NO175944B - Monoklonale antistoffer for anvendelse til in vitro påvisning av tumorassosiert mucinantigen, og hybridomcellelinjer som produserer disse - Google Patents
Monoklonale antistoffer for anvendelse til in vitro påvisning av tumorassosiert mucinantigen, og hybridomcellelinjer som produserer disse Download PDFInfo
- Publication number
- NO175944B NO175944B NO874796A NO874796A NO175944B NO 175944 B NO175944 B NO 175944B NO 874796 A NO874796 A NO 874796A NO 874796 A NO874796 A NO 874796A NO 175944 B NO175944 B NO 175944B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- mol
- antibody
- hybridoma cell
- antibodies
- cell line
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 124
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 124
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 124
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 title claims abstract description 75
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 43
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 title claims description 25
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 title claims description 25
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 126
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 58
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 9
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 84
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 61
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 59
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 59
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 59
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 59
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 52
- 208000002151 Pleural effusion Diseases 0.000 claims description 36
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 30
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 29
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 27
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 23
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 21
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 16
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 16
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 11
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 10
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 7
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 5
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 5
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 claims description 5
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 5
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 4
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 4
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 4
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 claims description 3
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 3
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 claims description 3
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 2
- 210000000069 breast epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 claims 4
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 claims 4
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 claims 4
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 claims 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 claims 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims 1
- 108010063954 Mucins Proteins 0.000 abstract description 202
- 102000015728 Mucins Human genes 0.000 abstract description 202
- 229940051875 mucins Drugs 0.000 abstract description 80
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 29
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 92
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 description 33
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 32
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 28
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 28
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 27
- 102100039648 Lactadherin Human genes 0.000 description 26
- 101710191666 Lactadherin Proteins 0.000 description 25
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 20
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 206010063045 Effusion Diseases 0.000 description 15
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 14
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 13
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 13
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 12
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 12
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 12
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 12
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 11
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 11
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 11
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 11
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 11
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 11
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 10
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 9
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 8
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 8
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 7
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 7
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N EtOH Substances CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 6
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 5
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 5
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 5
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 5
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 5
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 5
- FOIAQXXUVRINCI-LBAQZLPGSA-N (2S)-2-amino-6-[[4-[2-[bis(carboxymethyl)amino]-3-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]propyl]phenyl]carbamothioylamino]hexanoic acid Chemical compound N[C@@H](CCCCNC(=S)Nc1ccc(CC(CN(CCN(CC(O)=O)CC(O)=O)CC(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O)cc1)C(O)=O FOIAQXXUVRINCI-LBAQZLPGSA-N 0.000 description 4
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 2-Amino-2-Deoxy-Hexose Chemical compound NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 4
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 4
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 4
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010055113 Breast cancer metastatic Diseases 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000013276 bronchoscopy Methods 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 3
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 3
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 208000005726 Inflammatory Breast Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 206010021980 Inflammatory carcinoma of the breast Diseases 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101001035658 Mus musculus 28 kDa heat- and acid-stable phosphoprotein Proteins 0.000 description 2
- 101000785917 Mus musculus Arf-GAP with SH3 domain, ANK repeat and PH domain-containing protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000735426 Mus musculus Poly(A) RNA polymerase, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 201000004653 inflammatory breast carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 235000008939 whole milk Nutrition 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 2-amino-2-deoxy-D-galactopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KJDSORYAHBAGPP-UHFFFAOYSA-N 4-(3,4-diaminophenyl)benzene-1,2-diamine;hydron;tetrachloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.Cl.C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 KJDSORYAHBAGPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UCDLBNQQNRQANR-UHFFFAOYSA-N 4-(4-amino-3-methylphenyl)-2,6,6-trimethylcyclohexa-2,4-dien-1-amine Chemical compound CC1(C)C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=CC=2)=C1 UCDLBNQQNRQANR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 229910014813 CaC2 Inorganic materials 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910052688 Gadolinium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101001034314 Homo sapiens Lactadherin Proteins 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 102000005717 Myeloma Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010045503 Myeloma Proteins Proteins 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003788 Neoplasm Micrometastasis Diseases 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 1
- 108010046516 Wheat Germ Agglutinins Proteins 0.000 description 1
- OXNGKCPRVRBHPO-XLMUYGLTSA-N alpha-L-Fucp-(1->2)-beta-D-Galp-(1->3)-[alpha-L-Fucp-(1->4)]-beta-D-GlcpNAc Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]2NC(C)=O)O[C@H]2[C@H]([C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O2)O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OXNGKCPRVRBHPO-XLMUYGLTSA-N 0.000 description 1
- CMQZRJBJDCVIEY-JEOLMMCMSA-N alpha-L-Fucp-(1->3)-[beta-D-Galp-(1->4)]-beta-D-GlcpNAc-(1->3)-beta-D-Galp-(1->4)-D-Glcp Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H]([C@H](O[C@@H]3[C@H](OC(O)[C@H](O)[C@H]3O)CO)O[C@H](CO)[C@@H]2O)O)[C@@H]1NC(C)=O CMQZRJBJDCVIEY-JEOLMMCMSA-N 0.000 description 1
- DUKURNFHYQXCJG-JEOLMMCMSA-N alpha-L-Fucp-(1->4)-[beta-D-Galp-(1->3)]-beta-D-GlcpNAc-(1->3)-beta-D-Galp-(1->4)-D-Glcp Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](O[C@@H]2[C@H]([C@H](O[C@@H]3[C@H](OC(O)[C@H](O)[C@H]3O)CO)O[C@H](CO)[C@@H]2O)O)O[C@@H]1CO DUKURNFHYQXCJG-JEOLMMCMSA-N 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N beta-D-glucosamine Chemical compound N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 208000030270 breast disease Diseases 0.000 description 1
- 208000011803 breast fibrocystic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011976 chest X-ray Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000469 ethanolic extract Substances 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000007499 fusion processing Methods 0.000 description 1
- -1 gadolinium Chemical class 0.000 description 1
- UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N gadolinium atom Chemical compound [Gd] UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000016356 hereditary diffuse gastric adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 201000010985 invasive ductal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229940044173 iodine-125 Drugs 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-YPZZEJLDSA-N iodine-125 Chemical compound [125I] ZCYVEMRRCGMTRW-YPZZEJLDSA-N 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000007798 limiting dilution analysis Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 235000021243 milk fat Nutrition 0.000 description 1
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 1
- 201000010225 mixed cell type cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000029638 mixed neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 201000001514 prostate carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000010340 saliva test Methods 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3023—Lung
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3015—Breast
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår hybridomacellelinjer som produserer hittil ukjente monoklonale antistoffer som reagerer med muciner, rensede muciner, og monoklonale antistoffer som er i stand til fortrinnsvis å gjenkjenne nye epitoper på muciner som er forbundet med ondartet vev,
hvilke antistoffer er nyttige til påvisning og behandling av human cancer, i særdeleshet brystcancer.
Muciner er sterkt glycosylerte, høymolekylære glycoproteiner med et carbohydratinnhold på opptil 80%, og utskilles av seroviskosevev i munn, lunger, cervix og tarmer. Muciner er blitt identifisert som tumorassosierte antigener og er blitt isolert fra serum og ascitesvæske fra cancerpasienter, herunder fra pasienter med brystcancer.
Fettdråpene i human melk er omgitt av en bestemt membran som stammer fra plasmamembranen fra apikalover-flatene av melkedannende celler. Interessen for denne membran som er kjent som melkefettdråpemembranen (i det etter-følgende MFGM), er blitt øket som følge av påvisningen av at enkelte av de antigener som finnes innen MFGM, er mucin-lignende og er tumorassosierte, i særdeleshet med carcinomer i brystet. Antistoffer som er rettet mot epitoper på mucinantigener som er forbundet med brystcancer,
er oppnådd fra mus immunisert med fragmenter av humane melkefettperler (i det etterfølgende angitt som HMFG). Disse antistoffer finnes lovende med hensyn til diagnose av brysttumorer. Av særlig interesse er antistoffer rettet mot høymolekylære (Mr større enn 200.000), mucin-lignende komponenter av MFGM. Antistoffer til mucin-lignende antigener har vært anvendt med hell til diagnose av mikro-metastaser med biopsier, som en tumorprognoseindikator til radiolokalisering av tumorer og til serumanalyse til overvåkning av tumorutvikling. Det henvises til Linsley et al., Cancer Research, 46, s. 5444-5450 (1986).
De fleste av tidligere karakteriserte mucin-antigener har vist seg å være til stede i normalt vev foruten i tumorvev. Variasjoner i mucin-lignende antigener fra normale og fra tumorkilder har vært undersøkt av
Burchell et al., J. Immunol., 131, s. 508 (1983), som fant forskjeller i forholdet mellom determinanter som gjenkjennes av to monoklonale antistoffer (HMFG-1) og (HMFG-2) i normale, humane brystepitelceller, og i brysttumor-cellelinjer. Disse undersøkelser viste at det relative bindingsnivå for HMFG-1 og HMFG-2 varierte mellom cellelinjer fra normalt og ondartet brystepitel, idet HMFG-2-epitopen var sterkere uttrykt på tumorcellelinjene.
Sekine et al., i J. Immunol., 135, s. 3610 (1985), sammenlignet mucin-lignende antigener som reagerte med det monoklonale DF3-antistoff, Kufe et al., Hybridoma, 3,
s. 223 (1984), fra melk og pleurale effusjonsvæsker fra brystcancerpasienter. Disse undersøkelser antyder at muciner er antigent sammensatte, idet de uttrykker et antall forskjellige epitoper både på normalt vev og på tumorvev, og antyder også at muciner med hensyn til ut-trykkelse av epitoper kan variere mellom forskjellige vevs-kilder. Antistoffer som reagerer med epitoper på mucin-lignende antigener som finnes i forhøyede konsentrasjoner i serum fra brystcancerpasienter, er også beskrevet (Linsley et al., ovenfor og Frankel et al., J. Biol. Response Modifiers, 4, s. 273 (1985)). Et av disse antistoffer Wl er reaktivt med epitoper på et mucinantigen som er forbundet med brystcancerceller. Wl-antistoffet har vært anvendt ved en prøve til påvisning av nærvær av antigen i forhøyede konsentrasjoner i serum fra brystcancerpasienter (Linsley et al., ovenfor). Foruten Wl-epitopen kan andre epitoper slik som T- (Thomsen-Frieden-reich) og Tn-mucinepitopene, som er kjent for å være carcinomer, påvises ved en prøve under anvendelse av monoklonale antistoffer. Det henvises til Springer og Desai, Molecular Immunology, 22, s. 1303-1310 (1985) og Springer, Science 224, s. 1198-1206 (1984).
Det ville være ønskelig å utvikle nye antistoffer som utviser forøket spesifisitet ved prøver for tumorassosierte antigener som finnes i prøver fra humane individer. Slike antistoffer bør optimalt være i stand til å identifiseres ved spesifikke epitoper på et tumorassosiert mucinantigen, hvilke epitoper finnes i sterkt forminskede nivåer på, eller er skjult på antigen som stammer fra normalt vev. Slike antistoffer kunne deretter anvendes til å utføre mer følsomme prøver til påvisning av nærvær av cancer ved fortrinnsvis å reagere med tumorassosierte antigener i serum fra pasienter med cancer.
Foreliggende oppfinnelse angår således et monoklonalt antistoff til ln vltro anvendelse til påvisning av tumorassosiert mucinantigen, hvilket antistoff er kjennetegnet ved at det er av den art som oppnås ved dyrkning av en hybridomacellelinje valgt fra gruppen omfattende ATCC nr. HB 9209,
HB 9244, HB 9245, HB 9246, HB 9247, HB 9216, HB 9248, HB 9249, HB 9250, HB 9217, HB 9212, HB 9229, HB 9210, HB 9243, HB 9211 og HB 9365, og som er i stand til å binde tumorassosierte mucinantigener.
Oppfinnelsen angår også en hybridomacellelinje, hvilken hybridomacellelinje er kjennetegnet ved at den frembringer et monoklonalt antistoff ifølge krav 1 og er valgt fra gruppen omfattende ATCC nr. HB 9209, HB 9244, HB 9245,
HB 9246, HB 9247, HB 9216, HB 9248, HB 9249, HB 9250, HB 9217, HB 9212, HB 9229, HB 9210, HB 9243, HB 9211 og HB 9365.
Visse av hybridomacellelinjene oppnås under anvendelse av metoder hvor renset mucinantigen inngår som immunogen. De monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen kan anvendes til å undersøke serum med henblikk på påvisning av nærvær av tumorassosierte mucinantigener. I tillegg kan undersøk-elser til påvisning av mucinantigener i biologiske prøver, innbefattende spytt og bronkiale avstryk samt utskyllings-prøver, utføres under anvendelse av disse antistoffer.
Som sådan kan de av hybridomacellelinjene ifølge oppfinnelsen produserte antistoffer fremskynde diagnosen og behandlingen av human cancer, herunder bryst- og lungecancer.
Oppfinnelsen angår også renset tumorassosiert mucinantigen som har anvendelse ved fremstilling av monoklonale antistoffer, hvilket antigen er kjennetegnet ved at det hovedsakelig har følgende aminosyresammensetning: 14,5 mol% alanin, 3,4 mol% arginin, 4,4 mol% asparaginsyre, 5,7 mol% glutaminsyre, 9,2 mol% glycin, 2,9 mol% histidin, 0,9 mol% isoleucin, 1,9% leucin, 3,6 mol% lysin, 0,4 mol% methionin, 0,7 mol% fenylalanin, 18,6 mol% prolin, 8,1 mol% serin, 14,6 mol% threonin, 0,5 mol% tyrosin og 10,3 mol% valin.
Oppfinnelsen angår sluttelig anvendelse av et monoklonalt antistoff til påvisning av cancer; for å skjelne mellom normalt og unormalt humant vev, og til påvisning av tumorassosiert mucinantigen hos en pasient, samt testutstyr.
Minst ett av de nye, monoklonale antistoffer fremstilt under anvendelse av renset tumormucinantigen, nemlig det monoklonale antistoff Onc-M26, utviser en preferensiell gjenkjennelse av tumorassosiert mucinantigen i sammenligning med antigen som stammer fra normale kilder. Onc-M2 6-antistoffet utviser en vesentlig redusert reaktivitet overfor antigen isolert fra normale kilder. Dessuten utviser det monoklonale antistoff M38 en høy spesifisitet i forhold til en unik epitop på mucinantigener. Fjorten andre hittil ukjente monoklonale antistoffer som her beskrevet, reagerer likeledes med tumorassosiert mucinantigen. Dessuten viste disse antistoffer seg å være reaktive med antigener som stammet fra normale individer. Atskillige av disse hittil ukjente monoklonale antistoffer synes å reagere med andre epitoper på Wl-antigenet enn tidligere identifiserte epitoper.
Foreliggende oppfinnelse beskrives nærmere i det etterfølgende under henvisning til tegningen, hvor
figur 1 avbilder Wl-antistoff som bindes til fraksjoner fra CsCl-densitetsgradientrensede melkemuciner,
figur 2 er et fotografi av en SDS-PAGE-gel fra CsCl-densitetsgradientrensede melkemuciner,
figur 3 er et fotografi av SDS-PAGE gelanalyse av affinitetskromagrafisk rensede muciner fra melk (spor 2 til 5) og tumorvev (spor 6 = prøve nr. H3300 brysttumormucin fra peritoneal effusjonsvæske, spor 7 = prøve H3415 brysttumormucin fra pleural effusjon og spor 8 = brysttumor-mucinblanding),
figur 4 viser dose-responskurvene for binding av monoklonale antistoffer til rensede muciner under anvendelse
av den her beskrevne lectin-mucininnfangningsprøve (4A: melkemucin, 4B: mucin fra pleural effusjon), og
figur 5 er en grafisk avbildning som viser de mucinantigen-epitopekonsentrasjoner som påvises ved dobbelt determinant-immunoundersøkelse (DDIA) i serumanalyser fra brystcancerpasienter og pasienter med godartede bryst-lidelser, under anvendelse av monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen.
Hybridomacellelinjene som produserer de monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen, oppnås ved hjelp av de generelle metoder som er beskrevet av Kohler og Milstein, Nature, 256, s. 495 (1975). I henhold til disse metoder fremstilles hybridomacellelinjer ved sammensmelting av antistoffproduserende celler (typisk i miltceller fra mus som på forhånd er blitt immunisert med en mucinantigen-kilde) med celler fra en udødelig tumorcellelinje under anvendelse av somatiske cellehybridiseringsmetoder.
Midlene anvendt til immunisering av dyr ("immunogener"), som fremkaller produksjon av antistoffer til mucine antigener, har typisk bestått av levende, humane cancerceller, f.eks. brystcancerceller eller MFGM eller cancercellemem-branekstrakter. Det kan foretas inokuleringer med mer enn én type immunogen, idet f.eks. cancerceller og MFGM kan innføres ved separate immuniseringer. Utover MFGM og humane cancercellelinjer anvendes ifølge oppfinnelsen rensede muciner, herunder muciner oppnådd fra tumorkilder som beskrevet nedenfor, som immunogener. Anvendelse av rensede, tumorassosierte muciner som immunogen kan forbedre sjansene for produksjon av antistoffer til bestemte tumorassosierte epitoper.
