DK149063B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af trh-analoge derivater af histidylprolinamid eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf - Google Patents

Description

i 149063

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte derivater af histidylprolinamid eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf, som i kvalitativ henseende besid-5 der TRH-analoge virkninger, og hvori den ene eller begge aminosyrer kan være optisk aktiv eller racemisk, men fortrinsvis foreligger i L-konfigurationen.

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede derivater af histidylprolinamid har den almene for-

10 mel I

|=1 i I . V8 r*

/\X )—I

15 CT I ^CO-NH-CH-CO-N

H \__ eller er salte af disse forbindelser med farmaceutisk acceptable syrer.

20 I denne formel betyder Z en af grupperne med form len OH R4

I I

a) -N=C - CH - eller -NH-CO-CH-, eller b) -C-S-CH0- l2 '2 »5 1 2 R^ RZ R3 4 5 2 2 25 idet R sammen med R betegner en yderligere binding mellem de to carbonatomer, der bærer disse grupper, el 3 ler, når Z betyder gruppen (b), er et hydrogenatom, me- 4 5 dens R og R er ens eller forskellige og hver især betegner et hydrogenatom eller en alkylgruppe med 1-3 30 carbonatomer.

Særligt foretrukne er forbindelser med formlen I, hvori Z betyder én af grupperne a) eller betyder gruppen 5

b), hvori R betyder et hydrogenatom. I disse foretrukne tilfælde er der, for så vidt angår de med histidyl-pro-linamidet sammenknyttede carboxylsyrer med formlen II

2 149063 ! ί .1

: II

A /cC

5 (K Nr ^*C00H

H

f.eks. tale om orotsyre, thiomorpholin-(5)-on-(3)-L-car-boxylsyre og 6-methylthiomorpholin-(5)-on-(3)-L-carboxyl-10 syre.

Blandt andre egnede syrer med den almene formel II/ kan dog også nævnes f.eks. 6,6-dimethyl-thiomorpho-lin-(5)-on-(3)-L-carboxylsyre.

Når Z betegner gruppen b), foreligger også 15 resterne af syrerne med formlen II ved det carboxyl- gruppen bærende carbonatcm (3) fortrinsvis i Ir-formen i for- 4 5 bindeiserne med formlen I. Er R og R forskellige fra hinanden, så optræder et yderligere asymmetri-centrum (ved carbonatom 6), så at der på dette sted i for-20 bindeiserne med formlen I, kan foreligge D- eller L-eller også DL-konfiguration.

På grund af histidinrestens basicitet er forbindelserne med formlen I egnede til at danne salte med syrer.Fremgangsmåden ifølge opfindelsen omfatter der-25 for også fremstilling af salte af disse forbindelser med farmaceutisk (i saltform) acceptable uorganiske eller organiske syrer, som f.eks. saltsyre, hydrogenbromidsyre, svovlsyre, phosphorsyre, myresyre, eddikesyre, propion-syre, benzoesyre, salicylsyre, phenyleddikesyre, benzen-30 sulfosyre o.s.v.

Forbindelserne fremstillet ifølge opfindelsen udviser overraskende biologiske egenskaber, som i vidtgående grad i henseende til virkningskvalitet og virkningsstyrke ligner de biologiske egenskaber af pyroglutamyl-L-35 histidy1-L-prolinamidet, der sædvanligvis betegnes som "Thyrotropin-Releasing-Hormone" eller "TRH", men som dog varer betydeligt længere end hos det kendte produkt. Forbindelserne fremstillet ifølge opfindelsen er 149063 3 virksomme ved enteral og oral indgift, hvorhos virkning-gen indtræder hurtigt, f.eks. ved parenteral indgift efter ca. 10 minutters forløb.

TRH bliver hurtigt enzymatisk nedbrudt og 5 virkningsløst i legemet, hvilken nedbrydning i afgørende grad bevirkes af pyroglutamat-aminopeptidaser, der spalter pyroglutamyl-histidinbindingen. Det har overraskende vist sig, at pyroglutamat-aminopeptidaser ikke formår at spalte forbindelser med formlen I, 10 hvilket er påvist ved afprøvning af forbindelserne orotyl-L-histidyl-L-prolinamid, 5-oxo-thiomorpholin-3-(L)-carbonyl-L-histidyl-L-prolinamid og 5-oxo-6-methyl-thiomorpholin-3-(L)-carbonyl-L-histidyl-L-prolinamid ([a]33= -33,5°, c=l i methanol).

15 Toxiciteten af forbindelserne er meget ringe.

Eksempelvis blev der hverken efter intraperitoneal eller efter oral indgivelse af de førnævnte tre forbindelser til mus eller rotter iagttaget noget dødsfald, selv ved doser på 4000 mg/kg. Forbindelserne kan 20 derfor anvendes terapeutisk som psykostimuli eller antidepressiva både til mennesker og til dyr.

En af hovedvirkningerne af TRH er frigørelsen af thyrotropin, der har en generelt stimulerende virkning på skjoldbruskkirtelen. Denne virkning er for 25 forbindelser, der skal anvendes som psykostimulanter eller antidepressiva en lidet ønsket bivirkning.

For forbindelserne med formlen I har det kunnet vises, at forholdet mellem de doser, der kræves til udløsning af virkningerne på centralnervesystemet, og de doser, 30 der bevirker thyrotropin-udløsning, er væsentligt gunstigere end for TRH. Forbindelserne viser altså overvejende virkninger på det farmakologiske område, i sammenligning med hvilke virkningerne på skjoldbrusk-kirtelen træder i baggrunden.

35 Fra svensk fremlæggelsesskrift nr, 400.074 kendes en fremgangsmåde til fremstilling af kemisk set nært beslægtede tripeptider, som angives at besidde thyrotropinfrigørende virkning uden bivirkninger på 4 149063 centralnervesystemet. Imidlertid viser forsøg, at de kendte forbindelser faktisk har en virkning på centralnervesystemet i praktisk taget samme doser som TRH, og l de er altså i forhold til de ifølge opfindelsen frem-5 stillede forbindelser væsentligt underlegne med hensyn til sådan virkning på centralnervesystemet.

Dette betyder, at de ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser har en helt anden virkningsprofil end de kendte forbindelser.

10 I det følgende angives resultaterne af nogle forsøg, hvor de farmakologiske virkninger af forbindelser, fremstillet ifølge opfindelsen, sammenlignedes med virkningen af TRH og af den i eksempel 3 i det svenske fremlæggelsesskrift angivne forbindelse.

15

Forsøg 1.

