PT1140997E - Antigénios de chlamydia trachomatis - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO EPÍGRAFE: "ANTIGÉNIOS DE CHLAMYDIA TRACHOMATIS"

Esta invenção relaciona-se com proteínas antigénicas de Chlamydia trachomatis. Em particular, o invento está relacionado com antigénios que são reconhecidos por anticorpos presentes nos soros de pacientes cronicamente infectados ou convalescentes.

Antecedentes do invento

Os microorganismos do género Chlamydia são parasitas intracelulares obrigatórios de células eucarióticas responsáveis por infecções endémicas sexualmente transmitidas, tracoma, pneumonite infecciosa e vários outros síndromas patológicos. Estes parasitas ocupam um ramo filogenético eubacteriano exclusivo, que não possui uma relação próxima com quaisquer outros organismos conhecidos - são classificados numa ordem própria (Chlamydiales) que contém uma só família (Chlamydiaceae) que, por seu turno, contém um só género {Chlamydia). São actualmente conhecidas quatro espécies de clamídia - C. trachomatis, C. pneumoniae, C. pecorum e C. psittaci [p.ex., ver referência 1]. Foi recentemente publicada uma sequência do genoma de C. trachomatis (serovar D) [2].

Os serovariantes humanos ("serovars") de C. trachomatis estão divididos em dois biovariantes ("biovars"). Os serovars A-K desencadeiam infecções epiteliais primariamente a nível do tecido ocular (A-C) ou do tracto urogenital (D-K). Os serovars 1

Ll, L2 e L3 são os agentes do linfogranuloma venéreo invasivo (LGV).

Se bem que a infecção por clamídia seja por si só causadora de doença, pensa-se que, em alguns pacientes, a gravidade dos sintomas se deve, na verdade, a uma resposta imune aberrante por parte do hospedeiro. A incapacidade de eliminar a infecção resulta numa estimulação imune persistente e, em lugar de ajudar o hospedeiro, tal resulta em infecção crónica com consequências graves, incluindo esterilidade e cegueira [3] .

Adicionalmente, a protecção conferida por uma infecção natural por clamídia é usualmente incompleta, transitória e especifica de estirpe.

Devido à natureza grave desta doença, existe o desejo de produzir e fornecer vacinas adequadas. Estas poderão ser úteis para (a) a imunização contra a infecção por clamídia ou contra a doença induzida por clamídia (vacinação profiláctica) ou (b) a erradicação de uma infecção crónica por clamídia já estabelecida (vacinação terapêutica). Sendo um parasita intracelular, no entanto, a bactéria exibe de modo geral a capacidade de iludir as respostas imunes mediadas por anticorpos .

Foram já descritas diversas proteínas antigénicas de C. trachomatis, e a superfície celular em particular tem sido alvo de detalhada pesquisa [p.ex. 1,4]. Estas proteínas antigénicas incluem, por exemplo, a pgp3 [5, 6, 7], MOMP [8], Hsp60 (GroEL) [9] e Hsp70 (DnaK-like) [10] . No entanto, nem todas estas proteínas se evidenciaram como vacinas eficazes, constituindo um objectivo deste invento a identificação de antigénios de clamídia capazes de desencadear uma resposta imune durante uma infecção natural, de modo a se fornecerem antigénios e imunogénios adequados para uso no desenvolvimento de vacinas. 2

Descrição do invento 0 invento baseia-se na identificação de proteínas codificadas por Chlamydia trachomatis que se mostram imunogénicas no homem em consequência de uma infecção. A exposição deste invento proporciona uma proteína de C. trachomatis que possui as características de PM e pl correspondentes à proteína 5, 6, CO 11 , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 4^ CO 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou 55 , tal como exposto na Tabela II da página 14.

Estão incluídas as proteínas que possuem, na estirpe L2 de C. trachomatis, uma sequência N-terminal de aminoácidos tal como apresentada na Tabela III da página 16.

Esta exposição fornece igualmente proteínas que exibem identidade de sequência com estas proteínas de C. trachomatis. Dependendo da proteína particular considerada, o grau de identidade será preferencialmente superior a 50% (p.ex., 65%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais) . Estas proteínas homólogas incluem mutantes, variantes alélicos, serovariantes e biovariantes. A identidade entre as proteínas é preferencialmente determinada através do algoritmo de pesquisa de homologias de Smith-Waterman, tal como implementado no programa MPSRCH (Oxford Molecular), usando uma pesquisa de gaps de afinidade com parâmetros de gap open penalty=12 e gap extension penalty=l. Tipicamente, uma identidade de 50% ou mais entre duas proteínas é considerada como uma indicação de equivalência funcional.

Este invento proporciona ainda proteínas que compreendem fragmentos das proteínas de C. trachomatis expostas neste invento. Os fragmentos deverão compreender pelo menos n aminoácidos consecutivos destas proteínas e, dependendo da proteína considerada em particular, n corresponderá a 7 ou 3 mais (p.ex., 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 50, 100 ou mais). De preferência, os fragmentos contêm um epitopo da proteína.

As proteínas deste invento poderão, evidentemente, ser preparadas de diversas formas (p.ex., por expressão recombinante, purificação a partir de culturas celulares, síntese química, etc.) e sob diversas formas (p.ex., nativas, de fusão, etc.). As proteínas são preferencialmente preparadas sob uma forma substancialmente isolada ou purificada (i.e., substancialmente isenta de outras proteínas de C. trachomatis ou da célula hospedeira).

De acordo com um aspecto adicional do invento, são fornecidos anticorpos que se ligam a estas proteínas. Estes anticorpos poderão ser policlonais ou monoclonais, e poderão ser produzidos através de qualquer meio adequado.

De acordo com um outro aspecto do invento, o invento fornece ácido nucleico codificando para as proteínas e fragmentos de proteínas do invento. É também fornecido ácido nucleico possuindo identidade de sequência com este ácido nucleico. Dependendo do ácido nucleico considerado em particular, o grau de identidade será preferencialmente superior a 50% (p.ex., 65%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais).

Adicionalmente, o invento fornece ácido nucleico que se pode hibridizar com este ácido nucleico, preferencialmente sob condições de "elevada restringência" (p.ex., 65°C numa solução de 0,lxSSC, 0,5% SDS) . São igualmente fornecidos fragmentos deste ácido nucleico. Os fragmentos deverão compreender pelo menos n nucleótidos consecutivos das sequências e, dependendo da sequência particular considerada, n corresponderá a 10 ou mais (p.ex., 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40 ou mais).

