DE862008C - Verfahren zur Einfuehrung von Hydroxyl- und Ketogruppen in die 11-Stellung von Steroiden - Google Patents

Description

• Verfahren zur Einführung von Hydroxyl- und Ketogruppen in die 11-Stellunq von Steroiden Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Einführung von sauerstoffhaltigen Gruppen in Steroide in der ii-Stellung; insbesondere soll eine Hydroxyl-oder Ketogruppe in die ii-Stellung von Steroiden eingeführt werden, bei denen verdünnte Lösungen von Steroiden durch isolierte Nebennieren gepumpt werden, wobei durch biochemische Prozesse Oxy- oder Oxoreste in die ii-Stellung der Steroide eingeführt werden.
• Das Steroid wird in einer Flüssigkeit, die aus Blut, Blutplasma und Blutserum bestehen kann, gelöst und diese Lösung durch eine isolierte Nebenniere eines Säugetieres bei einem Pulsationsdruck von nicht weniger als 40 und nicht mehr als zoo mm Quecksilber gepumpt, zweckmäßig bei Pulsationen zwischen aq. und 18o je Minute. Hierauf wird das in der ii-Stellung oxydierte Steroid aus der Flüssigkeit abgetrennt. Durch das Verfahren ist es möglich, das ii-Desoxycorticosteron von der Formel in Corticosteron von der Formel umzuwandeln. In entsprechender Weise ist es durch die vorgeschlagenen Methoden möglich, eine Sauerstoff enthaltende Gruppe in die ii-Stellung des ii-Desoxy-i7-oxycorticosterons von der Formel einzuführen. Unter anderen Steroiden, die in gleicher Weise in der ii-Stellung oxydiert werden können, befinden sich folgende d 5-Pregnen-3-ol-2o-on-steroide, die sauerstoffhaltige Gruppen in der ii-Stellung entgalten, sind sehr schwierig zu synthetisieren, und bis heute ist noch kein ausführbares Verfahren zu ihrer Herstellung gefunden worden. Solche Verbindungen sind von großem Wert für die Herstellung von Zwischenprodukten bei der Herstellung von Hormonen der Nebennieren der Säugetiere. Das bekannteste dieser Hormone ist Cortison (auch als Verbindung E bezeichnet), ein i7-Oxy-ii-dehydrocorticosteron von der Formel Die Herstellung von Cortison aus Desoxycholsäure ist durch eine außerordentlich verwickelte Reihe von dreiunddreißig Verfahrensschritten ermöglicht worden. (Journal of Biological Chemistry, Bd. 16z [19q.6], S. 6o1 bis 631). Nach dieser Methode sind ausreichende Mengen des Hormons hergestellt worden, um seine bemerkenswerten therapeutischen Eigenschaften nachzuweisen, doch ist das Verfahren zu umständlich, so . daß die Herstellung von Cortison für klinische Zwecke sehr beschränkt ist (Proceedings of the Staff Meeting of the Mayo Clinic, Bd.24 [19q.9], S. 181). Das i7-Oxy-ii-dehydrocorticosteron und verwandte Steroidhormone, wie Cortico'steron, beeinflussen den Kohlehydrat- und Proteinstoffwechsel in der Weise, daß die Umwandlung von Protein in Kohlenhydrate durch die Leber erhöht und der Vorrat der Leber an Glykogen vermehrt wird. Diese Hormone erhöhen zudem die Arbeitsfähigkeit des isolierten' Muskels. Ein sehr wichtiges Anwendungsgebiet für das i7-Oxyii-dehydrocorticosteron ist die Behandlung rheumatischer Arthritis. Bei Anwendung dieser Verbindung wurde bei rheumatischer Arthritis innerhalb weniger Tage eine Besserung erzielt; Schmerzen, Steifigkeit und Bewegungsbeschränkung wurden herabgesetzt, Empfindlichkeit und Muskelschmerzen gelindert; Appetit und Gewicht besserten sich, und das Gefühl, vergiftet zu sein, wurde durch das Gefühl allgemeinen Wohlbefindens ersetzt. Die Rolle des Hormons bei anderen Zuständen, wie Myasthenia gravis und rheumatischem Fieber, ist noch nicht geklärt.