Centralstimulerende stoffer bevirker eksempelvis hos mus en forhøjet bevægelsestrang. Til måling af denne virkning blev grupper på 10 hanmus intraperitonealt 20 indgivet stigende doser af testforbindelserne, og derpå blev dyrene i de forskellige dosisgrupper indsat i mørkelagte målekasser, og ved hjælp af infrarødt- måleskabe måltes den spontane bevægelsesaktivitet for hver gruppe i 10 minutter, indtil aktiviteten atter var 25 gået tilbage til udgangsværdien. Den efterfølgende . tabel angiver den minimale dosis, ved hvilken der kunne iagttages en aktivitetsstigning. Symbolet R svarer til R i formlen R-His-Pro-NHj> hvor "His" betyder en L- histidinrest, medens "Pro" betyder en L-prolinrest: 30 R Minimaldosis Bemærkning _ i mg/kg mus_________ Γ\

o g CO- 20 - 50 TRH

O^N CO- 10 _ 20 SE freml. 400.074, Eks. 3 H

35 149063 5 R Minimaldosis Bemærkning __i mg/kg mus__ ιΐ

Cr^N^C 0- 2-5 ifølge opfindelsen, Η· Eks. 1 r'i 5-10 Eks. ?

H

Cr^-N'^· CO- 0 2 - 0,5 Eks. 9

H

O^N^CO- °·5 - M Støl 10

H

O^'N'^'QO- 1,0 Eks. 11

H

Η5ο2γ8\

H

i-c3H7 /S\ °"^Αχτ- 6 149063

Forsøg II.

Gode oplysninger om psykostimulerende eller antidepressive virkninger af forbindelser kan ved den farmakoloaiske aforOvnina eksemoelvis fås ved nrøvnina 5 af indvirkningen af de ved indgivelse af reserpin til forsøgsdyr udløste effekter.

a) En opløsning af reserpin i 5%'s ascorbinsyre-opløsning bliver ved intraperitoneal injektion indgivet mus i en dosis på 8 mg reserpin pr. kg legems- 10 vægt. Efter 24 timers forløb måles forsøgsdyrenes stærkt sænkede legemstemperatur ("udgangsværdi"), og derpå bliver testforbindelserne indgivet. Med 30 minutters mellemrum måles den rektale temperatur, og til fastlæggelse af EDC--værdien måles den maksimale

DU

15 virkning (ca. 30-60 minutter efter intraperitoneal indgift). Ud fra det antal dyr, hos hvilke hypothermien i sammenligning med kontroldyr var ophævet for 50%'s vedkommende/ beregnedes ED^g-værdien: 20 ________ r ED^g-Værdi for ophævelse af reserpin-hypothermien

Ved intraperitoneal Relativ virkning _indgift (mg/kg)__(TEB = 1)_ 25 O^CO- 3,3 1,0

H

O^O^CO- 4,2 0,8

H

30 2 || 1,0 3,3 O^N^CO-H - 149063 ___7_ R ED^Q-Værdi for ophævelse af reserpin-hypothermien

Ved intraperitoneal Relativ virkning _____ indgift (mg/kg)_(TRH » 1)__ a0,3 11,0 co-

H

H3C N. _ Y ] 0,04 82,5 q-K^co-

H

10 0,3 11,0

Ογ'-Λγ C0-H

w3C\/Sv> 0,2 16'5 %cl 1 15 0^Aco- H5C2-fSVS| 1,1 3'° /C0-

20 H

b) I ét .andet forsøg blev mus 18-20 timer før forsøgets begyndelse indgivet 5 mg reserpin pr. kg legemsvægt ved intraperitoneal injektion. Dyrene udviklede 25 indtil forsøgets begyndelse blandt andet en stærkt udpræget hypomotilitet. Efter intraperitoneal indgift af prøveforbindelserne blev grupper af dyr, som hver var på 10 med forbindelser behandlede dyr, samt 10 kontroldyr, der kun var forbehandlet med reserpin, 30 indsat i mørkelagte målekasser, og dyrenes bevægelsesaktivitet blev i 2 timer optaget og registreret med infrarødt-måleskabe. Middelværdien af motilitetsmålingen for alle med reserpin forbehandlede kontroldyr androg derved 14,2, medens der for helt ubehandlede dyr fandtes 35 en værdi på 123, gom minimaldosis, der modvirker reserpinvirkningen, blev der for forsøgsforbindelserne målt følgende: 8 149063 R ! o^co- 10 "s/k9

H

5 O

^||| 1 mg/kg O^N^CO-

H

a 3 mg/kg CO-

H

0,2 mg/kg o^n^co-

H

15

Forsøg III.

Under indvirkning af antidepressivt virkende stoffer, navnlig sådanne med centralstimulerende egenskaber, iagttages i dyreforsøg en stigning af 20 amphetamingruppetoxiciteten, der blandt andet fører til en højere dødsrate for dyrene. I forsøget blev grupper på hver 10 mus indgivet forsøgsforbindelserne ved intraperitoneal injektion, og 15 minutter senere blev dyrene indgivet amphetamin i en dosis på 5 mg/kg 25 subkutant. Dyrene sattes i glasbeholder med diameter på 20 cm, og antallet af de i de efterfølgende 4 timer afdøde dyre noteredes, idet størrelsen af grupperne blev holdt konstant ved ombytning af de døde dyr med ubehandlede kontroldyr. Som ED5Q, dvs. den dosis, der 30 bevirker, at 50% af de dermed (efter amphetamin-forbehandling) behandlede dyr dør, måltes følgende værdier: 9 149063 R Forøgelse af amphetamingruppetoxiciteten __(ED^0 i mg/kg)_' o^ir^co- H 4,1 oO>CO- H 10,3 - o^/sr'-co- 0,7

H

Λ o^n^-co-

H

0,18 O^N^CO-

H

S

H5C2~~~T ^ b λ I 0,75 O ^ CO—

H

3 0 ^\N^CO_ 10 149063 R Forøgelse af amphetamingruppetoxiciteten I___________(ED50 i mg/kg)__ 5 tt_C3H7 3,5 C0~ 10 oa. 5 O^N-^^CO—

Forsøg IV.

15 Indvirkningen af barbituratnarkose giver ligeledes et mål for centralstimulerende virkninger. Til dette formål blev grupper på hver 10 mus 15 minutter efter intraperitoneal indgift af forsøgsforbindelserne indgivet 50 mg/kg Secorbarbital-natrium intraperitonealt.

20 Ved konstant temperatur (31,5°C) iagttoges dyrene for genindtrædelse af refleksen til at rejse sig op, for spontane bevægelser, trækninger og tremor af extremi-teterne. Ud fra det antal dyr, som ved optræden af disse fænomener viste en afsvækkelse af narkosen, 25 beregnedes EDc -værdien:

OU

R Barbiturat-antagonisme fEDj0 i mg/kg) 30 Γ\ H ~10 35 co- 15,0

W

11 149063 R Barbiturat-antagonisme (ED50 i mg/kg) _____ —

5 «M'S

i 1 0,6 O^N^CO-

H

rsi 10 O^J/^-CO- %γ$Ί of 04

O^N^C 0-H

15 __

Forsøg V.

Et efter indgivelse af TRH og analogt virkende stoffer optrædende karakteristisk billede er den 20 såkaldte "wet-dog-shaking" hos rotter. Dyrene ryster sig derved under TRH-påvirkning på lignende måde som en våd hund/ der vil fjerne vandet fra sin pels.

