DE87906C - - Google Patents

Description

KAISERLICHES

PATENTAMT.

PATENTSCHRIFT

• KLASSE 30: Gesundheitspflege.

Patentirt im Deutschen Reiche vom 16. März 1895 ab.

A. Das Darstellungsverfahren.

Zur Reindarstellung des Thyreoprote'i'ds, dessen Eigenschaften weiter unten beschrieben werden sollen, sind folgende Vorrichtungen und Materialien erforderlich:

i. eine Centrifugalmaschine, 2. eine Rührmaschine, 3. eine Fleischhackmaschine, 4. eine Maschine zum Abpressen des Drüsenextractes, 5. eine bei Zimmertemperatur gesättigte Ammon-■ sulfatlösung, 6. eine 0,5 und 0,25 proc. Salzsäure (z. B. auf ι 1 destillirtes Wasser 20 bezw. 10 ecm Salzsäure vom spec. Gewicht 1,125), 7. einige Dialysatoren, 8. destillirtes Wasser, Lösungen von Chlorbaryum und Silbernitrat, Alkohol, Aether, bestes schwedisches und einfacheres Filtrirpapier, Waage, Mefscylinder etc.

Die Materialien, aus welchen das Thyreoproteid dargestellt werden kann, sind hauptsächlich Schilddrüsen (vom Rind, Kalb, Schaf, Pferd, Schwein), denn im Blut und in den Organen der Thiere befinden sich nur sehr Ideine Mengen dieses Stoffes.

Die Schilddrüsen werden im Schlachthause möglichst rein präparirt; besondere Sorgfalt ist dabei nur auf Sauberkeit zu legen, denn Fett und Bindegewebe haben keinen Einfiufs auf die Darstellung und werden leicht und vollständig beseitigt. Die ausgeschnittenen Drüsen werden am besten direct in wenn möglich alkoholfreiem Aether gesammelt (Anwesenheit gröfserer Mengen Alkohol beeinflufst die Ausbeute beträchtlich) und können so Wochen lang ohne Schaden conservirt werden; bei längerem Stehen sammelt sich oft am Boden des Gefäfses eine gallertartige Masse, welche hauptsächlich aus dem Thyreoprote'id besteht; sie darf daher nicht weggeworfen werden. Statt Aether können auch andere conservirende Mittel, wie z. B. Chloroformwasser (nur mufs ein grofser Ueberschufs an Chloroform zugesetzt werden), Fluorverbindungen in 1 proc. Lösung etc. gebraucht werden, sie stehen aber weit hinter Aether zurück.

Hat man einige Kilogramm Drüsen gesammelt, so wird der Aether abgegossen. Er enthält aufser Fett eine ziemlich beträchtliche Menge Paramilchsäure und kann, nachdem er neutralisirt und destillirt worden ist, wieder verwendet werden. Die Drüsen werden hierauf mittelst einer guten Fleischhackmaschine fein zerhackt; der Brei wird in einem geräumigen, gut verschliefsbaren Gefäfs von bekanntem Gewicht mit dem anderthalbfachen Gewicht destillirten Wassers, welches mit einem fäulnifshindernden Agens versetzt, z. B. mit Thymol gesättigt worden ist, Übergossen, gut durchgerührt und 24 Stunden an einem kühlen Orte stehen gelassen, während welcher Zeit er einige Male tüchtig durchgerührt werden mufs. Dann wird das Extract vermittelst einer Prefsvorrichtung gut abgeprefst. Die Drüsenreste enthalten alsdann nur noch sehr wenig Thyreoprote'ide und auch nicht mehr viel vom Ferment.

Das erhaltene Extract wird nun colirt und am besten gleich centrifugirt, um auf diesem Wege von den suspendirten Zellen und Drüsenpartikelchen befreit zu werden; steht keine Centrifugalmaschine zur Verfügung, so mufs das Extract filtrirt werden, was nur äufserst langsam vor sich geht. Um Fäulnifs zu vermeiden, mufs ein grofser Ueberschufs eines fäulnifshindernden Agens, z. B. Thymol, zu-

gesetzt werden. Ist das Extract auf diese oder andere Weise gereinigt worden, so erfolgt die Reindarstellung des Thyreoprote'ids, welche in folgender Weise erreicht werden kann:

I. Das Extract wird mit dem gleichen Volumen einer vortheilhaft bei Zimmertemperatur (15⁰ C.) vollständig gesättigten und filtrirten Lösung , von Ammoniumsulfat (N H₄^)₂ S O₄ versetzt und gut durchgemengt. Es bildet sich sogleich ein starker Niederschlag, welcher hauptsächlich aus dem Thyreoprote'id besteht. Obwohl noch Spuren von Prote'id in Lösung bleiben, ist es nicht rathsam, dem Extract mehr Ammoniumsulfat zuzusetzen.