De hittil ukjente monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen ble frembrakt ved å immunisere mus med cancercellelinjer, MFGM-preparater eller muciner- renset fra melk eller fra pleurale effusjoner fra cancerpasienter som sammenfattet i etterfølgende tabell III. Til immunisering med renset mucin inokuleres dyrene intraperitonealt og/eller subkutant minst én gang med 100 enheter immunogen eller mer. Det kan foretas inokuleringer med mer enn én type immunogen, f.eks. med cancerceller og med MFGM. Immuniser-ingen av dyrene forsterkes to eller tre ganger med immunogen. Miltene fjernes fra dyrene flere dager etter siste forsterkningsimmunisering, og en miltcellesuspensjon fremstilles til sammensmeltning med murine, myelome celler under anvendelse av kjente sammensmeltningsmetoder.
Hybridomacellelinjene fra sammensmeltningsprosessen tillates å vokse. Deretter screenes de resulterende supernatanter under anvendelse av immunoanalysemetoder for i supernatantene å påvise nærvær av antistoffer som er i stand til å bindes til de spesifikke antigener. I enkelte tilfeller ble det anvendt en lectin-innfangningsprøve (WGA) beskrevet i det etterfølgende, som en innledende screening til påvisning i supernatantene av nærvær av monoklonale antistoffer som kunne bindes til rensede antistoffer som stammet fra melk og pleurale effusjoner, eller kunne bindes til mucinantigener i serum tilveiebrakt fra mennesker med og uten cancer. I andre tilfeller ble supernatanter screenet med hensyn til evnen til å binde dyrkede cancerceller eller MFGM. En enzymimmunoanalyse (ELISA) ble anvendt til påvisning av binding av antistoff til lectinadherert, renset mucinantigen MFGM. Ytterligere screeningstyper ble utført på hybridomasupernatantene, herunder konkurrerende bindingsanalyser og iakttagelser av fluorescente bindings-mønstre som beskrevet i eksemplene.
En dobbelt determinantimmunoanalyse (DDIA) (Linsley et al., ovenfor), hvorved antistoffbindingen til epitoper på mucinantigenet, slik som Wl-epitopen ble avprøvet, ble anvendt til analyse av funksjonen av de hittil ukjente monoklonale antistoffer ved human serumanalyse til påvisning av tumorassosiert mucinantigen, og til å sammenligne de hittil ukjente antistoffer med Wl-antistoffet, og ved analyser av bronchiale avstryk oppnådd under bronkoskopi på mennesker. Ved DDIA anvendes et antistoff, fortrinnsvis et monoklonalt antistoff ("innfangnings"-antistoff" ) som er immobilisert på et substrat slik som en plaststruktur eller en kolonne til innfangning av antigen som forefinnes i en væskeprøve slik som blodserum fra en cancerpasient.
(Serum fra en pasient uten cancer anvendes som kontroll).
Et annet antistoff som også fortrinnsvis er et monoklonalt
antistoff, og som kan være merket til påvisning, f.eks.
125
med et radionuklid slik som jod-125 ( I) eller pepperot-peroxydase (HRP) ("påvisnings"-antistoffet), tilsettes.
Det merkede antistoff vil bindes til eventuelt innfanget antigen, hvilket tillater påvisning og mengdebestemmelse av mucinantigen som forefinnes i sera. I enkelte tilfeller hvor et antigen inneholder epitopegjentagelser slik som Wl-epitopen, kan det annet antistoff være det samme som det første antistoff, idet f.eks. begge er Wl-antistoff (homolog DDIA). Ved ikke-gjentatte epitoper kan det være nødvendig å anvende et annet antistoff som kan bindes til en avvikende epitope på antigenet, fordi eksempelvis en epitope er blokkert ved binding til det første antistoff. Sistnevnte betegnes som en heterolog DDIA, og hver analyse benevnes i overensstemmelse med det antistoff som anvendes som innfangningsantistoff som angis først, og det antistoff som anvendes som konjugat ved påvisningen. Ved "M26/M29"-analysen anvendes således M26 som innfangningsantistoff og HRP-M29 som konjugert påvisningsantistoff.
Optimalt er det ønskelig å identifisere nye epitoper på tumorassosierte antigener for å muliggjøre fremstillingen av monoklonale antistoffer som kan anvendes ved utøvelsen av en immunoanalyse under utvisning av forøket følsomhet og spesifisitet, det vil si tilveiebringelse av en analyse som bedre er i stand til å skjelne prøver fra personer med cancer fra prøver oppnådd fra personer uten cancer ved å forminske forekomsten av falske positive resultater.
Falske, positive resultater forekommer når analysen indikerer forekomst av cancer hos en pasient som ikke har cancer, fordi antistoffet binder til epitoper på mucinantigen fra normale kilder. Hertil kommer at en analyses følsomhet kan økes ved å anvende antistoffer med høyere spesifisitet for mucinantigener, i særdeleshet for epitoper på tumorassosierte antigener, idet små mengder av antigen vil bli bundet slik at tidlige stadier av cancer hos pasienter kan . påvises. Oppfinnelsen belyses nærmere i de etterfølgende eksempler.
Eksempel 1
Rensing av mucinantigener fra tumorkilder og normale
kilder
Kilder for mucinantigen
Kilder for mucin som ble anvendt ved utvikling av de monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen, ble utvalgt ved å undersøke et antall forskjellige prøver oppnådd fra melk, pleurale effusjonsvæsker og tumorer fra mennesker med' hensyn til antigenaktivitet. Antigenaktivitet ble påvist under anvendelse av en konkurrerende cellebindingsanalyse som beskrevet av Linsley et al. Denne analyse ble også anvendt til overvåkning av mucinrensing som beskrevet i det etterfølgende. Ved utvelgelsesmetoden ble prøver testet
125
med hensyn til evnen til å inhibere bindingen av I-merket eller HRP-konjugert Wl-antistoff til W5-6 celler. W5-6 er en cellelinje som er beriket med hensyn til mucin-antigener, hvilken cellelinje ble oppnådd fra Calu-1 lunge-carcinomaceller som beskrevet i det etterfølgende. En enhet inhiberende aktivitet defineres som den mengde materiale som bevirker en 50% reduksjon av bindingen av 125 I-merket eller HRP-konjugert Wl-antistoff (tilsatt i en konsentrasjon på 0,4 ug/ml) til 3 x 10 W5-6 celler.
125
Bindingen av I-merket Wl-antistoff ble påvist under anvendelse av en gammateller, og bundet HRP-konjugert Wl-antistoff ble påvist under anvendelse av en ELISA-analyse. HRP ble konjugert direkte til Wl-antistoffet ved hjelp av en modifikasjon av den av Nakani og Kawoi, J. Histochem. Cytochem., 22, s. 1084 (1974), beskrevne metode. Konjugatet utviste et molart forhold mellom HRP og antistoff på ca. 1:1. Bundne HRP-Wl-antistoffkonjugater ble påvist ved tilsetning av en oppløsning av ortho-fenylendiamin (OPD)
(100 ul), (0,5 ug/ml) i 100 mM natriumcitrat ved pH 5,0, hvilken løsning ytterligere inneholdt 0,0075% (volum/volum) H202. En gul farve fra reaksjonen mellom substrat og
enzym fikk utvikles inntil det ble oppnådd en maksimal absorbans på 0,4-1,5 (optiske densitetsenheter eller O.D.) ved 490 nm ifølge bestemmelse med et spektrofotometer.
(Disse verdier ligger innenfor det optimale område for
ELISA). Enzymsubstratfarvereaksjonene ble avsluttet ved tilsetning av 50 1 1,3 N H2S04, og absorbansen ved 490 nm ble målt under anvendelse av en "Microtiter"-plateavleser. Wl-antistoffet ble anvendt som følge av dets kjente reaktivitet med mucinantigener. Hovedsakelig identiske verdier ble oppnådd under anvendelse av de to analyse-metoder .
Under anvendelse av de ovenfor angitte metoder viste det seg at normal, human melk inneholdende proteiner som stammer fra brystepitel såvel som effusjonsvæsker som stammer fra cancerpasienter, inneholdt høye konsentrasjoner av Wl inhiberende aktivitet (større enn 1000 enheter/ml) . På grunn av muligheten for individuelle variasjoner som ikke var relatert til den ondartede tilstand mellom prøvene, ble muciner fra fire forskjellige melke-prøver og to pleurale effusjonsprøver renset. En blanding av syre-ethanolekstraherte brysttumorer fra et stort antall individer ble også anvendt som kilde for rensing av muciner. Rensingen av muciner fra disse kilder er beskrevet nedenfor.
Oppsamling av melk og pleurale effusjonsvæsker
Melk ble oppnådd fra fire cancerfrie donorer og
ble betegnet som prøve Milk 1, Milk 2, Milk 7 og Milk 11. Prøvene ble nedfrosset innenfor 5 til 10 minutter etter oppsamling. Først ble både oppløselige og MFGM-assosierte former av Wl-bindende muciner funnet i melkeprøvene. For å maksimere det totale utbytte av oppnådd mucin ble analysen ikke begrenset til den MFGM-assosierte form av antigenet fra melk.
De anvendte effusjoner inneholdt overveiende en oppløselig form av mucin. Pleurale effusjoner ble oppnådd fra brystcancerpasienter på Virginia Mason Hospital i Seattle, WA. En prøve (nr. H3300) ble sammensatt av peritoneal væske fra en pasient med diagnostisert, metastatisk, lobulær brystcancer. Prøve nr. H3422 var en pleural effusjonsvæske fra en pasient som opprinnelig fikk diagnostisert inflammatorisk brystcancer og som deretter utviklet moderat til veldifferensiert, infiltrerende, duktalt adenocarcinom. En annen prøve (nr. H3415) besto av pleural effusjonsvæske fra pasienter med diagnostisert, inflammatorisk brystcancer. Effusjonsvæskene ble oppbevart i frosset tilstand ved -20°C.
Isolering av muciner oppnådd fra melk og fra effusjonsvæsker
Den preliminære metode som ble anvendt til rensing av muciner fra melk og fra effusjonsvæsker, var en modifikasjon som beskrevet av Linsley et al., av den av
Creeth et al., Biochem. J. , 167, s. 557 (1977), beskrevne fremgangsmåte. Denne fremgangsmåte tillot preliminær rensing av både MFGM-assosierte og oppløselige•muciner og motvirket overbelastning av de til den endelige rensing anvendte, kromatografiske affinitetskolonner. I korthet ble fullmelken og effusjonsvæskene opptint, og guanidin-HCl ble tilsatt under dannelse av en sluttkonsentrasjon på 6 M. Blandingen ble omrørt inntil den var klar. Likevekts-sedimentering ved hjelp av cesiumklorid-densitetsgradienter ble deretter utført. Cesiumklorid (CsCl) ble tilsatt til , en konsentrasjon på 0,6 g/ml (opprinnelig volum), og densiteten ble innstilt til 1,33-1,35 g/ml ifølge gravi-metrisk måling. Prøvene ble deretter sentrifugert under anvendelse av en "Beckman 50,2"-rotor ved 40.000 opm (gjennomsnittlig 145.500 x G) i 60 til 65 timer ved 21°C. Fraksjoner ble oppsamlet fra bunnen av sentrifugeglasset, og densiteter ble målt. Fraksjonene ble dialysert mot 1^0 og ble deretter analysert med hensyn til Wl-inhiberende aktivitet som beskrevet ovenfor. Med hensyn til muciner som stammet fra effusjonsvæsker, ble toppfraksjoner forenet 1 og underkastet en ytterligere sentrifugering under anvendelse av en CsCl-gradient inneholdende 0,2 M guanidin-HCl.
Affinitetskromatografi
Til den endelige rensing av muciner ble det anvendt ; affinitetskromatografi. Toppfraksjoner med Wl-inhiberende aktivitet fra CsCl-gradienter ble blandet med antistoff W9 konjugert til "Sepharose" 4B i forhold på 200-3.500 enheter/mg antistoff i en 50 mM NaCl-oppløsning som var bufferinnstilt til pH 6,5 med 20 mM HEPES. W9-antistoffet ble valgt fordi W9-epitoper er funnet på samme molekyl som Wl-epitoper og fordi eluering av bundet mucin ble oppnådd ved en lavere pH-verdi ved anvendelse av W9-antistoff enn ved anvendelse av Wl-antistoff. Bundet antigen ble eluert som beskrevet ovenfor av Linsley et al., Biochemistry,
25, s. 2978 (19.86). Proteinkonsentrasjoner ble bestemt som beskrevet av Markwell et al., Anal. Biochem., 87,
s. 206 (1979).
Tumoravledet mucinblanding
Blandinger av tumoravledet mucin ble renset fra syre-ethanolekstraherte brysttumorer oppnådd fra dr. J. Rowe (Oncogen, Seattle, WA). Kirurgiske prøver hvorav hovedparten var brysttumorvev med forskjellig histologisk klassifisering, ble blandet og oppbevart i frosset tilstand ved -70°C. Tumorvevprøver (45 g hver) ble opptint i et volum bestående av 250 ml ekstraksjonsbuffer (95% ethanol, 100 mM HC1, fenylmethylsulfonylfluorid (32 ug/ml), aprotinin (2 mg/ml)), og blandingen ble omrørt deretter i 16 timer ved 4°C. Uoppløselig materiale ble oppsamlet ved sedimentering ved 4°C ved 10.000 x G i 30 minutter, ble resuspendert i 1^0 til en konsentrasjon på ca. 4 g/ml (vekt/volum) og guanidin, HC1 ble deretter straks tilsatt under dannelse av en sluttkonsentrasjon på 6 M. Blandingen ble kraftig hvirvlet opp og fikk stå over natten ved 4°C, hvoretter den ble sedimentert ved 1000 x G i 10 minutter,
og supernatanten ble deretter oppsamlet etter fjerning av lipidfasen. CsCl-densitetsgradientsentrifugering og affinitetsrensing ble utført som ovenfor beskrevet.
Natriumdodecylsulfat- polyacrylamidgelelektroforese ( SDS- PAGE)
Til vurdering av renhet ble SDS-PAGE utført på aliquoter av CsCl-gradientfraksjoner av muciner som viste seg å utvise Wl-inhiberende aktivitet. Ved denne fremgangsmåte ble det anvendt polyacrylamidgeler med en 5-20% gradient sammen med 4% stablingsgeler som beskrevet av Linsley et al., Biochemistry. Prøvene ble analysert under reduserende betingelser. Gelene ble farvet ved anvendelse av Coomassie Brilliant Blue, ble avfarvet, behandlet med 0,2% perjodsyre i 40 minutter ved 4°C og ble igjen farvet under anvendelse av Schiffs reagens i 40 minutter ved 4°C.
Aminosyreanalyse
Aminosyreanalysen av de affinitetsrensede muciner erholdt som beskrevet ovenfor, ble utført under anvendelse av standardmetoder beskrevet av Lowell H. Ericson (AAA Laboratories, Seattle, WA) etter hydrolyse-i 20 timer i 6 N HC1 ved 115°C.
Resultater
Biokjemisk analyse av rensede muciner
Muciner som stammet fra melk og som var i stand
til å binde til Wl-antistoff (fig. 1), ga ved CsCl-gradient-sedimentering som et gjennomsnitt av 7 forsøk, et bånd ved en densitet på 1,38 - 0,01 (standardavvik). Dette resulterte i en ca. 10-dobbel mucinrensing med et utbytte på ca. 40%. CsCl-densitetsgradientrensing av muciner oppnådd fra human melk i overensstemmelse med de ovenfor angitte fremgangsmåter, fremgår av figur 2. Muciner fra melk danner bånd ved en høyere likevektsdensitet enn hoveddelen av andre melkeproteiner slik det fremgår av SDS-PAGE-elektroforese. Tilsvarende rensing ble oppnådd med muciner av pleurale effusjonsvæsker og de blandede syre-ethanol-ekstrakter fra brysttumorer.
Affinitetsrensing av mucin fra melk resulterte i
at ca. 52% av den antigene mucinaktivitet i de blandede CsCl-fraksjoner (4 forsøk) ble gjenvunnet i eluatet, og det ble oppnådd en ca. 400-dobbel rensing av aktivitet i forhold til fullmelk. Med hensyn til pleurale effusjoner ble tilsvarende aktivitetsprosenter oppnådd i affinitets-kolonneeluatet, hvilket førte til en samlet rensing på ca. 2.300 ganger under dannelse av et samlet utbytte på ca. 26%.
SDS-PAGE-elektroforeseanalyser av affinitetsrensede mucinpreparater oppnådd fra melk eller tumorer (prøve nr. H3300 effusjon, prøve nr. H3415 effusjon og blandede ekstrakter fra brysttumorer) fremgår fra figur 3.
De overveiende bestanddeler i alle mucinpreparater var av langsomt migrerende PAS-farvende art og ble bundet til Wl-antistoff ved immunoblotting-forsøk. Hertil kommer at alle preparater inneholdt lavmolekylære urenheter i varierende mengder og med varierende molekylvekt, hvorav ingen reagerte med Wl-antistoffet. Muciner som stammet fra alle tre tumorkilder, inneholdt komponenttyper som migrerte som diffuse bånd med ca. Mr = 400.000 (angitte molekylvekter må betraktes som overslag da de ligger utenfor intervallet av de anvendte standarder og på grunn av den høye glycosyler-ingsgrad av disse molekyler). Preparater fra prøve H3300
og tumorblandingen ble hver især adskilt i to komponenter med hhv. Mr = 350.000 og 420.000 og 370.000 og 435.000. Muciner fremstilt fra forskjellige melkeprøver, utviser betraktelig variasjon med hensyn til migrering under SDS-PAGE. De forskjellige komponenter fra disse melkepreparater som migrerte med disse forskjellige hastigheter, utviste ingen signifikante forskjeller med hensyn til immunoreaktivitet overfor noen av de i det foreliggende, omhandlede antistoffer.