• Nach dem Verfahren der Erfindung ist die Gewinnung von ii-Oxy- und ii-Oxo-Sterinen aus zugänglichen Ausgangsmaterialien möglich, und zwar in reinem Zustand durch einfache und wirksame biochemische Methoden.
• Herausgeschnittene Nebennieren von Säugetieren werden mittels Durchspülen mit einem geeigneten natürlichen oder synthetischen Medium im lebenden funktionsfähigen Zustand erhalten unter Anwendung von Temperaturen von 35 bis 40Q, vorzugsweise von 36 bis 37,j°, wobei dem Durchspülungsmedium das Sterin zugegeben wird, das in der ii-Stellung oxydiert werden soll. Nachdem das Medium zumindest einmal durch die Drüse hindurchgegangen ist, werden die Hormone nach bekannten Verfahren abgetrennt. 'Das Medium für die Durchspülung kann aus Blut, Blutplasma oder Blutserum bestehen. Bei der erfolgreichsten Verfahrensweise bildet Plasma oder reines Blut das am meisten erwünschte Durchspülungsmedium. Reines Blut wird fernervorzugsweise dadurch defibriniert, daß man es eine Herz-Lunge oder ein Leberpräparat passieren läßt, ehe man es als Durchspülungsmedium benutzt, obgleich dies für kurze Durchspülungsperioden nicht notwendig ist. Diese Maßnahme ist wünschenswert, um die Bildung von Gerinnseln zu vermeiden und möglicherweise auftretende gefäßzusammenziehende Substanzen zu entfernen, die den freien Durchfluß des Mediums unterbinden könnten. Andere Medien, wie Blutserum, oder künstliche Medien können bei kurzen Perioden benutzt werden, jedoch sind sie im allgemeinen nicht so günstig wie Plasma oder reines Blut. Wenn man ein anderes Medium als Blut benutzt, muß es isotonisch sein und den gleichen kolloiden osmotischen Druck wie Blut aufweisen. Oft ist es wünschenswert, eine kleine Menge Ascorbinsäure dem Medium zuzusetzen, vorzugsweise etwa 2 mg auf ioo ccm. Erhöhte Mengen an Ascorbinsäure können bei weniger häufiger Erneuerung benutzt werden, beispielsweise wenn zunächst 40 mg auf ioo ccm zugefügt werden, so ist eine Erneuerung vor Ablauf von 2o Stunden Durchspülungsdauer nicht notwendig. Ascorbinsäure ist bei Durchspülungen, die sich über viele Stunden erstrecken, allgemein vorteilhaft. Bei kurzen Durchspülungen ist sie nicht notwendig. Das Durchspülungsmedium sollte unter ständigem, aber pulsierendem Druck zugeführt werden. Der Druck soll nicht unter 4o mm Quecksilber liegen und Zoo mm nicht übersteigen, obwohl es nicht notwendig ist, daß diese Werte zu irgendeinem Zeitabschnitt erreicht werden, Allgemein ist ein Druck zwischen 9o und 130 mm vorzuziehen. Die Pulsationen sollten nicht unter 24 in der Minute liegen und i8o nicht übersteigen. Die Zeitdauer der Durchspülung kann zwischen mehreren Minuten und einigen Stunden betragen, ist jedoch kein wesentlicher Faktor. Es ist nur nötig, daß die Flüssigkeit, die das Sterin enthält, die in Funktion befindliche Drüse wenigstens einmal passiert. Zusätzliche Durchgänge können mehr oxydierte Sterine ergeben, wobei aber weitere Abbauprodukte entstehen können, die unter Umständen die Abtrennung erschweren. Bei der praktischen Ausführung wurde gefunden, daß die rascheren Durchspülungen (5 bis 35 ccm je Minute) die besten Ausbeuten an reinsten Materialien ergeben.
• Unter den Steroiden, die bei dem Verfahren der Erfindung benutzt werden können, befinden sich Progesteron, i7-Oxyprogesteron, ii-Desoxycorticosteron, ii-Desoxycorticosteronacetat und -succinat, ii-Desoxy-i7-oxycorticosteron, Pregnandiol und Pregnanolon, d 4-Androstendion, Isoandrosteron, Dehydroisoandrosteron, d 5-Pregnenolon und verwandte Steroide. Die Konzentration dieser Steroide im Durchspülungsmedium kann i bis Zoo mg je ioo ccm Durchspülungsmedium betragen, vorzugsweise etwa 5o bis ioo mg je Liter.
