NL8203874A - N-4-(3-aminopropyl)aminobutyl-2-(w-guanidino-vetzuuramido)-2-gesubstitueerde-ethaanamide, zout daarvan en werkwijze ter bereiding daarvan. - Google Patents

Description

>/ > 1 * *’ . -1- N-/”4-(3-aminopropyl)aminobutyl/-2-(w-guanidino-vetzuur-amido)-2-gesubstitueerde -ethaanamide, zout daarvan en werkwijze ter bereiding daarvan.

Deze uitvinding heeft betrekking op een nieuwe ver-binding N-/4-(3-aminopropyl)aminobuty1/-2-(w-guanidino-vetzuur-amido)-2-gesubstitueerde-ethaanamide die nuttig is: als een careinostatische stof en kan worden weergegeven 5 door de algemene formule 1 van het formuleblad, waarin Y voorstelt de groep lg, lh of lj van het formuleblad, waarbij R voorstelt!een waterstofatoom, een alkylgroep van 1 tot en met 4 koolstofatomen een hydroxylgroep als sub-.stituent kunnen hebben, of een benzylgroep, en n een geheel 10 getal van 1 tot en met 8 is, met dien verstande dat, wan-neer Y de groep lj van het formuleblad is en n 4 is, R weergeeft de groepen anders dan het waterstofatoom; een zout daarvan en een werkwijze voor de bereiding daarvan.

Tijdens de systematische onderzoeken van carcino-15 statische gevallen, werd een nieuw carcinostatisch antibio-ticum BMG162~aF2 gevonden, dat spergualin werd genoemd, in een kweekfiltraat van een stam BMG162-aF2 (FERM P-5230; ATCC 31932) van Bacillus laterosporus die behoort tot het genus Bacillus /Journal of Antibiotics, Vo-1. 34,biz. 1619 20 en biz. 1622 (1981)/. De chemische structuur van spergualin wordt weergegeven door de formule lk van het formuleblad.

De configuratie in de positie 15 is S, terwijl die in de positie 11 nog moet worden bepaald /"Journal of Antibiotics Vol. 34, 1622 (1981)/. De verbinding van deze formule wordt 25 gesynthetiseerd door de condensatie van het zure amide en . glyoxylspermidine. De ontstane epimere verbinding wordt ge-scheiden in natuurlijk (-)-spergua-lin en niet-natuurlijk (+)-spergualin /Journal of Antibiotics, Vol. 34, 1625 (1981)/.

In het kader van de onderhavige uitvinding werd een 30 uitvoerig onderzoek uitgevoerd naar uiteenlopende verbin-dingen, die in verband staan met spergualin. De uitvinding berust op de vondst dat de verbindingen die zijn weergegeven met de algemene formule 1 van het formuleblad, een uitste-kende careinostatische werkzaamheid vertonen en bijzonder 35 wanneer R een groep is anders dan het waterstofatoom, zijn 8203874 V *4* *

1 X

" . ' -2- de verbindingen uitstekend ook wat betreft stabiliteit.

De verbindingen van deze uitvinding warden gesynthe-tiseerd zoals hieronder wordt beschreven.

De verbindingen van de algemene formule 1 van het 5 formuleblad waarin R een waterstofatoom is, worden bereid door de condensatie van een ω-guanidino-vetzuuramide van de algemene formule 2 van het formuleblad, waarin Y en n als boven zijn gedefinieerd, en N-/4-(3-aminopropyl)amino-butyl/-2,2-di-hydroxyethaanamide van de formule 3 van het 10 formuleblad.

In het geval dat R van de algemene formule (1) een van de andere groepen dan het waterstofatoom is, wordt de onderhavige verbinding gesynthetiseerd doordat men de verbinding die verkregen is door de bovenvermelde condensa-15 tie of spergualin die verkregen is uit het microbische kweekfiltraat, in welke verbinding of in welk spergualin, als dat noodzakelijk is de amino en iminogroepen zijn be-schermd, te laten reageren met een alifatische mono- of dialcohol van 1 tot en met 4 koolstofatomen, een diazo-20 alkaan van 1 tot 4 koolstofatomen, of benzylalcohol, en de beschermingsgroepen, als daarvan sprake is, te verwij-deren voor de amino en iminogroepen.

De verbinding van deze uitvinding wordt in het algemeen gebruikt in de vorm van een in farmacologisch 25 opzicht aanvaardbaar zuuradditiezout. Als voorbeelden van zure additiezouten kan melding worden gemaakt van zouten met anorganische zuren zoals chloorwaterstofzuur, zwavel-zuur, fosforzuur, en boorzuur, en organische zuren zoals azijnzuur, citroenzuur, wijnsteenzuur en glutaarzuur.

30 De verbindingen van deze uitvinding die zijn weer- gegeven door de algemene formule 11 van het formuleblad waarin Y, R en n als boven zijn gedefinieerd, heeft elk een asymmetrisch koolstofatoom in de positie 11 en bestaat daarom in de vorm van epimeren ten opzichte van koolstof-35 atoom 11, dat wil zeggen in de vorm van links draaiend epimeer /hierna aan te duiden als (-)7 en in de vorm van rechts draaiend epimeer /hierna aan te duiden als (+)7-Tenzij dat speciaal staat aangegeven is de onderhavige verbinding een mengsel (bij benadering 1:1) van een paar 4 0 epimeren /als dat noodzakelijk is, aangeduid met ( + )7· 8203874 * ' : «ν

Wanneer Y .een groep is met formuie lm van het formuleblad heeft de verbinding ook een asymmetrisch koolstofatoom in de positie 15 en er is daarom S§n epimeer met S-configura-tie in de positie 15 en het andere epimeer met R-configura-5 tie in de positie 15. Tenzij dit speciaal is aangegeven, is de onderhavige verbinding een mengsel (bij benadering 1:1) van (S)-epimeer en (R)-epimeer.

De fysisch chemische en biologische eigenschappen van typerende voorbeelden van de verbindingen van deze uit-10 vinding zijn hieronder weergegeven.' (1) Fysisch chemische eigenschappen.

De namen van typerende verbindingen van deze uit-vinding zijn weergegeven in tabel A. De molecuulformules en elementanalyses van hydrochloriden van deze verbin-15 dingen zijn samengevat in tabel B, en de infrarood spectra (KBr tablet) en proton-NMR spectra (in deutero-methanol, tetramethylsilan = TMS als inwendige standaard) in tabel C.

De specifieke rotaties van optische isomeren van verschei-dene verbindingen van deze uitvinding zijn weergegeven in 20 tabel D.

De chemische stabiliteit van de onderhavige verbinding werd beoordeeld door de retentie (%) te bepalen na 4 uur lang verhitten bij 60°C. In tabel E zijn weergegeven de testresultaten tezamen met die voor spergualin als refe-25 rentie. De retentie werd bepaald door middel van vloeistof chromatografie met hoog prestatievermogen (HPLC). De kolom (R) had als pakking Nucleosil 5C18. Het voor spergualin ge-bruikt oplosmiddel was een mengsel (6:94) van acetonitril-0,01M natrium pentaansulfonaat +0,01M Na2HPO^ (pH 3), 30 terwijl dat voor de verbindingen volgens de uitvinding een mengsel van acetonitril -0/005M natrium pentaansulfonaat +0,01M Na2HPO^ (pH 3) was. De mengverhouding in het laatste geval liep uiteen voor elke bepaalde verbinding. Bijvoorbeeld werd een mengverhouding van 10:90 gebruikt voor verbinding 35 No 9, terwijl die verhouding 7:93 was voor verbinding No.22, φ 40 8203874 . -4- *» ψ a τ * IΛ • Ν ι—! ' I Λ d § d (d d Ο» id cd (d id (d o cd +j (d -P (d i 4J fi X ft +> £ . O'

3 <D (D Φ Ο 0 H

Λ ft ' & a o d p 0 0 0 0 0 0 > d d d d d d . p •rl -Η -Η -H -H ij ? 1¾ (¾ 1¾ Ό T3 Ό > •P ·Η -P ·Ρ Ή Ή

d . fi fi g c S

id (d (d (d td id .

d 3 3 P . 3 2.

&i iji ij> Gi σ> σ> 111 I . » > 5JI lo to r** 00 <Tl W* "‘•W' '*** 1 I I ι ι ι

CM CM CM CM CM CM

111 I I ! O' N 'S •'N.f'S.N.

d ; r} r-? r-T r-Γ r-? . H* •H >i l>i . £ji £p !>i ΓΪ1 <0 +) +J +) +) -P +> .

c: d <u d ‘ 3 <u d o do d <u •p ΛΌ Λ Ό Λ Ό Λ'Ο.ΛΌ Λ'Ο J2 0 ·Η 0 Ή Ο ·Ρ 0 ·Η 0 -Η 0 ·Η ρ d g ‘ d g : dg; dg d g d g .

<u -H td ή B p id -p td ·η td ή <d > Ed g d g d . g d . Sd g g .

(did did (did (did id to .

Φ ^ td id .-. (d —. <d . —. (d —s td >d ' rl ij H a Ha Ha H a . H a .

>, +) >, Ρ >i P >i P >i P >« +> .

d ft 0) ft Q) ft Φ ' ft Φ ft CD ft CD

(d O >i 0 >t 0 >i 0 >1 O >1 . 0 >1

> MX ftXJ MX Ρ X

ftO ftO ft 0 ft O ft O ft 0

g OP OP OP OP OP . OP

«3 d'd dO d ό d Ό · . a ό a ό <! (d -P >1 H >i . ·Η >( -P >1; - *H >\ -p >i S g a , g.d· S a i "2 h (di id ι (d ι (d i (d ι

(D 1 CM | CM I CM I CM I CM [CM

^ mi mr C2.1 C2·1 C2·1 C2-* ph I Ο ι "ο ίο ίο ίο; ίο d ' Γ3· Ό ' Γ5*· TJ C* 10 ff Ό . ff Ό

\j ·Η *Vi ·Ρ 1>^j ·Ρ *P ’“vi -P 'nI *P

1 g I g I g I g . I g . is

Sid ' Sid S 3 . Sid Sid Sid PS a ' = = - = - =

CM

a

X U

CM = = = = - a u q h cm m p< a to 0> d

•P

d •p 0 j 12 h cm m p* tn to

P

o > * 8203874 X >* ν -5- *

'sD

I I N

I l· c i i β h β β § C g 2 Λ β <d its « 2 $ _ β β -Ρ β <2 "ft Π4 L ω ft -Ρ β ft Ο ρ 8 α> ο ο φ Λ Λ Λ Ο β Λ θ’ Ο Ο Ο 0.0 Ο Η β β β ς · « 5 2 Ό ^ Ό tJ . *0 'Ο ft Η -Η -Η ·Η -Η ·Η Φ G β '5 β S g - > td β β β β β β β β β β β

On Οι θ' θ’ Οΐ .

I 1 I I · 1 «-μ <0 Ο· CO ΟΊ Γ" I 1 1 1 I ι

, CM CM CM CM CM CM

! ! I i > J

^ : S> .¾ ^ h> : ir ί i? v £ : £ βφ βφ βφ βΦ βΦ β„, ΛΌ ΛΌ Λ Ό -51¾ -5¾ -9 ® Ο ·Η 0 Ή 0 ·Η . 0 -Η Ο ·Η 0 β .

βε βε βε e ε . eg. ζ ·£ •Η β -Η β -Η β -Η β ·Η β 'd § ε β ε β : es §β 15 15 3<ΰ toed d (ΰ tons. its κ> £ ^—4 /ν (d *-% π3 ^ <ΰ λπ3 ~ 2 <1 I—t JCJ ι—1 XS r-ί r-t ,β Η β ^ >,+3 >, -P >1+J >1 -Ρ . >1 -ft . >ι £ Η ft φ: ft Φ ft Φ ft Φ - β» ? φ Ο >ι 0 >ι 0 >ι Ο >ι . 0 >ι Ρ Φ π LiWi }-ibd p ^ p X . P X β β ft Ο:; ft 0 ft Ο ft 0 9*2 0*0 Β Οχ:: Ο β Ο β Ο β Ο Λ 2 2

β+J β -μ β -Ρ β -Ρ β-Ρ. β -C

β ε ε ε s . § ε s s § £ If !> βΐ β I βΐ β I β I . β 1

I CM I CM I CM I CM [CM | CM

m m i mi mi. ml. mi. mi.

r-i --- s: w ^-V w^ w^, 0 10 10 10 10 1 > ,-31 Ό ft1 V3 ^3* (¾1¾. Ν’ O ¢5¾ p V| ·Η VJ -Η N Ρ *vl τΗ . VJ ·Π VI ’β .

φ ι ε ιε: ι ε ι ε ' § ' ε > 2 β 2 ί . 2 β S β . S β m a υ m cm .

a ® O = » = = ° /

CM

a u CM = = = a u rH n -3» in vo ’S'

Ο r-H CM

. Γ>. CO σι Ή t~i m 8203874 k ^ ( *> ’ r -6- « > i * β i i a) a a i i i d) cd d) r- β β β -P 0) 0)

p (3 «3 ft +» fl N

ρ ρ P 0) u 0 i-+ +) +) -Ρ Λ 0 β Λ

ft ft ft I I I

φ Q) 0 CN CN CN a rj xi £ I I I 0 0 0 0 0 0 0 S3 £ β C fi fi &> '

•Η ·Η *rl *H ·Η ·Η H

ti Ό ' Ό Φ Ό Ό 0 •rH ·Ρ ·Ρ ·Η *H Ή > β S3 S3 β β β Ρ ρ ρ p Ρ P Ρ ο β 3 β β Ρ Ρ >

Cn cn Ι7> Φ Ο1 Ο1

I ΙΟΙ I I I

r~~ γ·" Ό Γ" Γ" οο σι W ·~· ·Η w

I I £ I I I I

CN CN P CN CN CN CN

I I S3 I I I I

3? 3? s 3? 3? 3? 3? 5* a ' a d ρω ρ -η pa) pa) pa) Λ 0) Λ >1 Λ £ Λ Ό Λ'Ο Λ'Ο ΟΌ Ο Ά OP Ο ·Η 0·Η Ο ·Η β -Η C0 ΡΡ β £ . β g β S .

•Η £ τ( β -rl Ρ -HP Ή Ρ ·Η Ρ £Ρ £ -Ρ £ Ρ S β . S β . I β .

(ΰβ ΡΟ) ΡΛ ΡΡ ΡΡ. Ρ.Ρ >-* ρ ,*-% κ -p ρ " *· Ρ Ρ

ιίΰ HP Η >1 HO) r-i Λ Η Λ I XS

>ι Ρ >ι Μ >ι >ι >) -Ρ . >ι +ί . >· £ Η ft -Ρ Ο. Ο ft * ft CD ' S4^ S4^ 0) ΟΟ) OP 00 Ο >ι Ο >ι Ο >1 Λ Μ >1 Ρ Ό Ρ Η Ρ X! . Ρ X! . Ρ >< Ρ ft X! ft >c ft ΪΡ ft ο . ft ρ . ft ρ

-Ρ 00 0Λ on OP . OP. OP

β-Ρ βΙ βρ β Ό . β Ό . β Ό β ·Η ρ Ή CN ·Ρ 0) ·Η >ι ·Η >1 ·Η 3Ρ Ρ £ Λ g ~ Η Λ %£.&£££ > PI pi ΡΙ ΡΙ ΡΙ ΡΙ

| CN | CN | CN I CN I CN ICN

0ΐ mi mi mi mi .mi ml ’ο Τ Ο I Ο I Ο I “ο : I ο : 10 > I'tf'd ref 'Ο .rr Ό rf Ό rtf Ό μ Vj ·Ρ ’ν» ·Η *νι -Η V, ·Ρ VI ·Ρ . ’να -Η 0) l£ lg >g IS 1 £ I £

> SP SP 13P SP SP .SP

33 in I o 3 cn m cn co

ETJ S3 S3 U

U O U I , „ - - CN CN CN CN ffi = .= .

33 S3 S3 S3 u u u u

CN

S3 W

u o cn = = II = = 33 S3 u υ

^ ·<3< "tf LD CO

m ^ in co Γ' oo

r—l iH i—t *“+ *—S

a*·· m 8203874 t 1 * -7- oo M ro ro cn cn N.

i l l I 1 H

0 0 0 0 0 Λ c β c ^ 5 rt •Η Ή *H -Η -H o >b Φ ' Ό Φ ό o •—2 *H *H *H er* S g c a o « ς> G (da) ns <D d *d S J ri 3 {3¾ G Φ G -H Ρ Φ 0 &ι·Η d> -H (JiS σ>·Η > 1 Ιβ l g I G I § ^ r~- co to σ> G r- β γ- G 2? w '-'G — G — G '-'Cl >

I CD | G I G I G I G

O) G CM G cm g n Λ mg I -Η I ,G I G I -{-? J "m in, g in, -p IV -P VO V +} .

ri 3 rid r-?(U H5 >, Ή 0 .

>·, G >i>i >1 >1 >i X !* >< +> 0 -Ρ K -Ρ K -P 0 G G GO GO G Λ S2 Λ Λ Λ Ρ . Λ Μ Λ -Ρ Λ ^ 04J Ο Ό 0 G 00 0 -Ρ .

GO G >ι β >ι · β 6 ζΟ

Η >ι ·Η Λ -Η Λ -HI -Η I

S X! § I § 1 § 01 S ™ S ο (3cn 3 cn (ϋ ι rui ^ ^ 1 ^-S | * ^-Ν ^ < Η +J ή V γΗ --- ι-l ο ^0- >ι 0 >1 ο >1 0 >1 Ό >1 *0

Η ft ε ft Φ . ft Φ ft-H ft-H

φ οι ο ·η ο ·η ο ε ρ ε λ μ μ ρ ε . ρ ε ρ ο

G ft I ft G . 0*2 0*5 nS

E4 0 0 G . 0 G 0 G 0 «

GO G G β G S G

G ---1¾ -W G -H G -H -P . ·Η -P

G S'd S -P §S Sm1 § fi1

!> (3 ε GO GO GO GO

IG 10 I β · -p I -p

Oi cn β n>i. cn >1 . m >1 H — Ο — * — X - * .-¾.

0 10 10 I 0 10 ip.

> ,<3< -p f^p c^id i5id if jj

p VI ft νι Φ V «Ο V Φ > *P

o io i >i . i >i ι >i ' ><

> ιZAZA Z A 2 i Z A

cn

B

o cn cn m M B a o a = o . ϋ

Ε CN CN <N

o a a a II o o —· o = a aa a a a a a a o-o o-o — o-o ςρ LO *>0 ^ ^ « * σ> ο -π cn cn μ <n cn <n m $ 8203874 » · r -8- « l m

•H

p ·* i

(D CM

d id

I I Η I U

oo n 5 oo id id i i id i ω o-o o o p o ' i C G id 33 •r) Η 0 H «3

d d £ d (D -H

•Η Ή +J H d G G a) G H >h 0 0 rtJ >i 0 6 _

G d p X 3 Λ P

tj> ·Η U> 0 S' G H

1 6 I Λ I «j £ t-- 0 r~ -P r*' 0 0 ^ G — Ο) A <d

Id I — I -P 15 _ OM id CM >1 CM O 0 i rC j X i >1 JT F*

Ns. H So ΓΝ.Χ d M

H 0) r-r M H' 0 GO) sh >i >i d h ’Ti’d -P K -P >i +> >1 ΛΛ GO PA 3 n 0

Λ +J Λ I Λ P H G

OG 0 CM 00 GO

G Λ G'-' 3 Λ S ?

•HI Ή l *H l MM

g (Μ 2 cm 2^ 00· 0 1 (3 I 0 I Ή £ =

«ή HO HO HO -P. 2 H

>i G iN d >i ti Ο Ο H

H |3i Ή Οι H Oj H A 0 G

0 02 02 02 _ +> p A MG MG MG GGGi

G ft 3 ft 3 ft 3 . OHM

HOG OGOG >00 GG GG GG -0(¾

G H -P -H -P -H -P H W G

hj 2(¾ eft eo<: ,¾1 > GO GO GO 0 0 — 1 A I A I A H ·P P3 ip oo>i oo >i . 00>1 G 0 _ H '--X —’ X 2 15 33

0 10 10 10 MG

> Μ Λ* Μ Λ* Μ 0 -P > m S d S d Sd mo^ 0 I >i I >1 . I >i , Λ 2 > SH Ϊ3 A . S A . a> d

3! P P 0 G G

e d —

0 I

tn w o Η Μ I G 0 fH d >h W o -p =

I Ο ΙΛ dO

CM 00 CM P3 o

iU a iG CO -P ft H

u U V U 0 0 G

CM CM CM CM BO

id 33 id !d _ u d

u U U U G td H

0 P

&1 3 d GOO

hog* cm d 33 33 God

—^ O - ~ ·Η ·Η G

CQ S K Λ _ .

— u -Ο M 1¾ Cn 0 0

> P > ^ 0 -P

Ο M

H >0

Q ^ ^ •H

* * * lo co ··

CM CM CM -P

0 0 3 8203874 ’ -9- ' Η r-vo in ο νο r~ ο ®

ο ο 0\ *3* (V) 00 ΙΟ C0 ιΗ Γ>* LO

«. *, * * % *» ** cn η η η ο ο οο σ>σ> CN CN CN CN CN CN CN CN Η ιΗ ο

rH

• Ν tn η r~co nco pH r- co co >h Z (Ο (N r^VjQ CN iH r^LO CN O'! Λ ^ ** «. H »* οο <τισ> cncri oooo ® Is &

CN CN ιΗιΗ iHiH iHrH pH pH O

& 01

Z, H

0 a) >

CQ . W

>.£1! "3* ro in ooo r'· cn . co Φ H r» oo <TiO r-im cn rr *3* γ·» . > flj K ^ ** v *> ^ ^ ** ^ ** C p* ο p* 00 00 00 00 00 00 00 ¢0 o cn mr·' σ> ro p- o m h .

