ES2269105T3 - Metodos y composiciones para el diagnostico de carcinomas. - Google Patents

Abstract

Método de cribado para detectar la presencia de un cuadro clínico maligno en un sujeto, que comprende: poner en contacto una muestra biológica de un sujeto con por lo menos un anticuerpo específico de polipéptido antígeno afín a la mesotelina, inclusive SEQ ID NO: 5 para determinar la presencia en dicha muestra biológica de una molécula que se presenta de modo natural en forma soluble en dicha muestra y tiene un determinante antigénico reactivo con el, por lo menos uno, anticuerpo mencionado, en condiciones y durante un período de tiempo suficiente para detectar la fijación de dicho anticuerpo en el mencionado determinante antigénico, y a partir de ahí, detectar la presencia de un cuadro clínico maligno.

Description

Métodos y composiciones para el diagnóstico de carcinomas.

La presente invención se refiere en general a cuadros clínicos malignos, como cáncer y, en particular, a métodos y composiciones para diagnosticar ciertos carcinomas como el carcinoma de ovario.

El cáncer comprende una amplia gama de patologías, que afectan aproximadamente a una de cada cuatro personas en el mundo. La gravedad del impacto negativo del cáncer no se puede subestimar ya que su influencia se puede observar tanto en la política como en los conocimientos médicos, como en la sociedad en general. Debido a que una de las características de muchos tipos de cáncer es la proliferación rápida y no regulada de células malignas, uno de los problemas principales para mejorar los métodos de acercamiento al cáncer es la necesidad de una detección y un diagnóstico prematuro. Se han realizado varios intentos tendentes a desarrollar unos criterios precisos y fiables para diagnosticar la presencia de un cuadro clínico maligno. En particular, los esfuerzos se han centrado en la utilización de marcadores antigénicos serológicamente definidos, conocidos como antígenos asociados a un tumor que constituyen la expresión exclusiva de células cancerígenas o que se encuentran presentes en niveles notablemente elevados en sujetos con un cuadro clínico maligno.

No obstante, debido a la elevada heterogeneidad de la expresión del antígeno asociado a un tumor, por ejemplo la extrema diversidad de los antígenos de carcinoma, se necesitan marcadores tumorales adicionales, que resultan útiles en el diagnóstico del cáncer. Se conocen muchos anticuerpos monoclonales que reaccionan con antígenos asociados a carcinoma (véase por ejemplo Papsidero, 1985, Semin. Surg. Oncol. 1:171, Allum et al., 1986 Surg. Ann. 18:41). Estos y otros anticuerpos monoclonales descritos se fijan en una variedad de antígenos asociados a carcinomas diferentes, inclusive glicoproteínas, glicolípidos y mucinas (véase p. ej. Fink et al., 1984 Prog. Clin. Pathol. 9:121; patentes US 4.737.579; US 4.753.894; US 4.579.827; US 4.713.352). Muchos de estos anticuerpos monoclonales reconocen antígenos asociados a un tumor, que presentan una expresión restringida en algunos tumores pero no en otros, como consecuencia de cierto linaje celular o tipo de tejido.

Solo existen unos pocos ejemplos de antígenos asociados a un tumor que parecen resultar útiles para identificar un tipo particular de estado maligno. El anticuerpo monoclonal B72.3, por ejemplo, se fija específicamente en un antígeno de mucina asociado a un tumor de elevada masa molecular (>10^{6} Da), que se expresa selectivamente en un número de carcinomas diferentes, inclusive la mayoría sino todos los carcinomas de ovario y una gran mayoría de carcinomas pulmonares microcíticos, carcinomas de colon y de mama (véase por ejemplo Johnston, 1987 Acta Cytol. 1:537; US 4.612.282). No obstante, la detección de marcadores tumorales asociados a una célula como el antígeno de mucina reconocido por B72.3 tras la resección quirúrgica de un tumor puede ser de utilidad limitada para el cribado diagnóstico, en el que se prefiere la detección de un cuadro clínico maligno antes de que se produzca la acumulación de una masa tumoral sustancial.

Una alternativa al diagnóstico de un tipo molecular de cáncer mediante cribado de muestras quirúrgicamente extirpadas para detectar antígenos asociados a tumores, donde la cirugía invasiva suele estar indicada únicamente cuando se ha detectado una masa tumoral acumulada, consistiría en ofrecer composiciones y métodos para detectar dichos antígenos en muestras obtenidas de sujetos por medio de procedimientos no invasivos o mínimamente invasivos. En los carcinomas de ovario y otros carcinomas, por ejemplo, suele haber cierto número de antígenos solubles asociados a un tumor, detectables en muestras de fluidos biológicos obtenidos con facilidades como suero o secreciones mucosales. Uno de estos marcadores es CA 125, un antígeno asociado a carcinoma que se vierte también en el flujo sanguíneo, donde se puede detectar en el suero (por ejemplo Bast et al., 1983 N. Eng. J. Med. 309:883; Lloyd et al., 1997 Int. J. Canc. 71:842). Los niveles de CA 125 en el suero y otros fluidos biológicos se han medido junto con niveles de otros marcadores, por ejemplo antígeno carcino embriónico (CEA), antígeno de carcinoma celular escamoso (SCC), antígeno específico de polipéptido hístico (TPS), sialil TN mucina (STN) y fosfatasa alcalina placental (PLAP), en un esfuerzo para proporcionar perfiles diagnósticos y/o de pronostico de carcinomas de ovario y otros (por ejemplo Sarandakou et al., 1997 Acta Oncol. 36:755; Sarandakou et al., 1998 eur. J. Gynaecol. Oncol. 19:73; Meier et al., 1997 Anticanc Res. 17(4B): 2945; Kudok et al., 1999 Gynecol. Obstet. Gynaecol. 1904:1024; Bell et al., 1998 Br. J. Obstet. Gynaecol. 105:1136; Cioffi et al., 1997 Tumori 83:594, Meier et al., 1997 Anticanc. Res. 17(4B):2949; Meier et al., 1997 Anticanc. Res. 17(4B):3019.

Unos niveles elevados de suero CA125, solo o en combinación con otros indicadores conocidos, no proporcionan sin embargo un diagnóstico definitivo del carácter maligno o de un carácter maligno particular como el carcinoma de ovario. Por ejemplo, unos CA 125, CEA y SCC elevados en el fluido vaginal y el suero están relacionados por lo general con una inflamación en enfermedades ginecológicas benignas, relativas a cáncer cervical y cánceres del tracto genital (por ejemplo Moore et al., 1998 Infect. Dis Obstet. Gynecol. 6:182; Sarandakou et al., 1997 Acta Oncol. 36:755). Otro ejemplo más. Un CA 125 elevado en el suero puede acompañar también un neuroblastoma (por ejemplo Hirokawa et al., 1998 Surg. Today 28:349), mientras que unos CEA y SCC elevados, entre otros, pueden acompañar el cáncer colorectal (Gebauer et al., 1997 Anticanc. Res. 17(4B):2939). Se puede apreciar por consiguiente la necesidad imperiosa de utilización de marcadores adicionales, inclusive marcadores útiles en el cribado de diagnóstico por factores múltiples (véase por ejemplo Sarandakou et al., 1998; Kudok et al., 1999; Ind et al., 1997).

La mesotelina del antígeno de diferenciación se expresa en las superficies de células mesoteliales normales y también en ciertas células cancerosas, inclusive tumores epiteliales del ovario y mesoteliomas. También conocida como CAK1, la mesotelina se identifica por su reactividad con el anticuerpo monoclonal K-1 (MAb K-1), que se generó tras la inmunización con la línea celular de carcinoma de ovario OVCAR-3 (Chang et al., 1992 Canc. Res. 52:181; Chang et al., 1992 Int. J. Canc. 50:373; Chang et al., 1992 Int. J. Canc. 51:548; Chang et al., 1996 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93:136; Chowdhury et al., 1998 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:669). La mesotelina se sintetiza como un precursor de glicoproteína de aproximadamente 70 kDa, que tiene una zona de unión de glicosil fosfatidil inositol C-terminal (GPI) para la fijación de membrana celular. Este precursor se procesa, inter alia mediante segmentación proteolítica en por lo menos dos componentes: (i) un polipéptido N-terminal \sim31 kDa desprendido (shed) (Chowdhury et al., 1998 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:669) que tiene una homología extraordinariamente elevada con un polipéptido soluble 31 kDa, conocido como factor potenciador de mega cariocito (MPF), derivado de forma similar por proteólisis de un precursor de glico proteína unido a GPI de 70 kDa aproximadamente que pertenece a la familia de polipéptidos de mesotelina (Yamaguchi et al., 1994 J. Biol. Chem. 269-805; Kojima et al., 1995 J. Biol. Chem. 270:21984; y (ii) un polipéptido maduro glicosilado de mesotelina C-terminal fijado a superficie celular unido a GPI de 40 kDa, que lleva el epítopo de reconocimiento K-1 (MAb K-1) (Chang et al., 1996). Según se define por reactividad con MAb k-1, la mesotelina está presente en la mayoría de los carcinomas celulares escamosos, inclusive los tumores de ovario epitelial, cervical y de esófago y en mesoteliomas (Chang et al., 1992 Canc. Res. 52:181; Chang et al., 1992 Int,. J. Canc. 50:373; Chang et al., 1992 Int. J. Canc. 51:548; Chang et al., 1996 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93:136; Chowdhury et al., 1998 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:669). Utilizando MAb K-1, la mesotelina se puede detectar únicamente como marcador de tumor asociado a célula y no se ha encontrado en suero de pacientes de cáncer de ovario o en medio condicionado por células OVCAR-3 (Chang et al., 1992 Int. J. Cáncer 50:373). Por consiguiente, la mesotelina, pese al modelo de expresión que se correlaciona con cuadros clínicos malignos específicos, no parece ofrecer un marcador útil para el cribado diagnóstico temprano, ya que con los métodos conocidos solo se pueden detectar formas asociadas a células y no solubles de mesotelina. Int. J. Canc. 57, 1984, pp. 19-97 (Chang et al., describe la existencia de una proteína citosólica soluble de 39-40 kDa denominada APK1.)

Las composiciones y métodos de la presente invención superan estas limitaciones del estado de la técnica al ofrecer un método de cribado para detectar la presencia de un cuadro clínico maligno utilizando anticuerpos específicos de antígenos afines a mesotelina/MPF y/o mesotelina/MPF para detectar polipéptidos que se presentan de modo natural en forma soluble y ofrecen otras ventajas correspondientes.

La presente invención se centra en composiciones y métodos útiles en el cribado para detectar la presencia de un estado clínico maligno en un sujeto. En particular, la invención se refiere al descubrimiento inesperado de que se pueden detectar en una muestra biológica de un sujeto, polipéptidos de mesotelina solubles o moléculas que se presentan de modo natural en forma soluble y tienen un determinante antigénico que reacciona con por lo menos un anticuerpo específico de un polipéptido de mesotelina.

Uno de los aspectos de la invención es ofrecer un método de cribado para detectar la presencia de un estado clínico maligno en un sujeto, que comprende la puesta en contacto de una muestra biológica de un sujeto con por lo menos un anticuerpo específico de un polipéptido antigénico afín a la mesotelina, que comprende SEQ ID NO: 5, para determinar la presencia en la muestra biológica de una molécula que se presenta de modo natural en forma soluble en la muestra y tiene un determinante antigénico que reacciona con el, por lo menos uno, antígeno, en condiciones y durante un período de tiempo suficiente para detectar la fijación del anticuerpo en el determinante antigénico, y a partir de ahí detectar la presencia de un cuadro clínico maligno. En algunas realizaciones, la muestra biológica es sangre, suero, fluido serosal, plasma, linfa, orina, fluido cerebro espinal, saliva, secreción mucosal, secreción vaginal, fluido de ascitis, fluido pleural, fluido pericardial, fluido peritoneal, fluido abdominal, medio de cultivo, medio de cultivo acondicionado o fluido de lavado.

En otras realizaciones, el polipéptido antigénico afín a la mesotelina comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que aparece en SEQ ID NO: 1 o en SEQ ID NO: 2 o un fragmento o derivado de la misma. En otra realización, la variante de polipéptido antigénico afín a la mesotelina es una variante de unión.

En ciertas realizaciones de la invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo policlonal, y en otras realizaciones el anticuerpo comprende un anticuerpo purificado por afinidad. En realizaciones particularmente preferidas, el anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal. En otras realizaciones, el anticuerpo comprende un anticuerpo recombinante y en otra realización el anticuerpo comprende un anticuerpo híbrido. En otra realización, el anticuerpo comprende un anticuerpo humanizado. En otra realización, el anticuerpo comprende un anticuerpo de una sola cadena.

En algunas realizaciones de la invención, la detección de la fijación del anticuerpo en un determinante antigénico comprende la detección de un radionúclido. En otras realizaciones, la detección de la fijación del anticuerpo en un determinante antigénico comprende la detección de un fluoróforo. En otra realización, la detección de la fijación del anticuerpo en un determinante antigénico, comprende la detección de un evento de fijación entre una molécula de avidina y molécula de biotina y en otra realización, la detección de la fijación del anticuerpo en un determinante antigénico comprende la fijación de un evento de fijación entre una molécula de estreptavidina y una molécula de biotina. En ciertas realizaciones, la detección de la fijación del anticuerpo a un determinante antigénico comprende la detección espectro fotométrica de un producto de una reacción enzimática. En algunas realizaciones de la invención, el, por lo menos uno, anticuerpo está rotulado de forma que se pueda detectar, mientras que en otras realizaciones, el, por lo menos uno, anticuerpo no está rotulado de forma detectable y la detección de la fijación del anticuerpo a un determinante antigénico es indirecta.

Según ciertas realizaciones de la invención, el cuadro clínico maligno puede ser adeno carcinoma, mesotelioma, carcinoma de ovario, carcinoma de páncreas o carcinoma pulmonar amicrocítico.

También se describe un método de cribado para detectar la presencia de un cuadro clínico maligno en un sujeto, que comprende la puesta en contacto de una muestra biológica de un sujeto con por lo menos un anticuerpo para determinar la presencia en la muestra biológica de una molécula que se presenta de modo natural de forma soluble en la muestra y tiene un determinante antigénico que reacciona con el, por lo menos uno, anticuerpo, cuya zona de combinación antigénica inhibe de forma competitiva la fijación inmuno específica de un anticuerpo monoclonal, OV569 MAb K-1, 4H3, 3G3 ó 1A6, en condiciones y durante un período de tiempo suficiente para detectar la fijación del anticuerpo al determinante antigénico, y partir de ahí detectar la presencia de un cuadro clínico maligno.

También se describe un método de cribado para detectar la presencia de un cuadro clínico maligno en un sujeto, que comprende la puesta en contacto de un muestra biológica de un sujeto con por lo menos un anticuerpo para determinar la presencia en la muestra biológica de una molécula que se presenta de modo natural en forma soluble en la muestra y tiene un determinante antigénico que reacciona con el anticuerpo, cuya zona de combinación antigénica inhibe competitivamente la fijación inmuno específica de anticuerpo monoclonal OV569, en condiciones y durante un período de tiempo suficiente para detectar la fijación del anticuerpo al determinante antigénico, y a partir de ahí detectar la presencia de un cuadro clínico maligno.

Otro aspecto más de la invención consiste en ofrecer un método de cribado para detectar la presencia de un cuadro clínico maligno en un sujeto, que comprende la puesta en contacto de una muestra biológica en un sujeto con por lo menos un anticuerpo específico de un polipéptido antigénico afín a la mesotelina humana, que comprende SEQ ID NO: 5, para determinar la presencia en la muestra biológica de una molécula que se presenta de modo natural en forma soluble en la muestra y tiene un determinante antigénico que reacciona con el anticuerpo, en condiciones y durante un período de tiempo suficiente para detectar la fijación de por lo menos un anticuerpo al determinante antigénico, donde el, por lo menos uno, anticuerpo se une de modo inmuno específico al antígeno afín a la mesotelina, y detectar a partir de ahí la presencia de un cuadro clínico maligno. En ciertas realizaciones, el antígeno afín a la mesotelina reacciona también de forma inmuno específica con anticuerpo monoclonal MAb K-1.

Considerando otro aspecto, la descripción presenta un método de cribado para detectar la presencia de un cuadro clínico maligno en un sujeto que comprende la puesta en contacto de una muestra biológica de un sujeto con por lo menos un anticuerpo específico de un polipéptido antigénico afín a la mesotelina humana para determinar la presencia en la muestra biológica de una molécula que se presenta de modo natural en forma soluble en la muestra y tiene un determinante antigénico que reacciona con el, con por lo menos uno, anticuerpo, cuya zona de combinación antigénica inhibe competitivamente la fijación inmunoespecífica de un anticuerpo monoclonal, es decir, OV569, MAb K-1, 4H3, 3G3 ó 1A6, en condiciones y durante un período de tiempo suficiente para detectar la fijación del anticuerpo en el determinante antigénico, donde el, por lo menos uno, anticuerpo se fija de modo inmunoespecífico a un antígeno afín a la mesotelina, y a partir de ahí detectar la presencia de un cuadro clínico maligno. En ciertas realizaciones, el antígeno afín a la mesotelina reacciona también de modo inmuno específico con anticuerpo monoclonal MAb K-1.

Considerando otro aspecto, la invención proporciona un método para el cribado de la presencia de un cuadro clínico maligno en un sujeto, que comprende la puesta en contacto de una muestra biológica de un sujeto con por lo menos un primer anticuerpo inmovilizado específico de un polipéptido antigénico afín a la mesotelina para determinar la presencia en la muestra biológica de una molécula que se presenta de modo natural en forma soluble en la muestra, en condiciones y durante un período de tiempo suficiente para fijar específicamente el, por lo menos uno, primer anticuerpo inmovilizado al polipéptido antigénico afín a la mesotelina y a partir de ahí formar un complejo inmune; eliminación de constituyentes de la muestra que no se fijan específicamente a, por lo menos uno, primer anticuerpo inmovilizado y poner en contacto el complejo inmune con por lo menos un segundo anticuerpo específico de un polipéptido antigénico afín a la mesotelina, donde la zona de combinación antigénica del, por lo menos uno, segundo anticuerpo no inhibe competitivamente la zona de combinación antigénica del, por lo menos uno, primer anticuerpo inmovilizado, en condiciones y durante un período de tiempo suficiente para detectar la fijación específica del, por lo menos uno segundo anticuerpo al polipéptido antigénico afín a la mesotelina y a partir de ahí detectar la presencia de un cuadro clínico maligno.

En otro aspecto más, la descripción ofrece un método para el cribado de la presencia de un cuadro clínico maligno en un sujeto, que comprende la puesta en contacto de una muestra biológica de un sujeto con, por lo menos uno, primer anticuerpo inmovilizado específico de un polipéptido antigénico afín a la mesotelina, para determinar la presencia en la muestra biológica de una molécula que se presenta de modo natural en forma soluble en la muestra, donde la zona que contiene el antígeno del, por lo menos uno, primer anticuerpo inhibe competitivamente la fijación inmunoespecífica de anticuerpo monoclonal OV569 en condiciones y durante un período de tiempo suficiente para fijar específicamente el, por lo menos uno, primer anticuerpo inmovilizado al polipéptido antigénico afín a la mesotelina y formar de este modo un complejo inmune; eliminación de constituyentes de la muestra que no se fija específicamente al, por lo menos uno, primer anticuerpo inmovilizado, y puesta en contacto del complejo inmune con por lo menos un segundo anticuerpo específico de un polipéptido antigénico afín a la mesotelina, donde la zona de combinación del antígeno del, por lo menos uno, segundo anticuerpo, no inhibe competitivamente la fijación inmuno específica de anticuerpo monoclonal OV569, en condiciones y durante un período de tiempo suficiente para detectar la fijación específica del por lo menos uno, segundo anticuerpo al polipéptido antigénico afín a la mesotelina, y a partir de ahí detectar la presencia de un cuadro clínico maligno.

En otro aspecto, la invención presenta un método para el cribado de la presencia de un cuadro clínico maligno en un sujeto, que comprende la puesta en contacto de una muestra biológica de un sujeto con, por lo menos uno, primer anticuerpo inmovilizado específico de un polipéptido antígeno afín a la mesotelina, que comprende SEQ ID NO: 5, para determinar la presencia en la muestra biológica de una molécula que se presenta de modo natural en forma soluble en la muestra, donde la zona de combinación de antígeno del, por lo menos uno, primer anticuerpo inhibe competitivamente la fijación inmuno específica de anticuerpo monoclonal MAb K-1 en condiciones y durante un período de tiempo suficiente para fijar específicamente el, por lo menor uno, prime anticuerpo inmovilizado al polipéptido antigénico afín a la mesotelina, y formar de este modo un complejo inmune; eliminación de constituyentes de la muestra que no se fijan específicamente al, por lo menos uno, primer anticuerpo inmovilizado, y puesta en contacto del complejo inmune con, por lo menos uno, segundo anticuerpo específico de un polipéptido antigénico afín a mesotelina, donde en la zona de combinación de antígeno del, por lo menos uno, segundo anticuerpo no inhibe competitivamente la fijación inmunoespecífica de anticuerpo monoclonal MAb K-1, en condiciones y durante un período de tiempo suficiente para detectar la fijación específica del, por lo menos uno, segundo anticuerpo al polipéptido antigénico afín a la mesotelina, y a partir de ahí detectar la presencia de un cuadro clínico maligno.

En ciertas realizaciones, el método objeto de la invención comprende además la determinación de la presencia, en la muestra, de por lo menos un marcador soluble de un cuadro clínico maligno, donde el marcador es antígeno carcino embriónico, CA125, sialil TN, antígeno de carcinoma celular escamoso, antígeno polipéptido del tejido o fosfatasa alcalina placental.

