin embargo, cuando se compara con el anticuerpo W1, se observaron un número muy pequeño de positivos falsos (0,5%) y, por ello, el ensayo es más específico. La confirmación de los resultados positivos para los ensayos de M26 o M29 proporciona una indicación más sensible de la presencia de cáncer que usando los resultados bien del ensayo M26 o bien del M29 solamente (por ejemplo, el 75% de pacientes que tenían cáncer metastático se clasificaron como positivos. Estos resultados demuestran la utilidad potencial de los anticuerpos monoclonales Onc-M26 y Onc-M29 en la detección de cáncer en sueros humanos.

Ejemplo V Análisis de competencia cruzada de unión de anticuerpo de mucina

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención han sido caracterizados además mediante estudios de competencia cruzada, cuyos resultados se reflejan en la Tabla 6 más adelante. Mediante estos estudios, se averiguó la concentración de anticuerpo de mucina no marcado que produce la mitad de la inhibición máxima (50%) de unión de una concentración estándar (0,5 \mug/ml) de anticuerpo de mucina marcado con ^{125}I. El análisis de competencia cruzada se realizó entre cada uno de los anticuerpos marcados (^{125}I) identificados en la Tabla 6 y cada uno de los anticuerpos no marcados designados a lo largo de la parte superior de la Tabla 6. La unión de competitividad de los anticuerpos M8, M15, M16, M22, M23, M25, M27, W1, W9 y M38 se midió sobre mucina derivada de leche purificada con CsCl, en tanto que la unión de los anticuerpos M10, M11 y M12, se determinó con respecto a la línea de células MCF7. La unión del Onc-M21 y Onc-M29 se determinó con respecto a la línea de células W5-6. La unión del anticuerpo marcado con ^{125}I a 0,5 \mug/ml se midió en presencia de proporciones crecientes de anticuerpos no marcados, hasta 50 \mug/ml. (El anticuerpo M26 no se incluyó en este análisis debido a que después del radiomarcado se unió muy pobremente a la mucina inmovilizada.

En la Tabla 6, la designación "++++" significa que se produjo la mitad de la inhibición máxima a una concentración de anticuerpo no marcado inferior a 3,2 \mug/ml; la designación "+++" significa que la cantidad anticuerpo no marcado requerido para obtener la mitad de la inhibición máxima estuvo comprendida entre 3,2 y 15,8 \mug/ml; la designación "++" significa que la concentración de anticuerpo no marcado requerido para obtener la mitad de la inhibición máxima de unión del anticuerpo marcado se obtuvo entre 16 y 31 \mug/ml; la designación "+" significa que la concentración de anticuerpo no marcado requerido para obtener la mitad de la inhibición máxima de unión del anticuerpo no marcado se obtuvo entre 32 y 50 \mug/ml; y la designación "-" significa que la concentración de anticuerpo no marcado requerido para obtener la mitad de la inhibición máxima de unión del anticuerpo marcado fue superior a 50 \mug/ml.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

7

\newpage

Con respecto a los resultados del análisis de competencia cruzada indicados en la Tabla 6, varios anticuerpos mostraron patrones únicos de comptencia cruzada, lo que indica que se unieron a epítopos distintos. El patrón más único de competencia cruzada es el mostrado por los anticuerpos M21 y M29 que compitieron mutuamente por la unión, pero ninguno de ellos compitieron ni fueron competidos por ninguno de los otros anticuerpos ensayados. De acuerdo con ello, estos anticuerpos reconocen o bien el mismo o epítopos relacionados espacialmente que son diferentes de los reconocidos por los otros anticuerpos.

Los anticuerpos W1 y M38, no fueron competidos por ningún otro anticuerpo, pero ellos, a su vez, compitieron por la unión de otros muchos anticuerpos. Esto sugiere que los epítopos para estos anticuerpos son distintos, pero son o bien estructuralmente similares o bien están espacialmente relacionados con los de otros anticuerpos. El anticuerpo M10 fue competido por varios otros anticuerpos, pero a su vez compitió únicamente por la unión del ^{125}I-M10, lo que sugiere que se une, también, a un epítopo distinto que está estructuralmente o espacialmente relacionado con los de los anticuerpos W1, M8, M16 y M38. Sin embargo, el anticuerpo M10 no compite significativamente por la unión del anticuerpo W1 incluso cuando se ensayó en células MCF7, a las cuales son a las que mejor se une este
anticuerpo.

Los anticuerpos restantes mostraron patrones de competencia cruzada que sugieren relaciones estructurales o espaciales entre sus epítopos respectivos. Por ejemplo, los epítopos para los anticuerpos W9, M8, M16 y M25 parecen estar relacionados, al igual que para los M11 y M12.

Los anticuerpos M15, M22, M23 y M27 mostraron también patrones similares de competencia cruzada, aunque se observaron algunas diferencias. En general, estos anticuerpos unen epítopos que parecen estar estructuralmente o espacialmente relacionados mutuamente. Los datos bioquímicos sugieren que estos anticuerpos reconocen epítopos de proteína del núcleo (véase más adelante). En base a los datos de competencia cruzada, los epítopos para estos cuatro anticuerpos están relacionados con el epítopo para el anticuerpo W1, y los anticuerpos M22 y M23 están relacionados también con el epítopo para el M38.

