DK166080B

DK166080B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af et n-oe4-(3-aminopropyl)aminobutylaa-2-(omega-guanidino-fedtsyreamido)-2-substitueret ethanamid eller et salt deraf

Info

Publication number: DK166080B
Application number: DK445182A
Authority: DK
Inventors: Teruya Nakamura; Akio Fujii; Hamao Umezawa; Tomio Takeuchi; Shinichi Kondo; Hironobu Ilnuma; Daishiro Ikeda
Original assignee: Zaidan Hojin Biseibutsu
Priority date: 1981-10-08
Filing date: 1982-10-07
Publication date: 1993-03-08
Also published as: ES8504690A1; FR2514350A1; ES526501A0; ES8402558A1; IT1189373B; CA1187513A; CH653015A5; FR2514350B1; SE8205698D0; AU554489B2; US4518532A; YU227682A; BE894651A; YU44678B; CS268654B2; IT8249228A0; CS717982A2; AU8912182A; US4983328A; NL8203874A

Description

DK 166080 B

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af et hidtil ukendt N-[4-(3-amino-propyl)aminobutyl]-2-(ω-guanidino-fedtsyreamido)-2-substitue-ret ethanamid, der er anvendeligt som carcinostatisk stof, 5 og som har formlen

H2NCNH ( CH2 ) nCONHCHCONH ( CH2) 4NH ( CH2) 3NH2 I

10 NH OR

hvor R er hydrogen, C1_4-alkyl, der eventuelt indeholder en hydroxylgruppe som substituent, eller en benzylgruppe, og n er et helt tal fra 3 til 10, eller et salt deraf.

Under systematiske undersøgelser af carcinostatiske 15 midler er der fundet et hidtil ukendt carcinostatisk antibiotikum BMG162-aF2, der kaldes spergualin, i et dyrkningsfiltrat af en stamme BMG162-aF2 (FERM P-5230, ATCC 31932) af Bacillus laterosporus hørende til slægten Bacillus (Journal of Antibiotics, bd. 34, side 1619 og side 1622 (1981)).

20 Spergualins kemiske struktur repræsenteres af formlen is 19 18 17 16 (S) li* 13 1211 10 98 7651*321 H NCNHCH CH CH CH CHCH CONHCHCONHCH CH2CH2CH2NHCH2CH2CH2NH2 a 2 i 2 2 2 2j 2 j

25 NH OH OH

Konfigurationen i 15-stillingen er S, medens den endnu ikke er bestemt i 11-stillingen (Journal of Antibiotics, bd. 34, 30 1622 (1981)). Forbindelsen med denne formel kan syntetiseres ved kondensation af syreamidet og glyoxylylspermidin. Den derved fremkomne epimere forbindelse opløses i naturligt (-)-spergualin og ikke-naturligt (+)-spergualin (Journal of Antibiotics, bd. 34, 1625 (1981)).

35 Der er blevet gennemført omfattende undersøgelser vedrørende forskellige forbindelser beslægtet med spergualin. Herved blev det opdaget, at forbindelserne med formlen I udviser udmærket carcinostatisk aktivitet, og forbindelserne

DK 166080 B

2 er også yderst stabile, især når R ikke er hydrogen.

Den her omhandlede analogifremgangsmåde er karakteriseret ved, at (a) et ω-guanidino-fedtsyreamid med form- 5 len

H2NCNH(CK2)nC0NH2 II

10 NH

hvor n har den ovenfor anførte betydning, kondenseres med N- [ 4- (3 -aminopropy 1) aminobutyl ] -2,2-dihydroxyethanamid med formlen

15 HO

\

CHCONH(CH2)4NH(CH2)3NH2 III

/

HO

20 eller (b) et ω-guanidino-fedtsyreamid med formlen II kondenseres med N- [ 4 - (3 -aminopropyl) aminobutyl ] -2,2 -dihydroxy-ethanamid med formlen III til dannelse af et N-[4- (3 -aminopropyl) aminobutyl ] -2- (ω-guanidino-fedtsyre-25 amido)-2-hydroxyethanamid med formlen 13 12 11 1098 7 S 5 3 2 1 H0NCNH (CH~) —'CONHCHCONHCH- CHnCH-CH-,NHCH_ CH~CH-,NH_ Ta ώ .i 2 li c 2 2 2 2 2 2 2 2 la 30 *

NH OH

hvor n har den ovenfor anførte betydning, hvorefter forbindelsen med formlen la, om ønsket efter beskyttelse af amino-gruppen og iminogruppen, omsættes med en mono- eller divalent 35 aliphatisk alkohol med 1-4 carbonatomer, en diazoparaffin med 1-4 carbonatomer eller benzylalkohol, og eventuelle beskyttende grupper fjernes.

De fremstillede forbindelser anvendes almindeligvis i form af et pharmakologisk acceptabelt syreadditionssalt.

40 Som eksempler på syreadditionssalte kan nævnes salte af uorganiske syrer, såsom saltsyre, svovlsyre, phosphorsyre og borsyre, og af organiske syrer, såsom eddikesyre, citron-

DK 166080 B

3 syre, vinsyre og glutarsyre.

De fremstillede forbindelser med formlen I, hvor R og n har den ovenfor anførte betydning, har hver et asymmetrisk carbon i 11-stillingen og forekommer derfor i form 5 af epimere med hensyn til carbon 11, dvs. i form af en venstredrejende epimer (herefter omtalt som (-)) og i form af en højredrejende epimer (herefter omtalt som (+)). Medmindre andet er udtrykkelig anført, er den fremstillede forbindelse en blanding (ca. 1:1) af de epimere (om nødvendigt anført 10 som (+)).

Fysiokemiske og biologiske egenskaber hos typiske eksempler på de fremstillede forbindelser er vist nedenfor.

(1) Fysiokemiske egenskaber.

Navnene på typiske forbindelser, der fremstilles ved 15 fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er vist i tabel I. De molekylære formler og grundstofanalyser af hydrochloriderne af disse forbindelser er anført i tabel II, og de infrarøde spektre (KBr-tablet) og proton-NMR-spektre (i deutero-meth-anol, tetramethylsilan = TMS som intern standard) i tabel 20 III. De specifikke drejninger for optiske isomere af flere af de fremstillede forbindelser er vist i tabel IV.

Forbindelsernes kemiske stabilitet bedømmes ved at bestemme retentionen (%) efter opvarmning ved 60*c i 4 timer.

I tabel V er prøveresultaterne vist sammen med de for sper-25 gualin opnåede som sammenligning. Retentionen bestemmes ved hjælp af højeffektiv væskechromatografi (HPLC). Kolonnen pakkes med "Nucleosil 5C18". Det opløsningsmiddel, der anvendes til spergualin, er en blanding (6:94) af acetonitril-0,01 molær pentansulfonat + 0,01 molær Na2HP04 (pH 3), medens 30 det, der anvendes til forbindelserne, der fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er en blanding af aceto-nitril - 0,005 molær natriumpentansulfonat + 0,01 molær Na2HP04 (pH 3). Blandingsforholdet i sidstnævnte tilfælde varieres for hver enkelt forbindelse. Således anvendes der 35 et blandingsforhold på 10:90 til forbindelse nr. 9.

DK 166080 B

4

Tabel I

H2NCNH(CH2)nCONHCHCONH(CH2)4NH(CH2)3NH2

II I

NH OR

5 Forb.

nr. n_R Forbindelsens navn___ 13 H N- [4-(3-aminopropyl) aminobutyl] -2- (4-guanidinobu- tanamido) -2-hydrojyethanamid 2 4 " N- [4- (3-aminopropyl) aminobutyl] -2- (5-guanidino- 10 pentanamido) -2-hydroxyethanamid 3 5 " N-[4-(3-aminopropyl) arrilmcbutyl]-2-(6-guanidinbhex- anamicb) -2-hydroxyethanamid 4 6 " N- [4- (3-aminopropyl) aminobutyl] -2- (7-guanidinchep- tanamido) -2-hydroxyethanamid 15 5 7 " N- [4- (3-anrincp:ropyl) aminobutyl]-2- (8-guanidino- octanamido) -2-hydroxyethanamid 6 8 " N- [4- (3-aminoprcpyl) aminobutyl] -2- (9-guanidinono- nanamido) -2-hydroxyethanamid 7 3 CH^ N- [4- (3-aminopropyl·) aminobutyl] -2-(4-guanidino- ^ ® butanamido) -2-methoxyethanamid 8 5 " N- [4- (3-aminopropyl) aminobutyl] -2- (6-guanidino- hexanamido) -2-methoxyethanamid 9 6 " N- [4- (3-aminopropyl) aminobutyl] -2- (7-guanidino- heptanamido) - 2 -methoxyethanamid 10 7 " N-[4-(3-aminopropyl) aminobutyl]-2-(8-guanidino- octanamido) -2-mei±oxyethanamid 11 8 " N- [4- (3-aminopropyl) aminobutyl] -2- (9-guanidinono- nanamido) - 2-methoxyethanamid 12 6 CH2CH3 N- [4- (3-amincpropyl) aminobutyl] -2- (7-guanidino- 3 0 heptanamido) -2-ethoxy ethanamid 13 6 CE^CHLj- N- [4- (3-aminopropyl) aminobutyl] -2- (7-guanidino- CH^CH^ heptanamido) -2-butoxyethanamid 14 6 CH^CI^OH N- [4- (3-aminopropyl) aminobutyl] -2- (7-guanidino- heptanamido) -2- (2-hydroxy) ethoxyethanamid 35 /- 15 o C^-CgH,- N- [4- (3-aminopropyl) aminobutyl]-2- (7-guanidino- heptanamido) -2-benzyloxyethanamid 5 0

DK 166080 B

Tabel II

Forb. _Gnmdstofanalyse (%)_ nr. Melekylær formel_C_H_N_Cl_ 1 C14H31N703*3 HC1-3/2 H20 Ber. 34,90 7,74 20,35 22,07 5 pat. 34,92 7,87 20,21 21,96_ 2 C15H33N7°3*3 æ1·3/2 H2° 36'33 7'93 19'77 21'45 _Fdt. 36,27 8,05 19,68 21,30_ 3 c16H35n703-3 HC1.3/2 H20 Ber. 37,69 8,10 19,23 20,86 _Fdt. 37,83 8,38 19,18 20,67_ 10 4 C17H37N703.3 HC1.3/2 H20 Ber. 38,97 8,27 18,71 20,30 _Fdt. 39,10 8,42 18,57 20,18_ 5 C18H39N703.3 HC1.3/2 H20 Ber. 40,19 8,43 18,23 19,77 _Fdt. 40,31 8,74 17,96 19,51_ 6 C19H41N7°3*3 hc1·3/2 H2° 41'34 8'58 17'76 19'27 15 Fdt. 41,32 8,79 17,65 19,13_ 7 C^3N7°3*3 æ1·3/2 ^2° Ber· 36#33 7/93 19,77 21,45 _Fdt. 36,41 8,10 19,46 21,32_ 8 C17H37N703.3 HCl.3/2 H20 Ber. 38,97 8,27 18,71 20,30 _Fdt. 39,20 8,31 18,48 20,11_ 20 9 ClgH3gN703.3 HCl.3/2 H^O Ber. 40,19 8,43 18,23 19,77 _Fdt. 40,33 8,51 19,08 20,11_ 10 C19H41N703.3 HCl.3/2 1^0 Ber. 41,34 8,58 17,76 19,27 _Fdt. 41,39 8,82 17,62 19,15_ 11 C20H43N7O3.3 HCl.3/2 H20 Ber. 42,44 8,73 17,32 18,79 25 Fdt. 42,51 8,92 17,33 18,50_ 12 C19H41N7°3*3 i*31*3/2 H2° Ber* 41'34 8>58 17,76 19,27 __Fdt. 41,44 8,75 17,59 19,11_ 13 C21H45N7°3*3 HC1*3/2 H2° Ber* 43'48 8^86 16^90 18'34 ______Fdt. 43,61 9,04 16,78 18,43_ 30 14 C^H^Ny^.3 HCl.3/2 H20 Ber. 40,18 8,34 17,26 18,73 _Fdt. 40,07 8,39 17,31 18,58_ 15 C21H43N703.3 HCL.3/2 ^0 Ber. 46,94 8,04 15,97 17,32 _ ~_Fdt. 47,04 8,20 15,76 17,12_ 6