Dette forsøg kan eksempelvis gennemføres som følger:

Hanrotter blev indgivet forsøgsforbindelsen 25 intraperitonealt/ og derpå blev hvert af dyrene med 5 minutters mellemrum iagttaget i 1 minut, idet antallet af rysteaktioner blev optalt. Som mål for virkningen af forsøgsforbindelsen antages det gennemsnitlige antal af rysteaktioner pr. minut. 1 den efterfølgende tabel 30 er værdierne efter intraperitoneai indgivelse af 25 mg forbindelse/kg (ved 1 og 2) eller 1 mg forbindelse/kg legemsvægt (ved 3} sammenstillet.

35 12 149063

Forbindelse IR "Wet-Dog-Shaking" reaktioner pr. minut 15 30 45 60 75 90 105 120 5 1 O^N^CO· 2,9 0,5 0 0 0 0 0 0

H

O

2 1 5,25 3,8 3;2 2,15 2,1 1,55 1,05 0,6 crN^CO-

10 H

3 4,9 3,1 2,9 1,6 0,95 0,6 0,5 0,2 O^N^CO-

H

15

Det ses deraf navnlig, at de ifølge opfindelsen fremstillede stoffer (2 og 3) udløser denne effekt ikke blot i stærkere grad, men også i betydelig længere tid end TRH, dvs. nedbrydes væsentligt langsommere end TRH 20 i den levende organisme. Som minimal virkningsdosis for udløsningen af "wet-dog-shaking" hos rotter er der for disse og andre testforbindelser målt følgende værdier: THR 5 - 10 mg/kg 25 Forbindelse 2 2 mg/kg

Forbindelse 3 0,25 mg/kg

Isomer af forbindelse 3 med [a]p35-108,5° 1,8 mg/kg 5-Oxo-6,6-dimethy1-thiomorpholin-30 3- (L) -carbonyl-L-histidyl-L- prolin-amid 1 mg/kg 5-0XO-6-(DL)-ethyl-thiomorpholin- 3-(L)-carbonyl-L-histidyl-L-prolin-amid 2 mg/kg 35 5-Oxo-6-(DL)-n-propy1-thiomorpho-lin-3-(L)-carbonyl-L-histidyl-L-prolin-amid 3,5 mg/kg 13 149063

Angående det tidligere omtalte forhold mellem de doser, der er nødvendige til udløsning af virkningerne på CNS, og de doser, der bevirker thyrotro-pin-udløsning, skal følgende værdier anføres for 5 (A) orotyl-L-histidyl-L-prolinamid, (B) 5-oxo- thiomorpholin-3-(L)-carbonyl-L-histidyl-L-prolinamid og (C) 5-oxo-6-methyl-thiomorpholin-3-(L)carbonyl-L-hi-stidyl-L-prolinamid: 10

Relativ virk----^ning

Forbindelse--—X__II__Forhold I:II_ A 3,3 0,08 41,25 B 11,0 0,07 157,14 15 C__82,5 2,5__33,0_ TRH 1,0 1,0 1,0 I : Relativ virkning m.h. til ophævelse af 20 reserpin-hypothermi (TRH = 1).

II: Relativ thyrotropin-udløsende virkning (TRH = 1)'.

25 Egnede farmaceutisk anvendelige tilberednings former er tabletter, drageer, granulater, kapsler, dråber, safter eller sirupper, og sprays til intranasal applikation eller til indgivelse af forbindelserne fremstillet ifølge opfindelsen gennem bronchierne, samt vandige sterile opløsninger til parenteral applikation.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af forbindelserne med den almene formel I er ejendommelig ved, at man a) omsætter histidylprolinamid, med eventuelt re-35 versibelt beskyttet 1-(3)-stilling i imidazolgruppen i histidylgruppen, eller et deraf ved omsætning med et af en trfalkylsilanol eller dialkylsilandiol (med 1-3 carbonatomer i hver alkylgruppe) afledt silylerings- 14 149063 middel på i og for sig kendt måde opnået silyleret histidyIprolinamidderivat, med en carboxylsyre med formlen 5 rz_'i 1 s 11 l i /G.

10 * ^COOH

hvori R^ og Z betegner det samme som ovenfor, og Y betegner et hydrogenatom eller en hydrogenolytisk fraspaltelig gruppe, i nærværelse af et vandbinående mid-15 del, eller med et funktionelt derivat af en syre med formlen II, og at man om nødvendigt på i og for sig kendt måde derefter fraspalter gruppen Y, beskyttelsesgruppen for imidazolgruppen i histidylresten, og/eller eventuelt tilstedeværende silylgrupper, eller at man 20 b) omsætter prolinamid med en forbindelse med formlen

M

ΓΊ t VM

c c-"R 9¾ i

o “ CO-NH-CH-COOH

hvori R^, Z og Y betegner det samme som ovenfor, 30 og som har en eventuelt reversibelt beskyttet 1-(3)-stilling i imidazolgruppen, i nærværelse af et vandbindende middel, eller med et funktionelt derivat af en forbindelse med formlen III, og at man derefter fraspalter eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgrupper, 35 eller at man 15 149063 c) omsætter en forbindelse med formlen N=1

5 IV

! : R1 T co-w

λχ r· A

6 ^CO-NH-CH-CO-N

V_i 10 hvori Y og Z betegner det samme som ovenfor, og W betegner en hydroxy- eller en acyloxygruppe, en p-nitrophenoxy-, tri- eller pentachlorphenoxy-, penta-fluorphenoxy-, pyridyloxy-, phenylmercapto-, p-nitro-phenylmercapto- eller cyanmethyloxygruppe eller 15 gruppen N-hydroxysuccinimid, og som har en eventuelt reversibelt i l-(3)-stillingen beskyttet imidazol-gruppe, med ammoniak eller et stof, der under reaktionsbetingelserne afgiver ammoniak, og at man derefter fraspalter eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgrupper, 20 eller at man d) til fremstilling af forbindelser med formlen I, hvor Z betegner én af grupperne a), omsætter histidylprolin-amid, der eventuelt er beskyttet reversibelt, fortrinsvis med hydrogenolytisk fraspaltelige grupper, i 1-(3)-stillingen i imidazolgruppen i histidylresten, med en syre med en af formlerne

0 OH

Jl Hal 1 Hal 30 I I V eller j Va /^Νοοη h(/S./V-co(m hvori Hal betegner et chlor- eller bromatom, i nærværelse af et vandbindende middel, specielt et 35 carbodiimid, eller med et funktionelt derivat af en sådan syre, at man derefter fra det opnåede mellemprodukt, om nødvendigt efter fraspaltning af histidyl-gruppens beskyttelsesgrupper, fjerner halogenatomet og 16 149063 eventuelt tilstedeværende hydrogenolytisk fraspaltelig grupper ved hydrogenolyse med katalytisk aktiveret hydrogen, og at man eventuelt overfører den opnåede forbindelse 5 med formlen I på i og for sig kendt måde i et salt deraf med en farmaceutisk acceptabel syre.