En resumen, los patrones de competencia cruzada entre los nuevos anticuerpos, y W1 y W9, indicaron la presencia de varios epítopos en moléculas de mucina. Los anticuerpos M21 y M29 reconocen epítopos que son o bien idénticos o bien muy íntimamente relacionados, y son distintos de los reconocidos por otros anticuerpos. Todos los anticuerpos restantes reconocen epítopos que comparten características estructurales, o están estéricamente relacionados con epítopos para otros anticuerpos. Los anticuerpos W1, M10 y M38 reconocen epítopos que están relacionados, pero no son idénticos a los de otros anticuerpos. Los anticuerpos M11 y M12 reconocen un epítopo(s) íntimamente relacionado que es también no idéntico al reconocido por otros anticuerpos. El anticuerpo monoclonal M38 identifica a un nuevo epítopo no reconocido por los otros nuevos anticuerpos monoclonales de la presente invención o por los anticuerpos W1 o W9. A partir de lo anteriormente indicado, parece que el anticuerpo monoclonal Onc-M38 muestra alta especificidad para un único epítopo en antígenos de mucina y, por ello, puede desarrollar una función no solamente en ensayos para la detección de tumores en pacientes, sino también en el tratamiento de dichos tumores usando las técnicas y procedimientos anteriormente expuestos.

Ejemplo VI Caracterización bioquímica de epítopos

Con el fin de determinar la naturaleza bioquímica de los epítopos reconocidos por los nuevos anticuerpos, se estudiaron los efectos de diversos tratamientos sobre la unión de anticuerpos a mucinas.

Para determinar qué tipos de estructuras de carbohidrato se requerían para la unión de los anticuerpos, se examinaron los efectos del tratamiento con peryodato sódico sobre la unión del anticuerpo (Tabla 7). Las mucinas se inmovilizaron sobre placas Microtiter® mediante WGA tal como se ha descrito anteriormente y se trataron con peryodato sódico (NaIO_{4}) a concentraciones que variaron desde 0,2 hasta 100 mM en un tampón de acetato sódico 50 mM, pH 4,5, durante un periodo de 30 minutos a 37ºC. La muestra de mucina derivada de Leche 2 se purificó por afinidad usando el anticuerpo W9 y la muestra de mucina derivada de H3300 se purificó con CsCl. Las mucinas procedentes de membranas de células MCF7 y W5-6, se solubilizaron con una solución de detergente no iónico (TNEN, Linsley y otros, Biochem., vol. 25, págs. 2778-2986, (1986)) y se separaron del material insoluble detergente mediante centrifugación (390.000 x g) antes de la inmovilización. Las cavidades se lavaron intensamente con PBS y se trataron con NaBH_{4} (100 mM en PBS) durante un periodo de tiempo adicional de 30 minutos a 37ºC. Después de estos tratamientos, las cavidades se bloquearon con el tampón de unión descrito por Linsley y otros, en Biochem., vol. 25, págs. 2978-2986, (1986), el cual se incorpora aquí como referencia, que contenía FCS al 10%, y se ensayaron para determinar la unión del anticuerpo mediante ELISA indirecto. La concentración de NaIO_{4} requerida para reducir la unión al 50% se determinó mediante interpolación a partir de valores determinados.

La unión de un anticuerpo de control (C6) a un epítopo de carbohidrato definido (estructura I) fue sensible al tratamiento con peryodato, produciéndose la inhibición máxima mitad de unión a 1 mM. Los anticuerpos W1 y W9, y M26 fueron más sensibles al tratamiento con peryodato que el anticuerpo de control; esta sensibilidad del W1 y del W9 ha sido previamente demostrada y sugiere que se requiere el carbohidrato para la unión de estos anticuerpos. Otros cinco anticuerpos (M10, M11, M12, M21 y M29) fueron sensibles al peryodato, pero requirieron concentraciones significativamente más elevadas que el anticuerpo de control. Los ocho anticuerpos restantes fueron insensibles al tratamiento con peryodato, incluso a concentraciones extremadamente elevadas (0,1 M). De acuerdo con ello, los epítopos para todos los nuevos anticuerpos, excepto el M26, fueron menos sensibles a la oxidación con peryodato que los anticuerpos W1 y W9, y el anticuerpo de control, el C6.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 7 Efectos del tratamiento con peryodato sobre la unión de anticuerpo

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

Para comprobar si se requería ácido siálico para la unión del anticuerpo, los anticuerpos se ensayaron para determinar la sensibilidad a neuraminidasa en el experimiento que se resume en la Tabla 8. Las mucinas se inmovilizaron sobre placas Microtiter® mediante WGA y se trataron con neuraminidasa procedente del Vibrio cholerae, tal como se describe por Linsley y otros, en Cancer Res., vol. 46, véase cita anterior. La neuraminidasa (4,5 mUnidades/cavidad) se agregó en NaCl 150 mM, acetato sódico 50 mM, pH 5,5 y CaCl_{2} al 0,1% durante una hora a 37ºC. A continuación, las cavidades se bloquearon con tampón de unión que contenía FCS al 10% y se ensayaron para determinar la unión de anticuerpo mediante ELISA indirecto.

TABLA 8 Efectos del tratamiento con neuraminidasa sobre la unión del anticuerpo

11

12

La unión del anticuerpo de control (6) se incrementó mediante el tratamiento, de acuerdo con la preferencia conocida de unión de este anticuerpo a estructuras no sialiladas. La unión de los anticuerpos M8, M16, M25, M21, M27 y M29 a mucina derivada de H3300 se incrementó también mediante tratamiento con neuraminidasa, lo que sugiere que los epítopos para estos anticuerpos se desenmascararon mediante la eliminación del ácido siálico. Por el contrario, la unión de estos mismos anticuerpos a mucinas derivadas de leche no resultó afectada por el tratamiento con neuraminidasa.

La unión de los anticuerpos W1 y W9 fue sensible a la neuraminidasa, tal como se ha demostrado previamente. La unión del anticuerpo M26 fue también sensible a la neuraminidasa, lo que sugiere que se requiere el ácido siálico para la unión de este anticuerpo. La unión de los siete anticuerpos restantes no resultó afectada por el tratamiento con neuraminidasa.