Deverá ainda salientar-se que este invento fornece ácido nucleico compreendendo sequências complementares às acima 4 descritas (p.ex., para proporcionar sequências anti-senso ou de sonda). 0 ácido nucleico de acordo com o invento poderá, evidentemente, ser preparado por diversas formas (p.ex., por síntese química, a partir de bibliotecas genómicas ou de cDNA, a partir do próprio organismo, etc.) e poderá encontrar-se sob diversas formas (p.ex., cadeia simples, cadeia dupla, vectores, sondas, etc.).

Adicionalmente, o termo "ácido nucleico" inclui DNA e RNA e também os seus análogos, tal como os contendo cadeias principais modificadas, e ainda ácidos nucleicos peptídicos (PNA), etc.

De acordo com um aspecto adicional do invento, são fornecidos vectores compreendendo ácido nucleico do invento (p.ex. vectores de expressão) e células hospedeiras transformadas com tais vectores.

De acordo com ainda outro aspecto do invento, são fornecidas composições compreendendo proteína, anticorpo e/ou ácido nucleico de acordo com o invento. Estas composições poderão mostrar-se adequadas como composições imunogénicas (incluindo vacinas), por exemplo, ou como reagentes para diagnóstico. 0 invento proporciona igualmente ácido nucleico, proteína ou anticorpo de acordo com o invento para uso como medicamentos (p.ex., como vacinas) ou como reagentes para diagnóstico. Em particular, o invento fornece a proteína 5, 6, 7, co 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou 55 (tal como definido na Tabela II da pág. 14) para uso como um imunogénio de clamídia. Em particular, o invento proporciona 5 uma proteína de C. trachomatis possuindo a sequência apresentada com o número de acesso P38001 e possuindo um PM de 15,8 kDa e um pi de 4,80, para uso como um medicamento, um anticorpo que se liga à proteína da Reivindicação 1, para uso como um medicamento, assim como ácido nucleico codificando para a proteína da Reivindicação 1, para uso como um medicamento.

Se bem que algumas das proteínas descritas na Tabela II possam já ser conhecidas per se, estas não foram ainda descritas como imunogénicas. O invento proporciona igualmente o uso de ácido nucleico, proteína ou anticorpo de acordo com o invento no fabrico de (i) um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma infecção devida a Chlamydia; (ii) um reagente para diagnóstico, para a detecção da presença de Chlamydia ou de anticorpos dirigidos contra Chlamydia·, e/ou (iii) um reagente que pode estimular a produção de anticorpos contra Chlamydia. O microorganismo Chlamydia poderá pertencer a qualquer espécie ou estirpe, mas corresponderá preferencialmente a C. trachomatis. Em formas de realização preferidas, o invento fornece uma proteína de entre as 55 proteínas da Tabela II para uso em tal fabrico.

Em particular, o invento proporciona o uso de uma proteína segundo a Reivindicação 1, um anticorpo segundo a Reivindicação 2, e/ou ácido nucleico segundo a Reivindicação 3, no fabrico de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma infecção por Chlamydia, o uso de uma proteína segundo a Reivindicação 1, um anticorpo segundo a Reivindicação 2, e/ou ácido nucleico segundo a Reivindicação 3, no fabrico de um reagente para diagnóstico destinado à detecção da presença de Chlamydia ou de anticorpos dirigidos contra Chlamydia, assim como 6 o uso de uma proteína segundo a Reivindicação 1, um anticorpo segundo a Reivindicação 2, e/ou ácido nucleico segundo a Reivindicação 3, no fabrico de um reagente com a capacidade de estimular a produção de anticorpos contra Chlamydia. 0 invento proporciona um método para o tratamento de um paciente, compreendendo a administração a um paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de ácido nucleico, proteína e/ou anticorpo de acordo com o invento.

De acordo com aspectos adicionais do invento, são fornecidos diversos processos. É proporcionado um processo para a produção de proteínas de acordo com o invento, compreendendo o passo de cultivar uma célula hospedeira de acordo com o invento sob condições que induzem a expressão de proteínas. É proporcionado um processo para a produção de uma proteína ou ácido nucleico de acordo com o invento, sendo a proteína ou ácido nucleico sintetizados no todo ou em parte através de meios químicos. É fornecido um processo para a detecção de ácido nucleico de acordo com o invento, compreendendo os passos de: (a) estabelecimento de contacto entre uma sonda de ácido nucleico de acordo com o invento e uma amostra biológica, sob condições de hibridização, para formar duplexes; e (b) detecção dos ditos duplexes. É apresentado um processo para detecção das proteínas do invento, compreendendo os passos de: (a) estabelecimento de contacto entre um anticorpo de acordo com o invento e uma amostra biológica, sob condições adequadas à formação de complexos de anticorpo-antigénio; e (b) detecção dos ditos complexos. Similarmente, o invento proporciona um processo para a detecção de anticorpos anti-clamídia numa amostra, compreendendo os passos de: (a) estabelecimento de contacto 7 entre uma proteína de acordo com o invento e uma amostra biológica, sob condições adequadas à formação de complexos de anticorpo-antigénio; e (b) detecção dos ditos complexos. 0 invento proporciona igualmente kits compreendendo reagentes adequados para uso nestes processos. É fornecido um kit compreendendo uma sonda de ácido nucleico de acordo com o invento e meios para a detecção de duplexes formados pela sonda. É fornecido um kit compreendendo um anticorpo de acordo com o invento e meios para a detecção de complexos de anticorpo-antigénio formados pelo anticorpo. É ainda fornecido um kit compreendendo uma proteína de acordo com o invento e meios para a detecção de complexos de anticorpo-antigénio formados pela proteína.

Para evitar dúvidas que possam surgir, o termo "compreender" abrange tanto "incluir" como "consistir em"; p.ex., uma composição "compreendendo" X poderá ser constituída exclusivamente por X ou poderá incluir algo para além de X, tal como x+Y.

Descrição dos Esquemas A Figura 1 apresenta o mapa de referência, anotado, de EBs (corpos elementares) após electroforese 2D, indicando igualmente as posições das manchas de proteínas imunoreactivas, marcadas de 1-55. Os grupos de manchas que parecem corresponder a uma série isoeléctrica da mesma proteína encontram-se reunidas por um círculo e foram classificadas com o mesmo número de identificação. A Figura 2 apresenta imunoblots típicos. É apresentada toda a área do mapa. Os principais imunogénios conhecidos encontram-se marcados para facilitar a comparação. Para a identificação de outras manchas, consultar a Figura 1 e a Tabela II. 0 blot A corresponde à paciente J051, sofrendo de DIP (título por MIF = 256), e corresponde a uma diluição de 8 soro de 1:5000. O blot B pertence à paciente J035 (título por MIF = 64) afectada por esterilidade secundária, e corresponde a uma diluição de soro de 1:2500. O blot C é semelhante ao blot B, mas pertence à paciente J052. O blot D pertence à paciente J031 com DIP (título por MIF = 256) e corresponde a uma diluição de soro de 1:5000.