Som vandbindende middel i fremgangsmåde a) kan hensigtsmæssigt benyttes et carbodiimid, fortrinsvis di-cyclohexylcarbodiimid, som funktionelt derivat af syren 10 med formlen II kan f.eks. benyttes et syrehalogenid, et anhydrid eller blandet anhydrid, et azid eller en aktiveret ester. Når gruppen Y betegner en hydrogenolytisk afspaltelig gruppe, kan denne navnlig være en carboben-zoxy- eller en substitueret carbobenzoxygruppe.

15 Egnede beskyttelsesgrupper for 1-(3)-stillingen i imidazolgruppen i histidylresten er kendte fra peptidkemien. Til dette formål kommer .især carboxybenzoxygrup-pen eller substituerede carbobenzoxygrupper, trityl-grupper, o-nitrophenoxyacetylgrupper, tert.-butyloxy-20 carbonylgruppen eller andre i og for sig kendte grupper i betragtning, hvilke grupper efter påfølgende omsætning lader sig fraspalte ved hydrolyse eller hydrogenolyse.

Som silyleringsmiddel for histidylprolinamidet kan eksempelvis anvendes hexamethyldisilazan, trimethyl-25 chlorsilan, trimethylsilylacetamid, eller dimethyl-dichlorsilan. Efter afsluttet omsætning, der sker i nærværelse af et ikke protonaktivt opløsningsmiddel, lader silylgrupperne sig derefter afspalte ved hydrolyse eller alkoholyse under skånsomme betingelser.

30 Ved anvendelse af et vandbindende middel i fremgangsmåde b), kan der ligesom i fremgangsmåde a) især benyttes et carbodiimid, fortrinsvis dicyclo-hexylcarbodiimid. Som funktionelt derivat af forbindelsen med formlen III, kan der f.eks. benyttes et 35 syrehalogenid, et blandet anhydrid eller en aktiveret ester.

I fremgangsmåde c) kan der som forbindelse, der afgiver ammoniak eksempelvis anvendes ammoniumcarbonat.

17 149063 I fremgangsnåde d) kan der også passende som vandbindingsmiddel (når sådant benyttes) gøres brug af et carbodiimid, fortrinsvis dicyclohexylcarbodiimid, og der kan også som funktionelt derivat af syren med 5 formlen V eller Va anvendes f.eks. et syrehalogenid, et anhydrid'eller blandet anhydrid, et azid eller en aktiveret ester. Som egnede beskyttelsesgrupper for 1-(3)-stillingen i imidazolgruppen i histidylgruppen kan benyttes de ovenfor allerede nævnte, i peptid-10 kemien anvendelige grupper. Til dette formål kommer især sådanne i betragtning, der (som f.eks. carbo-benzoxygruppen henholdsvis den substituerede carbo-benzoxygruppe eller o-nitrophenoxyacetylgruppen) kan fjernes ved hydrogenolyse. I et sådant tilfælde sker 15 fraspaltningen af beskyttelsesgruppen fra acyleringsproduktet fra første trin hensigtsmæssigt samtidig med hydrogenolysen af halogenatomet. Men man kan naturligvis også knytte i sig selv kendte,efter endt omsætning ved hydrolyse fraspaltelige grupper (f.eks. tritylgrupper, 20 tert.-butyloxycarboxylgrupper) til imidazolgruppen i histidylresten, og derefter kan man på sædvanlig måde fraspalte disse beskyttelsesgrupper efter afsluttet koblingsreaktion eller først efter endt hydrogenolyse af halogenatomet.

25 Hydrogenolysen af halogenatomet sker ved hjælp af katalytisk aktiveret hydrogen, idet der ifølge opfindelsen fortrinsvis som katalysator anvendes en ædelmetalhydrogeneringskatalysator, især en palladium-og/eller platinkatalysator f.eks. Pd eller Ft på carbon, 30 på bariumsulfat, på aluminiumoxid, på calcium- eller . bariumcarbonat, eller andre i og for sig kendte ædelmetalkatalysatorer. Hydrogenolysen kan gennemføres under normaltryk eller under forhøjet tryk, fortrinsvis ved stuetemperatur. Som opløsningsmiddel anvender man 35 fortrinsvis vand eller blandinger af vand med lavere alkoholer (methanol, ethanol) eller med tetrahydrofuran, dioxan eller lignende. Men man kan f.eks. også arbejde med iseddike som opløsningsmiddel. Til binding af den 18 149063 ved hydrogenolysen opståede hydrogenhalogenidsyre arbejdes fortrinsvis i nærværelse af et hydrogen-halogenidbindende stof. Når de føromtalte som foretrukne nævnte eller andre ikke surt reagerende op-5 løsningsmidler anvendes, kan der som sådanne stoffer anvendes f.eks. magnesiumoxid, bariumoxid, alkalimetal-hydroxid, ammoniak eller ammoniumhydroxid, triethylamin eller også salte af de nævnte stoffer med syrer, der tydeligt er svagere end den dannede hydrogenhalogenid-10 syre, som f.eks. alkalimetalcarbonater eller -acetater.

Egnede medier til gennemførelsen af hydrogenolysen er også opløsninger af alkalimetal-, jordalkalimetal-, ammonium- eller aminacetater i eddikesyre.

Som blandede anhydrider af syrer med formlen II, 15 III eller IV kommer især sådanne i betragtning, som afledes af monoestre af kulsyre med alifatiske, 1-4 carbonatomer indeholdende alkoholer eller f.eks. af trimethyleddikesyren (pivalinsyre). Egnede aktiverede estre af de nævnte syrer afledes f.eks. af p-nitrophenol, 20 tri- eller pentachlorphenol, pentafluorphenol, N- hydroxysuccinimid, 2- eller 4-hydroxypyridin, thiophenol, p-nitrothiophenol, glycolsyrenitril, 1-hydroxybenzo-triazol og sådanne, som i peptidkemien anvendes til dannelse af aktiverede estre af sædvanlige hydroxy-25 eller mercaptoforbindelser.

Forbindelserne fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er forholdsvis stabile og kan derfor renses, f.eks. ved omfældning, omkrystallisation, men også ved søjlechromatografi, modstrømsfordeling osv.

30 De følgende eksempler belyser fremgangsmåden ifølge opfindelsen nærmere. Alle temperaturangivelser er ukorrigerede heri. Ved udarbejdelsen af disse eksempler blev der ikke lagt vægt på opnåelse af maksimalt udbytte,

Eksempel 1 aj 10,5 g iEi-histidinhydrochlorid (monohydrat) opløses i 50 ml 2 N natriumhydroxidopløsning. Under omrøring i 35 19 149063 isbad tildryppes en opløsning af det af 7,8 g orotsyre ved behandling med thionylchlorid i nærværelse af di-methylformamid fremstillede orotylchlorid i 100 ml dimethylformamid. Ved samtidig tildrypning af 2 N 5 natriumhydroxidopløsning holdes reaktionsblandingens pH-værdi mellem 9 og 10. Efter endt tildrypning omrøres yderligere i 5 minutter.