Puesto que los epítopos para la mayoría de estos anticuerpos no fueron sensibles al peryodato o a la neuraminidasa, fue posible que algunos de ellos reconocieran epítopos de proteína del núcleo. Para ensayar esta posibilidad, se estudió la unión de ciertos anticuerpos a mucina derivada de leche purificada que había sido desglucosilada mediante tratamiento con fluoruro de hidrógeno anhidro (HF). La mucina derivada de leche se purificó hasta homogeneidad mediante cromatografía de afinidad y la cromatografía de exclusión de tamaño se realizó tal como se ha descrito anteriormente. Doscientos \mug de proteína purificada (determinada mediante la composición de los aminoácidos) se desglucosiló usando HF anhidro tal como se describe por Mort y Lanport, en Anal. Biochem., vol. 82, págs. 289-309, (1977), el cual se incorpora aquí como referencia. Después de tratamiento durante cuatro horas a 23ºC, la muestra se solubilizó en ácido acético al 50%, se dializó frente a acetato amónico 20 ml y se liofilizó. Las muestras de mucina no tratada (3 mg de proteína/cavidad) y desglucosilada (10 mg/cavidad) se absorbieron directamente en cavidades de microensayo de poliestireno y se ensayaron para determinar la unión del anticuerpo mediante ELISA indirecto.

Para confirmar que el tratamiento había eliminado los oligosacáridos, las muestras se sometieron a análisis de aminoácidos y de hexosamina (AA laboratories, Seattle, WA). Aunque las composiciones de los aminoácidos de ambas muestras fueron idénticos, la mucina tratada con HF tenía un contenido en hexosamina (glusosamina + galactosamina) menor del 2% de la mucina no tratada. Este tratamiento dió como resultado la eliminación de más del 98% de la N-acetil glucosamina y N-acetil galactosamina procedente de la preparación purificada, pero no afectó significativamente a su composición de aminoácidos.

TABLA 9 Unión de anticuerpos a mucina derivada de leche desglucosilada

13

Tal como se muestra en la Tabla 9, la desglucosilación eliminó la unión del anticuerpo de control, y la de seis de diez anticuerpos que se habían unido fuertemente a la mucina no tratada. Por el contrario, los anticuerpos M15, M23 y M27 se unieron fuertemente a la mucina desglucosilada inmovilizada, lo que sugiere que estos anticuerpos se unen a los epítopos de la proteína del núcleo. La unión del anticuerpo M22 se redujo mediante el tratamiento con HF, pero la unión fue aún significativa. Los anticuerpos M10, M11, M12, M21 y M29 no se ensayaron para determinar la unión a los epítopos de la proteína del núcleo debido a que estos anticuerpos se unieron muy pobremente a la mucina derivada de leche (Tabla 4).

Tal como se observa en este experimento, varios anticuerpos (M15, M22, M23 y M27) se unen a epítopos resistentes al tratamiento con HF, el cual elimina la mayor parte del carbohidrato procedente del núcleo de la proteína. De acuerdo con ello, los epítopos para estos experimentos son lo más probablemente de naturaleza proteínica.

Los ensayos anteriores revelan que la relación entre los epítopos reconocidos por los anticuerpos de esta invención en base a los análisis de competencia cruzada deben de observarse a la luz de otros tratamientos tales como peryodato, neuraminidasa y desglucosilación. De acuerdo con ellos, los anticuerpos W9 y M8 muestran patrones similares de competencia cruzada (Tabla 6) pero sus epítopos pueden distinguirse en base a sus sensibilidades a los tratamientos con peryodato y con neuraminidasa (Tablas 7 y 8).

Ejemplo VII Ensayo de suero usando anticuerpos adicionales M23, M26, M29 y M38

Se realizó un ensayo DDIA usando los anticuerpos monoclonales Onc-M29 y Onc-M38, y los Onc-M26 y Onc-M38 obtenidos tal como se describió en el Ejemplo II. Igualmente, se realizó un ensayo homólogo con Onc-M23. El ensayo comercial Ca15-3 (Centocor, Malvern, TA) y un ensayo homólogo con el anticuerpo W1 se usaron con fines de comparación. Los ensayos se realizaron usando un panel de sueros que comprendían 72 muestras procedentes de pacientes con cáncer de pecho metastático (M) y 94 muestras procedentes de pacientes con enfermedad de pecho benigna (B) analizados para determinar niveles de antígeno detectados mediante DDIA tal como se ha descrito en el Ejemplo IV, excepto que se usó el anticuerpo Onc-M29 como el anticuerpo de captura con el Onc-M38 como el anticuerpo de detección ("DDIA" M29/M38) y el Onc-M26 se usó como el anticuerpo de captura con el Onc-M38 como el anticuerpo de detección ("DDIA" M26/M38). Los resultados de estos ensayos se compararon con los procedentes del ensayo W1 homólogo y con el ensayo Ca15-3 en el experimiento descrito en la Figura 5. Los ensayos se compararon en términos de su capacidad para discriminar entre los dos grupos de pacientes con valores de corte seleccionados para dar aproximadamente un 90% de especificidad (es decir, para que el 90% del grupo de control ensayado diera negativo).

En la Figura 5, los valores obtenidos se representaron de forma que la mediana del grupo de control para cada ensayo estuviera situada aproximadamente en la décima división de una escala líneal que tenía un total de cien divisiones. Las líneas de puntos indican valores que dieron un 90% de especificidad para cada ensayo. N es el número de muestras ensayadas.