Exemplos

Soros humanos

Os soros (Tabela I) foram obtidos a partir de mulheres que haviam respondido a uma infecção do tracto genital por clamídia. Os dezassete soros (A...Q) foram obtidos a partir de 4 casos de infecção do tracto genital inferior e de 13 casos de DIP (doença inflamatória pélvica) confirmados por laparoscopia, incluindo 2 casos de esterilidade secundária. Todos os soros se evidenciaram como positivos face a um teste convencional de microimunofluorescência (MIF) usando corpos elementares L2 de C. trachomatis purificados [11], e foram confirmados como soros imunes para C. trachomatis através de um teste ELISA usando o antigénio pgp3 codificado em plasmídeo [5] .

Foi, do mesmo modo, testado por imunoblot um grupo de 10 soros seronegativos de controlo obtidos a partir de dadores de sangue saudáveis, efectuando as mesmas diluições que foram utilizadas para os soros das pacientes, de modo a excluir a ocorrência de reacções não específicas. A maioria dos soros foi obtida a partir da colecção de Chlamydia do Biobanque de Picardie (Amiens, França). Alguns soros de DIP e soros de controlo de dadores de sangue saudáveis foram fornecidos pelo Ospedale Policlínico S. Orsola (Bologna, Itália). 9

Preparação das Amostras de Proteínas

As células purificadas de clamídia foram obtidas tal como descrito na Referência 12, cultivando a estirpe L2/343/Bu de C. trachomatis em culturas de células Vero de acordo com procedimentos padronizados, seguindo-se dois ciclos de centrifugação em gradiente de densidade [13] . A concentração média em proteína da preparação de corpos elementares (EB) purificados foi determinada usando um ensaio de biureto. Foram conservadas aliquotas (2 mg proteina/ml) em água a -20°C para análise electroforética subsequente. As células usadas encontravam-se principalmente sob a forma de EBs - todos os antigénios de clamidia conhecidos até à data têm sido encontrados nos corpos elementares, e não nos corpos reticulares.

Separação das Proteínas de Clamídia

As proteínas de clamídia foram separadas usando electroforese 2D de alta resolução, efectuada utilizando o sistema de imobilina/poliacrilamida, essencialmente tal como descrito nas Referências 14 e 15.

Para os geles analíticos, foi utilizada uma quantidade aproximada de 45 pg de proteína do corpo elementar total por cada gel. Para os geles semipreparativos (para a microsequenciação), usou-se aproximadamente 1 mg de proteína. Prepararam-se pellets a partir das aliquotas de proteínas de EB centrifugando-as a baixa velocidade, sendo os pellets ressuspensos em ureia 8M, 4% CHAPS (sulfonato de 3—[(3— colamidopropil)dimetilamónio]-1-propano), base Tris 40 mM, ditioeritritol (DTE) 65 mM e quantidades vestigiais de azul de bromofenol. A focagem isoeléctrica foi efectuada em tiras de imobilina proporcionando um gradiente de pH não linear de 3 a 10 (tiras de IPG, Amersham Pharmacia Biotech). A voltagem foi aumentada 10 de modo linear a partir de 300 V até 3500 V durante as primeiras 3 horas, sendo então estabilizada a 5000 V durante 22 horas (produto de volts totais-hora = 110 kVh). Após a electroforese, as tiras de IPG foram equilibradas durante 12 min contra ureia 6 M, 30% glicerol, 2% SDS, Tris.HCl 0,05 M, pH 6,8, e 2% DTE. A segunda dimensão foi efectuada num sistema Laemmli em geles de gradiente linear de 9-16% de poliacrilamida (18 cm x 20 cm x 1,5 mm), a uma corrente constante de 40 mA/gel, durante aproximadamente 5 horas até a linha da frente do corante atingir o fundo do gel. Os geles analíticos foram corados com nitrato de prata amoniacal [16] . Os mapas de proteínas foram submetidos a varrimento com um fotodensitómetro de laser (Molecular Dynamics) e convertidos para ficheiros electrónicos que foram então analisados através do software de computador Melanie II (Bio-Rad). A Figura 1 apresenta o mapa de referência anotado de EB que foi usado para identificar as proteínas nos imunoblots. As coordenadas de PM e pl para o mapa de referência foram calibradas por co-migração das proteínas de clamídia com proteínas do soro humano actuando como proteínas de referência. Os valores de ponto isoeléctrico usados para as proteínas do soro foram os descritos na Referência 17.

Análise por Imunoblot

Os resultados dos imunoblots encontram-se resumidos na Figura 2 e na Tabela II.

Após a electroforese a duas dimensões, os geles foram submetidos a electroblot para membranas de nitrocelulose [18], e processados de acordo com procedimentos padronizados, modificados tal como descrito na Referência 19. Abreviadamente, antes da imunodetecção, as membranas foram coradas com Ponceau S a 0,2% (p/v) em ácido tricloroacético a 3% (p/v) durante três minutos, e as posições das manchas- 11 âncora seleccionadas foram marcadas no blot para auxiliar no estabelecimento da correspondência entre os imunoblots e o mapa corado por prata. As manchas imunoreactivas foram detectadas através de incubação durante 12 horas à temperatura ambiente com os soros dos pacientes (diluições de 1500-5000x), seguindo-se uma incubação com IgGs de coelho anti-humanas conjugadas com peroxidase (Cappel, diluição 7000x), e detecção usando um kit baseado em quimioluminescência (Pharmacia Amersham Biotech).

Tipicamente, são preparados seis mapas 2D idênticos em paralelo para cada experiência - cinco foram transferidos por blot para nitrocelulose e um foi corado com nitrato de prata para correlação subsequente com os imunoblots e estabelecimento de correspondência, através de computador, com o mapa de referência.

Os sinais das manchas no imunoblot corresponderam em quase todos os casos a uma mancha no gel corado por prata. No entanto, em pelo menos dois casos (manchas 13 e 14 na Figura 1), a análise por imunoblot detectou manchas de proteínas que não eram visíveis no mapa corado por prata. Tal mostra que esta técnica tem uma sensibilidade superior e deve ser tomada em consideração como ferramenta valiosa para estudos sistemáticos de proteómica.