Derefter indstilles der til en pH-værdi på 7-8 ved tilsætning af saltsyre. Efter nogen tids forløb 10 danner der sig en udfældning, som frafiltreres. Filtratet inddampes under formindsket tryk. Til ind-dampningsresten sættes ca. 30 ml vand. Ved tilsætning af saltsyre indstilles på en pH-værdi på 5-5,5. Efter henstand i isbad frasuges det udfældede stof. Efter 15 omkrystallisation i kogende vand fås den rene orotyl-L-histidin. Udbytte efter tørring: 4,5 g = 30% af det teoretiske. Stoffet misfarves lidt efter lidt fra 230°C og sønderdeles under forkulning véd 263-266°C.

[a]^ = -36,9° (c = 0,5 1 N saltsyre).

20 b) 587 mg orotyl-L-histidin opløses i noget vand under tilsætning af 2 ml 1 N saltsyre og underkastes derefter frysetørring. Dette frysetørrede orotyl-L-histidinhydrochlorid, 288 mg 1-hydroxybenzotriazol og 301 mg L-prolinamidhydrochlorid opløstes i 10 ml 25 dimethylformamid. Under omrøring ved stuetemperatur tilsættes efter hinanden 0,56 ml triethylamin og en opløsning af 412 mg Ν,Ν'-dicyclohexylcarbodiimid i 7,4 ml diethylformamid. Derefter omrøres i yderligere 12 timer ved stuetemperatur. Det dannede bundfald fra-30 filtreres. Filtratet inddampes under formindsket tryk.

Til inddampningsresten sættes lidt vand, og der filtreres. Filtratet omrøres med ca. 15 g af en kation-bytter i fri syreform, som f.eks. produktet ""Dowex" 50 WX 4" (200 til 400 mesh) fra Dow Chemical Co., og filtreres derpå. Kationbytteren med produktet vaskes med vand og derpå med overskud af IN ammoniakopløsning, hvorpå der filtreres. Det ammoniakalske filtrat inddampes under formindsket tryk, Inddampningsresten 20 149063 underkastes modstrømsfordeling i systemet n-butanol-vand.

De kombinerede fraktioner, som indeholder hovedproduktet inddampes under formindsket tryk. Inddampningsresten opløses i vand, og der frysetørres. Der fås 482 mg 5 orotyl-L-histidyl-L-prolinamid-hydrat = 59% af det teoretiske.

[<x]22 = -45,8° (c = 1:methanol) .

Eksempel 2 10 15,6 g orotsyre, 14,4 g 1-hydroxybenzotriazol og L-histidyl-L-prolinamiddihydrobromid, fremstillet ud fra 38,5 g N-benzyloxycarbonyl-L-histidyl-L-prolin-amid (K. Inouye et al. Bull. Chem. Soc. Japan, 44, 1689-91 (1971) ved fraspaltning af benzyloxycarbonyl-15 gruppen ved hjælp af en 40%'s opløsning af hydrogenbro-mid i iseddike,sattes til 200 ml dimethylformamid. Man afkølede til -5°C og tilsatte under omrøring 27,8 ml triethylamin og kort derefter ved samme temperatur en opløsning af 20,6 g Ν,Ν'-dicyclohexylcarbodiimid i 20 50 ml dimethylformamid. Man omrørte i 24 timer og lod herunder temperaturen stige til stuetemperatur. Det dannede bundfald blev frasuget efter dette tidsrum, og filtratet blev inddampet under formindsket tryk. Resten blev sat til 200 ml vand og opbevaret ved 0°C i 12 timer.

25 Efter filtrering blev filtratet omrørt ved stuetemperatur i 10 minutter med 170 g af en kationbytter i den frie syreform, som f.eks. produktet fra Dow Chemical Co. ""Dowex" ®-50 WX 4" (200 til 400 mesh), og herefter filtrerer man. Kationbytteren, der var fuld af 30 produktet, blev vasket grundigt med vand, methanol og igen med vand. Herefter blev omrørt i 5 minutter med ca. 200 ml 1 N ammoniak, filtreret, og harpiksen blev vasket endnu nogle gange med 1 N ammoniak. Filtratet blev inddampet under formindsket tryk ved temperaturer 35 indtil 35°c til et volumen på ca. 100 ml. Den koncentrerede opløsning, der var opnået på denne måde blev behandlet med aktivt kul og herefter frysetørret. Ved udkogning to gange med 250 ml absolut alkohol pr. gang 21 149063 skete der allerede en vidtgående rensning. Til den endelige rensning kan man f.eks. anvende søjlechromatografi.

Til dette formål blev 2 - 3 g af materialet opløst i 5 ml vand/ tilsat 10 ml methanol og hældt over en 5 søjle af 200 g basisk aluminiumoxid. Elueringen sker med methanol/vand (2:1) og følges ved ultraviolet absorption ved 254 nm (= 2/54 can ^). Forureningerne elueres først sammen med noget hovedprodukt, derefter følger eluering af det rene produkt. De forenede 10 fraktioner, der indeholder hovedproduktet, inddampes under formindsket tryk. Resten optages med vand og frysetørres. Man opnår således 11,25 g = 28% af det teoretiske udbytte orotyl-L-histidyl-L-prolinamidhydrat.

Smp. 250°C; [<x]22 = -45,8° (c = 1, methanol).

15 C16H19N7°5,H2° (407'4)

Beregnet : C 47,20 H 5,19 N 24,12

Fundet : C 47,95 H 5,27 N 24,10

Man kan også opnå det samme produkt ved omsætning af L-histidyl-L-prolinamid med orotsyrechlorid (J. Med.

20 Chem. 6, 334-335 (1963)), idet man hensigtsmæssigt renser orotsyrechloridet for orotsyre, der ikke er overført til dets syrechlorid, ved opløsning i absolut tetra-hydrofuran. Udbytte 42% af det teoretiske.

25 Eksempel 3 a) 4,8 g 5-chlororotsyre, 3,6 g 1-hydroxybenzotriazol og L-histidyl-L-prolinamiddihydrobromid, der er fremstillet ud fra 9,7 g N-benzyloxycarbonyl-L-histidyl-L-prolinamid som i eksempel 2, tilsættes til 150 ml 30 dimethylformamid. Man afkøler til -5°C og tilsætter efter hinanden under omrøring 7,0 ml triethylamin og en opløsning af 5,2 g Ν,Ν'-dicyclohexylcarbodiimid i 20 ml dimethylf ormamid. Man lader henstå i 1,5 timer i et afkølingsbad (-5 til ca. 0°) og omrører derefter 35 yderligere i 24 timer, hvorunder man lader temperaturen stige til stuetemperatur. Det dannede bundfald bliver efter denne tid frasuget, og filtratet inddampes under formindsket tryk ved ca. 35°C. Resten tilsættes 75 ml 22 149063 vand og henstår herefter i 12 timer ved 0°C. Efter filtrering røres filtratet ved stuetemperatur i 10 minutter med 75 g af en kationbytter i den fri syre-form, som f.eks. det i eksempel 2 nævnte handelsprodukt, 5 og herefter filtrerer man. Kationbytteren, der har op- . taget produktet, vaskes 4 gange med 250 ml vand pr. gang og 4 gange med 50 ml methanol pr. gang. Derefter opslemmes i 100 ml vand og under omrøring tilsættes 120 ml 1 N ammoniak. Der frasuges og vaskes 6 gange med 10 20 ml 1 N ammoniak pr. gang. Filtratet inddampes under formindsket tryk ved temperaturer indtil 35°C til et mindre volumen, og herefter frysetørrer man. For at rense omkrystalliseres 2 gange med 45 ml vand-ethanol (1:1). Efter tørring i vakuum over phosphorpentaoxid 15 får man 4,7 g = 44,8% af det teoretiske udbytte af 5- chlororotyl-L-histidy 1-L-prolinamid.