DK 166080B

— 33

CM U

33 ^ u — o «. m

» x O —» *» »N

-—· — m CN ^ Lf)

CM CN *\ X CN

* X CM CM X

CM CM 33 CN —»

- 33 33 - O 33 - CO

~ — O — O *-χ — ~ O — —»33

cm 33 χ·' 33 ^ 33 cm 33 33 ^ 33 cm O

£ 33 O O O 33 O ^ O 0330 P O w m —· in O ^ «-s'— O —' iH ' •N'-' CM . *x — H-> m CM m CM CM ID I CM CM O 00 M o in lin ι'ιητιη om im om <D ,3,*'»0*-^0*xCM«x Xk, -*Λ o ·λ ·-> ft—» *a m r m Mm *\ tn cm m «v m «-» m

tø -rH CM CM CM CM' CM CM

χ χ χ χ χ χ »» x 03 Ih » —» χ —. χ —» χ —. —» —» ·. .—. ^ S 8 — m -»m —> m —»tn r~m —» in —» m

2 > ^ X ^ X m K ιο X XX CO X -μ* X

I XcmXcm XcmXcm cm cm X cm X cm C °o cm 33 CM 33 CM 33 cm 33 3333 cm33 cm33 O— 33 O 33 O 330330 O O 330 330 O 0 2 0 2 02 02 w 2 - CJ 2 0 2

Sh O

(¾ Μ' O M* O MT o M1 rs'a’ O <3· r\ ·χ *-s ^ CN ^ r-\

CM O CM d CM CO CM m | m CM CO CM CO

H I I 1 I I I I I O I II II

H ^ CTi O O ^ σι CM (Ti CM O CM en MT CO

[ I r f—^ rx r-\ x-k — *\ ·-» x-v mf\

Η (M rH CM —I CM rH CM H CM iH CM pH CM

iH

O--------- 8

Ir*

K N V «. «> N

O O tn ooo o o o

VØ O KO CO 10 KO KO KO

«3* O ^1* np

rH rH rH rH rH iH rH rH rH

0] te te te te te te ^ te te C in m o o o o in o o o o o o 0 cn H ro cn rocN cn ro cnco cn cn <t> •h ion in o iniH in o in o tn m o

«Ρ Η H rH rH rH rH rH rH rH rH *H rH rH

ft-»

}HpH XX X X XX XX XX X XX

01 mo oo om rt o mo mo oo tø £ m o o co ko co m cm m cm mco m ko

XI ϋ ID H ko o m rH IOH O rH M3 O lOH

(0 ' pH i—I rHrH pH i—I pHpH HrH rHpH pHpH

S £ χ χ - - χ χ ' ' - - ' - - - 33 o o oo oo oo mo mm oo 5h5h m o m cm m τ mvo cm M3 cm rH m σι

(ΰ -P σι cm ο —i σ cm σι h c\H σιΗ σι pH

IH .¾ CM pH CM pH CM pH CM pH CM H CM pH CM pH

<4H φ

£ O4 x X XX XX XX XX XX XX

h u om 00 00 00 00 om oo cm o 0 r-' r* ρχ 010 cn ko in ovo mm ^ pH cm m <3< m mm m H *3< m mn m pH m pH m h mn mn mn

— vil tø pH

0) Π3 5*pH cm m^ m 0 r~-

Η. H

8 β 0 1¾

DK 166080 B

7 «P·—*»

^ ^ — K

s s κ κ o u u u u ^ tn

σι to oo <n "'T

CN CN CN CN - »n

«. #λ *. O k ·* *~v -—- ^ * LD

^in «in /-.in «in m in (N CN <N CN X X CN *

Xv X·» X·· X*· cn <M X —'

CN CN^-v CN — CN r-> K K CNCN

ΚηκηίΕηκο » U * U Κ X

UK UK UK UK — 2 ~ 2 U CN

'—* u '-'U '-'U — U vo ·— CO·— —' K

o O O O x x u in'-' m - in—' in '—' cn ^ cn ^ m ^

»v **N ^ K * \ X *N

CN 00 CN Γ— CN I— CN t— u ο U n CNO

in in in Ίη - ι ^ ' I ^ I c— o^o^o^o^n σι Κ σι K o*"· η η *χ η t- η ο — U ο ^ U ·*-ν η

CN CN CN CN *Ν CN —' »χ CN ’ CN

·.*.·.*. CN CN - » » .—. ν — *· ^— I ν CN I *· Ή * ^ ,- in ^ ιη in ^ in η — •η1 cn -—· q' ιη inX VO X Γ- X CO X τ- CN f-χ ·ν <ν — νο Χ

XcN XCN XCN XcNiHXin rH X m X CN CN K CN K CNK CN K CN CN CN K

„ KU KU KU KU - K - K K U

~ U 2 U 2 U 2 U 2 — U - ^U~ U2 w — — — — n — cn n cn '—

Jj K K K K

O'er o 'T o^r o ^ umu U m U o ^ q r> rx *>χ C' *N r\ ^ C —' C' N— ojcsncNncNncNn cn cn cn n

-U II || Il II cn I Ν' CN I r-i II

rr σι cn σ cn ο cn σι cn ο vo cn o vo cn σι I i r« ·—. A cn fr-v r\ «r\ rv r*s m f\ ^

η rH CN i-η CN H CN rH CN rH CN CO O CN n rH CN

H

iH

0) 8 g_i «.·%«» *» %► ** ·*“ ο o in ο ο o in in co vd m σι vo vo in in ·<ί< ^ Ο Ν' Ν’ *3* Ν' rH rH γΗι—I f—I i—I Ή Ή K ftk ·» ^ **► ^ ^ oo oo oo oo o o oo cn cn cn cn cnvo cn οί cn cn cn vo in o in o in h in o in in tno

rH rH rH rl H rH Η H rH rH rHrH

v *» ^ *> « ^ ^ ^ ^ ^ % oo oo oo ιηο inin in o in o in vo in vo ιησι invo inoo in æ in h

VO H VO rH VO H VO H VO O VOO VO H

rH i—1 rHrH rHrH rHrH rHrH rHrH rHrH

« « » - «. * * * *.·. *· *· » * oo oo in o oo oo ιηιη o in Ν' σι men cn in noi nvo cn m nvo oiri σι η <n cn cn η σ> ή σι η σι «η

CN rH CN rH CN rH CN rH CN rH CN rH CN rH

H % V W W «. % ^ ^ V %»·* o m oo o m oo oo oo om cn in cnvo om o vo . o vo co vo t— m rr n iy n ^ n n* n nn nn n rH n rH nn nn n rH η η nn co σι o rH cn n ^

rH rH rH rH rH

DK 166080 B

8

X

o I—i - t n

cn m X

cn - X —

U cg — k O

in ^ *\ CN -ςρ

I ID

o ^ f\ Tj·

CN

^ N

in

ID X

X CN cn EC

EC O — — U S in

• - ^ EC

W ID

4J O ^ O

M «\ — O cn cn

‘Η I I CN

cn cn m •"\ ·~> <r> H H CN r-~

H

H _

rH

CD

fl B o in in

rH CTl lO

* O -

CN O

in -ν' rH Γ" ^ * m o in cn id o

rH rH

« *.

o in cn id σι o CN rH

«. * o o

H> ID CO rH

cn rH

m r—!

DK 166080B

9

O O O

CN CN CN

D3 S SJ

tn {-* ^ %

-,H r-1 i—i rH

c u o o n ' ' — ' ’ (1) >h ti in

X <N Q

•rH *—i U-Ι S 0 0 0

H —* O 'tf iD

0 —s <u o o cn

η, n CN

m i + >

H

tn Ή fi

CD -H

rQ rH

^ rH ,—

Eh -η +11 + tø

rH

o æ

rH

a( •c · _ C u

•H CJ

fi o

En 10

DK 166080B

σι o oo οι O - Η Γ"· ID Γ"· l£> οι σ\ m iji m o in o «— *- q σι h oo h di σι σι σι σ> © © o © ,η co o o o o rH i—I i—I _ iH vo

ID

O I I I

O <N

iH t—I

«*-*

dP

in o o o o G vo o o o o ^ 0 i—ii—li—1 r-H "-o

•H

•P

C

<D

+1 in

Φ O I I I

PS in o cnj H oo > H 00

Φ O O O O

n «a< o o o o γ ιο i—I (H iH r-1 00 E-*

00 rH IQ -3* O

»- r ·· r k

oo (Τι O O H CO

oo σι σι σι oo ro rp co in ή r\ r\ *-s s ru σι cn Η io oo m r- r- r- co

K / S

Qi / Ή / 1-1 / <tf / 3 / / '· (TI oo H1 in μ

/ ΉI rH rH

/ W

U U I

f fe ^ 11

DK 166080B

o (2) Biologiske egenskaber.

Alle forbindelserne, der fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er i besiddelse af en klar carcino-statisk aktivitet og udviser en stærk vækst-inhiberende virk-5 ning på cancerceller in vitro og en livsforlængende virkning på mus med implanterede cancerceller, således som det vises nedenfor.

I. Vækstinhiberende aktivitet over for cancerceller in vitro 5 DBA/2-mus får implanteret hver 10 museleukæmi— 10 L-1210-celler. Ascitesvæske indsamles aseptisk fra musene efter 4 dages fodring og vaskes tre gange med fysiologisk saltvandsopløsning, så at der fås L-1210-celler, der derefter suspenderes i RPMI 1640 dyrkningsmedium (G.E. Moore, Journal of the American Medical Association, bd. 199, 519 (1967), H.J.

15 Morton, In Vitro, bd. 6, 89 (1970)), hvortil der er tilsat 10% kalvefosterserum og 5 .Umol 2-mercaptoethanol, og den fremkomne ' 4 suspension fortyndes til 5 x 10 L-1210-celler pr. 0,9 ml.

En mikroplade med 0,9 ml af cellesuspensionen og 0,1 ml dyrkningsmedium indeholdende den forbindelse, der afprøves, opbe-20 vares i en carbodioxid-inkubator ved 37°C. Efter 48 timers dyrkning måles antallet af celler ved hjælp af en "Coulter® Counter" (Coulter Electronics, Inc., USA) for at få vækstin-hiberingen (%) = (1-T/C x 100 = [1-(antallet af celler dyrket i mediet, der indeholder prøveforbindelsen)/(antallet af 25 celler dyrket i kontrolmedium)] x 100. Koncentrationen med 50% vækstinhibering beregnes ud fra værdierne for vækstinhi-bering ved forskellige prøveforbindelseskoncentrationer. Resultaterne af prøverne med typiske forbindelser fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen med hensyn til vækst-30 inhibering af L-1210-celler er vist i tabel VI.