• Die verwendeten Nebennieren können von Tieren, wie Pferden, Schafen, Schweinen, Rindvieh, Hunden, Kaninchen, Katzen und Affen, genommen werden. Eine Säugetiernebenniere für das vorliegende Verfahren wird folgendermaßen präpariert: Die gesamte Region der gepaarten Nebenniere wird abgetrennt, und alle Arterien, ausgenommen die an die Kanüle angeschlossenen, werden abgebunden. Eine Kanüle wird in die Aorta gerade unterhalb der Nierenarterien, die die Nebenniere versorgen, oder in irgendeine Abzweigung einer Aorta, die in die Nierengegend führt, eingeführt. Eine gepufferte Salzlösung kann durch dieses kanülierte Präparat gespült werden, um das in den Gefäßen verbliebene Blut des Präparats zu entfernen. Doch ist dies nicht unbedingt notwendig. Die Kanüle wird dann am Arterieneintritt einer Pumpe zum Durchspülen befestigt, um das Medium für die Durchspülung kontinuierlich unter Pulsationsdruck zirkulieren zu lassen. Es ist wesentlich, daß der Anschluß des Präparats an die Pumpe schnell erfolgt und daß ein sofortiges Durchpumpen des Mediums bei einem Druck erfolgt, der eine wirksame Zirkulation durch das Drüsengewebe sichert. Zweckmäßig wird unter völlig sterilen Bedingungen gearbeitet, um eine größtmögliche Erhaltung der Drüsen zu sichern, obgleich für kürzere Perfusionsperioden unbedingte Sterilität nicht erforderlich ist. Die Sterilität kann durch Zugabe geeigneter Konzentrationen von Antibiotica, wie Penicillin und Streptomycin, aufrechterhalten werden.
• Die Steroidhormone, die nach diesem Verfahren hergestellt werden, können aus dem Medium durch verschiedene Methoden gewonnen werden. Die einfachste ist die unmittelbare Extraktion des Mediums mit einem halogenierten Lösungsmittel, wie Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Methylenchlorid, Äthylenchlorid. Nach der Entfernung des Lösungsmittels, vorzugsweise durch Verdampfung im Vakuum bei niedriger Temperatur in einer inerten Atmosphäre, erhält man im Rückstand das Steroid. Im Rückstand sind ferner, falls das Medium reines Blut ist, verhältnismäßig große Mengen an Fetten und Lipoiden enthalten. Das Medium kann gegen eine Salzlösung dialysiert und diese extrahiert werden. Die Steroide, die im Dialysat sich in Lösung befinden, gehen durch die Membran und sind zwischen Medium und der Salzlösung gleichmäßig verteilt. Die Methode hat den Vorzug, die Verunreinigung mit größeren Mengen an Fetten zu vermeiden, gibt aber keine hohen Ausbeuten an Steroiden, da diese teilweise im Dialysat zurückbleiben. Bei der zweckmäßigsten Aufarbeitung werden die Steroide direkt aus dem Medium an Aktivkohle adsorbiert. Diese wird mit Wasser oder Salzlösung gewaschen und dann mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie Methylenchlorid, Äthylenchlorid, Chloroform, Aceton, Äthylacetat, extrahiert. Beim Herauslösen der Steroide aus der Kohle hat es sich als vorteilhaft erwiesen, zuerst die Kohle kurze Zeit mit Aceton zu extrahieren, um unerwünschte Stoffe zu entfernen, dann wird sie mit erwärmtem Methylen- oder Äthylenchlorid extrahiert, und die gewünschten Steroide, die in der ii-Stellung sauerstoffhaltige Gruppen aufweisen, werden in verhältnismäßig reiner Form gewonnen. Durch weitere Extraktion mit erwärmtem Benzol werden weitere Steroide entfernt, von denen einige kristallinisch sind. , Die sauerstoffhaltigen Gruppen sind Hydroxyl- und Ketogruppen. Ein formaldehydogenes Steroid ist ein solches, das a-Ketol- oder a-Glykol-Konfigurationen in der 2o- oder 7,i-Stellung aufweist und das bei periodischer saurer Oxydation Formaldehyd entwickelt.
• Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert.