Este análisis mostró que el ensayo con las mejores características con este panel de sueros fue el ensayo heterólogo M29/M38, el cual detectó el 93% de pacientes de cáncer de pecho metastático (es decir, dió un 93% de sensibilidad). En comparación, los ensayos con W1, M23, M26/M38 y Ca15.3 detectaron un 67%, 60%, 60% y 83% de pacientes con cáncer de pecho metastático, respectivamente. De acuerdo con ello, los diferentes ensayos dieron resultados diferentes, mostrando los ensayos con M29/M38 y Ca15.3 mejores características que el ensayo con W1 homólogo, y los ensayos M23 y M26/M38 mostraron una característica igual o peor.

De los quince sueros de pacientes con tumor que resultaron negativos con el ensayo M29/M38, dos muestras resultaron positivas con los ensayos W1, M23 y Ca15.3, y una de estas muestras resultó positiva para el ensayo con M26/M38. De acuerdo con ello, combinando los resultados de M29/M38 con un ensayo adicional, 69/72 (es decir, el 95%) de los sueros de paciente con tumor resultaron positivos.

Igualmente, se realizaron ensayos para evaluar su capacidad para confirmar los resultados obtenidos con el ensayo M29/M38. Un cierto número de pacientes con tumor tenían niveles de antígeno en suero igual o superior al corte usado en la Figura 5, pero dentro del intervalo de control de valores. De acuerdo con ello, la interpretación de estas determinaciones está sujeta a incertidumbres debido al solapamiento con valores determinados para las muestras de control. Por ello, la detección mejorada de estos pacientes incrementaría la utilidad clínica del ensayo M29/M38.

Para este fin, el ensayo más prometedor fue el ensayo M26/M38 (Tabla 10). Un total de 24 de los 72 sueros procedentes de pacientes con cáncer de pecho dieron valores de M29/M38 que fueron positivos, pero por debajo del valor más alto determinado para las muestras de control (\leq35 unidades/ml). De estas 24 muestras, 8 dieron valores de M26/M38 que estaban fuera del intervalo normal (\geq79 unidades/ml). Tres de estas muestras dieron niveles de M26/M38 que fueron más de tres veces el valor más alto detectado para el grupo de control. Por el contrario, las muestras de suero 0/24, 0/24 y 3/24 tenían niveles fuera del intervalo normal para los ensayos con W1, M23 y CA15.3; en todos los casos, los aumentos para el último ensayo fueron menor de dos veces. De acuerdo con ello, aunque el ensayo con M26/M38 detecta menos positivos que con los otros ensayos, los niveles obtenidos son suficientemente elevados como para que este ensayo pueda usarse para identificar de manera positiva pacientes con cáncer que no muestran valores fuertemente elevados con otros ensayos.

TABLA 10 Niveles de epítopo detectado mediante diferentes ensayos en sueros procedentes de pacientes con carcinoma de pecho metastático

14

Ejemplo VIII Especificidad del anticuerpo Onc-M38

Para demostrar adicionalmente la especificidad del anticuerpo monoclonal Onc-M38 de la presente invención, se realizaron ensayos inmunohistológicos usando tejidos humanos con cáncer y normales tal como se describe por Hellstron y otros, en Cancer Research, vol. 46, págs. 3917-3923, (1986), el cual se incorpora aquí como referencia.

Se obtuvieron carcinomas de pecho, pulmón (carcinomas de pulmón de células no pequeñas (NSCLC)) y de colon, y muestras de diferentes tejidos normales de los departamentos de cirujía del Swedish Hospital Medical Center, del Virginia Mason Hospital y del Harborview Hospital, de Seattle, WA, bien procedentes de biópsias extraídas quirúrgicamente, o bien en forma de efusiones pleurales.

Inmediatamente después de la extracción de los pacientes, las muestras de tejido con tumor y normales se congelaron en nitrógeno líquido, después de lo cual, se almacenaron a -70ºC o en nitrógeno líquido hasta su uso.

Se prepararon secciones congeladas, de aproximadamente 5 \mum a 6 \mum de espesor, y se secaron al aire durante un tiempo mínimo de dos horas. Después de tratamiento con acetona a -20ºC durante diez minutos, se secaron rápidamente con un chorro de aire. Las secciones a usar para teñido inmunohistológico se preincubaron durante 30 minutos con suero humano normal diluido 1:5 en PBS. Se prepararon secciones congeladas paralelas y se tiñeron con hematoxilina:eosina para evaluación histológica. Para un conjunto de experimentos se prepararon secciones de parafina procedentes de tejidos que habían sido fijados en solución de Carnoy inmediatamente después de la extracción de los pacientes, embebidas en parafina, y seccionadas; estas secciones se tiñeron de manera similar a las secciones congeladas.

El teñido inmunohistológico se realizó usando la técnica PAP de Sternberger (véase Immunocytochemistry, págs. 104-169, New york, John Wiley & Sons, (1979)), modificada por Garrigues y otros, Int. J. Cancer, vol. 29, págs. 511-515, (1982) y Hellstrom y otros, J. Immulon., vol. 130, págs. 1467-1472, (1983), todos los cuales se incorporan aquí como referencias. Se diluyó Onc-M38, inmunoglobulina anti-ratón de conejo, y PAP de ratón (Sternberger Meyer Cytoimmunochemicals, Inc., Jarrettsville, MD) en una solución de suero de ratón normal al 10% y suero de conejo al 3% en PBS. El procedimiento de teñido consistió en las etapas siguientes: (a) tratamiento durante una hora de las secciones bien con sobrenadante específico o bien con anticuerpo de control (p. ej., proteína de mieloma (p117) diluida 1:2 en la mezcla de suero anterior); (b) aplicación de la inmunoglobulina anti-ratón de conejo diluida 1:30; y (c) exposición al complejo PAP de ratón diluido 1:80. Todos los anticuerpos se incubaron con las secciones durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después del tratamiento con anticuerpo, los portaobjetos se lavaron ligeramente con una corriente de PBS y, a continuación, se lavaron dos veces en PBS.

