DE69937004T2

DE69937004T2 - Antigene aus chlamydia trachomatis

Info

Publication number: DE69937004T2
Application number: DE69937004T
Authority: DE
Inventors: Giulio Ratti
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics SRL
Current assignee: GSK Vaccines SRL
Priority date: 1998-12-18
Filing date: 1999-12-17
Publication date: 2008-05-21
Anticipated expiration: 2019-12-18
Also published as: EP1598362A3; ES2292261T3; EP1857464A2; US20060188516A1; DK1140997T3; US20130156775A1; PT1140997E; JP2010220622A; ATE371668T1; EP1857464A3; WO2000037494A2; CA2355876A1; DE69937004D1; EP1598362A2; CY1107024T1; JP2002534062A; WO2000037494A3; US20100098697A1; EP1140997B1; US8114401B2

Description

Diese Erfindung betrifft antigene Proteine von Chlamydia Trachomatis. Insbesondere betrifft sie Antigene, die von Antikörpern aus Seren von chronisch infizierten oder genesenden Patienten erkannt werden.
HINTERGRUND
Die Chlamydia sind obligat intrazelluläre Parasiten von eukaryontischen Zellen, die für endemische sexuell übertragene Infektionen, Trachoma, infektiöse Pneumonitis und verschiedene andere Krankheitssymptome verantwortlich sind. Sie besetzen einen exklusiven eubakteriellen phylogenetischen Zweig, der keine nahe Verwandtschaft mit irgendwelchen anderen bekannten Organismen hat – sie werden als eigene Ordnung klassifiziert (Chiamydiales), die eine einzige Familie (Chlamydiaceae) enthalten, die wiederum eine einzige Gattung (Chlamydia) enthält. Zur Zeit sind vier Chlamydien-Arten bekannt – C.trachomatis, C.pneumoniae, C.pecorum und C.psittaci [vgl. z.B. Referenz 1]. Eine Genomsequenz von C.trachomatis (Serovar D) wurde kürzlich veröffentlicht [2].
Die menschlichen Serovarianten ("Serovars") von C.trachomatis werden in zwei Biovarianten ("Biovars") unterteilt. Die Serovars A-K rufen Epithelinfektionen vor allem im Augengewebe (A-C) oder dem Urogenitaltrakt (D-K) hervor. Die Serovars L1, 12 und 13 sind die Ursache des invasiven Lymphogranuloma-venereum (LGV).
Obwohl die Chlamydien-Infektion selbst Krankheit verursacht, denkt man, daß die Ernsthaftigkeit der Symptome bei einigen Patienten in der Tat von einer gestörten Immunantwort des Wirts kommt. Die fehlende Beseitigung der Infektion resultiert in einer persistierenden Immunstimulierung und dies resultiert statt in der Hilfe für den Wirt in einer chronischen Infektion mit ernsthaften Konsequenzen, einschließlich Sterilität und Blindheit [3].
Außerdem ist der Schutz, der von einer natürlichen Chlamydien-Infektion hervorgerufen wird, üblicherweise unvollständig, transient und stammspezifisch.
Wegen der ernsthaften Natur der Krankheit besteht der Wunsch nach der Bereitstellung geeigneter Impfstoffe. Diese können von Nutzen sein für (a) die Immunisierung gegen eine Chlamydien-Infektion oder von Chlamydien verursachter Krankheit (prophylaktische Impfung) oder (b) die Beseitigung einer etablierten chronischen Chlamydien-Infektion (therapeutische Impfung). Da es ein intrazellulärer Parasit ist kann das Bakterium jedoch im allgemeinen den Antikörper-vermittelten Immunantworten entkommen.
Es wurden verschiedene antigene Proteine für C.Trachomatis beschrieben und insbesondere die Zelloberfläche war das Ziel detaillierter Forschung [vgl. 1,4]. Diese umfassen zum Beispiel pgp3 [5,6,7], MOMP [8], Hsp60 (GroEL) [9] und Hsp70 (DnaK-ähnlich) [10]. Nicht alle von diesen stellten sich jedoch als wirksame Impfstoffe heraus und es ist ein Ziel der Erfindung, Chlamydien-Antigene zu identifizieren, die während der natürlichen Infektion eine Immunantwort hervorrufen, um Antigene und Immunogene bereitzustellen, die für die Verwendung bei der Entwicklung eines Impfstoffs geeignet sind.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung beruht auf der Identifikation von Proteinen, die von Chlamydia trachomatis codiert werden und die infolge der Infektion im Menschen immunogen sind.
Die Offenbarung stellt ein C.trachomatis-Protein bereit, das das MW und die pl-Charakteristika von Protein 5, 6, 7, 8, 9, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 oder 55 hat, wie dargestellt in Tabelle 2 auf Seite 15.
Diese umfassen Proteine, die im Stamm 12 von C.trachomatis eine N-terminale Aminosäuresequenz haben, wie sie in Tabelle III auf Seite 16 offenbart ist.
Die Offenbarung stellt auch Proteine bereit, die eine Sequenzidentität zu diesen C.trachomatis-Proteinen haben. In Abhängigkeit von dem speziellen Protein, ist das Ausmaß der Identität vorzugsweise höher als 50 % (z.B. 65 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % oder höher). Diese homologen Proteine umfassen Mutanten, allelische Varianten, Serovarianten und Biovarianten. Die Identität zwischen Proteinen wird vorzugsweise mit dem Smith-Waterman Homologiesuche-Algorithmus bestimmt, wie er im MPSRCH-Programm (Oxford Molecular) implementiert ist, unter Verwendung einer „affine gap"-Suche mit den Parametern „gap open penalty=12" und „gap extension penalty=1". Typischerweise werden 50 % Identität oder mehr zwischen zwei Proteinen als Hinweis auf funktionelle Äquivalenz betrachtet.
Die Offenbarung stellt weiterhin Proteine bereit, die Fragmente der C. trachomatis-Proteine der Offenbarung umfassen. Die Fragmente sollten mindestens n aufeinanderfolgende Aminosäuren von den Proteinen enthalten und in Abhängigkeit von dem speziellen Protein ist n 7 oder mehr (z.B. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 50, 100 oder mehr). Vorzugsweise umfassen die Fragmente ein Epitop von dem Protein.