Para auxiliar o estabelecimento da correspondência entre o imunoblot e o mapa de referência apresentado na Figura 1, as manchas na nitrocelulose foram marcadas com diversas manchas internas de "âncora" usando uma coloração transitória com Ponceau Red. Após incubação com os soros e detecção dos anticorpos ligados por quimioluminescência, as imagens no imunoblot foram comparadas com o mapa de referência e foram atribuídas às manchas as coordenadas de PM e pi correspondentes (ver Tabela II). Quando a posição e a forma da mancha (ou da série isoeléctrica de manchas) coincidiu com um 12 antigénio de EB anteriormente identificado, foi registada a ocorrência de uma resposta imune contra esse antigénio. Em todos os outros casos, a mancha no imunoblot foi identificada através das coordenadas de PM e pi tomadas a partir do baricentro da área corada (ou através da gama de coordenadas, no caso dos padrões complexos de manchas). Será de notar que os valores de PM e de pi são determinados electroforeticamente, e poderão estar afectados de um erro médio potencial de +/- 10%. As medições mais elevadas de PM tenderão para uma menor exactidão.

Enquanto que os blots de controlo se encontravam totalmente em branco, os blots das pacientes apresentavam padrões individualmente distintos compreendendo um número de manchas que variou entre 2 e 28, com uma média de cerca de 15 (ver Tabela II) . O número de manchas imunoreactivas não se correlacionou com os titulos séricos por MIF (ver Tabelas I e II), pelo que os padrões de blot parecem reflectir uma verdadeira variação individual quanto às respostas humorais, e não apenas uma diferença relativamente aos títulos de anticorpos. Tal foi igualmente confirmado por comparação dos resultados de cada soro em diversas diluições.

Os resultados tipicamente obtidos para o imunoblot são apresentados na Figura 2. A única característica constante entre todos os soros examinados foi a presença de anticorpos contra um cluster complexo de manchas previamente identificado como devido à proteína da membrana externa rica em cisteína OMP2 [12] . Este cluster corresponde à mancha 1 na Figura 1 -todas as manchas marcadas como "1" foram classificadas como pertencendo a um único antigénio, mas diversas outras manchas acessórias com valores inferiores de PM e Pi, que usualmente aparecem associadas a reactividade a OMP2, foram classificadas à parte, uma vez que a sua relação com o polipéptido OMP2 é ainda pouco clara. Uma vez que a proteína OMP2 é específica 13 para clamídia, e não parece estar sujeita a qualquer tipo de variação antigénica relevante, esta poderá ser considerada como provavelmente o melhor marcador de infecção por clamidia deste estudo.

As segundas manchas mais frequentes que foram observadas correspondem às seguintes: • Mancha 2 - a proteína GroEL-like (hsp60) (15/17 pacientes)

• Mancha 3 - a proteína principal da membrana externa MOMP (13/17 pacientes) • Mancha 4 - a proteína DnaK-like (hsp70) (11/17 pacientes) . A reactividade com estes imunogénios conhecidos pode ser considerada como um controlo interno que demonstra a qualidade dos soros humanos usados neste estudo. A ausência de reactividade a pgp3 nos blots, no entanto, é significativa porque todos os soros foram determinados como positivos num ensaio confirmatório por ELISA usando uma forma solúvel purificada de pgp3. Tal sugere que a resposta de produção de anticorpos contra a pgp3 em infecções humanas ocorre principalmente contra epitopos que se encontram disponíveis apenas numa estrutura proteica correctamente dobrada, a qual se perderia nestas experiências.

Foram igualmente detectadas reacções imunes das pacientes face às seguintes proteínas [cf. Ref. 12]: • Mancha 10 - factor de elongação de proteínas EF-Tu (8/17) • Mancha 19 - proteínas ribossomais SI (5/17) • Mancha 12 - proteína ribossomal L7/L12 (7/17)

Para além destas proteínas conhecidas, foram detectadas diversas outras proteínas imunoreactivas novas em frequências que variaram entre 11/17 e 1/17. As características de PM e pi 14 destas proteínas são apresentadas na Tabela II.

Adicionalmente, em alguns casos, foi realizada uma análise mais detalhada por sequenciação N-terminal de aminoácidos suplementada com buscas de homologias em base de dados.

Microsequenciação das Manchas

Foram preparados mapas 2D tal como acima se descreve, começando por 1 mg de proteína EB total por corrida, seguindo-se um blot sobre membranas de difluoreto de polivinilideno (membranas PVDF da BioRad, 20 x 20 cm, dimensão dos poros 0,2 micron), tal como exposto na Referência 20. Os blots foram corados com Azul Brilhante de Coomassie R250 a 0,1% (p/v) em metanol aquoso a 50% durante 5 minutos, sendo então descoradas em 40% metanol, 10% ácido acético. As membranas foram secas a 37°C e armazenadas a -20°C para análise posterior. As manchas de proteína seleccionadas foram cortadas das membranas e submetidas a sequenciação de aminoácidos através de degradação de Edman usando um sequenciador automatizado de proteínas/péptidos (Protein/Peptide Sequencer, mod. 470A, Applied Biosystems Inc.) ligado on-line com um analisador de feniltiohidantoína-aminoácidos modelo 120A e um Módulo de Controlo/Dados medeio 900A (Applied Biosystems Inc.). Tipicamente, foram usadas 3 ou 4 manchas equivalentes de blots similares, de acordo com a quantidade molar relativa estimada para a proteína na mancha.

Os resultados da sequenciação são apresentados na Tabela III da página 16.

Análise de Sequências por Computador

Usando os dados da sequência N-terminal, foram efectuadas buscas em base de dados para detecção de similaridades entre as proteínas, usando o programa BLAST [21] fornecido pela NCBI [http://www.ncbi.nlm.nih.gov] e programas do software GCG 15 (Wisconsin Package Version 9.0) [22]. Os valores teóricos de PM e pi foram calculados usando o programa de computador para pi/PM disponível a partir do servidor de internet ExPASy [http://www.expasy.ch] .

Para além das bases de dados habituais, foi efectuada uma pesquisa entre os dados de sequenciação genómica da estirpe D/UW-3/Cx de C. trachomatis fornecidos pelo Chlamydia Genome Project [http://chlamydia-www.berkeley.edu:4231] . Se bem que o presente estudo tenha usado uma estirpe do serovar L2 de C. trachomatis (biovar do linfogranuloma), que possui um fenotipo de patogenicidade diferente, foi possível estabelecer com segurança a correlação de diversas sequências de proteínas com os genes do serovar D.