Melkepreparater nr. 2 og 7 inneholdt to diffuse fraksjonstyper med relativ molekylvekt Mr = 335.000 og 480.000 for preparat nr. 2 og 400.000 og 500.000 for preparat nr. 7. Preparat nr. 1 og 11 inneholdt hver især bare enkelte diffuse fraksjonstyper med hhv. Mr = 450.000
og 380.000. Det ble ikke iakttatt noen signifikante forskjeller med hensyn til immunoreaktivitet hos de hurtigere eller langsommere migrerende komponenter overfor noen av de anvendte antistoffer.
Aminosyresammensetningen for muciner renset fra
melk (preparat nr. 2) og effusjoner (prøve nr. H3300,
H3415 og H3422) fremgår av tabell I. Aminosyresammensetningen av glycoproteinet PAS-0 beksrevet av Shimizu et al., J. Biochem., Tokyo, 91, s. 515 (1982), inngår i tabell I
til sammenligning. (Verdiene bestemt for serin og threonin, ble korrigert med hhv. 10% og 5% til kompensering for destruksjon under hydrolyse).
Fra tabell I fremgår det at selv om enkelte forskjeller med hensyn til sammensetning ble iakttatt, stemte de generelle aminosyresammensetninger av begge preparater godt overens og stemte også godt overens med.sammensetningen av PAS-O. Aminosyrene alanin, glycin, prolin, serin og threonin utgjorde 59 og 66% av den samlede mengde av aminosyrer i hhv. melkepreparat nr. 2 og effusjonsprøve nr. H3300. Dette stemmer overens med 65% for de samme aminosyrer i PAS-O.
Eksempel 2
Frembringelse av monoklonale antistoffer til muciner
Rensede muciner oppnådd som beskrevet ovenfor, ble anvendt til frembringelse av hybridomacellelinjer til fremstilling av monoklonale antistoffer til muciner, og til karakterisering av mucinene.
Celler
Forskjellige humane cancercellelinjer ble anvendt også som immunogener til frembringelse av monoklonale antistoffer med reaktivitet overfor muciner. Calu-l-lunge-carcinomaceller som produserer mucinantigener (tilgjenge-lige fra American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, nr. HTB54), har vist seg å utvise et karakteristisk, heterogent farvningsmønster når fluorescentmerkede antistoffer som gjenkjenner mucinantigen, bindes til cellene. Calu-l-celler ble anvendt til oppnåelse av med hensyn til mucinantigen-berikede, hittil ukjente klonale cellelinjer W5-6 samt US-5, hvilken som beskrevet av Linsley et al., Cancer Research, ovenfor, gir lave mengder mucinantigen. 1 korthet ble Calu-l-cellene oppbevart i Dulbeccos modi-fiserte Eagles medium ("DMEM"), supplert med 10% kalve-fosterserum (FCS). Cellekloning ble utført ved begrensningsfortynning i mikrotestbrønner. Kloner som stammet fra brønner som bare inneholdt enkeltceller ifølge fase-kontrastmikroskopi, ble omhyggelig utvalgt. De oppnådde cellelinjer utviste samme isozym-fenotyper som Calu-1-cellelinjer, som beskrevet av Cell Culture Laboratory, (Children's Hospital, Detroit Medical Centre, Detroit, MI). Det monoklonale antistoff W5 (som beskrevet av Frankel et al., ovenfor) ble anvendt til å isolere derivater av Calu-l-celler fra kloning ved fluorescente farvningsmetoder under anvendelse av fluorescensaktivert cellesortering (FACS). Celler som var farvet som følge av binding av W5-antistoffet, ble deretter sortert ved analysering av celler under anvendelse av FACS og steriloppsamling av de klareste celler (ca. 10% av 100-500.000 celler). W5-6-cellelinjen (klon 6) ble oppnådd ved begrensningsfortynningsanalyse av W5S2-celler som var en cellepopulasjon som ble oppnådd ved 2 ganger å sortere celler oppnådd fra Calu-l-celler som ble farvet som reaksjon på binding av W5-antistoff. US-5-cellelinjen ble oppnådd fra usorterte Calu-l-celler (uberikede). W5-6-cellelinjen utviste en forhøyet grad av Wl-, W5- og W9-antistoffbinding i forhold til evnen hos Calu-l-stampopulasjonen til å binde til disse antistoffer. Den beskrevne W5-6-cellelinje er således beriket med hensyn til mucinantigen. Derimot utviste US5-cellelinjen en sterkt forminsket grad av Wl-, W5- og W9-antistoffbinding i sammenligning med W5-6-cellelinjen eller Calu-l-stam-populas jonen. Angjeldende W5-6-cellelinje er deponert ved ATCC under deponeringsnr. CRL 9267. US-5-cellelinjen ble anvendt ifølge oppfinnelsen som immunogen i et forsøk på
å gjøre mus tolerante overfor nonmucinantigener og for å øke reaktiviteten av de angjeldende, monoklonale antistoffer overfor mucinantigener.
MCF-7, en brystcarcinomacellelinje, ble tilveiebrakt fra dr. Marc Lippman (National Institute of Health, Bethesda, MD) og ble anvendt til frembringelse av monoklonale antistoffer med reaktivitet overfor brystvev-assosierte mucinantigener.
Monoklonale antistoffer
I tillegg til de omhandlede hittil ukjente monoklonale antistoffer ble det også anvendt tidligere beskrevne monoklonale antistoffer ved følgende fremgangsmåter for sammenligning med de hittil ukjente monoklonale antistoffer. Disse antistoffer ble valgt på grunn av tilgjengelig og tidligere påvist reaktivitet ved muciner fra brysttumorer eller andre maligne vev. Disse antistoffer er anført i tabell II.
Antistoffene Wl og W9 (Linsley et al., Cancer Research, ovenfor) ble tidligere betegnet som 2G3 og
245E7 av Frankel et al., J. Biol. Response Modifiers, 4,
s. 273-286 (1985) og ble oppnådd fra dr. David Ring (Cetus Corporation, Emeryville, CA). Antistoff HMFG-1 og HMFG-2 (Taylor-Papadimitriou et al., Int. J. Cancer, 28,
s. 17 (1981) ble erholdt fra Unipath Limited (Bedford, England). Antistoff B72:3 (Colcher et al., PNAS, (USA), 78, s. 3199 (1981)). og DUPAN-2 (Metzgar et al., PNAS (USA), 81, s. 5242 (1984)) ble tilveiebrakt hhv. fra dr. Jeffrey Schlomm (NIH) og dr. Richard Metzgar (Duke University, Raleigh, NC). Antistoffet CA 19-9 (Koprowski et al., Somatic Cell Genetics., 5, s. 957 (1979), antistoffet CO-51.4 (Blaszczyk et al., Hybridoma, 2, s. 240
(1983)) og antistoffet CO-30.1 (Id.), ble alle erholdt fra ATCC. Antistoff L15 og L17 (Hellstrom et al., Cancer Research, 46, s. 3917-3921 (1986), ble erholdt fra dr. I. Hellstrom (Oncogen, Seattle, WA). Antistoff C6 (Fenderson et al., Mol. Immunology, 23, s. 747 (1986) ble erholdt fra dr. Bruce Fenderson og dr. S. Hakomori (Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC), Seattle, WA). Antistoff DF3 ble erholdt fra dr. D. Kufe (Harvard University, Cambridge, MA).
Antistoff B72.3 og DUPAN-2 ble anvendt som ascitesvæske. Antistoff CA19-9 og C6 ble anvendt som dyrknings-supernatanter. Alle andre antistoffer var renset fra ascitesvæske.
Hittil ukjente monoklonale antistoffer
Hittil ukjente hybridomacellelinjer som frembringer monoklonale antistoffer som utviser reaktivitet med rensede muciner og som produserer minst ett antistoff som fortrinnsvis gjenkjenner tumoravledede muciner, ble utviklet under anvendelse av forskjellige immuniseringsmetoder og screeninger som beskrevet i det etterfølgende.
Mus som ble anvendt til immuniseringer, ble erholdt fra FHCRC eller Jackson Laboratories, Bar Harbour, Maine, US. Etter intraperitoneal (i.p.) eller subkutan (s.c.) immunisering med MFGM, MCF-7, W5-6-celler eller US-5-celler eller rensede muciner som beskrevet nedenfor, mottok musene en booster, og 3 dager senere ble miltcellene fjernet fra musene. Miltcellene ble høstet og sammensmeltet med NS-1-myelomaceller (Genetic Systems, Seattle, WA) under anvendelse av kjente sammensmeltningsmetoder, under dannelse av en hybridomacellelinje. Alle hybridomacellelinjer ble klonet med begrensningsfortynning. I enkelte tilfeller ble subkloning utført til oppnåelse av mer stabile hybridoma-celler. Hybridomacellelinjene ble deponert ved ATCC og tildelt de i tabell III angitte deponeringsnummere.
Immuniseringsmetoder
Hybridomacellelinjer som produserer monoklonalt antistoff / 0nc- M8
Balb/c-mus ble immunisert i.p. og s.c. ved injeksjon
av 225 ug MFGM sammen med Freunds komplette adjuvans (CFA).
2 uker senere ble 270 ug MFGM injisert i.p. uten adjuvans.
20 dager senere ble 13 5 ug MFGM injisert subkutant med Freunds ufullstendige adjuvans (IFA). 2 måneder senere ble 200 ug MFGM injisert i.p. uten adjuvans. 8 dager senere ble immuniserte mus gitt en booster bestående av 900 enheter renset melkemucin.
Hybridomacellelinje som produserer monoklonale antistoffer Onc- MlO, One- Mil, 0nc- M12 og 0nc- Ml5
Balb/c-mus ble immunisert i.p. med 1,2 x 10 MCF-7-celler under anvendelse av CFA. 28 dager senere ble 1,2 x 10 7MCF-7-celler injisert i.p. uten adjuvans. 14 dager
7
senere ble 1,3 x 10 MCF-7-celler injisert i.p. uten adjuvans. 24 dager senere ble 1,2 x IO<7> MCF-7-celler injisert i.p. uten adjuvans. Ca. 4 måneder senere, før ut-førelse av cellesammensmeltningen, mottok de immuniserte mus en i.p. booster bestående av 4 x 10^ MCF-7-celler og 100 ug MFGM.
Hybridomacellelinje som produserer monoklonalt antistoff 0nc- M16, 0nc- M21 og Onc- M25
(C57-B1/6 x Balb/c)Fl-hybridmus (0nc-Ml6 og Onc-
M25 ble oppnådd fra samme mus, og 0nc-M21 ble oppnådd fra
en separat immunisert mus) ble immunisert i.p. og s.c. med 10 7 W5-6-celler (Oncogen, Seattle, WA) uten adjuvans. 17 dager senere ble ytterligere 5 x IO<6> W5-6-celler injisert i.p. og s.c. uten adjuvans. 33 dager senere ble 5 x 10 gW5-6-celler deretter injisert i.p. og s.c. uten adjuvans. De immuniserte mus mottok 34 dager etter den siste injeksjon en i.p. booster bestående av MCF-7-celler og 100 ug MFGM uten adjuvans.
Hybridomacellelinje som produserer monoklonalt antistoff Onc- M22 og Onc- M23
Balb/c-mus ble immunisert i.p. med 6,5 x 10^ MCF-7-celler under anvendelse av CFA. 20 dager senere ble 3,5 x IO*' MCF-7-celler injisert i.p. under anvendelse av IFA og 125 ug MFGM. 18 dager senere ble 5 x 10<6> MCF-7-celler injisert i.p. uten adjuvans. Før utførelse av cellesammensmeltning mottok de immuniserte mus en i.p. booster bestående av 160 ug MFGM-celler.
Hybridomacellelinje som produserer monoklonalt antistoff Onc- M26
Balb/c-mus ble immunisert i.p. med 250 enheter CsCl-gradientisolert, pleuralt effusjonsmucin, og 25 dager senere med 150 enheter i.p. og s.c. affinitetsrenset, pleuralt effusjonsmucin fra en pasient med brystcancer (prøve nr. H3300). 8 x 10 W5-6-celler ble dessuten injisert s.c. 33 dager etter de første to pleurale effusjonsinjeksjoner. CFA ble anvendt i forbindelse med den første injeksjon av pleuralt effusjonsmucin, og IFA ble anvendt i forbindelse med de etterfølgende injeksjoner av pleuralt effusjonsmucin. Det ble ikke anvendt adjuvans ved injeksjon av W5-6-celler. Immuniserte mus mottok 30 dager senere en i.p. booster bestående av 1000 enheter SDS-PAGE-gelrenset, pleuralt effusjonsmucin (mucinbåndet var utskåret fra en polyacrylamidgel til injeksjon) med EFA, derpå 24 dager senere 500 enheter av CsCl-gradientisolert mucin, og ytterligere 25 dager senere 1000 enheter CsCl-renset mucin.
Hybridomacellelinje som produserer monoklonalt antistoff Onc- M27
NZB-mus ble immunisert i.p. og s.c. uten adjuvans med 3 injeksjoner bestående av 8,5 x 10 6 til 10 7 W5-6-celler hver 3. uke. En i.p. og s.c. booster bestående av 3 x 10 W5-6-celler og 200 ug MFGM uten adjuvans ble inn-gitt etter 23 dager.
Hybridomacellelinje som produserer monoklonalt antistoff Onc- M29 og 0nc- M30
Neonatale Balb/c-mus (fra Balb/c-mus erholdt fra FHCRC) ble immunisert i.p. uten adjuvans med én injeksjon
bestående av 10 US-5-celler, derpå med en ukes mellomrom
7 7
i.p. med 10 til 2 x 10 W5-6-celler uten adjuvans,
7 etterfulgt 2 1/2 måned senere av en i.p. injeksjon av 10 W5-6-celler uten adjuvans, og en s.c. injeksjon på 310 enheter CsCl-gradientrenset melkemucin. 55 dager senere,
før utførelse av cellesammensmeltning, ble det gitt en i.p. og s.c. boosterinjeksjon bestående av 5 x 10 W5-6-celler og 1000 enheter CsCl-gradientrenset melkemucin.
Hybridoma som produserer monoklonalt antistoff Onc- M38
Balb/c-mus ble immunisert s.c. 3 ganger med 3 ukers intervaller under anvendelse av 800 enheter affinitetsrenset, pleuralt effusjonsmucin fra en pasient med brystcancer (prøve nr. H3415). Mucinet var bundet til poly-L-lycin-overtrukne kiselsyreanhydridperler (0,007 um) før injeksjon i musene. 18 dager etter den tredje immunisering med affinitetsrenset effusjonsmucin mottok musene en i.p. booster bestående av 4.000 enheter affinitetsrenset mucin.
Hybridomacellelinjene som produserer disse hittil ukjente, monoklonale antistoffer som er angitt i tabell III, er deponert ved ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville,
20851 MD, USA. De utviklede immuniseringsmetoder til fremstilling av de hittil ukjente antistoffer som er beskrevet ovenfor, er oppsummert i tabell III. De deponerte hybridomacellelinjer og de monoklonale antistoffer som produseres derav, fremgår dessuten av tabell III.
1) Isotyper ble bestemt ved hjelp av ELISA under anvendelse av klassespesifikke antistoffer. 2) Mus ble immunisert med MFGM, MCF-7, W5-6-celler og US-5 eller rensede mucinpreparater som beskrevet ovenfor. 3) Antigener som ble gjenkjent av foreliggende, hittil ukjente monoklonale antistoffer, ble identifisert ved hjelp av følgende metoder: immunutfelling (IP), immun-blotting (IB) eller dobbelt determinantimmunanalyse (DDIA) som beskrevet i eksempel 2. 4) De i eksempel 2 angitte data ble oppnådd fra en klon, hybridomacellelinje Onc-M29.41 (ATCC nr. HB 9243). Subklon, Onc-M29 (ATCC nr. HB 9210) stammet fra en søsterklon til Onc-M29.41, og ble karakterisert tilsvarende .
Screening
Forskjellige screeningsmetoder ble anvendt til isolering av hybridomacellelinjer som produserte monoklonale antistoffer som var i stand til å bindes til rensede mucinantigener.
Til påvisning av antistoffer som var til stede i hybridomacellelinjesupernatantene og som var i stand til å bindes til rensede muciner oppnådd som beskrevet ovenfor,
ble det utviklet en WGA-innfangningsanalyse. Ved denne metode ble rensede muciner fra pleuraleffusjon eller melk immobilisert på flatbunnede polystyren "Mikrotiter"-plater ("Immunolon" II) med 96 brønner, under anvendelse av Tritium vulgaris lectin (hvetekimagglutinin "WGA"). "Mikrotiter"-platene ble preparert ved å tilsette 50 ul/brønn av en 20 ug/ml oppløsning av WGA i 50 mM tris-HCl inneholdende CaCl2 og 10 mM MgCl2 ved pH 8,0. Etter inkubering ved 2 5°C i 2 timer til overtrekning av platene med WGA ble løsningen fjernet ved oppsugning. Etter affinitetskromatografi ble deretter rensede muciner tilsatt (1,0 inhiberende enhet (inhibering av Wl-antistoffbinding til Wl-antigen) pr. brønn med mindre annet er angitt) i 50 mM tris-HCl og ved pH 8, og inneholdende 1 mM CaCl2 og 1 mM MgCl2« Platene ble deretter inkubert i et tidsrom på fra 1 til 4 timer ved 25 C og ble vasket under anvendelse av PBS-buffer og 2% FCS.
Til utførelse av analysen ble på forhånd identifiserte monoklonale antistoffer tilsatt i metningskonsentra-sjoner (1 ug/ml) for rensede antistoffer, eller i fortynn-inger på 1:50 for ascitesvæsker. Til analyse av hittil ukjente antistoffer ble supernatanter fra hybridomacellelinje-kulturer tilsatt ufortynnet til platene.