La reacción inmunoquímica se desarrolló durante la adición de tetraclorohidrato de 3,3'-diaminobencidina al 0,05% recién preparada y peróxido de hidrógeno al 0,01% en tampón Tris 0,05 M, pH 7,6, durante 8 minutos. Después de exposición a una solución de OsO_{4} al 1% durante 15 minutos, se intensificó el producto de reacción. Las secciones se lavaron ligeramente con agua, se pasaron a través de concentraciones crecientes de alcohol, seguido de sileno, y se montaron con cubreportaobjetos.

Todos los portaobjetos fueron leídos por el mismo investigador que no conocía su procedencia. El grado de teñido de las células con tumor (o normales) se cuantificó desde "+" (muy débil) a "4+" (muy fuerte). Un teñido de "2+" o más se consideró como "positivo" y un teñido de "+" o menor se consideró como "negativo".

La Tabla 11 resume los datos inmunohistológicos usando tejidos de tumores y normales. Tal como se muestra en la tabla, el Onc-M38 se unió al menos al 50% de las muestras de tejidos con tumor estudiadas (con una intensidad al menos de 2+) pero no se unió a ninguno de los tejidos normales.

TABLA 11 Inmunohistología de secciones de tejidos congelados

	Unión de anticuerpo^{1}
Tejidos con cáncer
Cáncer de pecho	6/11
Cáncer de pulmón	2/4
Cáncer de colon	3/3
Tejidos normales
Bazo	0/3
Riñón	0/7
Hígado	0/4
Gránulo de linfocito	0/3
Piel	0/3
Cerebro	0/3
Colon	0/1
Pecho	0/1
Tiroide	0/1
1: Unión de anticuerpo al tipo de tejido indicado como el número de tumores positivos
(2+ o más)/número total de tumores ensayados.

Los datos mostrados en la Tabla 11 demuestran que el Onc-M38 reconoce antígenos de superfices de células relativamente específicos de tumores sobre varios carcinomas. Puesto que la localización selectiva del anticuerpo monoclonal para el tumor se requiere para la terapia, la capacidad del Onc-M38 para unirse a más de un tipo de tejido con tumor sugiere la utilidad de este anticuerpo para la terapia de tumores, solo o con otros anticuerpos monoclonales de la presente invención.

Ejemplo IX Ensayo para detectar enfermedad de pecho maligna usando anticuerpos monoclonales M26, M29 y M38

La capacidad de los anticuerpos monoclonales de mucina de la presente invención para detectar epítopos de mucina asociados con tejido de pulmón enfermo se demostró mediante el uso de muestras broncoscópicas y de sueros obtenidos a partir de sujetos humanos tal como se indica a continuación.

Se obtuvieron cauterizaciones bronquiales durante el exámen broncoscópico de 27 sujetos con molestias relacionadas con los pulmones a través del Dr. Steve Springmeyer, Virginia Mason Hospital, Seattle, Washington, a lo largo de un periodo de seis meses en 1987. Las cauterizaciones se tomaron del pulmón izquierdo y derecho de cada paciente de acuerdo con procedimientos broncoscópicos estándar y se analizaron usando procedimientos histológicos estándar. Los resultados del examen broncoscópico y los ensayos histológicos conjuntamente con información adicional que incluía rayos X del tórax, y escaner CT, se usaron para separar los sujetos en tres grupos: 17 individuos benignos (no probaron tener enfermedad de pecho maligna), 7 individuos con carcinoma de pecho de célula no pequeña (NSCLC), y 3 pacientes con otros cánceres (SCLC, carcinoma de próstata y carcinoma de colon). Este último grupo no se debatió posteriormente.

Se realizó un ensayo DDIA para comparar con los resultados histológicos usando los anticueros monoclonales Onc-M29 y Onc-M38, y Onc-M26 y Onc-M38 para detectar niveles de antígeno de mucina tal como se ha descrito en los Ejemplos II y VII. Cada muestra de cauterización de broncoscopia se colocó en 0,5 ml de solución salina de PBS y se almacenó congelada a -70ºC hasta su uso. A continuación, la muestra se descongeló a temperatura ambiente y se microcentrifugó durante 10 minutos a 4ºC. A continuación, cada muestra se diluyó en una relación de 1:11 (50 \mul de muestra y 500 \mul de diluyente de muestra). Además de las muestras bronquiales, se realizó tambien un ensayo DDIA sobre suero sanguíneo extraído de cada sujeto.

Los niveles de epítopo detectados por el ensayo DDIA se presentan en la Tabla 12 para las cauterizaciones bronquiales y los sueros procedentes de los sujetos indicados como benignos y que tienen NSCLC en base al exámen broncoscópico y a los ensayos histológicos.

TABLA 12 Niveles de epítopo detectados por el ensayo DDIA en muestras bronquiales y sueros procedentes de sujetos normales y sospechosos de enfermedad de pulmón

\vskip1.000000\baselineskip

15

Tal como puede observarse en la Tabla 12, para los 17 individuos no probados mediante exámen histológico que tenían malignidad, el DDIA M26/M38 sobre cauterizaciones bronquiales procedentes de ambos pulmones indicaron niveles de epítopos de 100 unidades/ml o menores. El DDIA M29/M38 mostró 6 unidades/ml o menos. Para los siete individuos diagnosticados con NSCLC, el DDIA M26/M38 detectó cuatro pacientes que tenían niveles significativamente elevados de epítopo en el pulmón implicado; el DDIA M29/M38 que indicaba tres sujetos con malignidad de pulmón tenían niveles de epítopo elevados en el pulmón implicado. En dos pacientes (Nos. 21 y 22), los niveles de M26/M38 en el pulmóm no implicado fueron elevados.