Otro de los aspectos de la invención es ofrecer un método para el cribado de la presencia de un cuadro clínico maligno en un sujeto, que comprende la puesta en contacto de (i) una primera muestra biológica de un primer sujeto sospecho de presentar un cuadro clínico maligno, y (ii) una segunda muestra biológica de un segundo sujeto que se sabe no presenta ningún cuadro clínico maligno, con por lo menos un anticuerpo específico de un polipéptido antigénico afín a la mesotelina, que comprende SEQ ID NO: 5, para determinar la presencia en la primera y segunda muestras biológicas de una molécula que se presenta en forma soluble en las muestras y tiene un determinante antigénico reactivo con el, por lo menos uno, anticuerpo, en condiciones y durante un período de tiempo suficiente para detectar la fijación del anticuerpo al determinante antigénico y la comparación de un nivel de fijación detectable del anticuerpo al determinante antigénico en la primera muestra biológica con un nivel de fijación detectable del anticuerpo al determinante antigénico en la segunda muestra biológica, detectando a partir de ahí la presencia de un cuadro clínico maligno.

En otro aspecto, la invención ofrece un método para el cribado de la presencia de un cuadro clínico maligno en un sujeto que comprende la detección en una muestra biológica del sujeto de la presencia de un anticuerpo que se fija inmunoespecíficamente a un polipéptido antigénico afín a la mesotelina. En ciertas realizaciones, el polipéptido antigénico afín a la mesotelina comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 13.

Considerando otro aspecto, la invención presenta un anticuerpo específico de un polipéptido antigénico afín a la mesotelina humana que comprende una región variable de inmunoglobulina monoclonal que no inhibe competitivamente la fijación específica de anticuerpo monoclonal MAb K-1 a un polipéptido de mesotelina y que se fija a un polipéptido antigénico afín a la mesotelina, que comprende la secuencia de aminoácidos que aparece en SEQ ID
NO: 1 o en SEQ ID NO: 2 o en SEQ ID NO: 13. En ciertas realizaciones el anticuerpo es una proteína de fusión, mientras que en otras realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo de una sola cadena. En otras realizaciones, el polipéptido antigénico afín a la mesotelina comprende además un polipéptido glicosilado de mesotelina. En otras realizaciones, el polipéptido antigénido afín a la mesotelina tiene un peso molecular aparente de aproximadamente de 42 a 45 kilodaltons. En ciertas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal OV569, 4H3, 3G3 o 1A6.

En otro aspecto más, la invención presenta un método para el cribado de la presencia de un cuadro clínico maligno en un sujeto, que comprende la puesta en contacto de una muestra biológica de un sujeto con un polipéptido antigénico afín a la mesotelina, rotulado de forma detectable, que comprende SEQ ID NO: 5, en condiciones y durante un período de tiempo suficiente para detectar la fijación al polipéptido antigénico afín a la mesotelina de un anticuerpo que se presenta de modo natural en forma soluble en la muestra, y detectar a partir de ahí la presencia de un cuadro clínico maligno.

Volviendo a otro aspecto, la invención presenta una molécula de ácido nucleico aislada, que es una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido antigénico afín a la mesotelina, polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que aparecen en SEQ ID NO: 1 o EN SEQ ID NO: 2 o en SEQ ID NO: 13; o es una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido antigénico afín a la mesotelina y que es capaz de hibridar con una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno afín a la mesotelina en condiciones moderadamente rigurosas, donde la molécula de ácido nucleico aislada no es una molécula de ácido nucleico constituida por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 15, la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 16, la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 17 o la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 18. En ciertas realizaciones, la invención presenta un oligonucleótido antisentido que comprende por lo menos 15 nucleótidos consecutivos complementarios de la molécula de ácido, nucleico que codifica un polipéptido antigénico afín a la mesotelina.

En otras realizaciones, la presente invención ofrece una proteína de fusión que comprende una secuencia de polipéptidos condensada con un polipéptido antigénico afín a la mesotelina. En otras realizaciones, más, el polipéptido es una enzima o un variante o fragmento de al misma. En ciertas realizaciones ulteriores, la secuencia de polipéptidos condensados a un polipéptido antigénico afín a la mesotelina se puede fragmentar mediante una proteasa. En otra realización, la secuencia de polipéptidos es un polipéptido de marca (tag) por afinidad que tiene afinidad por un ligando.

En otras realizaciones, la invención presenta un constructo de expresión recombinante que comprende por lo menos un promotor operativamente unido a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido antigénico afín a la mesotelina según se ha descrito anteriormente. En ciertas realizaciones, el promotor es un promotor regulado y en otras realizaciones el polipéptido antigénico afín a la mesotelina se expresa como una proteína de fusión, con un producto polipeptídico de una segunda secuencia de ácidos nucleicos. En otra realización, el constructo de expresión es un constructo de expresión viral recombinante. Según otras realizaciones, la invención presenta una célula huésped que comprende un constructo de expresión recombinante según lo indicado aquí. En una realización la célula huésped es una célula procariota y en otra realización la célula huésped es una célula eucariota.

En otro aspecto, la invención presenta un método para la producción de un polipéptido antigénico afín a la mesotelina recombinante, cultivando una célula huésped que comprende un constructo de expresión recombinante que comprende por lo menos un promotor operativamente unido a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido antigénico afín a la mesotelina tal como se presenta aquí. En ciertas realizaciones, el promotor es un promotor regulado, en otras realizaciones, la invención presenta un método para producir un polipéptido antigénico afín a la mesotelina recombinante, cultivando una célula huésped infectada con el constructo de expresión viral recombinante, tal como se presenta aquí, para la expresión de un polipéptido antigénico afín a la mesotelina recombinante.

La presente invención también comprende, en otra realización, un método para detectar la expresión antigénico afín a la mesotelina en una muestra, poniendo en contacto un oligonucleótido antisentido, según lo descrito anteriormente, con una muestra que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido antigénico afín a la mesotelina que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 13 o un fragmento o variante de la misma; y la detección en la muestra de una entidad de ácido nucleico que codifica polipéptido antigénico afín a la mesotelina que hibrida con (a) el oligonucleótido antisentido, y detectar a partir de ahí expresión antigénica afín a la mesotelina en la muestra. En otra realización la cantidad de ácido nucleico codificador de polipéptido antigénico afín a la mesotelina que hibrida con el oligonucleótido antisentido se determina utilizando una reacción en cadena de polimerasa. En otra realización, la cantidad de ácido nucleico codificador de polipéptido afín a la mesotelina que hibrida con el oligonucleótido antisentido se determinan utilizando un ensayo de hibridación. En otra realización, la muestra comprende una preparación de ARN o cADN.

Estos y otros aspectos de la invención se podrán apreciar con referencia a la siguiente descripción detallada, y a las figuras adjuntas. Además, se exponen aquí varias referencias que describen con mayor detalle algunos aspectos de esta invención y se incorporan por lo tanto en su totalidad en la misma.

La figura 1 muestra la caracterización por inmuno transferencia Western del antígeno asociado al carcinoma detectado por el anticuerpo monoclonal OV569.

La figura 2 muestra la fijación de anticuerpo monoclonal OV569 a proteínas de fusión de la región constante de inmunoglobulina humana, que contiene dominios asociados a membrana (D2hIg) o solubles (D1hIg) de MPF en ELISA.

La figura 3 describe la detección de polipéptidos de mesotelina soluble en sueros de pacientes de carcinoma por ELISA sandwich.

La figura 4 ilustra la detección utilizando ELISA sandwich de polipéptidos de mesotelina soluble en sueros de sujetos normales de pacientes con un diagnóstico de cuadro clínico maligno.

La figura 5A-B muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) de antígeno afín a la mesotelina (MRA-1) y una secuencia de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 3) que codifica el antígeno afín a la mesotelina MRA-2. Las posiciones de nucleótidos y aminoácidos están numeradas según la secuencia MRA-2 (figura 6A-B), que comienza con tres aminoácidos N-terminales adicionales (nueve nucleótidos 5' adicionales). Se destaca en negrita la inserción de base 82 relativa a las secuencias MPF/mesotelina afines. La figura 5C muestra una secuencia de aminoácidos utilizando un código de una sola letra.

La figura 6A-B muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de antígeno afín a la mesotelina (MRA-2) y una secuencia de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 4) que codifica el antígeno afín a la mesotelina MRA-2, que comienza con tres aminoácidos N-terminales adicionales (nuevo uncleótidos 5' adicionales). Se destaca en negrita 80 nucleótidos de la inserción de base 82 relativa a las secuencias MPF/mesotelina afines. La figura 6A-B muestra una secuencia de aminoácidos utilizando un código de una sola letra.

La figura 7A-B muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 13) de antígeno afín a la mesotelina soluble (SMR) y una secuencia de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 14) que codifica este SMR. Se destaca en negrita la inserción de base 82 relativa a las secuencias afines MPF/mesotelina.

La figura 7C muestra una secuencia de aminoácidos utilizando un código de una sola letra.

La presente invención pertenece en parte al descubrimiento inesperado de que se producen de forma natural en sujetos formas de ciertos productos génicos que reciben el nombre aquí de polipéptidos de mesotelina, que comprenden niveles elevados de dichos polipéptidos de mesotelina soluble en sujetos que presentan ciertos carcinomas. La invención ofrece por lo tanto composiciones y métodos útiles para la detección y el diagnóstico de un cuadro clínico maligno en un sujeto mediante la detección específica de dichos polipéptidos de mesotelina solubles.

Como se describe detalladamente en lo que sigue, ciertas realizaciones de la invención se refieren a polipéptidos de mesotelina humana, que comprenden polipéptidos tales como el nuevo polipéptido antigénico afín a la mesotelina soluble (MRA) que aquí se describe. En otras realizaciones, la invención se refiere a fragmentos, derivados y/o análogos de polipéptidos MRA. En suma, según ciertas realizaciones de la presente invención, se ofrece un método de cribado para detectar la presencia de un cuadro clínico maligno en un sujeto mediante la puesta en contacto de una muestra biológica del sujeto con un anticuerpo específico, de un polipéptido de mesotelina humana. Las secuencias completas de codificación de ácido nucleico y aminoácidos de MRA se describen aquí, inclusive la observación sorprendente de que una molécula de ácido nucleico derivada de poliA+ARN y que codifica MRA, carece de codón de terminación. Se conocen las secuencias completas de codificación de ácidos nucleicos y aminoácidos para la mesotelina (Chang et al., 1996) y MPF (Kojima et al., 1995), inclusive las partes de estas secuencias que corresponden a polipéptidos de mesotelina tal como se utilizan aquí, inclusive MRA.

Se conoce la expresión de polipéptidos de mesotelina en el citoplasma así como sobre las superficies de una variedad de líneas celulares de tumores humanos (véase por ejemplo Chang et al., 1996; Kojima et al., 1995; y referencias aquí citadas), que permite la utilización de dichas células como inmunógenos para generar anticuerpos específicos de un polipéptido de mesotelina, tal como se describe aquí. Ya se conoce por los informes realizados y se encuentra disponible un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente un polipéptido de mesotelina humana (Chang et al., 1996; Chang et al., 1992 Int. J. Cancer 50:373). Por otra parte, los expertos en la materia pueden proceder de forma rutinaria y sin ninguna experimentación innecesaria, a la inmunización de un huésped y al cribado para detectar la producción de anticuerpos específico de polipéptido de mesotelina utilizando las presentes enseñanzas junto con metodologías bien conocidas en el estado de la técnica. Por ejemplo, ciertas células tumorales que se pueden utilizar como inmunógenos, expresan, como es bien sabido, polipéptidos de mesotelina (véase por ejemplo Chang et al., 1996; Kojima et al., 1995; y referencias aquí citadas), y se puede realizar la determinación de la expresión de polipéptido de mesotelina en una línea celular inmunógena candidata sobre la base de la caracterización de polipéptidos de mesotelina que aquí se ofrece y/o de la expresión detectable de las secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos de mesotelina, según lo señalado, por ejemplo en Chang et al., (1996) y Kojima et al. (1995).

Partiendo de las propiedades inmunoquímicas y fisico-químicas de polipéptidos de mesotelina soluble como los aquí descritos, y utilizando las secuencias de ácidos nucleicos aquí descritos que codifican miembros de la familia de polipéptidos de mesotelina, que son antígenos a la mesotelina (MRAs), o utilizando opcionalmente las propiedades referidas de secuencias de nucleótidos codificadoras de otros polipéptidos de mesotelina (por ejemplo mesotelina o MPF), una persona versada en la materia puede preparar también un polipéptido de mesotelina recombinante que se puede utilizar para producir y caracterizar anticuerpos específicos según metodologías bien conocidas. Los polipéptidos de mesotelina se pueden expresar en células de mamíferos, levaduras, bacterias u otras células bajo el control de promotores adecuados. Se pueden emplear también sistemas de traducción libre de célula (cell-free) para producir estas proteínas utilizando ARN derivados de las regiones codificadoras de ADN de polipéptidos de mesotelina de las referencias citadas (Chang et al., 1996; Kojima et al., 1995) y de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el MRA aquí descritas, o que se pueden deducir de secuencias de aminoácidos MRA como las que aquí se ofrecen Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, (1989). Describen vectores adecuados de clonación y expresión que se utilizan con huéspedes procariotas y eucariotas. En realizaciones preferidas de la invención, los polipéptidos de mesotelina se expresan en células de mamíferos.

Los ácidos nucleicos de la presente invención pueden encontrarse en forma de ARN o en forma de ADN, ADN que incluye cADN, ADN genómico y ADN sintético. El ADN puede ser de dos cadenas o de una sola y si es de una sola cadena, puede ser la cadena codificadora o la cadena no codificadora (antisentido). Una secuencia codificadora que codifica un polipéptido MRA que se utiliza según la invención, puede ser idéntica a la secuencia codificadora ofrecida en SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o puede ser una secuencia codificadora diferente que, como resultado de al redundancia o degeneración del código genético, codifica el mismo polipéptido MRA como, por ejemplo, los cADN SEQ ID NO: 3 y 4. La presente invención ofrece por lo tanto una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido antigénico afín a la mesotelina que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ó 2, o una molécula de ácido nucleico capaz de hibridar con un ácido nucleico codificador de polipéptido MRA de este tipo o una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia complementaria al mismo.

Las variantes presentan de preferencia por lo menos un 70% de identidad, todavía mejor por lo menos en torno a 80% de identidad, y todavía mejor por lo menos en torno a 90% de identidad con una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido antigénico afín a la mesotelina nativo o una parte del mismo como por ejemplo las secuencias de ácidos nucleicos que aparecen en SEQ ID NO: 3 y 4. El porcentaje de identidad se puede determinar fácilmente comparando secuencias utilizando algoritmos informáticos bien conocidos por los expertos en la materia tales Align o el algoritmo BLAST (Altschul, J. Mol. Biol. 219:555-565, 1991; Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 89:10915-19191, 1992), que se encuentra disponible en la página Web de NCBI
(http://www/ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST). Se pueden utilizar parámetros por defecto.

Ciertas variantes son prácticamente homologas a un gen nativo. Estas variantes de polinucleótidos son capaces de hibridar en condiciones moderadamente rigurosas con una secuencia de ARN o ADN que se presenta de forma natural, que codifica un antígeno afín a la mesotelina nativa (o una secuencia complementaria). Unas condiciones moderadamente rigurosas suponen por ejemplo las siguientes etapas o su equivalente: lavar previamente en una solución de 5X SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0); hibridar a 50ºC-65ºC, 5 X SSC, durante la noche, seguido de lavado durante dos veces a 65ºC durante 20 minutos con 2X, 0,5X y 0,2X SSC que contiene 0,1% SDS. Las condiciones de rigurosidad adicional pueden incluir por ejemplo un lavado en 0,1X SSC y 0,1% SDS a 60ºC durante 15 minutos, o su equivalente. Todo experto en la materia podrá apreciar fácilmente que los parámetros se pueden variar de forma rutinaria para crear condiciones de hibridación rigurosa adecuada que son, en cierto modo selectivas para un ácido nucleico particular de interés, y apreciarán además que dichas condiciones pueden estar en función, entre otras cosas, de las secuencias de ácidos nucleicos particulares involucradas en la hibridación, tales como por ejemplo, las aquí descritas como SEQ ID NO: 3 y 4, que codifican polipéptidos antigénicos afines a la mesotelina MRA-1 y MRA-2, respectivamente. Véase también por ejemplo Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1995, en relación con la selección de condiciones de hibridación de ácido nucleico.

Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos MRA, por ejemplo los polipéptidos MRA humanos que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-2 o cualquier otro polipéptido MRA que se utiliza según la invención, pueden comprender, sin que esto suponga limitación, únicamente la secuencia de codificación para el polipéptido MRA, la secuencia de codificación para el polipéptido MRA y una secuencia de codificación adicional; la secuencia de codificación para el polipéptido MRA (y opcionalmente la secuencia de codificación adicional) y una secuencia de no codificación, tales como intrones o secuencias de no codificación 5' y/o 3' de la secuencia de codificación para el polipéptido MRA que por ejemplo puede incluir además, aunque no tiene que limitarse a, una o más secuencias de ácidos nucleicos regulatorias que pueden ser un promotor, potenciador, otra secuencia regulatoria de transcripción, secuencia de fijación de represor, secuencia regulatoria de traducción o cualquier otra secuencia de ácidos nucleicos regulatorios, regulada o regulable. Por consiguiente el termino "ácidos nucleicos que codifican polipéptidos MRA" comprende un ácido nucleico que incluye únicamente una secuencia de codificación para el polipéptido así como un ácido nucleico que incluye secuencia(s) adicional(es) de codificación y/o de no codificación.

La presente invención se refiere además a las variantes de los ácidos nucleicos aquí descritos que codifican para fragmentos, análogos o derivados de un polipéptido MRA, por ejemplo el polipéptido MRA humano, que tienen la secuencias de aminoácidos deducidas de SEQ ID NO: 1 y 2. Las variantes de los ácidos nucleicos que codifican MRA pueden ser variantes alelas que se presentan de modo natural, de los ácidos nucleicos o variantes que no se presentan de modo natural. Según se sabe en el estado de la técnica, una variante alela es una forma alternativa de una secuencia de ácido nucleico que puede tener por lo menos un nucleótido de sustitución, de deleción o de adición o más nucleótidos, que no alteran prácticamente la función del polipéptido MRA codificado. Por consiguiente, por ejemplo, la presente invención comprende ácidos nucleicos que codifican los mismos polipéptidos MRA mostrados en SEQ ID NO: 1 y 2, así como variantes de dichos ácidos nucleicos, variantes que pueden codificar un fragmento, derivado o análogo de cualquiera de los polipéptidos de SEQ ID NO: 1 o 2.

Se pueden obtener variantes y derivados de MRA mediante mutaciones de secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos MRA. También se pueden realizar alteraciones de la secuencia de aminoácidos nativos utilizando cualquiera de los diversos métodos convencionales. Se pueden introducir mutaciones en loci particulares sintetizando oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante, flanqueada por zonas de restricción que permiten la ligadura a fragmentos de la secuencia nativa. Tras la ligadura, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la inserción, sustitución o deleción de aminoácidos deseado.

Alternativamente, se pueden utilizar procedimientos de mutagénesis específicos de zona dirigidos a oligonucleótidos para proporcionar un gen alterado en el que se pueden alterar codones predeterminados por sustitución, deleción o inserción. Ejemplos de métodos para realizar dichas alteraciones se describen en Walter et al., (Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Crack (BioTechniques, January 1985, 12-19; smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Method, Plenum Press, 1981); Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:488, 1985); Kunkel et al. (Methods in Enzymol. 154:367, 1987); and US Patent 4.518.584 y 4.737.462.

La identificación de moléculas de ácido nucleico que se utilizan como agentes antisentido, que incluyen oligonucleótidos antisentido y ribozimas específicos de secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos MRA o variantes o fragmentos de los mismos, y de oligonucleótidos, de ADN que codifican genes MRA para terapia genética puntual, utilizan métodos bien conocidos en el estado de la técnica. Por ejemplo, las propiedades deseables, longitudes y otras características de dichos oligonucleótidos son bien conocidas. En ciertas realizaciones preferidas, un oligonucleótido antisentido de este tipo comprende por lo menos 15 nucleótidos consecutivos complementarios de una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido MRA según se describe aquí. Los oligonucleótidos antisentidos se suelen diseñar para resistir la degradación por enzimas uncleolíticas endógenas, utilizando uniones como: fosforotioato, metilfosfonato, sulfona, sulfato, cetil, fosforoditioato, fosforamidato, ésteres de fosfato y otros enlaces de este tipo (véase por ejemplo Agwal et al., Tetrehedron Lett. 28:3539-3542 (1987); Millar et al., J. Am. Chem. Soc. 93:6657-6665 (1971); Stec et al., Tetrehedron Lett. 26: 2191-2194 (1985); Moody et al., Nucl. Acids Res. 12:4769-4782 (1989); Uznanski et al., Nucl. Acids Res. 81989); Letsinger et al., Tetrahedron 40:137-143 (1984); Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 54:367-402 (1985; Eckstein, Trenes Biol. Sci. 14:97-100 (1989); Stein In: Oligodeoxynucleotides. Antisense Inhibitors of Gene Expresión, Cohen, Ed, Macmillan Press, London, pp. 97-117 (1989); Pager et al., Biochemistry 27:7237-7246 (1988)).

Los nucleótidos antisentido son oligonucleótidos que se unen de forma específica a la secuencia a ácidos nucleicos, tales como mARN o ADN. Cuando se una a mARN que tiene secuencias complementarias, el antisentido evita la traducción del mARN (véanse patente US 5.168.053 de Altman et al., US 5.190.931 de Inouye, US 5.135.917 de Burch; US 5.087.617 de Smith and Clusel et al., (1993) Nucl. Acids Res. 21:3405-3411, que describe oligonucleótidos antisentido dumbbell). Las moléculas triplex se refieren a cadenas individuales de ADN que fijan ADN duplex formando una molécula triplex colineal, evitando de este modo la transcripción (véase por ejemplo la patente US 5.176.996 de Hogan et al., que describe métodos para fabricar oligonucleótidos sintéticos que se unen a zonas determinadas en ADN duplex).