Die Proteine der Offenbarung können natürlich auf eine Vielzahl von Weisen hergestellt werden (z.B. rekombinante Expression, Reinigung aus Zellkultur, chemische Synthese usw.) und in verschiedenen Formen (z.B. nativ, Fusionen usw.). Sie werden vorzugsweise in im Wesentlichen isolierter oder gereinigter Form hergestellt (d.h. im Wesentlichen frei von anderen C.trachomatis- oder Wirtszellproteinen).
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Offenbarung Antikörper bereit, die an diese Proteine binden. Diese können polyclonale oder monoclonale Antikörper sein und sie können auf geeignete Weise produziert werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Offenbarung Nucleinsäure bereit, die die Proteine und die Proteinfragmente der Offenbarung codieren. Eine Nucleinsäure, die Sequenzidentität mit dieser Nucleinsäure hat, wird auch bereit gestellt. In Abhängigkeit von der speziellen Nucleinsäure, ist das Ausmaß der Identität vorzugsweise höher als 50 % (z.B. 65 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % oder höher).
Weiterhin stellt die Offenbarung Nucleinsäure bereit, die mit dieser Nucleinsäure hybridisieren können, vorzugsweise unter Bedingungen "hoher Stringenz" (z.B. 65°C in einer Lösung mit 0,1 × SSC, 0,5 % SDS).
Es werden weiterhin Fragmente dieser Nucleinsäure bereit gestellt. Die Fragmente sollten mindestens n aufeinanderfolgende Nucleotide von den Sequenzen enthalten und in Abhängigkeit von der speziellen Sequenz ist n 10 oder mehr (z.B. 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40 oder mehr).
Es sollte auch verstanden werden, daß die Offenbarung Nucleinsäure bereit stellt, die Sequenzen umfassen, die zu den vorstehend beschriebenen komplementär sind (z.B. für Antisense- oder Sondenzwecke).
Die Nucleinsäure gemäß der Offenbarung kann natürlich auf viele Weisen hergestellt werden (z.B. durch chemische Synthese, aus genomischen oder cDNA-Bibliotheken, aus dem Organismus selbst usw.) und sie kann verschiedene Formen annehmen (z.B. einzelsträngig, doppelsträngig, Vektoren, Sonden usw.).
Außerdem umfaßt der Ausdruck "Nucleinsäure" DNA und RNA und auch ihre Analoga, wie diejenigen, die ein modifiziertes Rückgrat haben, und auch Peptidnucleinsäuren (PNA) usw.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Offenbarung Vektoren bereit, die eine Nucleinsäure der Offenbarung (z.B. Expressionsvektoren) umfassen und Wirtszellen, die mit solchen Vektoren transformiert wurden.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Offenbarung Zusammensetzungen bereit, die Protein, Antikörper und/oder Nucleinsäure gemäß der Offenbarung enthalten. Diese Zusammensetzungen können zum Beispiel als immunogene Zusammensetzungen geeignet sein (einschließlich Impfstoffen), oder als diagnostische Reagentien.
Die Offenbarung stellt auch Nucleinsäure, Protein oder Antikörper gemäß der Offenbarung zur Verwendung als Arzneimittel (z.B als Impfstoffe) oder als diagnostische Reagentien bereit. Insbesondere stellt die Offenbarung Protein 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 oder 55 bereit (wie dargestellt in Tabelle II auf Seite 15) zur Verwendung als Chlamydienimmunogen. Insbesondere stellt die Erfindung ein C.trachomatis-Protein bereit, das die Sequenz hat, wie sie in der Zugangsnummer P38001 angegeben ist und das ein MW von 15,8 kDa und einen pl-Wert von 4,80 hat, für die Verwendung als ein Arzneimittel, einen Antikörper, der an das Protein von Anspruch 1 bindet, für die Verwendung als ein Arzneimittel, ebenso wie eine Nucleinsäure, die das Protein von Anspruch 1 codiert, für die Verwendung als ein Arzneimittel. Während man annimmt, daß einige der Proteine, die in Tabelle II beschrieben sind, per se bekannt sind, wurde nicht offenbart, daß sie immunogen sind.
Die Offenbarung stellt auch die Verwendung von Nucleinsäure, Protein oder Antikörper gemäß der Offenbarung zur Herstellung eines (i) Arzneimittels für die Behandlung oder Vorbeugung einer Infektion aufgrund von Chlamydia bereit; (ii) diagnostischen Reagens zum Nachweis der Anwesenheit von Chiamydia oder Antikörpern, die gegen Chlamydia gebildet wurden; und/oder (iii) eines Reagens, das Antikörper gegen Chlamydia hervorrufen kann. Chiamydia kann jede Art oder jeder Stamm sein, ist aber vorzugsweise C.trachomatis. Bei bevorzugten Ausführungsformen stellt die Offenbarung ein Protein der 55 Proteine von Tabelle II zur Verwendung bei dieser Herstellung bereit.
Insbesondere stellt die Erfindung die Verwendung eines Proteins gemäß Anspruch 1, eines Antikörpers gemäß Anspruch 2, und/oder einer Nucleinsäure gemäß Anspruch 3, bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung oder Vorbeugung einer Infektion aufgrund von Chlamydia bereit,
die Verwendung eines Proteins gemäß Anspruch 1, eines Antikörpers gemäß Anspruch 2, und/oder einer Nucleinsäure gemäß Anspruch 3, bei der Herstellung eines diagnostischen Reagens zum Nachweis der Anwesenheit von Chiamydia oder Antikörpern, die gegen Chiamydia gebildet wurden, bereit, ebenso wie
die Verwendung eines Proteins gemäß Anspruch 1, eines Antikörpers gemäß Anspruch 2, und/oder einer Nucleinsäure gemäß Anspruch 3, bei der Herstellung eines Reagens, das Antikörper gegen Chlamydia hervorrufen kann.
Die Offenbarung stellt auch ein Verfahren für die Behandlung eines Patienten bereit, das die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge an Nucleinsäure, Protein und/oder Antikörper gemäß der Erfindung an den Patienten umfaßt.
Gemäß weiteren Aspekten stellt die Offenbarung verschiedene Verfahren bereit.
Es wird ein Verfahren für die Produktion der Proteine der Offenbarung bereitgestellt, das den Schritt der Züchtung einer Wirtszelle gemäß der Offenbarung unter Bedingungen umfaßt, die die Proteinexpression induzieren.
Es wird ein Verfahren für die Produktion von Protein oder Nucleinsäure der Offenbarung bereitgestellt, wobei das Protein oder die Nucleinsäure teilweise oder insgesamt unter Verwendung von chemischen Mitteln synthetisiert werden.
