DK154841B - Fremgangsmaade til fremstilling af membranproteiner ud fra neisseria meningitidis - Google Patents

Description

Opfindelsen angår en forbedret fremgangsmåde til.fremstilling af membranproteiner ud fra Neisseria meningi¬tidis.

Fremkalderen af meningitis cerebrospinalisepidemica er Neisseria meningitidis, også kaldet Meningo¬coccus. Den ved dråbeinfektion overførbare nakkestivhedeller hjernehindebetændelse optræder først og fremmesthos børn og andre personer i tæt beboede områder. Derer således et behov for at kunne immunisere udsatte per¬songrupper.

Ifølge foreliggende erkendelser er det vigtig¬ste membranprotein ("Major outer Membrans protein") fraNeisseria meningitidis i stand til at inducere bacteri¬cide antistoffer. Disse frembyder en serologisk typespeci¬fik beskyttelse mod sygdommen. Andre bestanddele afNeisseriae, især kapselpolysacchariderne af Neisseriaeaf gruppe A og C, kan tilvejebringe en gruppespecifikbeskyttelse. De inducerer imidlertid ikke en virksombeskyttelse mod Neisseriae af gruppe B. Der findes hel¬ler ingen angivelser om, at kapselpolysaccharidet afgruppe B kan inducere en sådan beskyttelse. Herefterer membranproteinerne af Neisseria meningitidis af grup¬pe B af særlig interesse.

Til fremstilling af en vaccine er det nødven¬digt at udvinde membranprotein fra Neisseria meningi¬tidis gruppe B i tilstrækkelig mængde. Den af Frasch iBact., 127, 973-981 (1976) beskrevne metode fører tilet brugbart præparat. Udbyttet ved denne metode liggerimidlertid ved den nedre, økonomisk forsvarlige grænse.Metoden ifølge Frasch består i, at man først vaskerkim af Neisseria meningitidis med saltopløsninger(CaC^- eller LiCl-opløsninger) , hvorpå ekstrakten be¬handles med desoxychol'at. Som allerede nævnt fører den¬ne metode imidlertid til et dårligt udbytte.

Ifølge en i.J. Infect. Dis., 137,728-739 (1978)beskreven fremgangsmåde frigøres det ydre membrankompleksved indvirkning af forskydningskræfter fra kimene ogrenses derpå yderligere ved gelchromatografi i nærværelseaf desoxycholat. Denne besværlige fremgangsmåde giverligeledes kun et dårligt udbytte af membranproteiner.

Det har nu ifølge opfindelsen overraskende vistsig, at udbyttet kan forøges væsentligt, når kimmassenunderkastes en direkte behandling med detergenter.

Eftersom indvirkningen af detergenter på kimene afNeisseria meningitidis fører til en opbrydning af kimene,måtte fagmanden forvente, at man på denne måde ville få etvæsentligt mere urent produkt, som endnu gennem yderligeretrin måtte renses. For fagmanden var det derfor på ingen mådenærliggende, men derimod udtalt overraskende, at man vedden direkte indvirkning af en detergent på kimene kunneopnå et produkt med væsentligt forøget udbytte (mere end5 gange bedre) og i samme renhed og med de samme egenskaber,uden at yderligere rensningstrin er nødvendige.

En behandling af kim af Neisseria meningitidis meddesoxycholat til udvinding af cellevægge er allerede beskreveti J. Bacteriol., 91, 1992-1997 (1966). I dette litteratur¬sted er der beskrevet udvinding af cellevægge fra Neisseriameningitidis med serogruppe-specificitet, medens man.ifølge opfindelsen udvinder membranproteiner med serotype--specificitet. Den her beskrevne metode ("cell suspensionwere ruptured by treatment with sodium deoxycholate(0,5% final concentration) for 10 min. while shakingat 37°C") er ganske vist identisk med det første trin inærværende ansøgnings fremgangsmåde for så vidt som kimenebehandles direkte med desoxycholat. Der er imidlertid væ¬sentlige forskelle med hensyn til formålet med behandlin¬gen og med hensyn til den videre oparbejdning af behand¬lingsblandingen. I trykskriftet videreforarbejdes det efterdetergentbehandling og centrifugering opnåede sediment afcellevæggene, og den ovenstående væske bortkastes, hvori¬mod man ved nærværende fremgangsmåde bortkaster sedimentet og videreoparbejder den ovenstående væske indeholdendemembranproteinerne.

Der findes imidlertid ingen angivelser om anvendel¬sen af fremgangsmåden til udvinding af membranproteiner.Eftersom indvirkningen af detergenter på kimene afNeisseria meningitidis fører til en opbrydning af kimene,måtte det forventes, at man ville få et væsentligt mereurent membranprotein-præparat, som yderligere måtte rensesved hjælp af flere fremgangsmådetrin. Det har imidlertidoverraskende vist sig, at det ved fremgangsmåden ifølgeopfindelsen udvundne materiale ikke adskiller sig erkende¬ligt fra membranproteiner som beskrevet i Bact., 127,973-981 (1976) eller J. Infect. Dis., 137, 738-739 (1978).Materialet har de samme elektroforetiske egenskaber iSDS-holdige pufferopløsninger. Dets endotoksinindhold erligeledes sammenligneligt med indholdet i det ifølgedenne kendte teknik opnåede materiale, og dette gælderogså dets evne til at inducere beskyttende antistoffer idyr.