Smp. 204-206°Cf [a]33 « -36,2° (c = 1,16, methanol).

C16H18N7°5C1 (423'8)

Beregnet: C 45,25 H 4,27 N 23,12 Cl 8,37 20 Fundet : C 44,99 H 5,05 N 22,64 Cl 8,31

Det samme produkt får man ved omsætning af 5-chlororotsyrechlorid (opnået fra chlororotsyre med thionylchlorid i benzen i nærværelse af dimethylforraamid) med L-histidyl-L-prolinamid i et udbytte på 48% af det 25 teoretiske.

b) Til 15 ml vand sætter man 165 mg vandfrit natriumacetat og 100 mg 5%’s palladiumcarbon. I et rysteapparatur behandles blandingen med hydrogen, indtil der ikke yderligere sker hydrogenoptagelse. Herefter 30 tilsætter man en opløsning af 850 mg 5-chlororotyl-L-histidy1-L-prolinamid (opnået som angivet i afsnit a)) i 30 ml vand og omryster ved stuetemperatur og normaltryk indtil 2 mmol (ca. 50 ml) hydrogen er optaget. Efter frafiltrering af katalysatoren udrystes filtratet 2 35 gange med ether (for at fjerne det fra natriumacetatet frigjorte eddikesyre), og der inddampes ved stuetemperatur og formindsket tryk til et mindre volumen (2-3 ml) og tilsættes den dobbelte mængde 23 149063 methanol. Opløsningen hældes over en søjle af 150 g basisk aluminiumoxid og elueres derefter med methanol/ vand (2:1), idet man følger ultravioletabsorptionen ved 254 nm, indtil hovedproduktet indfinder sig i 5 eluatet. De fraktioner, der indeholder hovedprodukter, inddampes under formindsket tryk og frysetørres herefter. Man får således 780 mg (96% af det teoretiske udbytte) oroty1-L-histidy1-L-prolinamidhydrat.

Smp. 250°C; [a]^ = -45,8° (c = 1, methanol).

10

Eksempel 4

Man går frem som i eksempel 3b), men anvender dog i stedet for natriumacetat 100 mg magnesiumoxid og undlader at behandle med ether efter fraskillelse 15 af katalysatoren. Man opnår på denne måde samme forbindelse som i eksempel 3b) i et udbytte på 97% af det teoretiske.

Eksempel 5 20 100 mg af en 5%'s palladium-carbon-katalysator forhydreres i 15 ml iseddiké. Herefter tilsætter man 850 mg 5-chlororotyl-L-histidyl-L-prolinamid opløst i 30 ml iseddike og ryster ved stuetemperatur og normaltryk med hydrogen. Efter optagelse af 2 mmol hydrogen 25 filtreres, inddampes til et mindre volumen og tilsættes absolut ether. Bundfaldet fraskilles, vaskes med ether og tørres herefter, hvorved man opnår orotyl-L-histidyl-L-prolinamidhydrochloridet i næsten kvantitativt udbytte.

Til analyse af dette produkt (hvis chlorindhold påvistes 30 kvalitativt) opløstes det i vand. Der udrørtes med magnesiumoxid, hvorpå der filtreredes. Filtratet oparbejdes på samme måde som i eksempel 3 b), hvorved der fremkom orotyl-L-histidyl-L-prolinamidhydrat, identisk med den i eksempel 1, 2 og 3 b) fremstillede for-35 bindelse

Eksempel 6

Ud fra 5-bromorotsyre fremstiller man analogt 24 149063 med eksempel 3 a) 5-bromorotyl-L-histidyl-L-prolin-amidet og underkaster dette en hydrogenolyse under de Λ eksempel 4 nævnte betingelser. Man opnår på denne måde orotyl-L-histidyl-L-prolinamidhydrat i et udbytte 5 på 39% af det teoretiske (udregnet på 5-bromorotsyre), hvilken forbindelse er identisk med den i de foregående eksempler opnåede.

Eksempel 7 10 9,7 g L-5-oxo-thiomorpholin-3-carboxylsyre (Tetrahedron, 28 4503-13 (1972)) og L-histidyl-L-prolin-amiddihvdrobromid fremstillet ud fra 23,2 g N-benzyloxy-carbonyl-L-histidyl-L-prolinamid som i eksempel 2 sættes til 150 ml dimethylformamid. Man afkøler til -10°C, 15 tilsætter under omrøring 16,7 ml triethylamin og kort derefter ved den samme temperatur en opløsning af 12,3 g N,N1-dicyclohexylcarbodiimid i 50 ml dimethylformamid.

Man omrører i 24 timer, hvorunder man langsomt lader temperaturen stige til stuetemperatur. Derefter frasuger 20 man bundfaldet, inddamper filtratet under formindsket tryk og sætter den således opnåede rest til 200 ml vand.

Efter 2 timers opbevaring ved stuetemperatur frasuges, og filtratet behandles beskrevet som i eksempel 2 med en kationbytterharpiks og derefter med 1 N ammoniak. De 25 forenede ammoniakaiske filtrater inddampes under formindsket tryk ved temperaturer under 35°C. Resten underkastes modstrømsfordeling i et system af n-butanol/vand.

De fraktioner, der indeholder hovedproduktet, samles og inddampes under formindsket tryk. Resten opløses i vand, 30 behandles med aktivt kul og frysetørres. Man får 6,9 g = 30% af det teoretiske udbytte af L-5-oxo-thiomorpholin- 3-carbonyl-I,-histidyl-L-prolinamidhydrat.

Smp. 155-157°C? ία]33 = -48,5° (c = 0,52, methanol).

35

Eksempel 8 a) 53,0 g benzyloxycarbonyl-L-histidyl-L-prolin-methylester (fremstillet i overensstemmelse med 25 149063

St. Guttmann, Helv. Chem. Acta 44, 721 (1961)) opløses i 200 ml dioxan og 50. ml vand og forsæbes under omrøring ved stuetemperatur ved portionsvis tilsætning af den nødvendige mængde 1 N-natriumhydroxidopløsning under 5 anvendelse af thymolphthalein som indikator. Efter endt forsæbning indstilles opløsningens pH-værdi på 8.

