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Verfahren zur Herstellung vön Pregnan=11 a, 17 a, 21-triol-3, 20-dion
Zusatz zum Patent 836 203 Gegenstand des Patents 936 207 ist ein Verfahren
zur Herstellung von oxydierten Steroiden, nach welchem man Steroide mit einem oxydierend
wirkenden Stamm einer Pilzart der Ordnung Mucorales oder von aus derartigen Pilzen
erhältlichen oxydierend wirkenden Enzymen behandelt und gegebenenfalls die erhaltenen
oxydierten Steroide in bekannter Weise, z. B. durch Extraktion, abtrennt. Auf diese
Weise können mit einfachen Mitteln aus Steroiden in hoher Ausbeute die entsprechenden
oxydierten Steroide hergestellt werden, die vielfach als Heilmittel bekanntgeworden
sind. Außerdem können nach dem Verfahren des Patents 936 207 neue Verbindungen
hergestellt werden,, welche bisher durch kein anderes Verfahren hergestellt werden
konnten. Die Erfindung bezieht sich auf eine Weiterbildung des Verfahrens nach Patent
936 207, und . das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, das Pregnan-iia,
i7a, 2i-triol-3, 2o-dion durch Behandlung von 4-Pregnen-z7a, 2i-diol-3, 2o-dion
mit einer Kultur einer Pilzart der Gattung Rhizopus oder den daraus erhältlichen
oxydierenden Enzymen herzustellen. In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird also
gleichzeitig die ii-Stellung des als Ausgangsverbindung verwendeten 4-Pregnen-17a,
2i-diol-3, 2odions oxydiert und die q. (5)-ständige Doppelbindung reduziert. Ferner
erhält man nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, im Gegensatz zu den meisten bekannten
chemischen Reduktionsverfahren, die »normale« Verbindung (A: B = cis) an
Stelle der bei
den üblichen Hydrierverfahren- gebildeten »Alloa-Verbindung
(A: B = trans) bzw. des Gemisches beider Isomeren. Das erfindungsgemäß herstellbare
Pregnan-iia, 17a, 2i-triol-3,, 2o-dion wurde bisher in der Literatur noch nicht
beschrieben. Die Verbindung ist für sich physiologisch wirksam und als Zwischenprodukt
für die Synthese anderer in ii-Stellung' oxydierter Steroide von Bedeutung. Wenn
es auch möglich ist, die Kulturlösung mit dem darin enthaltenen iza, i7a, 2i-Trioxypregnan-3,
2o-dion unmittelbar weiterzuverwenden, so ist es doch in vielen Fällen vorteilhaft,
das Steroid zunächst aus dem Reaktionsgemisch abzutrennen. Von den Pilzen der Gattung
Rhizopus haben sich gewisse Arten, z. B. Rbizopus arrhizus oder Rhizopus nigricans,
zur Herstellung des Pregnan-iia, 17a, 2i-triol-3, 2o-dions aus 4-Pregnen-17a, 2i-diol-3,
2o-dion als besonders geeignet erwiesen.
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Es ist zwar schon versucht worden, Steroide mit Nebennierenrindenhomogenaten
bzw. durch das Perfu5ionsverfahren enzymatisch zu oxydieren, jedoch verläuft dabei
die Oxydation in anderer Richtung als bei dem erfindungsgemäßen Verfahren. Zudem
sind die verwendeten enzymatischen Rohstoffe im Gegensatz zu den nur als Schlachthausabfall
in sehr begrenzten Mengen zur Verfügung stehenden Nebennieren industriell herstellbar,
so daß es daher auch in großem Maßstab ausgeführt werden kann.
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Es ist auch vorgeschlagen worden, Steroide unter Verwendung des Pilzes
Proactinomyces roseus aus der Ordnung Moniliales zu oxydieren. Dabei kommt es.jedoch
nicht zum Eintritt einer Hydroxylgruppe in die iia-StelIung des Steroidmoleküls.
Es werden außerdem nicht die Ausbeuten wie bei Verwendung von Pilzen der Ordnung
Mucorales erreicht.: Nach der Erfindung wird vorzugsweise ein lebensfähiger Pilz
mit dem Steroid unter Fermentationsbedingungen in Gegenwart eines für den Pilzgeeigneten
Nährbodens oxydiert. Das folgende Beispiel,erläutert das erfindungsgemäße Verfahren.