35 12

DK 166080B

Q) i d

Λ d O

'HO-rl--' O rH o in *\ CN *-v ^ »N *\

dj0 S cMincocococorHoocMcvorH

*·* ϋί ^ CO «-i CM rH CO i—1 CM

Ό -P Φ # d d ^ 0 <U QJ c in μ. o ·— co cm o in

O I I I I «\ I I *v Η -o I I

VO ID 00 <D CTi i—i cn oo σι r* P-i ^ vo in n o if σι in viol *·>. I I *N| I ·". «Ν r\ rv

Jv co o co vo o cm Γ" co ,-3¾ t" oo νο σ vo r·- p~ o rH ·.-------------- Q) X ω Λ vo r-~ ο η in ri ^ co ο

ri rrt Ο I Ο- I ^v«r\| ^ *Λ «ί «Λ *ί *V

ν - 1 ^a* σι .oo vo σ ro co cm Η οο

Is* r- id σι in. p" in t"· in 1 Λ rH μ-------------- H 0

S

^0) vor^mcNincTkCOfo m ^ co f~-J ^ Ο *N <v Λ rs r\ <\ «<y ·ο Γ <U (*i-Q.cMO!>ioin,3,r~<yi'DcM vo σι r·* ο '--μ οΡ'οοΡ'ΐηιησι^νο ro m

fd Cu H

Em tn______________ d μ -huj ιηνο-^'οοοοοι-ισιηηο’ί' μ O rXr.^^srNr^^rxiN·^»^

OdHrHCTlHCOOOOVCOinOOCMCO

,Q0 O'DCOin’C'in^rorrcMinro Η -Η Ή •d -P______________ d d •η μ

-P -P cooicMovr-iinincNinovorH

¢/] £

X Φιησ»νο^σ^σ»ΐΛθθοηιησ\ΐΠϊΗ ftj U OO^IDCMCM^^fOCOHCOCO

> d

O

M-------------- mcMinr^incnror' in «-s «r^ «-, > «-x 1 I 1 1 «-v CM CM O VO t" H< 0.0 i—i

in CO CO CM CM 'Φ CO CM

O

in ID VO O P-

CM l *n *x | I I I I

«'s I σι ο o oo oo

iH CM CM CO CO

d ω

•HW^^CMco^invor-oo^OHCM

fi <U d rH rM rH

Ο Π3 Pn

DK 166080 B

13 t—f o* <n m i—I in I I t

ID

I I

00 in • in t~~ ui

-P CN CN O

P Γ" *=3* o

O rP

m____ H C· 0Ί t" ^ tr· in σι r·» Ή ID N Ol

<D

Λ ifl--- E-t es io tn u Γ· »-> i1* n rr tt m <n σ o <o o n n

T N H

CN CN Γ~

m O

<r\ I

γη σι <N ro

o H

r I n

H <N

n ^ in

i—I iH r-H

0 14

DK 166080 B

II. Terapeutisk virkning på implanteret cancer hos mus.

Hanmus af BDF^-stammen (5 uger gamle) inokuleres hver intraperitonealt med 10° muse-leukæmi-L-1210-celler og indgives intraperitonealt en gang daglig en prøveforbindelse op-5 løst i fysiologisk s altvands opløsning i 6 på hinanden følgende dage begyndende på inokulationsdagen. Under opdrættet iagttages musene derefter i 30 dage for at bestemme graden af overlevelsestidens forlængelse = 100 x T/C = 100 x (gennemsnitlige overlevelsesdage i den behandlede gruppe) / (genn em-10 snitlige overleveIsesdage i kontrolgruppen). Den terapeutiske virkning af typiske forbindelser, der fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, på muse-leukæmi-L-1210 er vist i tabel VII.

15

Tabel VII

' ^ Dosering Forlængelse af 20 For“*' (mg/kg/dag) overlevelses- Antal mus, der o-'nr. tid (%) verlever i 30 T/C x 100 dage 50 0 0/4 25 336 0/4 12,5 >357 2/4 „ 6„25 >369 1/4 25 4 3 '13 >364 2/4 l'56 >429 4/4 0,78 >429 4/4 0,39 >390 3/4 0,20 197 0/4 50 0 0/4 30 25 306 0/4 , 12,5 181 0/4 6,25 125 0/4 3,13 118 0/4 1,56 104 0/4 - I ! 35

DK 166080 B

15

Tabel VII (forts.) 50 0 0/4 25 0 0/4 12.5 >429 4/4 6.25 >429 4/4 6 3.13 >386 2/4 l',56 >393 3/4 0.78 >429 4/4 0 39 >383 2/4 0,20 >354 2/4 50 . 0 0/4 25 0 0/4 12.5 >429 4/4 6.25 >429 4/4 9 3,13 >429 4/4 (±) 1,56 >411 1/4 0,78 >300 2/4 0,39 171 0/4 0,20 114 0/4 25 0 0/4 12.5 >390 2/4 6.25 >336 1/4 9 3,13 >411 3/4 (-) 1,56 >356 2/4 0,78 >370 2/4 0,39 >342 2/4 0,20 127 0/4 0,10 110 0/4 50 0 0/4 25 0 0/4 12.5 129 0/4 U 6,25 107 0/4 3,13 100 0/4 1.56 i 100 0/4 --1--;- 50 i 0 0/4 25 ; 0 0/4 12.5 i >357 2/4 6.25 >393 3/4 11 3,13 ! >357 2/4 1.56 i 200 0/4 0,78 200 0/4 0,39 143 0/4 0,20 i 107 0/4 __'_i___

DK 166080 B

16 o III. Toksicitet.

Alle forbindelserne, der fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, udviser en forholdsvis lav toksicitet og er karateristiske ved lav toksicitetsakkumulering ved 5 fortsat indgivelse. I tabel VIII er vist de gennemsnitlige dødelige doser (LD_A) for typiske forbindelser, der fremstil-les ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, for mus efter en enkelt intraperitoneal indgivelse samt maksimalt tolererede doser udtrykt som total dosis, når der indgives en fastsat 10 mængde pr. enhed legemsvægt intraperitonealt til mus én gang daglig i 6 på hinanden følgende dage.

15 20 25 30 35

Tabel VIII

0 17

DK 166080 B

_ , LD,_rt+ Maksimal . .

Forfc- , „50* tolereret dosis** (mg/kg) (mg/kg) 5 ______ 1 50 < 300< 2 50 < 300 < 3 50 < 300 < 10 4 25 - 50 150< 5 25-50 150< 6 12;5 - 25 75< 15 8 25 - 50 150< 9 12,5 - 25 75< 10 12,5 - 25 75< 11 12,5-25 75< 20 -—.................. .

12 12,5 - 25 75< 14 25 - 50 150< 25 15 12,5 - 25 75<

Bern.: * Gennemsnitlig dødelig dosis ved en en kelt indgivelse xx Maksimal værdi for totaldosis, der ikke forårsager død, når der indgives en fastsat mængde pr. enhed legemsvægt til mus 30 én gang daglig i 6 på hinanden følgende dage.

35

DK 166080 B

18

Det fremgår klart af den foregående beskrivelse, at forbindelserne, der fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen med formlen I, er nyttige carcinostatiske midler.

Alle de ovenfor anførte enkelte forbindelser udviser udmærket 5 vækst-inhiberende aktivitet over for museleukæmi-L-1210-celler. Blandt disse forbindelser har især sådanne forbindelser meget høj aktivitet, hvor R er et hydrogenatom, en C1_4-alkylgruppe, der eventuelt har en hydroxylgruppe som substituent, eller en benzylgruppe, og n er et helt tal 10 fra 3 til 8. Desuden viser der sig en udmærket terapeutisk virkning på mus med implanteret cancer ved anvendelse af sådanne forbindelser, hvor R er hydrogen eller en alkylgruppe med 1 eller 2, fortrinsvis 1 carbonatom, der kan have en hydroxylgruppe som substituent, og n er 6 eller 8. Af disse 15 forbindelser foretrækkes sådanne, hvor R er en methylgruppe (en alkylgruppe med 1 carbonatom), også hvad angår kemisk stabilitet, idet forbindelsen nr. 9 er den mest foretrukne.

Fremgangsmåden til syntetisering af forbindelserne med formel I vil blive beskrevet mere detaljeret nedenfor.

20 Selv om kondensationen af e ω-guanidino-fedtsyreamid med formlen II og et dihydroxyethanamid med formlen III kan foregå i organiske opløsningsmidler, udføres den almindeligvis i nærvær af en lille smule vand, af hensyn til opløseligheden af begge forbindelser, der almindeligvis behandles 25 i form af syreadditionssalte.

Når der anvendes organiske opløsningsmidler, er a-cetone og dimethylfonnainid egnede, men kondensationen udføres som regel i nærvær af små mængder vand uden anvendelse af organiske opløsningsmidler. Den mængde vand, der skal an-30 vendes, skal være den mindst mulige for at opløse begge forbindelser. I praksis anvendes der en mængde på fra 2 til 60 mol, fortrinsvis fra 4 til 40 mol, pr. mol guanidino-fedtsyre-amid med formlen II. Eftersom disse forbindelser med formlerne II og III almindeligvis anvendes i form af syreaddi-35 tionssaltet, er det ikke nødvendigt at tilsætte en syre til 0 19

DK 166080 B

opløsningen ved denne reaktion. Imidlertid foretrækkes det af hensyn til udbyttet af kondensat at anvende en syrekatalysator. Egnede syrekatalysatorer omfatter uorganiske syrer, såsom saltsyre, svovlsyre, phosphorsyre og borsyre og 5 organiske syrer, såsom eddikesyre, citronsyre, vinsyre, ravsyre, glutarsyre og adipinsyre. En dicarboxylsyre, såsom glu-tarsyre, foretrækkes. Den mængde syre, der skal anvendes, ligger på 0-10 mol,fortrinsvis 0,5-4 mol, pr. mol guanidino-fedt-syreamid med formlen II. Reaktionstemperaturen er 0-100°C, 10 i reglen fra stuetemperatur til 80°C, fortrinsvis 40-70°C. Reaktionstiden varierer med reaktionstemperaturen. Der foretrækkes en reaktionstid på 1-2 dage for at forøge udbyttet. Selv om forholdet mellem guanidin-fedtsyreamid med formlen II og dihydroxyethanamid med formlen III ikke er specielt begræn-15 set, er det praksis at anvende 0,5-4 mol, fortrinsvis 0,8-1,5, mol af sidstnævnte til 1 mol af førstnævnte. Den fremkomne forbindelse er et N-[4-(3-aminopropyl) aminobutyl]-2-(cJ-guanidino-fedtsyre-amido)-2-hydroxyethanamid, der kan gengives ved formlen 20 13 12 11 1098 7 S S **3 2 1 H2NjfNH (CH2] n“CONHCHCONHCH2CH2CH2CH2NHCH2CH2CH2NH2

NH OH

(la) 25 hvor n har de tidligere anførte betydninger, og som er en forbindelse med formlen I, hvor R er hydrogen.

Forbindelserne med formlen I, hvor R ikke er hydrogen, fås ved at alkylere hydroxylgruppen i 11-stillingen i forbindelsen med formlen la med ovennævnte aliphatiske alko-30 hol, diazoparaffin eller benzylalkohol. Den forbindelse, der fås ved ovennævnte kondensation, eller spergualin, fremstillet ud fra en mikrobiel kultur, kan begge anvendes til en forbindelse med formlen la. Den forbindelse, der fås ved al-kyleringen, er et N-[4-(3-aminopropyl) aminobutyl]-2-(co-gua-35 nidinofedtsyre-amido) -2-alkoxyethanamid, der kan gengives ved formlen

DK 166080 B

20 H2NCNH(CH2) nCONHCHCONH(CH2) 4NH(CH2) 3NH2 Ib

II I

NH OR* 5 hvor n har den ovenfor anførte betydning, og R' er C^_^-alkylgruppe, der eventuelt har en hydroxylgruppe som substituent, eller en benzylgruppe. Alkyleringen udføres på følgende måde.