Es wird ein Verfahren für den Nachweis der Nucleinsäure der Offenbarung bereitgestellt, welches die Schritte umfaßt: (a) das Inkontaktbringen einer Nucleinsonde gemäß der Offenbarung mit einer biologischen Probe unter Hybridisierungsbedingungen für die Bildung von Duplexen; und (b) Nachweis der besagten Duplexe.
Es wird ein Verfahren für den Nachweis des Proteins der Offenbarung bereitgestellt, welches die Schritte umfaßt: (a) das Inkontaktbringen eines Antikörpers gemäß der Offenbarung mit einer biologischen Probe unter Bedingungen, die für die Bildung von Antikörper-Antigen-Komplexen geeignet sind; und (b) Nachweis der Komplexe. In ähnlicher Weise stellt die Offenbarung ein Verfahren für den Nachweis von anti-Chlamydien-Antikörpern in einer Probe bereit, welches die Schritte umfaßt: (a) das Inkontaktbringen eines Proteins gemäß der Offenbarung mit einer biologischen Probe unter Bedingungen, die für die Bildung von Antikörper-Antigen-Komplexen geeignet sind; und (b) Nachweis der Komplexe.
Die Offenbarung stellt auch Kits bereit, die Reagentien umfassen, die zur Verwendung bei diesen Verfahren geeignet sind. Es wird ein Kit bereit gestellt, der eine Nucleinsonde gemäß der Offenbarung umfaßt und Mittel zum Nachweis der Duplexe, die von der Sonde gebildet werden. Es wird ein Kit bereitgestellt, der einen Antikörper gemäß der Offenbarung umfaßt und Mittel zum Nachweis der Antikörper-Antigen-Komplexe, die von dem Antikörper gebildet werden. Es wird ein Kit bereitgestellt, der eine Protein gemäß der Offenbarung umfaßt und Mittel zum Nachweis der Antikörper-Antigen-Komplexe, die von dem Protein gebildet werden.
Zur Vermeidung von Zweifel beinhaltet der Ausdruck "umfassend" "einschließlich" ebenso wie "bestehend aus", d.h. eine Zusammensetzung X "umfassend" kann ausschließlich aus X bestehen oder sie kann etwas zusätzlich zu X einschließen, wie X + Y.
BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
Die 1 zeigt die mit Anmerkungen versehene Referenz-2D-Elektrophorese-EB-Karte, die auch die Positionen der immunreaktiven Proteinflecken angibt, die mit 1-55 markiert sind. Gruppen von Flecken, die eine isoelektrische Serie desselben Proteins zu sein scheinen, sind zusammen eingekreist und unter derselben Identifikationszahl klassifiziert.
Die 2 zeigt typische Immunblots. Die gesamte Kartengegend ist gezeigt. Wichtige bekannte Immunogene sind für den leichteren Vergleich markiert. Für die Identifikation der anderen Flecken auf 1 und Tabelle II Bezug nehmen. Blot A ist von dem PID-Patienten JO51 (MIF-Titer 256) und hat eine Serumverdünnung von 1:5000. Blot B ist von dem Patienten JO35 (MIF-Titer 64), der von sekundärer Sterilität betroffen ist, und hat eine Serumverdünnung von 1:2500. Blot C ist ähnlich Blot B, ist aber von Patient JO52. Blot D ist von dem PID-Patienten JO31 (MIF-Titer 256) und hat eine Serumverdünnung von 1:5000.
BEISPIELE
Menschliche Seren
Die Seren (Tabelle I) wurden von Frauen gewonnen, die auf eine Chlamydien-Infektion des Genitaltrakts reagiert hatten. Die siebzehn Seren (A...Q) wurden von 4 Fällen der Infektion des unteren Genitaltrakts und 13 laparoskopisch bestätigten Fällen von PID (entzündliche Erkrankung des Beckens) gewonnen, einschließlich zweier Fälle von sekundärer Sterilität. Alle Seren waren positiv bei einem Standard-Mikroimmunfluoreszenztests (MIF) mit gereinigten C.trachomatis 12-Elementarkörpern [11] und wurden mit einem ELISA-Test mit dem Plasmid-codierten pgp3-Antigen [5] als C.trachomatis-Immunseren bestätigt.
Eine Gruppe von 10 seronegativen Kontrollseren von gesunden Blutspendern wurde auf die gleiche Weise und unter Verwendung derselben Verdünnungen wie bei den Patientenseren mit Immunblotting getestet, um das Auftreten von unspezifischen Reaktionen auszuschließen.
Die meisten Seren wurden von der Chlamydien-Sammlung der Biobanque de Picardie (Amiens, Frankreich) erhalten. Einige PID- und Kontrollseren von gesunden Blutspendern wurden vom Ospedale Policlinico S.Orsola (Bologna, Italien) erhalten.
Herstellung der Proteinproben
Gereinigte Chlamydienzellen wurden wie in Referenz 12 beschrieben durch Züchten des C.trachomatis-Stamms L2/343/Bu in Vero-Zellkulturen gemäß Standardverfahren erhalten, gefolgt von zwei Zyklen Dichtegradientenzentrifugation [13]. Die durchschnittliche Proteinkonzentration der gereinigten Elementarkörper (EB)-Präparation wurde unter Verwendung eines Biuret-Tests bestimmt. Aliquots (2 mg Protein/ml) wurden in Wasser bei -20°C für die anschließende elektrophoretische Analyse aufbewahrt. Die Zellen wurden hauptsächlich in der Form von EBs verwendet – alle bis heute bekannten Chlamydienantigene wurden in Elementarkörpern statt in Retikularkörpern gefunden.
Auftrennung der Chlamydienproteine
Die Chlamydienproteine wurden unter Verwendung der hochauflösenden 2D-Elektrophorese aufgetrennt, die unter Verwendung des Immobilin/Polyacrylamid-Systems durchgeführt wurde, im Wesentlichen wie beschrieben in den Referenzen 14 und 15.
Für analytische Gele wurden etwa 45 μg Gesamtelementarkörperprotein pro Gel verwendet. Für halbpräparative Gele (für die Mikrosequenzierung) wurde etwa 1 mg Protein verwendet. Aliquots der EB-Proteine wurden durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit pelletiert und in 8 M Harnstoff, 4 % CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonium]-1-propansulfonat), 40 mM Tris-Base, 65 mM Dithioerythritol (DTE) und Spurenmengen Bromphenolblau resuspendiert.