Estos resultados sugieren que un porcentaje significativo de pacientes a los que se realizaron procedimientos de diagnóstico precoz para sospechosos de cáncer de pulmón tenían niveles elevados de marcadores de epítopos de mucina detectados por los anticuerpos de la presente invención. De acuerdo con ello, el ensayo usando estos anticuerpos demuestra ser útil para la detección precoz de carcinoma de pulmón y otros carcinomas metastáticos de los pulmones que pueden escapar a la detección mediante procedimientos histológicos.

Con respecto a los resultados para los sueros, los niveles de epítopo para sujetos benignos fueron de 54 unidades/ml o menos en el ensayo DDIA M26/M38 y de 43 unidades/ml o menos en el ensayo M29/M38. Para los siete individuos diagnosticados con NSCLC, el ensayo M26/M38 mostró niveles de antígeno elevados en tres sujetos y el ensayo M29/M38 mostró también niveles de antígeno elevados para tres sujetos. De acuerdo con ello, una proporción relativamente elevada de sujetos con cáncer de pulmón tenía niveles elevados de estos antígenos en sus sueros, lo que sugiere que los antígenos de esta invención pueden ser útiles para la detección precoz de cáncer de pulmón usando dichos ensayos de suero.

Además de la detección de los epítopos de mucina asocidos con cáncer de pulmón en cauterizaciones bronquiales, pueden ensayarse otras muestras con ensayos que usan los anticuerpos monoclonales de la invención y otros anticuerpos frente a epítopos de mucina. Por ejemplo, las muestras de lavados bronquiales y de esputos expectorados pueden diluirse y ensayarse de manera similar en un ensayo.

Los nuevos epítopos identificados en la presente invención pueden servir como marcadores de tumores para la detección de tumores en pacientes. Además, los nuevos epítopos de los antígenos de mucina asociados con tumor purificados aquí descritos e inmunológicamente reactivos con los nuevos anticuerpos monoclonales, pueden promover el desarrollo de anticuerpos monoclonales más sensibles para inmunoensayos mejorados. En particular, los anticuerpos monoclonales erigidos frente al antígeno de mucina asociado con tumor usando mucina purificada (Onc-M8, Onc-M26, Onc-M29, Onc-M30 y Onc-M38) prueban ser útiles en la detección precoz del cáncer y para la implementación de tratamientos contra el cáncer. Los anticuepos Onc-M26 y Onc-M38 parecen mostrar mayor especificidad para epítopos en antígeno de mucina derivado de fuentes de tumores que el antígeno de mucina derivado de fuentes normales. El antígeno de mucina asociado con tumor puede detectarse en muestras de suero sanguíneo u otros fluidos corporales, tal como esputo, efusión pleural y leche, usando inmunoensayos que usan el anticuerpo monoclonal Onc-M26 o el M38 solos o en combinación con cualquiera de los otros anticuerpos monoclonales aquí descritos, con anticuerpos monoclonales adicionales desarrollados usando antígeno de mucina purificada como el inmunógeno, así como con anticuerpos previamente conocidos tal como los anticuerpos W1 o W9. Los anticuerpos de esta invención pueden usarse en procedimientos histológicos para detectar la presencia de antígeno de mucina asociado con tumor en células procedentes de un mamífero, así como para detectar mucina presente en muestras de fluido tal como suero. Repitiendo estos procedimientos histológicos a lo largo del tiempo, el progreso del cáncer en un paciente puede ser controlado. Por ejemplo, los anticuerpos aquí descritos pueden ensayarse para determinar la unión a células de epitelio de pecho obtenido a partir de un paciente para detectar la presencia de antígeno de mucina asociado con tumor que indica que las células de cáncer pueden estar presentes.

El anticuerpo monoclonal Onc-M26, así como los otros nuevos anticuerpos aquí descritos, pueden ensamblarse solos, o bien pueden usarse dos o más de los anticuerpos en combinación, en juegos de ensayo de diagnóstico con instrucciones adecuadas, para determinar la presencia de antígenos de mucina asociados con tumor en suero u otras muestras biológicas. Por ejemplo, un juego para la realización de un ensayo DDIA que usa los anticuerpos Onc-M26 y Onc-M29 puede contener un soporte sólido, por ejemplo, un soporte de placas de microcavidades (Nunc, Newbury Park, CA) con sellantes, conteniendo de una a ocho tiras con cavidades múltiples. Las tiras tienen el anticuerpo monoclonal recubierto sobre cada cavidad. Igualmente, en el juego se incluyen reactivos de ensayos tales como estándares que contienen antígeno humano, por ejemplo, antígeno procedente de efusión pleural de cáncer de pecho, diluido en una solución adecuada. Los estándares pueden estar formados por concentraciones variables de antígeno, por ejemplo, para Onc-M29 un primer estándar puede estar formado por cuatro unidades de antígeno M29/ml y un segundo estándar de 10 unidades/ml. Para el Onc-M26 un primer estándar puede estar formado por 30 unidades de antígeno M26/ml y un segundo estándar de 75 unidades/ml. Se proporcionan controles que pueden estar formados por antígeno humano diluido en el suero humano normal (solución al 10% de antígeno M26 y solución al 11% de antígeno M29) con los agentes antimicrobianos.

