DE726636C - Verfahren zur Gewinnung hochwirksamer Praeparate von thyreotropem Hormon - Google Patents

Description

• Verfahren zur Gewinnung hochwirksamer Präparate von thyreotropem Hormon Nach dem Verfahren der Patente 681 216 und 714 185 werden bereits hochwirksame thyreotrope Hormonpräparate gewonnen durch Behandlung wäßriger Extrakte von Hypophysenvorderlappen, die das thyreotrope Hormon enthalten, mit eiweißfällenden Mitteln, insbesondere solchen stark saurer Natur, oder mit Zink- oder Cadmiumsalzlösungen und weiterer Reinigung der erhaltenen Fällungen.
• Es wurde nun gefunden, daß die Wirksamkeit der nach dem vorbeschriebenen Verfahren sowie auch auf andere Weise erhaltenen chyreotropen Hormonpräparate zu einer bislang nicht erreichten Höhe gesteigert werden kann, wenn man z. B. aus saurer Lösung des nach den genannten Verfahren erhaltenen Pikrinsäure- oder Zink- oder Cadmiumniederschlages zweckmäßig in Gegenwart von Mineralsäuren bei einem px von 2 und darunter die Begleitstoffe durch Fällung mit einem Überschuß eines stark sauren eiweißfällenden Mittels entfernt und gegebenenfalls etwa mitgerissenes Hormon aus dem Niederschlag durch mehrfache Behandlung desselben unter gleichen Bedingungen in Lösung bringt und aus der Lösung das Hormon mit eiweißfällenden Mitteln vom Charakter der Nitrophenole oder mit komplexen Metallsäuren der 7. Gruppe des periodischen Systems niederschlägt und den Niederschlag in bekannter Weise zerlegt. Als stark saure eiweißfällende Mittel finden vor allem Trichloressigsäure und Sulfosalicylsäure Verwendung, die bei stark saurer Reaktion der zu fällenden Lösung das tyreotrope Hormon nicht ausfällen bzw. etwa ausgefälltes Hormon wieder in Lösung treten lassen. Die erforderlichen Reaktionsbedingungen, Säuregehalt der Lösung, Menge des Fällungsmittels usw. sind leicht durch Vorversuche festzustellen. Im allgemeinen

  findet bei der Behandlung der mit lIinera 1-

  säuren versetzten Uisung bei einem pli unter

  1I11 wesentlichen 11;1.' eine @u@tallting !aet' Be-

  gleitstoffe, nicht aber des tllyreotrol>en

  nions statt. -Man hat zwar bereits das thvreo-

  trope Hormon elfthaltende Rohauszüge finit

  sauren Eiweißfällungcmitteln behandelt, vgl.

  Archiv für experimentelle Pathologie und

  Pharmakologie Ballt 1661,1C132), Seite('9,ti..

  jedoch nicht bei einem pi@ von z um! dar-

  unter und nicht in Gegeit""vai't von Mineral-

  säuren.

  Aus den vereinigten Filtraten. au: denen

  der Überschub des verwelldeteli Fiillungs-

  II1lttelS nicht einferne zu werdet bratecht. wild

  dann das H,3rIT@@n 1I1 bekannter Weise durch

  Behandlung mit elwelßtallwlden Mitteln vom

  Charakter der titrophenole, z. P. Pikrin-

  säure. Pikrolonsäure u. dgl.. oder tnit @olll-

  plexen .Metallsäuren der ; . ! irul ,pe des PKW

  dischen Arteins z. B. mit A\'olfrantsäure

  y`IolvbdanJ<inre,Pll!1Spliorlyolira111SÜ11Te.P hcl3-

  phoriIlolybdansattre usw. oder i,1ltlyalei_ten

  \-erbindungen gefillt. Auch bei diesen h:il-

  lungsinitteln lassen sich die opthnalei Iäl-

  lungsbedingungen leicht durch Vorversuchc

  feststellen. Nach Zerlegung des i\itierschla-

  ges h1 bekannter Weise wird zweckmiß,ig das

  Filtrat einer Dialyse oder Ultrafiltration zur

  Entfernung unwirksamer Salze unterworfen

  und durch Fällung nlit einem finit Was-

  ,;er mischbaren organischen Lösungsmittel.