Der erhaltene Niederschlag wird centrifugirt, mit halbgesättigter Ammoniumsulfatlösung (gleiche Volume gesättigter Lösung und destillirten Wassers) zweimal aufgerührt und wieder centrifugirt; darauf wird er gesammelt, in destillirtem Wasser gelöst, was, wenn man genug Wasser zugegeben hatte, leicht von statten geht, und dann filtrirt. Die erhaltene Lösung wird so weit verdünnt (durch Zusatz von destillirtem Wasser), bis sie eine hellgelbe Farbe angenommen hat und ganz durchsichtig geworden ist; manchmal fallen dabei einige halbdurchsichtige Fädchen oder Klümpchen aus, auf die keine Rücksicht zu nehmen ist.

Die Lösung wird zum zweiten Male mit einem gleichen Volumen gasättigter Ammoniumsulfatlösung vermischt und der entstehende Niederschlag centrifugirt und mehrere Male mit halbgesättigter Ammoniumsulfatlösung gewaschen. (Es ist klar, dafs diesmal das Thyreoprotei'd mit einer mehr als halbgesättigten Ammoniumsulfatlösung niedergeschlagen wird, da von den Prote'iden ziemlich viel Salz vom ersten Ausfällen in Lösung gegangen. ist.) Beim zweiten Ausfällen wird alles in Lösung befindliche Thyreoprote'id niedergeschlagen.

Um mit Bestimmtheit auf ein brauchbares fermentfreies Präparat rechnen zu können — und nur ein solches darf für die Behandlung der Basedow 'sehen Krankheit gebraucht werden —, mufs die Operation des Auflösens und Niederschlagens, genau wie angegeben, zum dritten Mal wiederholt werden; auch diesmal mufs zum Auflösen des Niederschlages viel destillirtes Wasser angewendet werden. Der centrifugirte Niederschlag wird mit einer geringen Menge halbgesättigter Ammonsulfatlösung aufgerührt und auf ein grofses Filter gebracht (zweckmäfsig bringt man unter ein Papierfilter noch eine Unterlage aus Kaliko oder grobmaschiger Leinwand).

Steht keine grofse Centrifuge zur Verfügung, so läfst man das Gefäfs, in welchem das Ausfällen vorgenommen worden ist, an einem kühlen Orte ruhig stehen und zieht, nachdem der Niederschlag sich abgesetzt hat, was sehr unvollkommen geschieht, die. obenstehende Flüssigkeit vermittelst eines Hebers ab, dessen in die Flüssigkeit eingetauchtes Ende zweckmäfsig nach aufwärts gebogen ist, um den Niederschlag nicht aufzurühren. Auch nach 48 stündigem Stehen kann kaum ein Viertel von der. ganzen Flüssigkeit abgegossen werden. Nun bringt man den Niederschlag auf eine Reihe grofser Filter und läfst das Salzwasser abtropfen. Nach 24 Stunden thut man gut, die im tieferen Theil der Filter stehende Masse abzugiefsen und auf frische Filter zu bringen. Der auf den Filtern sich befindende Niederschlag wird mit frischer halbgesättigter Ammonsulfatlösung Übergossen. Nachdem die Flüssigkeit abgetropft ist, oder (was gewöhnlich der Fall ist) wenn nach 24 Stunden das Salzwasser im Trichter die tiefer liegenden Theile des Niederschlages noch bedeckt, giefst man es ab und erneuert es zum zweiten Mal, um nach wieder 24 Stunden den Rest abzugiefsen. Wie man aus eben Gesagtem ersieht, geht die Reinigung des Thyreoprote'ids, wenn keine Centrifuge zur Verfügung steht, sehr langsam vor sich und es vergehen gewöhnlich 2 bis 2¹J₂ Woche bis zur Fertigstellung des Präparates (die Dialyse mit gerechnet).