Utførelsen av WGA-analysen ble testet med stigende mengder renset melke- og effusjonsmucin ved et forsøk vist i fig. 1. Dose-responskurven for binding av Wl-antistoffet var lineær over mere enn et tidobbelt intervall for inhiberende enheter pr. brønn, både for melk og blandede tumoravledede muciner, men kurven for den tumoravledede prøve skiftet til høyre og ble steilere. Andre undersøkte antistoffer utviste en dose-responskurve som var parallell med kurvene for Wl-antistoffer, men hvis relative posisjoner skiftet avhengig av den bestemte mucin-kilde. Disse resultater indikerer at epitoper som gjenkjennes av antistoffene, er uttrykt med forskjellige relative tettheter på muciner fra normale og fra tumorkilder.
En indirekte enzymimmunoanalyse (ELISA) ble anvendt til påvisning av antistoffbinding ved hjelp av WGA-immobiliserte, rensede mucinantigener. (Denne metode betegnes i det etterfølgende som "WGA innfangningsprøve").
I korthet måles bindingen av de hittil ukjente monoklonale antistoffer som beskrevet ovenfor, ved tilsetning av pepperrotperoxydase (HRP)-konjugert geite-antimus-immunoglobulin, eller ved anvendelse av IgG-spesifikt geite-antimus-antistoff til reduksjon av det oppnådde antall IgG-antistoff.
Til preliminær screening av 0nc-M8-hybridomacelle-linjen ble supernatanter testet 9 dager etter sammensmeltning med hensyn til binding til renset, pleuralt effusjonsmucin under anvendelse av den ovenfor beskrevne WGA innfangningsanalyse. Hybridomacellelinjer som viste seg positive ved bindingstesten, ble underkastet en sekundær, konkurrerende bindingsanalyse under anvendelse av blandinger av normalt serum og tumorserum.
0nc-M10, Onc-Mll, 0nc-Ml2 og 0nc-M15 hybridomacellelinjesupernatanter ble først screenet ved en test i form av en ELISA-analyse med hensyn til binding til levende (ufikserte) MCF-7-celler. Hybridomacellelinjesupernatanter som var positive ved testen, ble underkastet to sekundære screeninger. Først ble det utført en konkurrerende bindingsanalyse under anvendelse av levende MCF-7-celler hvor hver hybridomacellelinjesupernatant ble testet med hensyn til antistoff som var i stand til å bindes til cellene. Deretter ble supernatanter screenet under anvendelse av polylysin til påvisning av binding, til renset melkemucin bundet til plater.
Til preliminær screening av Onc-M16 og Onc-M25 hybridomacellelinjesupernatanter fra sammensmeltning av myelomaceller med miltceller fra immuniserte mus, ble bindingen til paraformaldehydfikserte W5-6-celler testet. Bindingsanalysen ble utført på paraformaldehydfikserte celle-monolag som beskrevet av Linsley et al., i Biochemistry, ovenfor. Hybridomacellelinjer som viste seg positive ved testen, ble underkastet en sekundær screening ved å iaktta det fluorescente farvningsmønster for binding av antistoff til Calu-l-celler.
0nc-M21-hybridomacellelinjen ble screenet preliminært ved å teste bindingen overfor polylysinbundet MFGM under anvendelse av .ELISA. Hybridomacellelinjer som viste seg positive ved testen, ble underkastet en sekundær screening ved bruk av WGA innfangningsprøven, til påvisning av binding under anvendelse av tumorserum og normalt serum.
Onc-M22 og Onc-M23 hybridomacellelinjesupernatanter fra sammensmeltning av myleomaceller med miltceller fra immuniserte mus ble screenet preliminært 11 og 13 dager etter sammensmeltningen. WGA-innfangningsprøven ble anvendt til å påvise tilstedeværende antistoff i hybridomacellelinjesupernatanten som var i stand til fortrinnsvis å bindes til tumorserumprøver fremfor til normale serumprøver.
Onc-M26 hybridomacellelinjesupernatanten fra sammensmeltningen av myelomaceller med miltceller fra immuniserte mus ble testet preliminært 7 dager etter cellesammensmeltningen ved binding til renset, pleuralt effusjonsmucin innfanget av lectin under anvendelse av WGA-bindingsanalysen. Hvor binding ble påvist, ble WGA-ELISA-analysen deretter anvendt til å sammenligne bindingsevnen hos hybridomacellelinjesupernatanten overfor WGA-innfanget mucin fra serum erholdt fra pasienter med tumorer, i forhold til WGA-innfanget mucin fra normalt serum.
Onc-M27, Onc-M29 og 0nc-M30 hybridomacellelinjesupernatantene ble testet 7 dager etter sammensmeltningen ved binding til CsCl-renset melkemucin erholdt som ovenfor beskrevet, under anvendelse av WGA-innfangningsanalysen. Hybridomacellelinjesupernatanter som utviste positive testresultater, ble reanalysert på affinitetsrenset melkemucin under anvendelse av WGA-ELISA-analysen. Hybridoma-cellelin jesupernatantene ble også screenet ved sammen-ligningsbinding til IgG-og IgM-spesifikke geite-antimus-antistoffer, idet supernatanter som viste seg spesifikke overfor IgG, ble utvalgt til ytterligere karakterisering. • Onc-M38 hybridomacellelinjesupernatanten ble screenet med hensyn til nærvær av antistoff ved binding til gradientrenset, pleuralt effusjonsmucin innfanget av lectin under anvendelse av WGA-bindingsanalysen. De hybridoma-cellelin jesupernatanter som viste seg positive ved testen, ble igjen testet ved WGA-bindingsanalysen under anvendelse av gradient- og affinitetsrenset, pleuralt effusjonsmucin.
Hybridomacellelinjesupernatanter som produserte monoklonale antistoffer som utviste binding til mucinantigen (renset antigen eller celleassosiert) som beskrevet ovenfor, ble injisert i pristan-behandlede mus for frembringelse av ascitesvæske, hvorfra de monoklonale antistoffer ble renset under anvendelse av kjente rensemetoder. Etter ammoniumsulfatrensing ble IgG-antistoffer renset ved ione-bytning på "DEAE Sephacel"-kolonner, og IgM-antistoffet
(M26) ble renset under anvendelse av størrelsesfraksjoner
på en "Sephacryl S-300"-kolonne. Isotyper (immunoglobulin underklasser av antistoffene) av rensede antistoffer ble bestemt ved en enzymimmunanalyse (beskrevet nedenfor)
under anvendelse av klassespesifikke antistoffer.
Eksempel 3
Karakterisering av foreliggende, hittil ukjente, monoklonale antistoffer
Evnen hos de nye antistoffer isolert som ovenfor beskrevet, til å bindes til alle de rensede muciner under anvendelse av den ovenfor beskrevne WGA-innfangningsanalyse, ble testet. Det ble anvendt en enkeltkonsentrasjon på
1,5 inhiberende enheter antigen pr. brønn og metningskonsen-trasjoner av antistoff (1 ug/ml). Substratinkuberingen ble
stanset ved oppnåelse av en maksimal O.D.-verdi for hver prøve i intervallet fra 0,4 til 1,4.
Forskjellige ytterligere metoder ble anvendt til
å demonstrere at foreliggende, nye antistoffer gjenkjente mucinantigen som også ble bundet til Wl-antistoff. Disse metoder var immunutfelling (IP) fra tumorcelleekstrakter merket med enten 3 H-glucosamin eller <3>H-threonin, og immunoblotting (IB) på rensede muciner eller cellemembran-preparater som beskrevet av Linsley et al., Biochemistry, 25, s. 2978 (1986). Det ble også anvendt en dobbelt determinant immunoanalyse (DDIA), hvorved antistoffenes evne til å innfange muciner som bandt til HRP-konjugert Wl-antistoff (tabell III), ble testet.
De nye antistoffer ble også testet med hensyn til binding til paraformaldehydfikserte, dyrkede W5-6-cellelinjer som beskrevet i Linsley et al., Biochemistry, 25,
s. 2978 (1986).
Resultater
Antistoffbinding til renset mucinantigen
De her produserte, monoklonale antistoffer reagerer med muciner fra human melk, tumorcellelinjer, pleurale effusjonsvæsker og tumorer ifølge de ovenfor beskrevne WGA-innf angningsanalyser og DDIA-bindingsanalyser. De fleste av de her beskrevne, nye antistoffer reagerte ved mer enn én metode med muciner, idet dog DDIA-metoden alene ble anvendt i forbindelse med antistoffet 0nc-M30. Da de rensede muciner inneholder Wl-epitope (se tabell IV), reagerer de nye antistoffer derfor enten med Wl-epitopen eller med hva som synes å være hittil ukjente epitoper på mucinantigener. Disse antistoffer kan også bindes til ytterligere epitoper på mucinantigener, slik som T- og Tn-epitopene.
Som det fremgår av tabell IV, ga enkelte monoklonale antistoffer (0nc-M8, 0nc-Ml6, Wl og W9) høye absorbansverdier (>0,1) ved binding til hovedparten av prøver fra melke- og tumorkilder, visse antistoffer (0nc-M15, Onc-M22, Onc-M23, Onc-M25, Onc-M27, HMFG-1 og HMFG-2) høye absorbansverdier (>_0,1) ved binding til hovedparten av melkemuciner, men ikke til tumoravledede prøver, og andre antistoffer (Onc-MlO, Onc-Mll, 0nc-M12, 0nc-M21, Onc-M29, 0nc-M30, B72.3, DUPAN-2 og Cal9-9) absorbansverdier på
<0,1 som følge av manglende binding til hovedparten av prøvene fra enten melke- eller tumorkilder. Antistoff Onc-M25 utviste en sterk binding til pleuralt effusjonsmucin (prøve H3300), men svak binding til alle melke-avledede mucinprøver. Selv om visse antistoffer ikke bandt signifikant til pleurale effusjons- eller brysttumormuciner ved den direkte bindingsanalyse, skal det bemerkes at binding av alle antistoffer til mucinepitoper på den pleurale effusjonsmucinprøve H3300 ble påvist ved den mer følsomme DDIA-analyse. Onc-M3 8 ble ikke testet ved denne analyse, men ga ved et separat forsøk høye absorbansverdier for binding til melk og effusjonsmucin.
Muciner renset fra melk fra et antall donorer, viste seg å være antigent like, hvilket antyder at de testede antistoffer ikke påviser polymorfe antigendetermin-anter slik som blodgruppeantigener (f.eks. ABO og Lewis). Selv om 80% av befolkningen er Lewis-positive (og to av melkedonorene, 1 og 7, ved salivatest viste seg å være Lewis-positive), utviste ingen av de tumoravledede muciner ved bindingsanalysen påviselige nivåer av Lewis-antigener. Ingen av melkemucinpreparatene (inklusive prøve 1 og 7) hadde påviselige nivåer av Lewis b (antistoff Co-30.1) eller Lewis y (antistoff L15), mens 3 av preparatene (inklusive prøve 1 og 7) hadde påviselige, men lave nivåer av Lewis a (antistoff CO-51.4) og Lewis x (antistoff L17). Dette antyder at Lewis-antigener bare uttrykkes svakt i melkemucin og i meget liten grad, muligens overhodet ikke,
i mucin som stammer fra brystcarcinomer. Derimot er disse
epitoper blitt påvist på mucin-antigener av tykktarms-carcinomer. Det henvises til Magnani et al., Cancer Research, 43, s. 5489 (1983), og Johnson et al., Cancer Research, 46, s. 850 (1986).
Ved sammenligning med melkemuciner utviser de tumoravledede muciner ganske avvikende antistoffbindings-profiler. Verdiene antyder at monoklonale antistoffer som gjenkjenner hittil ukjente mucinepitoper, identifiseres under anvendelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Wl-antistoff bandt i relativt høyere grad enn andre testede antistoffer til alle tumoravledede prøver, hvilket vil si at bindingen av alle andre antistoffer var redusert i forhold til Wl.
Et av de her beskrevne, nye antistoffer, Onc-M26, produsert av hybridomacellelinje ATCC nr. HB 9212, påviste den mest "tumorspesifikke" epitope. Denne epitope ble påvist også på andre tumoravledede prøver når høyere konsentrasjoner av muciner ble anvendt ved analysen, men i et langt lavere nivå på muciner fra melkeprøver. Onc-M26
synes således å være et monoklonalt antistoff som er i stand til å skjelne mellom nærvær av normale og cancervevassosi-erte muciner i serum fra mennesker ved analyser til påvisning av cancer.
Disse data fastslår at de fleste av foreliggende
nye antistoffer utviser spesifisiteter som avviker fra spesifisiteten av tidligere beskrevne antistoffer. Epitoper på antistoff 0nc-M21 og Onc-M29 kunne imidlertid på basis av disse data ikke skjelnes fra epitoper på andre antistoffer slik som B72.3 og DUPAN 2, da de ikke bandt signifikant til de rensede mucinkilder ved analyse. W5-6-cellebindingsforsøkene viser at 0nc-M21 og Onc-M29 sammenlignet med de tidligere kjente antistoffer, fortrinnsvis bindes til W5-6-cellelinjen, hvilket påviser at disse antistoffer utviser en unik spesifisitet.
Disse resultater viser at rensede muciner som stammer fra tumorkilder ved anvendelse av foreliggende fremgangsmåter, adskiller seg immunologisk fra muciner fra normalt brystepitel som finnes i melk. Foreliggende data antyder også at antigene epitoper som finnes på muciner fra normalt brystepitelvev, kan være skjult av andre determinanter, eller kan forefinnes i redusert grad på muciner oppnådd fra tumorer. Dette antyder på sin side at tumor-muciner kan inneholde epitoper som ikke finnes på muciner fra normale kilder. Rensede muciner, inklusive tumoravledede muciner, kan derfor tilveiebringe et forbedret immunogen til utvikling av monoklonale antistoffer som er i stand til å gjenkjenne mucinantigen, i særdeleshet slike antistoffer som fortrinnsvis er i stand til å reagere med tumoravledede muciner fremfor muciner fra normale kilder.
Eksempel 4
Serumanalyse under anvendelse av monoklonalt antistoff M26 og M2 9
For å demonstrere anvendeligheten av foreliggende monoklonale antistoffer ble en DDIA utført under anvendelse av de ovenfor, i eksempel 2 erholdte monoklonale antistoffer Onc-M26 og Onc-M29. Wl-antistoffet ble anvendt til sammenligning.
"Immunolon" II-plater ble inkbuert med 50 ul/brønn av 10 ul/ml Onc-M26 eller Onc-M29-antistoff i 50 mM tris-buffer, pH 8,0, i 1 time for å belegge platene med antistoff ("innfangningsantistoff"). Væsken ble suget bort og platene blokkert under anvendelse av 350 ul/brønn blokk-eringsbuffer (0,5% kvegserumalbumin (BSA), 5% saccharose og 5% tris-buffer) i et tidsrom på fra 1 time til over natten. Platene ble igjen suget tørre natten over under anvendelse av papirhåndklær. Platene ble oppbevart tørt i plastfolie ved romtemperatur. Serum som stammet fra pasienter med diagnostisert cancer og kontrollserum (fra normale pasienter), ble fortynnet under anvendelse av kalve-fosterserum (FCS). Når analysen til påvisning av innfangningsantistoff ble utført under anvendelse av det monoklonale antistoff Onc-M26 og Wl-antistoffet, ble både
serum og kontrollserum fortynnet i et forhold på 1:8. Ved anvendelse av det monoklonale antistoff M29 og Wl-antistoff et til analyse, ble serum og kontrollserum fortynnet i et forhold på 1:50. Absorbansstandardene for det monoklonale antistoff Onc-M26 ble fremstilt ved volumetrisk fortynning av en pleural effusjonsprøve (H3375) erholdt som ovenfor beskrevet, i en blanding bestående av blandet serum og FCS. Absorbansstandarder for Onc-M29-antistoffet ble fremstilt ved fortynning av prøve nr. H3375 i FCS. Absorbansstandarder ble kalibrert ved å tildele blandingen av serum en verdi på 20 absorbansenheter pr. ml. Kontroll-prøver besto av serumblandinger erholdt fra ansatte ved Oncogen og to pleurale brysteffusjonsprøver. Både standard-oppløsninger og kontrolloppløsninger ble oppdelt i por-sjoner og oppbevart ved -70°C. 50 ul fortynnet serum, kontrolloppløsninger og standardoppløsninger ble utpipettert in duplo i belagte brønner. Brønnene ble forseglet med en plateforseglings-anordning og ble inkubert ved romtemperatur i 1 time. Platene ble deretter skylt manuelt to ganger under anvendelse av 2% FCS i fosfatbufferholdig saltvann, (PBS)-buffer. 50 ul av en passende fortynning av Wl-HRP-konjugert antistoff ble tilsatt til platene. Til M26-analysen ble det anvendt en konsentrasjon på 0,5 ug/ml Wl-HRP. Til M29-analysen viste det seg at en konsentrasjon på 0,1 ul/ml Wl-HRP-konjugat var optimal. Alle konjugater ble fortynnet i 2% FCS og PBS. Platene ble igjen forseglet og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Platene ble deretter skylt manuelt 3 ganger under anvendelse av PBS-buffer. 100 yl OPD-substrat ble tilsatt til platene som ble inkubert i 1 time i mørke. Reaksjonene ble avbrutt ved anvendelse av 50 ul 1,5 N svovelsyre. Absorbansen ble avlest ved 490 nm. Dobbeltbestemmelser med en absorbans som innbyrdes avvek mer enn 10 enheter/ml (eller 2 enheter/ml. hvis absorbansen er mindre enn 10 enheter/ml), ble gjentatt. Prøver som ga høye resultater, ble fortynnet og gjentatt. Analysene ble
sammenlignet med hensyn til evnen til å skjelne mellom de to grupper av pasienter (med og uten cancer). Avskjærings-verdier (enheter/ml) ble slik utvalgt at en spesifisitet på ca. 90% (dvs. 90% av kontrollgruppen ga negativt resultat) ble oppnådd. Resultatet fremgår av tabell V.