• Beispiel i ioo mg ii-Desoxycorticosteron wurden zu 400 ccm mit Citronensäure versetztem Rinderblut gegeben und die Lösung 31/Z Stunden durch die Nebenniere eines Rindes bei einem mittleren Druck von, ioo mm Quecksilber gepumpt. Die durchschnittliche Geschwindigkeit des Blutstroms betrug etwa 9 ccm in der Minute.. Zoo ccm der Lösung wurden gegen 21 Salzlösung (Kochsalzgehalt von o,85 °/o Natriumchlorid) 3 Tage bei 2° dialysiert. Die Salzlösung wurde mit Chloroform extrahiert und der Chloroformextrakt mit verdünnter Säure; verdünntem Alkali und Wasser gewaschen. Nach der Verdampfung des Chloroforms erhält Tran einen neutralen Rückstand:` Eine Probe des Rückstandes wurde nach der in dem Buch von Pincus und Thimann, vThe Hormones«, Bd. 1 [1948], S. 613 beschriebenen Methode auf formaldehydogene Steroide geprüft (s. Löwenstein, Corcoran und Page, Endocrinology, Bd.39 [1946] S.82). Auf ioo mg angewandtes Steroid erhielt man 21 mg formaldehydogenes Steroid. Der neutrale Rückstand wurde nach der Glykogen-Niederschlagsmethode geprüft (Pabst und Mitarbeiter Endocrinology, Bd. 41 [1g47], S.55 bis 65) und bei einer Dosierung von 5oo y aktiv befunden. Dieses Material ist daher =o mg Corticosteron annähernd äquivalent. -Beispiel 2 i5oo ccm Plasma, das =5o mg ii-Desoxycorticosteron enthielt, wurden nach der Methode des Beispiels i durch eine Rindernebenniere etwa 3 Stunden gepumpt. Die Lösung wurde dann in einer Viskoseröhre etwa 212 Tage mit 5oo ccm einer mit Citronensäure versetzten isotonischen Salzlösung, die 1,5 g Aktivkohle enthielt, stehengelassen, -wobei die Flüssigkeit nur- gelegentlich hin und her bewegt wurde. Die Kohle wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und viermal -mit je 5o ccm Aceton verrührt: Die Acetonlösungen wurden vereinigt und in einer Stickstoffatmosphäre bei vermindertem Druck eingedampft, der Rückstand mit Chloroform extrahiert, die Chloroformlösung mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand von 83 mg halbkristallinischem - Material enthielt 61 mg formaldehydogene Steroide.-Der halbkristallinische Rückstand wurde in Benzol gelöst ünd durch eine Säule- (o,8 X 18 cm)- mit Silicagel (T2oo) gegossen. Das Gel- wurde mit Benzol-Äthylacetat-Mischungen ausgelaugt, wobei ungefähr 25 mg nahezu reines Corticosteron (Schmelzpunkt =7o bis 176°) und etwa 25 mg nahezu reines ii-Desoxycorticosteron (Schmelzpunkt 138,5 bis 14o,5°) erhalten wurden. Der Mischschmelzpunkt des gewonnenen Corticosterons mit einer Probe eines auf andere-Weise gewonnenen Materials mit einem Schmelzpunkt von 178 bis 182° betrug 171 bis 179°. Der Mischschmelzpunkt des ii-Desoxycorticosterons mit einer Probe eines auf andere Weise gewonnenen Materials betrug 138 bis 14o°: Beispiel 3 z-1 reines Blut, das ioo mg gelöstes Desoxycorticosteron enthielt, wurde durch eine Rindernebenniere entsprechend Beispiel i gepumpt. Die Lösung wurde dann 30 Minuten mit 5 g Aktivkohle bei etwa 23° verrührt und über Nacht bei etwa 5° stehengelassen. Das Blut wurde dekantiert und mit weiteren 6 g Aktivkohle bei etwa 15° verrührt. Die vereinigten Kohlenmengen wurden mit Salzlösung gewaschen und bei 45° und 23 mm Druck in Stickstoffatmosphäre getrocknet. Die Kohle wurde mit Methylenchlorid in kontinuierlichem Verfahren ausgelaugt. Der Extrakt wurde bei vermindertem Druck eingedampft, wobei ein Rückstand von 99 mg eines öligen Materials erhalten wurde, der 29 mg formaldehydogene Sterine enthielt. Der Rückstand wurde mit Corticosteron angeimpft, und