Reaktionen mellen et N-[4-(3-aminopropyl)aminobu-10 tyl]-2- (Co-guanidino-fedtsyre-amido) -2-hydroxyethanamid med formlen la og alkoholen udføres almindeligvis i nærvær af en syrekatalysator. Det er ikke nødvendigt før reaktionen at beskytte guanidino- og aminogrupperne i hydroxyethanamidet med formlen la, men det kan gøres. Alkoholen kan gengives 15 ved formlen

R'-QH IV

hvor R' er en C^_^-alkylgruppe, der eventuelt har en hydr-20 oxylgruppe som substituent, eller en benzylgruppe. Sådanne alkoholer indbefatter f.eks. methanol, ethanol, propanol og butanol, glycoler, såsom ethylenglycol og propylenglycol, samt benzylalkohol. Reaktionen udføres fortrinsvis i alkoholen med formlen IV, men der kan anvendes et inaktivt opløs-25 ningsmiddel. Egnede syrekatalysatorer omfatter uorganiske syrer, såsom saltsyre og svovlsyre, organiske syrer, såsom eddikesyre og p-toluensul fonsyre, samt kationbytterharpikser. Reaktionstemperaturen ligger i intervallet fra 0 til 100°C, i reglen fra stuetemperatur til 80°C, hvor stuetemperatur er 30 mest foretrukket. Reaktionstiden varierer med reaktions temperaturen og ligger fra 1 time til 10 dage, fortrinsvis 1-2 dage.

Når et hydroxyethanamids (formlen la) opløselighed er ringe i en alkohol med formlen IV, er det en fordel at be-35 skytte hydroxyethanamidets amino- og iminogrupper af hensyn til øget udbytte. Egnede beskyttelsesgrupper kan vælges ud fra henvisninger i litteraturen, jf. J.F.W. Mcomie, udg., "Protective

DK 166080B

21 c

Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, N.Y. 1973. De beskyttelsesgrupper for aminogrupper, der almindeligvis anvendes ved peptidsyntese, kan anvendes. Eksempler herpå er monovalente beskyttelsesgrupper, såsom benzyloxycarbonyl, p-5 -methoxybenzyloxycarbonyl, p-nitrobenzyloxycarbonyl, tert.but-oxycarbonyl, trichlorethoxycarbonyl og isobornyloxycarbonyl, samt divalente beskyttelsesgrupper såsom phthaloyl og succi-nyl. Af disse grupper foretrækkes aralkyloxycarbonylgrupper såsom benzyloxycarbonyl- og p-methoxybenzyloxcarbonylgrupper, 10 fordi de let kan indføres og fjernes. Indførelsen af disse beskyttelsesgrupper sker ved kendte metoder, og fordelagtigt ved anvendelse af metoden med aktiv ester. Ved denne metode forbliver guanidinogruppen i forbindelsen med formlen la uforandret.

15 Alkyleringen af hydroxylgruppen i 11-stillingen i hydroxyethanamidet med formlen la ved hjælp af omsætning med en diazoparaffin foretages på følgende måde.

Almindeligvis beskyttes amino- og iminogruppeme i hydroxyethanamidet med formlen la først med en af de ovennævn-20 te beskyttelsesgrupper, og den fremkomne forbindelser underkastes reaktion med en diazoparaffin i et inaktivt organisk opløsningsmiddel, såsom methylenchlorid eller tetrahydrofuran, ved en temperatur på fra -20 til 20°C, i reglen fra -10 til 10°C, fortrinsvis fra -3 til 3°C, i 1-15, sædvanligvis 2-8 25 timer for at opnå alkylering. Reaktionen kræver ikke nødvendigvis en katalysator, men den fremskyndes, når der er en Lewis-syre-katalysator til stede, såsom bortrifluorid, alumi-niumchlorid, hydrofluoborsyre eller selendioxid. Som eksempler på diazoparaffiner med 1-4 carbonatomer kan nævnes diazo-30 methan, diazoethan, diazopropan og diazobutan. Disse diazo-paraffiner kan syntetiseres ud fra tilsvarende N-nitrosoalkyl-urinstof, N-nitrosoalkylurethan, N-nitrosoalkylsulfonamid og N-nitrosoalkyl-N'-nitroguanidin ved hjælp af kendte metoder (f.eks. "Organic Synthesis" (John Wiley & Sons, Inc.), II, 35 1 65 (19 4 3), III, 119 (1955); Journal of Organic Chemistry, 13, 763 (1948); "Organic Synthesis", IV, 250 (1963); Chemi-sche Berichte, 94, 2547 (1961); Canadian Journal of Research, 0 22

DK 166080 B

28B, 683 (1950) f "Organic Synthesis", III, 244 (1955);

Journal of Chemical Society, 286 (1935)).

Alkyleringen med en diazoparaffin muliggør ethylering af hydroxylgruppen i 11-stillingen, uden 5 at konfigurationen i 11-stillingen i formel la ændres. F.eks. omdannes et (-) hydroxyethanamid med formlen la til det tilsvarende (-) alkoxyethanamid med formlen Ib. Der fås et (+)alk-oxyethanamid eller en epimer blanding (+) med hensyn til 11--stillingen ud fra henholdsvis (+)hydroxyethanamidet eller 10 (+) hydroxyethanamidet.

Beskyttelsesgrupperne for amino- og iminogrupperne i det alkylerede produkt kan fjernes på gængs måde, hvorefter der fås et alkoxyethanåmid med formlen Ib. Når således den beskyttende gruppe er en aralkyloxycarbonylgruppe, kan 15 den fjernes ved gængs katalytisk hydrogenering ved atmosfæretryk. Reaktionen udføres i et passende opløsningsmiddel, såsom methanol, ethanol, dioxan eller en blanding deraf, i nærvær af palladium eller platin som katalysator. Reaktionen fremskyndes ved tilsætning af en syre såsom saltsyre eller 20 eddikesyre.

Når R1 i alkoxyethanamidforbindelsen med formlen Ib er en benzylgruppe, fjeraes benzylgruppen ved den katalytiske reduktion, og forbindelsen omdannes til hydroxyethan-amidforbindelsen med formlen la, medens konfigurationen i 25 11-stillingen bibeholdes uforandret. I dette tilfælde forløber den katalytiske reduktion til f jernese af en beskyttende aralkyloxycarbonylgruppe med ringe hastighed ved atmosfæretryk, hvorimod der fås et tilfredsstillende resultat med nedsat reaktionstid ved at udføre reaktionen i vandig eddikesy-30 reopløsning under et højere tryk på flere til adskillige atmosfærer.

Gjf-Guanidino-fedtsyreamidet, der er gengivet ved formlen 35

H2NCNH(CH2)nCONH2 II

DK 166080B

23

NH

5 hvor n har den ovenfor anførte betydning, som er udgangsmateriale for syntesen af forbindelsen med formlen la, syntetiseres som beskrevet nedenfor.

Syntese af en forbindelse med formlen II.

10 Disse ω-guanidino-fedtsyreamider er kendte forbindelser og kan syntetiseres ud fra i handelen værende råmaterialer ved hjælp af kendte reaktioner. Således fås forbindelsen ved at beskytte aminogruppen i en ω-amino-fedtsyre med formlen

15 H2N(CH2)nCOOH V

hvor n har den ovenfor anførte betydning, hvorefter carb-oxylgruppen esterificeres, den fremkomne ester behandles med ammoniak for at omdanne den til et amid, den amino-be-20 skyttede gruppe fjernes,, og aminogruppen omdannes til en guanidinogruppe.

Forbindelsen med formlen II kan også fremstilles ved at oxidere en diamin til en tilsvarende nitril forbindelse, der kan gengives ved formlen 25

H2N(CH2)nCH IV

hvor n har den ovenfor anførte betydning, hvorefter nitrilgruppen hydrolyseres til dannelse af en amidforbindelse, og 30 aminogruppen omdannes til en guanidinogruppe. Eksempler på særlige ω-guanidino-fedtsyreamider med formlen II omfatter 4-guanidinobutanamid, 5-guanidinopentanamid, 6-guanidino-hexanamid, 7-guanidinoheptanamid, 8-guanidinooctanamid, 9-guanidinononanamid, 10-guanidinodecanamid og 11-guanidino-35 undecanamid.

0 24

DK 166080 B

N-[4-(3-Aminopropyl)aminobutyl]-2,2-dihydroxyethan-amid med formlen HOv^

CHCONH(CEL) „NH (CH0)..NIL III

5 HO^ 2 4 2 3 2 der er udgangsmateriale for syntesen af en forbindelse med formlen la, syntetiseres på følgende måde som anført detaljeret i Journal of Antibiotics, bd. 34, 1625 (1981).

10 Den frie aminogruppe i forbindelsen med formlen

H2N(CH2)4N(CH2)^H-X1 X

X1 15 hvor X^ er en amino-beskyttende gruppe, acyleres med en dial-kylacetal af glyoxylsyre, der kan gengives ved formlen X1Ck^

9 CHC00H XI

20 X

35 hvor X er en C^_,--alkylgruppe, eller med et reaktions dygtigt derivat af carboxylsyren, og derefter fjernes den amino-beskyt-1 2 tende gruppe X og alkylgrupperne X , hvilket giver en forbin-25 delse med formlen III.

Forbindelsen med formlen III kan også fås i stort udbytte ved hjælp af hydrolyse af de ovennævnte antibiotiske stof BMG 162-aF2 (spergualin).

Opfindelsen vil i det følgende blive nærmere for-30 klaret ved hjælp af eksempler og fremstillingseksempler.

0

DK 166080B

25

Fremstillingseksempel 1

Syntese af (S)-7-guanidino-3-hydroxyheptanamid (a) Syntese af (S)-3,7-diaminoheptansyre:

Til en opløsning af 15 g (82,15 mmol) L-lysin-hy-5 drochlorid i 150 ml vand tilsættes 8,7 g (82,15 mmol) natri-umcarbonat og 43,2 g (200 mmol) N-ethoxycarbonylphthalimid. Blandingen omrøres i 20 timer ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen vaskes med 50 ml ethylacetat. Det vandige lag indstilles til pH 3,0 med 6N saltsyre og ekstraheres tre gange 10 med 100 ml toluen. Ekstrakten vaskes to gange med 100 ml vand (pH 2,0) , tørres over vandfrit natriumsulfat og inddampes til tørhed under formindsket tryk, hvilket giver 27,95 g (84% udbytte) af et hvidt pulver af di_N-phthaloyl-L-lysin, sønderdelingspunkt 71-72°C, [a]^ -32° (Cl, methanol) .

15 Til 27,0 g (66,4 mmol) di-N-phthaloyl-L-lysin til sættes 40 ml oxalylchlorid. Blandingen opvarmes i oliebad ved 90°C, derefter blandes med 40 ml 1,2-dimethoxyethan, hvorefter der opvarmes under tilbagesvaling i 2 timer. Reaktionsblandingen inddampes til tørhed, opløses igen i 20 ml 1,2-di-20 methoxyethan og tilsættes dråbevis til 500 ml af en etheropløs-ning indeholdende 330 mmol diazomethan, idet der afkøles i isvand. Derefter omrøres blandingen i en time. Reaktionsblandingen inddampes til tørhed og opløses i 250 ml vandfrit methanol. Til opløsningen tilsættes 50 ml af en triethylamin-25 opløsning indeholdende 3,4 g (14,8 mmol) sølvbenzoat. Blandingen omrøres ved stuetemperatur i 15 timer. Bundfaldet opsamles ved filtrering, opløses i 100 ml chloroform, filtreres fra de uopløselige bestanddele og inddampes til tørhed, hvilket som udbytte giver 15,3 g (53%) (S)-3,7-diphthaloylamino- o 2 2 30 heptansyre-methylester. Sønderdelingspunkt 118-119 C, [a] ^ -3° (C2, chloroform) .