Opfindelsen angår således en fremgangsmåde tilfremstilling af membranproteiner ud fra Neisseria meningi¬tidis, især en stamme af gruppe B, og denne fremgangsmådeer ejendommelig ved, at man henstiller Neisseria meningi¬tidis med en vandig opløsning af en detergent i en koncen¬tration fra 0,1% til 2% (vægt pr. rumfangsenhed) i fra 15minutter til 24 timer, eventuelt under bevægelse, skillerekstrakten fra bakterieremanensen og renser eventueltekstrakten yderligere.

Som detergent anvendes der fortrinsvis desoxy-cholat, især i dets forholdsvis let vandopløselige formsom natriumsaltet. Koncentrationen af detergenten påfra 0,1% til 2% henfører sig til vægten af detergenteni gram pr. rumfang i ml'. Forholdet mellem fugtig bak¬teriemasse og detergentopløsning ligger med fordel fra1:3 til 1:20, fortrinsvis på 1:5 (vægt pr. rumfangsen¬hed) .

Såfremt der anvendes natriumdesoxycholat somdetergent, anvendes dette i en koncentration på fra0,1% til 1% i en vandig opløsning. Som vandige opløs¬ninger kommer først og fremmest de i den biokemiskeeller mikrobiologiske praksis gængse pufferopløsningerpå tale.

Som udgangsmateriale udvindes en efter kendtemetoder fremstillelig kultur af Neisseria meningitidis,og cellemassen adskilles fra det ovenstående nærings¬medium. Det er herved fordelagtigt at anvende centri¬fugering. Centrifugeringsremanensen suspenderes i dendetergentholdige opløsning og henstilles i overensstem¬melse med opfindelsen i et vist tidsrum. Derefter skil¬les ekstrakten, der indeholder det ønskede produkt, fracelleremanensen. Det er her ligeledes fordelagtigt at gen¬nemføre en centrifugering.

Den temperatur, ved hvilken ekstraktionen udføres,begrænses nedadtil ved de anvendte opløsningers frysepunkt.Den øvre grænse bestemmes af tabet af membranproteinernesimmunogenitet ved varmedenaturering. Det er således anbe¬fal el ses værdigt at arbejde i temperaturområdet mellem stue¬temperatur og ca. 60°C.

Ekstrakten kan om ønsket renses yderligere..Tilyderligere rensning (dette trin indgår ikke i kravene)sedimenteres de højmolekylære membranproteiner ved ultra-centrifugering (f.eks. i en Beckmann-'centrifuge, 45-Ti-Rotor,60 min. ved 40.000 ο/min.). Det ønskede produkt findes nu isedimentet. Dette sediment suspenderes i detergentopløsning..De efter en ultralydbehandling uopløste partikler fraskillesved centrifugering, f.eks. i en Sorvall-centrifuge,SS-34-Rotor, 20 min. ved 20.000 o/min. Det ønskede produktbefinder sig herefter i den ovenstående væske, og ved til¬sætning af ethanol udfældes membranproteinerne. Således kanNeisseria meningitidis-antigenet fældes‘ved tilsætning aff.eks. 4 rumfangsdele ethanol, og fældningen kan genoptagesi vandig opløsning.

Det sterilfiltrerede og eventuelt frysetørredeNeisseria meningitidis-antigen er egnet til at inducerebeskyttende antistoffer mod sygdomsfremkalderen.

Dette antigen kan tilsættes adjuvanser, stabili¬serende tilsætninger, fyldstoffer og lignende stoffer,således som de almindeligvis anvendes ved vaccinefrem¬stilling.

Membranproteinerne udyiser en immunogen virkning.Der kan fremstilles en vaccine, der indeholder de ifølgeopfindelsen fremstillelige membranproteiner i en immunisa-torisk aktiv mængde. Vaccinen.kan indgives i en doseringpå fra ca. 10 til ca. 200 pr. dosis.

Opfindelsen belyses nærmere i de følgende udfø¬relseseksempler .