  "I_. b'. Weton oder 1Iethvlalkohal. gegebenen-

  falls in Mischung mit Äther oder einen ande-

  ren geeigneten masserunlöslichen Lösungs-

  mittel, das thyreotroPC Horirioiiprii;larat in

  Cü1CIn PW ü112eIt5@T@i:_1 von 50 11:3 10 Meer-

  je mg 11 guter _As-

  heute erhalten. Präparate von noch höheren

  Reinheitsgraden (bis zu 16o lleerscli@yeinclien-

  einheiten) l;ii@iiieu durch Wiederholung der

  beschriebenen -Maßnahmen erhalten vierdun.

  wenn man die einzelnen Phasen dieser \\'ieder-

  holung möglichst schnell und in der Kälte

  durchführt und zwmkmäwg noch eine L ltra-

  hitration der Pikratlö seng vor der Endaus-

  fällung einschaltet.

  Beispie11

  in 1o 1 eines durch EZtralction von ;oo g

  getrockneten Rinderhypophysen mit o,a; °; "i@;el'

  Essigsäure liergestelltei Roheztraktes, der

  insgesamt 5o- bis 6o ooo 1Ieerschweinchen-

  einheiten enthält (in i m @rochenrüchstand

  Weses Eitraktes 1.2 1Ieursch;l.-cinchene:n-

  heitetl). werden ioog pulverisiertes Ziill;acutat

  t Ill@ettlfl2"t 11I1#il tIllt I @O Cem _@l1f:I1,@Illal; ( 1 0'i ":@@ )

  auf pll 7.5 eingestellt. I-on der sehr gut

  abgesetzten Füllung wird die klare, fast farb-

  lose Lösten` nach 12 Stunden abgehebert und

  <fier Rückstand weitgehend durch Zeltriingie-

  ren i",_121 ,1Lf i`it1331@kelt b e11"eli.. Die Zink-

  i;illull<< wir,I null in 1 1 Waseer suspendiert,

  unter `l@lll'1-elf 1a1(1 LI31;illllilil@` n?lt ,50 "j"lger

  hssigsäurc an<@es:iuert till(i `mit 10 "/"iger

  SChwefel<£11Ire auf 1)i1- ehirestellt. Darauf

  \#; erden langsam i;0 ccm 29 ", "ige Sutosalicyl-

  ::iure hinzugegeben. bis ein Probefiltrat keine

  Wung mehr mit@I#,lsa licylsäure gibt. Dur

  elltstatl,let:e yolunlilfi-,se Niederschlag wird

  nach ciilstüll,ligrlll I'ül:rer scharf abzentrifu-

  girrt, zur @-nif:ilIun;;" in =oo c@In Wasser sus-

  pendiert. mit t"erdümitem --runoniak in Lö-

  3ung gellr.cht Tufd Julch dein Einstellen auf

  1'11 -.' mit t-erdüllnter Sch«-efels@iure durch

  110 @@I11 @i11103@1I@@.-I3at1_e (20.1,) gei:illt. Der

  iedmschlag AG d in gleicher Wise wie oben

  aIlg@gc!1@11 ab;@'@Li"tnllt und zur Erfassung der

  letztoll Reste, wirksamer Substanz nochmals

  unigef;illt. hie z-ereinigten Sulfosalicyls:iui-c-

  Otrate werden daraufhin unter Lislkiililting

  3o langt nlit fein pulverisierter 1'ikrinsäur(^

  verrührt, fit: keine i-i-,sta", .iielii- stattfindet:

  !1111I1 elii 1_llel'3CIltlja -i111 -001CIII

  _ -3iittitcr cc-ülari@cr 1'ikrinsäure hinzugege-

  heli. Dur gut al)Leseizt;. \iedri-schlaä xird

  nach 1= Stunden abgesaugt, mit gesiittigter

  I'il;r ills:iur eh-@sun:,` gewaschen. in =3o ccin

  1lasser aus, verdunntein Am-

  nl,liil2iI; in U,3ung gebracht- Bei schwach

  all;ali@tllel' Re al;ti,)tl -eil: inaa nun ?;()O @cin

  eifites Genfisches aus "leicllen @@cilen @\Icthvl-

  :ill;(lh,ll lind _itlier tuiiur Schlltiuhl hinzu, Saugt

  den \intersclAag nadi i Sttmdc ab. wäscht

  griimuidl mit dem I_usmlgsinittelgwniscli und

  zum Sc?ilt:la mit Äther nach. .\ac11 ilein'hrock-

  nun lln \'ahat?la ci"ll:ilt 1-1,111 1.= g @@ 1'.Il.i(' Stil)-

  MM :nie j.o \I_ersch@yeinchene:nhc:ten

  je mg.

  Beispiel

  1.1 ` eines flach Beispiel r @elyonnenen

  1Lndllr,l@ui;tes.. reiches lcl 1leersclicc-einchen-

  c',111eite:': ie m entll;a`. @@:e_ eil :il ioo ccin

  Wasser su#lendiert, unter Ilskiillleng nlit

  ,

  10""Igor S_1Irsüur:2 auf 111 -' eingestellt und

  o ccnl einer @n" "i:;m Wiliri@`en Trielllore3sig-

  s;iur eli-,@un hinzle,ugrbeti. 'An der reichlidien

  T.i_l:ulzr_1tril-ugiert 111 an -lach »Minuten

  schari@ab. wi:,lcrliolt all` diel in verclünnteln

  _,_iunloniak -eli@sten \ic,lersclilag nach Ein-

  stcLlet niit 1,-" '1."iger Salz3iit11'e auf 111t a die

  h inf;illtlllg zwei- bis ,freimal. Die vereinigten

  frichlore33ig3äureiihrate werden in der Kälte

  mit (lein gleichen Voluinei) h,llizcliti-iertcr

  cc-iü:,riger 1-'il;rir_s:a:re versetzt. a11 kiihleni

  Orte :mfirwatlrt und nach 1 Stunde zentri-

  fugien. Der Pikrinsiureniederschlag mird in

  wenig Wasser stisllendiert. mit Annnoniak

  (10",") in @östtllg gebracht, hei schwach al-

  kalischer Reaktion reit dein iofachen Volumen

  hlethylalk4fo7 @,-eWO ulid schliclilich nach

  dem Waschen mit absolutem Äther im Vakuum getrocknet. Man erhält nach diesem Arbeitsgang 56o mg rein weiße, in Wasser leicht lösliche Substanz, die in 1 mg 70 Meerschweincheneinheiten an thy reotropen Hormon enthält. Das Präparat ist selbst in hohen Dosen frei von gonadotroper Wirkung. Beispiel 3 1, 7 g eines nach Beispiel i, jedoch mittels Trichloressigsäure statt Sulfosalicylsäure und io°/oiger Salzsäure statt Schwefelsäure, gewonnenen Endproduktes, «-elches in i mg 30 Meerschweincheneinheiten enthält, werden folgenden Reinigungsverfahren, dessen einzelne Phasen unter ständiger Eiskühlung und möglichst schnell ausgeführt werden, unterworfen. Das Präparat wird in 5o ccm Wasser suspendiert, mit io°/oiger Salzsäure auf pH 2 eingestellt und .to ccm 2o°/oige Trichloressigsäure hinzugegeben. Nach 30 Minuten zentrifugiert man von dem reichlichen Niederschlag ab, suspendiert den Niederschlag in 6o ccm Wasser, löst ihn in verdünntem Ammoniak, stellt mit io°/oiger Salzsäure ie.der auf PH z ein und fällt mit 30 CM] 20% iger Trichloressigsäure. Der