Die isoelektrische Fokussierung wurde auf Immobilin-Streifen durchgeführt, die einen nicht-linearen 3 bis 10 pH-Gradienten von pH 3 bis 10 (IGP-Streifen, Amersham Pharmacia Biotech) bereitstellte. Die Spannung wurde während der ersten drei Stunden linear von 300 bis 3500 V erhöht, dann 22 Stunden bei 5000 V stabilisiert (gesamtes Voltstunden-Produkt = 110 kVh). Nach der Elektrophorese wurden die IGP-Streifen 12 Min. gegen 6 M Harnstoff, 30 % Glycerin, 2 % SDS, 0,05 M Tris.HCl, pH 6,8, und 2 % DTE äquilibriert. Die zweite Dimension wurde in einem Laemmli-System auf 9-16 % linearen Polyacrylamid-Gradientengelen (18 cm × 20 cm × 1,5 mm) bei einem konstanten Strom von 40 mA/Gel etwa 5 Stunden durchgeführt, bis die Farbstofffront das untere Ende des Gels erreichte. Analytische Gele wurden mit Ammoniak-Silbernitrat [16] gefärbt. Die Proteinkarten wurden mit einem Laser-Photodensitometer (Molecular Dynamics) gescannt und in elektronische Files umgewandelt, die dann mit der Melanie II Computer-Software analysiert wurden.
1 zeigt die mit Anmerkungen versehene Referenz-EB-Karte, die verwendet wurde, um die Proteine auf den Immunblots zu identifizieren. Die MW- und pl-Koordinaten für die Referenzkarte wurden durch co-Migration der Chlamydienproteine mit menschlichen Serumproteinen kalibriert, die als Referenzproteine dienten. Die Werte für den isoelektrischen Punkt, die für die Serumproteine verwendet wurden, waren diejenigen, die in Referenz 17 beschrieben werden.
Immunblot-Analyse
Die Immunblotresultate sind in 2 und Tabelle II zusammengefaßt.
Nach der zweidimensionalen Elektrophorese wurden die Gele auf Nitrocellulosemembranen [18] elektrogeblotted und gemäß Standardverfahren verarbeitet, die wie in Referenz 19 beschrieben modifiziert waren. Kurz gesagt wurden vor dem Immunnachweis die Membranen mit 0,2 % (Gew./Vol.) Ponceau S in 3 % (Gew./Vol.) Trichloressigsäure 3 Minuten gefärbt und die Positionen der ausgewählten Ankerflecken wurden auf dem Blot markiert, um die Zuordnung der Immunblots mit der silbergefärbten Karte zu unterstützen. Immunreaktive Flecken wurden durch Inkubation übernacht bei Raumtemperatur mit Patientenseren (1500-5000 × Verdünnungen), gefolgt von Inkubation mit Kaninchen-anti-Mensch IgGs, konjugiert mit Peroxidase (Cappel, 7000 × Verdünnung), und Nachweis mit einem Kit auf Chemilumineszenz-Basis (Pharmacia Amersham Biotech) nachgewiesen.
Typischerweise werden sechs identische 2D-Karten für jedes Experiment parallel erstellt – fünf wurden auf Nitrocellulose geblotted und eine wird für die anschließende Korrelation mit den Immunblots und den Computer-unterstützten Abgleich mit der Referenzkarte mit Silbernitrat gefärbt.
Die Flecksignale auf dem Immunblot entsprechen fast immer einem Flecken auf dem silbergefärbten Gel. In mindestens zwei Fällen jedoch (Flecken 13 und 14 in 1) wies die Immunblotanalyse Proteinflecken nach, die auf den silbergefärbten Karten nicht sichtbar waren. Dies zeigt, daß diese Technik eine überlegene Sensitivität hat und auch für systematische Proteomstudien als wertvolles Werkzeug in Betracht gezogen werden sollte.
Um den Abgleich der Immunblots mit der in 1 gezeigten Referenzkarte zu unterstützen wurden die Nitrocelluloseblots unter Verwendung der transienten Färbung mit Ponceaurot mit einer Zahl von internen „Anker"-Flecken markiert. Nach der Inkubation mit den Seren und dem Nachweis der gebundenen Antikörper mittels Chemilumineszenz wurden die Immunblotbilder mit der Referenzkarte abgeglichen und die Flecken wurden entsprechend ihrer pl- und MW-Koordinaten zugeordnet (vgl. Tabelle II). Wenn die Position und die Form des Flecken (oder die isoelektrische Serie von Flecken) mit einem zuvor identifizierten EB-Antigen zusammenfielen, wurde eine Immunantwort gegen solch ein Antigen festgestellt. In allen anderen Fällen wurde der Immunblotflecken mit den MW- und pl-Koordinaten identifiziert, die im Barizentrum der gefärbten Fläche (oder dem Koordinatenbereich im Falle von komplexen Fleckmustern) genommen wurden. Es sollte festgehalten werden, daß die MW- und pl-Werte elektrophoretisch bestimmt werden und einen potentiellen mittleren Fehler von +/-10 % haben können. Die höheren MW-Messungen werden dazu tendieren, weniger genau zu sein.
Während die Kontrollblots völlig leer waren, zeigten die Patientenblots individuell unterschiedliche Muster, die eine Anzahl von Flecken umfassten, die von 2 bis zu 28 variierten, mit einem Mittelwert von etwa 15 (vgl. Tabelle II). Die Zahl an immunreaktiven Flecken korrelierte nicht mit den Serum-MIF-Titern (vgl. Tabellen I und II), somit scheinen die Fleckenmuster eine reale individuelle Variation bei den humoralen Antworten zu reflektieren und nicht nur die Differenz der Antikörpertiter. Dies wurde auch durch den Vergleich der Ergebnisse von jedem Serum bei verschiedenen Verdünnungen bestätigt.
Typische Immunblotergebnisse sind in 2 gezeigt. Die einzige konstante Eigenschaft aller untersuchten Seren war die Anwesenheit von Antikörpern gegen ein komplexes Cluster von Flecken, die zuvor als dem cysteinreichen äußeren Membranprotein OMP2 [12] zugehörig identifiziert worden waren. Dieses Cluster ist in 1 als Fleck 1 gezeigt – alle Flecken, die mit "1" bezeichnet werden, wurden als ein einziges Antigen gewertet, aber eine Anzahl von begleitenden Flecken mit niedrigeren MW- und pl-Werten, die üblicherweise mit der OMP2-Reaktivität assoziiert erscheinen, wurden separat gewertet, da ihre Beziehung zum OMP2-Polypeptid noch unklar ist. Da das OMP2-Polypeptid Chlamydien-spezifisch ist und keiner relevanten antigenen Variation zu unterliegen scheint, kann es in dieser Untersuchung als der wahrscheinlich beste Marker für eine Chlamydien-Infektion betrachtet werden.
Die nächsthäufigsten Flecken, die beobachtet wurden, entsprechen dem folgenden:

• Fleck 2 – das GroEL-ähnliche Protein (hsp60) (15/17 Patienten)
• Fleck 3 – das Haupt-äußere Membranprotein MOMP (13/17 Patienten)
• Fleck 4 – das DnaK-ähnliche (hsp70) Protein (11/17 Patienten)

Die Reaktivität mit diesen bekannten Immunogenen kann als eine interne Kontrolle betrachtet werden, die die Qualität der in dieser Untersuchung verwendeten menschlichen Seren demonstriert. Das Fehlen der Reaktivität mit pgp3 auf den Blots ist jedoch signifikant, weil alle Seren in einem ELISA-Bestätigungstest mit einer gereinigten löslichen Form von pgp3 positiv gefunden worden waren. Dies legt nahe, dass eine Antikörperantwort gegen pgp3 bei menschlichen Infektionen hauptsächlich gegen Epitope auftritt, die nur bei einer korrekt gefalteten Proteinstruktur verfügbar ist, die bei diesen Experimenten verloren gehen würde.
Patientenimmunreaktionen wurden auch gegen die folgenden Proteine nachgewiesen [vgl. Ref. 12]:

• Fleck 10 – Proteinelongationsfaktor EF-Tu (8/17 Patienten)
• Fleck 19 – ribosomale Proteine S1 (5/17)
• Fleck 12 – ribosomales Proteine L7/L12 (7/17)

Neben diesen bekannten Proteinen wurden mehrere neue immunreaktive Proteine mit Häufigkeiten nachgewiesen, die von 11/17 bis zu 1/17 reichten. Die MW- und pl-Charakteristika dieser Proteine sind in Tabelle II gezeigt. Außerdem wurde in einigen Fällen eine zusätzliche Analyse durch N-terminale Sequenzierung durchgeführt, die durch Homologierecherchen in Datenbanken ergänzt wurde.
Fleckmikrosequenzierung
2D-Karten wurden wie vorstehend beschrieben hergestellt, ausgehend von 1 mg gesamt-EB-Protein pro Lauf, gefolgt von Blotten auf Polyvinylidendifluorid-Membranen (BioRad PVDF-Membranen 20 × 20 cm, 0,2 Mikron Porengröße) wie in Referenz 20. Die Blots wurden mit 0,1 % (Gew./Vol.) Coomassie-Brillantblau R250 in 50 %-igem wässrigem Methanol 5 Minuten gefärbt und in 40 % Methanol, 10 % Essigsäure entfärbt. Die Membranen wurden bei 37°C getrocknet und bei -20°C für die weitere Analyse aufbewahrt. Ausgewählte Proteinflecken wurden ausgeschnitten und unter Verwendung eines automatischen Protein/Peptid-Sequenzierungsgeräts (Mod. 470 A, Applied Biosystems Inc.), das mit einem Phenylthiohydantoin-Aminosäureanalysator Modell 120 A und einem Kontroll/Datenmodul Modell 900 A (Applied Biosystems Inc.) der Aminosäuresequenzierung mittels Edman-Abbau unterworfen. Typischerweise wurden 3 oder 4 äquivalente Flecken von ähnlichen Blots verwendet, entsprechend der geschätzten relativen molaren Menge an Protein in dem Flecken.
Die Resultate der Sequenzierung sind in Tabelle III Seite 16 gezeigt.
Computeranalyse der Sequenzen
Unter Verwendung der N-terminalen Sequenzierungsdaten wurden Datenbankenrecherchen für Proteinähnlichkeit unter Verwendung des Programms BLAST [21], das von NCBI [http://www.ncbi.nlm.nih.gov] verfügbar ist, und von Programmen der GCG-Software (Wisconsin Package Version 9,0) [22] durchgeführt. Die theoretischen pl- und MW-Werte wurden mit dem pl/MW-Computerprogramm berechnet, das bei dem ExPASy Internet-Server [http://www.expasy.ch] verfügbar ist.
Zusätzlich zu den üblichen Datenbanken wurden die genomischen Sequenzierungsdaten des C.trachomatis-Stamms D/UW-3/Cx recherchiert, die von dem Chlamydia Genomprojekt [http://chlamydia-www.berkeley.edu:4231] bereit gestellt wurden. Obwohl die vorliegende Untersuchung den C.trachomatis-Stamm Serovar 12 (Lymphogranuloma Biovar) verwendete, der einen verschiedenen Pathogenitäts-Phänotyp hat, konnten mehrere Proteinsequenzen sicher mit den Serovar D-Genen korreliert werden.
Die Recherchen mit den N-terminalen Daten erlaubten die Korrelation von sieben immunreaktiven Flecken mit bekannten Sequenzen (zusätzlich zu den sieben vorstehend festgehaltenen):

• Fleck 15: vorhergesagt, eine periplasmische Peptidase zu sein (gegenwärtig in der genomischen Datenbank von Serovar D als htrA bezeichnet).
• Flecken 18 & 46: vorhergesagt, ein äußeres Membranprotein zu sein (gegenwärtig in der genomischen Datenbank als ompB bezeichnet).
• Fleck 21: Obwohl die Aminosäuresequenz keinem zuvor beschriebenen Protein entspricht, zeigt sie Homologie zu einer internen Sequenz von EF-Tu. Diese Protein kann ein Abbau- oder Prozessierungsprodukt von EF-Tu oder einer Variante sein.
• Fleck 24: Die alpha-Untereinheit der RNA-Polymerase (rpoA)
• Fleck 25: homolog mit bakteriellen Leucin-Peptidasen (gegenwärtig in der genomischen Datenbank als pepA bezeichnet).
• Fleck 38: vorhergesagt, ein GTP-Bindungsprotein zu sein (gegenwärtig als ychF bezeichnet).