En algunos casos, si una muestra contiene antígenos a niveles superiores a 825 unidades/ml para M26 y a 110 unidades/ml para M29 (superiores al estándar más alto) en la realización de un ensayo inicial, la muestra puede diluirse adicionalmente con una proporción apropiada del diluyente de muestra. La dilución puede realizarse de la forma siguiente:

1:1 = 50 \mul de muestra de ensayo = 500 \mul de diluyente de muestra;

1:55 = 50 \mul de dilución 1:11 + 200 \mul de diluyente de muestra;

1:275 = 50 \mul de dilución 1:55 + 200 \mul de diluyente de muestra.

Igualmente, en el juego se incluye anticuerpo conjugado. Por ejemplo, el anticuerpo conjugado con la enzima HRP se suministra en un envase separado que contiene el diluyente adecuado. El sustrato de enzima, por ejemplo, si el marcador de enzima es HRP, incluye peróxido de hidrógeno tamponado con citrato y 3,3',5'-tetrametilbencidina en sulfóxido de dimetilo (cromógeno TMB), en un envase separado en el juego para uso en la detección del anticuerpo conjugado unido. El diluyente de la muestra y un reactivo de terminación de la reacción, tal como ácido sulfúrico 1M, pueden ser los componentes adicionales del juego. Igualmente, puede proporcionarse una solución de lavado (p. ej., 10 x PBS). La solución de lavado y el reactivo de terminación se almacenan a temperatura ambiente. El resto de los reactivos se mantienen, preferiblemente, a 4ºC, pero se llevan a temperatura ambiente para su uso. Es preferible que los estándares y los controles se realizen por duplicado.

Para inmunoterapia, cualquier anticuerpo seleccionado entre los descritos en la presente invención puede acoplarse a un radionúclido u otro marcador detectable e introducirse dentro del cuerpo de un mamífero para obtener imágenes de células de cáncer o para realizar la radioterapia. De acuerdo con ello, el anticuerpo elegido puede acoplarse a un radionúclido o a un mediacamento antitumor e introducirse dentro de un mamífero usando cualquier procedimiento adecuado de introducción, incluyendo la inyección intravenosa, para suministrar el radionúclido o el medicamento a los tejidos con tumor que contienen antígeno reactivo con el anticuerpo. El marcador detectable puede seleccionarse entre fluoróforos, enzimas, cromóforos, coenzimas, materiales quimioluminiscentes, inhibidores de enzima, metales paramagnéticos tal como gadolíneo, y radionúclidos que son conocidos en la técnica.

Aunque la presente invención ha sido descrita conjuntamente con las realizaciones preferidas, un experto en la materia, después de leer esta memoria descriptiva estará en condiciones de efectuar diversos cambios, sustituciones de equivalentes, y alteraciones a las composiciones y procedimientos aquí establecidos.

Claims (36)

1. Un procedimiento para la preparación de una célula de hibridoma, que comprende el proporcionar una célula de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal, caracterizado porque la unión inmunológica a un antígeno de mucina está seleccionado entre el grupo formado por los ATCC Nos.: HB 9248; HB 9212; HB 9210; y HB 9365 con su antígeno diana.

2. Un procedimiento para la preparación de un anticuerpo monoclonal, que comprende el cultivo de una línea de células de hibridoma de la reivindicación 1, y la recolección del anticuerpo procedente del medio de cultivo.

3. Un procedimiento para la preparación de un juego de ensayo útil para ensayar la presencia de cáncer, que comprende el proporcionar, al menos, un anticuerpo monoclonal producido por una línea de células de hibridoma seleccionada entre el grupo formado por los ATCC Nos.: HB 9209; HB 9244; HB 9245; HB 9246; HB 9247; HB 9216; HB 9248; HB 9249; HB 9250; HB 9217; HB 9212; HB 9210; HB 9211; y HB 9365.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, que comprende además el proporcionar los reactivos de ensayo y un soporte sólido para realizar la unión antígeno-anticuerpo.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicho anticuerpo se adhiere al soporte sólido para capturar el antígeno de una muestra.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, que comprende además el proporcionar un segundo anticuerpo para detectar el antígeno unido a dicho anticuerpo adherido.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que dicho segundo anticuerpo es un anticuerpo monoclonal producido por una línea de células de hibridoma seleccionada entre el grupo formado por los ATCC Nos.: HB 9209; HB 9244; HB 9245; HB 9246; HB 9247; HB 9216; HB 9248; HB 9249; HB 9250; HB 9217; HB 9212; HB 9210; HB 9211; y HB 9365.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el segundo anticuerpo monoclonal de detección está acoplado a un marcador detectable.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el marcador detectable está seleccionado entre el grupo formado por enzimas, cromóforos, fluoróforos, coenzimas, materiales quimioluminiscentes, inhibidores de enzima, metales paramagnéticos y radionúclidos.

10. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el anticuerpo monoclonal está acoplado a un marcador detectable seleccionado entre el grupo formado por enzimas, cromóforos, fluoróforos, coenzimas, materiales quimioluminiscentes, inhibidores de enzima, metales paramagnéticos y radionúclidos.

11. Un procedimiento para la detección de cáncer mediante la determinación de la presencia de antígeno de mucina presente en una muestra procedente de un mamífero, en el que el anticuerpo monoclonal de la reivindicación 2 se usa para reaccionar con antígeno de mucina presente en la muestra.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que dicha muestra es un fluido biológico seleccionado entre el grupo formado por sangre, suero, plasma, esputo, efusión pleural, leche, cauterizaciones bronquiales y lavado bronquial.