4JO <T> σ> CO CN Ό CO ® Η iHOO

£j *» *, *» N. *» % ^ .

Φ n*«3< 10 10 p· ρ» co σι o © .

gj coco γογο coco ro co *3* .

i-4 W >d fi Ό β VC fl C >2 β .

β Φ β CD β Φ β Φ . β Φ Φτί φ ϋ ΦΤ! Φ'Φ Φ ΰ

A! f! Λί β χ Ζ % % S

φ 0 ΦΟ Φ0 ΦΟ Φ Ο U > U > u > JH > . ^ ί> φφ φφ φφ φ φ φφ

CQ CQU PQCD ffl U CQO CQO

r·} Φ

rQ

as

Eh o oooo; CN CN CN cn cn

E EC EC E EC

φ CN CN CN CN CN

p) 'N ^ ^ pj ro co co ro ro g · * · · ·

ί-Ι H ι-i Η Η H

0 O O O O U

tw E E EC EC EC

H co co ro . co co ^ 4 · * · ·

3 ro CO co CO CO

U O O OOO

φ Ρ» Ρ» P- Γ>· P* Η Z Z z 2 2 Ο h ro uo <Ti

g CO CO co CO CO

X EC E E E

3> in ό p- ό

r-H rH pH i**H pH

o o o o o

CP

β •p) nd β •Η O _ JQ X I-H CN CO cn u Φ > 8203874 -10- 4 ί ν ‘ * [^co in (Ν ο η i" η f" m m ο cm /—ι Tf co co h c^-r-) cn h r'in « N V ». V »» ' «· <ncri HrH ο ο «Γιο <J\ σ\ coco H rH CN CM CN CN i—I (N Η H rH (H ·

H

H

•

N

H

a in o h co co co co cn cn co ,0

[>» ri< CN Ο CO CO OO

s s ·»>» ** ·* “· r. r. *. ^ Pu

i> p~. o', as co co coco I'-r·' C" ["~ O

rH rH rH rH HrH HH HH HH

σ' r-t

O

>

SH

(D

oo <j\ no r-'H eo h co cn on cn |> in r- <y>H cn μ in in co Γ" οί co oo Γ" co coco coco ooco coco

Ht<CN η h r-« ο σι n . ^ oi . n1 rsi co co co ^ σ> cn h m on on m PQ * * *, *» * ·» *> * *

HH CO CO CO m OO HH CN CN

H Hjt-si CO CO CO co *5r rf -¾1 ^ a)

A

td &h Ό C HJ β Ό G >0 G g fi . ^ g G 0 G (D GO) GO ti 0) . a) .

G (DO Q) <ϋ (D 'ΰ ΦΌ 0)¾ <D t5

id M G C MG M G M G M G

> (DO (DO (DO (DO (DO (DO

iH> U > U > U > U > H >

tji (D (D (D(D CD (D (D CD <D (D . <D (D

i—i PQO ffl ο ffl CO E CD ffl CD E O

0 >

SH

(D

> o o o o o o

CN CN CN CN CN CN

E X E e E κ

CN CN CN CN CN CN

\ S. \ N N

CO CO CO co CO CO

• · · · * · Η Η Η Η H . H .

U U U U CJ U

X Hi X X E X .

co CO CO CO CO co • « · · · · n co co co co co

O O O O O O

S S X S X X

h co Γ*» <r< h co

>5ti co CO CO HP

® E Hi E X E

<T\ in oo σ^ o

Η Η Η Η H CN

o u u o o u

Ο H

CO [" CO O' Η H

8203874 ’ '· -11-

<N

ι-Η •

N

C- ,Η ·3< ro ro 00 CN CN 00l> Λ ffl H

cvj ,—ι η -¾. in oo >—i ro o co vo Λ «. «. -- - - -- - * " “· m 01 oooo co oo Γ- C" oo σ\ <Ti ft

pH r-i ft ft r—i r—« ft ft CN CN ,-1.-1 O

CQ

ft (¾ vo σι o co vo ft t" co w in σννο Λ r-vn σι r- cn ro σι r- r-o <ncn as w». » - -- -- - " +1 vovo r- r~~ i/i i/i co σι coco

Η H ft ft ft ft ft ft r-t r-i 1H1H C

(0 > U> ft 0 CO If) VO ^ "ϊ Ol O' O CNCN ClCN k* in r>* co o ro co o cn σιο σ cn w ., ., - - -- -- - Φ oooo oo σι oooo oo co r- oo oooo > rj. co h cor- o' co cn o o· co ro o* o' vo fto σι ο h ft com ·»«. ** K ·*»* 'ι*** * *· ^ ^ r-iM co co oo or- σι σ> oo rp o’ o< o' ο* ο· ro co o' o' m ft ft β ndfl Ό S τ3 β TJ β πΰ β Φ β φ β Φ βΦ βφ βΦ £ Φ ,Ο φηφ ΦΌ Φ Τ3 Φ ^ 0) 'ΰ Φ <rt β ρ^β X β ρ4 β —4β —^ £3 Ρη ΦΟ ΦΟ Φ0 ΦΟ ΦΟ Φ 0 ^ μι > Μ > !-ΐ> Μ> ^ ^ > β φ φ φφ ΦΦ ΦΦ ΦΦ 5}¾ φ mo mo mo mo mo mo >

CP

ft

O

> Φ > o o o o o o

CN CN CN CN CN CN

κ m m κ w m

CN CN CN CN CN CN

N N N N N N

ro ro ro co ro ro .····· ft ft i—I ft ft

η Ο Ο ο ο O

S3 S S B « « co ro ro ro co ro ,,··· ro co "=/* ro ro ro

O O O O O O

[-» r- t— p- r— r— z z z z z z rHioftcovnr-O' O' O' O' ro ro JU m m S3 33 S3 σι ft σι ft r- 00 rH CN —I CN ft ft o u u o u u cn ro o* lo ό p- ft ft ft ft ft ft 8203874 • ' -12- o in η oh n co o in min m cn co Γ' cn ^ p* in cn h Γ" m ΟΊ Οϊ ΟΊΟΊ σ> Ο 00 CO 0Ί CXl coco

I—I Η HH H CN HH HH HH

m

H

•

N

H

mm οϊη ο n1 com o 01 or" Λ oo σι cN h r" co mm t"'# cn h * ·» ·. « *· * »1». « « **» ft t"C" COCO Γ" C" Γ" I" C" Γ" Γ" Γ" 0

HH HH HH HH HH HH

&» r—t 0 > 0) in [" σι ιο cn in ^ ο σ\θ a* in > cn ο o co ho mio h m mi" *. «* ·*** «*,*»» ** *S *» ** *“ ** COCO 00 Γ" CO co coco COOO 0000 σι ιο σι mt" coh mm oom <3< rr o ot" h n* oo h cn «»1» ·* «I. % K **. ·* *» ·>*· hh mo σι co oo <s\ cn oo -3«^ ·>ν* mm n* n* mm n'n*

PQ O

Ν' iH

a) τ3α -d β 'ϋ G Td G ^ c d G

Λ GO) G (U GO) GO) GO) CCD

rd (Dt) 0 d oj ϋ 0 d 0)¾ ru'd P MG MG MG MG MG Λ! G .

(DO 0 0 (DO 00 0)0 00 G U > U > U > P > U > U > 0 00 00 0 0 00 00 00 > fQU ¢3 0 PQ 0 PQ 0 PQ 0 PQ 0

H

0 >

G

0 > o o o o o o

CN CN CN CN CN CN

a a a a a w

CN CN CN CN CN CN

\ \ \ N \ \ m m m m m m ······

Η H r-t Η Η H

0 O 0 0 0 0 a a a a a a m m m m m m «!«··* m m

O O O O O O

Γ— c~~ c— c— c— r-" z a z a a s cn Γ" σι Η σι h m m m m ^ a a a a a a σ\ oo co cn co cn

Η Η Η Η Η H

0 0 0 0 0 0 oo σι ο h cn m

Η H CN CN CN CN

8203874 -13- rp Ttf ιΗ O 00 ''tf CO > N H 00 «3 K «. W ». * * Γ'. Γ" 00 00 vo Ό iH pH H r-H H i-t II) H ffl N Ό £Ti •a· n f- h* ld ro *. «. *> * *» *·* \D <D KO KO ΙΠ IT)

ιΗ ιΗ .Η ιΗ H iH

(N O rt W "fl1 CO

VO ΟΊ rH CM 00 σ\ ^ w ^ > oo oo oo oo r» r·* .

CN Γ" CO LD LD

ro co o ih . r" r- ^ H *t ·» ** cn cn σν σι ld m ^ ^a* <o ro . "«r 'i* m -d β : ό β : ^ 5 : r-i g a) c: <u β J .

Qj 0) Π3 ¢) Φ Ό 4 M G M G MG.

13 <u o φ o φ o 4-i U > '. u > . M > φ δ) φ φ φ φ g mo: mo. mo.

ί> εή Η ο >

U

φ ^ ο ο ο CN CN <Ν m m β

CN CN CN

\ \ Ν CO <Ό CO .

• · · Η Η Η ο υ ο m m m co ro γο • · * «ςτ IT) 'tf ο ο ο γ- r-~ γ-~ 3 2 Ζ ιη η η Η4 m m m Η (Τι "Φ

CN Η CN

υ ο Ο η* ιη νο

CN CN CN

8203874 » + , ' . -14- w £ Ϊ '"cm N > Π H r~ U Λ ~ Oa ^ - o 0 _ m 04 04 ' 5

X X ™ H

04 04 o - a ®- - £

I 04 a - a ~ a ™» SJ

jj U ~ in — in U ~ M —» — ' ' ' ^ , πι m in oi m oi 04 r- q. m o in I in I in m f m S * O' o*· M «· ..in 'in 'in T10· (¾ flj ' 04 04 04 04 ss ^ j;

fto^in^in^tn— in Cw X *r X m X ίο X

Ο X04 X 04 X 04 X 04 k

+J 04 H 04 H 04 K 04 H

o HU a U a U a U

U US US US u 5 (¾ — — "" rr'TO'TO-'Τθ''Τ r *. ·». S'» * ** ** " oin οι m o4 oi om m •I I 1 I' I l «3<cn σι σι to 040 > - ' ' Η 04 (-H 04 1—I 04 f-104

U

I—I

aj Λ Γ m r

&H

»* ·» s %.

ο o m 0 0 0 10 O' 10 ID 03 >X) 'το ^ -το τ H r4 i—4 r4 rl —4 S ** ' % H ·, 5 in in 00 00 m 0 'Π I oi <—* onoi no) 04 on

Jr inHinoinHino

, r-4 r—4 r-4 (—4 r—I ι—I r-4 i—I

H

0·Η » * ' ' * * * « ~ in ο ο ο o m mo OS iniO VO CO l£? »s0 LO 04

10 Z. ID H lOO in r—4 iflH

Γφ r—4 r4 r-4r-4 ι—I ι—I H r4 OS „ U u too oo O o oo

Si! lino m οι in τ mio un 1 o 04 σι H cno4 σι Η μ_]0 04 —! 04 1—4 04 ι—( 04 ι—4 C α,

u (J] Ν " ** ^ ** ** SV

ο m οσ ο ο ο ο 04 10 Ο θ' Γ' Γ' ΟΟ mm τ Η - οι m -f m m r-ι mr-4 mi—ι mi-4 cn c

•H

T3

C

*H ·

U S ^ 04 m 'T

<a > 8203874 (·, * -15- f

VO

r-H

•

N

b § I'll w ^ 0 O O S Vn cn (Μ «Ν tN &> - - - - - - - " ^ — ' in — in — Lf> ^ in p ™ Γ? fsj CM CM K*

^ ^ CM r-* CM «-* CM 3) I

53 *7 „r,:nmKr''>33f0> s S I s -«8 HS a g as

— μ nKO Ο Ο O

^ H ^ 8 ΰ ~ ^ w ^ w ^ 7^. N O ~ CO cm CO cm t~- « I' AS is. S i " i "- i "* «« 5“ «" «" . - «. - * ^ ^ ^ ^ *. ,—*. H —> 'Γη _«ίη tn --* m --»in

T'^^w^TwinttvoXi-'X

K" y* *«* Η H

u Hg u I 5 I 5 5 H 5 H5 jj ° <τ o «· O -* o o <r 2 ? 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 e S J, A A id, «r ο «ο, N «η

g H Cs” ^ CM -« ΓΜ - CM ^ CM

O’

H

0 > u <ΰ >

K » ** * ** S

ο ο ο ο o in o io vo vo . vo vo mo >ςρ Tp rp rp τΡ ·ςρ o H H 1Η Η M r—f 1—4 ** ** ^ ^ *“ % *» oo o oo oo oo oo CM CO CM CM cn CM σι CM O cmvo in o in o ino mo mn Η Η Ή rt Η η ri Mr-1 Hr-1 *,». ^ " - * > *· * - - mo mo oo oo oo oo m cm moo mvo mvo mvo mo

VOH VOO VO H VO H VDH VOH

Η Η HH HH Η H m H HH

^ k. k* K ···«► ·*» ^ *·*- ** ·.

mo mm oo oo oo mo cmvo cm h mo μ1 o mo cm m

<3\H OH OH θ'-e OH OCM

CM H CM H CM H CM H CM H (V) H

*, k» H ^ ^ S % ^ «» oo om oo om oo om m m Γ- m ovo cm m cmvo om mm mn ·μ* m 'i* m m ^ m mn mn mn mn mn mn o m vo r- °o 01 ^ 8203874 • -.- ' -16- a κ 2 a Η υ to *— ^ . .. - rd ™ ^ .. m - m n in in in — s ^ s X, X « ^ 3 ". Λ ·.

’Im' b a <N CM CM v & 1 S’rL . π - u ax a - o u a ^ z —^ «—-μ — a tp i: i~ ^ »J § 7 s S 7 - - 7 - 7 ? 7 s g ό * ό a a o - o ' > -m o - U o - U * <n ' ^ - CM ~ - 04 — 04 οι 04 04 ~ ' - I ' ™ Λ ~ ~ £ - in £ Ώ t - £ - id X ωχ 3 *" - 1m1" " 1m- 1m bN *«»" g g ;g ; ~-5 ~ S z S s - £ β"- b” af “ aT “ “ “ “

o * 5 in o 2 in U O * ο ·» O

Γ, 'pi pi . W CM cm cm ro cm ro ^ il /η I i^i CM I ιΗ II 1104

Η N (P CM O ID O ID N © Ol^ fO

j§ CM η N ro ο OI rn h is ^ ‘N ^ <ti t* d (d > O’

H

0

M - ** _T

0) o i © in m ° » > id id m m m «? . -sf ^ ^ cn

Η Η Ή Ή ^VO

.. “ - " ' o© o o oo O -

2 © Ol CM CMlD NO

100 ^ “2 2 2 HH r—I -Η ino in m- mo mo mo in id m co m co mn m cm

UJrH OO DO D H DO

H rd 1-11-1 H rd „ - - - V -- - ' oo oo m m om om COD CM m co .ID coo

Old DH md o-H OTO

C\j rd CM r-d CM ι-d CM rd CM rd -- - - -- - - - * oo oo' oo om oo oo o © oo vo » m ^d TTCO <3< 00 coco COCO CO rt ΠΗ n ^ CO r-d CO -H CO^ 2 ; : s 8203874 r -17-

«""N

a o '•W’ o o ' a a CO U U 00 - “ , ^ ^3 in in in in - <n “ « ΐ,ϊ xn£ *«» >s :- : 3.

: *« §h sh s~ ." -: § ~ 3 ~ £ ~ S ' g g g g 51

^ v <3** ^ ** r^VD U U Si -w Q

7. 7 . 7 - 7 - co o mo £ ό ~ 0 ~ 0 ~ ' 0 a m - ^ ; g I— -a -a - u *· ^ *> CN O <NU « U ™ ~ ™ ™ ..

„ W - - O - — - —- _ _, ,-.01 — Ν' —· o -'in — m

it* r^o COO VO * coX

'S ° V 2. . " 7. X λ X ηι X CM

^CN cO CN CO CN ΙΟ η» ^ g S* m

NiH >7* SI ^ rC Ο £Π O

u - u χ s: s ^ O a u a in 0 m5 mu m U m <* ^ 7 « 7 « 7 ο ^ m 7-.77 77 ,.( i S 4* io n « 7. 7. 7 7 J-j 3 in H in ή in h m r-tcs m cn to

C

(ti > O'

r—I

0 - % ' > ο ο ο o m ο o ft VO io m co m o u 0)^, <* mo 2 2 2

> H r-J Η H H l-i l—I

s * - ' *· o oo o tn o tn o CN n CO VOH ,7m irt ^ in m o m —< 2 S 3 7

H H H --1-1 H H

^ ^ * * ·* O o' in O in mm o m mm S in m cn m r-' m c- 5 Sh cocm 2 3 23 33

. H r—( i—I OJ H -l-1 -iH HH

o' in in θ' σ' O m m ο ο o m dio ^ιο 33 33 33 O Cl —I on OH oh oh

CN (N Η ΟΙ H CN H CN H IN H

^ ·»». % ^ ·»% % « om oo oo 23 oo om mm ο vo o vo 23 33 23 mm tt n n· n· !? g ^h n^h m η η Η η h mn hh oh

« 5 2 2 S S

8203874 * -18- . ν - - ' - - S ' ' _ _ Λ Μ CM CJ --- CM Β <Μ EC NS ™w -Γ1· Ν' Κ U ECU EC U ® ® ® υ - υ - υ ~ Ο g s Η μ< Μ< ή - mo ια ιο ο ιο w 'f 2 ΓΪ ^ H - Ο - ^ v m< » m - cn - ' ' CM CM CM CM —. CM "«

.. x -. CM

«· —* ** ' *· '—- - X - — —x in in -~· cm -—* m· CM EC ID X r- X N ® ™ ® ·

EC U X S* * ™ * Η η H

rj — CM EC CM EC U w U —' x- ECU ECU w rH u S US O O - m2 H 5 _ — n is 2ί ° ni°

„ EC —* H - r-l'S

χ m orrU o mv EC - co ' ^ r2 jM x x w - V U CM CM u * i-^m —i m — - - ^ χ ^ lim II * *T *" Γη m <» c\ <f in m r-i --2 2 ,-% v x x x x x tj* in x in x m XCN CM in Η N ‘ X CM X CM - CM EC 1/1 „Ν ” CM EC r- >r* r) s *» κ %»· κ U Kw S Z -..-- us u s -

ϋ C „ m m cm m cm — w ^ C "" w CT

m EG EC EC EC EC EC M "

m m· U UUU UUU o^U cn^U

s—+ Xx_** W W **—' «. <. **—1* ** *- 2 m -I cn * m

r λ iitn m co CM (N η h I I m* IIO

U 4- ck m m μ· o mM-o n· m ί* _4 χ χ X - - - " ' - dj Η M in r-l CM ·>!Τ OCM-T rHCNin rM CM . in Λ (0

EM

c nj > >-n 1/1 ^ m o - o '1X5 £ a E S 2 a 3 σ o vo 2 <* 2 ^ TJ*0 2 H r-lr-

H H N

-- OO OO cm OO

O O Μ<Ν in cm CM

CMO £ S rH 22

in o , ~4 r-liH HH

-- min mo ιηιο min

•CIO SS 1003 COO

cnio 22 h2 22

IQH _| J HH ,—I ·—I

Η Ή H H

-- in a in in ° ° o° S2 ^2 «η £2 m2 22 22 CM r-l * % - - - ' ' in in - ' -- oo 22 p- io 2 2 00 m io 22 22 cnio Js on nrH mm mm £)2 nr_l'

m r-H

S S S S S

8203874 -19- ©

CN

•

N

r-f

A

*-v »—* ·—i <—* <—> <—* ' ^ ^ _ ooo ooo OOO OOO ft CM CM CM CM CM CM CM CM CN 04 CM 04 0 EBB. BSE EBB EBB.

m ^ fc·,· "***-**. 1 1 •H Hr-IH Hi-tH. HHH ΓίΓίΤΐ 9 ;+j ^oo. ooo. ooo. ooo > m W W W: ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ φ 0 > u

CD

X cn .

(U CM Q

•H . o 0

CD

ft co ooo ooo ooo ooo σ m* in onm cm o cm η σ» n v*·*,; * * ^ *»·*··* ' . ^ * *» ο ο σν η O' lo o in μ* © cm co cn cm: i cm cm i cm cm: + cm cm I +: I + 1+. 1+.

l

Q

CD

A

cd iH

Eh <h <D ' ^ ^ ^ ^ +} +i i + ^ +i i + +i i + +j _+

CQ

0 ft n

HI

CD

•H · .—' —· '

4J CO CO CO

•H ~ w — cn o (¾ cn d

•H

Ό d -HO cm to n* !3 σi cm cm cm M CD > 8203874 ‘ . . -20- 0 Ο Ο ο ο ο (Ν Ν Ν (Ν (Ν Μ η X S3 κ w κ Η W ^ W % 1—i i—! r—1 r—ί I—ί ι—! υ υ υ υ υ υ 0 0 0 0 0 0 Η Ι" 00 ιΗ η ο ν'*** ^ ^ Ο Ν co m η τι< η 1 r-) ιΗ I Ν !Ν Η I + I + Φ X! Φ

Ei a rd > r-i 0 > 5-( Φ > +17+1 7i 7 7 W ·>—✓

N »«—N

cn (Λ m >£1 CM in 8203874 -21- .