Fra tabell V fremgår resultatene av DDIA-analysen på serum fra cancerpasienter under anvendelse av et monoklonalt antistoff Wl og foreliggende, nye monoklonale antistoffer Onc-M26 og Onc-M29. Testkolonnen angir hvilke monoklonale antistoffer som ble anvendt sammen med det monoklonale Wl-antistoff ved den ovenfor beskrevne DDIA-analyse. Ved Wl-testen (homolog DDIA) ble det monoklonale Wl-antistoff immobilisert som innfangningsantistoff til binding av det i serum fra mennesker, tilstedeværende mucinantigen. Det sekundære påvisningsantistoff som ble anvendt ved disse tester, var Wl-antistoff konjugert med HRP. Ved M26-testen var det immobiliserte antistoff Onc-M26, og ved M29-testen ble Onc-M29-antistoffet immobilisert. Tallene
i avskjæringsverdikolonnen som følger etter antistoff-betegnelsen, angir antigennivået i enheter/ml over hvilket det ble bestemt at analysen var positiv med hensyn til nærvær av tumorassosiert mucin. Kolonnene 0-6 angir for den angjeldende cancertype det prosentvise antall pasienter som under anvendelse av de angitte antistoffer viste seg å ha et Wl-epitopenivå som oversteg det i avskjæringsverdikolonnen, angitte nivå. Kontrollkolonnen angir det prosentvise antall analyser av kontrollserum (fra pasienter uten cancer) med en positiv reaksjon (dvs. påvisning av det i avskjæringsverdikolonnen angitte antigennivå, såkalte "falske positive" resultater). Antallet av pasienter i hver serumkategori (0-6) og den hos disse pasienter, tilstedeværende cancertype, er også angitt i tabell V. Når Onc-M26 var oppfangningsantistoffet, ble cancer diagnostisert ved et antigenavskjærings-verdinivå på over 95 enheter/ml hos ca. 43% av de 116 pasienter med metastatisk cancer, idet Onc-M26-oppfangningsantistoffet og Wl-påvis-ningsantistoffet ble anvendt ved analysen. Bare hos 0,5% av kontrollpasientene ble det feilaktig diagnostisert cancer (falske positiver). Anvendelse av Onc-M29-antistoffet resulterte i korrekt diagnostisering hos 66% av pasientene, idet Onc-M29-antistoffet samtidig ga 4% falske,
positive resultater. Når Wl-antistoffet ble anvendt som det primære og sekundære antistoff ved analysen, ble cancer diagnostisert hos 58% av de 166 pasienter, idet Wl-antistoff et dog samtidig ga 4% falske, positive resultater.
Anvendelse av Onc-M29-antistoffet ved DDIA-analysen diagnostiserte således korrekt cancer hos en større andel av cancerpasienter enn Wl-antistoffet, hvilket indikerer en større følsomhet hos Onc-M29 som innfangningsantistoff enn hos Wl-antistoffet. Anvendelse av Onc-M26-antistoff resulterte i en noe lavere følsomhet ved analysen enn anvendelsen av Onc-M29-antistoffet. Sammenlignet med Wl-antistoffet ble det imidlertid iakttatt et meget lavt antall falske, positive resultater (0,5%), og analysen er således mer spesifikk. En bedømmelse av de positive resultater for M26- eller M29-testen gir en mer følsom diagnostisering av cancer enn bare alene å anvende resultatene av enten M26- eller M29-testen (diagnosen for 75%
av pasientene med metastatisk cancer er således positiv). Disse resultater viser den potensielle nytte av de monoklonale antistoffer Onc-M26 og Onc-M29 ved påvisning av cancer i humant serum.
Eksempel 5
Kryss- konkurrerende analyse av mucinantistoffbinding
De monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen er ytterligere blitt karakterisert ved kryss-konkurrerende analyser, hvis resultater er angitt i etterfølgende tabell VI. Ved disse analyser ble det konstatert hvilken konsentrasjon av umerket mucinantistoff som resulterte i halvparten (50%) av den maksimale inhibering av bindingen av en standardkonsentrasjon (0,5 ug/ml) av i-merket mucinantistoff. En kryss-konkurrerende analyse ble utført
125
mellom hvert av de merkede ( I)-antistoffer angitt i tabell VI, og hvert av de umerkede antistoffer angitt over kolonnene i tabell VI. Den konkurrerende binding av antistofféne M8, M15, M16, M22, M23, M25, M27, Wl, W9 og
M38, ble målt på CsCl-renset, melkeavledet mucin, mens bindingen av antistoffene M10, Mil og M12 ble bestemt med
125
hensyn til MCF7-cellelinjen. Bindingen av I-merket antistoff ble bestemt med hensyn til W5-6-cellelinjen.
125 Binding av <125>I-merket antistoff ved en konsentrasjon på 0,5 ug/ml ble målt i nærvær av stigende mengder umerkede antistoffer, opptil 50 ug/ml. (M26-antistoffet inngikk ikke i denne analyse da det etter radiomerking ble dårlig bundet til immobilisert mucin).
I tabell VI betegner "++++" at halvparten av den maksimale inhibering forekom ved en konsentrasjon av umerket antistoff på mindre enn 3,2 ug/ml, "+++" at halvparten av den maksimale inhibering krevet en konsentrasjon av umerket antistoff på mellom 3,2 og 15,8 ug/ml, "++" at halvparten av den maksimale inhibering krevde en konsentrasjon av umerket antistoff på mellom 16 og 31 ug/ml,
"+" at halvparten av den maksimale inhibering krevde en konsentrasjon av umerket antistoff på mellom 32 og 50 ug/ml og "-" at halvparten av den maksimale inhibering krevde en konsentrasjon av umerket antistoff som oversteg
50 yg/ml.
Med hensyn til resultatene av den kryss-konkurrerende analyse som fremgår fra tabell VI, utviste flere antistoffer et unikt kryss-konkurrerende mønster, hvilket antyder at disse antistoffer bindes til distinkte epitoper. Det mest unike kryss-konkurrerende mønster ble utvist av antistoffene M21 og M2 9 som innbyrdes konkurrerte om binding, men hverken ble utsatt for konkurranse eller selv konkurrerte med andre av de prøvede antistoffer. Disse antistoffer gjenkjenner derfor enten de samme eller rommelig beslektede epitoper som avviker fra epitoper som gjenkjennes av de andre antistoffer.
Antistoffene Wl og M38 ble ikke utsatt for konkurranse fra noen av de andre antistoffer, men konkurrerte selv med mange andre antistoffer med hensyn til binding. Dette antyder at disse antistoffer bindes til distinkte epitoper som enten svarer strukturelt til, eller er rommelig beslektet med epitopene for andre antistoffer. Antistoff M10 ble utsatt for konkurranse fra flere andre antistoffer, men konkurrerte med hensyn til binding på sin side bare med 125
I-MlO, hvilket antyder at dette antistoff likeledes binder til en distinkt epitope som er strukturelt eller rommelig beslektet med epitopene for antistoff Wl, M8, M16 og M38. Antistoff M10 konkurrerte imidlertid med hensyn til binding ikke signifikant med antistoff Wl ved prøving på MCF7-celler, hvortil dette antistoff bindes best.
De resterende antistoffer utviste et kryss-konkurrerende mønster som antydet strukturelle eller romme-lige relasjoner mellom disse antistoffers respektive epitoper. Eksempelvis synes epitopene for antistoffene W9, M8, M16 og M25 å være beslektet, såvel som epitopene for
Mil og M12.
Antistoffene M15, M22, M23 og M27 utviste også tilsvarende kryss-konkurrerende mønstre, selv om det ble iakttatt enkelte forskjeller. Generelt bindes disse antistoffer til epitoper som synes å være innbyrdes strukturelt eller rommelig beslektede. Biokjemiske data antyder at disse antistoffer gjenkjenner kjerneproteinepitoper (se nedenfor). Basert på kryss-konkurrerende data er epitoper for disse fire antistoffer beslektede med epitopen for antistoff Wl, og epitopene for antistoffene M22 og M23 er også beslektet med epitopen for M38.
Sammenfattet indikerer de kryss-konkurrerende mønstre mellom de nye antistoffer og Wl og W9 nærvær av flere epitoper på mucinmolekyler. Antistoffene M21 og M29 gjenkjenner epitoper som enten er identiske eller nært beslektede og som adskiller seg fra epitopene som gjenkjennes av andre antistoffer. Alle andre antistoffer gjenkjenner epitoper som deler strukturelle trekk eller er sterisk beslektede med epitoper for andre antistoffer. Antistoffene Wl, M10 og M38 gjenkjenner epitoper som er beslektet med, men ikke identiske med epitopene for andre antistoffer. Antistoffene Mil og M12 gjenkjenner en eller flere nært beslektede epitoper som heller ikke er identisk eller identiske med epitoper gjenkjent av andre antistoffer. Det monoklonale antistoff M38 identifiserer en hittil ukjent epitope som ikke gjenkjennes av de andre nye, monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen, eller av Wl- eller W9-antistoffene. Av det ovenfor angitte fremgår det at det monoklonale antistoff M38 utviser høy spesifisitet overfor en unik epitope på mucinantigener og kan således tjene en viktig funksjon, ikke bare i forbindelse med analyse til diagnostisering av tumorer hos pasienter, men også i forbindelse med behandling av slike tumorer under anvendelse av de nye metoder og fremgangsmåter.
Eksempel 6
Biokjemisk karakterisering av epitoper
For å bestemme den biokjemiske natur av de nye antistoffer ble innvirkningen av forskjellige behandlinger på antistoffbindingen til muciner undersøkt.
Til bestemmelse av hvorvidt carbohydratstrukturene var nødvendige for å binde antistoffene, ble virkningen av natriumperjodat -behandling på antistoffbindingen (tabell VII) undersøkt. Muciner ble immobilisert på mikrotiter-plater ved hjelp av WGA som ovenfor beskrevet, og ble behandlet med natriumperjodat (NalO^) i konsentrasjoner fra 0,2 til 100 mM i en buffer av 50 mM natriumacetat, pH 4,5,
i et tidsrom på 30 minutter ved 37°C. Den Milk 2-avledede mucinprøve ble affinitetsrenset under anvendelse av antistoff W9, og den H3300-avledede mucinprøve ble CsCl-renset. Muciner fra MCF7 og W5-6-cellemembraner ble oppløseliggjort med en ikke-ionisk detergentoppløsning (TNEN, Linsley et al., Biochem., 25:2778-2986 (1986)) og ble separert fra detergentuoppløselig materiale ved hjelp av sentrifugering (390.000 x G) før immobilisering. Brønnene ble vasket grundig med PBS og ble behandlet med NaBH^ (100 mM i PBS) i ytterligere 30 minutter ved 37°C. Etter behandlingene ble brønnene blokkert med en 10% FCS-holdig bindingsbuffer som beskrevet av Linsley et al., Biochem., 25:2978-2986 (1986), og antistoffbindingen ble testet ved indirekte ELISA. Den nødvendige konsentrasjon av NalO^ for 50% reduksjon av bindingen ble bestemt ved interpolering ut fra bestemte verdier.
Bindingen av et kontrollantistoff (C6) til en definert carbohydratepitope (I-struktur) var følsom overfor perjodatbehandlingen, idet 50% av den maksimale inhibering av bindingen forekom ved 1 mM. Antistoffene Wl og W9 og M26 var mere følsomme overfor perjodatbehandling enn kon-trollantistof fet, idet denne følsomhet hos Wl og W9 tidligere var blitt påvist og antydet at carbohydrat er nød-vendig til binding av disse antistoffer. Fem andre antistoffer (M10, Mil, M12, M21 og M29) var perjodatfølsomme, men krevde signifikant høyere konsentrasjoner enn kontrollantistoffet. De resterende 8 antistoffer var ufølsomme overfor perjodatbehandling selv ved ekstremt høye konsentrasjoner (0,1 M). Epitopene for alle de nye antistoffer, bortsett fra M26, var således mindre følsomme overfor perjodatoxydasjon enn antistoffene Wl og W9 samt kontroll-anstistoffet C6.
For å teste hvorvidt sialsyre var nødvendig for antistoffbinding ble antistoffene testet med hensyn til sensibilitet overfor neuraminidase ved det i tabell VIII angitte forsøk. Muciner ble immobilisert på mikrotiter-plater ved hjelp av WGA og ble behandlet med neuraminidase fra Vibrio cholera som beskrevet av Linsley et al., Cancer Res. 46, ovenfor. Neuraminidase (4,5 m-enheter/brønn) ble tilsatt i 150 mM NaCl, 50 mM natriumacetat, pH 5,5 og 0,1% CaC^ i 1 time ved 37°C. Brønnene ble deretter blokkert med bindingsbuffer inneholdende 10% FCS og ble testet med hensyn til antistoffbinding ved indirekte ELISA.
Bindingen av kontrollantistoffet (C6) ble øket ved behandlingen i overensstemmelse med kjente bindingsprefer-anser for dette antistoff til ikke-sialylerte strukturer. Bindingen av antistoff M8, M16, M25, M21, M27 og M29 til H3300-avledet mucin ble også øket ved neuraminidasebehandlingen, hvilket antydet at epitopene for disse antistoffer ble avmaskert ved fjerning av sialsyren. Derimot var bindingen av disse samme antistoffer til melke-avledede muciner upåvirket av neuraminidasebehandlingen.
Bindingen av antistoffer Wl og W9 var neuraminidase-følsom som tidligere påvist. Bindingen av antistoff M26 var også neuraminidasefølsom, hvilket antydet at sialsyren er nødvendig for binding av dette antistoff. Bindingen av de resterende 7 antistoffer var upåvirket av neuraminidasebehandlingen.
Da epitopene for de fleste antistoffer ikke var perjodat- eller neuraminidasefølsomme, var det mulig at enkelte av disse ville gjenkjenne proteinkjerneepitoper.
For å teste denne mulighet ble bindingen av visse antistoffer til renset, melkeavledet mucin som var blitt deglycosylert ved behandling med vannfritt hydrogenfluorid (HF), undersøkt. Melkeavledet mucin ble renset til homogenitet ved affinitetskromatografi, og størrelsesutelukkelseskromatografi .som beskrevet ovenfor, ble utført. 200 ug renset protein (bestemt ved hjelp av aminosyresammensetning) ble deglycosylert under anvendelse av vannfritt HF som beskrevet av Mort og Lamport, Anal. Biochem. 82:289-309 (1977).
Etter behandling i 4 timer ved 23°C ble prøven oppløselig-gjort i 50% eddiksyre, ble dialysert mot 20 mM ammonium-acetat og lyofilisert. Prøver av ubehandlet (3 ng protein/brønn) og deglycosylert (10 ng/brønn) ble direkte absorbert på polystyren-mikrotestbrønner og ble testet med hensyn til antistoffbinding ved indirekte ELISA.
Til bekreftelse av at oligosaccharider var fjernet ved behandlingen, ble prøver underkastet aminosyre- og hexosaminanalyse. Selv om aminosyresammensetningene av begge prøver var identiske, hadde det HF-behandlede mucin et innhold av hexosamin (glucosamin + galactosamin) på mindre enn 2% av innholdet i ubehandlet mucin. Denne behandling resulterte i fjerning av mere enn 98% av et N-acetylglucosamin og et N-acetylgalactosamin fra det rensede preparat, men påvirket ikke signifikant aminosyresammensetningen derav.
Som det fremgår av tabell IX, opphever deglycosylering bindingen av kontrollantistoffet og 6 av 10 antistoffer, som sterkt ble bundet til ubehandlet mucin. Derimot ble antistoff M15, M23 og M27 sterkt bundet til immobilisert, deglycosylert mucin, hvilket antyder at disse antistoffer bindes til epitoper på proteinkjernen. Bindingen av antistoff M22 ble redusert ved HF-behandling, men bindingen var stadig signifikant. Antistoff M10, Mil, M12, M21 og M29 ble ikke testet med hensyn til binding til proteinkjerneepitoper, da disse antistoffer ble dårlig bundet til melkeavledet mucin (tabell IV).
Som det fremgår av dette forsøk, ble flere antistoffer (M15, M22, M23 og M27) bundet til epitoper som var resistente overfor HF-behandling som fjernet det meste av carbohydratet fra proteinkjernen. Epitoper for disse antistoffer er således mest sannsynlig bare protein.
De ovenfor angitte tester avslører at slektskap basert på kryss-konkurrerende analyser mellom epitoper som gjenkjennes av antistoffene ifølge oppfinnelsen, bør betraktes i lys av andre behandlinger, slik som perjodatbehandling, neuraminidasebehandling og deglycosylering. Antistoffene W9 og M8 utviser således tilsvarende mønstre ved kryss-konkurrerende analyse (tabell VI), men epitopene for disse antistoffer kan skjelnes fra hverandre på basis av antistoffenes følsomhet overfor perjodat- og neuramini-dasebehandlinger (tabell VII og VIII).