Ist der Niederschlag ausgewaschen, so bringt man ihn sammt dem Filter auf eine dicke Schicht einfaches Filtrirpapier und läfst ihn ruhig liegen, bis alles überflüssige Salzwasser aufgesaugt wird, er kann nun im Vacuum getrocknet und dann ohne zu verderben lange Zeit aufbewahrt werden. Vor dem Gebrauch aber mufs er einer gründlichen Dialyse unterworfen werden. Damit während der Dialyse kein Niederschlag entsteht, mufs gegen eine 1 bis Y₂ proc. Kochsalzlösung dialysirt werden. Man kann auf diese Weise das Ammoniumsulfat vollständig ausdialysiren, ohne dafs dabei auch nur eine Spur des Thyreopote'ids verloren geht. Die Dialyse wird so lange fortgesetzt, bis sich im Dialysator ein Niederschlag zu bilden beginnt; gewöhnlich ist zu dieser Zeit fast alles Ammoniumsulfat ausdialysirt. Die Dialyse mufs dann unterbrochen werden, weil der ausgefallene Niederschlag sich auch in Alkalien sehr schwer löst. Die Flüssigkeit wird nun aus dem Dialysator genommen, filtrirt, im Vacuum stark " eingeengt, am besten bei 35⁰C, und wieder der Dialyse unterworfen, bis ein Niederschlag sich zu bilden beginnt. Jetzt bleiben nur Spuren von Ammoniumsulfat in Lösung, welche keine Bedeutung mehr haben. Nun giefst man die erhaltene Lösung in flache Schalen ab, so dafs nur einige Millimeter dicke Schichten entstehen, und bringt sie in einen grofsen Exsiccator über Phosphorsäureanhydrid oder Chlorcalcium. Nach einigen Tagen verdunstet das Wasser (im Vacuum geschieht es selbsverständlich schneller und bei Anwendung der Pf lüger'sehen Quecksilberpumpe schon in

einigen Stunden) und man erhält das Thyreoprotei'd in trockenem Zustande in der Form gelblicher durchsichtiger Lamellen, welche leicht und gut in destillirtem Wasser bezw. physiologischer Kochsalzlösung löslich sind.

II. Ein zweites Verfahren, welches ein noch reineres Präparat liefert und das einzige für die Darstellung des Thyreoprote'ids aus dem Blute und Organ thyteoidectomirter Thiere brauchbare ist folgendes.

Nachdem der Niederschlag in der oben beschriebenen Weise gereinigt worden ist, wird er jetzt auf dem Filter direct mit einer 0,5 proc. Salzsäurelösung so lange gewaschen ■— die Flüssigkeit mufs den Rand des Filters überragen —, bis alles Ammom'umsulfat entfernt worden ist. Der Niederschlag wird dabei ganz weifs und bildet eine feste undurchsichtige Membran, welche dem Filter sehr fest anliegt. Durch diese Membran sickert die Salzsäurelösung nur sehr langsam hindurch und das Auswaschen des Ammonsulfates und auch anderer löslicher Salze geschieht mehr auf dem Wege der Diffusion; die im Trichter sich befindende Flüssigkeit mufs daher oft gewechselt werden. Das Waschen wird fortgesetzt, bis Chlorbarium keine Schwefelsäurereaction mehr giebt; aber auch jetzt mufs auf den Niederschlag 2 bis 3 Mal frische 0,125 proc. Salzsäurelösung aufgegossen und jedes Mal einige Stunden damit in Berührung gelassen werden. Nun' wird die 0,5 proc. Salzsäure durch eine 0,25 proc. ersetzt und oft gewechselt; der Niederschlag beginnt dabei schon nach kurzer Zeit zu quellen und wird in dickerer Schicht gelblich und halbdurchsichtig. Ist der Niederschlag auf der ganzen Filterfläche gequollen-, so giefst man die Salzsäurelösung ab und ersetzt sie durch destillirtes Wasser, welches im Anfange nur auf den im tieferen Theile des Trichters sich befindenden Niederschlag aufgegossen werden soll. Unter Einwirkung des Wassers quillt das Thyreoprote'id stark auf und bildet eine fast ganz reine, durchsichtige, manchmal hellgelb gefärbte Gallerte. Jetzt giefst man den Trichter voll. Der am Rande des Filters und in dünnerer Schicht ausgebreitete Niederschlag quillt bald sehr stark und hebt sich vom Filter ab. Das Wasser kann aber ohne Verlust des Materials einige Male gewechselt werden. Ist das Prote'id stark gequollen, so läfst man es ruhig unter Wasser stehen, bis es so stark anschwillt, dafs es einer Lösung ähnlich sieht. Ist dieser Punkt erreicht, so kann eine thatsächliche Lösung vermittelst einiger Tropfen einer normalen Natronhydratlösung erhalten werden. Da das Thyreoprote'id in Gegenwart von Salzen durch Säuren gefällt wird, so ent-, steht, sobald noch freie Säure vorhanden ist, bei allmäligem Zusatz des Alkalis ein immer zunehmender Niederschlag, der sich aber bei sehr schwach alkalischer Reaction wieder löst. Man setzt jetzt zweckmä'fsig etwas Chlornatrium zu (oder ein anderes neutrales Salz), rührt um, bis fast alles gelöst wird, und neutralisirt genau; gewöhnlich bleibt aber ein kleiner Theil ungelöst, welcher abfiltrirt werden mufs. Jetzt wird die Lösung auf flache Teller gegossen und getrocknet, wie unter I. angegeben.