σ'! Ο η CN [*" νο 00 ο S»'·*··*'**· ^ Γ~~ *>0 Li*) L0 'β1 σι σι σ σ σ σ as ^

CM

• Ν ι-ί Λ LD Ο LD Ο SO r-i & (3^ »*.»*»*· Ο *· ο 00 Γ~* σ Γ· Ο Γ' c\ as as σ as η σ & γΊ ο >

U

Φ > 00 ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ιΗ ιΗ (Η Ή ιΗ r-l Η Γ-* ο · ο ο ο ο I ι I ο ο ο ' Η ιΗ ιΗ dp φ: •Η

jJ

rj VO Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Φ ' Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο ,Η <Η Η Η Η >Η Η Φ Μ 13 *Φ IT) Ο 5 9 2 Λ ο I ι I ο ο ο Π3 <Η Η Γ-Ι Η ε* 5JI ο Ο ο Ο Ο Ο ο ο ο ο ο ο ο ο Γ-Ι ιΗ Η Η Η γΗ ή CO ιΗ Ό Γ0 ·* » ** ** σι ο ο ι-ι ιι ι οο σι σ σ η ττ οο m Γ" γ- οο f\J - - - " - * as cm ιη ό σ σ νο Γ-» Γ- Γ~· Ε Γ" .

ίΰ / cu / / «·*·»* / . I + /ι Ο w w / -Η^σ m η* in cm ** / ^ Q1 rH <-Ι Ή ™ / μ a / φ -Η / > ti 5203874 -22- m m ·. η in -sr i σι σ r*· σ r~ m ο σ σ

ο Ο fH

ο ο -

rH ιΗ VO

<& W 1£> ο ο *·

Φ Ο Ο CN

'Η γ-Ί rH ιΗ -μ ΰ α)

-U

Φ μ m ο ο - W ο ο wj - .

(—I r-! Φ 3 * ΰ ο ο *· Π3 Ο Ο <Ν > ιΗ r—I C0 CT» Η Ο > μ οο (U ο ο *> > ο ο ι> .

ι—! ιΗ 00 Ο *· 1 1 00 00 σ ηι r-i * *. >» οο r· ' co m r* οο £ a rri |·Φ μ tn μ <u ft in vo w m m /—* i 8203874 · . " ' -23- (2) Biologische eigenschappen.

Alle verbindingen volgens de uitvinding bezitten een duidelijke carcinostatische werkzaamheid en vertonen een sterk groei-belemmerend effect op kankercellen in vitro 5 en een levensverlengend effect op muizen die geinplanteerde kankercellen dragen zoals hieronder is weergegeven.

I. Groeibelemmerende werkzaamheid tegen kankercellen in vitro.

DBA/2 muizen werden geinplanteerd met elk 10^ 10 muis leukemie L-1210 cellen. De aseptisch verzamelde asciten van de muizen na 4 dagen voeding werden drie maal gewassen met fysiologisch zouthoudend water ter verkrijging van L-1210 cellen, die daarna werden gesuspendeerd in RPMI 1640 kweekmedium. /G.E. Moore, Journal of the American 15 Medical Association, Vol. 199, 519 (1967); H.J. Morton,

In Vitro, Vol.6, 89 (1970)J waaraan 10% fetaal kalfserum en 5 uM 2-mercaptoethanol was toegevoegd, en de ontstane 4 suspensie werd verdund tot 5 x 10 L-1210 cellen per 0,9 ml.

Een microschaal waarop aanwezig was 0,9 ml van de celsus-20 pensie en 0,1 ml van het kweekmedium dat het te onderzoe-ken monster bevatte, werd in een kooldioxyde-incubator bij 37°C gehouden. Na 48 uur kweken werd het aantal cellen ge-meten door middel van een coulter-teller (Coulter Electronics, Inc. U.S.A.) ter verkrijging van de groeibelemmering 25 (%) = (1-T/C) x 100 - {1 - (aantal gegroeide cellen in het monster-bevattende medium)/(aantal gegroeide cellen in vergelijkingsmedium)/ x 100. De 50% groeibelemmeringscon-centratie werd berekend uit de waarde van groeibelemmering bij uiteenlopende monsterconcentraties.

30 De resultaten van onderzoeken aan typerende verbindingen volgens de uitvinding voor de groeibelemmering van L-1210 cellen waren zoals is weergegeven in tabel F.

Tabel F op biz.24 35 8203874 *·· -24- Η g I \

m tn tn o S g •H S

<D 0) g Ή ^ g+j ^or^i-f o in cm Φ cd - »** *>** · HM cm in m oo co co h n φ +J iH t-i A S . Λ 0 · _ dP 0 ft o S 0 in 0 w.

η σ’ r-i 0 >

CO U

o " - <D

r-i V£> | I | I M3 I . I > g '-I σι \ &> ϋ ^ co in * o «» *

Cn co i σ> i i oo i . I .

fi : : r- . « .

•H

d os ο ·Η co r- ο m m ' Λ o - *.

μ l οί i oo co i σ> χ ' Φ r> t~- co σ .

> ' ο' <d \ 4J Cο . Γ- L0 CM. in σι.

-·* * * *. ·* ι ο ο ο γ~ co ιη γ> σι r-i ' 0'cm'o oo r-~ in tn. σι — CM ' Η s. ; .

5¾ ** d —·. Τ5 η ο\ο s φ '-' Ο LO «3 ·9· ο m oo ,0 o' - **>*· ** *.·-.

πϊ cn ss r—ι r-4 σι rH co ο ο. σι Εη g ; φ ; ο. co. oo. cn -31 . in σι

•Η t> rH

S .

<D CD

g -η m σ cm σι ή in m .

g ' +j in - » *· --. *· *· * Φ π3 σ» co -rf m σι in oo m S-Γ co -3* co cm cm -31 σ

Φ -P

Λ ' S ' η φ cm m r- m σ m r- Φ u in .- - *· ** - o- - OS % cm o co t> -φ -». o U 0 cm in m m cm cm -m· co a o: in co ο o . r- ' CM co *· *· *· ** S. ' O O 1 00 00 mi σι cm . cm m m O’

S

ri s rM 0

Jq Z m m cm m in co s d) > 8203874 -25-

VO

i—i CM

k ·

CO CN O'! Ο Ή O' CM CO P- ο N

cm i-ι oo i-η cm i-ι in h - p- H

& 0 i-i 0 > u CM O ^ 2! co vo σ> I l . I I I 1 1 oo σι γ- γο σι ^ σι ΐο vo k k ' - - ' ** - CO O CM [— 00 | 00 l I 1.

VO <T\ VO Ρ- Ρ- ΙΟ.

οο [X4 LO f—I 00 . Ό ' to I to ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ .

Η CO 00 CM r-i 00 CM CM Ο. ! CM

aj m r- to ρ* in . ρ- •μ* o to A * (d t-i pj co eo in -¾1 oo ' ρ- σι ; p- . oo p* .

nj ' ». % - - -. -..- * *v l> vo cm vo σι p- . tn σ\ . p- vo co.

^ vo oo to Ί1 . vo. cm. σι to co cn i-l 0 > 0 ,η σι to cm . cm vo .to in to.

k.· k k k k k k k k k oo in' oo cm co oo -a* . ^ cm vo oo ^ cm' in. oo. oo cm σι oo ή cm in σι o r-ι ’ o' oo . ο ή oo k k' k ‘ - k k k k k k co in σι in h cm ih ή oo ro oo ; l-ι oo; 00 CM CM P- 00 1-1 in oo o vo in * *

I I I | ιΗ Ή 1 σι CM

CM . CM CO CM

o 1-1 Ή *» *** **

1 |l I IP-IP- I CM

i—I CM

COcyiOiH CMOO'tfVO VO P- iH ι-i i-l i-l r—I Ή ιΗ Ή 8203874 1‘ · ’ · -26- ps oo cm so cn cn >, < V Κ V.

o U3 p- CO H CN . CN O CN

os cn .η .

i i i : I· i . i 1-: i i co h us ^ ^ *

ro i q* ι ΐ . l : \ I

^: os . CP» .

PS "q·: Ο PS ; q· : CN [S. PS

' * » .:¾ * »* cn:' us |: q* oo so : . q1 . P* .

PS : ' oO co OS OS os Is· . OS

ph ;: : .

h : : :. / - . .

:<D · .

Xi tn. so r> so os H O us so .

(β* . *·: ?· > :¾ ·* > s "· > £h OS us' US iH so. SO US PS so.

CN ' p* us os os os so OS

:G ' ..

.(¾ .

·> . : .

:&s ’ .

H os : q> r> . us. us o us O. CN

0 ·* *» >» - ^ ^ ** ;> © u>: O Is·, q* CO OS CN o

CN US' PS CO OS OS CO q1. OS

Φ . .

> r* q< os Is·. so us so ο o »,’* *» ^ ** ·>» ** W v

US SO CO OS CN US US o OS

fH : q*: cn' CN CO CO P- CN .

cn: iH : us CO US PS O CN.

I cn o r-i o <30 r^- os q ps : cn: cn so us q* . us os: cn so:

S N V

i © p·* q* ι ι ι ι I

CN . p-l . r-t

00 OS O iH CN PS q* US SO

rH HCNCNCNCNCNCNCN

8203874 '» ψ . ‘ . -27- II. Therapeutisch effect op geinplanteerde kanker bij muizen.

Mannetjes-muizen van de BDF -stam (5 weken *· 5 oud) werden elk intraperitoneaal geinoculeerd met 10 5 muis leukemie L-210 cellen en δ§η maal per dag intraperito-neaal toegediend met een testverbinding die was opgelost in fysiologisch zouthoudend water "gedurende 6 achtereen- v volgende dagen te beginnen vanaf de dag van inoculatie. Terwijl zij werden opgefokt, werden de muizen 30 dagen.

10 lang geobserveerd ter vaststelling van de verlenging van de overlevingsperiode = 100 x T/C = 100 x (gemiddelde overlevingsdageh van behandelde groep)/(gemiddelde over-levingsdagen van vergelijkingsgroep). Het therapeutisch effect van typerende verbindingen van deze uitvinding op 15 muisleukemie L 2110 was als is weergegeven in tabel G.

Tabel G

20 Verbin- Dosering Verlenging van Aantal muizen dat ding (mg/kg/dag) overlevings- in leven bleef gedu-

No. periode (%), rende 30 dagen T/C x 100 25 : : “ ' —— - 50 0 0/4 25 336 0/4 12,5 >357 2/4 6.25 >369 1/4 4 3,13 >364 2/4.

1.56 >429 4/4 0,78 >429 4/4 -30 0,39 >390 3/4 0,20 197 0/4 50 0 0/4 25 306 0/4 5 12,5 131 0/4 6.25 125 0/4 35 3,13 118 0/4 1.56 104 0/4 —j - I : ^ 40 820 3 8 74 - * • · -28-

Vervolg van Tabel G

50 0 0/4 25 0 0/4 12 5 >429 4/4 5^25 >429 4/4 1 6 3!13 >386 2/4 1.56 >393 3/4 0,78 >429 4/4 0^39 >383 2/4 0,20 >354 2/4__ ' 50 0 0/4 25 0 0/4 12.5 >429 4/4 6\ 25 >429 4/4 9 3^13 >429 4/4 (i)· 3;56 >411 1/4 0,78 >300 2/4 0,39 171 0/4 0,20 114 0/4__ “ 25 ” 0 0/4 12.5 >390 2/4 6.25 >336 1/4 9 3.13 >411 3/4 (1) 1,56 >356 2/4 ( 0 78 >370 2/4 0,39 >342 2/4 0,20 127 0/4 0,10 HO 0/4_ 50 0 0/4 25 0 0/4 12.5 129 · 0/4 10 6 25 107 0/4 3,13 100 0/4 1.56 100_ 0/4__ 50 0 0/4 25 - 0 0/4 12.5 >357 2/4 6.25 >393 3/4 U 3,13 '357 2/4 1.56 200 0/4 0,78 200 0/4 0,39 143 0/4 0,20 107 0/4_ 8203874 ' · ¥ -29-

Vervolg van Tabel G

50 0 0/4 25 236 0/4 12.5 >354 2/4 16 6,25 >350 2/4 3.13 >343 2/4 1.56 233 o]n 129 0/4_ 12.5 0 0/4 6.25 >350 2/4 3 13 >429 4/4 18 156 >429 3/4 0 78 200 0/4 ' o,39 157 ' 0/4 0,20 136 0/4 0,10 129__0/4_ 25 0 0/4 12.5 >364 2/4 6.25 >429 3/4 3.13 >321 2/4 19 1,56 >350 2/4 19 0 78 164 0/4 0,39 107 0/4 0,20 100 _°/4 50 0 0/4 25 229 0/4 12.5 200 0/4 625 164 0/4 21 3.13 129 0/4 1 56 114 0/4 0,78 100 0/4 0 39 100 0/4 0,20 100_ Ο/4_ 50 7 0/8 22 25 >414 6/8 (S) 12,5 >380 5/8 U) 6,25 >332 4/8 3.13 163 0/8 1.56 117 0/8 25 >423 5/5 22 12f5 >408 4/5 (S) 6 25 >400 I 4/5 (-) 3f13 >290 | 1/5 1.56 177 i 0/5_ ___ * — — 1 1 1 1...... 1 "" --! ; i 8203874 ·. **. ’ -30- '

Vervolg van Tabel G

25 200 0/4 5 12,5 129 0/4 23 6,25 119 0/4 3,13 104 0/4 50 >429 4/4 25 229 0/4 25 12,5 193 0/4 6,25 107 0/4 10 _ ? .....J____ III. Toxiciteit.

15 Alle verbindingen volgens de uitvinding ver- tonen een vergelijkenderwijs lage toxiciteit en worden ge-kenmerkt door de lage opeenhoping van toxiciteit bij voort-gezette toediening. In tabel H zijn weergegeven de mediane lethale dosis (LD^q) van typerende verbindingen volgens de 20 uitvinding bij muizen bij enkelvoudige intraperitoneale toe-di'ening, en voorts maximaal verd'ragen dosis in termen van totale dosis wanneer een vastgestelde hoeveelheid per eenheid lichaamsgewicht intraperitoneaal werd toegediend aan muizen een maal per dag gedurende 6 achtereenvolgende 25 dagen.

30

Tabel H op biz.31 35 8203874 , t ¥ \ ‘ . -31-

Tabel H

Verb in- LD^qJIe Maximum verdra- xk ite ding No. (mg/kg) gen dosis (mg/kg) 1 50 < 300< .... " "' ~ 1 ' ' 'n T“" " ' i 2 50 < 300 < 3 50 < 300< 4~ 2 5 - 50 ” 150< 5 25-50 150< 6 12;5 - 25 75< 8 25 - 50 150 < -- — - ----- 1 - .....-..........—---- 9 12,5 - 25 75< 10 12,5 - 25 75< 11 12,5 - 25 75 < 12 12,5 - 25 75< 14 25 - 50 150 < 15 12,5 - 25 75 < 16 25 - 50 150< 17 12,5 - 25 75< 18 6,25 - 12.5 37,5< 19 12,5 - 25 75^ 20 50 < 300< 21 25 - 50 150< 22 25 - 50 150 < 23 25 < 150 < 8203874

* , V

·' . -32- 24 50< 300< 5 _______ 25 50< 300< 26 12.5 - 25 75< 10 Noot: * Mediane lethale dosis bij enkelvoudige toedie- ning.

Maximum waarde van de totale dosis die niet de dood veroorzaakt wanneer een vastgestelde hoeveel-heid per eenheid lichaamsgewieht wordt toegediend 15 aan muizen, een maal per dag gedurende 6 achter- eenvolgende dagen.

20 Zoals uit-de voorafgaande beschrijving duidelijk is zijn de verbindingen volgens de uitvinding die zijn weer-gegeven met de formule 1 van het formuleblad bruikbaar als carcinostatische stoffen. Alle afzonderlijke verbindingen die in het voorafgaande zijn opgesomd vertonen een uitste-25 kende groei-belemmerende werkzaamheid tegen muisleukemie L1210 cellen. Van deze verbindingen hebben in het bijzonder die verbindingen de zeer hoge werkzaamheid, waarin R is een waterstofatoom, een alkylgroep van 1 tot en met 4 kool-Stofatomen die een hydroxylgroep als substituent kan hebben, 30 of een benzylgroep, en n een geheel getal is van 1 tot en met 6, met dienverstande dat, wanneer Y is een groep met formule lj van het formuleblad, R de groepen voorstelt anders dan het waterstofatoom. Voorts bleek een uitstekend thera-peutisch effect bij de muizen die geinplanteerde kanker 35 hadden, op te treden tengevolge van die verbindingen waarin R is een waterstofatoom of een alkylgroep van 1 of 2, bij voorkeur 1 koolstofatoom, die een aantal hydroxylgroepen als substituenten kan hebben, en n is 4 of 6. Van deze verbindingen zijn die, waarin R een methylgroep (een alkyl-40 groep van 1 koolstofatoom) is, uitstekend, ook voorwat be- 8203874 > Λ ' ' ‘ -33- treft chemische stabiliteit, waarbij de verbindingen Nos.

9, 19 en 22 het wenselijkst zijn.

De werkwijze voor de synthese van de verbindingen volgens de uitvinding is hieronder beschreven.

5 Hoewel uitvoering kan plaatsvinden in organische oplosmiddelen, wordt de condensatie van een w-guanidino-vetzuuramide van de formule 2 van het formuleblad en een - dihydroxyethaanamide van de formule 3 van het formuleblad volgens de uitvinding in het algemeen uitgevoerd in de 10 aanwezigheid van kleine hoeveelheden water, vanwege de op-losbaarheid van beide verbindingen die in het algemeen worden behandeld in de vorm van zure additiezouten.

Wanneer organische oplosmiddelen moeten worden gebruikt zijn aceton en dimethylformamide geschikt, maar 15 de condensatie wordt in het algemeen uitgevoerd in de aanwezigheid van kleine hoeveelheden water zonder gebruik te maken van organische oplosmiddelen. De hoeveelheid te gebruiken water dient zo min mogelijk te zijn voor het oplossen van beide verbindingen. In de praktijk wordt het 20 gebruikt in een hoeveelheid in het traject van 2 tot 60, bij voorkeur van 4 tot 40 molen per molguanidinovetzuur-amide van de formule 2 van het formuleblad. Omdat deze verbindingen van formules 2 en 3 van het formuleblad ge-woonlijk worden gebruikt in de vorm van zure additiezouten, 25 is het niet noodzakelijk een zuur in de oplossing voor de reactie toe te voegen. Met het oog op de opbrengst aan condensaat heeft het echter de voorkeur een zure katalysa-tor te gebruiken. Geschikte zure katalysatoren sluiten in anorganische zuren zoals zoutzuur, zwavelzuur, fosforzuur, 30 en boorzuur en organische zuren zoals azijnzuur, citroen-zuur, wijnsteenzuur, barnsteenzuur, glutaarzuur en adipine-zuur. Een dicarbonzuur zoals glutaarzuur heeft de voorkeur.

De hoeveelheid van een te gebruiken zuur bedraagt 0 tot 10, bij voorkeur 0,5 tot 4 molen/mol guanidinovetzuur-35 amide van formule 2 van het formuleblad. De reactietempera-tuur is 0° tot 100°C, gewoonlijk van kamertemperatuur tot 80°C, bij voorkeur 40° tot 70°C. De reactietijd loopt uit-een met de reactietemperatuur. Een reactietijd van 1 tot 2 dagen heeft de voorkeur ter verhoging van de opbrengst.-40 Hoewel de verhouding van guanidinovetzuuramide van formule 8203874 . . -34- 2 van het formuleblad tot dihydroxyethaanamide van formu-le 3 van het formuleblad niet specifiek is be^rensd, is het in het algemeen praktisch 0,4 tot 4, bij voorkeur 0,8 tot 1,5 molen van de laatste per mol van de eerste te ge-5 bruiken. De ontstane verbinding is een N-/4-(3-aminopropyl)-aminobutyl7-2- (w-guanidinovetzuur-amido)-2-hydroxyethaan-. .. amide dat is weergegeven met de algemene formule la van het formuleblad, waarin Y en n zijn zoals boven is gedefi-nieerd, welke de verbinding van formule 1 van het formule-10 blad is, waarin R een waterstofatoom is.

De verbindingen van formule 1 van het formuleblad waarin R is een groep anders dan het waterstofatoom, worden verkregen door de hydroxylgroep in de positie 11 van de verbinding van formule la van het formuleblad te 15 alkyleren met de in het voorafgaande genoemde alifatische alcohol, diazoalkaan of benzylalcohol. De verbinding die verkregen is door de bovengenoemde condensatie of spergua-lin verkregen uit de microbische kweek kan allebei worden gebruikt voor de verbinding van formule la van het formule-20 blad. De door de alkylering verkregen verbinding is een N-/4-(3-aminopropyl)aminobutyl7-2- (w-guanidinovetzuur-amido)-2-alkoxyethaanamide die wordt weergegeven door de algemene formule lb van het formuleblad, waarin Y en n zijn zoals boven is gedefinieerd en R' voorstelt een 25 alkylgroep van 1 tot en met 4 koolstofatomen, die een hydroxylgroep als substituent kan hebben, of een benzyl-groep. De alkylering wordt op de volgende manier uitge-voerd.