Beispiel: Es wurde eine Nährlösung aus 2o g Dextrose (bekannt unter dem Handelsnamen
»Cerelosea), 40 g Maisquellwasser und 4 g Natriumnitrat in 11 Leitungswasser bereitet
und auf einen p$ Wert von 5,5 eingestellt. 41 dieser Nährlösung wurden bei einem
Dampfdruck von etwa 0,4 kg/cm2 in einer etwa 221 fassenden Flasche aus Spezialglas
(bekannt unter dem Handelsnamen »Pyrekglasa) sterilisiert, sodann mit Rhizopus nigricans
geimpft und 3o Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Sodann wurde i g 4-Pregnen-i7a,
2i-diol-3, 2o-dion, in einer kleinen Menge absolutem Äthanol gelöst, zugesetzt und
die Bebrütung weitere 112 Stunden fortgesetzt. Der p.-Wert betrug sodann
7,9. Die gesamte, das Mycel enthaltende Würze wurde aufeinanderfolgend zweimal
mit dem ihrem halben und dann zweimal mit dem ihrem . Viertelvolumen entsprechenden
Volumen Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten Methylenchloridextrakte wurden
je zweimal mit dem ihrem Zehntelvolumen entsprechenden Volumen 2°/oiger wäßriger
Natriumbicarbonatlösung und mit Wasser gewaschen. Nach dem. Trocknen des Methylenchlorids
mit etwa 3 bis 5 g wässerfreiem.Na2SO4 je 1 Lösungsmittel und Filtrieren, wurde
das Lösungsmittel abdestilliert.
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Die i,go8 g wiegenden Methylenchloridextrakte wurden in
7,30 cm3 Äthylendichlorid gelöst und über 150 g synthetischem Magnesiumsilikat
(bekannt unter dem Handelsnamen »Florisila) unter Verwendung von je 230 cm3
betragenden Lösungsmittelmengen, wie aus der nachstehenden Tabelle ersichtlich 'ist,
chromatographiert.
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Die Eluatfeststoffe der Fraktionen 2o bis 26 wurden vereinigt, in
25 em3 Methylenchlond gelöst und mit 0,5 g Magnesiumsilikat (bekannt unter dem Handelsnamen
»Magnesola) in bekannter Weise entfärbt, anschließend filtriert und mit Methylenchlorid
gewaschen. Das Filtrat und die Waschflüssigkeit wurden zur Trockene verdampft. Der
Rückstand wurde mit 5 cm3 Methylenchlorid gewaschen. Das Unlösliche wurde,in 15
cm3 Aceton gelöst, filtriert, die Lösung zur Trockene verdampft und der Rückstand
mit 5 cm3 Äthei gev@aschen. Es. wurden 86 mg kristallines Pregnan-iia, 17a, 2i-triol-3,
2o-dion erhalten; F. = igo bis i96°; [a]D = -+- 57° (in Chloroform).
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Das Infrarotspektrum zeigte, in Mineralöl gemessen, Absorptionsbanden
für die Hydroxylgruppen bei 3533 und 3444 mY und für die Ketogruppen bei 1704 und
1713 mau.
| Tabelle |
| Extra- |
| Fraktion Lösungsmittel hierte |
| Feststoffe |
| in mg |
| 1 Äthylendichlorid 16,4 |
| 2 Äthylendichlorid Aceton 25: 1 114,9 |
| 3 Äthylendichlorid Aceton 25: 1 187,4 |
| 4 Äthylendichlorid Aceton 15: 1 51,7 |
| 5 Äthylendichlorid Aceton 15 : 1 17,8 |
| 6 Äthylendichlorid Aceton 12: 1 6;7 |
| 7 Äthylendichlorid Aceton =2: 1 12,1 |
| 8 Äthylendichlorid Aceton io : 1 8,2 |
| g. Äthylendichlorid Aceton io : 1 4,6 |
| io Äthylendichlorid Aceton io : 1 9,6 |
| i1 Äthylendichlorid Aceton 8: 1 9,4 |
| 12 Äthylendichlorid Aceton 8: 1 2o,6 |
| 13 Äthylendichlorid Aceton 8: 1 26,7 |
| 14 Äthylendichlorid Aceton 8: 1 31.4 |
| 15 Äthylendichlorid Aceton 8: 1 25,8 |
| 16 Äthylendichlorid Aceton 5 : 1 25,2- |
| 17 Äthylendichlorid Aceton 5 : 1 5ö,1 |
| 18 Äthylendichlorid Aceton 5 : 1 52,2 |
| ig Äthylendichlorid Aceton 5 : 1 5o,6 |
| 20 Äthylendichlorid Aceton 2 : 1 42,2 |
| 21 Äthylendichlorid Aceton 2: 1 1559 |
| 22 Äthylendichlorid Aceton 2 : 1 144,5 |
| 23 Aceton 81,1 |
| 24 Aceton 185,2 |
| 25 Aceton 50,0 |
| 26 Aceton 17,0 |
| Gesamtmenge 1367,3 |
Durch Behandlung des Pregnan-iia, i7a, 2i-triol-3, 2o-dions mit
einem Acylierungsmittel in bekannter Weise kann man die Ester des Pregnan-iia, 17a,
2i-triol-3, 2o-dions herstellen, und zwar erhält man bei Verwendung von Acylierungsmittel
und Steroid in etwa äquivalenten Mengen vorwiegend das monoacylierte, bei Verwendung
der doppelt äquivalenten Mengen, des Acylierungsmittels oder mehr vorwiegend das
diacylierte Produkt.