Eksempel 7
Serumanalyse under anvendelse av monoklonalt antistoff M23, M26, M29 og M38
En DDIA-analyse ble utført under anvendelse av de ifølge eksempel 2 erholdte, monoklonale antistoffer Onc-M29 og Onc-M38 samt Onc-M2 6 og Onc-M3 8. Det ble også utført en homolog analyse med Onc-M23. En test med et kommersielt tilgjengelig preparat CA 15-3 og en homolog analyse med Wl-antistoff ble anvendt til sammenligning. Analysene ble utført under anvendelse av et panel av serum omfattende 72 prøver fra pasienter med metastatisk brystcancer (M) og
94 prøver fra pasienter med godartet brystlidelse (B), idet prøvene ble analysert med hensyn til antigennivåer som ble påvist ved hjelp av DDIA-analyse, som beskrevet i eksempel 4, bortsett fra at antistoff Onc-M29 ble anvendt som innfangningsantistoff med Onc-M38 som påvisningsantistoff (M29/M38 "DDIA"), og Onc-M26 ble anvendt som innfangnings-antistof! med Onc-M38 som påvisningsantistoff (M26/M38 "DDIA"). Resultatene av disse analyser ble sammenlignet med resultatene fra den homologe Wl-analyse og fra CA 15.3-testen ved det i fig. 5 avbildede forsøk. Analysene ble sammenlignet med hensyn til evnen til å skjelne mellom de to grupper pasienter, idet avskjæringsverdiene ble valgt slik at det ble oppnådd en spesifisitet på ca. 90% (dvs. 90% av kontrollgruppen ga negativt resultat).
De oppnådde verdier ble avsatt slik at kontroll-gruppens median ved hver test ble anbrakt ved ca. den 10. inndeling på en lineær skala med ialt 100 inndelinger. Den punkterte linje antyder verdien som gir hver test en spesifisitet på 90%. N er antallet av testede prøver.
Denne bearbeidelse av resultater viser at den heterologe M29/M38-analyse ga det beste resultat, idet metastatisk brystcancer ble påvist hos 93% av pasientene (93% følsomhet). Til sammenligning påviste Wl-, M23-, M26/M38- og CA 15.3-analysene metastatisk brystcancer hos hhv. 67%, 60%, 60% og 83% av pasientene. Forskjellige tester ga således forskjellige resultater, idet M29/M38-og CA 15.3-testen ga bedre resultater enn den homologe Wl-analyse og M23- og M26/M38-analysene som gir like eller dårligere resultater.
Blant 5 tumorpasient-serumprøver som ga negativt resultat ved M29/M38-testen, ga 2 prøver positivt resultat ved Wl-, M23- og C 15.3-testene, og én av disse prøver ga et positivt resultat ved M26/M38-testen. Ved således å kombinere M29/M38-testresultatene med en ytterligere test, ga 69/72 (95%) av tumorpasientserum positivt testresultat.
Testene ble også bedømt med hensyn til evnen til å bekrefte resultater oppnådd ved M2 9/M38-analysen. Et antall tumorpasienter hadde serumantigennivåer svarende til eller over den i fig. 5 anvendte avskjæringsverdi, men innenfor kontrollintervallet av verdiene. Fortolkning av disse bestemmelser er derfor underkastet usikkerhet på grunn av overlapningen med verdier bestemt for kontrollprøyer. En forbedret påvisning i forbindelse med disse pasienter ville således øke den kliniske nytte av M29/M38-analysen.
Den mest lovende analyse til dette formål var M26/M38-analysen (tabell X). Ialt 24 av 72 serumprøver
fra brystcancerpasienter ga M29/M38-verdier som var positive, men under den høyeste verdi bestemt for kontroll-prøven (_<35 enheter/ml) . Av disse 24 prøver ga 8 M26/M38-verdier som lå utenfor det normale område (X7 9 enheter/ml).
3 av disse prøver ga M26/M38-nivåer som lå mere enn
3 ganger over den høyest bestemte verdi for kontrollgruppen. Derimot utviste 0/24-, 0/24-og 3/24-serumprøver nivåer utenfor det normale intervall for Wl-, M23- og CA 15.3-analysen, idet økningen med hensyn til sistnevnte analyse i alle tilfeller var mindre enn 2-dobbelt. Mens M26/M38-analysen således gir færre positive resultater enn de andre tester, er de oppnådde nivåer tilstrekkelig høye til at denne test kan anvendes til positivt å identifisere cancerpasienter som ikke utviser sterkt forhøyede verdier ved andre tester.
Eksempel 8
Spesifisitet av Onc- M38- antistoff
For ytterligere å påvise spesifisiteten av det monoklonale antistoff Onc-M38 ifølge oppfinnelsen ble immunohistologiske tester utført under anvendelse av humant cancervev og normalt vev som beskrevet av Hellstrom et al., Cancer Research, 46, s. 3917-3923 (1986).
Carcinoma i bryst, lunge (ikke-småcellet lungecarcinoma (NSCLC)) og tykktarm, og prøver av forskjellig normalt vev, ble erholdt ved kirurgi, enten i form av biopsiprøver fjernet ved kirurgi eller i form av pleurale effusjoner.
Straks etter fjerning fra pasienter ble prøver av tumorer og normalt vev nedfryst i flytende nitrogen, hvoretter prøvene ble oppbevart ved -70°C eller i flytende nitrogen inntil anvendelse.
Fryste seksjoner med en tykkelse på 5 pm til 6 um ble fremstilt og lufttørket i minst 2 timer. Etter behandling med aceton ved -20°C i 10 minutter ble de raskt tørket i en luftstrøm. Seksjoner som skulle anvendes til immunohistologisk farvning, ble preinkubert i 30 minutter med normalt, humant serum fortynnet 1:5 med PBS. Parallelle, fryste seksjoner ble preparert og farvet med hematoxy-lin:eosin med henblikk på histologisk vurdering. Til en rekke forsøk ble paraffinseksjoner fra vev preparert, som var blitt fiksert i Carnoys oppløsning umiddelbart etter fjernelse av pasientene, innleiret i paraffin og oppdelt i seksjoner, idet disse seksjoner ble farvet på samme måte som de fryste seksjoner..
Immunohistologisk farving ble utført under anvendelse av PAP-teknikken ifølge Sternberger (In Immunocyto-chemistry, s. 104-169, New York, John Wiley & Sons (1979)) med de av Garrigues et al., Int. J. Cancer, 29, s. 511-515
(1982) og Hellstrom et al., J. Immunol., 130, s. 1467-1472
(1983) beskrevne modifikasjoner, idet det med hensyn til
den nærmere utførelse av angjeldende farving henvises til de nevnte referanser. Onc-M38, kanin-anti-mus-immunoglobulin
og muse-PAP ble fortynnet i en oppløsning av 10% normalt museserum og 3% kaninserum i PBS. Farvningsmetoden besto av følgende trinn: (a) behandling i 1 time av seksjoner enten med spesifikk antistoffsupernatant eller kontroll-antistoffsupernatant (f.eks. myelomaprotein (pll7) fortynnet 1:2 med ovennevnte serumblanding), (b) påføring av kanin-anti-mus-immunoglobulin fortynnet 1:30, og (c) eksponering for muse-PAP-kompleks fortynnet 1:80. Al-antiserum ble inkubert med seksjoner i 30 minutter ved romtemperatur. Etter antistoffbehandlingen ble preparatene skylt lett med en PBS-strøm og ble deretter vasket to ganger i PBS.
Den immunokjemiske reaksjon ble fremkalt i løpet av 8 minutter ved tilsetning av friskt fremstilt 0,05% 3,3'-diaminobenzidin, tetrahydroklorid og 0,01% hydrogenperoxyd i 0,05 M tris-buffer, pH 7,6. Ytterligere eksponering overfor en 1% OsO^-oppløsning i 15 minutter forsterket reaksjonen. Seksjonene ble skylt kort med vann, ble ført gjennom alkohol i stigende konsentrasjoner, etterfulgt av xylen og montert med dekkglass.
Alle preparater ble avlest av samme forsker som ikke kjente deres opprinnelse. Farvningsgraden for tumor-celler eller normale celler ble vurdert fra "+" (meget svak) til "4+" (meget sterk). En farvning vurdert til "2+" eller mer, ble betraktet som "positiv", og en farvning vurdert til "+" eller mindre, som "negativ".
Tabell XI sammenfatter de immunohistologiske data erholdt ved anvendelse av tumorvev og normalt vev. Som det fremgår fra tabellen, ble Onc-M38 bundet til minst 50% av de undersøkte tumorvevsprøver (med en intensitet på minst 2+), men ble ikke bundet til noen av de normale vev.
De data som fremgår av tabell XI, viser at Onc-M38 relativt gjenkjenner tumor-spesifikke celleoverflateanti-gener på forskjellige carcinoma. Da selektiv lokalisering av tumorer med monoklonalt antistoff er nødvendig av hensyn til behandling, synes evnen hos Onc-M38 til å bindes til mer enn én tumorvevstype, å være tegn på dette antistoffs an-vendelighet til tumorterapi, enten alene eller sammen med andre monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen.
Eksempel 9
Analyse til påvisning av ondartet lungelidelse under anvendelse av monoklonalt antistoff M26, M29 og M38
Evnen hos de monoklonale mucinantistoffer ifølge oppfinnelsen til påvisning av mucinepitoper forbundet med sykt lungevev, ble påvist på følgende måte ved anvendelse av bronchoskopiprøver og serum fra mennesker.
Bronchiale avstryk ble tilveiebrakt av
dr. Steve Springmeyer, Virginia Mason Hospital, Seattle, WA, i løpet av en seks måneders periode i 1987 ved broncho-skopiske undersøkelser av 27 pasienter med lunge-relaterte sykdommer. Avstrykene ble tatt fra venstre og høyre lunge fra hver pasient i overensstemmelse med standardmetoden for bronchoskopi og ble analysert under anvendelse av standardhistologiske metoder. Resultatene av den broncho-skopiske undersøkelse og den histologiske test sammen med ytterligere informasjon, herunder røntgenundersøkelse av brystkasse og CT-scanninger, ble anvendt til å oppdele pasientene i tre grupper: 17 individer med godartede lidelser (ingen påvist ondartet lungesykdom), 7 individer med ikke-småcellet lungecarcinom (NSCLC) og 3 pasienter med andre cancertyper (SCLL, prostatacarcinoma og tykktarms-carcinoma). Den siste gruppe vil ikke bli diskutert ytterligere.
For sammenligning med de histologiske resultater ble det utført en DDIA-analyse under anvendelse av de monoklonale antistoffer Onc-M29 og Onc-M38 samt Onc-M26 og Onc-M38 til påvisning av mucinantigennivåer som beskrevet i eksempel 2 og 7. Hver bronchial avstrykprøve ble anbrakt i 0,5 ml PBS-saltvann og ble oppbevart i fryst tilstand ved
-70°C inntil anvendelse. Prøven ble deretter opptint ved romtemperatur og mikrosentrifugert i 10 minutter ved 4°C. Hver prøve ble deretter fortynnet i et forhold på 1:11
(50 ul prøve og 500 ul prøvefortynningsmiddel). Foruten DDIA-analyser på bronchialprøver ble disse analyser også utført på blodserum fra hver pasient.
Epitopenivåene påvist ved DDIA-analyse, er angitt i tabell XII for bronchiale avstryk og serum fra pasientene, idet det i de enkelte tilfeller på basis av den broncho-skopiske undersøkelse og histologiske test er angitt om tilstanden er godartet, eller om det er påvist NSCLC.
For de 17 individer som ved den histologiske under-søkelse ikke har fått påvist en ondartet lidelse, indikerer, som det fremgår av tabell XII, M26/M38-DDIA-analysen på bronchiale avstryk fra begge lunger epitopenivåer på
100 enheter/ml eller mindre. Resultatet av M29/M38-DDIA-analysen var 6 enheter/ml eller mindre. For de 7 individer med diagnostisert NSCLC ble det ved M26/M38-DDIA-analysen påvist signifikant forhøyede epitopenivåer i den involverte lunge hos 4 pasienter, idet M29/M38-DDIA-analysen indikerte forhøyede epitopenivåer i den involverte lunge hos 3 individer med ondartet lungetilstand. Hos to pasienter (nr. 21 og 22) var M2 6/M3 8-nivåene forhøyet i den ikke-involverte lunge.
Disse resultater antyder at en signifikant prosent-del av de pasienter som ble underkastet tidligere diagnos-tiske undersøkelser for formodet lungecancer, utviser for-høyede nivåer av mucinepitopemarkører som kan påvises ved hjelp av antistoffene ifølge oppfinnelsen. Analyser under anvendelse av disse antistoffer kan således vise seg nyttige til tidlig påvisning av lungecarcinoma og andre metastatiske lungecarcinomatyper, som kan unnslippe påvisning ved histologiske metoder.
Med hensyn til serumresultater lå epitopenivåer
hos individer med godartede lidelser på 54 enheter/ml eller lavere ved M26/M38-DDIA-analyse og på 43 enheter/ml eller lavere ved M29/M38-DDIA-analyse. Med hensyn til de 7 individer med diagnostisert NSCLC viste M26/M38-DDIA-analyse forhøyede antigennivåer hos 3 individer og M29/M38-DDIA-analyse forhøyede antigennivåer likeledes hos 3 individer. En relativt høy andel av individer med lungecancer utviste således høye nivåer av disse antigener i serum, hvilket antyder at antistoffene ifølge oppfinnelsen kan være nyttige til tidlig påvisning av lungecancer under anvendelse av slike serumanalyser.
Foruten påvisning av mucinepitoper forbundet med lungecancer i bronchiale avstryk kan andre prøver testes ved analyse ved mucinepitopenivåer under anvendelse av de monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen og andre antistoffer. Eksempelvis kan bronchiale utskyllingsprøver og expektorert spytt fortynnes og på tilsvarende måte testes ved en analyse. '■
De her identifiserte, nye epitoper kan tjene som tumormarkører til påvisning av tumorer hos pasienter. Hertil kommer at de hittil ukjente epitoper på de her beskrevne, rensede tumorassosierte mucinantigener som er immunologisk reaktive med de nye monoklonale antistoffer, kan fremme utvikling av mer følsomme monoklonale antistoffer til forbedrede immunoanalyser. I særdeleshet kan de monoklonale antistoffer som fremkalles overfor tumorassosiert mucinantigen under anvendelse av renset mucin (0nc-M8, Onc-M26, Onc-M29, 0nc-M30 og Onc-M38), vise seg nyttige ved den tidlige påvisning av cancer, og til gjennom-føring av cancerbehandlinger. De monoklonale antistoffer Onc-M26 og Onc-M38 synes å utvise større spesifisitet overfor epitoper på mucinantigen som stammer fra tumorkilder enn mucinantigen som stammer fra normale kilder. Tumorassosiert mucinantigen kan påvises i blodserumprøver eller i andre kroppsvæsker slik som spytt, pleurale effusjoner og melk, under anvendelse av immunoanalyser, hvorved det monoklonale antistoff Onc-M26 eller Onc-M38 anvendes alene eller i kombinasjon med ethvert av de her beskrevne andre monoklonale antistoffer, foruten monoklonale antistoffer som er utviklet under anvendelse av renset mucinantigen som immunogen, såvel som med kjente antistoffer slik som Wl eller W9. Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan anvendes ved histologiske metoder til påvisning av nærvær av tumorassosiert mucinantigen på celler fra et pattedyr, såvel som til bestemmelse av mucin som forefinnes i væskeprøver, slik som serum. Ved å gjenta disse histologiske metoder over et tidsrom, kan forløpet av cancer hos en pasient overvåkes. De her beskrevne antistoffer kan eksempelvis testes med hensyn til binding til brystepitelceller erholdt fra en pasient, til påvisning av nærvær av tumorassosiert mucinantigen, hvorved det kan oppnås en indikasjon
på nærvær av cancerceller.
Det monoklonale antistoff Onc-M26 såvel som de andre, nye antistoffer, kan inngå alene, eller to eller flere av antistoffene kan anvendes i kombinasjon i diag-nostisk testutstyr ved passende instruksjoner, til analyse av serum eller andre biologiske prøver med henblikk på påvisning av tumorassosierte mucinantigener. Et testutstyr for utførelse av en DDIA-analyse under anvendelse av de monoklonale antistoffer Onc-M26 og Onc-M29, kan eksempelvis inneholde en fast støtteanordning, f.eks. en mikrobrønn-plateholder med forseglingsanordning, og inneholdende 1x8 rekker med multiple brønner. Hver brønn i rekkene er belagt med monoklonalt antistoff. I testutstyret inngår også analysereagenser slik som standarder inneholdende humant antigen, f.eks. antigen fra brystcancer-
pleural effusjon fortynnet i en passende oppløsning. Standardene kan bestå av varierende konsentrasjoner av antigen, idet f.eks. en første standard til Onc-M29 kan bestå av 4 enheter M29 antigen/ml, og en annen standard av 10 enheter/ml. Til Onc-M26 kan en første standard bestå av
30 enheter M26-antigen/ml og en annen standard av 75 enheter/ml. Kontrollprøver inngår i testutstyret og kan bestå av det humane antigen fortynnet i normalt, humant serum
(10% oppløsning av M26-antigen og 11% oppløsning av M29-antigen) med de antimikrobielle midler.
Hvis en prøve inneholder antigen i nivåer som overstiger 825 enheter/ml for M26 og 110 enheter/ml for M29 (overstiger den høyeste standard) ved et første analyse-forsøk, kan prøven i enkelte tilfeller ytterligere fortynnes med en passende mengde prøvefortynningsmiddel. Fortynn-inger kan fremstilles som følger: 1:11 - 50 pl testprøve + 500 pl prøvefortynningsmiddel 1:55 - 50 pl 1:11 fortynning + 200 pl prøvefortynningsmiddel 1:275 - 50 pl 1:55 fortynning + 200 pl prøvefortynningsmiddel
Konjugert antistoff inngår også i testutstyret. Antistoff konjugert med enzymet HRP, inngår f.eks. i en separat beholder inneholdende passende fortynningsmiddel.