Die N-terminalen Sequenzen der Flecken 26, 31 und 33 stimmten mit keinen Datenbankensequenzen, einschließlich der publizierten Serovar D-Sequenz überein.
Die Tabelle IV zeigt eine Zusammenstellung an Identifikationen (einige mutmaßlich) von mehreren immunreaktiven Antigenen, die entweder durch Vergleich mit vorherigen 2D-Kartierungsdaten oder durch Homologierecherchen mit den vorstehend erhaltenen N-terminalen Sequenzierungdaten erhalten wurden
Proteine von besonderem Interesse
Von besonderem Interesse sind die folgenden von den Immunblots identifizierten Proteine:
Fleck 24
Von diesem Fleck nimmt man an, dass er die alpha-Kette der RNA-Polymerase von C.trachomatis (gi620029) ist, basierend auf seiner MW/pl-Position und seiner Sequenz am N-Terminus. Obwohl die RNAP-alpha-Kette zuvor beschrieben wurde [23], wurde nie berichtet, dass sie ein Chlamydien-Immunogen ist. Vier Patienten zeigten eine Reaktivität gegenüber diesem Protein, was zeigt, dass es infolge einer Chlamydien-Infektion im Menschen immunogen ist. Während die intrazelluläre parasitäre Natur von Chlamydia bedeutet, dass es im allgemeinen der Antikörper-vermittelten Immunantwort entkommen kann, zeigte die vorstehend gezeigte Antikörperreaktivität, dass das Immunsystem während der natürlichen Infektion diesen Proteinen nicht begegnet und dass die Bildung von Antikörpern zum Beispiel auch dem Hervorrufen der T-Zell-vermittelten Immunantworten helfen kann.
Flecken 18 & 46
Die Flecken 18 und 46 scheinen dem ompB-Gen im Genom von Serotyp D homolog zu sein, dem zugeordnet wird, dass es mutmaßlich ein äußeres Membranprotein codiert. Die N-terminalen Sequenzen und die pl- & MW-Werte (zumindest für den Fleck 18 – 5,08/34,09 gegenüber den vorhergesagten theoretischen Werten von 5,06/34,5) sind in Übereinstimmung mit den erwarteten Eigenschaften eines ompB-Genprodukts, nach der Abspaltung des vorhergesagten N-terminalen Signalpeptids.
Es wurde auch gefunden, dass die Flecken 18 und 46 in einer 2D elektrophoretischen Karte einer gereinigten Präparation eines äußeren Membrankomplexes von Chlamydien vorhanden sind, was auch die Ansicht unterstützt, dass die Flecken 18 und 46 Homologe des ompB-Gens von Serotyp D darstellen.
Der Grund, warum dieses Protein als zwei verschiedene elektrophoretische Spezies erscheint, wurde nicht untersucht, aber eine Fleckverschiebung dieses Typs ist üblicherweise assoziiert mit einer Variation der Aminosäurezusammensetzung, entweder wegen einer Aminosäuresequenzvariation und/oder tatsächlicher oder auf Artefakten beruhender Derivatisierung einiger Aminosäurereste.
Fünf Patienten zeigten eine Reaktivität gegenüber diesem Protein, was zeigt, dass es infolge einer Chlamydien-Infektion im Menschen immunogen ist.
Fleck 25
Von diesem Fleck glaubt man, dass er eine Aminopeptidase ist, basierend auf seiner MW/pl-Position und seiner Sequenz am N-Terminus (beides im Vergleich mit der publizierten Sequenz von pepA von Serovar D). Vier Patienten zeigten eine Reaktivität gegenüber diesem Protein, was zeigt, dass es infolge einer Chlamydien-Infektion im Menschen immunogen ist.
Fleck 38
Von diesem Fleck glaubt man, dass er ein GTP-Bindungsprotein ist, basierend auf seiner MW/pl-Position und seiner Sequenz am N-Terminus (beides im Vergleich mit der publizierten Sequenz von ychF von Serovar D). Zwei Patienten zeigten eine Reaktivität gegenüber diesem Protein, was zeigt, dass es infolge einer Chlamydien-Infektion im Menschen immunogen ist.
Fleck 15
Von diesem Fleck glaubt man, dass er eine Stress-induzierte Protease ist, basierend auf seiner MW/pl-Position und seiner Sequenz am N-Terminus (beides im Vergleich mit der publizierten Sequenz von htrA von Serovar D). Sieben Patienten zeigten eine Reaktivität gegenüber diesem Protein, was zeigt, dass es infolge einer Chlamydien-Infektion im Menschen immunogen ist.
Fleck 8
Neun Patienten zeigten Reaktivität gegenüber Proteinfleck 8, der nicht mittels N-terminaler Sequenzierung charakterisiert werden konnte. Er hat jedoch die folgende Aminosäurezusammensetzung 'Konstellation Typ 2' (molare Prozentsätze):