De reactie tussen een N-/4-(3-aminopropyl)-30 aminobutylJ-2- (ω-guanidinovetzuur-amido)-2-hydroxyethaan-amide van formule la van het formuleblad en de alcohol wordt in het algemeen uitgevoerd in aanwezigheid van zure katalysator. Voor de reactie zijn de guanidino en amino-groepen in de hydroxyethaanamide van formule la van het 35 formuleblad niet noodzakelijkerwijze beschermd maar kunnen zijn beschermd. De alcohol wordt weergegeven door de formule 4 van het formuleblad, waarin R1 is een alkylgroep van 1 tot en met 4 koolstofatomen die een hydroxylgroep als substituent kan hebben, of een benzylgroep. Derge- · 40 lijke alcoholen sluiten in lagere alcoholen zoals methanol, 8203874 *··' _ ’ t -35- « ethanol, propanol en butanol, glycolen zoals ethyleenglycol en propyleenglycol, en benzylalcohol. De reactie wordt bij voorkeur uitgevoerd in de alcohol van bovengenoemde formu-le 4 van het formuleblad, hoewel een inert oplosmiddel 5 kan worden gebruikt. Geschikte zure katalysatoren sluiten in anorganische zuren zoals zoutzuur en zwavelzuur, orga-nische zuren zoals azijnzuur en p-tolueensulfonzuur, en cationische uitwisselingsharsen. De reactietemperatuur ligt in het traject van 0° tot 100°C, in het algemeen van 10 kamertemperatuur tot 80°C, waarbij kamertemperatuur de meeste voorkeur heeft. De reacti-etijd varieert met de reactietemperatuur en ligt in het traject van 1 uur tot 10 dagen, bij voorkeur van 1 tot 2 dagen.

Wanneer de oplosbaarheid van een hydroxyethaan-15 amide van de formule la van het formuleblad in een alcohol van de formule 4 van het formuleblad laag is, is de be-scherming van amino en iminogroepen van het hydroxyethaan-amide met beschermende groepen voordelig ter verhoging van de opbrengst. Geschikte beschermende groepen worden ge-20 kozen onder verwijzing naar de literatuur (J.P. W.

Mcomie, Ed., "Protective Groups in Organic Chemistry",

Plenum Press. N.Y. 1973). Deze beschermende groepen voor de aminogroep die in het algemeen worden gebruikt in de peptidesynthese zijn nuttig. Voorbeelden zijn eenwaardige 25 beschermende groepen zoals benzyloxycarbonyl, p-methoxy-benzyloxycarbonyl, p-ni-trobenzyloxycarbonyl, tert-butoxy-carbonyl, trichloorethoxycarbonyl, en isobormyloxycarbonyl en tweewaardige beschermende groepen zoals ftaloyl en succinyl. Van deze groepen aralkyloxycarbonylgroepen zoals 30 benzyloxycarbonyl en p-methoxybenzyloxycarbonylgroepen de voorkeur van wege het gemak van invoering en verwijderingi De invoering van deze beschermende groepen wordt met bekende werkwijzen tot stand gebracht en met voordeel gebeurd dat onder toepassing van de werkwijze met achieve ester. Bij 35 deze werkwijze blijft de guanidinogroep in de verbinding van formule la van het formuleblad onveranderd.

De alkylering van de hydroxylgroep in de positie 11 van het hydroxyethaanamide van formule la van het formuleblad door de reactie met een diazoalkaan (diazoparaffine) 40 wordt op de volgende manier uitgevoerd.

8203874 ’’ . , -36-

In het algemeen worden eerst de amino en imino-groepen van het hydroxyethaanamide van de formule la van het formuleblad beschermd met de bovenvermelde beschermende groep en de ontstane verbinding wordt onderworpen aan de 5 reactie met een diazoalkaan in een inert organisch oplos-middel zoals methyleenchloride of tetrahydrofuran bij een temperatuur van -20° tot 20°C, gewoonlijk -10° tot 10°C, bij voorkeur -3 tot 3°c gedurende 1 tot 15, gewoonlijk 2 tot 8 uur teneinde alkylering tot stand te brengen. De 10 reactie vereist niet noodzakelijkerwijze een katalysator, maar kan worden versneld in aanwezigheid van een Lewis-zuurkatalysator zoals boriumtrifluoride, aluminiumchloride, hydrofluorboorzuur, of seleendioxyde. Als voorbeelden van diazoalkanen met 1 tot en met 4 koolstofatomen kan melding 15 worden gemaakt van diazomethaan, diazoethaan, diazopropaan, en diazobutaan. Deze diazoalkanen kunnen worden gesynthe-tiseerd uit het overeenkomstige N-nitrosoalkylureum, N-nitrosoalkyluretaan, N-nitrosoalkylsulfo.namide, en N-nitrosoalkyl-N'-nitroguanidine onder toepassing van de 20 bekende werkwijzen (bijvoorbeeld "Organic Synthesis" (John Wiley en Sons, Inc.), II, 165 (1943)? Ill, 119 (1955);

Journal of Organic Chemistry, 13^, 763 (1948) ; "Organic Synthesis", IV, 250 (1963); Chemische Berichte, £4, 2547 (1961); Canadian Journal of Research, 28B, 683 (1950); 25 "Organic Synthesis", III, 244 (1955); Journal of Chemical Society, 1935, 2867·

De alkylering met een diazoalkaan maakt het mogelijk dat de hydroxylgroep in de positie 11 wordt gealky-leerd zonder verandering in de configuratie in de positie 30 11 van de verbinding met de formule la van het formuleblad.

Bijvoorbeeld wordt een (-)hydroxyethaanamide met de formule la van het formuleblad omgezet in het overeenkomstige (-)alkoxyethaanamide met de formule lb van het formuleblad. Een (+)alkoxyethaanamide of een epimeer mengsel (+) ten 35 opzichte van de positie 11 wordt verkregen uit respektieve-lijk het (+)hydroxyethaanamide of (+)hydroxyethaanamide.

De hydroxyethaanamide-verbinding met de formule la van het formuleblad zal hydroxylgroepen hebben in beide posities 11 en 15 wanneer Y is een groep met formule lj 40 van het formuleblad. In dit geval is het tengevolge van het 8203874 V' · , verschil in reactiviteit tussen de twee hydroxylgroepen raogelijk de hydroxylgroep in de positie 11 selectief te alkyleren.

De beschermende groepen voor de amino en imino-5 groepen van het gealkyleerde produkt kunnen op een gewone manier worden verwijderd, waarbij een alkoxyethaanamide met de formule lb van het formuleblad aohterblijft. Bij-voorbeeld kan, wanneer de beschermende groep een aralkyl-oxycarbonylgroep is, deze worden verwijderd door gewone 10 katalytische hydrogenering bij atmosferische druk. De reactie wordt uitgevoerd in een geschikt oplosmiddel zoals methanol, ethanol, dioxan, of een mengsel daarvan in de aanwezigheid van palladium of platina als katalysator.

De reactie wordt versneld door de toevoeging van een zuur 15 zoals zoutzuur of azijnzuur.

Wanneer R een groep met de formule lj van het formuleblad is, is het 2-gesubstitueerde ethaanamide met de formule 1 van het formuleblad N-/4- (3-aminopropyl) -aminobutyl7-2-(u>-guanidino-y8-hydroxyvetzuur-amido)-2-20 gesubstitueerd ethaanamide dat wordt weergegeven met de algemene formule lc van het formuleblad waarin R een n zijn zoals boven is gedefinieerd, met dien verstande dat, wanneer n 4 is, R de groepen anders dan het waterstof-atoom voorstelt. Wanneer de configuratie in de positie 25 15 van deze verbinding hetzij (S) hetzij (R) is en de ver- binding een epimeer mengsel is ten opzichte van de positie 11, kan de verbinding worden gescheiden in beide epi-meren /*(+)-vorm en (-)-vorm7 door middel van chromatografie. Voor dit doel is vloeistofchromatografie met hoog presta-30 tievermogen (HPLC) geschikt. Een wenselijk resultaat wordt fR\ verkregen door bijvoorbeeld Nucleosil C18 (M. Nagel Co.) te gebruiken als kolompakkingsmateriaal en een mengsel van acetonitrilnatriumpentaansulfonaat-fosfaatbuffer als § eluent, 35 Zoals hierboven is beschreven levert alkylering van de hydroxylgroep in de positie 11 met een diazoalkaan of scheiding door middel van HPLC een optisch actief N-/4-(3-aminopropyl) aminobuty 17-2-(u>-guanidino-p-hydroxyvet-zuur-amidq7-2-alkoxyethaanamide die wordt weergegeven door 40 de algemene formule Id van het formuleblad, waarin R1 en n 8203874 ’ . *’ -38- zijn zoals boven is gedefinieerd, Wanneer de hydroxyIgroep in positie 15 van deze verbinding wordt verwijderd door dehydratatie of wordt gedehydroxygeneerd, zal worden ge-vormd een optisch actief (3-aminopropyl) aminobutyl/- 5 2-^b-guanidino- (o£,/3-onverzadigde) -vetzuur-amido/-2-alkoxy-ethaanamide die wordt weergegeven door de algemene formule le van het formuleblad waarin R' en n zijn zoals boven is gedefinieerd, of een optisch actief N-/4-(3-aminopropyl)-aminobutyl7-2- (w-guanidino- (verzadigd) vetzuur-aming7~2-10 alkoxyethaanamide die is weergegeven met de algemene formule If van het formuleblad, waarin R' en n zijn zoals boven . is gedefinieerd.

De verbinding van formule (le) wordt verkregen door de amino en iminogroepen van de verbinding van formule 15 Id van het formuleblad te beschermen met de in het vooraf-gaande vermelde beschermende groepen, waarbij de ontstane verbinding wordt onderworpen aan een dehydratatiebehandeling, en de beschermende groepen worden verwijderd. De dehydratatie kan bijvoorbeeld tot stand worden gebracht door een 20 bekende methode waarbij men dicyclohexylcarbodiimide laat reageren in aanwezigheid van een koper (I of II) chloride (Journal of the American Chemical Society, 9£ , 3245 (1965)). Deze werkwijze heeft de voorkeur omdat hij wordt uitgevoerd onder milde neutrale omstandigheden. Een overmaat dicyclo-25 hexylcarbodiimide verkort de reactietijd. Met het oog op de oplosbaarheid van uitgangsmaterialen is N,N-dimethyl-formamide een voorbeeld van een geschikt oplosmiddel. De reactietemperatuur bedraagt gewoonlijk van kamertemperatuur tot 100°C. De reactietijd loopt uiteen van verscheidene 30 uren tot verscheidene dagen afhankelijk van de reactietemperatuur .

De verbinding van formule If van het formuleblad, die zal worden gevormd uit de verbinding van formule Id van het formuleblad door de deoxygenering van de hydroxyIgroep 35 in de positie 15, wordt bij voorkeur verkregen uit de verbinding van formule le van het formuleblad door de reductie van de dubbele binding. De reductie van de dubbele binding wordt tot stand gebracht door gebruikelijke werkwijzen zoals bijvoorbeeld katalytische reductie. Als de voor amino 40 en iminogroepen beschermende groep een aralkyloxycarbonyl- 8203874 -39- groep is, worden door reductie van de dubbele binding en de verwijdering van de beschermende groepen tegelijkertijd door de katalytische reductie bereikt.

Wanneer R1 van de alkoxyethaanamideverbinding van 5 formule lb van het formuleblad een benzylgroep is, wordt de benzylgroep door de katalytische reductie verwijderd en wordt de verbinding omgezet in de hydroxyethaanamide-verbinding van formule la van het formuleblad, terwijl de configuratie in de positie 11 behouden blijft. In dit IQ geval verloopt de katalytische reductie voor de verwijde-ring van een beschermende aralkyloxycarbonylgroep bij een lage snelheid onder atmosferische druk, terwijl een resul-taat naar tevredenheid wordt verkregen met verminderde reactietijd door de reactie uit te voeren in een waterige 15 azijnzure oplossing onder een hogere druk van verscheidene tot verscheidene tientallen atmosferen.

Het UJ-guanidinovetzuuramide dat is weergegeven door de formule 2 van het formuleblad, waar Y en n zijn zoals boven is gedefinieerd, hetgeen een uitgangsmateriaal 20 is voor de synthese van de verbinding van formule la van het formuleblad, wordt gesynthetiseerd zoals hieronder wordt beschreven (a) Synthese van een verbinding van formule 2 van het 25 formuleblad waarin Y is -C^CH^:

Deze verbinding is een u;-guanidinoverzadigde vet-zuuramide weergegeven met de algemene formule 2a van het formuleblad waarin n is zoals boven is gedefinieerd. Deze W-guanidinoverzadigde vetzuuramiden zijn bekende verbin-30 dingen en kunnen worden gesynthetiseerd uit in de handel verkrijgbare ruwe materialen door bekende reacties. Bijvoor-beeld wordt de verbinding verkregen door de aminogroep van een amino vetzuur van de formule 5 van het formuleblad waar n is zoals boven is gedefinieerd, te beschermen, daar-35 na de carboxylgroep te veresteren, de ontstane ester te be-handelen met ammoniak ter omzetting in een amide, de amino-beschermende groep te verwijderen, en de aminogroep om te zetten in een guanidinogroep.

De verbinding van de formule 2a van het formuleblad 40 kan ook worden bereikt door een diamine te oxyderen tot een 8203874 ’’ · -40- overeenkomstige nitrilverbinding door de formule 4 van het formuleblad, waarin n is zoals boven is gedefinieerd, daarna de nitrilgroep te hydrolyseren ter vorming van een amide-verbinding en de aminogroep om te zetten in een guanidino-5 groep. Voorbeelden van bepaalde ω-guanidinoverzadigde vet-zuuramiden van formule 2a van het formuleblad sluiten in 4-guanidinobutaanamide, 5-guanidinopentaanamide, 6-guani-dinohexaanamide, 7-guanidinoheptaanamide., 8-guanidinooctaan-amide, 9-guanidinononaanamidef 10-guanidinodecaanamide en 11-10 guanidinoundecaanamide.

(b) Synthese van een verbinding van formule 2 van het formuleblad waarin Y groep lj van het formuleblad voor-stelt: 15 Deze verbinding is een w-guanidino-0-hydroxy vetzuur- amide weergegeven met de algemene formule 2b van het formuleblad waarin n is zoals boven is gedefinieerd, en wordt op uiteenlopende manieren gesynthetiseerd door middel van bekende reacties. Bijvoorbeeld wordt het gesynthetiseerd 20 door de aminogroep van een β-aminovetzuur weergegeven met 3e f0rmule 7 van.het formuleblad waarin n is zoals boven is gedefinieerd, te beschermen, daarna de koolstofketen te ver-lengen met twee koolstofatomen, de ontstane verbinding om te zetten in een /^-hydroxyvetzuuramide via een reeks van 25 reacties die algemeen gebruikt worden bij de bereiding van een ^-hydroxycarbonzuurderivaat, daarna de beschermende groep te verwijderen ter terugwinning van de aminogroep, en de aminogroep om te zetten in de guanidinogroep. De werkwijze wordt verder hieronder in detail beschreven onder 30 verwijzing naar een voorbeeld.

Een u>-guanidino-£-hydroxyvetzuuramide wordt gesynthetiseerd door de aminogroep van een '-u-aminovetzuur van formule 7 van het formuleblad te beschermen met een amino-beschermende groep zoals benzyloxycarbonylgroep, het car-35 bonzuur om te zetten in een reactief derivaat zoals een zuur imidazolide, het reactieve derivaat te condenseren met magnesiumenolaat van monoethylmalonaat met de formule 8 van het formuleblad /feuletin de la Societe Chimique de France, 945 (1964ter verkrijging van een j^-keto-ester 40 van formule 9 van het formuleblad waarin X’ een amino- be- 820 3 8*74 « * • “41- schermende groep voorstelt en n is als boven gedefinieerd, de ketoncarbonyigroep te reduceren ter vorming van een /-hydroxyester, de ester te behandelen met ammoniak ter vorming van een amide, de amino-beschermende groep te ver-5 wijderen, en de teruggewonnen aminogroep om te zetten in een guanidinogroep. Bij wijze van aldus bereide w-guanidino- 0-hydroxyvetzuuramiden kan melding worden gemaakt van 4-guanidino-3-hydroxybutaanamide, 5-guanidino-3-hydroxy-pentaanamide, 6-guanidino-3-hydroxyhexaanamide, 7-guanidino-10 3-hydroxyheptaanamide, 8-guanidino-3-hydroxyoctaanainide, en 9-guanidino-3-hydroxynonaanamide.

(S)-7-guanidino-3-hydroxyheptaanamide wordt ook ver-kregen door te hydrolyseren met een zuur of base de anti-biotische stof BMG 162-aF2 (spergualin) die wordt weerge-15 geven door de formule 9a van het formuleblad die wordt ge-isoleerd uit het kweekfiltraat van een micro-organisme van het genus Bacillus zoals bijvoorbeeld, Bacillus BMGl62-aF2 (FEBM-P5230; ATCC 31932). Het wordt ook gesynthetiseerd zoals is beschreven in het Journal of Antibiotics, Vol. 34, 20 1625 (1981), door (S)-3,7-diaminoheptanoisch zuur uit L-lysine te vormen door de Amdt-Eistert reactie ^Journal of Organic Chemistry, Vol. 17, 347 (1952)^, daarna de -aminogroep te deamineren met een salpeterzuur, de carboxyl-groep am te zetten in een amidegroep, en voorts de amino-25 groep om te zetten in de guanidinogroep.

(c) Synthese van een verbinding van formule 2 van het formuleblad waarin Y is -CH=CH-:

Deze verbinding is een ω-guanidino o^^-onverzadigd 30 vetzuuramide die is weergegeven met de formule 2c van het formuleblad waarin n is zoals boven is gedefinieerd. Deze verbindingen worden met voordeel gesynthetiseerd door de dehydratatie van ω-guanidino 0-hydroxyvetzuuramiden van formule 2b van het formuleblad, waarvan de bereiding 35 hierboven is beschreven. Hoewel de dehydratatie kan worden uitgevoerd met behulp van de methoden, die gewoonlijk worden gebruikt bij het dehydrateren van een 0-hydroxy-vetzuuramide, heeft het toch de voorkeur de reactie uit te voeren onder miIde neutrale omstandigheden. Een van de 40 geschikte manieren is dehydratatie te weeg te brengen door 8203874 f Γ % r * -42- de werking van dicyclohexylcarbodiimide in de aanwezigheid van koper (II) chloride /journal of the American Chemical Society, 9£, 3245 (1968)/. Omdat de verbinding van formule 2b van het formuleblad in het algemeen wordt behandeld ' 5 in de vorm van een zuur additiezout, is een voorkeuroplos-middel N,N-dimethylformamide vanwege de oplosbaarheid van het zure additiezout. De reactietemperatuur ligt in het algemeen tussen kamertemperatuur en 10Q°C. De reactietijd ligt in het algemeen in het traject van verscheidene uren 10 tot verscheidene dagen afhankelijk van de reactietemperatuur. De reactietijd kan worden verminderd door het dicyclohexylcarbodiimide in overmaat te gebruiken. Voorbee-1-den van aldus bereide ω-guanidino ^/^-onverzadigde vetzuur-amiden sluiten in 4-guanidino-2-buteenamide, 5-guanidino-15 2-penteenamide, 6-guanidino-2-hexeenamide, 7-guanidino- 2-hepteenamide, 8-guanidino-2-octeenamide, en 9-guanidino- 2-noneenamide.

De reductie van de dubbele binding in het ω-guanidi-no crff/£-onverzadigde vetzuuramide met formule 2c van het 20 formuleblad hetzij katalytisch op een gebruikelijke manier hetzij onder toepassing van natriumboriumhydride in de aanwezigheid van een overgangsmetaalverbinding zoals nikkel-chloride of kobaltchloride /Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 19_, 817 (1971)/ geeft een W-guanidino verzadigd 25 vetzuuramide met de formule 2a van het formuleblad.

N-/^-(3-aminopropyl)aminobuty]/-2,2-dihydroxy-ethaanamide met de formule 3 van het formuleblad, dat een uitgangsmateriaal is voor de synthese van de verbinding met de formule la van het formuleblad, wordt gesynthetiseerd op 30 de volgende manier zoals in detail is weergegeven in Journal of Antibiotics, Vol. 34, 1625 (1981).

De vrije aminogroep van de verbinding die wordt weergegeven door de formule 10 van het formuleblad, waarin X1 een amino-beschermende groep voorstelt, wordt geacyleerd 35 met een dialkylacetaal van glyoxylzuur zoals is weergegeven 2 door formule 11 van het formuleblad waarin X een alkyl- groep met 1 tot en met 5 koolstofatomen voorstelt, of met een reactief derivaat van carbonzuur, en daama worden de 1 2 amino-beschermende groepen X en alkylgroepen X verwijderd, 40 zo<3.at de verbinding met formule 3 van het formuleblad wordt 8203874 *‘ ' · -43- verkregen.

De verbinding met formule 3 van het formuleblad kan ook in hoge opbrengst worden verkregen door de hydrolyse van de in het voorafgaande vermelde antibiotische stof 5 BMG l62-aF2 (spergualin).

De uitvinding wordt hieronder toegelicht onder ver-wijzing naar referentievoorbeelden en voorbeelden.

Referentievoorbeeld 1 10 Synthese van (S)-7-guanidino-3-hydroxyheptaanamide.

(a) Synthese van (S)-3,7-diaminoheptanoisch zuur:

Aan een oplossing van 15 g (82,15 mmol) L-lysine-hydrochloride in 150 ml water werd toegevoegd 8,7 g (82,15 15 mmol) natriumcarbonaat en 43,2 g (200 mmol) N-ethoxycarbo-nylftalimide. Het mengsel werd 20 uur lang bij kamertem-peratuur geroerd. Het reactiemengsel werd met 50 ml ethyl-acetaat gewassen. De waterige laag werd op een pH van 3,0 ingesteld met 6N zoutzuur en 3 maal met 100 ml tolueen 20 geextraheerd. Het extract werd 2 maal met 100 ml water (pH 2,0) gewassen, gedroogd boven watervrij natriumsulfaat, en tot droog ingedampt onder vernuinderde druk ter verkrij-ging van 27,95 g (84% opbrengst) van een wit poeder van di-N-ftaloyl-L-lysine,· ontledingspunt, 71°-72°C; 25 “ 32° (Cl, methanol).