I testutstyret inngår et enzymsubstrat, f.eks. citratbuffer-holdig hydrogenperoxyd og 3,3',5,5-tetramethylbenzidin i dimethylsulfoxyd (TMB kromogen), hvis enzymmarkør er HRP, i en separat beholder for anvendelse ved påvisning av det bundne, konjugerte antistoff. Prøvefortynningsmidler og reaksjonsavsluttende reagenser slik som 1 N svovelsyre, kan inngå som ytterligere komponenter i testutstyret. En vaske-oppløsning (f.eks. 10 x PBS) kan også inngå. Vaskeoppløs-ningen og avslutningsreagenset oppbevares ved romtemperatur. Alle andre reagenser oppbevares fortrinnsvis ved 4°C, men bringes opp til romtemperatur for anvendelse. Det fore-trekkes at standardprøver og kontrollprøver foretas in duplo.
Til immunoterapi kan ethvert antistoff valgt blant de her beskrevne, kobles til et radionuklid eller en annen påviselig markør og innføres i kroppen på et pattedyr til avbildning av cancerceller eller for utøvelse av radio-terapi. Det valgte antistoff kan således kobles til et radionuklid eller et antitumor-legemiddel og innføres i et pattedyr under anvendelse av en hvilken som helst passende utførelsesmetode, innbefattet intravenøs injeksjon, til avlevering av radionuklidet eller legemidlet i tumorvevet inneholdende antigen som er reaktivt med antistoffet. Den påviselige markør kan være valgt blant fluoroforer, enzymer, kromoforer, coenzymer, chemiluminescente materialer, enzyminhibitorer, paramagnetiske metaller, såsom gadolinium, og radionuklider, som er kjent innen faget.
Claims (30)
1. Monoklonalt antistoff til ln vitro anvendelse til påvisning av tumorassosiert mucinantigen, karakterisert ved at det er av den art som oppnås ved dyrkning av en hybridomacellelinje valgt fra gruppen omfattende ATCC nr. HB 9209, HB 9244, HB 9245, HB 9246, HB 9247, HB 9216, HB 9248, HB 9249, HB 9250, HB 9217,
HB 9212, HB 9229, HB 9210, HB 9243, HB 9211 og HB 9365, og som er i stand til å binde tumorassosierte mucinantigener.
2. Hybridomacellelinje,
karakterisert ved at den frembringer et monoklonalt antistoff ifølge krav 1 og er valgt fra gruppen omfattende ATCC nr. HB 9209, HB 9244, HB 9245, HB 9246, HB 9247,
HB 9216, HB 9248, HB 9249, HB 9250, HB 9217, HB 9212, HB 9229, HB 9210, HB 9243, HB 9211 og HB 9365.
3. Renset tumorassosiert mucinantigen som har anvendelse ved fremstilling av monoklonale antistoffer ifølge krav 1, karakterisert ved at det hovedsakelig har følgende aminosyresammensetning: 14,5 mol% alanin, 3,4 mol% arginin, 4,4 mol% asparaginsyre, 5,7 mol% glutaminsyre,
9,2 mol% glycin, 2,9 mol% histidin, 0,9 moH isoleucin, 1,9% leucin, 3,6 mol% lysin, 0,4 mol% methionin, 0,7 mol% fenylalanin, 18,6 mol% prolin, 8,1 mol% serin, 14,6 mol% threonin, 0,5 mol% tyrosin og 10,3 mol% valin.
4. Renset tumorassosiert mucinantigen som har anvendelse ved fremstilling av monoklonale antistoffer ifølge krav 1, karakterisert ved at det hovedsakelig har følgende aminosyresammensetning: 17,6 mol% alanin, 5,5 mol% arginin, 6,0 mol% asparaginsyre, 6,0 mol% glutaminsyre,
11,8 mol% glycin, 2,9 mol% histidin, 1,6 mol% isoleucin,
3,6 mol% leucin, 2,3 mol% lysin, 0,0 mol% methionin, 1,4 mol% fenylalanin, 14,1 mol% prolin, 10,3 mol% serin, 10,8 mol% threonin, 1,0 mol% tyrosin og 6,5 mol% valin.
5. Renset tumorassosiert mucinantigen som har anvendelse ved fremstilling av monoklonale antistoffer ifølge krav 1, karakterisert ved at det hovedsakelig har følgende aminosyresammensetning: 16,8 mol% alanin, 5,2 mol% arginin, 5,6 mol% asparaginsyre, 5,5 mol% glutaminsyre, 9,8 mol glycin, 3,9 mol% histidin, 1,2 mol% isoleucin, 3,2 mol% leucin, 2,4 mol% lysin, 0,4 mol% methionin, 1,2 mol% fenylalanin, 15,9 mol% prolin, 10,7 mol% serin, 11,2 mol% threonin, 1,2 mol% tyrosin og 5,8 mol% valin.
6. Anvendelse av et monoklonalt antistoff ifølge krav 1 til påvisning av cancer, hvor nærvær av et tumorassosiert mucinantigen som forekommer i en prøve fra et pattedyr bestem-mes ved reaksjonen med det monoklonale antistoff.
7. Anvendelse ifølge krav 6, hvor prøven er en biologisk væske valgt fra gruppen bestående av blodserum, plasma, spytt, pleurale effusjoner, melk, bronchiale avstrykninger og bronchiale utskyllinger.
8. Anvendelse ifølge krav 6 av et monoklonalt antistoff ifølge krav 1 til påvisning av cancer, hvor (a) en prøve fra et pattedyr bringes i kontakt med et innfangningsantistoff, hvilket antistoff er et monoklonalt antistoff produsert av en hybridomacellelinje valgt fra gruppen bestående av ATCC nr. HB 9209, HB 9244, HB 9245, HB 9246, HB 9247, HB 9216, HB 9248, HB 9249, HB 9250, HB 9217, HB 9212, HB 9229, HB 9210, HB 9243, HB 9211 og HB 9365, eller et lecitin, idet et slikt antistoff eller lecitin er fastholdt til et underlag til binding av det tumorassosierte antigen som foreligger i kroppsvæsken, til antistoffet eller lecitinet, (b) et påvisningsantistoff tilsettes til substratet for å reagere med det tumorassosierte antigen som er bundet til innfangningsantistoffet eller lecitinet, hvilket påvis-ningsantistof f er produsert av en hybridomacellelinje valgt fra gruppen bestående av ATCC nr. HB 9209, HB 9244, HB 9245, HB 9246, HB 9247, HB 9216, HB 9248, HB 9249, HB 9250, HB 9217, HB 9212, HB 9229, HB 9210, HB 9243, HB 9211 og HB 9365, og (c) det bundne påvisningsantistoff påvises.
9. Anvendelse ifølge krav 6 eller 8, hvor det monoklonale antistoff er koblet til en påviselig markør valgt fra gruppen bestående av enzymer, kromoforer, fluoroforer, coenzymer, chemiluminescente materialer, enzyminhibitorer, paramagnetiske metaller og radionuklider.
10. Anvendelse ifølge krav 8, hvor prøven omfatter et biologisk materiale valgt fra gruppen bestående av blodserum, plasma, spytt, pleurale effusjoner, melk, bronchiale avstrykninger og bronchiale utskyllinger og cellulært materiale.
11. Anvendelse ifølge krav 8, hvor påvisningstrinnet omfatter anvendelse av en indirekte enzym-immunoanalyse.
12. Anvendelse av et monoklonalt antistoff ifølge krav 1 for å skjelne mellom normalt og unormalt humant vev, hvor en prøve fra et menneske inneholdende cellulært materiale bringes i kontakt med to eller flere av de monoklonale antistoffer produsert av hybridomacellelinjene ifølge krav 1, på en slik måte at tilstedeværelse av unormalitet i prøven kan påvises.
13. Anvendelse ifølge krav 12, hvor det humane vev er brystepitelvev eller lungevev.
14. Anvendelse av et monoklonalt antistoff ifølge krav 1, til påvisning av tumorassosiert mucinantigen i en pasient, hvor en prøve inneholdende cellulært materiale fra pasienten bringes i kontakt med to eller flere monoklonale antistoffer produsert av hybridomacellelinjene ifølge krav 1, på en slik måte at forekomsten av tumorer i pasienten kan påvises.
15. Anvendelse ifølge krav 14, hvor prøven omfatter et biologisk materiale valgt fra gruppen bestående av blodserum, plasma, spytt, pleurale effusjoner, melk og brystepitelceller.
16. Anvendelse av minst ett monoklonalt antistoff fremstilt av en hybridomacellelinje valgt fra gruppen bestående av ATCC nr. HB 9209, HB 9244, HB 9245, HB 9246, HB 9247, HB 9216, HB 9248, HB 9249, HB 9250, HB 9217, HB 9212, HB 9229, HB 9210,
HB 9243, HB 9211 og HB 9365 i en sammensetning til påvisning av lungecarcinoma og carcinoma, som metastatisk er utbredt til lunger, hvor sammensetningen bringes i kontakt med en prøve valgt fra gruppen bestående av bronchiale avstrykninger, ut-skyllingsvæsker og expektorert spytt.
17. Anvendelse ifølge krav 16, hvor prøven bringes i kontakt med et første antistoff fremstilt av hybridomacellelinje HB 9212, og et annet antistoff fremstilt av hybridomacellelinje HB 9365.
18. Anvendelse ifølge krav 16, hvor prøven bringes i kontakt med et første antistoff fremstilt av hybridomacellelinje HB 9210, og et annet antistoff fremstilt av hybridomacellelinje HB 9365.
19. Testutstyr for anvendelse ved analyse med hensyn til nærvær av cancer,
karakterisert ved at det omfatter minst ett monoklonalt antistoff ifølge krav 1.
20. Testutstyr ifølge krav 19, karakterisert ved at det ytterligere omfatter analysereagenser og et fast underlag til utførelse av antigen-antistoffbinding.
21. Testutstyr ifølge krav 20, karakterisert ved at antistoffet fastholdes til det faste underlag til oppfangning av antigen i en prøve.
22. Testutstyr ifølge krav 21, karakterisert ved at det ytterligere omfatter et andre antistoff til påvisning av antigen bundet til det fastholdte antistoff.
23. Testutstyr ifølge krav 22, karakterisert ved at det andre antistoff er et monoklonalt antistoff produsert av en hybridomacellelinje valgt fra gruppen bestående av ATCC nr. HB 9209, HB 9244,
HB 9245, HB 9246, HB 9247, HB 9216, HB 9248, HB 9249, HB 9250, HB 9217, HB 9212, HB 9229, HB 9210, HB 9243, HB 9211 og HB 9365.
24. Testutstyr ifølge krav 23, karakterisert ved at det andre monoklonale påvisningsantistoff er koblet til en påviselig markør valgt fra gruppen bestående av enzymer, kromoforer, fluoroforer, coenzymer, chemiluminescente materialer, enzyminhibitorer, paramagnetiske metaller og radionukleider.
25. Testutstyr for analyse av nærvær av cancer, karakterisert ved at det omfatter et første monoklonalt antistoff fremstilt av hybridomacellelinje HB 9212, og et annet monoklonalt antistoff fremstilt av hybridomacellelinje HB 9365.
26. Testutstyr for analyse av nærvær av cancer, karakterisert ved at det omfatter et første monoklonalt antistoff fremstilt av hybridomacellelinje HB 9210, og et annet monoklonalt antistoff fremstilt av hybridomacellelinje HB 9365.
27. Testutstyr for analyse av nærvær av cancer, karakterisert ved at det omfatter et første monoklonalt antistoff fremstilt av hybridomacellelinje HB 9212, og et annet monoklonalt antistoff fremstilt av hybridomacellelinje HB 9210, og et tredje monoklonalt antistoff fremstilt av hybridomacellelinje HB 9365.
28. Testutstyr ifølge krav 19, 20 eller 21, karakterisert ved at det ytterligere omfatter analysereagenser og et fast underlag for utførelse av antigen-antistoffbinding.
29. Testutstyr til diagnose av brystcancer, karakterisert ved at panelet omfatter minst to forskjellige monoklonale antistoffer produsert av hybridom-cellelinjene ifølge krav 1.
30. Testutstyr ifølge krav 29, karakterisert ved at en av hybridomcelle-linjene er ATCC nr. HB 9212.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US93278186A | 1986-11-19 | 1986-11-19 | |
US10451187A | 1987-10-08 | 1987-10-08 |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO874796D0 NO874796D0 (no) | 1987-11-18 |
NO874796L NO874796L (no) | 1988-05-20 |
NO175944B true NO175944B (no) | 1994-09-26 |
NO175944C NO175944C (no) | 1995-01-04 |
Family
ID=26801637
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO874796A NO175944C (no) | 1986-11-19 | 1987-11-18 | Monoklonale antistoffer for anvendelse til in vitro påvisning av tumorassosiert mucinantigen, og hybridomcellelinjer som produserer disse |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5849876A (no) |
EP (1) | EP0268279B2 (no) |
JP (1) | JP2597372B2 (no) |
KR (1) | KR900007951B1 (no) |
AT (1) | ATE130029T1 (no) |
AU (1) | AU613590B2 (no) |
CA (1) | CA1340815C (no) |
DE (1) | DE3751585T3 (no) |
DK (1) | DK175635B1 (no) |
ES (1) | ES2080717T5 (no) |
GR (1) | GR3018093T3 (no) |
HK (1) | HK1007766A1 (no) |
IE (1) | IE71154B1 (no) |
IL (1) | IL84475A (no) |
NO (1) | NO175944C (no) |
NZ (1) | NZ222509A (no) |
PT (1) | PT86180B (no) |
Families Citing this family (80)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6222020B1 (en) * | 1987-01-07 | 2001-04-24 | Imperial Cancer Research Technology Limited | Antigens derived from the core protein of the human mammary epithelial mucin |
AU625856B2 (en) * | 1987-07-15 | 1992-07-16 | United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The | Second generation monoclonal antibodies having binding specificity to tag-72 and human carcinomas and methods for employing the same |
JPH02255097A (ja) * | 1989-03-29 | 1990-10-15 | Ikuo Yamashina | 単クローン抗体nny128 |
EP0544898A1 (en) * | 1991-06-26 | 1993-06-09 | The Biomembrane Institute | Early diagnosis of lung cancer using anti-carbohydrate antibody combinations |
FR2697088B1 (fr) * | 1992-10-15 | 1997-06-27 | Lacassagne Centre Antoine | Anticorps monoclonaux pour le diagnostic différentiel de cancers épithéliaux dans des épanchements séreux, hybridomes les secrétant et kit de diagnostic. |
EP0695760A1 (en) * | 1994-08-05 | 1996-02-07 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Novel tumor marker for lung cancer |
US6207805B1 (en) | 1997-07-18 | 2001-03-27 | University Of Iowa Research Foundation | Prostate cell surface antigen-specific antibodies |
WO1999065523A1 (en) * | 1998-06-15 | 1999-12-23 | Altarex Corp. | Immunotherapeutic composition and method for the treatment of prostate cancer |
US7947496B2 (en) | 1999-10-08 | 2011-05-24 | Hoffmann-La Roche Inc. | Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44 |
US6794494B1 (en) | 2003-04-14 | 2004-09-21 | Arius Research, Inc. | Cancerous disease modifying antibodies |
US20040105816A1 (en) * | 1999-10-08 | 2004-06-03 | Young David S. F. | Cancerous disease modifying antibodies |
US6657048B2 (en) * | 1999-10-08 | 2003-12-02 | Arius Research, Inc. | Individualized anti-cancer antibodies |
US20040001789A1 (en) * | 1999-10-08 | 2004-01-01 | Young David S. F. | Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of gp96 or precursors thereof |
US7442776B2 (en) * | 1999-10-08 | 2008-10-28 | Young David S F | Cancerous disease modifying antibodies |
US6180357B1 (en) | 1999-10-08 | 2001-01-30 | Arius Research, Inc. | Individualized patient-specific anti-cancer antibodies |
US20090004103A1 (en) * | 1999-10-08 | 2009-01-01 | Young David S F | Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44 |
US7256271B2 (en) | 2003-01-21 | 2007-08-14 | Arius Research Inc. | Cancerous disease modifying antibodies |
US7189397B2 (en) * | 1999-10-08 | 2007-03-13 | Arius Research Inc. | Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44 |
US20050100542A1 (en) * | 1999-10-08 | 2005-05-12 | Young David S. | Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44 |
US8048416B2 (en) * | 1999-10-08 | 2011-11-01 | Hoffmann-La Roche Inc. | Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44 |
US7252821B2 (en) | 1999-10-08 | 2007-08-07 | Arius Research Inc. | Cancerous disease modifying antibodies |
US8071072B2 (en) * | 1999-10-08 | 2011-12-06 | Hoffmann-La Roche Inc. | Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44 |
US7419792B2 (en) * | 1999-10-08 | 2008-09-02 | Arius Research Inc. | Laminin Receptor 1 Precursor Protein (37LRP) epitope delineated by an Hepatocellular carcinoma specific antibody |
US20080124327A1 (en) * | 1999-10-08 | 2008-05-29 | Arius Research, Inc. | Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44 |
KR100643818B1 (ko) * | 2000-05-08 | 2006-11-10 | 셀덱스 쎄라퓨틱스, 인크. | 수상세포에 대한 인간 모노클로날 항체 |
US7534429B2 (en) * | 2000-11-29 | 2009-05-19 | Hoffmann-La Roche Inc. | Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD63 |
US7442777B2 (en) * | 2000-11-29 | 2008-10-28 | Arius Research Inc. | Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD63 |
US7431923B2 (en) * | 2005-01-03 | 2008-10-07 | Arius Research Inc. | Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD63 |