Til 15,0 g (34,5 mmol) (S)-3,7-diphthaloylaminohep-tansyre-methylester tilsættes 100 ml 1 molær ethanolisk hydrazinhydrat og 100 ml 95%'s ethanol. Blandingen opvarmes (olie-35 badstemperatur 90°C) under tilbagesvaling i en time. Reaktionsblandingen inddampes til tørhed, opløses i 250 ml 5%'s saltsyre, opvarmes ved 80°C i en time, indstilles til pH 7,1

DK 166080B

26 med 17%’s vandig ammoniak og ledes gennem en kolonne (indvendig diameter 27 mm) pakket med 300 ml "Amberlite® CG-50" (70% NH^-type). Kolonnen vaskes først med 900 ml vand og derefter med 900 ml 0,2 molær vandig ammoniak og elueres med 5 0,5 molær vandig ammoniak. De ninhydrin-positive fraktioner opsamles og inddampes til tørhed, hvilket giver 3,15 g (udbytte 57%) (S)-3,7-diaminoheptansyre . 1/4 H^CO^) i form af en farveløs sirup, [a] +2,9° (Cl, vand).

(b) syntese af (S)-7-guanidino-3-hvdroxvheptanamid: 10 Til 30 ml af en pyridin/vand/triethylamin-blan- ding (10:10:1) indeholdende 3,1 g (19,3 mmol) af den ovenfor under (a) fremstillede (S)-3,7-diaminoheptansyre sættes langsomt 4,81 g (19,3 mmol) N-benzyloxycarbonyloxysuccinimid. Blandingen omrøres i 5 timer ved stuetemperatur. Reaktions-15 blandingen inddampes til tørhed, opløses derefter i 30 ml vand, indstilles på pH 6,4 med 6N saltsyre og ledes gennem en 100 ml kolonne (indvendig diameter 16 mm) pakket med "Amberiite® CG-50" (80% NH^type). Kolonnen fremkaldes med 300 ml vand. Den opsamlede afgangsstrøm ledes yderligere 20 gennem en kolonne (indvendig diameter 16 mm) pakket med 100 ml "Dowex® 50W-X4" (H-type). Kolonnen vaskes først med 300 ml vand og 300 ml 0,2 molær vandig ammoniak og elueres med 0,5 molær vandig ammoniak (fraktionsstørrelse 10 ml). Fraktionerne nr. 16-33 forenes og inddampes til tørhed, hvilket 25 giver 2,73 g (udbytte 48%) af et hvidt pulver af (S)-3-amino- 7-benzyloxycarbonylaminoheptansyre (Ci5H22N2°4*H2°)> sønderdelingspunkt 143-147'C, [α]^2 +14” (Cl, methanol). Kolonnen med "Amberlite® CG-50" elueres med 0,5N vandig ammoniak, hvorved der udvindes 746 mg (24% (S)-3,7-diaminoheptansyre.

30 Til en opløsning af 2,7 g (9,17 mmol) (S)-3-amino- -7-benzyloxycarbonylaminoheptansyre i 33%'s vandig eddikesyre sættes under afkøling i is dråbevis i løbet af en time en opløsning af 1,9 g (27,51 mmol) natriumnitrit i 10 ml vand. Blandingen omrøres i yderligere en time og henstår ved 5°C i 35 24 timer. Efter tilsætning af 50 ml vand ekstraheres reak tionsblandingen to gange med 50 ml ethylacetat. Det organiske lag tørres over vandfrit natriumsulfat og inddampes til 0 27

DK 166080 B

tørhed, hvilket som udbytte giver 2,16 g råpulver. Ved hjælp af søjlechromatografi (kolonne med indvendig diameter på 28 mm) med 200 g silicagel ("Wakogel C-200") fremkaldes ovennævnte råpulver med en chloroform/methanol/koncentreret 5 ammoniak-blanding (30:10:1) (fraktionsstørrelse 20 ml). Fraktionerne nr. 51-60 forenes og inddampes til tørhed, hvilket giver 460 mg (17%'s udbytte) af et hvidt pulver af (S)-7--benzyloxycarbonylamino-3-hydroxyheptansyre, sønderdelingspunkt 115-117°C, [a]2D3 +3° (C2, methanol).

10 Til en opløsning af 450 ml (1,52 mmol) (S)-7-benz- yloxycarbonylamino-3-hydroxyheptansyre i 1,2-dimethoxyethan sættes under afkøling i is dråbevis 7 ml (4,56 mmol) af en opløsning af diazomethan i ether. Blandingen omrøres i 30 minutter. Reaktionsblandingen inddampes til tørhed, hvil- 15 ket giver 461 mg (udbytte 98%) (S)-7-benzyloxycarbonylamino- 22. o -3-hydroxyheptansyre-methylester, [a] ^ +1 .

En opløsning af 450 ml (1,45 mmol) (S)-7-benzyl-oxycarbonylamino-3-hydroxyheptansyre-methylester i 50 ml vandfri methanol mættes under afkøling ved -10°C med gasformig 20 ammoniak og henstår i et lukket glas ved stuetemperatur i 3 dage. Reaktionsblandingen inddampes til tørhed og underkastes chromatografi med en kolonne med indvendig diameter på 20 mm og indeholdende 50 g silicagel ("Wakogel C-200"), idet der fremkaldes med chloroform/methanol (100:1 efter volumen).

25 Fraktionerne nr. 82-106 (hver på 10 ml) forenes og inddampes til tørhed, hvilket giver 371 mg (87%'s udbytte) af et hvidt pulver af (S)-7-benzyloxycarbonylamino-3-hydroxyheptanamid, sønderdelingspunkt 126-127°C, [a]^ -3° (C5, methanol).

I en blanding af 10 ml 90%'s vandig methanol og 30 0,01 ml eddikesyre opløses 350 mg (1,19 mmol) (S)-7-benzyl- oxycarbonylamino-3-hydroxyheptanamid. Efter tilsætning af 50 mg palladium-på-carbon omrøres blandingen under en hydrogenstrøm ved stuetemperatur i 3 timer. Efter at katalysatoren er fjernet ved filtrering, inddampes filtratet til tør-35 hed, opløses igen i en lille smule vand og ledes gennem en kolonne (indvendig diameter 12 mm) indeholdende 30 ml "Do-wex® 50W-X4" (H-type). Kolonnen vaskes med 90 ml vand og 0 28

DK 166080 B

elueres med 0,5 molær vandig ammoniak (fraktionsstørrelse 3 ml). Fraktionerne nr. 28-34 forenes og inddampes til tørhed, hvilket giver 201 mg (96%'s udbytte) af (S)-7-amino-3-hydroxyhep-tanamid, [a]^ -2° (C2, vand).

5 Til en opløsning af 190 mg (1,08 mmol) (S)-7-amino- -3-hydroxyheptanamid i 3 ml vand tilsættes 0,54 ml 2N vandig natriumhydroxidopløsning. Til den fremkomne opløsning sættes under afkøling i is dråbevis i løbet af 30 minutter 1 ml af en methanolopløsning indeholdende 129 mg (1,08 mmol) 2-me-jo thyl-l-nitrosourinstof. Blanding omrøres i yderligere 5 timer, indstilles derefter på pH 6,0 med 6N saltsyre, inddampes til tørhed og renses ved chromatografi ved hjælp af en kolonne (indvendig diameter 15 mm) indeholdende 30 g silica-gel ("Wakogel C-200"), der fremkaldes med en blanding af 15 chloroform, methanol og koncentreret vandig ammoniak (60:10: 1 efter volumen). Fraktionerne nr. 67-90 (størrelse 6 ml hver) forenes og inddampes til tørhed, hvilket giver 187 mg (udbytte 70%) af et hvidt pulver af (S)-7-nitroguanidino-3--hydroxyheptanamid, sønderdelingspunkt 148-149°C, [a] ^ -2° 20 (C2, methanol) .

I en blanding af 15 ml vand, 15 ml methanol og 7,5 ml eddikesyre opløses 170 mg (0,69 mmol) (S)-7-nitroguanidi-no-3-hydroxyheptanamid. Efter tilsætning af 50 mg 5%'s palla-dium-på-carbon omrøres blandingen under hydrogenstrøm i en 25 time ved stuetemperatur. Efter at katalysatoren er fjernet ved filtrering, inddampes filtratet til tørhed, hvorved der fås 165 mg råpulver. Råpulveret opløses i 10 ml vand, ledes gennem en kolonne med indvendig diameter på 12 mm og pakket med 20 ml "CM-Sephadex® C-25" (Na-type) og elueres 30 med 0,5 molær natriumchloridopløsning (fraktionsstørrelse 2 ml). Fraktionerne nr. 18-25 forenes, inddampes til tørhed og ekstraheres tre gange med 10 ml methanol. Methanol-opløsningerne forenes, ledes gennem en kolonne med indvendig diameter på 20 mm og pakket med 100 ml "Sephadex® LH-20" og 35 elueres med methanol (fraktionsstørrelse 1 ml) . Fraktionerne nr. 28-46 forenes og inddampes til tørhed, hvilket giver 149 mg (91%'s udbytte) af et hvidt pulver af (S)-7-guanidino- 0 29

DK 166080 B

-3-hydroxyheptanamid-hydrochlorid (C8Hi8N4°2*HC·^ ' [α]2^ -2° (C2, vand).

Fremstillingseksempel 2 5 Syntese af 8-quanidino-3-hydroxyoctanamid (a) Syntese af 8-benzyloxycarbonylamino-3-ketooctan-syre-ethylester:

Til en opløsning af 6,56 g (50 mmol) 6-aminohexan-syre i 25 ml 2N vandig natriumhydroxidopløsning sættes 5 ml 10 ethylether. Til blandingen sættes dråbevis under afkøling i is og omrøring i løbet af 30 minutter 10 ml benzyloxycarbo-nylchlorid og 37,5 ml 2N vandig natriumchloridopløsning. Efter tilsætningen får temperaturen lov at vende tilbage til stuetemperatur, og omrøringen fortsættes i 2 timer. Reak-15 tionsblandingen vaskes to gange med 20 ml ethylether. Det vandige lag symes med koncentreret saltsyre og ekstraheres 3 gange med 50 ml ethylacetat. Ekstraktopløsningerne forenes, vaskes med mættet saltvandsopløsning, tørres over vandfrit natriumsulfat og befries for opløsningsmiddel ved de-20 stillation, hvorved fås 12,16 g (udbytte 92%) 6-benzyloxy-carbonylaminohexansyre med et smeltepunkt på 127-128°C.