Aan 27,0 g (66,4 mmol) di-N-ftaloyl-L-lysine werd 40 ml oxalylchloride toegevoegd. Het mengsel werd in een oliebad bij 90°C verhit, daarna vermengd met 40 ml 1,2-dimethoxyethaan, en onder terugvloeiing onder verhitting 30 2 uur lang gekookt. Het reactiemengsel werd ingedampt tot droog, opnieuw opgelost in 20 ml 1,2-dimethoxyethaan, en toegedruppeld aan 500 ml van een etheroplossing die 330 mmol diazomethaan bevatte, terwijl in ijswater werd gekoeld. Het mengsel werd daarna 1 uur lang geroerd. Het reactie-35 mengsel werd tot droog ingedampt, en opgelost in 250 ml watervrije methanol. Aan de oplossing werd 50 ml triethyl-amine-oplossing die 3,4 g (14,8 mmol) silverbenzoaat bevatte, toegevoegd. Het mengsel werd 15 uur lang bij kamer-temperatuur geroerd. Het neerslag werd gefiltreerd en bij-40 eengebracht, opgelost in 100 ml chloroform, gefiltreerd uit 8203874 -44- onoplosbare stoffen, en tot droog ingedampt ter verkrijging van 15,3 g (53% opbrengst) (S)-3,7-diftaloylaminohepta-no’isch. zure methylester. Ontledingspunt 118°-119°C; “3° (C2, chloroform).

5 Aan 15,0 g (34,5 mmol) (S)-3,7-di£taloylaminohep- tano'isch zure methylester werd 100 ml 1 molair ethanolisch hydrazinehydraat en 100 ml 95% ethanol toegevoegd. Het mengsel werd 1 uur lang onder verhitting (oliebadtempera-tuur; 90°C) gekookt onder terugvloeiing. Het reactiemeng-10 sel werd tot droog ingedampt, opgelost in 250 ml 5% zout-zuur, 1 uur lang bij 80°C verhit, ingesteld op een pH van 7,1 met 17% waterige ammoniak, en door een kolom (27 mm (R) inwendige diameter) met een pakking van 300 ml Amberlite 1 CG-50 (70% NH^-type) geleid. De kolom werd achtereenvoigens 15 gewassen met 900 ml water en 900 ml 0,2 molair waterige ammoniak, en geelueerd met 0,5 molaire waterige ammoniak.

De ninhydrine-positieve frakties werden verzameld en tot droog ingedampt ter verkrijging van 3,15 g (57% opbrengst) van (S)-3,7-diaminoheptanoisch zuur (C7Hl6N202.1/4 H2C03) 20 in kleurloze siroopvorm? + 2,9° (Cl, water).

(b) Synthese van (S)-7-guanidino-3-hydroxyheptaan-amide:

Aan 30 ml van een pyridine-water-triethylamine 25 (10:10:1) mengsel dat 3,1 g (19,3 mmol) van in (a) hier- boven verkregen (S)-3,7-diaminoheptano*isch zuur bevatte, werd langzaam 4,81 g (19,3 mmol) N-benzoyloxycarbonyloxy- succinimide toegevoegd. Het mengsel werd 5 uur lang bij kamertemperatuur geroerd. Het reactiemengsel werd ingedampt 30 tot droog, daarna opgelost in 30 ml water, ingesteld op een pH van 6,4 met 6N zoutzuur en door een 100 ml kolom (16 mm (R) inwendige diameter) met een pakking van Amberlite CG-50 (80% NH4~type) geleid. De kolom werd ontwikkeld met 300 ml water. Het verzamelde effluent werd verder geleid door 35 een kolom (16 mm inwendige diameter) met een pakking van (R) 100 ml Dowexv ' 50W-X4 (H-type). De kolom werd achtereen-volgens gewassen met elk 300 ml water en 0,2 M waterige ammoniak en geelueerd met 0,5 M waterige ammoniak (10 ml fractiegrootte). De fracties No. 16 tot en met 33 werden 40 gecombineerd en afgedampt tot droog ter verkrijging van 8203874 -45- 2,73 g (48% opbrengst) van een wit poeder van (S)-3-amino- 7-benzyloxycarbonylaminoheptanoIsch zuur (ci5H22N2°4,H2°)' ontledingspunt, 1430“147oC7 + 14° (Cl, methanol).

(R) ^

De Amberlite ' CG-50 kolom werd geelueerd met 0,5 N wate- 5 rige ammoniak ter terugwinning van 746 mg (24% terug- winning (S)-3,7-diaminoheptanolsch zuur.

Aan een oplossing van 2,7 g (9,17 mmol) (S)-3-amino- 7-benzyloxycarbonylaminoheptanolsch zuur in 33%'s waterig azijnzuur, werd, terwijl werd gekoeld in ijs over een ^ periode van 1 uur een oplossing van 1,9 g (27,51 mmol) natriumnitriet in 10 ml water toegedruppeld. Het mengsel

werd nog eens 1 uur lang geroerd en men liet het bij 5°C

24 uur lang staan. Na toevoeging van 50 ml water werd het reactiemengsel 2 maal geextraheerd met 50 ml ethylacetaat.

15

De organische laag werd boven watervrij natriumsulfaat gedroog en tot droog ingedampt ter verkrijging van 2,16 g van een ruw poeder. Onder toepassing van kolom 28 mm in- wendige diameter) chromatografie met 200 g silica gel (R) (Wakogel C-200) werd de bovengenoemde ruwe poeder ont- 20 wikkeld met een chloffoform-methanol-geconcentreerde waterige ammoniak (30:10:1 volume) mengsel (20 ml fractiegrootte) ontwikkeld. De fracties No. 51 tot en met 60 werden gecom- bineerd en ingedampt tot droog ter verkrijging van 460 mg (17% opbrengst) van een wit poeder van (S)-7-benzyloxy-25 .carbonylamino^3-hydroxyheptanoisch zuur; ontledingspunt, 115°C - 117°C? A7p3+ 3° (C2, methanol).

Aan een oplossing van 450 ml (1,52 mmol) (S)-7-benzyloxycarbonylamino-3-hydroxyheptano'isch zuur in 1,2-dimethoxyethaan werd, terwijl in ijs werd gekoeld, 7 ml 30 (4,56 mmol) van een oplossing van diazomethaan in ether toegedruppeld. Het mengsel werd 30 min. lang geroerd. Het reactiemengsel werd ingedampt tot droog ter verkrijging van 461 mg (98% opbrengst) (S)-7-benzyloxycarbonylamino-3- hydroxyheptanoisch zuur methylester; + 1°- 35 u

Een oplossing van 450 ml (1,45 mmol) (S)-7-benzyl- oxycarbonylamino-3-hydroxyheptanoisch zure methylester in 50 ml van waterig methanol werd, terwijl werd gekoeld bij -10°C, met gasvormig ammoniak verzadigd en men liet haar 3 dagen lang in een luchtdicht afgesloten buis bij kamer-40 temperatuur staan. Het reactiemengsel werd tot droog xnge- 8203874 ' · -46- dampt en onderworpen aan een chromatografische behandeling onder .toepassing van een kolom (20 mm inwendige diameter) (R) die 50 g silica gel (Wakogel C-200) bevatte en onder ontwikkeling met chloroform-methanol (100:1 volume). De 5 fracties No. 82 tot en met 106 elk met een volume van 10 ml werden gecombineerd en tot droog ingedampt ter verkrijging van 371 mg (87% opbrengst) van een wit poeder van (S)-7- benzyloxycarbonylamino-3-hydroxyheptaanamide; ontledingspunt, 126°-127°C; [«J22 - 3° (C5, methanol).

10 In een mengsel van 10 ml 90%'s waterig methanol en 0,01 ml azijnzuur werd 350 mg (1,19 mmol) (S)-7-benzyl- oxycarbonylamino-3-hydroxyheptaanamide opgelost, Na toevoe- ging van 50 mg 5%'s palladium-koolstof werd het mengsel 3 uur lang bij kamertemperatuur geroerd onder een waterstof- 15 stroom. Na verwijdering van de katalysator door filtratie werd het filtraat ingedampt tot droog, opnieuw opgelost in een klein volume water en geleid door een kolom (12 mm (R) inwendige diameter) die 30 ml Dowex 50W-X4 (H-type) bevatte. De kolom werd gewassen met 90 ml water en geelu- 20 eerd met 0,5 M waterige ammoniak (3 ml in fractiegrootte).

De fracties Nos. 28 tot en met 34 werden gecombineerd en ingedampt tot droog ter verkrijging van 201 mg (96% opbrengst) 22 o van (S)-7-amino-3-hydroxyheptaanamide; M-q “ 2° (C2, water).

25 Aan een oplossing van 190 mg (1,08 mmol) (S)-7- amino-3-hydroxyheptaanamide in 3 ml water werd 0,54 ml 2N waterige natriumhydroxyde-oplossing toegevoegd. Aan de ontstane oplossing werd, terwijl in ijs werd gekoeld, over een periode van 30 min. 1 ml van een methanoloplossing die 30 129 mg (1,08 mmol) 2-methyl-1-nitrosoureum bevatte, toege- druppeld. Het mengsel werd verder 5 uur lang geroerd, daar- na ingesteld tot een pH van 6,0 met 6 N zoutzuur, ingedampt tot droog, en gezuiverd door chromatografie onder gebruik- making van een kolom (15 mm inwendige diameter) die 30 g (R) 35 silica gel (Wakogel C-200) bevatte en onder ontwikkeling met een mengsel van chloroform, methanol en geconcen-treerde waterige ammoniak (60:10:1 volume). De fracties Nos. 67 tot en 90 (6 ml in fractiegrootte) werden gecombineerd en ingedampt tot droog ter verkrijging van 187 mg 40 (70% opbrengst ) van een wit poeder van (S)-7-nitroguanidino- 8203374 ·· " , :-47- I * 3-hydroxyheptaanamide; ontledingspunt, 148°-149°C; -2° (C2, methanol).

In een mengsel van 15 ml water, 15 ml methanol en 7,5 ml azijnzuur werd 170 mg (0,69 mmol) (S)-7-nitro-5 guanidino-3-hydroxyheptaanamide opgelost. Na toevoeging van 50 mg van 5%1s palladium-koolstof werd het mengsel 1 uur lang bij kamertemperatuur onder een waterstofstroom geroerd. Na verwijdering van de katalysator door filtra-tie werd het filtraat ingedampt tot droog ter verkrijging 10 van 165 mg van een ruw poeder. Het ruwe poeder werd opgelost in 10 ml water, geleid door een kolom (12 mm inwen- (R) dige diameter) met een pakking van 20 ml CM-Sephadex C-25 (Na-type), en geelueerd met 0,5 M waterige natrium-chloride-oplossing (2 ml in fractiegrootte). De fracties 15 Nos. 18 tot en met 25 werden gecombineerd, ingedampt tot droog en drie maal met 10 ml methanol geextraheerd. De methanol-oplossingen werden gecombineerd, geleid door een kolom (20 mm inwendige diameter) met een pakking van 100 (R) ml Sephadex LH-20 en geelueerd met methanol (1 ml in 20 fractiegrootte). De fracties Nos. 28 tot 46 werden gecombineerd en tot droog ingedampt ter verkrijging van 149 mg (91% opbrengst) van een wit poeder van (S)-7-guanidino- 3-hydroxyheptaanamide hydrochloride (Cg H18N4°2*HC1)? [«3™ “2° (C2, water) .

25

Referentie voorbeeld 2

Synthese van 7-guanidino-2-hepteenamide.

Aan een oplossing van 955 mg (4 mmol) (S)-7-guanidino-3-hydroxyheptaanamide hydrochloride in 20 ml wa-30 tervrij Ν,Ν-dimethylformamide werd 2,48 g (12 mmol) dicyclo-hexylcarbodiimide en 40 mg koper (II) chloride toegevoegd. Het mengsel werd 2 dagen lang bij kamertemperatuur geroerd. Het reactiemengsel werd gefiltreerd ter verwijdering van het neerslag en het filtraat werd onder verminderde druk 35 geconcentreerd. Het residu werd in 10 ml water opgelost en twee maal met 10 ml ethylacetaat gewassen. De waterige laag werd ingedampt tot droog, opgelost in 5 ml water, geleid door een kolom (20 mm inwendige diameter) met een pakking (R) van 50 ml CM-Sephadex C-25 (Na-type) en de kolom werd 40 geelueerd met 200 ml 0,5 M waterige natriumchloride-oplos- 8203874 -48- sing (10 ml fractiegrootte). De fracties No 17 tot en met 30 werden gecombineerd, tot droog ingedampt, en drie maal geextraheerd met methanol. De methanol-oplossing werd ge- leid door een kolom (20 mm inwendige diameter) die een (R) 5 pakking had van 150 ml Sephadex' ' LH-20 en werd ontwik-keld met methanol (5 ml fractiegrootte). De fracties No.

9 tot en met No. 16 werden gecombineerd en tot droog ingedampt. Het residu, dat 950 mg woog, werd gekristalliseerd uit ethanol-aceton zodat 790 mg (89,5% opbrengst) 7-guani-10 dino-2-hepteenamide hydrochloride met een smeltpunt van 162°-168°C werd verkregen.

Proton NMR (gemeten in deuteromethanol), & : 1,4 - 1,8 (CH2 x 2); 2,27 (CH2); 3,20 (CH2); 5,98 (CH); 6,80 (CH) 15 Infrarood absorptie spectrum (KBr tablet), cm ^: 3370, 3150, 1660, 1625, 1610, 1590, 1415, 1395, 1370.

Referentievoorbeeld 3 20 _ Synthese van 7-guanidinoheptaanamide hydro chloride.·

Aan een oplossing van 441 mg (2mmol) 7-guanidino- 2-hepteenamide hydrochloride in 7 ml methanol, werd 47,5 mg (0,2 mmol) van nikkel-chloride toegevoegd. Aan het 25 mengsel werd, terwijl bij kamertemperatuur werd geroerd, 189 mg (5 mmol) natriumboriumhydride in kleine porties toegevoegd. Na de toevoeging werd het mengsel 1,5 uur lang verder geroerd, daarna gefiltreerd vanuit een zwart neerslag, en het filtraat werd tot droog ingedampt. Het 30 residu werd opgelost in 5 ml 0,5 M waterige natriumchloride- oplossing, geleid door een kolom (30 mm inwendige diameter), (R) die een pakking had van 100 ml Diaion HP-20, en ont-wikkeld met 300 ml 0,5 M waterige natriumchloride-oplossing, daarna met.. 300 ml water (15 ml fractiegrootte) . De fracties 35 No. 25 tot en met No 33 werden gecombineerd, tot droog ingedampt, en drie maal met 5 ml ethanol geextraheerd. De methanollaag werd geleid door een kolom (20 mm inwendige (R) diameter) die een pakking had van 150 ml Sephadex LH-20, en ontwikkeld met methanol (5 ml fractiegrootte). De frac-40 ties No. 8 tot en met 13 werden gecombineerd, tot droog in- - 8203874 < ' ·’· -49- gedampt, en gekristalliseerd uit ethanol-aceton zodat werd verkregen 372 mg ( 83,5% opbrengst) kleurloze kristal-len van 7-guanidinoheptaanamide hydrochloride met een smeltpunt van 140°-141°C.

5 Proton NMR (gemeten in deuteromethanol), 1,2.-.1,9 (CH2x4)? 2,23 (CH2); 3,20 (CH2) . Infrarood absorptiespectrum (KBr tablet), cm 3350, 3150, 2920, 1655, 1630, 1590, 1455, 1430, 1400, 1220, 1165, 1130, 1065.

10

Referentievoorbeeld 4

Synthese van 8-guanidino-3-hydroxyoctaanamide.

(a) Synthese van 8-benzyloxycarbonylamino-3-ketooctanolsch zur.e ethylester: 15 Aan een oplossing van 6,56 g (50 mmol) 6-amino- hexanolsch zuur in 25 ml van 2N waterige natrlumhydroxyde oplossing werd 5 ml ethylether toegevoegd. Aan het mengsel werd, terwijl in ijs werd gekoeld en geroerd, over een periods van 3 0 min. 10 ml benzyloxycarbonylchloride en 20 37,5 ml 2N waterige natriumhydroxydeoplossing toegedrup- peld. Na de toevoeging werd de temperatuur tot kamertem-peratuur teruggebracht en het roeren werd 2 uur lang voortgezet. Het reactiemengsel werd twee maal gewassen met 20 ml ethylether. De waterige laag werd aangezuurd 25 met geconcentreerd zoutzuur en drie maal geextraheerd met 50 ml ethylacetaat. De extract-oplossingen werden ge-combineerd, gewassen met verzadigd zouthoudend water, gedroogd boven watervrij natriumsulfaat, en vrijgemaakt van oplosmiddel door destillatie ter verkrijging van 12,16 30 g (92% opbrengst) 6-benzyloxycarbonylaminohexanoxsch zuur met een smeltpunt van 127-128°C.

Een oplossing van 2,65 g (10 mmol) 6-benzyloxy-carbonylaminohexanoisch zuur en 1,62 g (10 mmol) in de handel verkrijgbaar 1,11-carbonyldiimidazool in 25 ml 35 watervrij tetrahydrofuran werd 15 min. lang bij kamertem-peratuur geroerd. Aan het reactiemengsel werd een suspen-sie van 6,18 g (40 mmol) van een wit poeder van magnesium-enolaat van monoethylmalonaat (bereid uit 5,28 g monoethyl-malonaat en 972 mg magnesium) in 50 ml watervrij tetra-40 hydrofuran toegevoegd. Het mengsel werd 2 uur lang bij 8203874 V . . -50- * kamertemperatuur geroerd. Na toevoeging van 50 ml IN zoutzuur en 10 min. lang roeren werd het mengsel drie maal met 50 ml chloroform geextraheerd. De chloroformlaag werd achtereenvolgens gewassen met IN zoutzuur, verzadigde 5 waterige natriumwaterstofcarbonaat-oplossing en verzadigd zouthoudend water, daarna gedroogd boven watervrij natrium-sulfaat, en vrijgemaakt van oplosmiddel door destillatie. Het residu werd geleid door een kolom van 100 g "Silica Gel 60: (Merck and Co.) fen geelueerd met chloroform (20 g 10 fractiegrootte). De fracties No. 43 tot en met No. 105 werden gecombineerd en tot droog ingedampt ter verkrijging van 2,35 g (70% opbrengst) ethyl 8-benzyloxycarbonylamino- 3-ketooctanoaat.

Proton NMR spectrum (in deuterochloroform), £: 15 1,27 (CH3); 1,1 - 1,9 (CH2x3) ; 2,52 (0¾) ; 3,17 (NCH2); 3,40 (CH2); 4,18 (CHg); 5,05 (NH); 5,09 (CH2; 7,32 (C^) .

Infrarood adsorptiespectrum (KBr tablet), cm 1; 3360, 2920, 1730, 1710, 1520, 1240.

20 (b) Synthese van 8-guanidino-3-hydroxyoctaan- amide:

In 20 ml ethanol werd 2,01 g (6 mmol) ethyl 8-benzyloxycarbonylamino-3-ketooctanoaat dat hierboven in (a) werd verkregen, opgelost. Aan de oplossing werd 25 portiegewijs onder roeren bij kamertemperatuur 227 mg (6 mmol) natriumboriumhydride toegevoegd. Het mengsel werd 30 min. lang geroerd, daarna vermengd met verscheidene druppels azijnzuur, uitgegoten in 100 ml water, en drie maal met 50 ml chloroform geextraheerd. De chloroformlagen 30 werden gecombineerd, achtereenvolgens gewassen met IN: zoutzuur, verzadigde waterige natriumwaterstofcarbonaat-oplossing en verzadigd zouthoudend water, daarna gedroogd boven watervrij natriumsulfaat, en vrijgemaakt van het oplosmiddel bij destillatie zodat werd verkrege’n 2,00 g 35 (99% opbrengst) ethyl 8-benzyloxycarbonylamino-3-hydroxyoc- tanoaat met een smeltpunt van 47°-50°C.

In 40 ml methanol dat was verzadigd met gas-vormige ammoniak werd opgelost 1,69 g (5 mmol) ethyl 8-ben-zyloxycarbonylamino-3-hydroxy-octanoaat. De oplossing werd 40 3 dagen lang bij kamertemperatuur geroerd, het reactiemeng- 8203874 i t v '.· ’· -51- sel werd ingedampt tot droog. Het residu werd uit ethanol gekristalliseerd zodat verkregen werd 1,18 g ( 72,5% op-brengst) 8-benzyloxycarbonylamino-3-hydroxyoctaanamide met een smeltpunt van 100° - 101°C.

5 Aan een oplossing van 1,04 g (3,2 mmol) 8*benzyl- oxycarbonylami.no-3-hydroxyoctaanamide in 20 ml methanol werd toegevoegd 3,2 ml IN zoutzuur en 200 ml 10% palla-dium-koolstof. Het mengsel werd onder een stikstofstroom 3 uur lang bij kamertemperatuur geroerd. De katalysator 10 werd door filtratie verwijderd en het filtraat werd tot droog ingedampt ter verkrijging van 670 mg 8-amino-3-hydroxyoctaanamidehydrochloride.