Estas buscas usando dados da sequência N-terminal permitiram estabelecer a correlação entre sete manchas imunoreactivas e sequências já conhecidas (para além das sete acima referidas): • Mancha 15: prevista como correspondendo a uma protease periplásmica (actualmente anotada na base de dados genómica do serovar D como htrA) . • Manchas 18 e 46: previstas como correspondendo a uma proteína da membrana externa (actualmente anotada na base de dados genómica como ompB). • Mancha 21: Se bem que a sequência de aminoácidos não corresponda a qualquer das proteínas anteriormente descritas, esta mostra homologia com uma sequência interna de EF-Tu. Esta proteína poderá ser um produto de catálise ou de processamento de EF-Tu, ou uma variante. • Mancha 24: A subunidade alfa da RNA polimerase (rpoA) • Mancha 25: Homóloga de leucina peptidases bacterianas (actualmente anotada na base de dados genómica como pepA) . 16 • Mancha 38: prevista como correspondendo a uma proteína de ligação ao GTP (actualmente anotada como ychF).

As sequências N-terminais das manchas 26, 31 e 33 não correspondem a quaisquer sequências da base de dados, incluindo a sequência publicada para o serovar D. A Tabela IV apresenta um resumo de identificações (algumas presumíveis) de diversos antigénios imunoreactivos, as quais foram obtidas ou por comparação com anteriores dados de mapeamento 2D, ou por buscas de homologia com os dados de sequenciação N-terminal acima obtidos.

Proteínas de Interesse Particular

Revestem-se de particular interesse as seguintes proteínas identificadas a partir dos imunoblots:

Mancha 24

Acredita-se que esta mancha corresponda à cadeia alfa da rna polimerase de C. trachomatis (gi620029), com base na sua posição de PM/pI e na sua sequência N-terminal. Se bem que a cadeia alfa de RNAP tenha já anteriormente sido descrita [23], esta nunca foi relatada como imunogénio de clamídia. Quatro pacientes exibiram reactividade a esta proteína, demonstrando que a proteína é imunogénica no ser humano como consequência de uma infecção por clamídia. Enquanto que a natureza de parasita intracelular da Chlamydia significa que esta consegue geralmente iludir as respostas imunes mediadas por anticorpos, a reactividade por anticorpos acima demonstrada indica que o sistema imunitário se defronta de facto com estas proteínas durante uma infecção natural, e que a formação de anticorpos poderá, por exemplo, ajudar igualmente a desencadear as respostas imunes mediadas por células T. 17

Manchas 18 e 46

As manchas 18 e 46 parecem ser homólogas ao gene ompB do genoma do serotipo D, anotado como codificando para uma presumível proteína de membrana externa. As sequências N-terminais e os valores de pi e PM (pelo menos para a mancha 18 - 5.08/34.09 vs. valores teóricos previstos de 5.06/34.5) são concordantes com as propriedades esperadas para um produto do gene ompB, após o corte do péptido de sinal N-terminal previsto.

Verificou-se igualmente que tanto a mancha 46 como a 18 se encontram presentes num mapa de electroforese 2D de uma preparação purificada de complexo de membrana externa de clamídia, o que apoia igualmente a asserção de que as manchas 18 e 46 representam os homólogos do gene ompB do serotipo D. A razão pela qual esta proteína aparece sob a forma de duas espécies electroforéticas distintas não foi investigada, mas uma divergência de manchas deste tipo encontra-se usualmente associada a uma variação da composição em aminoácidos, que poderá ser devida a uma variação da sequência de aminoácidos e/ou a uma derivatização verdadeira ou artefactual de alguns resíduos de aminoácidos.

Cinco pacientes evidenciaram reactividade a esta proteína, demonstrando que esta é imunogénica em seres humanos em consequência de uma infecção por clamídia.

Mancha 25

Crê-se que esta mancha corresponda a uma aminopeptidase, tomando como base a sua posição de PM/pl e a sua sequência N-terminal (ambas em comparação com a sequência pepA publicada para o serovar D) . Quatro pacientes mostraram reactividade face a esta proteína, demonstrando que esta é imunogénica em seres humanos em consequência de uma infecção por clamídia. 18

Mancha 38

Crê-se que esta mancha corresponda a uma proteína de ligação ao GTP, tomando como base a sua posição de PM/pl e a sua sequência N-terminal (ambas em comparação com a sequência ychF publicada para o serovar D) . Dois pacientes mostraram reactividade face a esta proteína, demonstrando que esta é imunogénica em seres humanos em consequência de uma infecção por clamídia.

Mancha 15

Crê-se que esta mancha corresponda a uma protease induzida por stress, tomando como base a sua posição de PM/pl e a sua sequência N-terminal (ambas em comparação com a sequência htrA publicada para o serovar D) . Sete pacientes mostraram reactividade face a esta proteína, demonstrando que esta é imunogénica em seres humanos em consequência de uma infecção por clamidia.

Mancha 8

Nove pacientes exibiram reactividade face à proteína da mancha 8, a qual não foi possível caracterizar por sequenciação N-terminal. No entanto, esta proteína possui a seguinte composição de aminoácidos em "constelação de tipo 2" (percentagens molares): aa o "0 aa Q. "o aa o "0 aa Q. "o Ala 6.5 Gly 22.5 Lys 3.7 Ser 13.7 Arg 3.5 His 0.5 Met 0.5 Thr 5.1 Asx 8.4 Ile 3.7 Phe 2.8 Tyr 2.2 Glx 12.5 Leu 6.7 Pro 3.4 Vai 4.3 19

Os aminoácidos Cys e Trp não são determinados neste tipo de análise, e não é possível distinguir entre Glu/Gln e Asp/Asn. A incapacidade de obter a sequência N-terminal, apesar das repetidas tentativas efectuadas nesse sentido, sugere que o resíduo N-terminal se encontra bloqueado devido a algum tipo de modificação (p.ex., uma lipoproteína). A modificação é frequentemente uma característica das proteínas associadas a membranas em eucariotas, mas constitui igualmente uma característica das proteínas de membranas externas ou de proteínas secretadas em espécies bacterianas (p.ex. lipoproteínas [24], proteínas da membrana externa de Mycoplasma [25], o factor de virulência FHA de B. pertussis [26], etc.).