En opløsning af 2,65 g (10 mmol) carbonylamino-hexansyre og 1,62 g (10 mmol) i handelen værende 1,1'-carbon-yldiimidazol i 25 ml vandfrit tetrahydrofuran omrøres i 15 25 minutter ved stuetemperatur. Til reaktionsblandingen tilsættes en suspension af 6,18 g (40 mmol) af et hvidt pulver af magnesiumenolat af monoethylmalonat (fremstillet ud fra 5,28 g monoethylmalonat og 972 mg magnesium) i 50 ml vandfrit tetrahydrofuran. Blandingen omrøres i 2 timer ved stuetempera-30 tur. Efter tilsætning af 50 ml IN saltsyre og omrøring i 10 minutter ekstraheres reaktionsblandingen 3 gange med 50 ml chloroform. Chloroformlaget vaskes først red IN saltsyre, dernæst med mættet vandig natriumhydrogencarbonatopløsning og endelig med mættet saltvandsopløsning, tørres derefter 35 0 30

DK 166080 B

over vandfrit natriumsulfat og befries for opløsningsmiddel ved destillation. Remanensen ledes gennem en kolonne på 100 g "Silica Gel 60” (Merck & Co.) og elueres med chloroform (fraktionsstørrelse 20 g). Fraktionerne nr. 43-105 forenes 5 og inddampes til tørhed, hvilket giver 2,35 g (udbytte 70%) ethyl-8-benzyloxycarbonylamino-3-ketooctanoat.

Proton-NMR-spektrum (i deuterochloroform), : 1,27 (CH3), 1,1-1,9 (CH2x3), 2,52 (CH2, 3,17 (NCH2), 3,40 (CH2), 4,18 (CH2), 5,05 (NH), 10 5,09 (CH2), 7,32 (CgH5).

Infrarødt absorptionsspektrum (KBr-tablet) , cm’"'*': 3360, 2920, 1730, 1710, 1520, 1240.

(b) Syntese af 8-guanidino-3~hydroxyoctanamid: I 40 ml methanol mættet med gasformig ammoniak op-15 løses 1,69 g (5 mmol) ethyl-8-benzyloxycarbonylamino-3-hy- droxy-octanoat. Opløsningen omrøres i 3 dage ved stuetemperatur, og reaktionsblandingen inddampes til tørhed. Remanensen krystalliseres ;ud fra ethanol, hvilket som udbytte giver 1,18 g 8-benzyloxycarbonylamino-3-hydroxyoctanamid (udbytte 20 72,5%) med et smeltepunkt på 100-101°C.

I 20 ml ethanol opløses 2,01 g (6 mmol) ethyl-8-ben-zyloxycarbonylamino-3-ketooctanoat, fremstillet ovenfor under (a). Til opløsningen tilsættes portionsvis under omrøring ved stuetemperatur 227 mg (6 mmol) natriumhorhydrid. Blandingen omrøres i 30 minutter, blandes derefter med flere dråber eddikesyre, hældes i 100 ml vand og ekstraheres tre gange med 50 ml chloroform. Chloroformlagene forenes, vaskes først med IN saltsyre, derefter med mættet’ vandig natriumhydrogencarbonat- opløsning og endelig med mættet saltvandsopløsning, tørres 30 derefter over vandfrit natriumsulfat og befries for opløsningsmiddel ved hjælp af destillation, hvor ved fås 2,00 g ethyl-8--benzyloxycarbonylamino-3-hydroxyoctanoat (udbytte 99%) med et smeltepunkt punkt på 47-50°C.

35 0 31

DK 166080 B

Til en opløsning af 1,04 g (3,2 mmol) 8-benzyloxy-carbonylamino-3-hydroxyoctanamid i 20 ml methanol sættes 3,2 ml IN saltsyre og 200 ml 10%'s palladium-carbon. Blandingen omrøres under hydrogenstrøm ved stuetemperatur i 3 timer.

5 Katalysatoren fjernes ved filtrering, og filtratet inddampes til tørhed, hvilket giver 670 mg 8-amino-3-hydroxyoctanamid--hydrochlorid.

Til en opløsning af 670 mg 8-amino-3-hydroxyoctan-amid-hydrochlorid i 8 ml IN vandig natriumhydroxidopløsning 10 sættes 668 mg (2,4 mmol) S-methylisothiourinstof-semisul- fat. Blandingen omrøres natten over ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen indstilles på pH 6 med IN saltsyre, inddampes til tørhed og opløses i 5 ml 1 molær saltvandsopløsning. Opløsningen ledes gennem en kolonne af 160 ml "Diaion HP-20" 15 (Mitsubishi Chemical Co.), og kolonnen elueres først med 400 ml 1 molær saltvandsopløsning, dernæst med 400 ml 0,8 molær saltvandsopløsning og endelig, med 800 ml 0,6 molær saltvandsopløsning (fraktionsstørrelse 15 g) . Fraktionerne nr. 41-87 forenes, inddampes til tørhed og ekstraheres tre gange med 10 2Q ml methanol. Methanollaget ledes gennem en kolonne på 300 ml "Sephadex® LH-20" og elueres med methanol, hvilket bevirker afsaltning (fraktionsstørrelse 7 ml) . Fraktionerne nr. 25-35 forenes og inddampes til tørhed, hvorved fås 687 mg 8-guani-dino- 3 -hydroxyoctanami d-hydrochlorid, udbytte 85%.

25 Proton-NMR-spektrum (i deutero-methanol) , : 1,4-1,8 (CH2x4), 2,36 (CH2), 3,20 (NCH2), 3,95 (CH).

-1

Infrarødt absorptionsspektrum (KBr-tablet), cm : 3350, 3170, 2930, 1655, 1400, 1175.

30

Fremstillingseksempel 3

Syntese af N-[4-(3-aminopropyl)aminobutyl]-2,2-dihydroxyethan-amid (a) Syntese af mono-N-benzyloxycarbonyl-l,4-butandi- 35 amin:

Til en opløsning af 1,76 g (20 mmol) 1,4-butan di amin 0 32

DK 166080 B

i 30 ml 50%'s vandig methanol sættes 5,48 g (20 mmol) benzyl-S-4,6-dimethylpyrimid-2-ylthiocarbonat (Kokus an-kaga-ku Co.)· Blandingen orarøres i 3 timer. Reaktionsblandingen filtreres for at fjerne bundfaldet [2,08 g (29%) di-N-benzyl-5 oxycarbonylforbindelse fås ud fra bundfaldet]. Filtratet inddampes til tørhed, opløses i 250 ml chloroform og vaskes 5 gange med 100 ml vand. Chloroformlaget tørres over vandfrit natriumsulfat og inddampes til tørhed, hvorved der fås 1,0 g mono-N-benzyloxycarbonyl-1,4-butandiamin (udbytte 23%) 10 som en farveløs sirup.

(b) Syntese af 0-tosyl-3-tert.butoxycarbonylamino--1-propanol:

Til en opløsning af 1,5 g (20 mmol) 3-amino-l-pro-panol i 30 ml methanol sættes 4,8 g (20 mmol) tert.butyl-15 -S-4,6-dimethyl-pyrimid-2-ylthiocarbonat. Blandingen omrøres i 6 timer. Reaktionsblandingen inddampes til tørhed, opløses i 200 ml chloroform og vaskes med 200 ml vand. Chlorof ormlaget inddampes og underkastes søjlechromatografi ved hjælp af 300 g silicagel ("Wakogel·C-200") og en toluen/ethylacetat-20 blanding (1:1 efter volumen) som fremkaldende opløsningsmiddel (fraktionsstørrelse 15 ml). Fraktionerne nr. 82-151 forenes og inddampes til tørhed, hvilket giver 2,95 g 3-tert.buty loxycarbonylamino-l-propanol (udbytte 84%) som et farveløst olieagtigt stof.

25 Til en opløsning af 2,95 g (16,9 mmol) 3-tert.but- oxycarbonylamino-1-propanol i 50 ml pyridin sættes dråbevis under afkøling i is i argonatmosfære pyridinopløsning indeholdende 3,36 g (17,7 mmol) p-toluensulfonylchlorid i løbet af 40 minutter. Blandingen henstår natten over ved 7°C, 30 blandes derefter med lidt vand og inddampes til tørhed. Remanensen opløses i 200 ml chloroform, vaskes først med 5%'s vandig kaliumhydrogensulfatopløsning, derefter med mættet vandig natriumhydrogencarbonatopløsning og endelig med vand, tørres derefter over vandigt natriumsulfat og inddampes til tørhed.

35 Remanensen underkastes søjlechromatografi ved hjælp af 120 g silicagel ("Wakogel c-200") og en toluen/ethylacetatblanding (8:1 efter volumen) som fremkaldende opløsningsmiddel (frak

DK 166080B

33 0 tionsstørrelse 15 ml). Fraktionerne nr. 35-68 forenes og inddampes til tørhed, hvilket giver 3,06 g O-tosyl-3-tert.-butoxycarbonylamino-l-propanol (udbytte 55%) som et farveløst olieagtigt stof.

5 (c) Syntese af N-tert.butoxycarbonyl-N-(tert.but- oxycarbonylaminopropyl) -1,4-butandiamin.

I 15 ml Ν,Ν-dimethylformamid opløses 800 mg (2,43 mmol) af den i afsnit (b) fremstillede 0-tosyl-3-tert.butoxycarbonylamino-l-propanol . Efter tilsætning af 510 mg (4,8 10 mmol) lithiumbromid (LiBr.^O) omrøres blandingen ved stuetemperatur i 24 timer. Til reaktionsblandinqen, der indeholder bromforbindelsen, sættes 540 mg (2,43 mmol) mono-N-ben-zyloxycarbonyl-1,4-butandiamin fremstillet ovenfor i afsnit (a) samt 0,34 ml triethylamin. Blandingen omrøres ved stue-15 temperatur i 48 timer. Til reaktionsblandingen sættes 699 mg (2,9 mmol) tert.butyl-S-4,6-dimethylpyrimid-2-ylthio-carbonat. Blandingen omrøres i 13 timer ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen inddampes til tørhed, opløses i 100 ml chloroform, vaskes med 50 ml vand, tørres over vandfrit natrium-20 sulfat og inddampes til tørhed. Remanensen underkastes søj-lechromatografi ved hjælp af 200 g silicagel ("Wakogel C-200") og en toluen/ethylacetat-blanding (4:1 efter volumen) som fremkaldende opløsningsmiddel (fraktionsstørrelse 12 ml). Fraktionerne nr. 134-165 forenes og inddampes til tørhed, hvor-25 ved der fås 608 mg N-benzyloxycarbonyl-N'-tert.butoxycarbo-nyl-N'-(tert .butoxycarbonylaminopropyl)-l, 4-butandiamin (udbytte 52%) som et farveløst, sirupsagtigt stof.

Til en opløsning af 144 mg (0,3 mmol) af ovennævnte sirupsagtige stof i 5 ml methanol sættes 100 mg 30 5%'s palladium-bariumcarbonat. Blandingen omrøres under hy drogenstrøm ved stuetemperatur i 5 timer. Efter at katalysatoren er fjernet ved filtrering, inddampes filtratet til tørhed, hvorved fås 103 mg N-tert.butoxycarbonyl-N'-(tert.but-oxycarbonylaminopropyl)-1,4-butandiamin (udbytte 100%).