Según esta realización de la invención, particularmente útiles moléculas triplex y nucleótidos antisentido son las moléculas complementarias o que fijan la cadena sentido de ADN o mARN que codifica un polipéptido MRA de tal modo que se produce la inhibición de la traducción de mARN que codifica el polipéptido MRA.

Una ribozima es una molécula ARN que fragmenta específicamente sustratos de ARN, tales como mARN, como el resultado de una inhibición específica o interferencia con expresión génica celular. Existen por lo menos 5 clases conocidas de ribozimas que intervienen en la fragmentación y/o ligadura de cadena de ARN. Las ribozimas se pueden dirigir a cualquier transcripto ARN y pueden fragmentar catalíticamente estos transcriptos (véase por ejemplo patentes US 5.272.262; US 5.144.019 y US 5.168.053, 5.180.818, 5.116.742 y 5.093.246 de Cech et al.). Según ciertas realizaciones de la invención cualquiera de estos ribozimas específicos de mARN o un ácido nucleico que codifica dicho ribozima, se puede suministrar a una célula huésped para efectuar la inhibición de la expresión génica MRA. Las ribozimas y similares se pueden administrar a las células huésped por medio de ADN que codifica la ribozima ligada a un promotor eucariota, como un promotor viral eucariota, de tal forma que tras la introducción en el núcleo, la ribozima será transcrita directamente.

La invención también comprende constructos de ADN equivalentes que codifican diversas adiciones o sustituciones de residuos de aminoácidos o secuencias, o deleciones de residuos terminales o internos o secuencias no necesarios para la actividad biológica. Por ejemplo las secuencias que codifican residuos de Cys, no esenciales para la actividad biológica, se pueden alterar para hacer que los residuos Cys sean suprimidos o sustituidos por otros aminoácidos, evitando la formación de puentes de disulfuro intramolecular incorrectos tras la renaturalización. Otros equivalentes se pueden preparar modificando los residuos de aminoácidos dibásicos adyacentes para potenciar la expresión en sistemas de levadura en los cuales se encuentra presente la actividad de proteasa KEX2. El documento EP 212.914 describe la utilización de mutagénesis específica de la zona para desactivar las zonas de procesamiento de proteasa KEX2 en una proteína. Las zonas de procesamiento de proteasa KEX2 se desactivan suprimiendo, añadiendo o sustituyendo residuos para alterar los pares Arg-Arg, Arg-Lys y Lys-Arg para eliminar la ocurrencia de estos residuos básicos adyacentes. Los emparejamientos Lys-Lys son mucho menos susceptibles de fragmentación de KEX2, y la conversión de Arg-Lys o Lys-Arg a Lys-Lys representa un enfoque conservador y preferido para desactivar zonas de KEX2.

La(s) secuencia(s) de ADN adecuada(s) se puede(n) insertar en cualquiera de los vectores bien conocidos adecuados para la célula huésped seleccionada recurriendo a toda una serie de de procedimientos. En general, la secuencia de ADN se inserta en una zona de endonucleasa de restricción adecuada utilizando procedimientos conocidos en el estado de la técnica. Las técnicas standard para la clonación, aislamiento de ADN, amplificaron y purificación, para reacciones enzimáticas en las que interviene ligasa ADN, polimerasa de ADN, endonucleasas de restricción y similares, así como otras varias técnicas de separación son bien conocidas y suelen ser utilizadas habitualmente por los expertos en la materia. Se describe cierto número de técnica standard, por ejemplo en Ausubel et al. (1993 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc & John Wiley & Sons, Inc., Boston, MA); Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning, Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Plainview, NY), y en otras fuentes.

Como ejemplos de sistemas de expresión de mamíferos se pueden citar las líneas COS-7 de fibroblastos de riñón de mono, descritas por Gluzman, Cell 23:175 (1981), y otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamífero comprenderán un origen de replicación, un promotor adecuado y un potenciador, y también todas las zonas necesarias de fijación de ribosoma, zona de poliadenilación, zonas de donante y donante y aceptor de unión, secuencias de terminación de transcripción y secuencias no transcritas que flanquean 5'. Las secuencia de ADN derivadas, por ejemplo, de zonas de poliadenilación y unión de SV40 se pueden utilizar para proporcionar los elementos genéticos no transcritos requeridos. La introducción del constructo en la célula huésped se puede realizar utilizando toda una serie de métodos que conocen los expertos en la materia inclusive, sin que esto suponga limitación, por ejemplo, transfección de fosfato cálcico, transfección por medio de dextrano-DEAE o electroporación (Davis et al., 1986 Basic Methods in Molecular Biology).

La presente invención se refiere además a MRAs, a polipéptidos antigénicos afines a la mesotelina y en particular a métodos para detectar un cuadro clínico maligno. En una realización preferida, el estado maligno se detecta determinando la presencia en una muestra biológica de una, molécula soluble que se presenta de modo natural, que tiene un determinante antigénico que reacciona por lo menos con un anticuerpo específico de un polipéptido de mesotelina humana. En otra realización preferida, el estado maligno se detecta determinando la presencia en una muestra biológica de por lo menos un polipéptido MRA que se presenta de modo natural. En la presente descripción, el termino "polipéptido antigénico afín a la mesotelina" o "polipéptido MRA" comprende cualquier polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ó 2, inclusive cualquier fragmento, derivado análogo de la misma, y comprende también todo polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 3 ó 4, o por una molécula de ácido nucleico capaz de hibridar con una molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3 ó 4, o un fragmento, derivado o análogo de la misma. Por consiguiente, según la porción de aminoácido MR A, que se describe actualmente, o de la secuencia de ácidos nucleicos que se elige, un polipéptido MRA puede ser, aunque no necesariamente un polipéptido de mesotelina. En la presente descripción, "polipéptido de mesotelina" es un polipéptido soluble que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye el péptido:

EVEKTACPSGKKAREIDES SEQ ID NO: 5 y que tiene además por lo menos un determinante antigénico que reacciona con por lo menos un anticuerpo que tiene una zona de combinación de antígenos que inhibe competitivamente la fijación inmunoespecífica de MAb K-1 (Chang et al., 1996 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93:136; MAb K-1 se puede encontrar en por ejemplo Signet Laboratories, Inc., Dedham, MA) o de anticuerpos monoclonales OV569, 4H3, 3G3 o 1A6, según se describe aquí. Un polipéptido de mesotelina puede incluir por ejemplo un polipéptido antigénico afín a la mesotelina (MRA) según se describe aquí, o puede derivarse de la parte asociada de, superficie celular de la mesotelina misma (Chang et al., 1996), la parte ligada a la membrana de la proteína precursora MPF (Kojima et al., 1995 J. Biol. Chem. 270:21984), o cualquier fragmento, análogo o derivado de dichos polipéptidos.

El polipéptido MRA o el polipéptido de mesotelina de la invención pueden ser un polipéptido no modificado o un polipéptido que ha tenido una modificación post-traduccional, por ejemplo por glicosilación, fosforilación, acilación grasa que incluye modificación del primer iniciador de fijación de glicosilfosfatidilinositol o similares, fragmento de fosfolipasa como fosfolipasa específica de fosfatidilinositol o hidrólisis mediada o similares, fragmentación de proteasa, defosforilación o cualquier otro tipo de modificación post-traduccional de proteína como una modificación que supone la formación o fragmentación de un enlace químico covalente.

Los términos "fragmento", "derivado" y "análogo", referidos a polipéptidos antigénicos afines a mesotelina o proteínas de fusión se refieren a cualquier polipéptido antigénico afín a la mesotelina que conserva esencialmente la misma función biológica y/o actividad que dicho polipéptido. Por consiguiente, un análogo puede incluir un polipéptido antigénico afín a la mesotelina, isoformo, como un polipéptido antigénico afín a la fusión modificado diferencial y post-traduccionalmente o una variante como por ejemplo una variante de unión. En el estado de la técnica se sabe que una "variante de unión" comprende formas variantes o alternativas de un polipéptido que procede del procesamiento intracelular diferencial de un transcripto de ARN. Por ejemplo, dos especies distintas de mARN pueden ser variantes de unión de otra si difieren solamente por la inclusión de la totalidad o parte de una secuencia correspondiente a un exon particular en una especie mARN y su ausencia de las demás especies. Los expertos en la materia podrán observar que pueden existir otras relaciones estructurales entre especies de mARN que se considerarían en general como variantes de unión. Un polipéptido de mesotelina comprende además una proteína que se puede activar por fragmentación de la parte proteínica para producir un polipéptido de mesotelina activo.

Las funciones y/o actividades biológicas de fragüentos, derivados y análogos de polipéptidos MRA o polipéptidos de mesotelina incluyen, aunque sin necesidad de limitación, la utilización de estos polipéptidos como marcadores en un método de cribado para detectar la presencia de un cuadro clínico maligno en un sujeto, tal como se ha descrito aquí. Por ejemplo, mediante la detección en una muestra del sujeto de una molécula que se presenta de modo natural en forma soluble y tiene un determinante antigénico reactivo con por lo menos un anticuerpo específico de un polipéptido de mesotelina, un experto en la materia puede controlar y seguir una función y/o actividad biológica de un polipéptido MRA y/o de un polipéptido de mesotelina. Además, hay que señalar que en ciertas realizaciones, el método de cribado objeto de la invención se destina a comparar cantidades relativas, niveles y/o cuantías de una molécula detectable que se presenta de modo natural en forma soluble y tiene un determinante antigénico que reacciona con por lo menos un anticuerpo específico de un polipéptido de mesotelina en cada una de (i) una primera muestra biológica de un primer sujeto sospechoso de presentar un cuadro maligno, y (ii) una segunda muestra biológica de un segundo sujeto que se sabe o presenta ningún cuadro maligno. Por lo tanto, la presencia cuantitativa relativa de un polipéptido de mesotelina en una muestra biológica puede ser una función y/o actividad biológica de un polipéptido de mesotelina, aunque dicha función y/o actividad no debe limitarse de este modo.

Un fragmento, derivado o análogo de un polipéptido MRA o un polipéptido de mesotelina puede ser (i) uno en el cual uno o más de los residuos de aminoácidos son sustituidos por un residuo de aminoácido conservado o no conservado (de preferencia un residuo de aminoácido conservado); (ii) uno en el cual los aminoácidos adicionales se condensan con el polipéptido de mesotelina, incluyen aminoácidos que se pueden utilizar par purificar el polipéptido de mesotelina o una secuencia pro-proteínica; o (iii) un polipéptido de mesotelina truncado. Estos fragmentos derivados y análogos se consideran que se encuentran dentro del ámbito del estado de la técnica y de las enseñanzas que aquí se ofrecen.

Un polipéptido de mesotelina truncado puede ser cualquier molécula de polipéptido de mesotelina que comprende menos de una versión de longitud completa del polipéptido de mesotelina. Las moléculas truncadas presentadas por esta invención pueden incluir polímeros biológicos truncados, y en realizaciones preferidas de la invención, estas moléculas truncadas pueden ser moléculas de ácido nucleico truncadas o polipéptidos truncados. Las moléculas de ácido nucleico truncadas tienen menos de la secuencia de núcleotidos de longitud completa de una molécula de ácido nucleico conocida o descrita, donde dicha molécula de ácido nucleico conocida o descrita puede ser una que se presenta de modo natural, una molécula de ácido nucleico sintética o recombinante, siempre que un experto en la materia la considere molécula de longitud completa. Por ejemplo las moléculas de ácido nucleico truncadas que corresponden a una secuencia génica contienen por lo tanto menos del gen de longitud completa, donde el gen comprende secuencias de codificación y de no codificación, promotores, potenciadotes y otras secuencias reguladoras, secuencias de flanqueo y similares, y otras secuencias funcionales y no funcionales reconocidas como porte del gen. En otro ejemplo, las moléculas de ácido nucleico truncadas que corresponden a una secuencia mARN contienen menos del transcripto mARN de longitud completa, que puede incluir varias regiones traducidas y no traducidas, así como otras secuencias funcionales y no funcionales. En otras realizaciones preferidas, las moléculas truncadas son polipéptidos que comprenden menos de la secuencia de aminoácidos de longitud completa de una proteína particular.

Tal como se utiliza aquí "deleción" tiene el significado común que conocen los expertos en la materia y puede referirse a moléculas que carecen de una o más de una parte de una secuencia desde cualquier término o de una región no terminal, respecto de una molécula de longitud completa correspondiente, p. ej. como ocurre con las moléculas truncadas que aquí se presentan. Las moléculas truncadas que son polímeros biológicos lineales como moléculas de ácido nucleico o polipéptidos pueden tener una o más de una deleción desde cualquier término de la molécula o una deleción desde una región no terminal de la molécula, donde dichas deleciones pueden ser deleciones de 1-1500 residuos de aminoácidos o nucleótidos contiguos, de preferencia 1-500 residuos de aminoácidos o nucleótidos contiguos y todavía mejor 1-300 residuos de aminoácidos o nucleótidos contiguos.

Como es bien sabido en el estado de la técnica, la "semejanza" entre dos polipéptidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos y los sustitutos de aminoácidos conservados del polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido. La semejanza entre dos secuencias de nucleótidos o polipéptidos o incluso el porcentaje de identidad puede determinarse fácilmente comparando secuencias utilizando algoritmos informáticos bien conocidos de los expertos en la materia como el algoritmo BLAST (Altschul, J. Mol. Biol. 219:555-565, 1991; Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 89:10915-19191, 1992), que se encuentra disponible en la página Web de NCBI (http://www/ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST). Se pueden utilizar parámetros por defecto. Otros ejemplos de algoritmos informáticos útiles pueden ser los utilizados en programas como Align y FASTA, a los que se puede tener acceso por ejemplo en la página Web de Internet Genestream Institut de Genetique Humaine, Montpellier, Francia (www2.igh.cnrs.fr/home.eng.html) y que se puede utilizar con parámetros por defecto. Se pueden utilizar fragmentos o partes del polipéptido de la presente invención para producir el polipéptido de longitud completa correspondiente mediante síntesis de péptidos; por tanto, los fragmentos se pueden usar como intermedios para producir los polipéptidos de longitud completa.

El término "aislado" significa que el material se elimina de su entorno original (por ejemplo el entorno natural si se presenta de modo natural). Por ejemplo, un polipéptido que se presenta de modo natural o polinucleótido presente en un animal vivo no es aislado. Pero el mismo polipéptido o polinucleótido, separado de algo o de la totalidad de los materiales coexistentes en el sistema natural, se considera aislado. Estos polipéptidos o polinucleótidos podrían ser parte de una composición y considerarse aislados al no formar parte esta composición de su entorno natural.

Las técnicas de afinidad resultan particularmente útiles en el contexto del aislamiento de polipéptidos MRA y/o polipéptidos de mesotelina, en utilizaciones según los métodos de la presente invención y pueden incluir cualquier método que explote una interacción de fijación específica entre un polipéptido MRA o un polipéptido de mesotelina para producir una separación. Por ejemplo, debido a que los polipéptidos de mesotelina pueden contener mitades de oligosacáridos unidos por enlace covalente (véase por ejemplo Chang et al., 1996 proc. Nat. Acad. Sci. USA 93:136; Chang et al., 1992 Cancer Res. 52:181; Kojima et al., 1995 J. Biol. Chem 270:21984; Yamaguchi et al., 1994 J. Biol. Chem. 269-805), una técnica de afinidad como la fijación de un polipéptido de mesotelina a una lectina inmovilizada adecuada en condiciones que permiten al carbohidrato su fijación por la lectina, puede ser una técnica de afinidad particularmente útil. Otras técnicas de afinidad útiles pueden ser las técnicas inmunológicas para aislar un polipéptido de mesotelina, técnicas que se basan en la interacción de fijación específica entre zonas de combinación de anticuerpos para determinantes de antígeno y antigénicos presentes en los complejos. Las técnicas inmunológicas comprenden aunque sin necesidad de limitación, la inmunoafinidad, cromatografía, inmunoprecipitación, inmunoadsorción de fase sólida y otros métodos de inmunoafinidad. Para ésta y otras técnicas de afinidad útiles véase por ejemplo Scopes, R.K. Protein Purification: Principies and Practice, 1987, Springer-Verlag, NY; Weir D.M. Handbook of Experimental Immunology, 1986 Blackwell Scientific, Boston; and Hermanson, G.T. et al., Immobilized Affinity Ligand Techniques, 1992, Academia Press, Inc. California, que se incorporan aquí a modo de referencia en su totalidad para consultar detalles relativos a técnicas de aislamiento y caracterización de complejos, inclusive técnicas de afinidad.

Tal como se describe aquí, la invención ofrece una proteína de fusión que comprende un polipéptido condensado con un MRA. Estas proteínas de fusión MRA son codificados por ácidos nucleicos que tienen la secuencia de codificación MRA condensada en marco con una secuencia de codificación adicional par proporcionar la expresión de una secuencia de polipéptido MRA condensada con una secuencia de polipéptido funcional o no funcional adicional que permite, por ejemplo, a modo de ilustración y no de limitación, la detección, aislamiento y/o purificación de la proteína de fusión MRA. Estas proteínas de fusión MRA pueden permitir la detección, aislamiento y/o purificación de la proteína de fusión MRA por afinidad proteína-proteína, afinidad metálica o purificación de polipéptido basada en afinidad de carga o por fragmentación de proteasa específica de una proteína de fusión que contiene una secuencia de fusión que se puede fragmentar mediante una proteasa de modo que el polipéptido MRA es separable de la proteína de fusión.

Por consiguiente, las proteínas de fusión MRA pueden comprender secuencias de polipéptidos de marca (ag) de afinidad, lo cual hace referencia a polipéptidos o péptidos añadidos a MRA para facilitar la detección y el aislamiento del MRA por medio de una interacción de afinidad específica con un ligando. El ligando puede ser cualquier molécula, receptor, contra receptor, anticuerpo o similar, con el que puede interactuar la marca/rótulo (tag) de afinidad mediante una interacción de fijación específica, tal como se presenta aquí. Estos péptidos incluyen por ejemplo poli-HIs o los péptidos de identificación antigénica descritos en la patente US 5.011.912 y en Hopp et al., (1988 Bio/Technology 6:1204) o el rótulo/marca (tag) epítopo XPRESS^{TM} (Invitrogen, Carlsbab, CA). La secuencia de afinidad puede ser un tag (rótulo) hexa-histidina como la que suministra por ejemplo pBAD/His (Invitrogen) o un vector pQE-9 para obtener la purificación del polipéptido maduro condensado con el marcador en el caso de un huésped bacteriano, o por ejemplo, la secuencia de afinidad puede ser un tag (rótulo) de hemaglutinina (HA) cuando se utiliza un huésped mamífero, por ejemplo células COS-7. La etiqueta HA corresponde a un epítopo definido anticuerpo derivado de la proteína de hemaglutinina de la gripe (Wilson et al., 1984 Cell 37:767).

Las proteínas de fusión MRA pueden comprender además polipéptidos de región constante de inmunoglobulina añadidas a MRA para facilitar la detección, aislamiento y/o localización de MRA. El polipéptido de región constante de inmunoglobulina se condensa de preferencia con el término C de un polipéptido MRA. La preparación general de proteínas de fusión que contienen polipéptidos heterólogos condensados con varias porciones de polipéptidos derivados de anticuerpo (inclusive el dominio Fc) ha sido descrita por ejemplo por Ashkenazi et al., (PNAS USA 88:10535, 1991) y Byrn et al. (Nature 344:677, 1990). Se inserta una fusión génica que codifica la proteína de fusión MRA:Fc en un vector de expresión adecuado. En ciertas realizaciones de la invención, se dejar que las proteínas de fusión MRA:Fc se junten a semejanza de moléculas de anticuerpo, tras lo cual se forman enlaces de disulfuro entre cadenas, entre polipéptido Fc, obteniéndose proteínas de fusión MRA diméricas.

Las proteínas de fusión MRA que tienen afinidades de fijación específicas por antígenos pre-seleccionados en virtud de polipéptidos de fusión que comprenden dominios de región V de inmunoglobulina codificados por secuencias de ADN ligadas in-frame a secuencias que codifican MRA también se encuentran dentro del ámbito de la invención así como las variantes y fragmentos de la misma que aquí se presentan. Se describen estrategias generales para la construcción de proteínas de fusión que tienen polipéptidos de fusión de región V de inmunoglobulina p. ej. en el documento EP0318554; US 5.132.405, US 5.091.513, y US 5.476.786.

El ácido nucleico de la presente invención puede codificar también una proteína de fusión que comprende un polipéptido MRA condensado con otros polipéptidos que tienen propiedades de afinidad deseables, por ejemplo una enzima como glutaniona-S-transferasa. En otro ejemplo, las proteínas de fusión MRA pueden comprender también un polipéptido MRA condensado con un polipéptido A proteínico de Staphylococcus aureus; proteína A que codifica ácidos nucleicos y su utilización en la construcción de proteínas de fusión que tienen afinidad por regiones constantes de inmunoglobulina. Todo ello se describe en general por ejemplo en la patente US 5.100.788. Otros polipéptidos de afinidad útiles para la construcción de proteínas de fusión MRA pueden incluir proteínas de fusión de estreptavidina, según lo descrito, por ejemplo en el documento WO 89/03422; US 5. 489.528; US 5.672.691; WO 93/24631; US 5.168.049; US 5.272. 254 y en otras fuentes y proteínas de fusión de avidina (véase por ejemplo el documento EP 511.747). Según lo indicado aquí y en las referencias citadas, las secuencias de polipéptido MRA, inclusive MRAs mutantes que capturan sustrato, se pueden condensar con secuencias de polipéptidos de fusión que pueden ser polipéptidos de fusión de longitud completa y pueden ser alternativamente variantes o fragmentos de las mismas.