Mancha 12

Acredita-se que esta mancha se deve à proteína ribossomal L7/L12. Sete pacientes exibiram reactividade face a esta proteína, demonstrando que esta é imunogénica em seres humanos em consequência de uma infecção por clamídia. Se bem que esta proteína tenha já sido anteriormente descrita em associação a clamídia [n° de acesso P38001], a proteína nunca foi reportada como imunogénio de clamídia. No entanto, esta proteína foi já descrita como imunogénio em infecções por Brucella [27, 28].

Mancha 19

Crê-se que esta mancha se deve à proteína ribossomal Sl. Cinco pacientes exibiram reactividade a esta proteína, demonstrando que esta é imunogénica em seres humanos em consequência de uma infecção por clamídia. Se bem que esta proteína tenha já sido anteriormente descrita em associação a clamídia [n° de acesso P38016], a proteína nunca foi reportada como imunogénio. 20

Mancha 10

Crê-se que esta mancha se deve ao factor de elongação da síntese proteica EF-Tu. Oito pacientes exibiram reactividade face a esta proteína, demonstrando que esta é imunogénica em seres humanos em consequência de uma infecção por clamídia. Se bem que o EF-Tu de clamídia tenha já sido anteriormente descrito [n° de acesso P26622], este nunca foi reportado como imunogénio.

Manchas 10, 12, 15, 19 e 24

Dada a importância, em infecções crónicas, de uma possível sensibilização prévia a antigénios microbianos conservados que possam desencadear reacções imunopatogénicas, é de notar que diversos destes novos antigénios imunoreactivos pertencem a famílias conservadas de proteínas bacterianas: quatro (23%) soros reagiram com a mancha 24 (a subunidade alfa da RNA polimerase); cinco (29%) reconheceram a mancha 19 (proteína ribossomal Sl); oito (47%) reconheceram a mancha 10 (EF-Tu); sete (41%) reconheceram a mancha 15 (presumível protease induzida pelo stress da família HtrA (peptidase S2C)); e sete soros (41%) reconheceram a mancha 12 (a proteína ribossomal L7/L12). No grupo de soros usados neste estudo, 12/17 (70,6%) reagiram com pelo menos um destes cinco antigénios e, incluindo os antigénios hsp60 e hsp70, todos os soros apresentaram anticorpos que reagiram com entre 1 e 7 (média de 3,7) proteínas de clamídia que possuem homólogos em outras bactérias.

As teorias que postulam o envolvimento dos mecanismos de sensibilização imunológica na patologia por clamídia, tal como descrito para o antigénio "GroEL-like" hsp60 [29], deveriam na verdade ser alargadas a diversos outros antigénios bacterianos comuns, que poderão mostrar-se imunogénicos em outras 21 infecções bacterianas. Por exemplo, o factor de elongação de proteínas EF-Tu é imunogénico durante a fase aguda da infecção por Haemophilus influenzae, e ambos os homólogos de L7/L12 e de protease HtrA induzida por stress são imunogénicos em infecções por Brucella. No caso do EF-Tu, a abundância desta proteína na célula bacteriana poderá favorecer a sua "visibilidade" face ao sistema imunológico. Deverá ter-se em conta, no entanto, que o EF-Tu tem sido descrito como estando associado às fracções celulares da membrana externa e do espaço periplásmico [30], e que os dados mais recentes sugerem que o EF-Tu, para além da sua função na elongação de péptidos, possui igualmente uma actividade acompanhante implicada na dobragem das proteínas e na protecção contra o stress [31] . Particularmente intrigante é a resposta à proteína ribossomal L7/L12, uma vez que nas infecções por Brucella melitensis o antigénio L7/L12 homólogo induz uma resposta mediada por células DTH [27] . Adicionalmente, verificou-se que a vacinação de ratinhos BALB/c com L7/L12 conferia protecção contra a infecção por B. abortus [32] . A descoberta inesperada de que a presença de anticorpos contra L7/L12 era bastante frequente em pacientes infectados com C. trachomatis sugere que talvez se deva dedicar mais atenção também a estes antigénios ao estudar os estados de doença induzidos por clamídia.

Manchas 5, 6, 7 e 9

Estas proteínas, se bem que não tenham ainda sido sequenciadas nem correlacionadas com qualquer sequência de genoma disponível, revestem-se de óbvio interesse dada a sua prevalência (>50%) nos soros testados.

Tabela I - SDMÁRIO DOS SOROS DAS PACIENTES

As letras na primeira coluna correspondem às apresentadas na Tabela II. Os códigos na segunda coluna referem-se à 22 colecção original de soros. A patologia associada a cada paciente é genericamente indicada como cervicite (infecção do tracto genital inferior), DIP ou esterilidade (secundária a infecção) . Todos os soros foram caracterizados através de ensaios por MIF usando corpos elementares L2 purificados. 0 titulo por MIF apresentado na tabela corresponde à maior diluição x 2 que forneceu um sinal positivo. A "Melhor Diluição" corresponde à diluição que proporcionou um efeito de fundo mais baixo sem que se verificasse perda de sinal nas manchas mais fracas. ID do Soro na Tabela II ID Original do Soro Patologia Titulo por MIF Melhor Diluição A JQ45/7931 BB cervicite 256 1:5006 B j028/7935 BB cervicite 16 1:1500 C J029/7936 BB cervicite 16 1:2000 D J051/7997 BB cervicite 256 1:5000 E hs-C (Bolognâ) D.I.P 256 1:5000 F 14293 BB D.i.P 1024 1:10000 G hs-B (Bologna) D.I.P 32 1:2000 R J06/7942BB D.I.P 256 1:5000 1 J017/7953 BB D.I.P 256 1:5000 J JD43/7989 D.I.P 256 1:5000 K J02Q-/7956 BB D.I.P 256 1:5000 L J042/7988 BB D.I.P 256 1:5000 M JD41/7987BB D.I.P 256 1:5000 N J031/7977 BB D.I.P 256 1:5000 0 13839 BB D.I.P 256 1:5000 P J035/7934 BB esterilidade 64 1:2500 Q J052/7933 BB esterilidade 64 1:2500 23 TABELA II - Reactividade das pacientes com as manchas de proteínas FREQ N LO co T~ - O T-*. O σ> CD CO CO CD N N N N CD LO 10·· LO LO 10 sf α + t + 4 + 4 + 4 4 + 4 + 4 + + 4 + CL 4 4 4 4 + 4- 4 + + -1- -I- 4 + 4 4 0 4 4 + + + + z + + 4 4 + + 4 + + + + s 4 + _J 4 + + 4 X. + 4 + 4 + + + 4 + 4 4 + 4 4 + 4 4 4 4 ”3 4 4 4 + + + 4 + + + 4 _ + + + '4 + 4 4 + + 4 + + 4 I 4 4 o + 4 + + LL + 4 + + + 4 + + + + 4 4 + + 4- + LU 4 + 4 + + +· 4 + 4- 1" + 4 4 -4- + 4 + + Q + + + + + 4 + + + + + 4 O 4 4 4 4 + + 4 4 4 4 4 + 4 + m + 4 '+ + + 4 4 + 4 4 4 + + + 4 < + 4 + + 4 4 + + + 4 4 4 4 + 4 4 4 Έ 0. complexo 59.7 40 70.5 36.6 46.2-50 46.2-50.2 CD co" CO -4 03 co N- r-· co 42.2 26.1 15.8 37.4-39.2 47.9 48.4 46-50 25.3 34.09 69 26.2 40.5 46.3 34.2 40.5 47.6 Q, fO LO CM IO 4.6-4.9 4.92-5.04 60 S 6.34 6.59 4,96 6.36 5.44-5.64 6.66 4.80 (D 6.24 5.89 6.15 5.92 5.08 5.14-5.28 5.44 5.27 4.81 4.97 5.32 5.97 tt «3 £ V c (Ç s - CM CO xr LO CD. IN co: .03 O CM CO v 4 T" MO CD h- co T* 0> 20 CM CM CM 23 24 25 24 (continuação)