Aan een oplossing van 670 mg 8-amino-3-hydroxy-octaanamidehydrochloride in 8 ml IN waterige natriumhydro-15 xydeoplossing werd 668 mg (2,4 mmol) S-methylisotioureum-hemisulfaat toegevoegd. Het mengsel werd bij kamertemperatuur gedurende de nacht geroerd. Het reactiemengsel werd ingesteld op een pH van 6 met 1M zoutzuur, tot droog ingedampt, en in 5 ml IN zouthoudend water opgelost. De oplos- (R) 20 sing werd geleid door een kolom van 160 ml Diaion HP120 (Mitsubishi Chemical Co.) en de kolom werd achtereenvol- gens geelueerd met 400 ml 1M zouthoudend water, 400 ml 0,8 M zouthoudend water en 800 ml 0,6M zouthoudend water (15 g fractiegrootte). De fracties No. 41 tot en met No. 87 25 werden gecombineerd, tot droog ingedampt, en drie maal geextraheerd met 10 ml methanol. De methanollaag werd ge- (R) leid door een kolom van 300 ml Sephadex LH-20 en geelueerd met methanol teneinde ontzouting (7 ml fractiegrootte) tot stand te brengen. De fracties No. 25 tot en met 35 30 werden gecombineerd en tot droog ingedampt zodat werd verkregen 687 mg (85% opbrengst) 8-guanidino-3-hydroxyoctaan-amidehydrochloride.

Proton NMR spectrum (in deuteromethanol) , «Γ: 1,4 - 1,8 (CH2x4); 2,36 (CH2)? 3,20 (NCH2)? 35 3,95 (CH)

Infrarood absorptiespectrum (KBr tablet), cm 1: 3350, 3170, 2930, 1655, 1400, 1175.

Referentievoorbeeld 5 40 Synthese van 8-guanidino-2-octeenamide.

8203874 -52-

Op een manier soortgelijk aan die in de synthese van 7-guanidino-2-hepteenamide in referentievoorbeeld 2 werd 218 mg (86% opbrengst) 8-guanidino-2-octeenamidehydro-chioride met een smeltpunt van 163°-165°C verkregen uit 5 270 mg 8-guanidino-3-hydroxyoctaanamidehydrochloride.

Proton NMR spectrum (in deuteromethanol), %: 1,4-1,9 (CH2x3); 2,25 (CH2); 3,19 (NCH2); 5,94 (CH); 6,79 (CH).

Infrarood absorptiespectrum (KBr tablet), cm 1: 10 3400, 3120, 2920, 1660, 1630, 1400.

Referentievoorbeeld 6

Synthese van 9-guanidino-3-hydroxynonaanamide.

Op een manier soortgelijk aan die in de synthese 15 van 8-guanidino-3-hydroxyoctaanamide in referentievoorbeeld 4, werd 892 mg 9-guanidino-3-hydroxynonaanamidehydrochlori-de verkregen uit 2,56 g 7-aminoheptanoisch zuur.

Proton NMR spectrum (in deuteromethanol), <£: 1.2 - 1,9 (CH2x5); 2,35 (CH2)? 3,19 (NCH2); 20 3,29 (CH) .

Infrarood absorptiespectrum (KBr tablet), cm 1: 3350, 3180, 2940, 1660, 1400, 1175.

Referentievoorbeeld 7 25 Synthese van 9-guanidino-2-noneenamide.

Op een manier soortgelijk aan die in de synthese van 7-guanidino-2-hepteenamide in referentievoorbeeld 2 werd 253 mg (75% opbrengst) 9-guanidino-2-noneenamidehydro-chloride verkregen uit 361 mg 9-guanidino-3-hydroxynonaan-30 amidehydrochloride? smeltpunt 132°-135°C.

Proton NMR spectrum (deuteromethanol), & : 1.2 - 1,9 (CH2x4); 2,23 (CH2); 3,20 (NCH2); 5,97 (CH); 6,80 (CH).

Infrarood absorptiespectrum (KBr tablet), cm 1: 35 3350, 3175, 2940, 1660, 1620, 1420.

Referentievoorbeeld 8

Synthese van N-/"4-(3-aminopropyl) aminobutyl/- 2,2-dihydroxyethaanamide.

40 / 3203874 ’·' . . -53- (a) Synthese van mono-N-benzyloxycarbonyl-1,4-butaandiamine:

Aan een oplossing van 1,76 g (20 mmol) 1,4-butaandiamine in 30 ml van 50% waterig methanol, werd 5 5,48 g (20 mmol) benzyl s-4,6-dimethylpyrimide-2-ylthio- carbonaat (Kokusan-kagaku Co.) toegevoegd. Het mengsel werd 3 uur lang geroerd. Het reactiemengsel werd gefil-treerd ter verwijdering van het neerslag /5,08 g (29%) van di-N-benzyloxycarbonylverbinding werd verkregen uit 10 het neerslagj?. Het filtraat werd tot droog ingedampt, op-gelost in 250 ml chloroform, en vijf maal gewassen met 100 ml water. De chloroformlaag werd gedroogd boven water-vrij natriumsulfaat, en tot droog ingedampt ter verkrijging van 1,0 g (23% opbrengst) mono-N-benzyloxycarbonyl-1,4-15 butaandiamine, een kleurloze siroop.

(b) Synthese van 0-tosyl-3-tert-butoxycarbonyl-amino-1-propanol:

Aan een pplossing van 1,5 g (20 mmol) 3-amino- 1-propanol in 30 ml methanol, werd 4,8 g (20 mmol) tert- 20 butyl S-4,6-dimethyl-pyrimide-2-ylthiocarbonaat toegevoegd.

Het mengsel werd 6 uur lang geroerd. Het reactiemengsel werd tot droog ingedampt, opgelost in 200 ml chloroform en met 200 ml water gewassen. De chloroformlaag werd ge- concentreerd en onderworpen aan kolomchromatografie onder (R) 25 gebruikmaking van 300 g silica gel (Wakogel C-200) en een tolueen-ethylacetaat (1:1 volume) mengsel als ontwik-kelingsoplosmiddel (15 ml fractiegrootte). De fracties No.

82 tot en met 151 werden gecombineerd en tot droog ingedampt ter verkrijging van 2,95 g (84% opbrengst) 3-tert-30 butyloxycarbonylamino-1-propanol, een kleurloze olie-achtige stof.

Aan een oplossing van 2,95 g (16,9 mmol) 3-tert-butoxycarbonylamino-l-propanol in 50 ml pyridine werd, terwijl in ijs werd gekoeld onder een argon atmosfeer, 35 over een periode van 40 min. een pyridine-oplossing die 3,36 g (17,7 mmol) p-tolueensulfonylchloride bevatte, toe-gedruppeld. Het mengsel liet men bij 7°C gedurende de nacht staan, en daarna werd een klein volume water bijgemengd en werd tot droog ingedampt. Het residu werd opgelost in 200 40 ml chloroform, achtereenvolgens gewassen met 5% waterige 8203874 . -54- 1 ' < kalium waterstofsulfaatoplossing, verzadigde waterige natrium waterstofcarbonaatoplossing, en water, daarna ge- droogd boven watervrij natriumsulfaat, en tot droog inge- dampt. Het residu werd onderworpen aan kolomchromatogra- (R) 5 fie onder gebruikmaking van 120 g silica gel (Wakogel C-200) en een tolueen-ethylacetaat (8:1 volume) mengsel als ontwikkelingsoplosmiddel (15 ml fractiegrootte). De fractie No. 35 tot en met No. 68 werden gecombineerd en ingedampt tot droog ter verkrijging van 3,06 g (55% 10 opbrengst) O-tosyl-3-tert-butoxycarbonylamino-l-propanol, een kleurloze olieachtige stof.

(c) Synthese van N-tert-butoxycarbonyl-N-(tert-butoxycarbonylaminopropyl)-1,4-butaandiamine. In 15 ml Ν,Ν-dimethylformamide, werd 800 mg 15 (2,43 mmol) van de in (b) hierboven verkregen 0-tosyl-3- tert-butoxycarbonylamino-1-propanol opgelost. Na toevoe-ging van 510 mg (4,8 mmol) lithiumbromide (LiBr.^O) , werd het mengsel 24 uur lang bij kamertemperatuur geroerd. Aan het reactiemengsel dat de broomverbinding bevatte, 20 werd 540 mg (2,43 mmol) van hierboven in (a) verkregen mono-N-benzyloxycarbony1-1,4-butaandiamine en 0,34 ml triethylamine toegevoegd. Het mengsel werd bij kamertemperatuur 48 uur lang geroerd. Aan het reactiemengsel werd 699 mg (2,9 mmol) tert-butyl S-4,6-dimethylpyrimide-2-25 ylthiocarbonaat toegevoegd. Het mengsel werd 13 uur lang bij kamertemperatuur geroerd. Het reactiemengsel werd tot droog ingedampt, opgelost in 100 ml chloroform, ge-wassen met 50 ml water, gedroogd boven watervrij natriumsulf aat, en tot droog ingedampt. Het residu werd onder- 30 worpen aan kolomchromatografie onder gebruikmaking van (r) 200 g silica gel (Wakogel C-200) en een tolueen-ethylacetaat (4:1 volume) mengsel als ontwikkelingsoplosmiddel (12 ml fractiegrootte). De fracties No. 134 tot en met 165 werden gecombineerd en tot droog ingedampt ter ver-35 krijging van 608 mg (52% opbrengst) N-benzyloxycarbonyl-N*-tert-butoxycarbonyl-N1-(tert-butoxycarbonylaminopropyl)- 1,4-butaandiamine, een kleurloze siroopachtige stof.

Aan een oplossing van 144 mg (0,3 mmol) van de bovengenoemde siroopachtige stof in 5 ml methanol, 40 werd toegevoegd 100 mg 5%'s palladium-bariumcarbonaat. Het 8203874 -55- mengsel werd onder een waterstofstroom bij kamertemperatuur 5 uur lang geroerd. Na verwijdering van de katalysator door filtratie werd het filtraat tot droog ingedampt ter verkrijging van 103 rag (100% opbrengst) N-tert-butoxycar-5 bonyl-N1-(tert-butoxycarbonylaminopropyl)-1,4-butaan-diamine.

(d) Synthes© van N-/*4- (3-aminopropyl)-amino- butyl/-2 ,2-dihydroxyethaanamide:

In 2 ml ethylacetaat, werd 100 mg (0,29 mmol) 10 van het hierboven in (c) verkregen N-tert-butoxycarbonyl-N- (tert-butoxycarbonylaminopropyl)-1,4-butaandiamine en 148 mg (1 mmol) 2,2-diethoxyazijnzuur opgelost. Aan de ontstane oplossing werd 135 mg (lmmol) 1-hydroxybenzotriazool en 206 mg (1 mmol) dicyclohexylcarbodiimide toegevoegd.

15 Het mengsel werd 15 uur lang bij kamertemperatuur geroerd.

Het neerslag werd afgescheiden door filtratie en gewas- sen met koude ethylacetaat. Het filtraat en de wassingen werden gecombineerd en gewassen met 1M waterige ammoniak, daarna met water. De ethylacetaatlaag werd gedroogd boven 20 watervrij natriumsulfaat, tot droog ingedampt, en onder- worpen aan kolomchromatografie onder gebruikmaking van (R) een kolom van 20 g silica gel (Wakogel C-200) en een tolueen-ethylacetaat (1:2 volumeverhouding) mengsel als ontwikkelingsoplosmiddel (3 ml fractiegrootte). De frac-25 ties No. 14 tot en met 21 werden gecombineerd en tot droog ingedampt ter verkrijging van 109 mg (79% opbrengst) N- jQ-(3-tert-butoxycarbonylaminopropyl)-4-tert-butoxy-carbonylaminobutyl7-2,2-diethoxyethaanamide, een kleurloze siroopachtige stof.

30 Aan een oplossing van 44 mg (0,13 mmol) van bovengenoemde siroopachtige stof in 1 ml dioxan werd toegevoegd 2,5 ml 0,1N zoutzuur. Het mengsel werd in een oliebad bij 100°C 4 uur lang geroerd. Het reactiemeng- sel werd geneutraliseerd met 0,2N waterige natriumhydroxyde- 35 oplossing tot een pH van 6, en daarna tot droog ingedampt.

Het residu werd geextraheerd met 1,5 ml methanol en de methanollaag werd geleid door een kolom (16,5 mm inwen- (R) dige diameter) met een pakking van 100 ml Sephadexv LH-20, en ontwikkeld met methanol (2 ml fractiegrootte). De frac-40 ties No. 22 tot en met 25, positief op ninhydrinereactie, 8203874 ·’ . ’ ’.. -56- werden gecombineerd en ingedampt tot droog, zodat werd ver-kregen 13 mg (46% opbrengst) N-,^- (3-aminopropyl)aminobuty 17- 2,2-dihydroxyethaanamidedihydrochloride, een kleurloze siroopachtige stof.

5

Voorbeeld I

Synthese van 11-/¾- (3-aminopropyl) aminobutyl7~ 2-(4-guanidinobutaanamido)-2-hydroxyethaanamide. Een mengsel van 360 mg (2 mmol) 4-guanidino-10 butaanamidehydrochloride, 701 mg (2/4 mmol) N-/3-(3-amino-propyl) aminobuty 1/-2,2-dihydroxyethaanamidedihydrochloride, 264 mg (2 mmol) glutaarzuur en 0,36 ml water werd bij 60°C 24 uur lang verhit.

Na voltooiing van de reactie werd 5 ml water 15 aan het reactiemengsel toegevoegd/ daarna geleid door een kolom (20 mm inwendige diameter) met een pakking van 150 ml (R) CM-Sephadexv ' C-25 (Na-type), en gefractioneerd door de gradient eluering met 1,5 1 water en 1,5 1 0,8M waterige natriumchloride-oplossing (15 ml fractiegrootte). De frac-20 ties No. 125 tot en met 137 die overeen kwamen met de natriumchlorideconcentraties van 0,48 - 0,56M werden gecombineerd , daarna geconcentreerd, en drie maal met 10 ml methanol geextraheerd. De methanollaag werd geleid door een kolom (20 mm inwendige diameter) met een pakking van (R) 25 150 ml Sephadex ' LH-20, en ontwikkeld met methanol (7 ml fractiegrootte). De fracties No. 9 tot en met 15 werden gecombineerd en tot droog ingedampt, zodat werd verkregen 318 mg (35% opbrengst) van een wit poeder van N-/3-(3-aminopropyl)aminobuty17-2-(4-guanidinobutaanamido)-30 2-hydroxyethaanamidetrihydrochloride.

Voorbeeld II

Synthese van N-/4-(3-aminopropyl)aminobuty1/- 2-(5-guanidinopentaanamido)-2-hydroxyethaan-3 5 amide.

Een mengsel van 92,4 mg (0,48 mmol) 5-guanidino-pentaanamidehydrochloride, 166,5 mg (0,57 mmol) N-/4-(3-aminopropyl)aminobuty1/-2,2-dihydroxyethaanamidedihydro-chloride, 62,8 mg (0,48 mmol) glutaarzuur, en 0,1 ml 40 water werd bij 60°C 24 uur lang verhit. Na voltooiing van 8203874 t t ’·' . , -57- de reactie werd 5 ml water toegevoegd aan het reactiemeng-sel dat daarna werd gezuiverd op een manier die soortgelijk was aan die van voorbeeld I onder gebruikmaking van CM-Sephadex^ C-25 (Na-type) en Sephadex^ LH-20 zodat 5 werd verkregen 82/5 mg (37/1% opbrengst) van een wit poeder van N-/5- (3-aminopropyl) -aminobuty 1/-2- (5-guani-dinopentaanamido)-2-hydroxyethaanamidetrihydrochloride.

Voorbeeld III

10 Synthese van N-/*4- (3-aminopropyl) aminobuty 17- 2-(6-gnanidinohexaanamido)-2-hydroxyethaan-amide.

Een mengsel van 446 mg (2,14 mmol) 6-guanidino-hexaanamidehydrochloride, 750 mg (2,57 mmol) N-/5-(3-15 aminopropyl)aminobuty17-2,2-dihydroxyethaanamidedihydro-chloride, 283 mg (2,14 mmol) glutaarzuur en 0,45 ml water werd bij 60°C 24 uur lang verhit. Na voltooiing van de reactie werd 5 ml water toegevoegd aan het reactiemengsel en het ontstane mengsel werd gezuiverd op een manier die 20 soortgelijk was aan die in voorbeeld I onder gebruikmaking van CM-Sephadex^ C-25 (Na-type) en Sephadex^ LH-20 ter verkrijging van 459 mg (44% opbrengst) van een wit poeder van N-/5-(3-aminopropyl) aminobuty 1J7-2- (6-guanidino-hexaanamido)-2-hydroxyethaanamidetrihydrochloride.

25

Voorbeeld IV

Synthese van N-/3-(3-aminopropyl)aminobuty17- 2-(7-guanidinoheptaanamido)-2-hydroxyethaan-amide.

30 Een mengsel van 360 mg (1,62 mmol) 7-guanidino- heptaanamidehydrochloride, 568 mg (19,4 mmol) N-/4-(3-aminopropyl)aminobuty17-2,2-dihydroxyethaanamidedihydro-chloride, 214 mg (1,62 mmol) glutaarzuur, en 0,36 ml water werd bij 60°C 24 uur lang verhit. Na voltooiing van de 35 reactie werd 5 ml water toegevoegd aan het reactiemengsel en het ontstane reactiemengsel werd gezuiverd op een manier die soortgelijk was aan die in voorbeeld I onder gebruik- (R) (R) making van CM-Sephadex C-25 (Na-type) en Sephadex LH-20 ter verkrijging van 317 mg (39% opbrengst) van een 40 wit poeder van N-/5-(3-aminopropyl)aminobuty1/-2-(7-guani- 8203874 -58-

dinoheptaanamido)-2-hydroxyethaanamidetrihydroch.loride. Voorbeeld V

Synthese van N-/4- (3-aminopropyl) aminobuty17-5 2-(8-guanidinooctaanamido)-2-hydroxyethaan- amide.

Een mengsel van 500 mg (2,11 mmol) 8-guanidino-octaanamidehydrochloride, 740 mg (2,53 mmol) N-f\-(3-aminopropyl) aminobuty 1/-2,2-dihydroxyethaanamidedihydrochloride, 10 335 mg (2,53 mmol) glutaarzuur, en 0,34 ml water werd bij 60°C 24 uur lang verhit. Na voltooiing van de reactie werd 5 ml water toegevoegd aan het reactiemengsel en het ontstane mengsel werd gezuiverd op een manier die soort-gelijk was aan die in voorbeeld I onder gebruikmaking van 15 CM-Sephadex^ C-25 (Na-type) en Sephadex^ LH-20 ter verkrijging van 526 mg (49% opbrengst) van een wit poeder van N-/4-(3-aminopropyl)aminobutyl/-2-(8-guanidinooctaanamido) -2-hydroxyethaanamidetrihydrochloride.

20 Voorbeeld VI

Synthese van N-/5-(3-aminopropyl)aminobuty1/- 2-(9-guanidinononaanamido)-2-hydroxyethaan-amide.

Een mengsel van 316 mg (1,26 mmol) 9-guanidino-25 nonaanamidehydrochloride, 442 mg (1,51 mmol) N-/"4-(3-aminopropyl) aminobuty Ij7- 2,2-dihydroxyethaanamidedihydrochloride, 166 mg (1,26 mmol) glutaarzuur, en 0,01 ml water werd' bij 60°C 24 uur lang verhit. Na voltooiing van de reactie werd 5 ml water toegevoegd aan het reactiemengsel en het 30 mengsel werd gezuiverd op een manier die soortgelijk was aan die in voorbeeld I onder gebruikmaking van CM-Sephadex^ (R) C-25 (Na-type) en Sephadex 1 LH-20 ter verkrijging van 324 mg (49% opbrengst) van een wit poeder van N-/4-(3-amino-propyl) aminobutyl7“2-(9-guanidinononaanamide)-2-hydroxy-35 ethaanamidetrihydrochloride.

Voorbeeld VII

Synthese van N-/5-(3-aminopropyl)aminobuty1/- 2-(4-guanidinobutaanamido)-2-methoxyethaanamide.

40 Aan een oplossing van 45,5 mg (0,10 mmol) N- 8203874 V · ’ -59- /*4- (3-aminopropyl) aminobutyl7“2- (4-guanidinobutaanamide) - 2-hydroxyethaanamidetrihydrochloride in 1 ml watervrije methanol, werd 0,1 ml 2N zoutzuur methanol verkregen. Het mengsel werd bij kamertemperatuur 17 uur lang geroerd. Het 5 reactiemengsel werd geconcentreerd onder verminderde druk en opgelost in 3 ml water. De onstane oplossing werd ge- leid door een kolom (20 mm inwendige diameter) met een pakking van 150 ml CM-Sephadexv ' C-25 en gefractioneerd door de gradient eluering met elk 1 1 water en 1M waterige 10 natriumchloride-oplossing (17 ml fractiegrootte). De frac- ties No. 67 tot en met 71 die overeen kwamen met de zout- concentraties van 0,63-0,67M werden gecombineerd, tot droog ingedampt en drie maal met 5 ml methanol geextra- heerd. De methanollaag werd geleid door een kolom (20 mm (R) 15 inwendige diameter) met een pakking van 150 ml Sephadex LH-20 en ontwikkeld met methanol (7 ml fractiegrootte).

De fracties No. 10 tot en met 14 werden gecombineerd en tot droog ingedampt, ter verkrijging van 31,4 mg (67% opbreiigst) van een wit poeder van N-/"4-(3-amino-20 propyl)aminobutyl/-2-(4-guanidinobutaanamido)-2-methoxy-ethaanamidetrihydrochloride.

Voorbeeld VIII

Synthese van N-^-(3-aminopropyl)aminobuty 1/-25 2-(6-guanidinohexaanamido)-2-methoxyethaan- amide.