La presente invención también contempla proteínas de fusión de MRA que contienen secuencias de polipéptidos que dirigen la proteína de fusión hacia el núcleo de la célula, para residir en el lumen del reticulum endoplásmico (ER), para ser secretada de una célula a través de la vía secretora clásica ER-Golgi (véase por ejemplo Heijne, J. Membrane Biol. 115:195-201, 1990), para incorporarse en la membrana del plasma, asociarse con un componente citoplásmico específico inclusive el dominio citoplásmico de un receptor de superficie celular transmembrana o ser dirigido a una ubicación subcelular particular por cualquier variedad de mecanismo conocido de selección de proteína intracelular, familiares para el experto en la materia (véase por ejemplo Rothman, Nature 372:55-63, 1994, Adran et al., 1998 J. Biol. Chem. 273:10317 y las referencias citadas aquí). Por consiguiente estas realizaciones y otras afines están incluidas en las composiciones y métodos instantáneos dirigidos a llevar un polipéptido de interés a una ubicación predefinida intracelular de la membrana o extra celular.

La presente invención también se refiere a vectores y a constructos que comprenden ácidos nucleicos de la presente invención, y en particular a "constructos de expresión recombinante" que incluyen cualquier ácido nucleico que codifica polipéptidos MRA según la invención, tal como se indica más arriba; a células huéspedes cinéticamente diseñadas con vectores y/o constructos de la invención y a la producción de polipéptidos MRA y proteínas de fusión de la invención, o fragmentos o variantes de los mismos, por medio de técnicas recombinantes. Las proteínas MRA se pueden expresar en células de mamífero, levadura, bacterias u otras células bajo el control de promotores adecuados. Se pueden utilizar también sistemas de traducción libres de célula para producir estas proteínas utilizando ARN derivados de los constructos de ADN de la presente invención. Se describen vectores de expresión y de clonación adecuados que se utilizan con huéspedes procariotas y eucariotas, por ejemplo, así lo hace Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, New York, (989).

Por lo general, los vectores de expresión recombinante incluirán orígenes de replicación y marcadores seleccionables que permiten la transformación de la célula huésped, por ejemplo el gen de resistencia a la ampicilina de E. coli y S. cerevisiae TRP1 y un promotor derivado de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural aguas abajo. Estos promotores se pueden derivar de operones que codifican enzimas glicolíticas tales como 3-fosfoglicerato-quinasa (PGK), factor \alpha, fosfatasa ácida o proteínas de choque térmico, entre otros. La secuencia estructural heteróloga se ensambla en fase adecuada con secuencias de iniciación y terminación de traducción. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluye un péptido de identificación N-terminal que confiere las características deseadas, por ejemplo estabilización o purificación simpleficada de producto recombinante expresado.

Los constructos de expresión útiles para uso bacteriano se construyen insertando en un vector de expresión una secuencia de ADN estructural que codifica una proteína deseada junto con unas señales de iniciación y terminación de traducción adecuadas en fase de lectura operativa con un promotor funcional. El constructo puede comprender uno o más marcadores seleccionables fenotípicos y un origen de replicación para garantizar el mantenimiento del constructo vector y, si se desea, para proporcionar amplificación dentro del huésped. Como huéspedes procariotas adecuados para la transformación se pueden citar: E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies dentro de los géneros de pseudomonas Streptomyces y estafilococos, aunque se pueden utilizar también otras. Se puede utilizar cualquier otro plásmido o vector siempre que sean replicables y viables en el huésped.

Como ejemplo representativo aunque no limitativo, los vectores de expresión útiles para uso bacteriano pueden comprender un marcador seleccionable y un origen bacteriano de replicación derivada de plásmidos que se pueden obtener en el comercio, que comprenden elementos genéticos del vector de clonación bien conocidos pBR322 (ATCC 37017). Estos vectores comerciales incluyen por ejemplo pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y GEM1 (Promega Biotec, Madison, Wisconsin, EE.UU.). Estas secciones principales pBR322 se combinan con un promotor adecuado y la secuencia estructural que se va a expresar.

Tras la transformación de una cepa huésped adecuado y el crecimiento de la cepa huésped hasta una densidad celular adecuada, el promotor elegido, si es un promotor regulable como se aquí se indica, se induce utilizando medios adecuados (por ejemplo cambio de temperatura o inducción química) y se cultivan células durante un período adicional. Las células se suelen cosechar por centrifugación, romper con medios físicos o químicos, y el extracto crudo resultante mantenerse para una purificación ulterior. Las células microbianas utilizadas en la expresión de proteínas pueden romperse utilizando cualquier método conveniente, inclusive haciendo pasar por ciclos de congelación-descongelación, exposición a ultrasonidos, ruptura mecánica o utilización de agentes de lisado celular, estos métodos son bien conocidos por los expertos en la materia.

Así, por ejemplo, los ácidos nucleicos de la invención aquí descritos pueden incluirse en cualquiera de las variedades de constructos de vector de expresión como constructo de expresión recombinante para expresar un polipéptido MRA. Estos vectores y constructos comprenden secuencias de ADN sintético cromosomal y no cromosomal, por ejemplo derivados de SV40; plásmidos bacterianos; ADN fago; baculovirus; plásmido de levadura; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN fago, ADN viral como vacuna, adenovirus, virus de viruela aviar y pseudorrabia. Sin embargo, se puede utilizar cualquier otro vector para la preparación de un constructo de expresión recombinante siempre que sea replicable y viable en el huésped.

La(s) secuencia(s) adecuada(s) de ADN se puede(n) insertar en el vector utilizando toda una serie de procedimiento. En general, la secuencia ADN se inserta en una(s) zona(s) de endonucleasa de restricción adecuada(s) utilizando procedimientos conocidos en el estado de la técnica. Las técnicas standard para la clonación, aislamiento de ADN, amplificación y purificación, para reacciones enzimática que incorporan ligasa ADN, polimerasa ADN, endonucleasas de restricción y similares, y otras técnicas de separación son las conocidas y utilizadas habitualmente por los expertos en la materia. Algunas técnicas standard se describen por ejemplo en Ausubel, et al., (1993 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc, Inc & John Wiley & Sons, Inc., Boston, MA); Sambrook et al., (1989 Molecular Cloning, Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY), Maniatis et al., (1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY) y en otras fuentes.

La secuencia de ADN en el vector de expresión está ligada operativamente con por lo menos con una secuencia de control de expresión adecuada (por ejemplo un promotor o un promotor regulado) para dirigir la síntesis de mARN. Como ejemplos representativos de estas secuencias de control de expresión se pueden citar el promotor LTR o SV40, el E. coli lac o trp, el promotor P_{L} lambda fago y otros promotores conocidos para controlar la expresión de genes en células procariotas o eucariotas o en sus virus. Las regiones de los promotores se pueden elegir a partir de cualquier gen deseado utilizando vectores CAT (cloramfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores seleccionables. Dos vectores adecuados son pKK232-8 y pCM7. Como promotores bacterianos particularmente mencionados se pueden citar lacI, lacZ, T3, T7, gpt, P_{R}, P_{L} y trp. Los promotores eucariotas comprenden MV inmediato temprano, HSV timidina quinasa, SV40, temprano o tardío, LTRs de retrovirus, y metalotioneina-I de ratón. La selección del vector y promotor adecuados es algo que corresponde bien al nivel del estado de la técnica y se describe aquí la preparación de ciertos constructos de expresión recombinante particularmente preferidos que comprenden por lo menos un promotor o promotor regulado ligado operativamente con un ácido nucleico que codifica un polipéptido MRA.

Según se señala más arriba, en ciertas realizaciones el vector puede ser un vector viral como por ejemplo un vector retroviral. Por ejemplo, los retrovirus de los que se pueden derivar los vectores plásmido retrovirales comprenden, sin que esto suponga limitación, Virus de Leucemia Murina Moloney, virus de necrosis del bazo, retrovirus como Virus de Sarcoma Rous, Virus de Sarcoma Harvey, Virus de Leucosis Aviar, Virus de Leucemia de gibon, Virus de Inmunodeficiencia Humana, adenovirus, Virus de Sarcoma Mieloproliferativa y Virus Tumoral de Mama.

El vector viral comprende uno o más promotores. Como promotores adecuados que se pueden utilizar se pueden citar, sin que esto suponga limitación, LTR retroviral, promotor SV40; y el promotor citomegalovirus humano (CMV) descrito en Millar et al., Biotechniques 7:980-990 (1989) o cualquier otro promotor (por ejemplo promotores celulares como promotores celulares eucariotas inclusive, sin que esto suponga limitación, la histona, pol III y promotores de \beta-actina). Otros promotores virales que se pueden emplear son por ejemplo, sin que esto suponga limitación, promotores adenovirus, promotores de timidina quinasa (TK) y promotores parvovirus B19. La selección de un promotor adecuado será algo obvio para un experto en la materia a partir de las enseñanzas contenidas en el presente documento y pueden ser promotores regulados o promotores como los descritos anteriormente.

El vector plásmido retroviral se utiliza para transducir líneas celulares de envase para formar líneas celulares productoras. Como ejemplo de células de envase que se pueden transfectar, se pueden citar, sin que esto suponga limitación, las líneas celulares PE501, PA317, \psi-2, \psi-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, \psiCRE, \psiCRIP, GP+E-86, GP-envAm12, y DAN tal como se describe en Miller, Human Gene Therapy, 1:5-14 (1990), que se incorpora aquí a modo de referencia en su totalidad. El vector puede transducir las células de envase a través de cualquier medio conocido en el estado de la técnica. Estos medios incluyen, sin que esto suponga limitación, electroporación, la utilización de liposomas y la precipitaron de fosfato cálcico. En una alternativa, el vector plásmido retroviral puede encapsularse dentro de una liposoma, o acoplarse a un lípido y luego administrarse a un huésped.

La línea celular productora genera partículas de vector retroviral infeccioso que comprenden la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos que codifica(n) los polipéptidos MRA o proteínas de fusión. Estas partículas de vector retroviral se pueden utilizar entonces para transducir células eucariotas, in vitro o in vivo. Las células eucariotas transducidas expresarán la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos que codifica(n) el polipéptido MRA o la proteína de fusión. Las células eucariotas que se pueden transducir comprenden, sin que esto suponga limitación, células madres embrionarias, células de carcinoma embrionario así como células madres hematopoyéticas, hepatocitos, fibroblastos, mioblastos, queratinocitos, células endoteliales, células epitelialbronquiales y otras varias líneas celulares adaptadas al cultivo.

Como ejemplo adicional de una realización de la invención en la cual se utiliza un vector viral para preparar el constructo de expresión MRA recombinante, en una realización preferida, las células huéspedes transducidas por un constructo viral recombinante que dirige la expresión de polipéptidos MRA o proteínas de fusión pueden producir partículas virales que contienen polipéptidos MRA expresados o proteínas de fusión derivadas de partes de la membrana de una célula huésped incorporada por las partículas virales durante la gemación viral. En otra realización preferida, las secuencias de ácido nucleico codificador de MRA se clonan en un vector transportador de baculovirus, que se recombina entonces con un baculovirus para generar un constructo de expresión de baculovirus recombinante que se utiliza para infectar, por ejemplo células huéspedes Sf9, tal como se describe en Baculovirus Expresión Protocols, Methods in Molecular Biology Vol. 39. C.D. Richardson, Editor, Human Press, Totowa, NJ, 1995; Piwnica-Worms, "Expresión of Proteins in Insect Cells Using Baculoviral Vectors," Section II in Chapter 16 in: Short Protocols in Molecular Biology, 2nd Ed., Ausubel et al., eds. John Wiley & Sons, Nueva York, Nueva York, 1992, páginas 16-31 a 16-48. En otro aspecto, la presente invención se refiere a células huéspedes que contienen lo constructos de expresión de MRA recombinante descritos anteriormente. Las células huéspedes son diseñadas genéticamente (transducidas, transformadas o transfectadas) con los vectores y/o constructos de expresión de la presente invención, que pueden ser por ejemplo un vector de clonación, un vector transportador o un constructo de expresión. El vector o constructo puede tener por ejemplo la forma de un plásmido, una partícula viral, un fago, etc. Las células huéspedes modificadas por ingeniería genética se pueden cultivar en medios nutrientes convencionales modificados en la forma adecuada para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar genes particulares, como los genes que codifican polipéptidos de MRA o proteínas de fusión de MRA. Las condiciones del cultivo para células huéspedes particulares seleccionadas para la expresión tales como la temperatura, el pH y similares, son bien conocidas del experto en la materia.

La célula huésped puede ser una célula eucariota superior, como una célula de mamífero o una célula eucariota inferior, como una célula de levadura, o la célula huésped puede ser una célula procariota, como una célula bacteriana. Los ejemplos representativos de células huéspedes adecuadas según la presente invención comprenden, sin que esto suponga limitación, células bacterianas como E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; células fúngicas como levaduras; células de insectos como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, células animales como células CHO, COS o 293, adenovirus; células vegetales o cualquier célula adecuada ya adaptada a la propagación in vitro o establecidas de novo. La selección de un huésped adecuado es algo que entra dentro del ámbito de las enseñanzas de la presente invención así como de los expertos en la materia.

Se pueden utilizar también diversos sistemas de cultivo celular de mamífero para expresar proteína recombinante. La invención se centra por lo tanto en parte en un método para producir un polipéptido de MRA recombinante, cultivando una célula huésped que comprende un constructo de expresión recombinante, que comprende por lo menos un promotor operativamente ligado a una secuencia de ácido nucleico que codifica un MRA. En ciertas realizaciones, el promotor puede ser un promotor regulado, según se indica aquí, por ejemplo un promotor de tetracilcina-represible. En ciertas realizaciones, el constructo de expresión recombinante es un constructo de expresión viral recombinante tal como se indica aquí. Como ejemplos de sistemas de expresión de mamíferos se pueden citar las líneas COS-7 de fibroblastos de riñón de mono, descritas por Gluzman, Cell 23:175 (1981), y otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible, las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamífero comprenderán un origen de replicación, un promotor y un potenciador adecuado, así como zonas de fijación de ribosoma necesarias, zonas de poliadenilación, zonas de donante y aceptante de unión, secuencias de terminación transcripcional y secuencias no transcritas de flanqueo de 5' tal como se describe aquí, en relación con la preparación de construítos de expresión de MRA. Las secuencias de ADN derivadas del empalme/unión SV40 y las zonas de poliadenilación se pueden utilizar para proporcionar los elementos genéticos no transcritos requeridos. La introducción del constructo en la célula huésped se puede realizar utilizando toda una serie de métodos que conocen bien los expertos en la materia, inclusive, sin que esto suponga limitación, por ejemplo, transfección de fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano o electroporación (Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology).

Los polipéptidos antigénicos afines a la mesotelina, recombinantes expresados (o polipéptidos de mesotelina) o proteínas de fusión derivadas de los mismos, pueden resoltar útiles como inmunógenos en forma de células huéspedes intactas; organelas intactas como membranas celulares, vesículas intracelulares u otras organelas celulares; o preparaciones celulares rotas, que incluyen, sin que esto suponga limitación, homogenatos o lisatos celulares, vesículas de membrana uni- y multilaminal u otras preparaciones. Alternativamente, los polipéptidos antigénicos afines a la mesotelina, recombinantes expresados (o polipéptidos de mesotelina) o proteínas de fusión se pueden recuperar y purificar a partir de cultivos celulares recombinantes utilizando métodos que comprenden precipitación de etanol o sulfato de amonio, extracción de ácido, cromatografía por intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía por interacción hidrófoba, cromatografía por afinidad que incluye cromatografía por inmunoafinidad, cromatografía hidroxilapatita y cromatografía por lectina. Las etapas de replegado de proteína (refolding) se pueden utilizar, en la medida de lo necesario, para completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, se puede utilizar cromatografía de líquido de alto rendimiento (HPLC) para las etapas de purificación final. Los polipéptidos antigénicos afines a la mesotelina, recombinantes expresados (o polipéptidos de mesotelina) o proteínas de fusión también pueden resultar útiles como antígenos-blanco en cierto número de configuraciones de ensayo para el cribado rutinario de anticuerpos, que pueden realizar fácilmente los expertos en la materia.

El polipéptido antigénico afín a la mesotelina (o polipéptido de mesotelina) que es un inmunógeno para la producción de un anticuerpo específico, que se utiliza en el método de la presente invención puede ser por lo tanto un producto purificado naturalmente, o un producto derivados de procedimientos de síntesis química o producido por técnicas recombinantes a partir de un huésped procariota o de preferencia, un huésped eucariota. Según el huésped utilizado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden glicosilarse o modificarse post-traduccionalmente de otro modo, según se sabe en el estado de la técnica y como se describe aquí.

Según la presente invención un polipéptido antigénico afín a la mesotelina humana soluble (o polipéptido de mesotelina) se puede detectar en una muestra biológica de un sujeto o fuente biológica. Las muestras biológicas se pueden obtener a partir de una muestra de sangre, muestra de biopsia, explante de tejido, cultivo de órgano, fluido biológico o cualquier otra preparación celular o hística de un sujeto o fuente biológica. El sujeto o fuente biológica puede ser un ser humano o un animal, una línea celular adaptada a cultivo o un cultivo celular primario, inclusive, sin que esto suponga limitación, líneas celulares genéticamente modificadas que pueden contener secuencias de ácidos nucleicos recombinantes episomales o cromosómicamente integradas, líneas celulares inmortalizadas o inmortalizables, líneas celulares híbridas de células somáticas, líneas celulares diferenciadas o diferenciables, líneas celulares transformadas y similares. En ciertas realizaciones preferidas de la invención, el sujeto o fuente biológica pueden ser sospechosos de tener, o presentar el riesgo de tener un cuadro clínico maligno, y en ciertas realizaciones preferidas de la invención el sujeto o fuente biológica puede estar libre de riesgo o no presentar dicho cuadro clínico.

En realizaciones preferidas, la muestra biológica es un fluido biológico que contiene un polipéptido afín a la mesotelina, humano, soluble. Los fluidos biológicos suelen ser líquidos a temperaturas fisiológicas y pueden comprender fluidos que se presentan de modo natural que se encuentran en, se toman de, se expresan o se extraen de alguna otra forma de un sujeto o fuente biológica. Ciertos fluidos biológicos derivan de tejidos particulares, órganos o regiones localizadas y otros fluidos biológicos pueden estar situados de forma más global o sistémica en un sujeto o fuente biológica. Como ejemplo de fluidos biológicos se pueden mencionar la sangre, el suero y los fluidos serosales, plasma, linfa, orina, fluido cerebro espinal, saliva, secreciones mucosales de los tejidos y órganos secretores, secreciones vaginales, fluidos de ascitis como los asociados con tumores no sólidos, fluidos de las cavidades pleurales, pericardiales, peritoneales, abdominales y otras cavidades corporales y similares. Los fluidos biológicos pueden incluir también soluciones líquidas en contacto con un sujeto o fuente biológica, p. ej. medios de cultivo de órganos y células que incluyen medios condicionados para células u órganos, fluidos de lavado y similares. En ciertas realizaciones muy preferidas, la muestra biológica es suero y otras realizaciones muy preferidas la muestra biológica es plasma. En otras realizaciones preferidas la muestra biológica es una solución líquida, libre de células.

En otras realizaciones preferidas, la muestra biológica comprende una célula intacta, y en otras realizaciones preferidas la muestra biológica comprende un extracto de célula que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido antigénico afín a la mesotelina que tiene la secuencia de aminoácido indicada en SEQ ID NO: 1 ó 2, o un fragmento o variante de la misma.

Una "molécula que se presenta de modo natural en forma soluble" en una muestra puede ser una proteína soluble, polipéptido, péptido, aminoácido o derivado de los mismos; un lípido, ácido graso o similar o derivado de los mismos; un carbohidrato, sacárido o similar o derivado de los mismos; un ácido nucleico, nucleótido, nucleósido, purina pirimidina o molécula afín o derivado de los mismos, o similares o cualquier combinación de los mismos como, por ejemplo, una glicoproteína, un glicolípido, una lipoproteína, un proteolípido, o cualquier otra molécula biológica soluble o constituyente libre de células de una muestra biológica como se describe aquí. Una "molécula que se presenta de modo natural en forma soluble" se refiere además a una molécula que se encuentra en solución o presente en una muestra biológica, que comprende un fluido biológico tal como se describe aquí, y no está unida a la superficie de una célula intacta. Por ejemplo, una molécula que se presenta de modo natural en forma soluble puede incluir, aunque no necesariamente un soluto; un componente de un complejo macromolecular; un material desprendido, secretado o exportado de una célula; un coloide; una micropartícula o nanopartícula u otra partícula de suspensión fina;
o similares.

La presencia de un cuadro clínico maligno en un sujeto se refiere a la presencia de células transformadas y/o cancerosas, displásicas en el sujeto, inclusive, por ejemplo células neoplásicas, tumorales, transformadas oncogenéticamente o inhibidas sin contacto, o similares. A modo de ilustración y no de limitación, dentro del contexto de la presente invención, un cuadro clínico maligno se puede referir además a la presencia en un sujeto de células cancerosas capaces de secretar, desprender, exportar o liberar un polipéptido antigénico afín a la mesotelina (o polipéptido de mesotelina) de modo que se pueden detectar niveles elevados de dicho polipéptido en una muestra biológica del sujeto. En realizaciones preferidas, por ejemplo, estas células cancerosas son células epiteliales malignas como células de carcinoma y, en realizaciones particularmente preferidas, estas células cancerosas son células de mesotelioma maligno, que son variantes transformadas de células mesoteliales o epiteliales de células escamosas que se encuentran por ejemplo recubriendo cavidades pleurales, pericardiales, peritoneales, abdominales y otras cavidades corporales.