aa % aa % aa % aa %

Ala 6,5 Gly 22,5 Lys 3,7 Ser 13,7

Arg 3,5 His 0,5 Met 0,5 Thr 5,1

Asx 8,4 Ile 3,7 Phe 2,8 Tyr 2,2

Glx 12,5 Leu 6,7 Pro 3,4 Val 4,3
Cys und Trp werden bei dieser Art von Analyse nicht bestimmt und es ist nicht möglich, zwischen Glu/Gln und Asp/Asn zu unterscheiden.
Die Unmöglichkeit der Gewinnung der N-terminalen Sequenz trotz wiederholter Versuche legt nahe, dass der N-terminale Rest aufgrund einer Form von Modifikation (z.B. ein Lipoprotein) blockiert ist. Die Modifikation ist oft ein Charakteristikum von Membran-assoziierten Proteinen in Eukaryonten, ist aber auch ein Charakteristikum von Proteinen der äußeren Oberfläche oder sezernierten Proteinen von Bakterienarten (z.B. Lipoproteine [24], äußere Membranproteine von Mycoplasma [25], der FHA Virulenzfaktor von B.pertussis [26], usw.).
Fleck 12
Von diesem Fleck glaubt man, dass er auf dem ribosomalen Protein L7/L12 beruht. Sieben Patienten zeigten eine Reaktivität gegenüber diesem Protein, was zeigt, dass es infolge einer Chlamydien-Infektion im Menschen immunogen ist. Obwohl dieses Protein zuvor in Chlamydia beschrieben wurde [Zugangsnummer P38001], wurde es nie als Chlamydien-Antigen beschrieben. Es wurde jedoch als ein Immunogen bei Brucella-Infektionen beschrieben [27, 28].
Fleck 19
Von diesem Fleck glaubt man, dass er auf dem ribosomalen Protein S1 beruht. Fünf Patienten zeigten eine Reaktivität gegenüber diesem Protein, was zeigt, dass es infolge einer Chlamydien-Infektion im Menschen immunogen ist. Obwohl dieses Protein zuvor in Chlamydia beschrieben wurde [Zugangsnummer P38016], wurde es nie als ein Immunogen beschrieben.
Fleck 10
Von diesem Fleck glaubt man, dass er auf dem Proteinsynthese-Elongationsfaktor EF-Tu beruht. Acht Patienten zeigten eine Reaktivität gegenüber diesem Protein, was zeigt, dass es infolge einer Chlamydien-Infektion im Menschen immunogen ist. Obwohl EF-Tu in Chlamydia zuvor beschrieben wurde [Zugangsnummer P26622], wurde es nie als ein Immunogen beschrieben.
Flecken 10, 12, 15, 19 & 24
Unter Berücksichtigung der Bedeutung einer möglichen vorherigen Sensibilisierung gegen konservierte mikrobielle Antigene bei chronischen Infektionen, die immunpathogene Reaktionen auslösen könnten, ist es bemerkenswert, dass mehrere der neuen immunreaktiven Antigene zu konservierten Familien von bakteriellen Proteinen gehören: vier (23 %) Seren reagierten mit Fleck 24 (der alpha-Untereinheit der RNA-Polymerase); fünf (29 %) erkannten Fleck 19 (ribosomales Protein S1); acht (47 %) erkannten Fleck 10 (EF-Tu); sieben (41 %) erkannten Fleck 15 (vermutlich stress-induzierte Protease der HtrA (S2C Peptidase)-Familie); und sieben Seren (41 %) erkannten Fleck 12 (das ribosomale Protein L7/L12). In der Gruppe der bei dieser Untersuchung verwendeten Seren regierten 12/17 (70,6 %) mit mindestens einem dieser fünf Antigene und einschließlich der hsp60- und hsp70-Antigene hatten alle Seren Antikörper, die mit zwischen 1 und 7 (Mittelwert 3,7) Proteinen von Chlamydien reagierten, die Homologe in anderen Bakterien haben.
Theorien, die eine Rolle von immunologischen Sensibilisierungsmechanismen bei der Pathologie der Chlamydien postulieren, wie beschrieben für das hsp60 GroEL-ähnliche Antigen [29], sollten in der Tat ausgedehnt werden auf mehrere andere allgemeine bakterielle Antigene, die bei anderen bakteriellen Infektionen immunogen sein können. Zum Beispiel ist der Protein-Elongationsfaktor EF-Tu während der akuten Phase der Infektion mit Haemophylus influenzae immunogen und L7/L12 und die HtrA stress-induzierte Protease sind beide bei Brucella-Infektionen immunogen. Im Falle von EF-Tu kann die große Menge dieses Proteins in der Bakterienzelle die 'Sichtbarkeit' durch das Immunsystem favorisieren. Es sollte jedoch festgehalten werden, dass beschrieben wurde, dass EF-Tu mit Zellfraktionen der äußeren Membran und des Periplasma assoziiert ist [30], und neuere Daten legen nahe, dass EF-Tu zusätzlich zu seiner Funktion bei der Peptidverlängerung auch eine Chaperon-Aktivität hat, die in die Proteinfaltung und den Schutz vor Stress eingreift [31]. Besonders interessant ist die Antwort auf das ribosomale Protein L7/L12, da bei Infektionen mit Brucella melitensis das homologe Antigen L7/L12 eine von DTH-Zellen vermittelte Antwort induziert [27]. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass eine Impfung von BALB/c-Mäusen mit L7/L12 Schutz gegen eine Infektion mit B.abortus gibt [32]. Der unerwartet Befund, dass Antikörper gegen L7/L12 in Patienten relativ häufig sind, die mit C.trachomatis infiziert sind, legt nahe, dass vielleicht diesem Antigen auch bei von Chlamydien induzierter Krankheit weitere Aufmerksamkeit gezollt werden sollte.
Flecken 5, 6, 7 & 9
Während diese Proteine noch mit keinen verfügbaren Genomsequenzen korreliert sind und noch nicht sequenziert wurden, sind sie doch von offensichtlichem Interesse, unter Berücksichtigung ihrer häufigen Vorkommens (> 50 %) in den getesteten Seren.
TABELLE I – ZUSAMMENSTELLUNG DER PATIENTENSEREN

Die Buchstaben in der ersten Spalte entsprechen den in Tabelle II gegebenen. Die Codes in der zweiten Spalte betreffen die Originalserumkollektion. Die mit jedem Patienten assoziierte Pathologie ist im allgemeinen indiziert als Cervicitis (Infektion des unteren Genitaltrakts), PID oder Sterilität (sekundäre Infektion). Alle Seren wurden mit einem MIF-Test mit gereinigten L2-Elementarkörpern charakterisiert. Die MIF-Titer, die in der Tabelle angegeben werden, ist die höchste zweifache Verdünnung, die ein positives Signal ergab. Die 'Beste Verdünnung' ist die Verdünnung, bei der gefunden wurde, dass sie ohne Verlust der Signale von schwächeren Flecken einen minimalen Untergrund ergab.

Serum ID in Tabelle II	Orginalserum ID	Pathologie	MIF Titer	Beste Verdünnung
A	JO45/7931 BB	cervicitis	256	1:5000
B	JO28/7935 BB	cervicitis	16	1:1500
C	JO29/7936 BB	cervicitis	16	1:2000
D	JO51/7997 B5	cervicitis	256	1:5000
E	hs-C (Bologna)	P.I.D.	256	1:5000
F	14293 BB	P.I.D.	1024	1:10000
G	hs-B (Bologna)	P.I.D.	32	1:2000
H	JO6/7942 BB	P.I.D.	256	1:5000
I	JO17/7953 BB	P.I.D.	256	1:5000
J	JO43/7989	P.I.D.	256	1:5000
K	JO20=/7956 BB	P.I.D.	256	1:5000
L	JO42/7988 BB	P.I.D.	256	1:5000
M	JO41/7987 BB	P.I.D.	256	1:5000
N	JO31/7977 BB	P.I.D.	256	1:5000
O	13839 BB	P.I.D.	256	1:5000
P	JO35/7994 BB	Sterllität	64	1:2500
Q	JO52/7933 BB	Sterllität	64	1:2500