Aan een oplossing van 177 mg (0,37 mmol) van N-/4-(3-aminopropyl)aminobutyl/-2-(6-guanidinohexaan-amido)-2-hydroxyethaanamidetrihydrochloride in 3,6 ml 30 watervrije methanol, werd 0,36 ml 2N zoutzuur-methanol toegevoegd. Het mengsel werd bij kamertemperatuur 17 uur lang geroerd. Het reactiemengsel werd onder verminderde druk geconcentreerd en het ontstane witte poeder werd gezuiverd op een manier die soortgelijk was aan die in 35 voorbeeld VII onder gebruikmaking van CM-Sephadexv C-25 (Na-type) en Sephadex^ LH-20 ter verkrijging van 110 mg (60% opbrengst) van een wit poeder van N-^l-(3-aminopropyl)-aminobuty3J7-2-(6-guanidinohexaanamido)-2-methoxyethaan-amidetrihydrochloride.

40 8203874 1 ' *

’* . ’’ ' . -60-Voorbeeld IX

Synthese van ¢1-/4- (3-aminopropyl) aminobutyl7- 2-(7-guanidinoheptaanamido-2-methoxyethaan-amide.

5 Aan een oplossing van 920 mg (1,85 mmol) N- /5-(3-aminopropyl)aminobutyl/-2-(7-guanidinoheptaanamido)- 2-hydroxyethaanamidetrihydrochloride in 20 ml watervrije methanol, werd 2 ml 2N zoutzuur methanol toegevoegd.

Het mengsel werd 15 uur lang bij kamertemperatuur geroerd. 10 Het reactiemengsel werd geconcentreerd onder verminderde druk en de ontstane witte poeder werd opgelost in 15 ml water* De waterige oplossing werd ingesteld op een pH van 6 met IN waterige natriumhydroxydeoplossing, daarna geleid door een kolom (25 mm inwendige diameter) met een (R) 15 pakking van 300 ml CM-Sephadex C-25 (Na-type), en gefractioneerd door de gradient eluering met elk 2 1 water en 1M waterige natriumchloride-oplossing (fractiegrootte 17 ml). De fracties No. 138 tot en met 152 die overeen

kwamen met de natriumchlorideconcentraties van 0,59-0,65M

20 werden gecombineerd, tot droog ingedampt en twee maal met 10 ml methanol geextraheerd. De methanollaag werd geleid door een kolom (25 mm inwendige diameter) met een pakking (R) van 300 ml Sephadex ' LH-20, en ontwikkeld met methanol (fractiegrootte, 7 ml). De fracties No. 18 tot en met 25 32 werden gecombineerd en tot droog ingedampt, ter ver- krijging van 607 mg (64% opbrengst) van een wit poeder van 11-/¾- (3-aminopropyl) -aminobutyl7-2- (7-guanidinoheptaanamido) -2-methoxyethaanamidetrihydrochloride.

30 Voorbeeld X

Synthese van N-/4-(3-aminopropyl)aminobutyl/- 2-(8-guanidinooctaanamido)-2-methoxyethaan-amide.

Aan een oplossing van 220 mg (0,43 mmol) N-3 5 /¾- (3-aminopropyl) aminobutyl7“2·" (8-guanidinooctaanamido) - 2-hydroxyethaanamidetrihydrochloride in 4,4 ml watervrije methanol, werd 0,44 ml 2N zoutzuur methanol toegevoegd.

Het mengsel werd bij kamertemperatuur gedurende de nacht geroerd. Het reactiemengsel werd onder verminderde druk 40 geconcentreerd en de ontstane witte ,poeder werd gezuiverd 8203874 V . ‘ . -61- « op een manier, die soortgelijk was aan die in voorbeeld (T»\ VII onder gebruikmaking van CM-Sephadexv C-25 (Na-type) (R) en Sephadex LH-20 ter verkrijging van 195 rag (86% opbrengst) van een wit poeder van N-/4-(3-aminopropyl)-5 aminobuty1/-2-(8-guanidinooctaanamido)-2-methoxyethaan- araidetrihydrochloride.

Voorbeeld XI

Synthese van N-/4-(3-aminopropyl)aminobuty1/-10 2-(9-guanidinononaanamido)-2-methoxyethaan- araide.

Aan een oplossing van 160 mg (0,31 mmol) N- /4-(3-aminopropyl) aminobuty1/-2-(9-guanidinononaanamido)- 2-hydroxyethaanamidetrihydrochloride in 3,2 ml watervrije 15 methanol, werd 0,32 ml 2N zoutzuur methanol toegevoegd.

Het mengsel werd bij kamertemperatuur gedurende de nacht geroerd. Het reactiemengsel werd onder verminderde druk geconcentreerd en het ontstane witte poeder werd gezuiverd op een manier die soortgelijk was aan die in voorbeeld (R) 20 VII onder gebruikmaking van CM-Sephadex C-25 (Na-type) (R) en Sephadex LH-20 ter verkrijging van 107 mg (65% opbrengst) van een wit poeder van N-/4-(3-aminopropyl)-aminobuty2-(9-guanidinononaanamido)-2-methoxyethaan-amidetrihydrochloride.

25

Voorbeeld XII

Synthese van N-/4-(3-aminopropyl)aminobutyij- 2-(7-guanidinoheptaanamido)-2-ethoxyethaan-amide.

30 Aan 100 mg (0,20 mmol) N-/4-(3-aminopropyl)- aminobuty17-2-(7-guanidinoheptaanamido)-2-hydroxyethaanamide trihydrochloride, werd 10 ml watervrije ethanol en 1 ml watervrije ethanol verzadigd met gasvormig waterstof-chloride toegevoegd. Het mengsel werd bij kamertemperatuur 35 gedurende 24 uur lang geroerd. Het reactiemengsel werd gefiltreerd ter verwijdering van de onoplosbare stoffen en het filtraat werd geconcentreerd onder verminderde druk.

De ontstane witte poeder werd gezuiverd op een manier die soortgelijk was aan die in voorbeeld VII onder gebruik-40 making van CM-Sephadex^ C-25 (Na-type) en Sephadex^ 8203874 Λ t * -62- • t LH-20 ter verkrijging van 71 mg (68% opbrengst) van een wit poeder van N-/4-(3-aminopropyl)aminobuty1/-2-(7-guanidinoheptaanamido)-2-ethoxyethaanamidetrihydro-chloride.

5

Voorbeeld XIII

Synthese van N-/4-(3-aminopropyl)-aminobuty]/- 7-(7-guanidinoheptaanamido)-2-butoxyethaan-amide.

10 Aan 100 mg (0,2 mmol) N-^-iS-aminopropyl)- aminobuty]/-2-(7-guanidinoheptaanamido)-2-hydroxyethaan-amidetrihydrochloride, werd 10 ml n-butanol en 1 ml n-butanol verzadigd met gasvormig waterstofchloride toegevoegd. Het mengsel werd 2 dagen lang bij kamertempera-15 tuur geroerd. Het reactiemengsel werd gefiltreerd ter verwijdering van de onoplosbare stoffen en het filtraat (n-butanol-oplossing) werd drie maal met 5 ml water ge- extraheerd. De waterige laag werd geneutraliseerd met (R)

Amberlite IR-410 en geconcentreerd onder verminderde 20 druk. Het residu werd gezuiverd op een manier die soort-gelijk was aan die in voorbeeld VII onder gebruikmaking van CM-Sephadex ^ C-25 (Na-type) en Sephadex^ LH-20 ter verkrijging van 15 mg (13,5% opbrengst) van een wit poeder van N-/*4-(3-aminopropyl) aminobuty 1/-2-(7-guanidino-25 heptaanamido)-2-butoxyethaanamidetrihydrochloride.

Voorbeeld XIV

Synthese van N-/4-(3-aminopropyl)aminobutyl/- 2-(7-guanidinoheptaanamido)-2-(2-hydroxy)-30 ethoxyethaanamide.

Aan een oplossing van 100 mg (0,20 mmol) N-/- (3-aminopropyl)aminobutyl) -2-(7-guanidinoheptaanamide)- 2-hydroxyethaanamidetrihydrochloride in 5 ml ethyleen-glycol, werd 0,5 ml ethyleenglycol verzadigd met gas-35 vormige waterstofchloride,toegevoegd. Het mengsel werd gedurende de nacht bij kamertemperatuur geroerd. Na toe-voeging van 25 ml water werd het reactiemengsel ingesteld tot een pH van 6 met IN waterige natriumhydroxyde-oplos-sing en gezuiverd op een manier die soortgelijk was aan (R) 40 die in voorbeeld VII onder gebruikmaking van CM-Sephadex 8203874 . -63- (R) C-25 (Na-type) en Sephadex LH-20 ter verkrijging van 63 mg (58% opbrengst) van een wit poeder van N-/*4-(3-aminopropyl) aminobuty3,/-2- (7-guanidinoheptaanamido) -2-(2-hydroxy)ethoxyethaanamidetrihydrochloride.

5

Voorbeeld XV

Synthese van N-/4-(3-aminopropyl)aminobutyl/- 2-(7-guanidinoheptaanamido)-2-benzyloxyethaan-amide.

10 Aan 100 mg (0,20 mmol) N-/5-(3-aminopropyl)- aminobuty1/-2-(7-guanidinoheptaanamido)-2-hydroxyethaan- amidetrihydrochloride, werd 10 ml benzylalcohol en 1 ml benzylalcohol verzadigd met gasvormige waterstofchloride toegevoegd. Het mengsel werd bij kamertemperatuur 18 uur 15 lang geroerd. Het reactiemengsel werd gefiltreerd ter verwijdering van de onoplosbare stoffen en de benzylalcohol- laag werd drie maal met 5 ml water geextraheerd. De waterige (R) laag werd geneutraliseerd met Amberlite IR-410/ tot droog ingedampt, en gezuiverd op een manier die soortge-20 lijk was aan die in voorbeeld VII onder gebruikmaking van CM-Sephadex^ C-25 (Na-type) en Sephadex^ LH-20 ter verkrijging van 61 mg (52% opbrengst) van een wit poeder van N-/“4-(3-aminopropyl)aminobutyl7-2-(7-guanidinoheptaanamido)-2-benzyloxyethaanamidetrihydrochloride.

25

Voorbeeld XVI

Synthese van N-/4-(3-aminopropyl)aminobuty1/- 2-(7-guanidino-2-hepteenamido)-2-hydroxyethaan-amide.

30 Een mengsel van 234,5 mg (1,06 mmol) 7-guanidi- no-2-hepteenamidehydrochloride, 372,3 mg (1,27 mmol) N-/4-(3-aminopropyl)aminobutyl/-2,2-dihydroxyethaanamidedihy-drochloride, 140,4 mg (1,06 mmol) glutaarzuur, en 0,2 ml water werd bij 60°C 24 uur lang verhit. Na voltooiing van 35 de reactie werd het reactiemengsel gezuiverd op een manier die soortgelijk was aan die in voorbeeld I onder gebruikmaking van CM-Sephadex^ C-25 (Na-type) en Sephadex ^ LH-20 ter verkrijging van 244,6 mg (46,5% opbrengst) van een wit poeder van N-/4-(3-aminopropyl)aminobuty1/-2-(7-40 guanidino-2-hepteenamido)-2-hydroxyethaanamidetrihydro- 8203874 « t * '.· . '· -64- chloride .

Voorbeeld XVII

Synthese van N-/4-(3-aminopropyl)aminobutyl7-5 2-(8-guanidino-2-octeenamido)-2-hydroxyethaan- amide.

Een mengsel van 202,4 mg (0,86 mmol) 8-guanidino- 2-octeenamidehydrochloride, 302,4 mg (1,04 mmol) Ν-/ϊ-(3-aminopropyl)aminobutyl7~2,2-dihydroxyethaanamidedihydro-10 chloride, 113,9 mg (0,86 mmol) glutaarzuur, en 0,2 ml water werd bij 60°C 24 uur lang verhit. Na voltooiing van de reactie werd het reactiemengsel gezuiverd op de manier die soortgelijk was aan die in voorbeeld I onder gebruikmaking van CM-Sephadex^ C-25 (Na-type) en Sephadex^ LH-20 15 ter verkrijging van 128,3 mg (29,2% opbrengst) N-/“4-(3-aminopropyl)aminobutyl7-2-(8-guanidino-2-octeenamido)-2-hydroxyethaanamidetrihydrochloride.

Voorbeeld XVIII

20 Synthese van N-/4-(3-aminopropyl)aminobutyl7~ 2-(9-guanidino-2-noneenamido)-2-hydroxyethaan-amide.

Een mengsel van 206,2 mg (0,84 mmol) 9-guanidi- no-2-noneenamidehydrochloride, 291,0 mg (1,00 mmol) 25 N-/4-(3-aminopropyl)aminobutyl7-2,2-dihydroxyethaanamide- dihydrochloride, 109,6 mg (0,84 mmol) glutaarzuur, en 0,2 ml water werd bij 60°C 24 uur lang verhit. Na voltooiing van de reactie werd het reactiemengsel gezuiverd op een manier die soortgelijk was aan die in voorbeeld I onder (R) 30 gebruikmaking van CM-Sephadex C-25 (Na-type) en Sephadex^ LH-20 ter verkrijging van 135,0 mg (31,1% opbrengst) van een wit poeder van N-{%-(3-aminopropyl)-aminobutyl7-2-(9-guanidino-2-noneenamide)-2-hydroxyethaan-amidetrihydrochloride.

35

Voorbeeld XIX

Synthese van N-fA-(3-aminopropyl)aminobuty1/- 2-(7-guanidino-2-hepteenamido)-2-methoxyethaan-amide.

40 ' Aan een oplossing van 50,3 mg (0,10 mmol) N-^-

<5 * ft *? ft "? I

U c U 0 / -t V '’· -65- (3-aminopropyl)aminobutyl7-2-(7-guanidino-2-hepteenamido)- 2-hydroxyethaanamidetrihydrochloride in 1 ml watervrij methanol, werd 0,1 ml 2N zoutzuur methanol toegevoegd.

Het mengsel w£rd gedurende de nacht bij kamertemperatuur 5 geroerd en het reactiemengsel werd onder verminderde druk geconcentreerd. Het residu werd gezuiverd op een manier soortgelijk aan die in voorbeeld VII onder gebruikmaking van CM-Sephadex^ C-25 (Na-type) en Sephadex^ LH-20 ter verkrijging van 37,2 mg (72,4% opbrengst) N-/3-(3~ 10 aminopropyl)-aminobutyl7-2-(7-guanidino-2-hepteenamido)- 2- methoxyethaanamidetrihydrochloride.

Voorbeeld XX

Synthese van N-/“4- (3-aminopropyl) aminobutyl/-15 2-(8-guanidino-3-hydroxyoctaanamido)-2-hydro- xyethaanamide.

Een mengsel van 150 mg (0,59 mmol) 8-guanidino- 3- hydroxyoctaanamidehydrochloride, 208 mg (0,71 mmol) N-/4-(3-aminopropyl)aminobutyl7-2,2-dihydroxyethaanamide- 20 dihydrochloride, 78 mg (0,59 mmol) glutaarzuur en 0,1 ml water werd bij 60°C 24 uur lang verhit. Na voltooiing van de reactie werd het reactiemengsel gezuiverd op een manier die soortgelijk was aan die in voorbeeld I onder (R) gebruikmaking van CM-Sephadex C-25 (Na-type) en (IS.) 25 Sephadex hH-20 ter verkrijging van 120,7 mg (38,6% opbrengst) van een wit poeder van N-/4-(3-aminopropyl) aminobuty47-2-(8-guanidino-3-hydroxyoctaanamido)-2-hydroxyethaanamidetrihydrochloride.

30 Voorbeeld XXI

Synthese van N-/4-(3-aminopropyl)aminobutyl/- 2-(9-guanidino-3-hydroxynonaanamido)-2-hydroxy-ethaanamide.

Een mengsel van 325,8 mg (1,23 mmol) guanidino-35 3-hydroxynonaanamidehydrochloride, 428,1 mg (1,47 mmol) N-/4-(3-aminopropyl)aminobuty1/-2,2-dihydroxyethaanamide-dihydrochloride, 161,4 mg (1,23 mmol) glutaarzuur en 0,3 ml water werd bij 60°C 24 uur lang verhit. Na voltooiing van de reactie werd het reactiemengsel gezuiverd op een manier 40 die soortgelijk was aan die in voorbeeld I onder gebruik- 8203874 * ' .

** , ’ ’ , -66- fRl iRi making van CM-Sephadexv ' C-25 (Na-type) en Sephadex LH-20 ter verkrijging van 220,8 mg (33,4% opbrengst) van een wit poeder van N-/4-(3-aminopropyl)aminobutylj- 2-(9-guanidino-3-hydroxynonaanamido)-2-hydroxyethaanamide- 5 trihydrochloride.

Voorbeeld XXII

Synthese van 11-0-methylspergualin.

Aan een oplossing van 1,8 g (3,51 mmol) (-)- 10 spergualintrihydrochloride in 35 ml watervrije methanol, werd 3,5 ml 2N zoutzuur methanol toegevoegd. Het mengsel werd bij kamertemperatuur 15 uur lang geroerd. Het reac- tiemengsel werd ingedampt tot droog, daarna opgelost in (R) 30 ml water, geleid door een kolom van CM-Sephadex 15 C-25 (Na-type; 600 ml) en gefractioneerd door de gradient eluering met elk 3 1 water en 1M waterige natriumchloride-oplossing (fractiegrootte, 17 g). De fracties No. 208 tot en met No. 230 werden gecombineerd, tot droog ingedampt, en 3 maal met 0)0 ml methanol geextraheerd. De (R) 20 methanollaag werd geleid door een kolom van Sephadex LH-20 (300 ml) en geelueerd met methanol teneinde ontzou-ting tot stand te brengen (fractiegrootte, 7 g). De fracties No. 19 tot en met 33 werden gecombineerd en ingedampt tot droog ter verkrijging van 1,528 g (82% opbrengst) 25 van een wit poeder van 11-O-methylspergualintrihydro-chloride.

Voor de afscheiding van 11-O-methylspergualin trihydrochloride in zijn epimerische componenten werd ge- bruik gemaakt van HPLC op een kolom, 2 cm φ x 25 cm, (R) 30 met een pakking van Nucleosil 30Cl8, een omgekeerde fase pakkingmateriaal van M.Nagel Co., onder de volgende omstandigheden:

Stroomsnelheid: 10 ml/min.

Druk : 30 kg/cm^ 35 Oplosmiddel : acetonitril-/0,01M natriumpen- taansulfonaat + 0,01M Na2HPO (pH3)/ = 9:91 Belading : 6 mg

Detectie : UV 205 nm 40 In HPLC verscheen de UV absorptiepiek voor 8203874 . -67- (-)-11-0-methylspergualin (retentie tijd, 48,,3 min.) het eerst en die voor (+)-11-O-methylspergualin (reten-tietijd, 56,5 min.) volgde. De fractionering werd 12 maal herhaald. De fracties die overeenkwamen met elke 5 piek werden verzameld en gezuiverd op een manier die soort-gelijk was aan die in voorbeeld I onder gebruikmaking van CM-Sephadex ^ C-25 (Na-type) en Sephadex^ LH-20 ter verkrijging van 32,9 mg van een wit poeder van (-)-11-0-methylspergualintrihydrochloride en 24,5 mg 10 van een wit poeder van (+)-11-0-methylspergualintrihydro-chloride.

Voorbeeld XXIII

Synthese van 11-O-ethylspergualin.

15 Aan 484 mg (0,94 mmol) spergualindihydrochloride

/(-)-spergualin: (+)-spergualin = 1:1// werd 20 ml watervrij ethanol en 2 ml 2N zoutzuur ethanol toegevoegd. Het mengsel werd 2 dagen lang bij kamertemperatuur geroerd. Het reactiemengsel werd tot droog ingedampt, daarna opge-20 lost in 10 ml water, ingesteld op een pH van 4 met IN

waterige natriumhydroxyde-oplossing, en gezuiverd op in wezen dezelfde manier als in voorbeeld XXII onder ge- (R) (R) bruikmaking van CM-Sephadex ' C-25 (Na-type) en Sephadex H-20, zodat 355,6 mg (70% opbrengst) van een wit poeder 25 van 11-O-ethylspergualintrihydrochloride werd verkregen.

Voor de afscheiding van het 11-O-ethylspergualin- trihydrochloride in zijn epimerische componenten werd ge- bruik gemaakt van HPLC op in wezen dezelfde manier als in voorbeeld XXII, behalve dat het gebruikte oplosmiddel 30 een mengsel van acetonitri1-/0,10M natriumpentaansulfo- naat + 0,01M Νη2ΗΡ0^ (pH 3)] (10:5:89:5) was. Bij herhaal- de fractionering, 6 maal in totaal werd verkregen 11 mg van een wit poeder van (-)-11-0-ethylspergualintrihydro- chloride en 14,5 mg van een wit poeder van (+)-11-0-ethyl- 35 spergualintrihydrochloride.

Voorbeeld XXIV

Synthese van 11-O-n-butylspergualin.

Aan 493 mg (0,96 mmol) van (-)-spergualintri-40 hydrochloride werd 30 ml n-butanol en 3 ml n+butariol ver- 8203874 ./ -68- ♦ I i zadigd met waterstofchloride toegevoegd. Het mengsel werd 2 dagen lang bij kamertemperatuur geroerd. Het in n-buta-nol oplosbare gedeelte van het reactiemengsel werd tot droog ingedampt, daarna opgelost in 10 ml water, ingesteld 5 op een pH van 4 met IN waterige natriumhydroxydeoplossing, en gezuiverd met CM-Sephadex' ' C-25 (Na-type) en Sephadex'·"' LH-20 op in wezen dezelfde manier als in voorbeeld XXII ter verkrijging van 114,7 mg (21% opbrengst) van een wit poeder van 11-O-n-butylspergualintrihydrochloride.