Will man die grofse Genauigkeit erfordernde Arbeit des genauen Neutralisirens umgehen, so neutralisirt man nur ungenau, derart, dafs die Lösung noch sehr schwach alkalisch reagirt, und schlägt das Prote'id mit Ammoniumsulfat nieder und verfährt weiter, wie unter I. bezüglich der Dialyse angegeben ist.

Die schwach saure, salzarme Gallerte kann endlich im Vacuum über Natronhydrat und Phosphorsäureanhydrid oder Chlorcalcium getrocknet werden.

Es ist hierbei noch Folgendes zu bemerken:

Anstatt den Niederschlag direct auf dem Filter mit 0,5 proc. Salzsäure zu behandeln, kann man ihn in destillirtem Wasser lösen und mit gleichem Volumen einer 1 proc. Salzsäurelösung fällen und vom gröfsten Theile des Ammoniumsulfatwassers durch nachfolgendes Decantiren befreien. Endgültiges Auswaschen mufs aber auf dem Filter vorgenommen werden.

III. Ein drittes Darstellungsverfahren besteht im Fällen des Thyreoprote'ids vermittelst eines anderen Salzes, z. B. vermittelst Magnesiumsulfats anstatt Ammoniumsulfats. Das Schilddrüsenextract mufs dabei mit dem Salz abgesättigt werden, wobei eine Rührmaschine vorzügliche Dienste leistet. Auch mufs der erhaltene Niederschlag mit völlig gesättigter Lösung dieses Salzes gewaschen werden. Die weitere Behandlung des Präparates geschieht, wie unter I. und II. beschrieben.

IV. Das Thyreoprote'id kann aus dem Drüsenextract direct durch Zusatz einer Säure ausgefällt werden. Am besten verfährt man so, dafs man das Extract mit gleichem Volumen einer 1 proc. Salzsäurelösung mengt, wobei alles in Lösung befindliche Prote'id niedergeschlagen wird; nur selten wird man ein Salz, z. B. einige Cubikcentimeter einer gesättigten Chlornatriumlösung, dem Extract zusetzen müssen, Auch können andere Säuren statt Salzsäure verwendet werden, und am stärksten scheint Salpetersäure zu wirken.

Auch organische Säuren, z. B. Essigsäure, schlagen das Thyreoprote'id nieder. Orthophosphorsäure (H_B P O_tJ, tropfenweise zum Schilddrüsenextract hinzugesetzt, bewirkt eine Ausfällung des Thyreoprote'ids in gallertartiger Form.

Durch diese Methode kann das Präparat bei weitem nicht so rein erhalten werden, wie nach den ersten drei Methoden; das Haematin z. B. ist äufserst schwer zu entfernen.

Der erhaltene Niederschlag wird vermittelst Alkali gelöst und wieder durch Ansäuern niedergeschlagen, dann auf das Filter gebracht, mit Wasser gewaschen, bis er aufquillt, gelöst und wieder ausgefällt, wie unter II. beschrieben.