Derefter befries forsæbningsblandingen under formindsket tryk for opløsningsmiddel. Inddampningsresten opløses i vand og ekstraheres 3 gange med eddike-10 syreethylester/sek.-butanol (4:1). Derpå gøres den vandige fase sur til pH 3 med saltsyre, og der inddampes under formindsket tryk. Til remanensen sættes ca. 200 ml absolut ethanol, og efter længere tids henstand i isbad filtreres. Filtratet inddampes under 15 formindsket tryk. Efter tørring fås 39,6 g = 77% af det teoretiske udbytte af benzyloxycarbonyl-L-histidyl-L-prolin i form af en skumagtig størknet masse.

[a]23 = -56,3° (c = 1, methanol).

b) 39,4 g benzyloxycarbonyl-L-histidyl-L-prolin 20 opløses i 200 ml iseddikesyre, og under omrøring i ishad tilsættes 170 ml af en 40%'s opløsning af hydrogen-bromid i iseddikesyre. Efter 5 minutters forløb fjernes, isbadet, og reaktionsblandingen omrøres i 90 minutter ved stuetemperatur. Dipeptiddihydrobromidet udfældes 25 ved tilsætning af ca. 500 ml tør ether, frafiltreres, opløses i 150 ml absolut methanol og udfældes påny ved tilsætning af ca. 700 ml tør ether. Supernatantopløsningen afdekanteres fra det udfældede bundfald. Efter fjernelse af opløsningsmiddelrester under formindsket tryk opnås 30 35,7 g = 84% af det teoretiske udbytté af L-histidyl-L-prolindihydrobromid i form af en hygroskopisk, skumagtig størknet masse.

[a]22= -40,5° (c = 1, methanol).

c) 4,1 g L-5'-ΟΧΟ-thiomorpholin-3-carboxylsyre og 35 3,6 g 1-hydroxybenzotriazol opløses i 55 ml di- methylformamid, og under omrøring i isbad tilsættes en opløsning af 5,2 g Ν,Ν'-dicyclohexylcarbodiimid i 20 ml dimethylformamid. Der omrøres i 10 minutter i isbad og 26 149063 derefter 2 timer ved stuetemperatur. Den således opnåede opløsning af N-hydroxysuccinimidesteren sættes til en opløsning af 8,3 g L-histidin-L-prolindihydro-bromid i 90 ml dimethylformamid, til hvilken opløsning 5 der under omrøring i isbad er sat 8,4 ml triethylamin.

Der omrøres videre i 20 timer ved stuetemperatur. Det udfældede bundfald frafiltreres. Filtratet inddampes under formindsket tryk. Til remanensen sættes 100 ml vand, og blandingen opbevares i isbad i flere timer.

10 Bundfaldet frafiltreres. Filtratet inddampes under formindsket tryk. Rensningen foregår ved søjlechroma-tografi over kiselgel 60 (0,2 til 0,5 mm) i methanol.

De opsamlede fraktioner, som indeholder det ønskede produkt, inddampes under formindsket tryk. Til ind-15 dampningsresten sættes methanol, og der filtreres, hvorpå filtratet inddampes under formindsket tryk.

Den fedtede inddampningsrest opløses i vand, og der frysetørres. Der fås 3,8 g = 48% af det teoretiske udbytte af L-5-oxo-thiomorpholin-3-carbonyl-L-histidyl-L-20 prolin.

[a]^ = -45,3° (c = 0,5, methanol).

d) 198 mg L-5-oxo-thiomorpholin-3-carbonyl-L-histidyl- L-prolin opløses i vand, og der tilsættes 0,5 ml 1 N saltsyre og frysetørres. Der frysetørrede produkt og 25 63 mg N-hydroxysuccinimid opløses i 6 ml dimethyl- formamid, og vinder omrøring ved stuetemperatur tilsættes en opløsning af 103 mg N,N'-dicyclohexylcarbodiimid i 1,7 ml tetrahydrofuran. Efter at der er omrørt i 2 timer ved stuetemperatur, tilsættes 1 ml af en koncentreret 30 vandig ammoniakopløsning. Derpå omrøres der i 5 minutter ved stuetemperatur, hvorefter der inddampes under formindsket tryk. Til inddampningsresten sættes vand og filtreres. Filtratet behandles som beskrevet i eksempel 2 med en kationbytterharpiks (ca. 10 g) og derefter 35 med 1 N ammoniakopløsning. Filtratet inddampes under formindsket tryk. Inddampningsresten underkastes modstrømsfordeling i systemet n-butanol/vand. De kombinerede fraktioner, som indeholder hovedproduktet, inddampes 27 149063 vinder formindsket tryk, og der opløses i vand og frysetørres. Der fås 61 mg = 30% af det teoretiske udbytte af L-5-oxo-thiomorpholin-3-carbonyl-L-histidyl-L-prolinamidhydrat.

5 [a]^ = -48,6° (c = 0,5, methanol).

Eksempel 9 a) 12,0 g L-cystin opløstes i 300 ml flydende ammoniak.

Man tilsatte under omrøring så meget natrium (ca. 5,0 g) 10 i små portioner, at den dybblå farve forblev i ca.

20-30 sekunder og på denne måde viste et ringe natriumoverskud. Ved tilsætning af nogle krystaller ammonium-chlorid affarvedes. Nu tilsattes 10,8 g 2-chlorpropion-syreamid under omrøring. Man omrørte i 10 minutter, 15 hvorefter man afdampede ammoniakken. Resten blev optaget i ca. 150 ml vand, og opløsningens pH-værdi indstillet med koncentreret saltsyre til 7. Efter filtrering, blev filtratet inddampet vinder formindsket tryk, resten blev tørret over phosphorpentaoxid og derefter sus-20 penderet i 200 ml iseddike. Blandingen blev opvarmet 10 minutter til kogepunktet. Herefter blev iseddiken afdampet under formindsket tryk. Resten ekstraheredes 3 gange med 200 ml varm methanol hver gang. De forenede ekstrakter blev inddampet, og resten blev opløst i 25 50-100 ml vand. pH-værdien af opløsningen indstilledes til ca. 2. Den derved spontant igangsatte krystallisation fuldendtes ved 0°C. Krystallerne blev suget fra og omkrystalliseret 2 gange med 50 ml vand pr. gang.

Man opnåede efter tørring over phosphorpentaoxid 6,6 g 30 = 38% af det teoretiske udbytte af thiomorpholin-5-on-6(D,L)-methy1-3(L)-carboxylsyre. Produktet var tilstrækkeligt rent til videre omsætning. Til analyseformål omkrystalliserede man endnu 2 gange med 80 ml ethanol pr gang og 2 gange med 90 ml ethanol/vand pr, gang 35 (1;1), og man fik således den ønskede syre i form af hvide små nåle med smp. 186-188°C; +37,7° (c = 1, methanol).