10 Voor de scheiding van 11-0-n-butylspergualin- trihydrochloride in zijn epimerische componenten werd ge-bruik gemaakt van HPLC op in wezen dezelfde manier als in voorbeeld XXII, behalve dat het gebruikte oplosmiddel een mengsel was van acetonitril-/0,01M natriumpentaan-15 sulfonaat + 0,01M Na2HP04 (pH 3)J (14:5:85:5) was. Bij herhaalde fractionering, 6 maal in totaal, werd 15 mg van een wit poeder van (-)-11-O-n-butylspergualintrihy-drochloride en 16 mg van een wit poeder van (+)-ll-0-n-butylspergualintrihydrochloride.verkregen.

20

Voorbeeld XXV

Synthese van 11-0-(2-hydroxy)ethylspergualin.

Aan een oplossing van 2,88 g (5,61 mmol) van (-)-spergualintrihydrochloride in 100 ml ethyleenglycol, 25 werd 10 ml ethyleenglycol verzadigd met waterstofchloride toegevoegd. Het mengsel werd 24 uur lang bij kamertemperatuur geroerd. Na toevoeging van 200 ml water werd het reactiemengsel ingesteld op een pH van 4 met IN waterige (R) natriumhydroxyde-oplossing, en gezuiverd met CM-Sephadex (R\ 30 C-25 (Na-type) en Sephadex LH-20 op dezelfde manier als in voorbeeld XXII ter verkrijging van 2,7 g (73% opbrengst) van een wit poeder van 11-0-(2-hydroxy)ethylspergualin-trihydrochloride.

Voor de scheiding van het 11-0-(2-hydroxy)-35 ethylspergualintrihydrochloride in zijn epimerische componenten werd gebruik gemaakt van HPLC zoals in voorbeeld XXII, behalve dat het oplosmiddel en de belading als volgt waren:

Oplosmiddel: acetonitril-/0,01M natriumpentaan-40 sulfonaat + 0,01M Ν32ΗΡ04 (pH 3)J

8203874 V .·'·' -69- (7:93)

Belading : 20 mg

Bij herhaalde fractionering, 6 maal in totaal werd verkregen 2,3 mg van een wit poeder van (-)-11-0-5 (2-hydroxy)ethylspergualintrihydrochloride en 2,5 mg van een wit poeder van (+)-11-0-(2-hydroxy)ethylspergua-lintrihydrochloride.

Voorbeeld XXVI

10 Synthese van 11-0-benzylspergualin.

Aan 2,36 g (4,60 mmol) van (-)-spergualintri-hydrochloride werd 90 ml benzylalcohol en 9 ml benzylalco-hol verzadigd met waterstofchloride, toegevoegd. Het mengsel werd gedurende de nacht bij kamertemperatuur ge-15 roerd. Het reactiemengsel werd geextraheerd met 350 ml water en de waterige laag werd ingesteld op een pH van 6,0 met IN waterige natriumhydroxydeoplossing en tot droog geconcentreerd. Het residu werd opgelost in 20 ml 1M waterige natriumchloride-oplossing, geleid door een 20 kolom van 500 ml Diaion^ HP120 (Mitsubishi Chemical Co.) en achtereenvolgens geelueerd met elk 1,5 1 0,6M zouthou-dend water, 0,4M zouthoudend water en water. Het met water geelueerde gedeelte werd tot droog ingedampt en fR) ontzout met Sephadex^ LH-20 zoals in voorbeeld I ter 25 verkrijging van 1,92 g (69% opbrengst) van een wit poeder van 1.1-0-benzylspergualintrihydrochloride.

Voor de scheiding van 11-0-benzylspergualintri-hydrochloride in zijn epimerische componenten wordt ge-bruik gemaakt van HPLC dat werd uitgevoerd op dezelfde 30 manier als in voorbeeld XXII, behalve dat het gebruikte oplosmiddel een mengsel was van acetonitril-/O,01M natriumpentaansulfonaat + 0,.01M NajHPO^ (ph 3)] (16:84). Bij herhaalde fractionering, 9 maal in totaal werd verkregen 21,2 g van een wit poeder van (-)-11-O-benzyl-35 spergualintrihydrochloride en 18,8 g van een wit poeder van (+)-11-O-benzylspergualintrihydrochloride.

Voorbeeld XXVII

Synthese van (-)-11-O-methylspergualin.

40 Co) (-)-l-N,4-bis(benzyloxycarbonyl)spergualin: 8203874 < ·' -70- ( ι

Aan een oplossing van 2,3 g (4,48 mmol) van (-)-spergualintrihydrochloride in een mengsel van 11 ml Ν,Ν-dimethylformamide en 11 ml water, werd, terwijl werd gekoeld in ijs, 1,25 ml (8,96 mmol) triethylamine toege-5 voegd, hetgeen werd gevolgd door een oplossing van 2,24 g (8,97 mmol) N-benzyloxycarbonyloxysuccimide in 11 ml Ν,Ν-dimethylformamide. Het mengsel werd bij 5°C 15 uur lang geroerd. Het reactiemengsel werd onder verminderde druk geconcentreerd, opgelost in 10 ml 0,5M waterige 10 natriumchloride-oplossing, daarna geleid door een kolom (R) van Diaion HP-20 in evenwicht met 0,5M waterige natriumchloride-oplossing, gewassen met 11 0,5M zouthoudend water, daarna met 1 1 water, en geelueerd met methanol (fractiegrootte, 15 g). De fracties No. 21 tot en met 30 15 werden gecombineerd en tot droog ingedampt ter verkrij-ging van 287 mg (82% opbrengst) van een wit poeder van (-)-l-N,4-bis(benzyloxycarbonyl)spergualinhydrochloride;

2| Q

- 11 (Cl, water) .Proton NMR (in deuteromethanol) , S: 1,3 - 2,0 (CH2x6), 2,38 (CH2), 2,9-3,4 (NCH2x5), 20 4,0 (CH), 5,04 (CH2), 5,07 (CH2), 5,56 (CH), 7,30 (CgH5x2) (b) (-)-l-N,4-bis(benzyloxycarbonyl)-11-O-methyl-spergualin:

Aan een oplossing van 78 mg (0,484 mmol) van 25 het bovengenoemde (-)-l-N,4-bis(benzyloxycarbonyl)- spergualinhydrochloride in 12 ml methyleenchloride werd, * terwijl in ijs werd gekoeld, 2,44 ml (0,484 mmol) van een oplossing van 0,1 ml boriumtrifluoride-ethercomplex in 4 ml methyleenchloride toegevoegd. Aan het mengsel werd 30 portiegewijs 9 ml (1 ml met een tijdsinterval van 30 min.

tot 1 uur) van een oplossing van diazomethaan in methyleenchloride toegevoegd. /be diazomethaan-oplossing werd be-reid door geleidelijk 10 g N-nitrosomethylureum toe te voegen aan een mengsel van 30 ml van een 40%'s kalium-35 hydroxyde-oplossing en 100 ml methyleenchloride terwijl gekoeld werd bij 40°C in water; De organische laag af te scheiden en de waterige laag te extraheren met 10 ml methyleenchloride; De organische lagen te combineren en 3 uur lang boven korrelig kaliumhydroxyde bij 5°C te drogen.J 40 Na 3,5 uur vanaf het begin van de reactie werd het roeren 8203874 1 ( v . ' ’ , ^ -71- stopgezet. Na toevoeging van verscheidene druppels verdund azijnzuur werd het reactiemengsel geconcentreerd onder verminderde druk, daarna opgelost in 3 ml 50%'s waterige (R) methanol, geleid door een kolom van Diaionv HP120 5 (100 ml), gewassen met 300 ml 10%'s waterige methanol, en geelueerd met methanol (fractiegrootte, 15 ml). De fractie No.25 tot en met 28 werden gecombineerd en tot droog ingedampt ter verkrijging van 262,4 mg van een wit poeder van een mengsel van (-)-l-N,4-bis(benzyloxycarbonyl)-10 11-0-methylspergualinhydrochloride en niet gereageerd hebbend (-)-l-N,4-bis(benzyloxycarbonyl)spergualinhydrochloride (terugwinning, 69,2 gew.%). De samenstelling van dit mengsel werd bepaald door HPLC op een kolom van (R)

Nucleosil ^ci8 (4,0 x ^0 n®1)» geelueerd met een meng- 15 sel (1:1) van acetonitril en 0,01M (NH^^HPO^ bij een stroomsnelheid van 0,8 ml/min. Gevonden werd dat de ver- houding tussen (-)-l-N,4-bis(benzyloxycarbonyl)-11-0- methylspergualinhydrochloride (retentietijd, 10,47 min.) en (-)-l-N,4-bis(benzyloxycarbonyl)spergualinhydrochloride 20 (retentietijd, 7,74 min.) 47:50 bedroeg.

Het bovengenoemde mengsel (78,5 mg) werd geleid (R) door een kolom van 30 ml Silicagel 60 (Merck Co.) en geelueerd met een 10%1s methanol-chloroformmengsel. Het eluaat werd gezuiverd door HPLC en uitgevoerd onder de-25 zelfde omstandigheden als boven beschreven zijn. De fractie, die een UV absorptie bij 220 nm bij een retentietijd van 10,47 min. vertoonden, werden opgevangen en ingedampt tot droog, zodat 28,6 mg werd verkregen van een wit poeder van (-)-l-N,4-bis(benzyloxycarbonyl)-11-O-methyl- ΛΓ· 30 spergualinhydrochloride. -14,4° (Cl, methanol).

Proton NMR (in deuteromethanol), S' 1,3-2,0 (CH2X6), 2,42 (CH2), 2,9-3,4 (NCH2x5), 3,37 (0CH3), 4,0 (CH), 5,03 (CH2), 5,08 (CH2) , 5,34 (CH) , 7,29 (CgH^) .

(c) (-)-11-0-methylspergualin: 35 In een mengsel van 5 ml ethanol werd 5 ml water en 0,36 ml IN zoutzuur, opgelost in 130 mg van het bovengenoemde mengsel (47:50) van (-)-l-N,4-bis(benzyloxycarbonyl) -11 -O-methylspergualinhydrochloride en (-)-l-N,4-bis(benzyloxycarbonyl)spergualinhydrochloride. Na toevoe-40 ging van 50 ml 10%'s palladiumkoolstof aan de oplossing 8203874 ' ’ r -72- werd het mengsel 4 uur lang bij kamertemperatuur onder een waterstofstroom geroerd. De katalysator werd door fil- tratie verwijderd en het filtraat werd ingedampt tot droog.

Het residu werd opgelost in 3 ml water, geleid door een (R) 5 kolom van 150 ml CM-Sephadex .025 (Na-type) en gefrac- tioneerd door de gradient eluering met elk 900 ml water en 1M waterige natriumchloride-oplossing (fractiegrootte, 17 g). De fracties No. 76 tot en met 81 werden gecombi- neerd en ontzout zoals in voorbeeld XXII, onder gebruik- (R) 10 making van Sephadex LH-20 ter verkrijging van 25,4 mg (51% opbrengst) van een wit poeder van (-)-11-0-methyl- 25 o spergualintrihydrochloride? -27,1 (Cl, water).

De fracties No. 83 tot en met 86 van het eluaat (R) uit de CM-Sephadex kolom werden op soortgelijke wijze 15 ontzout ter terugwinning van 24,5 mg (52% terugwinning) van een wit poeder van (-)-spergualintrihydrochloride.

Voorbeeld XXVIII

Synthese van (-)-11-0-ethylspergualin.

20 Op een manier soortgelijk aan die in voorbeeld XXVII (b) liet men een methyleenchloride-oplossing van diazoethaan reageren met 352 mg (0,451 mmol) van het in voorbeeld XXVII (a) verkregen (-)-l-N,4-bis(benzyloxy-carbonyl)spergualinhydrochloride ter verkrijging van 217,0 25 mg van een mengsel van (-)-l-N,4-bis(benzyloxycarbonyl)- 11-0-ethylspergualinhydrochloride en niet gereageerd heb-bend (-)-1-N,4-bis(benzyloxycarbonyl)spergualinhydrochloride. Het mengsel werd op in wezen dezelfde manier als in voorbeeld XXVII (c) behandeld ter verkrijging van 30 41,7 mg van eenwit poeder van (-)-11-0-ethylspergualin- trihydrochloride in een totale opbrengst van 17,1%; -24,8° (Cl, water).

Voorbeeld XXIX

35 Synthese van (-) -N-^- (3-aminopropyl) aminobuty§- 2-(7-guanidinoheptaanamido)-2-methoxyethaan-amide.

(a) (-)-Ν-/Ϊ-(3-benzyloxycarbonylaminopropyl)-benzyloxycarbonylaminobutyl_7-2- (7-guanidino-40 2-hepteenamido)-2-methoxyethaanamide: 8203874 » Γ ' '· -73- ι

In 1,2 ml Ν,Ν-dimethylformamide werd opgelost 134,8 mg (0,187 mmol) van het in voorbeeld XXVII (b) verkregen (-)-l-N,4-bis-(benzyloxycarbonyl)-ll-0-methyl-spergualinhydrochloride. Aan de oplossing werd toegevoegd 5 192,9 mg (0,935 mmol) dicyclohexylcarbodiimide en 5,6 mg koperchloride (CuCl). Het mengsel werd 3 uur lang bij 70°C verhit. Na afkoeling werd het neerslag door filtratie ver-wijderd en het filtraat werd onder verminderde druk geconcentreerd. Het residu werd in 5 ml 30%'s waterig metha- 10 nol opgelost, ingesteld op een pH van 7, geleid door een (R) kolom (80 ml) van Diaion HP120, gewassen met 300 ml water, daarna met 300 ml 10%'s waterig methanol, en geelu-eerd met methanol. Fracties die positief waren ten opzichte van de Sakaguchi-reactie werden opgevangen en geconcentreerd 15 onder verminderde druk ter verkrijging van 114 mg ruw (-)-N-/4-(3-benzyloxycarbonylaminopropyl)benzyloxycarbo-nylaminobutyl7-2-(7-guanidino-2-hepteenamido)-2-methoxy-ethaanamidehydrochloride hetgeen een signaal vertoonde van een alkeen proton bij ζ 6,02 in proton NMR spectrum 20 (in deuteromethanol).

(b) (-) -N-/"4- (3-aminopropyl) aminobuty 3^7-2- (7-guanidinoheptaanamido)-2-methoxyethaan-amide:

In een mengsel van elk 5 ml methanol en water 25 werd opgelost 114 mg van het hierboven in (a) verkregen ruwe (-)-N-Z£-(3-benzyloxycarbonylaminopropyl)benzyloxy- carbonylaminobutyl7-2-(7-guanidino-2-hepteenamido)-2- methoxyethaanamidehydrochloride. Aan de ontstane oplossing werd toegevoegd 0,32 ml IN zoutzuur en 50 mg 10%’s palla- 30 dium-koolstof. Het mengsel werd 1,5 uur lang bij kamer- temperatuur onder een waterstofstroom geroerd. De kataly- sator werd door filtratie verwijderd en het filtraat werd onder verminderde druk geconcentreerd. Het residu werd ge- (R) leid door een kolom van 100 ml CM-Sephadex ' C-25 (Na- 35 type) en gefractioneerd door de gradient eluering met elk 500 ml water en 1M waterige natriumchloride-oplossing (fractiegrootte, 10 g). De fracties No. 69 tot 74 werden gecombineerd, onder verminderde druk geconcentreerd, en drie maal met 5 ml methanol geextraheerd. De methanollaag (R) 40 werd geleid door een kolom (150 ml) van Sephadex LH-20 8203874 -74- r J t r ' .

en geelueerd met methanol teneinde ontzouting tot stand te brengen (fractiegrootte, 5 g). De fracties No. 16 tot en met 121 werden gecombineerd en tot droog ingedampt ter •verkrijging van 17,4 mg van een wit poeder van (-)-N-/*4-5 (3-aminopropy1)aminobuty ij-2-(7-guanidinoheptaanamido) - 2-methoxyethaanamidetrihydrochloride; totaal-opbrengst 16,7%; /Vq5 -30,4° (Cl, water).

-conelusies- 8203874

Claims (9)

1. Verbinding, gekenmerkt doordat zij N-/4-(3-aminopropyl)aminobutyl7-2-(w-guanidinovetzuuramido)-2-gesubstitueerd-ethaanamide is, dat is weergegeven door de algemene formule 1 van het formuleblad, waarin Y voorstelt 5 de groep met de formule lg, lh of Ij van het formuleblad, R voorstelt een waterstofatoom, een alkylgroep met 1 tot en met 4 koolstofatomen, die een hydroxylgroep als substituent kan bevatten, of een benzylgroep, en n een geheel getal is van 1 tot en met 8, met dienverstande dat, wanneer Y is de 10 groep met de formule lj van het formuleblad en n is 4, R voorstelt de groepen anders dan het waterstofatoom; of een zout daarvan.

2. Verbinding of een zout daarvan volgens conclusie 1, 15 gekenmerkt doordat R is een waterstofatoom of een alkylgroep met 1 of 2 koolstofatomen die een hydroxylgroep als substituent kunnen bevatten en n een geheel getal van 4 tot en met 6 is. 20

3.Verbinding of een zout daarvan volgens conclusie 1, g e k e n m e r k t doordat R een waterstofatoom of methylgroep is en n een geheel getal van 4 of 6 is.

4. Verbinding, g ekenmerkt door N-/£-(3-aminopropyl)-25 aminobutyl7-2-(7-guanidinoheptaanamido)-2-methoxyethaanamide of een zout daarvan.

5. Verbinding, gekenmerkt door N-/3-(3-aminopropyl)-aminobuty1/-2-(7-guanidino-2-hepteenamido)-2-methoxyethaan-amide of een zout daarvan.

6. Verbinding, gekenmerkt door N-/4-(3-aminopropyl)-aminobutyl/-2-(7-guanidino-3-hydroxyheptaanamido)-2-methoxy-ethaanamide of een zout daarvan. 8203874 » ' I . f ' -76-

7. Verbinding, gekenmerkt doorN-^i-(3-aminopropyl)-aminobutyl/-2-(9-guanidinononaanamido)-2-methoxyethaanamide of een zout daarvan. 5

8.Verbinding, gekenmerkt door N-/4-(3-aminopropyl)-aminobutyl/-2- (7-guanidinoheptaanamido) -2-hydroxyethaanamide of een zout daarvan.

9 .Verbinding, gekenmerkt door N-/H-(3-aminopropyl)-10 aminobuty1/-2-(9-guanidinononaanamido)-2-hydroxyethaanamide of een zout daarvan. lO.Werkwijze voor het bereiden van een verbinding, met het kenmerk, dat men N-/"4-(3-aminopropyl)-aminobu-15 ty 1/-2- (uj-guanidinovetzuur-amido) -2-gesubstitueerdethaanamide, weergegeven met de algemene formule 1 van het formuleblad waarin Y voorstelt een groep met de formule lg, lh of lj van het formuleblad, R voorstelt een waterstofatoom, een alkyl-groep met 1 tot en met 4 koolstofatomen, die een hydroxyl-20 groep als substituent kan bevatten, of een benzylgroep, en n een geheel getal van 1 tot en met 8 is, met dienverstande, dat wanneer Y een groep met de formule lj van het formuleblad is en n 4 is, R de groepen anders dan het waterstofatoom voorstelt, bereidt, doordat men 25 (a) een UA-guanidinovetzuuramide voorgesteld door de alge mene formule 2 van het formuleblad, waarin Y en n zijn zoals boven gedefinieerd, condenseert met N-<T4~ (3-aminopropyl) amino-butyl/- 2,2-dihydroxyethaanamide weergegeven met de formule 3 van het formuleblad, of 30 (b) een w-guanidinovetzuuramide weergegeven met de alge mene formule 2 van het formuleblad waarin Y en n zijn zoals boven gedefinieerd, condenseert met N-/4-(3-aminopropyl)amino-butyl/- 2,2-dihydroxyethaanamide weergegeven met de formule 3, van het formuleblad, condenseert ter vorming van een N-,A-(3-35 aminopropyl) aminobutyl/-2- (u>-guanidinovetzuuramido)-2-hydroxyethaanamide weergegeven met de algemene formule la van het formuleblad waarin n en Y zijn zoals boven gedefinieerd, daar-na, na bescherming van de amino en iminogroep als dat noodza-kelijk is, de verbinding met formule la van het formuleblad 40 laat -reageren met een mono- of di-hydrisch alifatisch alcohol 8203874 » - ί ν , ‘ ' i -77- met 1 tot en met 4 koolstofatomen, een diazoalkaan met 1 tot en met 4 koolstofatomen/ of een benzylalcohol en als zij aanwezig zijn, de beschermende groepen verwijdert. 5 ll.Werkwijze voor het bereiden van een verbinding, met het k e n m e r k, dat men een verbinding N-/4-(3-amino-propyl) -aminobuty 1/-2- (ω-guanidinovetzuuramido) -2-alkoxy-ethaanamide weergegeven met de algemene formule lb van het formuleblad waarin Y voorstelt een groep met de formule lg, 10 lh of Ij van het formuleblad/ R' voorstelt een alkylgroep met 1 tot en met 4 koolstofatomen, die een hydroxylgroep als substituent kan bevatten, of een benzylgroep, en n een geheel getal van 1 tot en met 8 is, of een zout daarvan, doordat men een N-/£- (3-aminopropyl) aminobuty 1/-2- 6-u-guani-15 dinovetzuuramido)-2-hydroxyethaanamide, weergegeven door de algemene formule la van het formuleblad, waarin Y en n zijn zoals boven gedefinieerd, of een zout daarvan, na bescher-ming van de amino en iminogroepen als dat noodzakelijk is, laat reageren met een mono- of dihydrisch alifatisch alcohol 20 met 1 tot en met 4 koolstofatomen, diazoalkaan van 1 tot en met 4 koolstofatomen, of een benzylalcohol,en, als zij aanwezig zijn, de beschermende groepen verwijdert. 8203874