FREQ tf- tf" co CO CO co co CM 'CM CM CM CM CM CM CM T“ τ~ - - V” - - τ~ Τ’ 0 X +' + + + + + + + Q. + + + O z + + + Έ _J + x + + + + + + T X + + _ + + + X o LL + + + Ui + + + + + + + Q + + + + O + + CO + + < + + + m Cl 48. Θ 1.24:5 25.5 28.7 κ cd co 40.4 tf CM <0 25.4 28.1 29 5 37.5 40.3 40.1 45.7 os 105 20.3 26.5 26.95 29.7 33.4 35.8 35.8 39.0 41.0 Q. 5.68 6.29-6.42 & ID LO 4.8 5.43 r*- co td l CM d 5 cd 4.79: 4.82 6.55: tf d 5.23 4.69 6.89 6.39-6.55 4.57 4.72 9 Z 6.9 5:19- σ> cu cd 6.54 5.44: 5.37 Mancha # 26: 27 28 29 O o CO 32 33 34 35 36 37 38 0) co 40 'tf 42 43 44 45 co tf* 47 48 49 OS 25

FREQ - - - T” 0 Ú, o Z + e is: + + + “5 _ X a LL LU + Q ϋ + m < £ £L 42.6 49.2 49.4; 50.2 51.5 ã. 7.59 8.73 7,98 7.4 * e £ o f" 5 E η- LO <N 1X3 co LO LO lO LO 26

TABELA 111 - SEQUÊNCIAS N-TERMINAIS DAS PROTEÍNAS

Mancha # Sequência N-terminal 10 SKETFQRNK 12 TTESLETLVE 15 LAVSSGDQEVSQEDLLKE 18 XPAGNPAFRVIP 21 AKTRTLKGDG 24 SDSSHNLLYNK 25 VLLYSQASWDQRSKADAL 26 KAVYVGD(A/Q)E(V/D)Q 31 KDxxTNGQR 33 MSKGGQ:txD(Y/G) 38 XQXENGIVGL 46 MPAGNPAFPVIP

TABELA IV - IDENTIFICAÇÃO DOS ANTIGÉNIOS "Gene CT-D" refere-se ao nome do gene na Referência 2 e fornece os nomes dos genes que mais provavelmente codificarão para proteínas homologas em C. rrachomafc D. Os valores teóricos de pllPM ná última coluna, para comparação com os valores experimentais, foram calculados a partir das sequências do gene GT-D. Mancha Localização no mapa Sequência N-terminal de AA Anotação Gene GT-D Previsto pl/PM 1 çluster de GMP2 OMP2 omcB 7.65-7.92/54.5-58,7 2 5,2-5,3/59.7 VA:(D/KJNI(Kj'F)YNEE GroEL-like groEL 1 5.11/58.1 3 4,6-4.9/40 LPVGN MOMP ompA 4.69/40:3 4 4.92-5.04/70.5 SE KRk(S/A) N (K/S).... DnáK-likè dnaK 4.88/70.7 10 5.44-5.64/42.2 SKETFQRNK EF-T u tufA 5.36/43.1 12 4,80/15.8 TTESLETLVE Proteína ribossomal L7/12 r!7 5.09/13,5 15 5.89/48.4 LAVSSGDQEVSQEDLLKE Protease induzida por stress htrA 5.83/49.5 18 508/34.09 XPAGNPAFPVIP Proteína da membrana externa ompB 5.06/345 19 5.14-5.28/69 Não determinado Proteína ribossomal Si rsl 5.17/63,6 21 5.27/40.5 AKTRTLKGDG Péptido relacionado com EF-Tu? - 24 5.32/40.5 SDSSHNLLYNK Cadeia aita de RNAP rpoA 5.34/41.7 25 5.97/47.6 VLLYSQASWDQRSKADAL Aminopeptidase pepA 5.74/54.0 26 5.68/48.6 KAVY VQ D (A/Q) E( V/D) Q Não determinado - - 31 5.43/40.4 KDxxTNGQR Não determinado - - 33 6.64/25.4 MSKGGQtxD(Y/G) Não determinado - - 27 (continuação) "Gene CT-D” refere-sé ao nome do gene na Referência 2 e fornece os nomes dos genes que mais provavelmente codificarão para proteínas homólogas: :em C. tfàchomãtis D. Os valoras teóricos de pl/PM na Ultima coluna, para comparação com os valores experimentais, foram calculados a partir das sequências do gene CT-D, Mancha Lix-alização lio mapa Sequência N-termina! de AA Anotação Gene CT-D Previsto pl/PM 38 5.23/40.1 XQXENGÍVGL Proteína de ligação ao GTP yCPF 5.16/39.5 46 5,19/33,4 MRAGNPÁFPVIP Proteína da membrana externa ompB, 5.06/34.5