Eksempel 1 300 g kimmasse (fugtig vægt) af Neisseria menin¬gitidis, gruppe B, stamme 986, suspenderes i 1500 mlnatriumdesoxycho’latopløsning (0,5% natriumdesoxycholati 0,01 M Tris-HCl (tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-hydro-chlorid), pH 8,5, 0,01 M EDTA (ethylendiamintetraacetat)),der forinden er bragt op på en temperatur på 60°C, og hol¬des i 15 minutter i et vandbad (56°C). Derefter følger encentrifugering til fraskillelse af kimmassen (Sorvall GSARotor, 10.000 o/m). Remanensen behandles derpå som ovenforendnu en gang med natriumdesoxycholatopløsning i 15 minut¬ter, og den anden ovenstående væske forenes efter fornyetcentrifugering med den første ovenstående væske, og rema¬nensen bortkastes. De forenede ovenstående væsker centri¬fugeres derefter i 60 minutter i en Beckman L 75 centri¬fuge ved 40.000 o/min i en 45 Ti Rotor. Sedimentet, derindeholder det ønskede produkt, suspenderes i 150 ml na¬triumdesoxycholatopløsning og omrøres natten over ved4vC.

Til yderligere rensning opvarmes suspensionenden næste dag i et vandbad (56°C, 15 min) og centrifuge¬res på ny i en ultracentrifuge som ovenfor (Rotor 45 Ti,40.000 o/min, 60 min.)f og sedimentet, der indeholder detønskede produkt, gensuspenderes i 150 ml natriumdesoxy-cholatopløsning. Til gensuspenderingen anvendes der enUltrasonic Cleaner fra firmaet Laboratory Supplies Co., Inc.,Hicksville, N.Y. USA. Al.iquoter på hver 50 ml udsættesfor ultralyd i hver 3 minutter og forenes derpå. Partikel-formigt materiale skilles fra ved en gentagen centrifuge¬ring (Sorvall, SS-34 Rotor, 20.000 o/min., 20 min.), ogden ovenstående væske, der indeholder det ønskede produkt,filtreres. Membranproteinet udfældes derefter sterilt vedtilsætning af 600 ml 96%'s ethanol og henstilles i 60minutter. Fældningen udvindes ved centrifugering (Sorvall, GSA Rotor), vaskes én gang med 100 ml ethanol og optagesderpå i 150 ml 5%'s raffinose under sterile betingelserog omrøres natten over ved 4°C.

Den optiske tæthed af materialet (OD) ved 280 nmbestemmes og indstilles ved tilsætning af 5%'s raffinosepå O°280 = -*-'2· Dette koncentrat forarbejdes derpå pågængs måde til en vaccine. Til bestemmelse af den op¬tiske tæthed udtages der en aliquot del under sterilebetingelser, der fældes med 1 rumfang trichloreddike-syre (TCA) (10%'s), fældningen vaskes i 5%’s TCA, ogden optages i 1 Μ KOH.

Eksempel 2 50 g kimmasse oparbejdes som beskrevet i eksem¬pel 1, men i stedet for 0,5% natriumdesoxycholat an¬vendes der en opløsning med 0,1% natriumdesoxycholat.

Udbyttet andrager 0,8 mg pr. g cellemasse, medens ud¬byttet ifølge eksempel 1 er 2,3 mg pr. g.

Eksempel 3 50 g kimmasse oparbejdes som beskrevet i eksem¬pel 1, men i stedet for 0r5% natriumdesoxycholat an¬vendes der en opløsning med 2,0% natriumdesoxycholat.Udbyttet andrager 2,2 mg pr. g cellemasse, medens ud¬byttet ifølge eksempel 1 er 2,3 mg pr. g.

Eksempel 4

50 g kimmasse oparbejdes som beskrevet i eksem¬pel 1, men i stedet for 0,5% natriumdesoxycholat i 0,01 M

Tris-HCl-0,01 M EDTA anvendes der 0,5% natriumdesoxy¬cholat i a) 0,1 M phosphatpuffer, pH 7,8, i b) Hepe'spuffer (4-(2-hydroxyethyl)-piperazin-l-sulfonat) (0,1 M, pH 7,8) eller i c) 0,1 M natriumcarbonatpuffer,pH 8,5. Udbytterne varierer mellem 1,8 mg pr. g og 2,5 mgpr. g.

Eksempel 5

Svarende til eksempel 1 udføres ekstraktionen medandre detergenter. Udbytterne fremqår af den følgendetabel:

[Emulphogene ®BC-720 (GAF Corp.) = polyoxyethylen(10)-tridecylether; Tween ®20 (Atlas Chemical Industries,Inc.) = Dolyoxyethylen (20)-sorbitanmonolauratjTriton ®X 100 (Rohn & Haas Comp.) = polyoxyethylen(10)-p-isooctylphenylether].

Claims (3)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af membranpro¬teiner ud fra Neisseria meningitidis, kendeteg¬net ved, at man henstiller Neisseria meningitidis meden vandig opløsning af en detergent i en koncentration på fra 0,1 til 2% (vægt pr. rumfangsenhed) i fra 15 minut¬ter til 24 timer, eventuelt under bevægelse, skillerekstrakten fra bakterieremanensen og renser eventueltekstrakten yderligere.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg¬net ved, at der som Neisseria meningitidis anvendes en stamme af gruppe B.

3· Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg¬net ved, at der som detergent anvendes desoxycholat.