TABELLE II – PATIENTENREAKTIVITÄT MIT DEN PROTEINFLECKEN

Fleck #	pl	MW	A	B	C	D	E	F	G	H	I	J	K	L	M	N	O	P	Q	Häufigkeit
1	Komplex		+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	17
2	5,2-5,3	59,9	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+			+	+	+	+	15
3	4,6-4,9	40	+	+	+	+	+	+	+		+	+		+		+	+		+	13
4	4,92-5,04	70,5	+	+	+	+	+	+			+	+	+		+				+	11
5	5,09	36,6	+	+	+	+	+	+			+	+				+		+	+	11
6	6,34	46,2-50	+			+	+	+			+	+	+			+		+	+	10
7	6,59	46,2-50,2	+			+	+	+			+	+	+			+		+	+	10
8	4,96	36,6	+		+		+	+			+	+				+		+	+	9
9	6,36	37,7-39,4	+	+			+	+			+	+	+					+	+	9
10	5,44-6,64	42,2	+	+	+		+		+				+					+	+	8
11	6,66	26,1		+			+	+			+		+			+	+		+	8
12	4,80	15,8		+		+	+				+		+	+						6
13	6,1	37,4-39,2	+	+			+						+			+		+	+	7
14	6,24	47,9	+				+	+			+	+	+					+		7
15	5,89	46,4	+	+	+		+	+					+					+		7
16	6,15	46-50	+				+				+	+	+					+	+	7
17	5,92	25,3		+			+	+								+	+		+	6
18	5,08	34,09			+	+		+					+						+	5
19	5,14-5,28	69	+		+	+		+					+							5
20	5,44	26,2		+			+									+	+		+	5
21	5,27	40,5		+	+	+							+						+	5
22	4,81	46,3	+		+								+	+		+				5
23	4,97	34,2			+			+					+							4
24	5,32	40,5			+	+							+					+	+	4
25	5,97	47,6	+	+															+	4
26	5,68	48,6	+					+					+					+	+	4
27	6,29-6,42	124,5	+				+					+								4
28	5,39	25,5					+	+								+				3
29	5,1	28,7					+				+					+				3
30	4,8	36,7			+		+												+	3
31	5,43	40,4				+							+						+	3
32	5,2-5,37	52,4			+			+					+							3
33	6,64	25,4					+				+									2
34	4,79	28,1				+													+	2
35	4,82	29,5				+													+	2
36	6,55	37,5					+					+								2
37	5,14	40,3		+															+	2
38	5,23	40,1																+	+	2
39	4,69	45,7		+										+						2
40	6,89	50										+						+		2
41	6,39-6,55	105	+				+													2
42	4,57	20,3									+									1
43	4,72	26,5					+													1
44	7,6	26,95											+							1
45	6,9	29,7														+				1
46	5,19	33,4				+														1
47	6,99	35,8											+							1
48	6,54	35,9											+							1
49	5,44	39,0																	+	1
50	5,37	41,0																	+	1
51	7,59	42,6											+							1
52	8,73	49,2					+									+				1
53	7,98	49,4			+															1
54	7,4	50,2											+							1
55	7,4	51,5											+							1

TABELLE III – N-TERMINALE SEQUENZEN DER PROTEINE

Fleck	N-terminale Sequenz
10	SKETFQRNK
12	TTESLETLVE
15	LAVSSGDQEVSQEDLLKE
18	XPAGNPAFPVIP
21	AKTRTLKGDG
24	SDSSHNLLYNK
25	VLLYSQASWDQRSKADAL
28	KAVYVQD(A/Q)E(V/D)Q
31	KDxxTNGQR
33	MSKGGQtxD(Y/G)
38	XQXENGIVGL
46	MPAGNPAFPVIP

TABELLE IV – IDENTIFIKATION DER ANTIGENE

"CT-D-Gen" betrifft den Gennamen von Referenz 2 und gibt die Namen von Genen, die wahrscheinlich homologe Proteine in C.trachomatis D codieren. Die theoretischen pl/MW-Werte in der letzten Spalte wurden zum Vergleich mit den experimentellen Werten aus den CT-D-Gensequenzen berechnet.

Fleck	Kartenlage	N-terminale AA-Seq	Zuordnung	CT-D-Gen	Vorausgesagter PI/M
1	OMP2-Cluster	–	OMP2	omcB	7,65-7,92/54,5-58,7
2	5,2-5,3/59,7	VA(D/K)NI(K/F)YNEE	GroEL-ähnlich	groEL1	5,11/58,1
3	4,6-4,9/40	LPVGN	MOMP	ompA	4,69/40,3
4	4,92-5,04/70,5	SEKRK(S/A)N(K/S)	DnaK-ähnlich	dnaK	4,88/70,7
10	5,44-5,64/42,2	SKETFQRNK	EF-Tu	tufA	5,36/43,1
12	4,80/15,8	TTESLETLVE	Ribosonales Protein L7/12	rl7	5,09/13,5
15	5,89/48,4	LAVSSGDQEVSQEDLLKE	Stress-induzierte Protease	htrA	5,83/49,5,
18	5,08/34,09	XPAGNPAFPVIP	äußere Membranpratein	ompB	5,06/34,5
19	5,14-5,28/69	nicht bestimmt	Ribosomales Protein S1	rs1	5,17/63,6
21	5,27/40,5	AKTRTLKGDG	EF-Tuverwandtes Peptid?	–	–
24	5,32/40,5	SDSSHNLLYNK	RNAP A Alpha-Kette	rpoA	5,34/41,7
25	5,97/47,6	VLLVSQASWDQRSKADAL	Aminopeptidase	pepA	5,74/54,0
28	5,68/48,6	KAVYVQD(A/Q)E(V/D)Q	nicht identifiziert	–	–
31	5,43/40,4	KDxxTNGQR	nicht identifiziert	–	–
33	6,64/25,4	MSKGGQtxD(Y/G)	nicht identifiziert	–	–
38	5,23/40,1	XQXENGIVGL	GTP-bindendes Protein	ychF	5,16/39,5
46	5,19/33,4	MPAGNPAFPVIP	äußere Membranprotein	ampH	5,06/34,5

Claims

C.trachomatis-Protein mit der in Zugangsnummer P38001 gegebenen Sequenz und mit einem MW von 15,8 kDa und einem pl-Wert von 4,80 zur Verwendung als ein Arzneimittel.
Antikörper, welcher an das Protein nach Anspruch 1 bindet, zur Verwendung als Arzneimittel.
Nucleinsäure, die das Protein nach Anspruch 1 codiert, zur Verwendung als Arzneimittel.
Verwendung eines Proteins nach Anspruch 1, eines Antikörpers nach Anspruch 2 und/oder einer Nucleinsäure nach Anspruch 3 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Vorbeugung einer Infektion aufgrund von Chlamydia.
Verwendung eines Proteins nach Anspruch 1, eines Antikörpers nach Anspruch 2 und/oder einer Nucleinsäure nach Anspruch 3 für die Herstellung eines diagnostischen Reagenses zum Nachweis der Gegenwart von Chlamydia oder von gegen Chlamydia gerichteten Antikörpern
Verwendung eines Proteins nach Anspruch 1, eines Antikörpers nach Anspruch 2 und/oder einer Nucleinsäure nach Anspruch 3 für die Herstellung eines Reagenses, welches Antikörper gegen Chlamydia erzeugen kann.