35 (d) Syntese af N-[4-(3-aminopropyl)-aminobutyl]-2,2- - dihydroxy ethan amid: I 2 ml ethylacetat opløses 100 mg (0,29 mmol) af 0 34

DK 166080 B

den i afsnit (c) fremstillede N-tert.butoxycarbonyl-N-(tert.-butoxycarbonylaminopropyl)-1,4-butandiamin og 148 mg (1 mmol) 2,2-diethoxyeddikesyre. Til den fremkomne opløsning sættes 135 mg (1 mmol) 1-hydroxybenzotriazol og 206 mg (1 mmol) 5 dicyclohexylcarbodiimid. Blandingen omrøres ved stuetemperatur i 15 timer. Bundfaldet fraskilles ved filtrering og vaskes med koldt ethylacetat. Filtratet og vaskevæskeme forenes og vaskes med 1 molær vandig ammoniak og derefter med vand. Ethylacetatlaget tørres over vandfrit natriumsulfat, 10 inddampes til tørhed og underkastes søjlechromatografi med en kolonne på 20 g silicagel ("Wakogel C-200") og en toluen/ ethylacetat-blanding (1:2 efter volumen) som fremkaldende opløsningsmiddel (fraktionsstørrelse 3 ml). Fraktionerne nr. 14-21 forenes og inddampes til tørhed, hvilket giver 109 mg 15 N-[4-(3-tert.butoxycarbonylaminopropyl)-4-tert.butoxycarbo- nylaminobutyl]-2,2-diethoxy ethan amid (udbytte 79%) som et farveløst, sirupsagtigt stof.

Til en opløsning af 44 mg (0,13 mmol) af ovennævnte sirupsagtige stof i 1 ml dioxan sættes 2,5 ml 0,1N saltsy-20 re. Blandingen omrøres i et oliebad ved 100°C i 4 timer. Reaktionsblandingen neutraliseres med 0,2N vandig natriumhydroxidopløsning til pH 6 og inddampes til tørhed. - Remanensen eks-traheres med 1,5 ml methanol, og methanollaget ledes gennem en søjle (indvendig diameter 16,5 mm) pakket med 100 ml "Se-25 phadex® LH-20" og fremkaldes med methanol (fraktionsstørrelse 2 ml). Fraktionerne nr. 22-25, der er positive ved ninhy-drinreaktion, forenes og inddampes til tørhed, hvilket giver 13 mg N- [4- (3-aminopropyl) aminobutyl]-2,2-dihydroxyethanamid--dihydrochlorid (udbytte 46%) som et farveløst, sirupsagtigt 30 stof.

Eksempel 1

Syntese af N-[4-(3-aminopropyl)aminobutyl]-2-(4-guanidinobu-tanamido)-2-hydroxyethanamid 35 En blanding af 360 mg (2 mmol) 4-guanidino-butana- mid-hydrochlorid, 701 mg (2,4 mmol) N-[4-(3-aminopropyl)ami-nobmtyl]-2,2-dihydroxyethanamid-dihydrochlorid, 264 mg (2 0 35

DK 166080 B

mmol) glutarsyre og 0,36 ml vand opvarmes ved 60°C i 24 timer. Efter at reaktionen er løbet til ende, sættes 5 ml vand til reaktionsblandingen, der derefter ledes gennem en kolonne med indvendig diameter på 20 mm og pakket med 150 ml 5 "CM-Sephadex® C-25" (Na-type) og fraktioneres ved serievis eluering med 1,5 liter vand og 1,5 liter 0,8 molær vandig natriumchloridopløsning (fraktionsstørrelse 15 ml). Fraktionerne nr. 125-137 svarende til natriumchloridkoncentratio-nerne på 0,48-0,56 molær forenes, inddampes derefter og eks-10 traheres tre gange med 10 ml methanol. Methanollaget ledes gennem en kolonne med indvendig diameter på 20 mm og pakket med 150 ml "Sephadex® LH-20" og fremkaldes med methanol (fraktionsstørrelse 7 ml) . Fraktionerne nr. 9-15 forenes og inddampes til tørhed, hvilket giver 318 mg N-[4-(3-aminopropyl)-75 aminobutyl] -2- (4-guanidinobutanamido) -2-hydroxyethanamid-tri-hydrochlorid (udbytte 35%) som et hvidt pulver.

Eksempel 2

Syntese af N-[4-(3-aminopropyl)aminobutyl]-2-(5-guanidinopen-20 tanamido) -2-hydroxyethanamid

En blanding af 92,4 mg (0,48 mmol) 5-guanidino-pen-tanamid-hydrochlorid, 166,5 mg (0,57 mmol) N-[4-(3-aminopropyl) aminobutyl] -2 ,2-dihydroxyethanamid-dihydrochlorid, 62,8 mg (0,48 mmol) glutarsyre og 0,1 ml vand opvarmes ved 60°C i 25 24 timer. Efter at reaktionen er løbet til ende, sættes 5 ml vand til reaktionsblandingen, som derefter renses på lignende måde som beskrevet i eksempel 1 ved hjælp af "CM-Sephadex® C-25" (Na-type) og "Sephadex® LH-20", hvorved fås 82,5 mg N-[4-(3-aminopropyl)aminobutyl]-2-(5-guanidinopentanamido)-30 -2-hydroxyethanamid-trihydrochlorid (udbytte 37,1%) som et hvidt pulver.

Eksempel 3

Syntese af N-[4-(3-aminopropyl)aminobutyl]-2-(6-guanidinohex-35 anamido)-2-hydroxyethanamid

En blanding af 446 mg (2,14 mmol) 6-guanidinohexan-amid-hydrochlorid, 750 mg (2,57 mmol) N-[4-(3-aminopropyl)ami- 0 36

DK 166080 B

butyl]-2,2-dihydroxyethanamid-dihydrochlorid, 283 mg (2,14 mmol) glutarsyre og 0,45 ml vand opvarmes ved 60°C i 24 timer. Efter at reaktionen er løbet til ende, sættes der 5 ml vand til reaktionsblandingen, og den fremkomne blanding 5 renses på lignende måde som beskrevet i eksempel 1 ved hjælp af "CM-Sephadex® C-25" (Na-type) og "Sephadex® LH-20", hvorved fås 459 mg N-[4-(3-aminopropyl) aminobutyl]-2-(6-guanidi-nohexanamido) -2-hydroxyethanamid-trihydrochlorid (udbytte 44%) som et hvidt pulver.

10

Eksempel 4

Syntese af N- [4- (3-aminopropyl) aminobutyl] -2- (7-guanidinohep-tanamido)-2-hydroxyethanamid En blanding af 360 mg (1,62 mmol) 7-guanidinoheptan-15 amid-hydrochlorid, 568 mg (1,94 mmol) N-[4-(3-aminopropyl)aminobutyl] -2 ,2-dihydroxyethanamid-dihydrochlorid, 214 mg (1,62 mmol) glutarsyre og 0,36 ml vand opvarmes ved 60°C i 24 timer. Efter at reaktionen er løbet til ende, sættes der 5 ml vand til reaktionsblandingen, og den fremkomne blanding 20 renses på lignende måde som beskrevet i eksempel 1 ved hjælp af "CM-Sephadex® C-25" (Na-type) og "Sephadex® LH-20", hvorved fås 317 mg N-[4-(3-aminopropyl) aminobutyl]-2-(7-guanidi-noheptanamido) -2-hydroxyethanamid-trihydrochlorid (udbytte 39%) som et hvidt pulver.

25

Eksempel 5

Syntese af N-[4-(3-aminopropyl) aminobutyl]-2-(8-guanidinooc-tanamido) -2-hydroxyethanamid En blanding af 500 mg (2,11 mmol) 8-guanidinooctan-30 amid-hydrochlorid, 740 mg (2,53 mmol) N-[4-(3-aminopropyl)a-minobutyl]-2,2-dihydroxyethanamid-dihydrochlorid, 335 mg (2,53 mmol) glutarsyre og 0,34 ml vand opvarmes ved 60°C i 24 timer. Efter at reaktionen er løbet til ende, sættes der 5 ml vand til reaktionsblandingen, og den fremkomne blan-35 ding renses på lignende måde som beskrevet i eksempel 1 ved hjælp af "CM-Sephadex® C-25" (Na-type) og "Sephadex® LH-20" hvilket giver 526 mg N-[4-(3-aminopropyl)aminobutyl]-2-(8-gu-

DK 166080B

37 0 anidinononanamido) -2-hydroxyethanamid-trihydrochlorid (udbytte 49%) som et hvidt pulver.

Eksempel 6 5 Syntese af N-[4-(3-aminopropyl)aminobutyl]-2-(9-guanidinonon-anamido)-2-hydroxyethanamid En blanding af 316 mg (1,26 mmol) 9-guanidinononan-amid-hydrochlorid, 442 mg (1,51 mmol) N-[4-(3-aminopropyl)ami-nobutyl]-2,2-dihydroxyethanamid-dihydrochlorid, 166 mg (1,26 10 mmol) glutarsyre og 0,01 ml vand opvarmes ved 60°C i 24 timer. Efter at reaktionen er løbet til ende, sættes der 5 ml vand til reaktionsblandingen, og blandingen renses på lignende måde som beskrevet i eksempel 1 ved hjælp af "CM-Sephadex® C-25" (Na-type) og "Sephadex® LH-20", hvilket som udbytte gi-15 ver 324 mg N- [4- (3-aminopropyl) aminobutyl]-2- (9-guanidinononan-amido)-2-hydroxyethanamid-trihydrochlorid (udbytte 49%) i form af et hvidt pulver.

Eksempel 7 20 Syntese af N-[4-(3-aminopropyl)aminobutyl]-2-(4-guanidinobu- tanamido)-2-methoxyethanamid Til en opløsning af 45,5 mg (0,10 mmol) N-[4-(3-a-minopropy1)aminobutyl] -2-(4-guanidinobutanamido)-2-hydroxye-thanamid-trihydrochlorid i 1 ml vandfri methanol sættes 25 0,1 ml 2N hydrogenchlorid-methanol. Blandingen omrøres ved stuetemperatur i 17 timer. Reaktionsblandingen inddampes under formindsket tryk og opløses i 3 ml vand. Den fremkomne opløsning ledes gennem en kolonne med indvendig diameter på 20 mm og pakket med 150 ml "CM-Sephadex® C-25" og fraktio-30 neres ved serievis eluering med 1 liter vand og 1 liter 1 molær vandig natriumchloridopløsning (fraktionsstørrelse 17 ml). Fraktionerne nr. 67-71 svarende til saltkoncentrationerne 0,63-0,67 molær forenes, inddampes til tørhed og ekstraheres tre gange med 5 ml methanol. Methanollaget ledes gennem en 35 kolonne med indvendig diameter på 20 mm og pakket med 150 ml "Sephadex® LH-20" og fremkaldes med methanol (fraktionsstørrelse 7 ml). Fraktionerne nr. 10-14 forenes og inddampes til 0 38

DK 166080 B

tørhed, hvilket giver 31,4 mg N-[4-(3-aminopropyl)aminobutyl]--2- (4-guanidinobutanamido) -2-methoxyethan amid-trihydrochlorid (udbytte 67%) som et hvidt pulver.

5 Eksempel 8

Syntese af N-[4-(3-aminopropyl)aminobutyl]-2-(6-guanidinohex-anamido)-2-methoxyethanamid Til en opløsning af 177 mg (0,37 mmol) N-[4-(3-aminopropyl) aminobutyl] -2- (6-guanidinohexanamido) -2-hydroxyethan-10 amid-trihydrochlorid i 20 ml vandfri methanol sættes 2 ml 2N hydrogenchlorid-methanol. Blandingen omrøres ved stuetemperatur i 15 timer. Reaktionsblandingen inddampes under formindsket tryk, og det fremkomne hvide pulver opløses i 15 ml vand. Den vandige opløsning indstilles på pH 6 med IN van-15 dig natriumhydroxidopløsning, ledes derefter gennem en kolonne med indvendig diameter på 25 mm og pakket med 300 ml "CM-Sephadex® C-25" (Na-type) og fraktioneres ved serievis eluering med 2 liter vand og 2 liter 1 molær vandig natri-umchloridopløsning (fraktionsstørrelse 17 ml). Fraktioner-20 ne nr. 138-152 svarende til natriumchloridkoncentrationer på 0,59-0,65 molær forenes, inddampes til tørhed og ekstraheres to gang med 10 ml methanol. Methanollaget ledes gennem en kolonne med indvendig diameter på 25 mm og pakket med 300 ml "Sephadex® LH-20" og fremkaldes med methanol (friktionsstørrel-25 se 7 ml) . Fraktionerne nr. 18-32 forenes og inddampes til tærhed, hvilket giver 607 mg N- [4- (3-aminopropyl) aminobutyl] --2- (7-guanidinoheptanamido) -2-methoxyethanamid-trihydrochlo-rid (udbytte 64%) som et hvidt pulver.