C6HgN03S (175,2) 28 149063

Beregnet: C 41,35 H 5,17 N 7,98 S 18,30 Fundet : C 41,03 H 5,09 N 8,06 S 18,01 b) 17,5 g thiomorphlin-5-on-6(D,L )-methyl-3(L)-carboxylsyre, 14,4 g 1-hydroxybenzotriazol og L-5 histidyl-L-prolinamiddihydrobroinid fremstillet ud fra 38.5 g N-benzyloxycarbonyl-L-histidyl-L-prolinamid som i eksempel 2 opløstes i 200 ml dimethylformamid. Man afkølede til -5°C og tilsatte efter hinanden under omrøring 27,8 ml triethylamin og en opløsning af 20,6 g 10 N,N'-dicyclohexylcarbodiimid i 30 ml dimethylformamid.

Man lader henstå 1 time i kølebad (-5 til 0°C) oo lader derefter i løbet af 12 timer under omrøring stige til stuetemperatur. Efter dette tidsrum frasuges det opnåede bundfald. Filtratet inddampes under formindsket tryk 15 ved 35°C. Resten tilsættes 150 ml vand og opbevares i 12 timer ved 0°C, herefter filtrerer man, og filtratet behandles som beskrevet i eksempel 2 med en kationbytter og derefter med 1 N ammoniak. Filtratet inddampes under formindsket tryk og frysetørres herefter. Herefter om-20 krystalliseres 2 gange med 75 ml vand pr. gang, 1 gang med 50 ml ethanol/vand (1:1) og herefter 3 gange med 50 ml vandmættet n-butanol. Tørring over phosphor-pentaoxid giver thiomorpholin-5-on-6(D,L)-methyl-3(L)-carbonyl-L-histidyl-L-prolinamidtrihydrat. Ved om-25 krystallisation af resten af de samlede og inddampede moderlude fik man yderligere mængder af denne forbindelse. Det samlede udbytte beløber sig derefter til 14.5 g = 31,4% af det teoretiske udbytte.

Smp. 140-142°C; [a]J5= -33,5°C (c = 1, methanol).

30 C17H24Ng04S.3H20 (462,5)

Beregnet: C 44,15 H 6,55 N 18,17 S 6,93 Fundet : C 44,69 H 6,47 N 18,52 S 6,54 ^ Eksempel 10

Man går frem på samme måde som i eksempel 8, men anvender dog L-5-oxo-thiomorpholin-6,6-dimethyl-thiomorpholin-3-carboxylsyre i stedet for L-5-oxo-

Claims (7)

149063 thiomorpholin-3-carboxylsyre og får på denne måde L-5-oxo-6,6-dimethyl-thiomorpholin-3-carboxyl-L-histidyl-L-prolinamid med smeltepunkt 140-142°C i et udbytte på 48% af det teoretiske. 5 [a]22 = -67,5° (c = 0,5, methanol) C18H26°4N6S (422'5) C Η N S Beregnet: 51,20% 6,21% 19,89% 7,58% Pundet : 50,17% 6,32% 18,40% 8,19% 10 Eksempel 11 Man går frem på samme måde som i eksempel 7, idet man dog anvender L-5-oxo-6-{n-propyl)-thiomorpholin-3-carboxylsyre, og man får på denne måde L-5-oxo-6-(n-15 propyl)-thiomorpholin-3-carbonyl-L-histidyl-L-prolinamid. Udbytte 51% af det teoretiskét. [a]23 = -87,1° (c = 0,5, methanol) C19H28N4°6S (436'5) C Η N S

20 Beregnet: 52,35% 6,48% 19,27% 7,35% Pundet ; 51,90% 6,79% 19,16% 7,29%

25 PATENTKRAV

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af TRH-analoge derivater af histidylprolinamid med den almene formel I

30 Z \ 1=1 i ί v^H i0NH2 1 i é^Rl ch, i— f ^C0-NH—CH-CO-N H \__ 35 hvilken formel Z betyder en af grupperne 149063 on ΐ4 a) —N=C - CH- eller -NH-CO-CH, eller b) -C-S-CH-- *2 *2 *5 1 RΔ & R 1 2 5 og hvor R sammen med R betegner en yderligere binding mellem de to carbonatomer, der bærer disse grupper, eller, når Z betyder gruppen b), er et hydrogenatom, 4 5 medens R og R er ens eller forskellige og hver især betegner et hydrogenatom eller en alkylgruppe med 10 1-3 carbonatomer, eller salte af disse forbindelser med farmaceutisk acceptable syrer, kendetegnet ved, at man a) omsætter histidylprolinamid, med eventuelt reversibelt beskyttet l-(3)-stilling i imidazolgruppen i histidyl- 15 gruppen, eller ét deraf ved omsætning med et af en trialkylsilanol eller dialkylsilandiol (med 1-3 carbonatomer i hver alkylgruppe) afledt silyleringsmiddel på i og for sig kendt måde opnået silyleret histidyl-prolinamidderivat, med en carboxylsyre med formlen 20 » S II I !^R /C

25 N ^"'"COOH U Y hvori R1 og Z betegner det samme som ovenfor, og Y betegner et hydrogenatom eller en hydrogenolytisk fra-30 spaltelig gruppe, i nærværelse af et vandbindende middel, eller med et funktionelt derivat af en syre med formlen II, og at man om nødvendigt på i og for sig kendt måde derefter fraspalter gruppen Y, beskyttelsesgruppen for imidazolgruppen i histidylresten, og/eller eventuelt 35 tilstedeværende silylgrupper, eller at b) omsætter prolinamid med en forbindelse med formlen 149063 j=I D V" = i i-*1 9¾ Cf B CO-NH-CH-COOH tf . hvori r\ Z og Y betegner det samme som ovenfor, og som har en eventuelt reversibelt beskyttet 1-(3)-10 stilling i imidazolgruppen, i nærværelse af et vandbindende middel, eller med et funktionelt derivat af en forbindelse med formlén III, og at man derefter fraspalter eventuelt ti1stedeværehde beskyttelsesgrupper, eller at man 15 c) omsætter en forbindelse med formlen N -=i \ " Z~ 'i ks/*® IV • i i Y co-w

20. CH, I i2 /—] <y J ^CO-NH-CH-CO-N^_| hvori R"^, Y og Z betegner det samme som ovenfor, og W 25 betegner en hydroxy- eller en acyloxygruppe, en p-nitrophenoxy-, tri- eller pentachlorphenoxy-, penta-fluorphenoxy-, pyridyloxy-, phenylmercapto-, p-nitrophenylmercapto- eller cyanmethyloxygruppe eller gruppen N-hydroxysuccinimid, 30 og som har en eventuelt reversibelt i 1-(3)-stillingen beskyttet imidazolgruppe, med ammoniak eller et stof, der under reaktionsbetingelserne afgiver ammoniak, og at man derefter fraspalter eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgrupper, eller at man 35 d) til fremstilling af forbindelser med formlen I, hvor Z betegner én af grupperne a), omsætter histi-dylprolinamid, der eventuelt er beskyttet reversibelt, fortrinsvis med hydrogenolytisk fraspaltelige grupper,