En las realizaciones más preferidas de la invención, las células tumorales, cuya presencia significa la presencia de un cuadro clínico maligno, son células de carcinoma de ovario, inclusive células de carcinoma de ovario metastásico y primario. Los criterios para clasificar el carácter maligno de un carcinoma de ovario es algo bien conocido en el estado de la técnica (véase por ejemplo Bell et al., 1998 Br. J. Obstect. Gynaecol. 105:1136; Meier et al., 1997 Anticancer Res. 17 (4B):3019; Meier et al., 1997 Anticancer Res. 17(4B):2949; Cioffi et al., 1997 Tumori 83:594; y las referencias aquí citadas), como el establecimiento y la caracterización de líneas celulares de carcinoma de ovario humano de tumores metastásicos y primarios (por ejemplo OVCAR-3 Amer. Type culture Collection, Manassas, VA; Yuan et al., 1997 Gynecol. Oncol. 66:378). En otras realizaciones, el cuadro clínico maligno puede ser mesotelioma, carcinoma pancreático, carcinoma pulmonar amicrocítico y otras formas de cáncer, inclusive cualquiera de los diversos carcinomas como carcinomas celulares escamosos y adenocarcinomas, y comprende también sarcomas y estados malignos hematológicos (por ejemplo leucemia, linfomas, mielomas, etc). La clasificación de estos y otros cuadros clínicos malignos es algo bien conocido por los expertos en la materia y la presente descripción ofrece la determinación de la presencia de un polipéptido de mesotelina, que incluye la determinación de la presencia de un polipéptido de MRA en un cuadro clínico maligno sin experimentación innecesaria.

Tal como se indica aquí, el método de cribado para detectar la presencia de un cuadro clínico maligno en un sujeto, puede presentar la utilización de un anticuerpo específico de un polipéptido antigénico afín a la mesotelina humana, o un anticuerpo específico de polipéptido de mesotelina humana.

Los anticuerpos específicos de un polipéptido antigénico afín a la mesotelina (o polipéptido de mesotelina (o polipéptido de mesotelina) se generan fácilmente como anticuerpos monoclonales o como antisueros policlonales o se pueden producir como inmunoglobulinas modificadas genéticamente (Ig) diseñadas para presentar propiedades deseables utilizando métodos bien conocidos en el estado de la técnica. Por ejemplo, a modo de ilustración y no de limitación, los anticuerpos pueden incluir proteínas de fusión híbridas IgGs recombinantes que tienen secuencias derivadas de inmunoglobulina o anticuerpos "humanizados" (véase por ejemplo patente US 5.693.762; 5.585.089; 4.816.567; 5.225.539; 5.530.101; y las referencias aquí citadas) que se pueden utilizar todos ellos para la detección de un polipéptido de mesotelina humana según la invención. Muchos de estos anticuerpos han sido descritos y se encuentran disponibles en lugares específicos o se pueden preparar tal como se indica aquí, inclusive por inmunización con polipéptidos de mesotelina tal como se describe más abajo. Por ejemplo, tal como se indica aquí, las secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos de mesotelina son conocidas por la parte de mesotelina misma asociada a la superficie celular (Chang et al., 1996) y la parte unida a la membrana de la proteína precursora (MPF) del factor que potencia el megacariocito (Kojima et al., 1995), y la presente descripción ofrece además secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos antigénicos afines a la mesotelina (MRA), como los que los expertos en la materia suelen preparar de forma rutinaria cuando los utilizan como inmunógenos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales como 4H3, 3G3 y 1A6, que se describen con mayor detalle a continuación, se pueden utilizar para realizar ciertos métodos según la presente invención. Tal como se indica más abajo, otro anticuerpo útil es MAb K-1, un anticuerpo monoclonal que reacciona con un polipéptido de mesotelina (Chang et al., 1996 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93:136; Chang et al. 1992 Int. J. Cáncer 50:373; MAb K-1 se puede obtener por ejemplo en Signet Laboratories, Inc., Dedham, MA).

El término "anticuerpo" comprende anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, fragmentos de los mismos tales como F(ab')_{2}, y fragmentos de Fab así como cualquier otro partner de fijación que se produce de modo recombinante o se presenta de modo natural, como las moléculas que fijan específicamente un polipéptido de mesotelina por ejemplo mesotelina, antígeno afín a la mesotelina (MRA) o MPF. Se dice que los anticuerpos son "inmunoespecíficos" o de fijación específica si fijan un polipéptido de mesotelina con un K_{a} superior o igual a aproximadamente 10^{4} M^{-1}, de preferencia superior o igual a aproximadamente 10^{5} M^{-1}, todavía mejor superior o igual a aproximadamente 10^{6} M^{-1}, y todavía mucho mejor superior o igual a aproximadamente 10^{7} M^{-1}. Las afinidades de partners de fijación o anticuerpos se pueden determinar fácilmente utilizando técnicas convencionales, por ejemplo las descritas por Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660 (1949). La determinación de otras proteínas como partners de fijación de un polipéptido de mesotelina se puede realizar utilizando cualquiera de los métodos conocidos para la identificación y la obtención de proteínas que interactúan con otras proteínas o polipéptidos, por ejemplo, un sistema de cribado bi-híbrido de levadura como el descrito en la patente US 5.283.173 y la US 5.468.614 o equivalente. La presente invención también comprende la utilización de un polipéptido de mesotelina y péptidos basados en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de mesotelina, para preparar partners de fijación y anticuerpos que se fijan específicamente a un polipéptido de mesotelina.

Los anticuerpos se pueden preparar en general utilizando cualquiera de las diversas técnicas conocidas por los expertos en la materia (véase por ejemplo Harlow and Lane, Antibodies: Laboratory, 1988). En una de estas técnicas se inyecta, inicialmente un inmunógeno que comprende un polipéptido de mesotelina, por ejemplo una célula que tiene un polipéptido de mesotelina en su superficie o un polipéptido de mesotelina aislado como mesotelina, MRA o MPF, en un animal adecuado (ratones, ratas, conejos, ovejas y cabras), de preferencia siguiendo un programa predeterminado que incorpora una o más inmunizaciones de refuerzo, y los animales se sangran periódicamente. Los anticuerpos policlonales específicos del polipéptido de mesotelina se pueden purificar entonces a partir de estos antisueros, por ejemplo por cromatografía por afinidad utilizando el anticuerpo acoplado a un soporte sólido adecuado.

Los anticuerpos monoclonales específicos de polipéptidos de mesotelina o variantes de los mismos se pueden preparar por ejemplo utilizando la técnica de Kohler and Milstein (1976 Eur. J. Immunol. 6:511-519) y perfeccionamientos de la misma. En suma, estos métodos suponen la preparación de líneas celulares inmortales capaces de producir anticuerpos que tienen la especificidad deseada (por ejemplo reactividad con el polipéptido de mesotelina de interés). Estas líneas celulares pueden producirse por ejemplo a partir de células de bazo obtenidas de un animal inmunizado en la forma descrita anteriormente. Las células de bazo se inmortalizan entonces por ejemplo por fusión con un partner de fusión celular de mieloma, de preferencia uno singeneico con el animal inmunizado. Por ejemplo las células de bazo y las células de mieloma pueden combinarse con un agente promotor de membrana como polietilenglicol o un detergente no iónico durante unos pocos minutos y luego cultivarse a baja densidad sobre un medio selectivo que soporta el crecimiento de células híbridas, pero no de células de mieloma. Una técnica de selección preferida utiliza selección HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Transcurrido un tiempo suficiente, por lo general de una a dos semanas aproximadamente, se observan las colonias de híbridos. Se seleccionan colonias individuales y se comprueba la actividad de fijación respecto del polipéptido. Los hibridomas con reactividad y especificidad elevada son los preferidos. Los hibridomas que generan anticuerpos monoclonales que se fijan específicamente a polipéptidos de mesotelina son los contemplados en la presente invención.

Se pueden aislar anticuerpos monoclonales de los sobrenadantes de colonias de hibridoma en cultivo. Además, se pueden utilizar diversas técnicas para potenciar el resoltado como por ejemplo la inyección de la línea celular del hibridoma en la cavidad peritoneal de un huésped vertebrado adecuado, como un ratón. Se pueden cosechar entonces anticuerpos monoclonales del fluido de ascitis del o de la sangre. Se pueden eliminar contaminantes de los anticuerpos utilizando técnicas convencionales como por ejemplo cromatografía, filtración por gel, precipitación y extracción. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden purificar por cromatografía sobre proteína G inmovilizada o proteína A utilizando técnicas standard.

Dentro de ciertas realizaciones, la utilización de los fragmentos de fijación de antígeno de anticuerpos puede ser la solución preferida. Estos fragmentos comprenden fragüentos Fab, que se pueden preparar utilizando técnicas standard (por ejemplo por digestión con papaína para obtener fragmentos de Fab y Fc). Los fragmentos de Fab y Fc se pueden separar por cromatografía por afinidad (por ejemplo sobre columnas de proteína A inmovilizada), utilizando técnicas standard. Véase p. ej. Weir, D.M., Handbrook of Experimental Immunology, 1986, Blackwell Scientific, Boston.

En el estado de la técnica se conocen proteínas de fusión multifuncionales que tienen afinidades de fijación específicas por antígenos preseleccionados en virtud de unos dominios de región V de inmunoglobulina codificados por secuencias de ADN ligadas y n-frame (en marco de altura) a secuencias que codifican diversas proteínas efector, por ejemplo, según se describe en el documento EP-B1-0318554, patentes US 5.132.405, 5.091.513 y 5.476.786. Estas proteínas efector incluyen dominios polipeptídicos que se pueden utilizar para detectar la fijación de la proteína de fusión mediante una de las diversas técnicas que conocen los expertos en la materia, inclusive, sin que esto suponga limitación, a una secuencia mimética de biotina (véase por ejemplo Luo et al., 1998, J. Biotechnol. 65:225 y referencias aquí citadas), modificación covalente directa con una mitad de rotulación detectable, fijación no covalente a una molécula indicadora rotulada específica, modificación enzimática de un sustrato detectable o inmovilización (covalente o no covalente) sobre un soporte de fase sólida.

Los anticuerpos de cadena simple que se utilizan en la presente invención pueden generarse también y elegirse mediante un método como display fago (véase por ejemplo patente US 5.223.409; Schlebusch et al., 1997, Hybridoma 16: 47; y referencias aquí citadas). En suma, en este método, se insertan secuencias de ADN en el gen III génico o VIII génico de un fago filamentoso como M13. Se han desarrollado para la inserción diversos vectores con zonas de multiclonación (McLafferty et al., Gene 128:29-36, 1993; Scott and Smith, Science 249:386-390, 1990; smith and Scott, Methods Enzymol. 271:228-257, 1993). Las secuencias de ADN insertadas se pueden generar aleatoriamente o pueden ser variantes de un conocido dominio de fijación para la fijación a un polipéptido de mesotelina. Estos anticuerpos de cadena única se pueden generar fácilmente utilizando este método. Por lo general, los insertos codifican de 6 a 20 aminoácidos. El péptido codificado por la secuencia insertada se visualiza sobre la superficie del bacteriófago. Los bacteriófagos que expresan un dominio de fijación para un polipéptido de mesotelina se eligen utilizando la fijación a un polipéptido de mesotelina inmovilizado, por ejemplo un polipéptido recombinante preparado utilizando métodos conocidos en el estado de la técnica y secuencias de codificación de ácido nucleico tal como describen Chang et al. (1996 Proc. Nat. Acad. USA 93:136) o por Kojima et al. (1995 J. Biol. Chem. 270:21984). El fago no fijado se elimina por lavado, y suele contener 10 mM Tris, 1 mM EDTA, y sin sal o con una concentración de sal baja. El fago fijado se eluye con un tampón que contiene sal, por ejemplo. La concentración de NaCl se incrementa de forma gradual hasta que se ha eluido la totalidad del fago. Por lo general, el fago que se fija con afinidad superior será liberado con concentraciones de sal más elevadas. Los fagos eluidos son propagados en el interior del huésped bacteriano. Se pueden realizar otras tandas de selección para elegir los pocos fagos que se fijan con afinidad elevada. La secuencia de ADN del inserto en el fago de fijación se determina entonces. Una vez conocida la secuencia de aminoácidos prevista del péptido de fijación, se puede obtener péptido suficiente que se utiliza aquí como anticuerpo específico de un polipéptido de mesotelina humana utilizando medios recombinantes o de forma sintética. Los medios recombinantes se utilizan cuando el anticuerpo se produce como proteína de fusión. El péptido puede generarse también como conjunto aleatorio de dos o más péptidos similares o disimilares con el objeto de maximizar la afinidad o la fijación.

Para detectar un determinante antigénico que reacciona con un anticuerpo específico de un polipéptido de mesotelina humana, el reactivo de detección suele ser un anticuerpo que se puede preparar en la forma aquí descrita. Los expertos en la materia conocen toda una serie de formatos de conjuntos que utilizan un anticuerpo para detectar polipéptido en una muestra, inclusive, sin que esto suponga limitación, el ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), inmunofluorimetría, inmunoprecipitación, diálisis de equilibrio, inmunodifusión y otras técnicas. Véase Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Weir, D.M. Handbook of Experimental Immunology, 1986, Blackwell Scientific, Boston. Por ejemplo, el ensayo se puede realizar en un formato de transferencia Western, donde una preparación de proteína de la muestra biológica se somete a electrofóresis por gel, se transfiere a una membrana adecuada y se deja reaccionar con el anticuerpo. La presencia del anticuerpo en la membrana se puede detectar entonces utilizando un reactivo de detección adecuado, bien conocido en el estado de la técnica y que se describe a continuación.

En otra realización, el ensayo comprende la utilización de un anticuerpo inmovilizado sobre un soporte sólido para fijarlo al polipéptido de mesotelina "blanco" y quitarlo del resto de la muestra. El polipéptido de mesotelina fijado se puede detectar entonces utilizando un segundo anticuerpo que reacciona con un determinante antigénico de polipéptido de mesotelina distinto, por ejemplo un reactivo que contiene una mitad indicadora detectable. Como ejemplo no limitativo, según la presente realización, el anticuerpo inmovilizado y el segundo anticuerpo que reconoce determinantes antigénicos distintos pueden ser cualquiera de los dos anticuerpos monoclonales aquí descritos, elegidos entre los anticuerpos monoclonales OV569, 4H3, 3G3 y 1A6. Alternativamente, se puede utilizar un ensayo competitivo en el que se rotula un polipéptido de mesotelina con una mitad indicadora detectable y se deja que se fije al anticuerpo específico del anticuerpo del polipéptido de mesotelina inmovilizado tras la inmovilización del anticuerpo inmovilizado con la muestra. La medida en la que los componentes de la muestra inhiben la fijación del polipéptido rotulado al anticuerpo es indicadora de la reactividad de la muestra con el anticuerpo inmovilizado y por lo tanto indicadora del nivel de mesotelina en la muestra.

El soporte sólido puede ser cualquier material conocido en el estado de la técnica al que el anticuerpo se puede fijar, como un pocillo de prueba en una placa de microvaloración, un filtro de nitrocelulosa u otra membrana adecuada. Alternativamente, el soporte puede ser una perla o disco, como un cristal, fibra de vidrio, látex o un plástico como poliestireno o policloruro de vinilo. El anticuerpo se puede inmovilizar sobre el soporte sólido utilizando toda una serie de técnicas conocidas en el estado de la técnica, descrita repetidas veces en la literatura científica y las
patentes.

En ciertas realizaciones preferidas, el ensayo para la detección de polipéptido antigénico afín a la mesotelina en una muestra es un ensayo sandwich de dos anticuerpos. Este ensayo puede realizarse poniendo primero en contacto un anticuerpo específico del polipéptido antigénico afín a la mesotelina (p. ej. un anticuerpo monoclonal como OV569, 1A6, 3G3 o 4H3) que ha sido inmovilizado sobre un soporte sólido, por lo general el pocillo de una placa de microtaloración, con la muestra biológica, de modo que se deja que se fije una molécula soluble que se presenta de modo natural en la muestra y tiene un determinante antigénico que reacciona con el anticuerpo, al anticuerpo inmovilizado (p. ej. resulta por lo general suficiente un tiempo de incubación de 30 minutos a temperatura ambiente), para formar un complejo anticuerpo-antígeno o un complejo inmune. Los constituyentes no fijados de la muestra se eliminan de los complejos inmunes inmovilizados. Seguidamente se añade un segundo anticuerpo específico de un polipéptido antigénico afín a la mesotelina, en el que la zona de combinación antigénica del segundo anticuerpo no inhibe competitivamente la fijación de la zona de combinación antigénica el primer anticuerpo inmovilizado a un polipéptido antigénico afín a la mesotelina (por ejemplo un anticuerpo monoclonal como OV569, 1A6 o 4H3 no igual al anticuerpo monoclonal inmovilizado sobre el soporte sólido). El segundo anticuerpo se puede rotular de forma detectable según se indica aquí, de modo que se pueda detectar directamente. Alternativamente, el segundo anticuerpo puede detectarse indirectamente utilizando un anti-anticuerpo (o "segunda etapa") secundario rotulado de forma detectable, o utilizando un reactivo de detección específica según se indica aquí. El método objeto de la invención no se limita a un procedimiento de detección particular, y aquellas personas familiarizadas con los inmunoensayos podrán apreciar que existen numerosos reactivos y configuraciones para detectar inmunológicamente un antígeno particular (por ejemplo un polipéptido de mesotelina) en un inmunoensayo sandwich de dos anticuerpos.

En ciertas realizaciones preferidas de la invención que utilizan el ensayo sandwich de dos anticuerpos descritos anteriormente, el primer anticuerpo inmovilizado específico de un polipéptido antigénico afín a la mesotelina es un anticuerpo policlonal y el segundo anticuerpo específico de un polipéptido antigénico afín a la mesotelina es un anticuerpo policlonal. En otras realizaciones de la invención, el primer anticuerpo inmovilizado específico de un polipéptido antigénico afín a la mesotelina es un anticuerpo monoclonal y el segundo anticuerpo específico de un polipéptido antigénico afín a la mesotelina es un anticuerpo policlonal. Por ejemplo, en estas realizaciones hay que señalar que los anticuerpos monoclonales 4H3, 3G3, 1A6 y OV569 aquí mencionados reconocen determinantes antígenos distintos y no competitivos (por ejemplo epítopos) sobre polipéptidos de mesotelina como polipéptidos MRA, de tal modo que se puede utilizar una combinación en pareja de estos anticuerpos monoclonales. En otras realizaciones preferidas de la invención, el primer anticuerpo inmovilizado específico de un polipéptido antigénico afín a la mesotelina y/o el segundo anticuerpo específico de un polipéptido antigénico afín a la mesotelina pueden ser cualquiera de los anticuerpos conocidos en el estado de la técnica y mencionados aquí, por ejemplo a modo de ilustración y sin ánimo de limitación, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')_{2}, proteínas de fusión de región V de inmonuglobulina o anticuerpos de una sola cadena. Los expertos en la materia podrán apreciar que la presente invención comprende la utilización de otras formas de anticuerpos, fragmentos, derivados y similares en los métodos aquí descritos y reivindicados.

En ciertas realizaciones particularmente preferidas, el segundo anticuerpo puede contener una mitad indicadora detectable o etiqueta como una enzima, tinción, radionúclido, grupo luminiscente, grupo fluorescente o biotina, o similar. La cantidad de segundo anticuerpo que permanece fijada al soporte sólido se determina entonces utilizando un método adecuado para la mitad indicadora específica o etiqueta. Para grupos radioactivos, el recuento por centelleo o métodos autoradiográficos son por lo general adecuados. Se pueden preparar conjuntados enzima-anticuerpo utilizando una variedad de técnicas de acoplamiento (para hacerse una idea general, véase por ejemplo Scouten, W.H. Methods in Enzymology 135:30-65, 1987). Se pueden utilizar métodos espectroscópicos para detectar tinciones (inclusive por ejemplo productos colorimétricos de reacciones enzimáticas) grupo luminescentes y grupos fluorescentes. La biotina se puede detectar utilizando avidina o estreptavidina, acopladas en un grupo indicador diferente (por lo general un grupo radioactivo o fluorescente o una enzima). Los grupos indicadores de enzima se pueden detectar por lo general mediante la adición de sustrato (por lo general durante un período específico de tiempo), seguido de análisis espectroscópico, espectrofotométricos u otros análisis de los productos de reacción. Los estándares y las adiciones standard se pueden utilizar para determinar el nivel de polipéptido de mesotelina en una muestra, utilizando técnicas bien conocidas.

En otra realización, la invención contempla la utilización de un polipéptido antigénico afín a la mesotelina tal como se describe aquí, para cribar y detectar la presencia de un cuadro clínico maligno mediante la detección de anticuerpos inmunoespecíficamente reactivos en una muestra biológica procedente de una fuente biológica o sujeto. Según esta realización, un polipéptido antigénico afín a la mesotelina (o un fragmento o variante del mismo, inclusive un polipéptido truncado antigénico afín a la mesotelina según lo descrito aquí) está rotulado de forma detectable y se pone en contacto con una muestra biológica para detectar la fijación al polipéptido antigénico afín a la mesotelina de un anticuerpo que se presenta de modo natural en forma soluble en la muestra. Por ejemplo, el polipéptido antigénico afín a la mesotelina puede esta rotulado biosintéticamente, utilizando las secuencias aquí descritas junto con métodos bien conocidos como la incorporación durante la traducción in vitro de un aminoácido fácilmente detectable (por ejemplo rotulado radiactivamente) o utilizando otras mitades indicadoras detectables como las descritas anteriormente. Sin atenernos únicamente a la teoría, la presente realización de la invención contempla la posibilidad de que ciertos polipéptidos de mesotelina como los polipéptidos MRA aquí descritos, que presentan secuencias de marco desplazado resultantes de inserciones en -marco de secuencias de codificación a nivel del ácido nucleico, proporcionen péptidos particularmente inmunogénicos dando lugar de este modo a anticuerpos específicos y detectables. Por ejemplo, según esta teoría, ciertos polipéptidos MRA pueden representar antígenos "no-self" que provocan una respuesta inmune ávida mientras que lo polipéptidos de mesotelina que carecen de inserciones en -marco (por ejemplo MPF o mesotelina) pueden ser consideradas por el sistema inmune como antígenos "self" que no suscitan fácilmente inmunidad humoral o mediada por célula.