US7009040B2 (en) * | 2003-01-21 | 2006-03-07 | Arius Research, Inc. | Cancerous disease modifying antibodies |
US7361343B2 (en) * | 2003-01-21 | 2008-04-22 | Arius Research Inc. | Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD63 |
US20060210474A1 (en) * | 2000-11-29 | 2006-09-21 | Young David S | Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD63 |
MXPA04008870A (es) | 2002-03-13 | 2005-06-17 | Biogen Idec Inc | Anticuerpos anti-avb6. |
JP2006506072A (ja) | 2002-11-12 | 2006-02-23 | デイッセロース,アルバート,ビー | アデノウイルスベクターワクチン |
US7393531B2 (en) | 2003-01-21 | 2008-07-01 | Arius Research Inc. | Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of MCSP |
US7468254B2 (en) * | 2003-01-21 | 2008-12-23 | Arius Research Inc. | Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of MCSP |
US7488475B2 (en) | 2003-01-21 | 2009-02-10 | Arius Research, Inc. | Antibody therapy of tumors |
US7175846B2 (en) * | 2003-01-21 | 2007-02-13 | Arius Research Inc. | Cancerous disease modifying antibodies |
US7361342B2 (en) * | 2003-01-21 | 2008-04-22 | Arius Research Inc. | Cancerous disease modifying antibodies |
US20080025977A1 (en) * | 2003-04-14 | 2008-01-31 | Arius Research, Inc. | Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD59 |
US7195764B2 (en) | 2003-04-14 | 2007-03-27 | Arius Research Inc. | Cancerous disease modifying antibodies |
US7399835B2 (en) * | 2004-02-26 | 2008-07-15 | Arius Research Inc. | Cancerous disease modifying antibodies |
US20080213169A1 (en) * | 2003-04-14 | 2008-09-04 | Arius Research, Inc. | Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD59 |
US20060140963A1 (en) * | 2003-04-14 | 2006-06-29 | Arius Research, Inc. | Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD59 |
US20050027106A1 (en) * | 2003-07-28 | 2005-02-03 | Young David S. F. | Cancerous disease modifying antibodies |
WO2005051991A2 (en) | 2003-11-24 | 2005-06-09 | Sidney Kimmel Cancer Center | Mucin antigen vaccine |
US8828957B2 (en) * | 2003-12-11 | 2014-09-09 | Microvax, Llc | Methods for generating immunity to antigen |
US7348413B2 (en) * | 2004-02-26 | 2008-03-25 | Arius Research Inc. | Cancerous disease modifying antibodies |
US20050255041A1 (en) * | 2004-05-13 | 2005-11-17 | Arius Research, Inc. | Cancerous disease modifying antibodies |
US7394210B2 (en) * | 2004-09-29 | 2008-07-01 | Tir Technology Lp | System and method for controlling luminaires |
US20060286074A1 (en) * | 2005-05-31 | 2006-12-21 | Yucheng Tang | Methods for immunotherapy of cancer |
US7411046B2 (en) | 2005-08-02 | 2008-08-12 | Arius Research Inc | Cancerous disease modifying antibodies |
US7452978B2 (en) * | 2005-08-02 | 2008-11-18 | Arius Research, Inc. | Cancerous disease modifying antibodies |
US7456258B2 (en) | 2005-08-02 | 2008-11-25 | Arius Research, Inc. | Cancerous disease modifying antibodies |
US7494648B2 (en) * | 2005-08-02 | 2009-02-24 | Hoffmann-La Roche Inc. | Cancerous disease modifying antibodies |
US7456259B2 (en) | 2005-08-02 | 2008-11-25 | Arius Research, Inc. | Cancerous disease modifying antibodies |
US7452979B2 (en) | 2005-08-02 | 2008-11-18 | Arius Research, Inc. | Cancerous disease modifying antibodies |
JP2009514536A (ja) * | 2005-11-07 | 2009-04-09 | シドニー キンメル キャンサー センター | Cd40リガンド融合蛋白質ワクチン |
US20080213267A1 (en) * | 2006-02-24 | 2008-09-04 | Arius Research, Inc. | Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of TROP-2 |
CN101490247A (zh) | 2006-02-24 | 2009-07-22 | 阿里乌斯研究公司 | 癌性疾病调节抗体141205-02 |
US7420041B2 (en) * | 2006-02-24 | 2008-09-02 | Arius Research Inc. | Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of TROP-2 |
CA2643144A1 (en) * | 2006-02-24 | 2007-08-30 | Arius Research, Inc. | Cancerous disease modifying antibody 141205-04 |
US20080305104A1 (en) * | 2006-02-24 | 2008-12-11 | Young David S F | Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of TROP-2 |
US20080089891A1 (en) * | 2006-07-26 | 2008-04-17 | Arius Research, Inc. | Cancerous disease modifying antibodies |
KR20090059166A (ko) * | 2006-09-28 | 2009-06-10 | 센토코 오르토 바이오테크 인코포레이티드 | 단일클론 항체 생산에서 애주번트로서의 프로스타글란딘 e2 (pge2) |
EP2089514A1 (en) * | 2006-11-13 | 2009-08-19 | Arius Research Inc. | Cancerous disease modifying antibodies |
BRPI0718644A2 (pt) * | 2006-11-13 | 2013-11-26 | Arius Res Inc | Anticorpo monoclonal isolado, anticorpos humanizado e quimérico do anticorpo monoclonal isolado, linha de célula hibridoma isolada, método para iniciar a citotoxidez induzida por anticorpo de células cancerosas em uma amostra de tecido selecionada de um tumor humano, cdmab do anticorpo monoclonal isolado ou seu cdmab e usos de um anticorpo monoclonal ou seu cdmab, sozinho ou em conjução com pelo menos um agente quimioterapêutico, e composição |
KR20090101885A (ko) * | 2006-11-13 | 2009-09-29 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 암 질환 조절 항체 |
US8003761B2 (en) | 2007-01-23 | 2011-08-23 | Hoffmann-La Roche Inc. | Cancerous disease modifying antibodies |
US20080206133A1 (en) * | 2007-01-23 | 2008-08-28 | Young David S F | Cancerous Disease Modifying Antibodies |
MX2009009919A (es) * | 2007-03-26 | 2009-10-19 | Hoffmann La Roche | Anticuerpo 010207-01 modificador de la enfermedad del cancer, producido por la linea celular ar51a630.3 del hibridoma. |
CN101688183A (zh) * | 2007-05-07 | 2010-03-31 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 减轻癌性疾病的抗体 |
US20090191197A1 (en) * | 2008-01-28 | 2009-07-30 | Young David S F | Cancerous disease modifying antibodies |
US20090285751A1 (en) * | 2008-04-10 | 2009-11-19 | Young David S F | Cancerous disease modifying antibodies |
US20090304578A1 (en) * | 2008-05-19 | 2009-12-10 | Young David S F | Cancerous Disease Modifying Antibodies |
EP2313437A1 (en) * | 2008-07-17 | 2011-04-27 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Cancerous disease modifying antibodies |
WO2011004899A1 (en) | 2009-07-06 | 2011-01-13 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Cancerous disease modifying antibodies |
WO2014143739A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Biogen Idec Ma Inc. | Anti-alpha v beta 6 antibodies and uses thereof |
US10035859B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-07-31 | Biogen Ma Inc. | Anti-alpha V beta 6 antibodies and uses thereof |
AU2016381178B2 (en) * | 2015-12-30 | 2019-06-06 | Colgate-Palmolive Company | Mucin coated silica for bacterial aggregation |
CN110317273A (zh) * | 2018-03-30 | 2019-10-11 | 积水医疗株式会社 | 与dupan-2抗原特异性反应的单克隆抗体及其制造方法 |
Family Cites Families (28)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4650756A (en) * | 1981-08-31 | 1987-03-17 | Sloan Kettering Institute For Cancer Research | Monoclonal antibodies to cell surface antigens of human renal cancer |
US4584268A (en) * | 1981-10-13 | 1986-04-22 | Ceriani Roberto Luis | Method and compositions for carcinoma diagnosis |
US4522918A (en) * | 1981-12-15 | 1985-06-11 | Jeffery Schlom | Process for producing monoclonal antibodies reactive with human breast cancer |
US4612282A (en) * | 1981-12-15 | 1986-09-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Monoclonal antibodies reactive with human breast cancer |
US4485093A (en) * | 1982-08-13 | 1984-11-27 | Runge Richard G | Immunotoxin conjugate which comprises arsanilic acid, useful for treating malignant tumors, particularly pancreatic cancer |
GB2131830A (en) * | 1982-12-10 | 1984-06-27 | Ludwig Inst Cancer Res | Monoclonal antibody for use against breast cancer |
US4678747A (en) * | 1983-02-18 | 1987-07-07 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Monoclonal antibodies for detection of an H (O) blood group antigen |
US4916213A (en) * | 1983-02-22 | 1990-04-10 | Xoma Corporation | Ribosomal inhibiting protein-immunoglobulin conjugates with specificity for tumor cell surface antigens, and mixtures thereof |
EP0118365B1 (en) * | 1983-03-04 | 1990-08-29 | Health Research, Inc. | Monoclonal antibodies to human breast carcinoma cells and their use in diagnosis and therapy |
US4643971A (en) * | 1983-03-11 | 1987-02-17 | Sloan-Kettering Institute | Monoclonal antibodies to human bladder and ureter cancers and method |
WO1985002411A1 (en) * | 1983-11-25 | 1985-06-06 | The University Of Melbourne | Cell line and monoclonal antibody |
US4753894A (en) * | 1984-02-08 | 1988-06-28 | Cetus Corporation | Monoclonal anti-human breast cancer antibodies |
US4935344A (en) * | 1984-04-30 | 1990-06-19 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Method for characterizing types of renal carcinoma and prognosis |
US4960716A (en) * | 1984-05-01 | 1990-10-02 | Ciba Corning Diagnostics Corp. | Monoclonal antibodies specific for 330 KD breast tumor antigen and assay using said monoclonal antibodies |
DE3586216T2 (de) * | 1984-05-01 | 1992-12-10 | Ciba Corning Diagnostics Corp | Brusttumorassoziiertes antigen und monoklonale antikoerper dazu. |
US4683200A (en) * | 1984-05-17 | 1987-07-28 | Setsuo Hirohashi | Monoclonal antibody to human cancer antigen and method for producing same |
US4752569A (en) * | 1984-06-21 | 1988-06-21 | The Regents Of The University Of California | Sialylated Lewisx epitope, antibodies and diagnosis |
NZ212419A (en) * | 1984-06-25 | 1988-08-30 | Mucan Diagnostics Pty Ltd | In vitro diagnostic test for detecting cancer cells producing mucin antigens |
US4707438A (en) * | 1984-08-22 | 1987-11-17 | Tel Aviv University | Immunoassay for breast cancer employing monoclonal antibodies |
IL76877A (en) * | 1984-11-02 | 1991-11-21 | Oncogen | Diagnostic method for the determination of human non-small cell lung carcinomas employing novel monoclonal antibodies and compositions containing said antibodies |
US4628032A (en) * | 1984-12-05 | 1986-12-09 | The Salk Institute For Biological Studies | Monoclonal antibody specific for a mammary tumor cytoplasmic antigen |
EP0184369B1 (en) * | 1984-12-05 | 1992-04-01 | The Salk Institute For Biological Studies | Monoclonal antibody specific for a mammary tumor cell surface antigen |
ES8800604A1 (es) * | 1985-04-22 | 1987-11-16 | Hybritech Inc | Un metodo para producir anticuerpos monoclonales |
US4814275A (en) * | 1985-05-13 | 1989-03-21 | E.I. Dupont De Nemours And Company | Monoclonal hybridoma antibody specific for a human epithelial antigen |
US4863854A (en) * | 1985-08-12 | 1989-09-05 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Monoclonal antibodies to mucin-like human differentiation antigens |
US4938948A (en) * | 1985-10-07 | 1990-07-03 | Cetus Corporation | Method for imaging breast tumors using labeled monoclonal anti-human breast cancer antibodies |
US4803169A (en) * | 1986-02-05 | 1989-02-07 | Cetus Corporation | Assay for human breast cancer |
WO1988005054A1 (en) † | 1987-01-07 | 1988-07-14 | Imperial Cancer Research Technology Limited | Probe |
-
1987
- 1987-11-11 NZ NZ222509A patent/NZ222509A/en unknown
- 1987-11-11 AU AU80994/87A patent/AU613590B2/en not_active Ceased
- 1987-11-16 IL IL84475A patent/IL84475A/xx not_active IP Right Cessation
- 1987-11-16 CA CA000551952A patent/CA1340815C/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-11-17 EP EP87116997A patent/EP0268279B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-17 ES ES87116997T patent/ES2080717T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-17 AT AT87116997T patent/ATE130029T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-11-17 DE DE3751585T patent/DE3751585T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-18 KR KR1019870012996A patent/KR900007951B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1987-11-18 NO NO874796A patent/NO175944C/no not_active IP Right Cessation
- 1987-11-18 DK DK198706062A patent/DK175635B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-11-18 IE IE311087A patent/IE71154B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-11-18 JP JP62291645A patent/JP2597372B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-19 PT PT86180A patent/PT86180B/pt unknown
-
1994
- 1994-01-11 US US08/179,875 patent/US5849876A/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-11-15 GR GR950403215T patent/GR3018093T3/el unknown
-
1998
- 1998-06-26 HK HK98106951A patent/HK1007766A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DK606287A (da) | 1988-05-20 |
AU8099487A (en) | 1988-06-09 |
EP0268279A3 (en) | 1991-07-03 |
AU613590B2 (en) | 1991-08-08 |
NO874796D0 (no) | 1987-11-18 |
KR880006358A (ko) | 1988-07-22 |
US5849876A (en) | 1998-12-15 |
ES2080717T3 (es) | 1996-02-16 |
DE3751585D1 (de) | 1995-12-14 |
EP0268279B1 (en) | 1995-11-08 |
DE3751585T3 (de) | 2004-08-05 |
HK1007766A1 (en) | 1999-04-23 |
JPS63279784A (ja) | 1988-11-16 |
ATE130029T1 (de) | 1995-11-15 |
CA1340815C (en) | 1999-11-09 |
IE873110L (en) | 1988-05-19 |
KR900007951B1 (ko) | 1990-10-23 |
NO175944C (no) | 1995-01-04 |
GR3018093T3 (en) | 1996-02-29 |
NO874796L (no) | 1988-05-20 |
IL84475A (en) | 1992-06-21 |
IE71154B1 (en) | 1997-01-29 |
IL84475A0 (en) | 1988-04-29 |
EP0268279A2 (en) | 1988-05-25 |
JP2597372B2 (ja) | 1997-04-02 |
PT86180B (pt) | 1990-11-07 |
DK606287D0 (da) | 1987-11-18 |
EP0268279B2 (en) | 2003-12-03 |
ES2080717T5 (es) | 2004-07-16 |
DE3751585T2 (de) | 1996-04-25 |
NZ222509A (en) | 1993-03-26 |
PT86180A (en) | 1987-12-01 |
DK175635B1 (da) | 2004-12-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO175944B (no) | Monoklonale antistoffer for anvendelse til in vitro påvisning av tumorassosiert mucinantigen, og hybridomcellelinjer som produserer disse | |
JP4122050B2 (ja) | ヒト癌腫抗原(hca)、hca抗体、hca免疫アッセイ法、画像化の方法及び治療 | |
CA1320459C (en) | Anti-human pulmonary carcinoma monoclonal antibody | |
Linsley et al. | Monoclonal antibodies reactive with mucin glycoproteins found in sera from breast cancer patients | |
Lan et al. | Polypeptide core of a human pancreatic tumor mucin antigen | |
Scully et al. | AIDS-related Kaposi's sarcoma displays differential expression of endothelial surface antigens. | |
JP3137976B2 (ja) | 結腸癌のムチンエピトープに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマct43 | |
JP2555028B2 (ja) | ヒト非−小細胞肺癌に関するモノクロ−ナル抗体 | |
US6004761A (en) | Method for detecting cancer using monoclonal antibodies to new mucin epitopes | |
Major et al. | Monoclonal antibodies to antigens abnormally expressed in breast cancer. | |
JPS6321562A (ja) | 抗ヒト胃癌単クロ−ン性抗体amc−462 | |
JP3581160B2 (ja) | 抗粘液糖タンパク質モノクローナル抗体 | |
Brown et al. | Development and evaluation of monoclonal antibody-based immunoassays: Breast carcinoma-associated mucins as tumor markers | |
JPS61250000A (ja) | モノクロ−ナル抗体 | |
JPS63157995A (ja) | 抗ヒト大腸癌単クロ−ン性抗体acc−574 | |
Deutsch et al. | Detection of a novel marker in the bronchial secretions of patients with non‐small cell lung cancer using the 4B5 monoclonal antibody | |
EP0235817A2 (en) | Anti-human stomach cancer monoclonal antibody | |
JPH06113831A (ja) | ハイブリドーマおよびその抗体 | |
JP2003344414A (ja) | Rcas1の測定方法、及びrcas1測定用キット | |
LINSLEY et al. | JOSEPH P. BROWN | |
JPH0272198A (ja) | 抗ヒト肺腺癌モノクローナル抗体 | |
EP0339633A2 (en) | Anti-human gastric cancer monoclonal antibody | |
Taylor-Papadimitriou et al. | Development of monoclonal antibodies with specificity for human epithelial cells | |
JPH0867700A (ja) | ヒト肺癌細胞と反応するモノクローナル抗体および肺癌検出方法 | |
JPH06102038B2 (ja) | モノクロ−ナル抗体 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MK1K | Patent expired |