30 Eksempel 10

Syntese af N-[4-(3-aminopropyl)aminobutyl]-2-(8-guanidinooc-tananddo)-2-methoxyethanamid Til en opløsning af 220 mg (0,43 mmol) N-[4-(3-aminopropyl) aminobutyl] -2- (8-guanidinooctanamido) -2-hydroxyethan-35 amid-trihydrochlorid i 4,4 ml vandfri methanol sættes 0,44 ml 2N hydrogenchlorid-methanol. Blandingen omrøres natten o-ver ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen inddampes under 0 39

DK 166080 B

formindsket tryk, og det fremkomne hvide pulver renses på lignende måde som beskrevet i eksempel 7 ved hjælp af "CM-Sepha-dex® C-25" (Na-type) og "Sephadex® LH-20" , hvilket giver 195 mg N- [4- (3-aminopropyl) aminobutylj -2- (8-guanidinooctanamido) -5 -2-methoxyethanamid-trihydrochlorid (udbytte 86%) som et hvidt pulver.

Eksempel 11

Syntese af N-[4-(3-aminopropyl) aminobutyl]-2-(9-guanidinonon-10 anamido)-2-methoxyethanamid

Til en opløsning af 160 mg (0,31 mmol) N-[4-(3-aminopropyl) aminobutyl] -2- (9-guanidinonan amido) -2-hydroxyethan-amid-trihydrochlorid i 3,2 ml vandfri methanol sættes 0,32 ml 2N hydrogenchlorid-methanol. Blandingen omrøres natten οι 5 ver ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen inddampes under formindsket tryk, og det fremkomne hvide pulver renses på samme måde som beskrevet i eksempel 7 ved hjælp af "CM-Sepha-dex® C-25" (Na-type) og "Sephadex® LH-20", hvilket giver 107 mg N- [4- (3-aminopropyl) aminobutyl] -2- (9-guanidinononanamido) -20 -2-methoxyethanamid-trihydrochlorid (udbytte 65%) som et hvidt pulver.

Eksempel 12

Syntese af N-[4-(3-aminopropyl)aminobutyl]-2-(7-guanidinohep-25 tanamido)-2-ethoxyethanamid

Til 100 mg (0,20 mmol) N-[4-(3-aminopropyl)aminobutyl] -2-(7-guanidinoheptanamido)-2-hydroxyethanamid-tri-hydrochlorid .sættes 10 ml vandfri ethanol og 1 ml vandfri ethanol mættet med hydrogenchloridgas. Blandingen omrøres 30 ved stuetemperatur i 24 timer. Reaktionsblandingen filtreres for at fjerne uopløselige stoffer, og filtratet inddampes under formindsket tryk. Det fremkomne hvede pulver renses på en måde som beskrevet i eksempel 7 ved hjælp af "CM-Sephadex® C-25" (Na-type) og "Sephadex® LH-20”, hvilket gi-35 ver 71 mg N-[4-(3-aminopropyl)aminobutyl]-2-(7-guanidinohep-tanamido)-2-ethoxyethanamid-trihydrochlorid (udbytte 68%) i form af et hvidt pulver.

0 40

DK 166080 B

Eksempel 13

Syntese af N-[4-(3-aminopropyl)aminobutyl3-2-(7-guanidinohep-tanamido)-2-butoxyethanamid Til 100 mg (0,2 mmol) N-[4-(3-aminopropyl)aminobu-5 tyl]-2-(7-guanidinoheptanamido)-2-hydroxyethanamid-trihy- drochlorid .sættes 10 ml n-butanol og 1 ml n-butanol mættet med hydrogenchloridgas. Blandingen omrøres ved stuetemperatur i 2 dage. Reaktionsblandingen filtreres for at fjerne de uopløselige stoffer, og filtratet (n-butanolopløsning) eks-10 traheres tre gange med 5 ml vand. Det vandige lag neutraliseres med "Amberlite® IR-410" og inddampes under formindsket tryk. Remanensen renses på lignende måde som beskrevet i eksempel 7 ved hjælp af "CM-Sephadex® C-25" (Na-type) og "Sepha-dex® LH-20", hvilket giver 15 mg N-[4-(3-aminopropyl)amino-15 butyl] -2- (7-guanidinoheptanamido) -2-butoxyethanamid-trihy-drochlorid (udbytte 13,5%) som et hvidt pulver.

Eksempel 14

Syntese af N- [4- (3-aminopropyl) aminobutyl] -2- (7-guanidinohep-20 tanamido)-2-(2-hydroxy)ethoxyethanamid

Til en opløsning af 100 mg (0,20 mmol) N-[4-(3-aminopropyl) aminobutyl] -2- (7-guanidinoheptanamido) -2-hydroxye-thanamid-trihydrochlorid i 5 ml ethylenglycol sættes 0,5 ml ethylenglycol mættet med hydrogenchloridgas. Blandingen 25 omrøres natten over ved stuetemperatur. Efter tilsætning af 25 ml vand indstilles reaktionsblandingen på pH 6 med IN vandig natriumhydroxidopløsning og renses på lignende måde som beskrevet i eksempel 7 ved hjælp af "CM-Sephadex C-25" (Na--type) og "Sephadex LH-20" , hvilket giver 63 mg N-[4-(3-ami-30 nopropyl) aminobutyl]-2-(7-guanidinoheptanamido)-2-(2-hydroxy) -ethoxyethanamid-trihydrochlorid (udbytte 58%) som et hvidt pulver.

35 0

DK 166080B

41

Eksempel 15

Syntese af N-[4-(3-aminopropyl) aminobutyl]-2-(7-guanidinohep-tanamido)-2-benzyloxyethanamid

Til 100 mg (0,20 mmol) N-[4-(3-aminopropyl)aminobu-5 tyl]-2- (7-guanidinoheptanamido) -2-hydroxyethanamid-trihydro- chlorid sættes 10 ml benzylalkohol og 1 ml benzylalkohol mættet med hydrogenchloridgas. Blandingen omrøres ved stuetemperatur i 18 timer. Reaktionsblandingen filtreres for at fjerne uopløselige stoffer, og benzylalkohollaget ekstraheres 10 tre gang med 5 ml vand. Det vandige lag neutraliseres med "Amberlite® IR-410" , inddampes til tørhed og renses på samme måde som beskrevet i eksempel 7 ved hjælp af "CM-Sephadex® 025' (Na-type) og "Sephadexf© lh-20" , hvilket giver 61 mg N--[4-(3-aminopropyl)aminobutyl]-2-(7-guanidinoheptanamido)-2-15 -benzyloxyethanamid-trihydrochlorid (udbytte 52%) som et hvidt pulver.

20 25 30 35

Claims

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af et N-[4- (3-aminopropyl) aminobutyl]-2- (ω-guanidino-fedtsyreamido) -2- substitueret ethanamid med formlen 5 H2NCNH ( CH2 ) nCONHCHCONH ( CH2) 4NH (CH2) 3NH2 I NH OR 10 hvor R er hydrogen, Ci_4-alkyl, der eventuelt indeholder en hydroxylgruppe som substituent, eller en benzylgruppe, og n er et helt tal fra 3 til 10, eller et salt deraf, kendetegnet ved, at (a) et ω-guanidino-fedtsyreamid med formlen 15 H2NCNH(CH2)nC0NH2 II NH 20 hvor n har den ovenfor anførte betydning, kondenseres med N- [ 4 - (3 -aminopropy 1) aminobutyl ] -2,2 -dihydroxyethanamid med formlen HO 25 \ CHCONH(CH2)4NH(CH2)3NH2 III / HO eller 30 (b) et ω-guanidino-fedtsyreamid med formlen II kondenseres med N-[4-(3-aminopropyl)aminobutyl]-2,2-dihydroxy-ethanamid med formlen III til dannelse af et N-[4-(3-aminopropyl) aminobutyl ] -2- (ω-guanidino-fedtsyre- amido)-2-hydroxyethanamid med formlen 35 H2NCNH (CH2) n“CONHCHCONHCH2CH2CH2CH2NHCH2CH2CH2NH2 la NH OH hvor n har den ovenfor anførte betydning, hvorefter forbindelsen med formlen la, om ønsket efter beskyttelse af amino-gruppen og iminogruppen, omsættes med en mono- eller divalent aliphatisk alkohol med 1-4 carbonatomer, en diazoparaffin DK 166080 B med 1-4 carbonatomer eller benzylalkohol, og eventuelle beskyttende grupper fjernes.

2. Analogifremgangsmåde ifølge krav 1 til fremstilling af et N-[4-(3-aminopropyl)aminobutyl]-2-(o-guanidino-fedt-5 syre-amido)-2-alkoxyethanamid med formlen H2NC(CH2)nC0NHCHC0NH(CH2)4NH(CH2)3NH2 Ib

10 NH OR' hvor R’ er C^.^-alkyl, der eventuelt har en hydroxylgruppe som substituent, eller en benzylgruppe, og n er et helt tal fra 3 til 10, eller et salt deraf, kendetegnet ved, at en forbindelse med formlen la eller et salt deraf, 15 eventuelt efter beskyttelse af aminogruppen eller iminogrup-pen, omsættes med en mono- eller divalent aliphatisk alkohol med 1-4 carbonatomer, diazoparaffin med 1-4 carbonatomer eller benzylalkohol, og at eventuelle beskyttende grupper fjernes.

3. Analogifremgangsmåde ifølge krav 1, kende tegnet ved, at kondensationen af ω-guanidino-fedtsyreamidet med formlen II med dihydroxyethanamidet med formlen III udføres i nærvær af vand.

4. Analogifremgangsmåde ifølge krav 1 eller 3, k e n -25 detegnet ved, at kondensationen af ω-guanidino-fedt- syreamidet med formlen II med dihydroxyethanamidet med formlen III udføres i nærvær af en syrekatalysator.

5. Analogifremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at omsætningen mellem hydroxyethan- 30 amidet med formlen la med den aliphatiske mono- eller dialkohol med 1-4 carbonatomer eller benzylalkohol udføres i alkoholen i nærvær af en syrekatalysator.

6. Analogifremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at n er et helt tal fra 6 til 8.

7. Analogifremgangsmåde ifølge krav l, kende tegnet ved, at et ω-guanidino-fedtsyreamid med formlen DK 166080 B H2NCNH(CH2)6CONH2 NH kondenseres med dihydroxyethanamidet med formlen III til 5 dannelse af et hydroxyethanamid med formlen H2NCNH(CH2)gCONHCHCONH(CH2)4NH(CH2)3NH2

10 NH OH

8. Analogifremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at hydroxyethanamidet med formlen la, eventuelt efter beskyttelse af amino- og iminogruppen, omsættes med methanol eller diazomethan til dannelse af et meth-15 oxyethanamid med formlen H2NCNH (CH2) 6CONHCHCONH (CH2 ) 4NH (CH2 ) 3NH2 .

20 NH OCH3