Según lo indicado anteriormente, la presente invención se debe en parte al resultado sorprendente de que las formas solubles de polipéptidos antigénicos afines a la mesotelina humana se presentan de modo natural en sujeto, incluyendo niveles elevados de dichos polipéptidos de mesotelina solubles en sujetos que tienen ciertos carcinomas.

Un método para cribar la presencia de un estado clínico maligno según la presente invención se puede potenciar además con la detección de más de un marcador asociado a tumor en una muestra biológica de un sujeto. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la presente invención presenta un método de cribado que, además de detectar la reactividad de un componente de muestra soluble que se presenta de modo natural, con un anticuerpo específico de polipéptido antigénico afín a la mesotelina, incluye también la detección de por lo menos un marcador soluble adicional de un cuadro clínico maligno utilizando métodos establecido conocidos en el estado de la técnica y descritos aquí. Según se indica anteriormente, existen en la actualidad cierto número de antígeno asociados a tumores solubles que se pueden detectar en muestras de fluidos biológicos obtenidos fácilmente. Estos incluyen, sin que esto suponga limitación, CEA, CA125, sialil TN, SCC, TPS y PLAP, (véase por ejemplo Bast et al., 1983 N. Eng. J. Med. 309:883; Lloyd et al., 1997 Int. J. Canc. 71:842; Sarandakou et al., 1997 Acta Oncol. 36:755; Sarandakou et al., 1998 Eur. J. Gynaecol. Oncol. 19:73; Meier et al., 1997 Anticanc. Res. 17(4B):2945; Kudoh et al., 199 Gynecol. Obstet. Invest. 47:52; Ind et al., 1997 Br. J. Obstet. Gynaecol. 104:1024; Bell et al. 1998 Br. J. Obstet. Gynaecol. 105:1136; Cioffi et al., 1997 Tumori 83:594; Meier et al., 1997 Anticanc,. Res. 17(4B): 2949; Meier et al., 1997 Anticanc. Res. 17(4B):3019) y pueden incluir además cualquier marcado conocido cuya presencia en una muestra biológica se puede correlacionar con la presencia de por lo menos un cuadro clínico maligno, según lo que se describe aquí.

Alternativamente, se pueden detectar secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos antigénicos afines a la mesotelina utilizando técnicas de hibridación standard y/o de reacción en cadena de polimerasa (PCR). Los expertos en la materia pueden diseñar sondas e iniciadores adecuados sobre la base de las secuencias cADN antigénicas afines a la mesotelina que aquí se presentan. Los ensayos se pueden realizar en general utilizando cualquier tipo de muestra obtenida de una fuente biológica, como células eucariotas, bacterias, virus, extractos preparados a partir de estos organismos y fluidos encontrados dentro de organismos vivos.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y en ningún modo suponen una limitación.

Ejemplos Ejemplo 1 Anticuerpo monoclonal OV569 específico de polipéptidos de mesotelina

El presente ejemplo describe la generación de un anticuerpo monoclonal de murino (Mab), OV569, seguido de inmunización con células de ascitis maligna humana procedentes de carcinoma de ovario. Las células que se utilizan como inmunógenos eran células no fraccionadas recuperadas de fluidos de ascitis peritoneal de un paciente con cáncer de ovario maligno, por centrifugación, que se almacenaron y lavaron en nitrógeno líquido hasta su utilización. Se inmunizaron ratones BALB/c (aprox. de 3 meses de edad), un total de siete veces a intervalos de 14 días con 1 x 10^{7} células de carcinoma de ovario descongeladas por inmunización; no se utilizó adyuvante. Para la inmunización inicial, se inyectó a los ratones tanto por vía intraperitoneal (i.p.) como subcutánea (s.c.) mientras que para las seis inmunizaciones restantes, se administraron inyecciones de células descongeladas únicamente i.p. cuatro días después de la última inmunización, se quitó el bazo de un ratón, se descuartizó para formar una sola suspensión celular en medio de cultivo IMDM (Gibco BRL, Grand Island, NY) y los esplenocitos se condensaron ulteriormente en células de mieloma P3x63Ag8.653 (CRL 1580, ATCC, Rockville, MD) según lo descrito anteriormente utilizando 40% de polietilenglicol (PEG) como agente de condensación (Yeh et al., 1979 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 76:2927). Tras la hibridación, se diluyeron las suspensiones celulares condensadas para formar cultivos de baja densidad, de preferencia procedentes de células individuales, y se sembraron en placas de 96 pocillos (Falcon, Linden Park, NY) en medio selectivo que contenida 10% de factor de crecimiento de hibridoma (Igen Inc., Gaithersburg, MO), 10% de suero bovino fetal, 2% HAT y 0,25% de geneticina (Yeh et al., 1979).

Se cribaron los sobrenadantes de cada pocillo para detectar la presencia de anticuerpos capaces de fijarse en las células de ascitis de carcinoma de ovario utilizadas para inmunizaciones, a células de carcinoma de ovario cultivadas de otros pacientes y a fibroblastos humanos cultivados, utilizando un ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA) como el que describe Douillard et al., (1983 Meth. Enzymol. 92:168). Las células de hibridoma que produjeron anticuerpos que se fijaron a las células de cáncer de ovario humano pero no a lo fibroblastos humanos cultivados se clonaron dos veces limitando la dilución, se volvió a comprobar la reactividad específica de anticuerpo sobrenadante con las células de cáncer de ovario (y la no reactividad con células procedentes de una variedad de tejidos humanos normales) y se expandieron in vitro. Se purificaron los anticuerpos de sobrenadante de hibridoma por cromatografía por afinidad en proteína A inmovilizada (RepliGen, Cambrisge, MA), utilizando solución salina con tampón de fosfato (PBS) como tampón y elución de bajo pH seguido de neutralización según lo recomendado por el proveedor, tras lo cual se esterilizaron en filtro y se almacenaron a -70ºC hasta su utilización.

Uno de estos anticuerpos de hibridoma monoclonales que se fijan a células de carcinoma de ovario pero no a fibroblastos normales recibió el nombre de OV569. Se determinó por ELISA que el anticuerpo monoclonal (MAb) OV569 era el isotipo de IgGl de murino. En suma, se revistieron durante la noche a 4ºC unos pocillos de una placa de 96 pocillos Immunolon (Dynatech, Chantilly, VA), con anticuerpos de cabra (1 \mug/ml en PBS) específico de las diferentes subclases IgG de ratón (Southern Biotech, Birmingham, AL), se bloquearon y se usaron para probar varias diluciones de sobrenadante de hibridoma OV569 según un procedimiento descrito (Yeh et al., 1979 Proc. Nat,. Acad. Sci. USA 76:2927).

Ejemplo 2 Anticuerpos monoclonales de segunda generación específicos de antígeno de carcinoma de ovario reconocidos por OV569

Se generó y se seleccionó un segundo conjunto de hibridomas para la producción de anticuerpos que se fijan a la molécula antigénica reconocida por MAb OV569, aunque a través del reconocimiento de epítopos antigénicos distintos de los utilizados por OV569. Para utilizarlo como antígeno para lograr la segunda generación de MAbs, se purificó por afinidad el antígeno de fijación de OV569, de los sobrenadantes de cultivos celulares de carcinoma de pulmón y de ovario humano establecidos a partir de tumores extirpados quirúrgicamente (tal como se describe por ejemplo en Hellstrom et al., 1990 Cancer Res. 50:2183) o tras la recogida de fluidos pleurales o de ascitis utilizando una columna de MAb OV569 inmovilizado. En suma, se añadió 9,2 mg de OV569 a 1,5 g de Sefarosa 4B activada por bromuro de cianógeno (Sigma, St. Louis, MO) y la columna se lavó y se equilibró para utilizarla siguiendo el protocolo del proveedor. El material de partida del que se tenía que purificar antígeno (p. ej. sobrenadante de cultivo aclarado por centrifugación) se hizo pasar a través de la columna, y después la columna se lavó con 0,01 M 0,02% NaN_{3} en PBS, pH 7,2 hasta que no se detectó en el efluente de la columna ningún material con absorbancia a 280 nm. Se eluyó entonces antígeno soluble específicamente fijado a la columna de MAb OV569 utilizando un tampón de elución con un pH de 2,6 (glicina HCl - 0,1 M, pH 2,6, NaCl 0,15 M). El eluato se recogió en un volumen de 2 ml, se neutralizó con tampón Tris-HCl 2,5 M, pH 8,8 y se cuantificó por determinación espectrofotométrica de absorbancia 280 nm y 260 nm.

El antígeno OV569 purificado por afinidad (30 \mug de proteína en 0,1 ml) se mezcló con 0,1 ml de adyuvante Ribi (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT) y la mezcla se inyectó en ratones BALB/c de tres meses de edad en dos zonas, s.c., seguido, 14 días después, de una primea inmunización de refuerzo, que se administró i.p. Para las inmunizaciones de refuerzo, el adyuvante Ribi se mezcló con antígeno purificado por cromatografía por afinidad OV569 a partir del sobrenadante de células de carcinoma de pulmón cultivadas H4013 (una línea celular de carcinoma establecido utilizando los métodos descritos p. ej. por Hellstrom et al., 1990 Cancer Res. 50:2183). Catorce días después de la administración de la tercera, en una serie de tres inmunizaciones de refuerzo (cada una de las cuales se administró con 14 días de intervalo), se sometió a los ratones a un refuerzo final inyectando intravenosamente el antígeno (i.v.) sin adyuvante.

Tres días después del refuerzo final, se extirparon los bazos y se realizaron fusiones celulares tal como se describe más arriba en el Ejemplo 1 para MAb OV569. Los sobrenadantes de las células de hibridoma resultante se comprobaron para detectar la presencia de anticuerpos capaces de fijar a antígeno-blanco inmovilizado sobre placas de 96 pocillos de plástico utilizando métodos convencionales ELISA (Current Protocols in Immunology, J.E. Coligan et al., (Eds) 1998 John Wiley & Sons, NY). El antígeno-blanco era (i) antígeno OV569 purificado por afinidad (el antígeno de inmunización) preparado en la forma descrita anteriormente; o (ii) D2hIg, una proteína de fusión de inmunoglobulina que consta de aminoácidos 294-628 de la parte fijada a la membrana de mesotelina (Chang et al., 1996 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93:136) condensada con una región constante de inmunoglobulina utilizando un vector descrito que codifica una secuencia de Ig humana (Hollenbaugh et al., 1995 J. Immunol. Meth 188:1-7) y purificada por cromatografía por afi-
nidad de proteína A/G (ImmunoPure A/G, Pierce Chemicals, Rockford, IL) siguiendo las instrucciones del proveedor.

Se volvieron a someter a prueba los sobrenadantes positivos mediante ELISA para confirmar la reactividad y se cribaron ulteriormente en un inmunoensayo de competición de fijación ELISA modificado. En suma, en este ensayo, el antígeno de fijación OV569, purificado por afinidad según lo descrito anteriormente, se inmovilizó en pocillos de placas de 96 pocillos. Los pocillos recibieron sobrenadante de cada hibridoma positivo y 50 \mul (400 ng) de MAb OV569 biotinilado se prepararon por biotinilación según Weir, D.M. Handbook of Experimental Immunology (1986, Blackwell Scientific, Boston), para una etapa de incubación por competición de fijación (1 hora a temperatura ambiente) seguido de lavado con PBS y una etapa de detección utilizando 50 \mul de HRP-estreptavidina (PharMingen, San Diego, CA), se diluyeron siguiendo las recomendaciones del proveedor. Este ensayo se eligió para MAb que reconoce epítopos diferentes del reconocido por OV569 en virtud de su incapacidad para inhibir la fijación de biotina-MAb OV569. Los sobrenadantes testados en este ensayo de competición se testaron también utilizando también un juego paralelo de placas de control revestidas con el antígeno de fijación OV569 purificado por afinidad para confirmar la fijación del anticuerpo del hibridoma al antígeno OV569. Se identificaron tres hibridomas designados 4H3, 3G3 y 1A6 que produjeron anticuerpos capaces de fijarse a antígeno purificado por afinidad de D2hlg y OV569 de sobrenadantes de cultivo de carcinoma pulsitivo cultivado OV569, y que no competían con el OV569 MAb. Estos tres hibridomas se clonaron, se expandieron y transplantaron en ratones singeneicos para establecer tumores de ascitis productores de anticuerpo. El IgG1
MAb designado 4H3 se utilizó con OV569 en un ensayo determinante doble ("ELISA sandwich") descrito más abajo.

Ejemplo 3 Expresión de antígeno de carcinoma de ovario OV569 en superficies celulares de tumores humanos

Este ejemplo describe la caracterización inmunohistológica de la expresión del antígeno definido por MAb OV569. Se empleó una modificación de la técnica de inmunoperoxidasa (Sternberger, In: Immunocytochemistry, pp.104-169, John Wiley & Son, Inc. New York, 1979), utilizando el sistema reactivo de inmunotinción Vectastain ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. En suma, se obtuvieron varios tejidos humanos normales o muestras de tumores humanos mediante procedimientos de biopsia o resección quirúrgica standard y se congelaron de inmediato. Las muestras congeladas se seccionaron utilizando un microtomo refrigerado, se secó por aire sobre portaobjetos de microscopio de cristal, se fijaron con acetona fría (5 minutos, -20ºC), se lavaron dos veces en PBS, se bloquearon con suero de ratón normal (20 minutos, temperatura ambiente) y luego se trataron con reactivos de bloqueo de avidina/biotina. Los portaobjetos se incubaron seguidamente con anticuerpos primarios diluidos en solución de bloqueo Vectastain (Vector Laboratories) durante 90 minutos a temperatura ambiente y se lavaron con PBS. Seguidamente los portaobjetos se incubaron con IgG antiratón cabra biotinilado (Southern Biotechnology Assoc., Birmingham, AL), se diluyeron 1:150 en solución de bloqueo Vectastain durante 30 minutos a temperatura ambiente y se lavaron nuevamente con PBS. Se preparó una solución de trabajo (HRP) de peroxidasa rábano picante Vectastain ABC ("Vector Elite") y se mantuvo a temperatura ambiente. Los portaobjetos se incubaron con esta solución HRP durante 30 minutos a temperatura ambiente, se lavaron tres veces con PBS, y se enjuagaron en tampón Tris (Tris -HCl 0,05M, pH 7,5, 150 mM NaCl). Se preparó una solución de reactivo cromogénico de diaminobenzamidina (DAB, Bio-Tek Instruments, Inc. Winooski, VT), diariamente, siguiendo las instrucciones de Vectastain ABC, y los portaobjetos se incubaron con este reactivo durante 7 minutos a temperatura ambiente con luz tenue. La reacción se detuvo añadiendo PBS y lavando dos veces con agua destilada doble. Los portaobjetos se contra-tiñeron con hematoxilina (solución de hematoxilina de Bio-Tek diluida 1:10 con agua destilada) durante 10-45 segundos, se enjuagaron tres veces con agua y se deshidrataron a través de una serie de etanol graduado antes de montar para la microscopia.

Los portaobjetos fueron codificados y examinados por un investigador independiente, que fotografió sectores microscópicos representativos utilizando óptica de contraste de interferencia diferencial (Nomarski) con iluminación "bright-field" con un microscopio vertical Zeiss (Carl Zeiss, Inc. Thornwood, NY). Tal como se presenta aquí, las muestras se clasificaron como "positivas" cuando por lo menos un tercio de las muestras examinadas mostraron tinción DAB; las muestras designadas como "negativas" no presentaron tinción significativa (<5% de las células) utilizando las mismas diluciones de MAb. El cuadro 1 muestra la relación entre las muestras de cáncer de tinción positiva ("Ca") y el número de muestras de cáncer testadas. La tinción se vio en el citoplasma de las células del tumor y, en algunos casos, también en la superficie celular. Con MAb OV569 no se observó tinción de células normales (es decir no cancerosas). En muestras tumorales se observaron células neoplásicas y estromales y únicamente las primeras estaban teñidas por MAb OV569. En el Cuadro 2 se indican los resultados utilizando muestras de tejido humano normal.

CUADRO 1 Tinción inmuno histológica de tumores humanos con MAb OV569

Tumores	Positivo/Testado
Ca. Ovario	20/21
Ca. Endometrio	3/7
Ca. Cervix uteri	5/8
Ca. Mama	4/18
Ca. Estómago	3/7
Ca. Colon	2/15
Ca. Testículo	0/2
Ca. Pulmón (células amicrocíticas)	5/13
Carcinoma de pulmón (células pequeñas)	0/3
Ca. Vejiga	0/6
Ca. Próstata	0/14
Melanoma	0/8

CUADRO 2 Tinción inmuno histológica de tejidos humanos normales con MAb OV569

Tejido normal	Positivo/Testado
Suprarrenal	0/6
Cerebro	0/7
Mama	0/7
Caecum	0/3
Colon	0/6
Endometrio	1/6
Esófago	0/5
Corazón	0/8
Ileum	5/5
Yeyuno	0/4
Riñón	0/7
Hígado	0/8
Pulmón	0/6
Nodo linf.	0/1
Mesotelio	1/1
Nervio	0/6
Ovario	0/6
Páncreas	0/6
Placenta	0/2
Próstata	0/7
Hipertrofia prostática benigna	0/5
Piel	0/6
Estómago	0/6
Bazo	0/7
Tiroides	0/4
Testículo	0/12
Amígdala	0/4
* Tinción débil de una sub-población (<10%) de células

Ejemplo 4 Expresión de antígeno de carcinoma de ovario OV569 en superficies celulares de carcinoma humano cultivadas

En este ejemplo se evaluó la fijación de MAb OV569 a antígenos de la superficie celular de carcinomas por inmunocitofluorimetría de flujo utilizando un citofluorímetro Coulter Epics C FACS (Coulter Corp. Miami, FL), prácticamente según la descripción anterior (Hellstrom et al., 1986 Canc. Res. 46:3917). Se quitaron de matraces de cultivo con trixina/EDTA células de carcinoma humano adherente cultivadas generadas en la forma descrita anteriormente (por ejemplo Hellstrom et al., 1990 Cancer Res. 50:2183), se lavaron dos veces por centrifugación (200 x g, 10 minutos) y re-suspensión en medio IMDM (GibcoBRL, Grand Island, NY) que contenía 15% FBS y se equilibró durante por lo menos una hora a temperatura ambiente en el mismo medio. Se mantuvieron entonces en hielo durante 15 minutos partes de las células (0,5-1,0 x 10^{6} células/0,1 ml por cada grupo) y se resuspendieron durante una hora a 4ºC en 100 \mul de sobrenadaste de cultivo celular de hibridoma OV569. Las células se lavaron tres veces en tampón de tinción (medio IMDM que contenía 15% de suero de ternera fetal) y se resuspendieron durante 30 minutos a 4ºC en 0,1 mL por grupo de inmunoglobulina anti-ratón cabra fluoresceína-conjugada (FITC-GaMIg, BioSource Internacional, Inc., Camarillo, CA), se diluyeron en tampón de tinción siguiendo las recomendaciones del proveedor. Las células se volvieron a lavar tres veces, se resuspendieron en 0,5 mL de tampón de tinción refrigerado y se mantuvieron a 4ºC en la oscuridad hasta el análisis. Se realizó inmuno cito fluorimetría de flujo utilizando el citofluorímetro Coulter Epics C FACS (Coulter Corp. Miami, FL) siguiendo las instrucciones del fabricante, con parámetros "forward and side-scatter" para registrar eventos monocelulares. Se determinó la intensidad de fluorescencia media para cada muestra y se utilizó para calcular la equivalencia de fluorescencia lineal (LFE) utilizando el software con el que estaba equipado el Coulter Epics C FACS. La LFE de cada muestra dividida por la LFE de una muestra de control negativa (incubada con un MAb de especificidad irrelevante durante la primera etapa de incubación de anticuerpos) proporcionó una relación para comparar la luminosidad relativa de células teñidas específicamente por inmuno fluorescencia y las de células teñidas con el anticuerpo de control negativo. Los resultados se muestran en el Cuadro 3.