13. Un procedimiento para la detección de cáncer mediante la determinación de la presencia de antígeno de mucina presente en una muestra procedente de mamífero, que comprende:

(a) poner en contacto una muestra procedente de mamífero con un anticuerpo de captura, producido por una línea de células de hibridoma seleccionada entre el grupo formado por los ATCC Nos.: HB 9248; HB 9210; HB 9212; y HB 9365, estando dicho anticuerpo adherido a un sustrato, para unir cualquier anticuerpo de mucina presente en el fluido corporal para capturar el anticuerpo;

(b) la adición de un anticuerpo de detección producido por una línea de células de hibridoma seleccionada entre el grupo formado por los ATCC Nos.: HB 9209; HB 9244; HB 9245; HB 9246; HB 9247; HB 9216; HB 9248; HB 9249; HB 9250; HB 9217; HB 9212; HB 9210; HB 9211; y HB 9365, a dicho sustrato para reaccionar con cualquier antígeno de mucina unido a dicho anticuerpo de captura; y

(c) la detección de dicho anticuerpo de detección,unido.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicho antígeno de mucina está asociado a un tumor.

15. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicho anticuerpo monoclonal está acoplado a un marcador detectable.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que el anticuerpo monoclonal está acoplado a un marcador detectable seleccionado entre el grupo formado por enzimas, cromóforos, fluoróforos, coenzimas, materiales quimioluminiscentes, inhibidores de enzima, metales paramagnéticos y radionúclidos.

17. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicha muestra es un muestra biológica seleccionada entre el grupo formado por sangre, suero, plasma, esputo, efusión pleural, leche, cauterizaciones bronquiales y lavado bronquial.

18. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicha muestra comprende material celular.

19. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicha etapa de detección comprende el uso de un inmunoensayo de enzima indirecto.

20. Un procedimiento para la diferenciación entre tejido humano normal y anormal que comprende el contacto de una muestra que contiene material celular procedente de un humano con dos o más de los anticuerpos monoclonales producidos por la línea de células de hibridoma de la reivindicación 1, mediante el cual puede detectarse la presencia de anormalidad en el humano.

21. El procedimiento de la reivindicación 20, en el que dicho tejido humano es tejido epitelial de pecho.

22. El procedimiento de la reivindicación 20, en el que dicho tejido humano es tejido de pulmón.

23. Un procedimiento para la detección de antígeno de mucina asociado a un tumor en un paciente, que comprende poner en contacto de una muestra que contiene material celular procedente de un paciente con dos o más de los anticuerpos monoclonales producidos por la línea de células de hibridoma de la reivindicación 1, con lo cual puede detectarse la presencia de tumores en el paciente.

24. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que dicha muestra es un muestra biológica seleccionada entre el grupo formado por sangre, suero, plasma, esputo, efusión pleural y leche.

25. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que dicha muestra son células epiteliales de pecho.

26. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que dicha muestra está seleccionada entre el grupo formado por cauterizaciones bronquiales, muestras de lavado y esputo espectorado.

27. Un procedimiento para la preparación de un juego de ensayo para ensayar la presencia de cáncer, cuyo procedimiento comprende el proporcionar un primer anticuerpo monoclonal producido por la línea de células de hibridoma HB 9212 y un segundo anticuerpo monoclonal producido por la línea de células de hibridoma HB 9365.

28. Un procedimiento para la preparación de un juego de ensayo para ensayar la presencia de cáncer, cuyo procedimiento comprende el proporcionar un primer anticuerpo monoclonal producido por la línea de células de hibridoma HB 9210 y un segundo anticuerpo monoclonal producido por la línea de células de hibridoma HB 9365.

29. Un procedimiento para la preparación de un juego de ensayo para ensayar la presencia de cáncer, cuyo procedimiento comprende el proporcionar un primer anticuerpo monoclonal producido por la línea de células de hibridoma HB 9212, un segundo anticuerpo monoclonal producido por la línea de células de hibridoma HB 9210 y un tercer anticuerpo monoclonal producido por la línea de células de hibridoma HB 9365.

30. El procedimiento de la reivindicación 27, 28 ó 29, el cual comprende además el proporcionar reactivos de ensayo y un soporte sólido para la realización de la unión antígeno-anticuerpo.

31. Un procedimiento para la detección de carcinoma de pulmón y carcinomas metastáticos de pulmón, que comprende la reacción de una muestra seleccionada entre el grupo formado por cauterizaciones bronquiales, fluido de lavado y esputo expectorado, con al menos un anticuerpo monoclonal producido por la línea de células de hibridoma seleccionada entre el grupo formado por los ATCC Nos.: HB 9209; HB 9244; HB 9245; HB 9246; HB 9247; HB 9216; HB 9248; HB 9249; HB 9250; HB 9217; HB 9212; HB 9210; HB 9211; y HB 9365.

32. El procedimiento de la reivindicación 31, en el que dicha muestra reacciona con el primer anticuerpo producido por la línea de células de hibridoma HB 9212 y un segundo anticuerpo producido por la línea de células de hibridoma HB 9365.

33. El procedimiento de la reivindicación 31, en el que dicha muestra reacciona con el primer anticuerpo producido por la línea de células de hibridoma HB 9210 y un segundo anticuerpo producido por la línea de células de hibridoma HB 9365.

34. Un procedimiento para la diferenciación entre células humanas normales y con tumor que comprende poner en contacto una muestra que contiene material celular procedente de un humano, con al menos dos anticuerpos monoclonales diferentes producidos por las líneas de células de hibridoma de la reivindicación 1, y la detección de la presencia o ausencia de formación de complejo inmune con dichos anticuerpos, lo cual indica la presencia o la ausencia de células de tumor en dicha muestra.

35. El procedimiento de la reivindicación 34, en el que dicho material celular humano son células epiteliales de pecho.

36. El procedimiento de la reivindicación 34, en el que una de las líneas de células de hibridoma es la ATCC Nº. HB 9212.