es bildete sich rasch eine kristalline Masse. Die Masse wurde mit Äther befeuchtet und auf einem Filter gesammelt, wobei 13 mg kristallines Corticosteron mit einem Schmelzpunkt von 15o bis. 16o° erhalten wurden. Beispiel 4 20o ccm Plasma, das 2,5 mg ii-Desoxy-i7-oxycorticosteron enthielt, wurden entsprechend Beispiel -i g Stunden durch eine Rindernebenniere gepumpt. Die Lösung wurde 3o Minuten mit i g Aktivkohle bei etwa 2o° verrührt und die Kohle abgetrennt. Die Kohlebehandlung wurde wiederholt und die zwei Kohleportionen mit einer Salzlösung gewaschen und in einer Stickstoffatmosphäre bei 4o° und =o mm Druck getrocknet. Die getrocknete Kohle wurde mit Äthylenchlorid in einem Soxhlet-Apparat extrahiert. Der Extrakt wurde unter Vakuum eingedampft, und man erhielt einen Rückstand von 22 mg eines öligen Materials, der 8 mg formaldehydogene Sterine enthielt. Dieser Rückstand wurde nach der Glykogen-Niederschlagsprobe untersucht, er entspricht annähernd 6 mg i7-Oxy-ii-dehydrocorticosteron. Beispiel 5 ioo ccm Plasma, die in Lösung etwa =o mg ii-Desoxycorticosteron enthalten, wurden wie im Beispiel i durch eine Rindernebenniere gepumpt. Die Lösung wurde einige Minuten mit 1 g Aktivkohle geschüttelt und über Nacht bei etwa 5° gehalten. Die Kohle wurde mit Wasser gewaschen< und dann einige Minuten mit Aceton verrührt und in. einem Soxhlet-Apparat mit Methylenchlorid extrahiert. Der Methylenchloridextrakt wurde in einer Stickstoffatmosphäre bei vermindertem Druck eingedampft und ergab 1q. mg eines halbkristallinen Rückstandes und etwa 7 mg formaldehydogene Steroide. Diese bestehen in der Hauptsache aus Corticosteron. Die Kohle wurde dann weiter im Soxhlet-Apparat mit Benzol extrahiert. Nach Entfernung des Lösungsmittels bei Unterdruck in einer inerten Atmosphäre wird ein teilweise kristallines Steroid im Rückstand erhalten. Beispiel 6 ioo ccm Plasma, die in Lösung etwa io mg io-Desoxy-i7-oxycorticosteron enthalten, wurden in etwa 2o Minuten bei einem mittleren Druck von etwa i?,o mm Quecksilber und einer Durchflußgeschwindigkeit von etwa 5 ccm in der Minute durch eine Nebenniere eines Pferdes gepumpt. Die Flüssigkeit wurde dann 5 Minuten mit i,5 g Aktivkohle bei etwa 2o° gerührt und dann 15 Stunden bei 5° stehengelassen. Die Kohle wurde abgetrennt, mit kaltem Wasser und darauf mit kaltem Aceton gewaschen und dann stetig mit erwärmtem Methylchlorid extrahiert. Der Extrakt wurde in einer Stickstoffatmosphäre bei vermindertem Druck und bei gewöhnlicher Temperatur eingedampft. Der teilweise kristalline Rückstand enthielt etwa 8 mg formaldehydogene Steroide, die nach der Glykogen-Niederschlagsprobe bei einer Dosierung von etwa ioo y aktiv waren.

Claims (3)

1. PATENTANSPRÜCHE: i. Verfahren zur Einführung von Hydroxyl-und Ketogruppen in die ii-Stellung von Steroiden, dadurch gekennzeichnet, daß man das Steroid in einer aus Blut, Blutplasma und bzw. oder Blutserum bestehenden Flüssigkeit löst, die Lösung durch die isolierte Nebenniere eines Säugetieres pumpt und dann die Steroide mit Hydroxyl-und Ketogruppen in der ii-Stellung aus der Flüssigkeit abtrennt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß man durch die isolierte Säugetiernebenniere die Steroidlösung unter einem Pulsationsdruck von nicht weniger als 40 und nicht mehr als Zoo mm Quecksilber mit Pulsationen zwischen 24 und i8o in der Minute pumpt.
3. 3. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid ii-Desoxycorticosteron oder ii-Desoxy-i7-oxycorticosteron verwendet.