CUADRO 3 Análisis inmunocitofluorimétrico de flujo de expresión de OV569 por células de carcinoma humano cultivadas

\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Tipo de carcinoma \+  \hskip2cm   \+ Línea celular \+  \hskip2cm 
\+ LFE(muestra)/LFE (control)\cr  Ovario \+ \+  H3538 \+ \+
2,55\cr  Ovario \+ \+ H3907 \+ \+ 3,85\cr  Ovario \+ \+ H3909 \+ \+
3,84\cr  Ovario \+ \+ H4004 \+ \+ 2,43\cr  Ovario \+ \+ H3633 \+ \+
1,0\cr  Ovario \+ \+ H3750 \+ \+ 2,57\cr  Ovario \+ \+ H3759 \+ \+
6,74\cr  Ovario \+ \+  \hskip0,2cm  H3659.5 \+ \+ 5,63\cr  Ovario \+
\+ H4002 \+ \+ 8,48\cr  Ovario \+ \+ H4014 \+ \+ 1,0\cr  Ovario \+
\+ H4006 \+ \+ 2,53\cr  Ovario \+ \+ H4007 \+ \+ 8,72\cr  Ovario \+
\+  \hskip0,2cm  H4010-1 \+ \+ 1,12\cr  Ovario \+ \+
H4012 \+ \+ 1,0\cr  Pulmón \+ \+ H4013 \+ \+ 7,0\cr  Pulmón \+ \+
H2981 \+ \+ 1,3\cr  Pulmón \+ \+ H2987 \+ \+ 1,25\cr  Pulmón \+ \+
H3963 \+ \+ 1,11\cr  Pulmón \+ \+ H3776 \+ \+ 1,33\cr  Pulmón \+ \+
H3754 \+ \+
1,59\cr}

Ejemplo 5 Las células de carcinoma humano no interiorizan antígeno de carcinoma de ovario OV569

Para determinar si el antígeno definido por MAb OV569 puede ser interiorizado por células de carcinoma positivo antigénico se realizaron ensayos de localización de anticuerpo por inmunofluorescencia utilizando microscopía confocal de escaneo por láser. Las células de carcinoma de pulmón humano (H4013) o de carcinoma de ovario (H4007) adaptadas a cultivo tras resección quirúrgica según lo descrito anteriormente (por ejemplo Hellstrom et al., 1990 Cancer Res. 50:2183) se cultivaron en medio de cultivo IMDM (Gibco BRL, Grand Island, NY) que contenía 10% de suero de ternera fetal y se dejó adherir sobre portaobjetos de cristal (NUNC chamber coverslips, NUNC, Rochester, NY) durante 48 horas a 37ºC, CO_{2} 5% en atmósfera humedecida. Para el marcado de anticuerpo por inmunofluorescencia, se equilibraron las células durante 15 minutos a 4ºC, una temperatura que no permite la interiorización de antígenos de la superficie celular. Se preparó OV569 FITC-conjugado por incubación de fluorescein isotiocianato (Sigma, St. Louis, MO) en las condiciones descritas (Weir, D.M. Handbook of Experimental Immunology, 1986, Blackwell Scientific, Boston), con MAb OV569 purificado por afinidad sobre proteína A inmovilizada (RepliGEn, Cambridge, MA), siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se añadió FITC-OV569 o, como control negativo, IgG anti-ratón cabra FITC conjugado (Tago, Burlingame, CA) a las células con una concentración de 10 \mug/ml durante 1 hora a 4ºC en un volumen suficiente para cubrir cada cubreobjeto. Se quitó el anticuerpo no fijado enjuagando muy bien los cubreobjetos con un medio de cultivo frío. Las células se incubaron entonces durante períodos de tiempo diferente a 37ºC, una temperatura que permite la interiorización de ciertos antígenos de la superficie celular (Hellstrom et al., 1990, Canc. Res. 50:2183). El período de incubación a 37ºC se determinó añadiendo PBS frío a los cultivos y post-fijando las células con formaldehído al 2% en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se trató entonces cada cubreobjeto con ditioeritritol de reactivo anti-fading (Sigma, St. Louis, MO) o con el reactivo anti-fading Vectastain (Vector Laboratories Burlingame, CA) siguiendo las instrucciones del proveedor. Las imágenes de microscopía confocal con escaneo por láser se obtuvieron utilizando un microscopio confocal Leica (Leica, Inc., Deerfield, IL) equipado con un juego de filtros de detección de fluoresceína siguiendo las instrucciones del fabricante.

Las imágenes confocales demostraron la localización exclusiva de FITC-MAb OV569 en las superficies de células de carcinoma de pulmón y carcinoma de ovario humano expuestas al anticuerpo a 4ºC, lavadas y fijadas de inmediato cuando las células teñidas con FITC-MAb OV569 a 4ºC se cambiaron a 37ºC durante períodos de 8 horas o más, el FITCMAb OV569 detectable permaneció exclusivamente localizado en superficie celulares y no se observó tinción fluorescente citoplásmica.

Ejemplo 6 Caracterización por inmunotransferencia de antígeno de carcinoma de ovario OV569

El presente ejemplo describe la caracterización del antígeno celular de carcinoma humano reconocida por MAb OV569 utilizando análisis de inmuno transferencia Western.

Se prepararon muestras de análisis de inmunotransferencia incluidos lisatos, a partir de las siguientes líneas celulares humanas: carcinoma de pulmón H4013 (figura 1, vía 5), carcinoma de ovario OVCAR-3 (Amer. Type Culture Collection, Manassas, VA) (figura 1, vía 7) y carcinoma de riñón 6K (figura 1, vía 8) se prepararon lisatos celulares siguiendo los procedimientos standard (Current Protocols in Immunoly, J.E. Coligan et al., (Eds.) 1998 John Wiley & Sons, NY). Se cuantificó proteína utilizando el reactivo de ensayo proteínico Bradford Commassie (Pierce Chemicals, In, Rockford, IL) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Otras muestras del análisis de inmunotransferencia incluían material derivado de pacientes humanos y purificados por afinidad sobre una columna de MAb OV569 inmovilizado según se describe anteriormente en el Ejemplo 2. Estas muestras fracciones de OV569 purificadas por afinidad de fluido de ascitis de cáncer de ovario de un paciente que tenía carcinoma de ovario (figura 1, vía 2) y de fluido de efusión pleural recogido de la cavidad de la membrana interpleural llena de fluido, de un paciente al que se diagnosticó un carcinoma de pulmón (figura 1, vía 3). La preparación de la muestra fluida y la cromatografía por afinidad, respectivamente, se realizaron en la forma descrita más abajo en el Ejemplo 7 y más arriba en el Ejemplo 2.

Otras muestras para el análisis por inmunotransferencia comprendía materia derivado de líneas celulares de carcinoma humano y purificadas por afinidad sobre una columna de MAb OV569 inmovilizado según lo descrito anteriormente en el Ejemplo 2. Estas muestras comprendían fracciones purificadas por afinidad de OV569, de carcinoma de pulmón H4013 (figura 1, vía 4), carcinoma de ovario OVCAR-3 (ATCC, Manassas, VA) (figura 1, vía 6). La proteína de fusión D2hIg descrita en el Ejemplo 2 también se analizó (figura 1, vía 1).

Cada muestra normalizada por contenido de proteína se diluyó 1:1 con tampón de muestra SDS (Novex, San Diego, CA), 20 \mul (300 ng/vía) se incorporaron a un gel de Trisglicina 14% (Novex, San Diego, CA) y el gel se sometió a electrofóresis utilizando tampón "running" SDS a 125C durante aproximadamente 1,5 horas siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras la electrofóresis de gel, se procedió a la electrotransferencia de proteínas separadas sobre membrana PVDF (Novex, San Diego, CA) utilizando tampón de transferencia SDS Tris-glicina y las condiciones de transferencia por electrofóresis según las recomendaciones del fabricante.

Antes del sondeo de anticuerpos, la membrana de PVDF se bloqueó con leche no grasa 5% en tampón de lavado (0,2% Tween 20-PBS) a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de lavado con tampón de lavado, una vez durante 2 minutos y dos veces durante 5 minutos. Seguidamente, la membrana se bañó en una solución de MAb OV569 purificada por afinidad de proteína A (4,6 mg/ml) se diluyó hasta 3 \mug/ mL en tampón de lavado que contenía leche no grasa 1% a temperatura ambiente durante 1 hora seguido de una secuencia de tres lavados según lo descrito anteriormente. La detección de MAb OV569 fijada específicamente se realizó utilizando detección por quimioluminescencia de anticuerpos secundarios conjugados (HRP) de peroxidada rábano picante. En suma la membrana se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente en una dilución 1:5000 de anticuerpo IgG anti-ratón cabra marcado HRP (Zymed Laboratories, South San Francisco, California) en tampón de lavado que contenía leche no grasa 1% y luego los anticuerpos no fijados se eliminaron bañando la transferencia en tampón de lavado 1 vez durante 10 minutos y luego 4 veces durante 5 minutos cada vez. El sustrato de quimioluminescencia ECL (ECL-Amersham, Buckinghamshire, Inglaterra) se aplicó sobre la membrana durante 1 minutos en sala oscura siguiendo las instrucciones del proveedor, seguido de una breve exposición a película de radiología X-omat (Kodak, Rochester, NY).

La figura 1 muestra el modelo de especies resultas electroforéticamente que se detectaron por fijación de MAb OV569 que identifica un componente que tiene una masa molecular relativa aparente de 42-45 kDa en muestras derivadas de diversos carcinomas humanos.

Ejemplo 7 Antígeno afín a la mesotelina (MRA), un antígeno de carcinoma reconocido por anticuerpo monoclonal OV569 es un polipéptido de mesotelina

Este ejemplo describe la identificación de una molécula que se presenta de modo natural en forma soluble en una muestra biológica de un paciente con carcinoma y que es reconocida por MAb OV569, como polipéptido de mesotelina. Este polipéptido de mesotelina soluble naturalmente recibe aquí el nombre de "antígeno afín a la mesotelina" (MRA).

El fluido de efusión pleural (2 litros) recogido en tubos heparinizados por una sola extracción de un paciente al que se le diagnosticó carcinoma de pulmón se aclaró por centrifugación para eliminar células, se diluyó 1:1 (v/v) con PBS y se filtró a través de un papel de filtro 3 MM (Whatman, Clifton, NJ) antes de proceder a la cromatografía por inmunoafinidad. El fluido pleural diluido se aplicó a una columna de MAb OV569 inmovilizado, se lavó la columna para eliminar los componentes que no se fijaron y el material específicamente fijado se eluyó y se recogió según se describe en el Ejemplo 2. Las fracciones eluidas y fijadas se neutralizaron añadiendo 3MM de tampón de neutralización de glicina-NaOH 0,2 N. El material de fijación OV569 eluido, mezclado se sometió a alquilación añadiendo varios granos de yodoacetamida cristalina (Sigma, St. Louis, MO) para bloquear la formación de enlace de disulfuro artifactual de bloque a través de residuos de cisteína potencialmente presentes y se resolvió el material por electrofóresis de gel de SDS-poliacrilamida y se transfirió a una membrana PVDF tal como se describe en el Ejemplo 6, con la diferencia de que el gel de resolución contenía 7,5% de poliacrilamida. Se procedió a la inmunotinción de una vía de la membrana de PVDF con MAb OV569 según se describe también en el Ejemplo 6, para localizar una banda difusa de aproximadamente 40 kDa para el análisis de la secuencia N-terminal.

La secuencia de aminoácidos de la banda de aproximadamente 40 kDa se analizó por degradación secuencial Edman en un secuenciador de fase sólida ABI Modelo 473 (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA). El análisis de secuencia parcial reveló la siguiente secuencia de aminoácidos N-terminal para el polipéptido 40 kDa aislado por afinidad de OV569:

EVEKTACPSGKKAREIDES

SEQ ID NO: 5

Esta secuencia de aminoácidos representa una secuencia de aminoácidos parcial de un nuevo miembro naturalmente soluble de la familia de polipéptidos de mesotelina. Debido a que la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 se encuentra también presente en posiciones 294-312 de mesotelina, un antígeno de diferenciación de superficie celular expresado en canceres de mesotelio, mesotelioma y de ovario no detectables como molécula naturalmente soluble según lo descrito aquí (Chang et al., 1992 Int. J. Canc. 50:373; Chang et al., 1996 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93:136), el polipéptido de fijación de OV569 soluble aquí descrito ha recibido el nombre de "antígeno afín a la mesotelina" (MRA). Como se ha señalado más arriba, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 se encuentra también presente en la parte fijada a la membrana de la superficie celular (es decir no soluble según lo descrito aquí) de la proteína precursora MPF (Kojima et al., 1995 J. Biol. Chem. 270:21984).

Según lo indicado anteriormente, la mesotelina y MPF se sintetizan como precursores de aproximadamente 70 kDa, que se procesan proteolíticamente en productos solubles y fijados a la superficie celular (Chang et al., 1996 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93:136; Chowdhury et al., 1998 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:669; Kojima et al., 1995 J. Biol. Chem. 270:21984; Yamaguchi et al., 1994 J. Biol. Chem. 269: 805). Para identificar el dominio (soluble o asociado a membrana) en el que reside el epítopo OV569, se construyeron dos proteínas de fusión de región constante de inmunoglobulina humana. DlhIg contenía el dominio soluble de MPF, 33 kDa (Chang et al., 1996; Kojima et al., 1995), mientras que D2hIg contenía el dominio fijado membrana de 44 kDa de MPF (Chang et al., 1996, véase Ejemplo 2). Se comprobó la especificidad de OV569 utilizando métodos ELISA convencionales según se describe más arriba. Como se puede apreciar en la figura 2, OV569 se fijó a D2hIg pero no reconoció D1hIg.

Ejemplo 8 Ensayo para la detección de antígeno de carcinoma de ovario definido por anticuerpo monoclonal OV569 en sueros y efusión maligna de pacientes

Este ejemplo describe un inmuno ensayo sandwich ELISA para la detección de MRA un nuevo miembro naturalmente soluble de la familia de polipéptidos de mesotelina. El ensayo utiliza MAb OV569 y MAb 4H3 que se fija a epítopos distintos presentes en MRA.

Los pocillos de las placas Maxisorp Inmuno^{TM} (Nalge Nunc Internacional, Napeville, IL) se recubrieron durante la noche a 4ºC con 50 mg de inmunoglobulina MAb 4H3 purificada por inmunoafinidad proteína A (ImmunoPure A/G IgG Purification Kit, Pierce Chemicals, Rockford, Illinois) en 50 \mul/pocillo de tampón de bicarbonato-carbonato (C3041, sigma). Al día siguiente, los pocillos fueron drenados y bloqueados durante 2 horas a temperatura ambiente con 200 \mul/ pocillo de tampón de bloqueo de GSC (Genetic Systems Corp. Redmond, WA). Se lavaron entonces los pocillos 4 veces con 200 \mul/pocillo de PBS que contenía 0,1% Tween 20 (Fischer Chemicals, Fairlawn, New
Jersey).

Para iniciar el ensayo, se añadieron 100 \mul por pocillo de diluciones de duplicación en serie (1:40 a 1:1280) de suero de paciente diluido en tampón de bloqueo, y se mantuvieron las placas a temperatura ambiente durante 1 hora. Se lavaron los pocillos 4 veces con PBS-0,1% Tween-20, después de lo cual se añadió 50 \mul/pocillo de MAb OV569 biotinilado (preparado en la forma descrita en el ejemplo 2), 200 ng/ml en diluyente conjugado (Genetic Systems) y se dejó incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos se volvieron a lavar cuatro veces con PBS-Tween. Seguidamente se añadió 50 \mul/pocillo de HRP-estreptavidina (PharMingen, San Diego, CA) diluido 1:1000 en diluyente conjugado y las placas se mantuvieron a temperatura ambiente durante 45 minutos. Se lavaron los pocillos 4 veces con PBS-Tween y se revelaron/desarrollaron añadiendo 3,3',5,5'-tetrametilbencidina tamponada (TMB, Genetic Systems) más 1% (v/v) del conjugado de HRP-estreptavidina, durante 15 minutos. La reacción se detuvo añadiendo H_{2}SO_{4} 2M y se leyeron las placas a 460 nm utilizando un espectrofotómetro de microplaca Spectracount (Packard Instrument Co, Meriden, CT).

Se incluyeron en todos los ensayos muestras de suero de control positivas y negativas de dos pacientes. El suero de control negativo procedía de un voluntario sano y no ofreció ninguna señal detectable presente a una dilución 1:40. El control positivo ("c+") procedía de un paciente al que se le había diagnosticado carcinoma de ovario y presentó una señal fácilmente detectable en las condiciones de ensayo descritas, cuando se producía, con una dilución de 1:1280 o menos.

La figura 3 ilustra resultados representativos utilizando inmunoensayo ELISA sandwich para la detección de MRA. Las moléculas solubles reconocidas por los dos MAbs, 4H3 y OV569 se detectaron fácilmente en sueros procedentes de dos pacientes con carcinoma de ovario (nº 2896 y nº 2897) y en sueros procedentes de un paciente con carcinoma de pulmón (nº 3L) y se pudieron cuantificar relativamente como reactividades valorables. El suero de control positivo (c+) también presentó reactividad con los MAbs que fijan MRA, la cual disminuyó al aumentar el factor de
dilución.

Se sometieron a ensayo sueros procedentes de pacientes adicionales con un diagnóstico de carcinoma ovario y también de pacientes con tumores diferentes, utilizando el inmunoensayo ELISA sandwich para la detección de MRA. También se compararon utilizando este ensayo, sueros de pacientes adicionales que presentaban cuadros clínicos no neoplásicos y sueros de pacientes sanos. En la figura 4 se recoge gráficamente un resumen de los resultados. Con una dilución de suero de 1:160, 23 de los 30 sueros procedentes de pacientes que tenían carcinoma de ovario en etapa 3 ó 4 presentaron niveles de circulación de MRA notablemente elevados sin se compara con 0 de 68 sueros procedentes de voluntarios sanos. Utilizando los mismos criterios, 25 de 75 sueros procedentes de pacientes con tumores que no eran carcinoma de ovario presentaron una reactividad detectable en el ELISA sandwich de MRA, observándose la mayor frecuencia de sueros positivos (66%) en pacientes con carcinoma de pulmón (Cuadro 4). Los sueros procedentes de tres pacientes con cuadros clínicos no neoplásicos dieron resultados negativos en el ELISA sandwich de
MRA.

CUADRO 4

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Diagnóstico \+  \hskip1cm   \+ Número de sueros con OD>3SD \+
 \hskip1cm   \+ Número de sueros\cr  \+ \+ por encima de lo negativo
\+ \+ testados\cr  Sueros de control \+ \+ 0 \+ \+ 68\cr  Ca. Ovario
\+ \+ 23 \+ \+ 30\cr  Ca. Mama \+ \+ 11 \+ \+ 35\cr  Ca. Pulmón \+
\+ 6 \+ \+ 9\cr  Ca. Colon \+ \+ 2 \+ \+ 14\cr  Leucemias \+ \+ 6 \+
\+
17\cr}

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 9 Clonación molecular y secuenciación de secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno afín a la mesotelina (MRA-1)

Debido a que el anticuerpo monoclonal OV569 reconocía el dominio (D2hIg) fijado a membrana pero no el dominio (D1hIg) soluble de MPF, pero se podía utilizar también para aislar por afinidad un polipéptido soluble de fluido de efusión pleural (Ejemplo 7), se determinó la identidad de un nuevo antígeno afín a la mesotelina (MRA). Este ejemplo describe la clonación y secuenciación de una molécula de cADN que codifica un MRA, MRA-1 procedente de una línea celular de carcinoma prostático humano, utilizando información de secuencia del antígeno definido por el anticuerpo monoclonal OV569. Se realizaron, siguiendo los procedimientos publicados, aislamiento de plásmido, producción de células competentes, transformación y manipulaciones de M13 (Sambook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Se aisló ARN total de una línea celular de carcinoma prostático humano (HE1P generado en la forma descrita anteriormente; véase por ejemplo Hellstrom et al., 1990 Cáncer Res. 50:2183) utilizando un kit RNAgents^{TM} (Promega, Inc. Madison, WI) y se purificó poliA+ ARN del ARN total con un Separador^{TM} de mARN (Clontech, Inc., Palo Alto, CA), siguiendo en ambos casos las recomendaciones del fabricante. Se utilizó un kit de amplificación de cADN Marathon^{TM} (Clontech, Palo Alto, CA) para transcripción inversa de ARN y obtener cADN de doble cadena, que se ligó a un adaptador provisto del kit Marathon^{TM} y se amplificó utilizando un sistema PCR de alta fidelidad EXPAND^{TM} (Roche Molecular Biopchemicals, Indianápolis, IN), siguiendo las instrucciones del proveedor. Para esta amplificación, el primer iniciador oligonucleótido era específico de la secuencia adaptor Marathon^{TM} y el segundo iniciador correspondía a la región de codificación para la secuencia N-terminal del antígeno OV569 [SEQ ID NO: 5] y tenía siguiente secuencia derivada de la secuencia de cADN de MPF (Kojima et al., 1995):

GSP1:

5'-GGA AGT GGA GAA GAC AGC CTG TCC TTC-3'

SEQ ID NO: 6

El producto PCR se ligó en el vector pGEM-T (Promega, Madison, WI) y la mezcla de ligadura se transformó en células competentes de DH5\alpha (Life Technologies, Gathersburg, MD), siguiendo en ambos casos las instrucciones del fabricante. Se aislaron plásmidos de colonias individuales de células DH5\alpha transformadas utilizando un kit miniprep spin QIAprep^{TM} (Qiagen, Valencia, CA) y se secuenciaron utilizando un kit de secuenciación de ciclo terminal por BigDye^{TM} (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Se aislaron 10 clones, inclusive 8 que poseían una secuencia de ácidos nucleicos idéntica a la secuencia de cADN de MPF (Kojima et al., 1995), una que tenía una secuencia idéntica a mesotelina (Chang et al., 1996), una que, tras la secuenciación, reveló una secuencia de ácidos nucleicos (figura 5A-B y SEQ ID NO: 3), afín a MPF y secuencias de mesotelina pero que contenían también un inserto de 82 bp en posición de un nucleótido, correspondiente al nucleótido 1874 de la secuencia de codificación de MPF (Kojima et al., 1995), que indujo un cambio de marco de lectura de 212 bp.

El análisis de la secuencia indicó que este cambio de marco de lectura tenía como resultado una secuencia de codificación para un nuevo polipéptido que recibió aquí el nombre de antígeno-1 afín a la mesotelina (MRA-1) que a diferencia de MPF y la mesotelina, contiene una cola C-terminal hidrófila y es probable por lo tanto que sea soluble entornos fisiológicos acuosos. Los 98 aminoácidos C-terminales de MRA-1 eran diferentes de las secuencias de aminoácidos encontradas en las regiones C-terminales de MPF o de mesotelina. Sorprendentemente, esta nueva secuencia de ácidos nucleicos que codifica proteína (SEQ ID NO: 1) incluía codones no de terminación sino que continuaba directamente hasta la zona de poliadenilación para la cola poliA. Esta carencia de un codón de terminación puede estar relacionada con el origen de esta secuencia en células neoplásicas. La secuencia de MRA-1 era más afín a MPF que a mesotelina ya que carecía de una inserción de 24 bp que se encontraba presente en la secuencia de ADN de la mesotelina pero no en la secuencia de MPF y porque era idéntica a MPF en dos posiciones de nucleótido donde se encontraron diferencias de base singulares entre MPF y mesotelina. La secuencia de polipéptido MRA-1 (SEQ ID NO: 1) se muestra en la fig. 5A-B.