V. Aufser von Ammonsulfat und Magnesiumsulfat (auch Magnesiumnatriumsulfat) wird aus Protei'd von Chlornatrium, Chlorkalium, Chlorammonium, Chlorbarium, Kalium- und Natriumacetat, Salpeter und noch anderen Salzen nur in Anwesenheit einer Säure gefällt. Das Extract mufs mit einer beliebigen Säure sehr schwach angesäuert werden. Die weitere Behandlung geschieht alsdann, wie unter I. oder II. beschrieben. Will man z. B. Natriumnitrat gebrauchen, so verfährt man zweckmäfsig wie folgt. Das Drüsenextract wird mit dem gleichen Volumen einer gesättigten Lösung dieses Salzes gemengt und einige Cubikcentimeter einer o,iproc. Salzsäurelösung zugesetzt, was genügt, um alles Prote'id auszufällen. Der Niederschlag wird mit schwach angesäuerter Natriumnitratlösung gewaschen und dann in destillirtem Wasser mit einigen Tropfen eines Alkalis gelöst. Hierauf wird wie früher durch Ansäuern oder durch Zusatz der schon vorher angesäuerten Natriumnitratlösung niedergeschlagen. Auch kann das Natriumnitrat durch halbgesättigte Ammoniumsulfatlösung entfernt werden und die Darstellung, wie oben unter I. angegeben, weiter geführt werden. Das nach den Methoden L, II. und III. dargestellte Thyreoprote'id ist, wie aus der Elementaranalyse folgt, chemisch rein.

B. Eigenschaften des Thyreoprote'ids.

Von denselben ist hier das Verhalten zu Eisenchlorid, Tannin und Alkohol zu erwähnen. Mit einigen Tropfen Eisenchloridlösung versetzt, gerinnt das Prote'id, und fast die ganze Flüssigkeit gesteht zu einem halbdurchsichtigen Gallertstück.

Gerbsäure, in sehr kleinen Mengen und zu einer schwach sauren Lösung des Körpers zugesetzt, bewirkt Bildung durchsichtiger Gallertstückchen; in gröfserer Menge und zu einer stärkeren Lösung zugesetzt grobflqckige Fällung.

Alkohol schlägt, wenn die Lösung des Prote'ids nur nicht zu sehr salzarm ist, das Prote'id in groben Flocken nieder, wobei es seine Löslichkeit sehr schnell und vollkommen einbüfst; salzarme Lösungen werden nur von angesäuertem Alkohol gefällt, das Prote'id bewahrt aber dabei seine Eigenschaft, mit Wasser in Berührung gebracht gallertartig aufzuquellen. Manchmal behält es auch seine Löslichkeit in schwachen Alkalien, so dafs bei dem unter II. angegebenen Darstellungsverfahren diese Eigenschaft Anwendung finden kann. Das Präparat löst sich aber oft sehr schwer; in Pulverform aber für innerlichen Gebrauch kann es vielleicht angewendet werden. Nur mufs der Niederschlag womöglich kurze Zeit mit Alkohol in Berührung gelassen werden. Zur Prote'idgallerte wird das dreifache Volumen absoluten Alkohols zugesetzt.

Von den physiologischen Eigenschaften ist zu erwähnen, dafs das Prote'id giftig ist und, in die Blutbahn gebracht, Erscheinungen der strumipriven Cachexie hervorruft. Bei einem entdrüsten Thiere genügen ungefähr 1,5 bis 2,0 g pro Kilogramm Gewicht., Ein 100 g schwerer Frosch erkrankte nach Einführung von 0,2 g in einen Lymphsack an dem Tetanus ähnlichen Krämpfen. Bei Basedow'schen Kranken gehen unter Einwirkung dieses Präparats alle Krankheitserscheinungen zurück, bei ihnen mufs täglich ungefähr 1,0 g innerlich bezw. 0,1 bis 0,2 g subkutan eingeführt werden.

Claims (3)

Patent-Ansprüche:

1. Die Herstellung von Thyreoprote'id aus thyreoprote'idhaltigem Material (insonderheit Schilddrüsen) durch Auslaugen des betr. Materials und Ausfällen des Thyreoprote'ids aus der Lösung durch Salze (wie Ammoniumsulfat, Magnesiumsulfat, Chlornatrium) event, unter Behülfe von Säure oder durch Säure selbst.

2. Die weitere Verarbeitung des nach Anpruch 1 erhaltenen Niederschlags in der Weise, dafs man ihn auswäscht, trocknet, und zwar event, unter Zuhülfenahme von wasseranziehenden Stoffen bezw. Luftleere, und vor dem Gebrauch dialysirt.

3. Das Aufquellenlassen des nach Anspruch 1 gefällten, bezw. nach Anspruch 2 gewaschenen Produktes in wässeriger Flüssigkeit, Lösen in geringen Mengen Alkalis, event, in Gegenwart eines Salzes, und Eintrocknen der event, neutralisirten Lösung oder Wiederfällung des Thyreoprote'ids.