abzentrifugierte Rückstand wird nochmals in gleicher Weise umgefällt. Die vereinigten Trichloressigsäurelösungen werden unter Eiskühlung mit 60o ccin konzentrierter w äßriger Pikrinsä tirelösung versetzt und die Fällung nach i Stunde abgesaugt. Der Rückstand wird mit Ammoniak gelöst und durch ein kongorotdichtes Ultrafeinfilter filtriert. Der auf dem UItrafeinfilter bleibende Rückstand wird nunmehr in io ccm Wasser aufgenommen und mit ioo cein Methylalkohol gefällt. Der sich gut absetzende :Niederschlag wird nach kurzer Zeit abgesaugt, mit Methylalkohol und Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält so 172 mg eines rein weißen Präparates, welches im mg mindestens 16o 12eerschweincheneinheiten enthält. Beispiel d. 2 g eines durch Fällung mit Pikrinsäure und nachlieriger Zerlegung mit Aceton gemäß Verfahren des Patents 681 216 erlialte-

  neu Rohproduktes mit insgesamt 4ioo _'@leer-

  schwe:nclieneinhe:ten werden in ioo ecni

  Wasser gelöst, durch 1o°/oige Salzsäure auf

  11H 1 eingestellt und unter Eiskühlung in:t

  5o ccin 2o°;oiger Sulfosalicvlsäure gefällt.

  Nach kurzer Zeit wird der Niederschlag alr

  zentrifugiert und mit 30 ccm salzsaurer 7 °/"i1,1,er

  Sulfosalicvlsäure von pil i gewaschen. Die

  vereinigten Sulfosal:c@-Is:itirefiltrate «-erden

  hierauf mit Ammoniak abgestumpft und so

  lange dialysiert, bi: die Reaktion mit Ferri-

  chlorid auf Sulfosalicvlsäure negativ gewor-

  den ist. Die Innenflüssigkeit wird min mit

  dein zehnfachen Volumen Aceton gefällt, nach

  gutem Absitzen die Ausfockung abgesaugt

  und der Niederschlag mehrmal: mit Aceton

  und Xtlier nachgewaschen. Das ini Vaktiuni

  getrocknete Präparat hat ein Gewicht von

  .foo mg und enthält je fing über io Meer-

  achwe:ncliene:nheiten.

Claims (1)

1. I',1"!-fiNTANSP(t l`CÜP: i. Verfahren zur Gewinnung hochwirksamer Präparate des thyreotropen Hypophysenvorderlappenhorinons unter Reini- gung finit sauren Fiweißfi-:lltingsinitteln und F?lltulg des Hornions mit eiweiß- fällenden Mitteln vorn Charakter der N itrophenole oder finit komplexen 'Metall- säuren der 7. Gruppe des periodischen Systems, dadurch gekennzeichnet, dal.l nian die Lösung des rohen Hormons bei e:nein Pii von 2 Lind darunter, zweckmäßig in mineralsaurer Lösung ni:t einem n>er- schtil, 3 von stark sauren, ei«-eißfällenden 1litteIn, «-:e Sulfosalicvlsäure oder Tri- chloressigsäure, -%-ersetzt, den Niederschlag gegebenenfalls mehrfach umfällt, aus den erhaltenen Filtraten das Hormon finit einem der obengenannten Hornlonfälhings- mittel niederschlägt und den N iedersclilag in bekannter Weise zerlegt. 2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß man das Reinigungs- verfahren unter Eiskühlung und möglichst schneller Durchführung der '\-erfahrens- schritte unter Einfügung einer Ultratiltra- tion vor der Zerlegung des Hornionnieder- schlagei wiederholt.