Ejemplo 10 Clonación PCR inversa de un antígeno afín a la mesotelina (MRA-2)

Este ejemplo describe la clonación y secuenciación de una molécula de cADN que codifica una variante de MRA, MRA-2 de una línea celular de carcinoma de colon humano. MRA-2 difiere de MRA-1 por la presencia de 3 aminoácidos adicionales (FRR) en el término N (SEQ ID NO: 2) y en virtud de la forma que se identificó, según se describe más abajo, carece de la región C-terminal completa de MRA-1, en lugar de terminar en la posición de aminoácido correspondiente al residuo 325 de MRA-1. Se realizaron, siguiendo los procedimientos publicados, el aislamiento de plásmido, la producción de células competentes, la transformación y manipulaciones afines (Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Se utilizó PCR inverso (Zeiner et al., 1994 Biotechniques 17:10451) para clonar una molécula de ácido nucleico que codifica un MRA de carcinoma de colon 3719, una línea celular generada en la forma descrita anteriormente (véase por ejemplo Hellstrom et al., 1990 Cáncer Res. 50:2183). En suma, se extrajo ARN total (5 mg) de cultivos de base (bulk) de 3719 células utilizando reactivo Trizol^{TM} (GIBCO-BRL, Grand Island, NY) y se purificó mARN poliA' utilizando perlas magnéticas revestidas con oligo-dT PoliATtract^{TM} (Promega, Inc., Madison, WI) siguiendo las instrucciones del proveedor. Se inició la síntesis de cADN primera cadena por transcripción inversa utilizando un iniciador oligonucleótido específico de una porción que comprende nucleótidos en posiciones 56-80 del inserto de 82 bp identificado en la secuencia de nucleótidos MRA del ejemplo 9:

Op56-80

5'-GCG CTC TG AGTC ACC CCT CTC TCTG-3'

SEQ ID NO: 7

La segunda cadena de cADN se generó utilizando el iniciador adaptor Marathon^{TM} descrito en el ejemplo 9 (Clontech, Palo Alto, CA). Se permitió la circularización de cADN por auto religadura durante 24 horas a 15ºC utilizando el protocolo del kit Marathon^{TM} (Clontech) en un volumen de reacción de 200 \mul. De esta mezcla de ligadura se utilizó una parte de 5 \mul como plantilla en una reacción PCR con los siguientes iniciadores:

mpf f735	AGA AAC TTC TGG GAC CCC AC	SEQ ID NO: 8
mpf r290	GGG ACG TCA CAT TCC ACT TG	SEQ ID NO: 9

y los siguientes iniciadores encajados:

GSP-2	5'-GAA GGA CAG GCT GTC TTC TCC ACT TCC C-3'	SEQ ID NO: 10
r80-54	5'-CAG AGA GAG GGG TGC CTC AGA GC-3'	SEQ ID NO: 11

El producto PCR se secuenció utilizando un kit de secuenciación de ciclo terminador BigDye^{TM} (PE Applied Biosystems, Foster, City, CA). La secuencia de ADN resultante (SEQ ID NO: 4, figura 6A-B) era idéntica a nucleótidos en posiciones 1-978 de la secuencia de ADN MRA-1 (SEQ ID NO: 3) descrita en el Ejemplo 9, con excepción de la presencia de 9 bp adicionales situados 5' respecto del nucleótido en número de posición 1 de SEQ ID NO: 3. Estos 9 nucleótidos codifican el FRR tripéptido terminal-N que comprende aminoácidos 1-3 de SEQ ID NO: 2 que reciben aquí el nombre de MRA-2. Estos tres codones de nucleótido son idénticos a los tres codones encontrados en las secuencias de codificación corriente arriba de la zona de fragmentación entre mesotelina y su precursor (Chang et al., 1996) y entre MPF y su precursor (Kojima et al., 1995). Por consiguiente la secuencia de polipéptido antígeno (SMR) afín a la mesotelina soluble (SEQ ID NO: 13) se muestra en la figura 7A-B, como una secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 14) que codifica dicho polipéptido SMR. SMR comprende el tripéptido N-terminal FRR identificado en MRA-2 más todas las secuencias de polipéptidos (SEQ ID NO: 1) de MRA-1 descrita anteriormente, cuyo término C es codificado por una secuencia de núcleotidos que se extiende al interior de la zona de poliadenilación pero carece de un codón de terminación.

Ejemplo 11 Expresión de MRA en una línea celular de carcinoma de ovario

En este ejemplo, se describe la detección de secuencias de ácido nucleico que codifican MRA en una biblioteca de cADN derivada de una línea celular de carcinoma de ovario humano. Se extrae ARN de 3997 células de carcinoma de ovario cultivadas (generadas en la forma descrita anteriormente, véase por ejemplo Hellstrom et al., 1990 Cáncer Res. 50:2183) y se utiliza para producir una biblioteca de cADN por transcripción inversa utilizando el kit de amplificación de cADN Marathon^{TM} (Clontech, Palo Alto, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. La biblioteca es clonada en pCDNA3-Zeo (Invitrogen, Inc., San Diego, CA) y cribada por hibridación con sonda de oligonucleótido con transferencias northern. El siguiente nucleótido se sintetiza, correspondiente a una región del inserto de 82 uncleótidos de MRA descrito en el Ejemplo 9:

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 i35: \+ 5'-CCA GGG CTG GGG GCA GAG CTG GGG GGG CGT
GGA GGT G-3' \+ SEQ ID NO:
12\cr}

Se realiza la rotulación final de i35 con [^{32}P] utilizando el Sistema de Extensión de iniciador (Promega, Madison, WI) siguiendo las instrucciones del proveedor y el oligonucleótido rotulado se utiliza para sondear una transferencia northern que contiene muestras de ARN separadas electroforéticamente de varios tejidos humanos (MTN^{TM} Multiple Tissue Northern Blot, Cat. No. 7760-1, Clontech, Palo Alto, CA) siguiendo los procedimientos bien conocidos. Se eligen clones individuales identificados por el ensayo de cribado, se amplifican y se secuencian en la forma descrita en el Ejemplo 10 para determinar una secuencia de MRA de la línea celular del carcinoma de ovario.

A la vista de lo anterior, se observará que si bien se han descrito aquí realizaciones específicas de la invención a efectos de ilustración, se pueden realizar varias modificaciones sin apartarse del ámbito de la invención. Por consiguiente, la invención solo queda limitada por las reivindicaciones adjuntas.

<110> Pacific Nortwest Research Institute

\hskip1cm Scholler, Nathalie B.

\hskip1cm Hellstrom, Ingegerd

\hskip1cm Hellstrom, Kart Eric

\vskip0.400000\baselineskip

<120> MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA EL DIAGNÓSTICO DE CARCINOMAS

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 730033.410PC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> PCT/US00/04834

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 2000-02-25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 399

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PAT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

1

100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 328

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

2

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1198

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

3

4

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 985

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

5

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Val Glu Lys Thr Ala Cys Pro Ser Gly Lys Lys Ala Arg Glu Ile}

\sac{Asp Glu Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> PCR primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaagtggag aagacagcct gtccttc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> PCR primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgctctgag tcacccctct ctctg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> PCR primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaaacttct gggaccccac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> PCR primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggacgtcac attccacttg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> PCR primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaggacagg ctgtcttctc cacttccc

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> PCR primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagagagagg ggtgactcag agc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de oligonucleótido sintetizada para hibridación en transferencia Northern

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccagggctgg gggcagagct gggggggcgt ggaggtg

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 402

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

6

7

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1207

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

8

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 412

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

9

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 396

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> mísc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(396)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A,T,C or G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

10

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 427

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 507

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

12

Claims (52)

1. Método de cribado para detectar la presencia de un cuadro clínico maligno en un sujeto, que comprende:

poner en contacto una muestra biológica de un sujeto con por lo menos un anticuerpo específico de polipéptido antígeno afín a la mesotelina, inclusive SEQ ID NO: 5 para determinar la presencia en dicha muestra biológica de una molécula que se presenta de modo natural en forma soluble en dicha muestra y tiene un determinante antigénico reactivo con el, por lo menos uno, anticuerpo mencionado, en condiciones y durante un período de tiempo suficiente para detectar la fijación de dicho anticuerpo en el mencionado determinante antigénico,

y a partir de ahí, detectar la presencia de un cuadro clínico maligno.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra biológica se elige dentro del grupo formado por sangre, suero, fluido serosal, plasma, linfa, orina, fluido cerebro espinal, saliva, secreción mucosal, secreción vaginal, ascitis, fluido pleural, fluido pericardial, fluido peritoneal, fluido abdominal, medio de cultivo, medio de cultivo condicionado y fluido de lavado.

3. El método de la reivindicación 1, donde el antígeno afín a la mesotelina comprende un polipéptido que tiene la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 1, o un fragmento o derivado de la misma, que mantiene prácticamente la misma función y/o actividad biológica.

4. El método de la reivindicación 3, donde el polipéptido antigénico afín a la mesotelina es una variante de unión (splice variant).

5. El método de la reivindicación 1, en el que el antígeno afín a la mesotelina comprende un polipéptido que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO: 2 o un fragmento o derivado de la misma, que mantiene prácticamente la misma función y/o actividad biológica.

6. El método de la reivindicación 5 en el que el polipéptido antigénico afín a la mesotelina es una variante de unión (splice variant).

7. El método de la reivindicación 1, donde el polipéptido antigénico afín a la mesotelina es una variante antigénico afín a la mesotelina o un fragmento derivado de la misma, que mantiene prácticamente la misma función y/o actividad biológica.

8. El método de la reivindicación 1, en el anticuerpo se elige dentro del grupo formado por un anticuerpo policlonal, un anticuerpo purificado por afinidad, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo híbrido, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo de una sola cadena.

9. El método de la reivindicación 1, en el que la detección de la fijación del anticuerpo a un determinante antigénico comprende la detección de un radionúclido.

10. El método de la reivindicación 1, donde la detección de la fijación del anticuerpo en el determinante antigénico comprende la detección de un fluoróforo.

11. El método de la reivindicación 1, en el que la detección de la fijación del anticuerpo en un determinante antigénico comprende la detección de un evento de fijación entre una molécula de avidina y una molécula de biotina.

12. El método de la reivindicación 1, en el que la detección de la fijación del anticuerpo en un determinante antigénico comprende la detección de un evento de fijación entre una molécula de estreptavidina y una molécula de biotina.

13. El método de la reivindicación 1, en el que la detección de la fijación del anticuerpo en un determinante antigénico comprende la detección espectrofotométrica de un producto de una reacción enzimática.

14. El método de la reivindicación 1, en el que el mencionado anticuerpo (por lo menos uno) está rotulado de forma que se pueda detectar.

15. El método de la reivindicación 1, en el que por lo menos un anticuerpo no está rotulado de modo que se pueda detectar y donde la detección de la fijación del anticuerpo en un determinante antigénico es indirecta.

16. El método de la reivindicación 1, en el que el cuadro clínico maligno se elige dentro del grupo formado por adenocarcinoma, mesotelioma, carcinoma de ovario, carcinoma pancreático y carcinomas pulmonares amicrocíticos.

17. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra biológica se pone en contacto con por lo menos un anticuerpo específico de un polipéptido antigénico afín a la mesotelina humana, que comprende SEQ ID NO: 5, para determinar la presencia en dicha muestra biológica de una molécula que aparece de modo natural en forma soluble en dicha muestra y tiene un determinante antigénico reactivo con dicho anticuerpo, en condiciones y durante un período de tiempo suficiente para detectar la fijación de éste, por lo menos uno, anticuerpo en el mencionado determinante antigénico,

y detectar a partir de ahí la presencia de un cuadro clínico maligno.

18. El método de la reivindicación 17, en el que el antígeno afín a la mesotelina reacciona también de modo inmunoespecífico con el anticuerpo monoclonal MAb K-1.

19. El método de la reivindicación 1, donde la muestra biológica se pone en contacto con por lo menos un primer anticuerpo inmovilizado específico de un polipéptido antigénico afín a la mesotelina, que comprende la SEQ ID NO: 5, para determinar la presencia en dicha muestra biológica de una molécula que aparece de modo natural en forma soluble en dicha muestra en condiciones y durante un tiempo suficiente para fijar específicamente este, por lo menos uno, primer anticuerpo inmovilizado al indicado polipéptido antigénico afín a la mesotelina, formando de este modo un complejo inmune;

se quitan los constituyentes de la muestra que no se fijan específicamente en dicho, por lo menos uno, primer anticuerpo inmovilizado; y

se pone en contacto el mencionado complejo inmune con por lo menos un segundo anticuerpo específico de un polipéptido antigénico afín a la mesotelina, donde la zona de combinación de antígeno de dicho por lo menos uno, segundo anticuerpo no inhibe de forma competitiva la zona de combinación antigénica de dicho por lo menos uno, primer anticuerpo inmovilizado, en condiciones y durante un tiempo suficiente para detectar la fijación específica de éste, por lo menos uno, segundo anticuerpo al polipéptido antigénico afín a la mesotelina, detectándose a partir de ahí la presencia de un cuadro clínico maligno.

20. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra biológica se pone en contacto con por lo menos un primer anticuerpo inmovilizado específico de un polipéptido antigénico afín a la mesotelina, que comprende SEQ IN NO: 5, para determinar la presencia en dicha muestra biológica de una molécula que aparece de modo natural en forma soluble en dicha muestra, donde la zona de combinación antigénica de dicho, por lo uno, primer anticuerpo inhibe de forma competitiva la fijación inmunoespecífica de anticuerpo monoclonal MAb K-1 en condiciones durante un tiempo suficiente para fijar específicamente dicho, por lo menos uno, primer anticuerpo inmovilizado en el mencionado polipéptido antigénico afín a la mesotelina, formándose a partir de ahí un complejo inmune;

se quitan los constituyentes de la muestra que no se fijan específicamente en dicho por lo menos uno, primer anticuerpo inmovilizado; y

se pone en contacto dicho completo inmune con por lo menos un segundo anticuerpo específico de un polipéptido afín a la mesotelina, donde la zona de combinación antigénica de dicho, por lo menos uno, segundo anticuerpo, no inhibe de forma competitiva la fijación inmunoespecífica de anticuerpo monoclonal MAb K-1, en condiciones y durante un tiempo suficiente para detectar la fijación específica de dicho, por lo menos uno, segundo anticuerpo al mencionado polipéptido antigénico afín a la mesotelina, detectando a partir de ahí la presencia de un cuadro clínico maligno.

21. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-20 que comprende además la determinación de la presencia, en dicha muestra, de por lo menos un marcador soluble de un cuadro clínico maligno elegido dentro del grupo formado por antígeno carcino embriónico, CA125, sialil TN, antígeno de carcinoma celular escamoso, antígeno de polipéptido hístico y fosfatasa alcalina placental.

22. Método de cribado para detectar la presencia de un cuadro clínico maligno en un sujeto, según la reivindicación 1, que comprende:

poner en contacto (i) una primera muestra biológica de un primer sujeto sospechoso de presentar un cuadro clínico maligno, y (ii) una segunda muestra biológica de un segundo sujeto que se sabe no presenta ningún cuadro clínico maligno, con por lo menos un anticuerpo específico de un polipéptido antigénico afín a la mesotelina, que comprende SEQ ID NO: 5, para determinar la presencia en cada una de las muestras biológicas, primera y segunda, de una molécula que se presenta de modo natural en forma soluble en dichas muestras y tiene un determinante antigénico que reacciona, con dicho, con por lo menos uno, anticuerpo, en condiciones y durante un período de tiempo suficiente para detectar la fijación de dicho anticuerpo en el mencionado determinante antigénico, y la comparación de un nivel de fijación detectable de dicho anticuerpo al mencionado determinante antigénico en la primera muestra biológica con un nivel de fijación detectable de dicho anticuerpo en el mencionado determinante antigénico en la segunda muestra biológica, detectando a partir de ahí la presencia de un cuadro clínico maligno.

23. Método de cribado para detectar la presencia de un cuadro clínico maligno en un sujeto que comprende:

la detección, en una muestra biológica del sujeto de la presencia de un anticuerpo que se fija de modo inmunoespecífico en un polipéptido antigénico afín a la mesotelina, que comprende SEQ ID NO: 5.

24. El método de la reivindicación 23, en el que el polipéptido antigénico afín a la mesotelina comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos elegida dentro del grupo formado por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 13.

25. Anticuerpo específico de un polipéptido antigénico afín a la mesotelina que comprende:

una región variable de inmunoglobulina monoclonal que no inhibe de forma competitiva la fijación inmunoespecífica de anticuerpo monoclonal MAb K-1 a un polipéptido de mesotelina y que se fija específicamente en un polipéptido afín a la mesotelina, donde dicho polipéptido afín a la mesotelina comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos elegida dentro del grupo formada por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 13.

26. El anticuerpo de la reivindicación 25, que es una proteína de fusión o un anticuerpo de una sola cadena.

27. El anticuerpo de la reivindicación 25, donde el polipéptido antigénico afín a la mesotelina está glicosilado.

28. El anticuerpo de la reivindicación 25, en el que el polipéptido antigénico afín a la mesotelina tiene una masa molecular aparente de aproximadamente 42 a 45 kilodaltons.

29. Método de cribado para detectar la presencia de un cuadro clínico maligno en un sujeto, que comprende:

poner en contacto una muestra biológica de un sujeto con un polipéptido antigénico afín a la mesotelina rotulado de forma detectable, que comprende SEQ ID NO: 5, en condiciones y durante un tiempo suficiente para detectar la fijación al citado polipéptido antigénico afín a la mesotelina de un anticuerpo que se presenta de modo natural en forma soluble en dicha muestra, detectando a partir de ahí la presencia de un cuadro clínico maligno.

30. Molécula aislada de ácido nucleico, elegida dentro del grupo formado por:

(a) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido antigénico afín a la mesotelina, polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos elegida dentro del grupo formado por la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, la secuencia de aminoácidos que aparece en SEQ ID NO: 2 y la secuencia de aminoácidos que aparece en SEQ ID NO: 13; y

(b) una molécula de ácido nucleico capaz de hibridar con una molécula de ácido nucleico de (a) en condiciones moderadamente rigurosas y que codifica un polipéptido antigénico afín a la mesotelina,

donde la molécula de ácido nucleico aislada no es una molécula de ácido nucleico constituida por la secuencia de nucleótidos elegida dentro del grupo formado por la secuencia de nucleótidos que aparecen en SEQ ID NO: 15, la secuencia de nucleótidos que aparecen en SEQ ID NO: 16, la secuencia de nucleótidos que aparecen en SEQ ID NO: 17 y la secuencia de nucleótidos que aparecen en SEQ ID NO: 18.

31. Un oligonucleótido antisentido que comprende por lo menos 15 nucleótidos consecutivos complementarios de la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 30.

32. Una proteína de fusión que comprende una secuencia de polipéptidos condensada con un polipéptido antigénico afín a la mesotelina.

33. La proteína de fusión de la reivindicación 32, en la que el polipéptido es una enzima.

34. La proteína de fusión de la reivindicación 33, donde la secuencia de polipéptidos condensada con un polipéptido afín a la mesotelina se puede segmentar mediante una proteasa.

35. La proteína de fusión de la reivindicación 32, donde la secuencia de polipéptidos es un polipéptido de marca (tag) por afinidad, que tiene afinidad por un ligando.

36. Constructo de expresión recombinante que comprende por lo menos un promotor ligado operativamente a un ácido nucleico de la reivindicación 30.

37. El constructo de expresión de la reivindicación 36, donde el promotor es un promotor regulado.

38. Constructo de expresión según la reivindicación 36, donde el polipéptido antigénico afín a la mesotelina se expresa como proteína de fusión con un producto polipeptídico de una segunda secuencia de ácido nucleico.

39. El constructo de expresión de la reivindicación 36 en el que el producto polipeptídico de dicha segunda secuencia de ácidos nucleicos es una enzima.

40. Constructo de expresión recombinante según la expresión 36, donde el constructo de expresión es un constructo de expresión viral recombinante.

41. Una célula huésped que comprende un constructo de expresión recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 36-40.

42. Una célula huésped según la reivindicación 41, donde la célula huésped es una célula procariota.

43. Una célula huésped según la reivindicación 41, donde la célula huésped es una célula eucariota.

44. Método de producción de un polipéptido antigénico afín a la mesotelina recombinante, que comprende:

el cultivo de una célula huésped que comprende un constructo de expresión recombinante que comprende por lo menos un promotor ligado operativamente a una secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 36.

45. El método de la reivindicación 44, donde el promotor es un promotor regulado.

46. Método de producción de un polipéptido antigénico afín a la mesotelina recombinante, que comprende:

el cultivo de una célula huésped infectada con el constructo de expresión viral recombinante de la reivindicación 44.

47. Método para detectar la expresión antigénica afín a la mesotelina en una muestra, que comprende:

(a) poner en contacto un oligonucleótido antisentido según la reivindicación 31 con una muestra que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido antigénico afín a la mesotelina que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 13 o un fragmento o variante de la misma, que conserva esencialmente la misma función y/o actividad biológica, y,

(b) la detección en la muestra de una cantidad de ácido nucleico que codifica el polipéptido antigénico afín a la mesotelina, que hibrida con el oligonucleótido antisentido, detectándose a partir de ahí la expresión antigénica afín a la mesotelina en la muestra.

48. Método según la reivindicación 47, en el que la cantidad de ácido nucleico que codifica el polipéptido antigénico afín a la mesotelina que hibrida con el oligonucleótido antisentido se determina utilizando reacción en cadena de polimerasa.

49. Método según la reivindicación 47, en el que la cantidad de ácido nucleico que codifica polipéptido antigénico afín a la mesotelina, que hibrida con el oligonucleótido antisentido se determina utilizando un ensayo de hibridación.

50. Método según la reivindicación 47, en el que la muestra comprende una preparación de ARN o cADN.

51. Anticuerpo específico de un polipéptido antigénico afín a la mesotelina, que comprende SEQ ID NO: 5, que se utiliza en un método de cribado para detectar la presencia de un cuadro clínico maligno en un sujeto.

52. Polipéptido antigénico afín a la mesotelina que comprende SEQ ID NO: 5, que se utiliza en un método de cribado para detectar la presencia de un cuadro clínico maligno en un sujeto.