REFERENCIAS I Raulstón (4995) Chlamydial envelope compònents and pathògeh-host eél| iriteractions. Mói Micróbiol 15(4): 607-6'6 2Stephensetal.(1998)Gén:omeSequenceofánObligaitelntraceiluiafPathògénofHumans:GhlaraydÍatrachprriatis. Science 282:754-759. 3 Ward (1995) The immunobiology and imiriunopatholagy of chlamydial infections. Apmis. 103:769-96. 4 Moulder (1991) Interaction of Ghlamydiae and host cells in vitro. Microbiol Rev 55(1):143-190. 5Comanduccietal.(1994) Húmoral immune response to plasmid protein pgpSinpatientswithChlarnydia.lrachomatis i nfèction. Infect I mmun '62(12): 5491 -5497. 6 EP-A,0499681 7WQ95/28487 8 Murdin ètal. (1993) InfèctIramun 61:44064414 9 Cerrcre etal. (1991) Coning and sequence Of the gene for heat shock protein 60 from Chlamydia trachomatis and immunological reactivity df the protein. Infectlmmun 59(1)::79-90. 10 Raulstón etal. (4993): Molecular characterization and avter membrane association of a Chlamydia trachomatis protein related to the hspTti fàmily.of proteins. J. Biol. Chem. 268:23139-23147. II Wang & Grayston(1970) mmunologic relationship betwsen genital TRIC, lymphogranuloma venereum, and related organísms in a new mcrotiter índirectimmunofiuorescencetest. Am. J. Ophthalmol. 70:367-374 12 Bini ét âl, (1996) Mapping òf Chlamydia trachomatis proteins by immobiline-polyacrylamide two-dirnerisional electrophoresis: spot Identification by N-terminal sequencíng and immunoblotting. Electrophoresis 17:185-190. 13 Schacter & Wyrick (1994) Culture and isplation of Chlamydia trachomatis. Meth Enzymol 236:377-390 14 Gòrg et al. (1988) The current state of two-dimensiona! electrophoresis with imnxibilized pi I gradients. Electrophoresis 9:531-546 15 Hochstrasser etal (1988):Méthõdsfor irTcreasingtheresoliifion oftwo-dimensional protein electrbphorésis. Anal. B.ochem. 173 424-435. 16 Oakley et al. (1980) A sjmplifted ultrasensitive siiyer stain for detecting proteins in polyacrylamide geis. Anál. Biochem. 105:361-363. 17 Bjellqvístet al. (1993) A noníinear wide-range immobUized pH gradieritfortwo dimensional electrophoresis and its definition In a relevant pH scaie. Eiectròphoresls 14:1357-1365 18 Towbin ét al (1979) Electrophoretio transter of proteins from polyacrylamide géis fo nitroceilulose sheets pro-cédure and some applications Proc Nâtl Aead Sei USA 76 4350-4354 19 Magi etal Chapter entitled "Immunoattimty Identification of 2-DE separated proteins" in Methods jn Molecular Biology. 2-D Proteome analysis protocois. AJ Link (éd), Humana Press, Totowa, NJ, USA. 20 Matsudaira (1987) Sequence from picomole quantities of proteins eiectroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes. d Biol Chem 262:10035-10038. 21 Altschuletal. (1990) Basic local alignmentsearçhtool. J Mol Biol 215:403-410. 22 Devereux etal. (1984) A comprehensive set ot sequence analysis programs for the VAX. Nucleic Acids Res 12: 387-395. 23 Gu et al (1995) Chlamydia trachomatis RNA polymérase àlpha subunit: sequence and stmctufâl analysis J Bacteriol 177:2594-2601 24 Nystrsm et al. (1992) Membrane protein acylation. Preference for exogenous myrislic acid of endogenous sat- 28 urated chains in Acholeplasma laidlawii Eur J Brochem 204:231-40 25 Jan et al. (1995) Acylation and immunoiogical properties of Mycoplasma gallisepticum membrane proteins. Res Microbiol 146:739-50 26 Lambert-Buisine et al. (1998) N-íermina! characterization of the Bordetella pertussisfilamentous haemagglutinin. MolMiçrobiol 28:1283-93 27 Bachraçh ét al. (1994) Brucella ribasomal protein L7/L12 is a major component in the ahtigánícity qf bruçellin INRA fer deíayed-type hypersensitivity in Bruçella-sensitized guinea pigs. Infect. Immun. 62:5361-5366 28 Roop et al. (1994) Identification oí an immunoreactive Brucella abortus HtrA stress response protein homolog Infect.I mmun 62:1000-1007 29 Morrisonetal. (1989) Chlamydia! disease pathcgenesis: the 57-kD chlamydial hypersensitivity antigen is a stress response protein J Exp.Med. 170:1271 1283. Similarly: Morrison et al, (1989) Chlamydial disease pathogenesis: ocular hypersensitivity elidted by a genus-specific 57-kD protein >1Γxp Med 169 663-675 30 Marques et al. (1998) Mapping and Identification of the Major Cell Wall Associated Components of Mycobaderium leprae Infect Immun. 66:2625-2631. 31; Caidas et ai (1998) Chapèrone properties of bactériaI elongation factor EF-Tu. J Biol. Chem. 273:11478-82 32 Qliveira & Splitter (1996) Immunization of mice with recombinant L//L12 ribosomal protein confers protection against Brucella abortus infection. Vaecine 14:959-62

Lisboa, 28 de Novembro de 2007 29

Claims (6)

1. REIVINDICAÇÕES 1- Uma proteína de C. trachomatis, caracterizada por possuir a sequência apresentada com o número de acesso P38001 e possuindo um PM de 15,8 kDa e um pi de 4,80, para uso como medicamento.
2. 2- Um anticorpo que se liga à proteína, de acordo com a Reivindicação N°.l, caracterizado por se destinar ao uso como medicamento.
3. 3- Ácido nucleico codificando para a proteína, de acordo com a Reivindicação N°.l, caracterizado por se destinar ao uso como medicamento.
4. 4- O uso de uma proteína, de acordo com a Reivindicação N°.l, um anticorpo, de acordo com a Reivindicação N°.2, e/ou ácido nucleico, de acordo com a Reivindicação N°.3, caracterizada por ser aplicado no fabrico de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma infecção devida a Chlamydia.
5. 5- O uso de uma proteína, de acordo com a Reivindicação N°.l, um anticorpo, de acordo com a Reivindicação N°.2, e/ou ácido nucleico, de acordo com a Reivindicação N°.3, caracterizado por ser aplicado no fabrico de um reagente para diagnóstico destinado à detecção da presença de Chlamydia ou de anticorpos produzidos contra Chlamydia.
6. 6- O uso de uma proteína, de acordo com a Reivindicação N°.l, um anticorpo, de acordo com a Reivindicação N°.2, e/ou ácido nucleico de acordo com a Reivindicação N°.3, caracterizado por ser aplicado no fabrico de um reagente com a capacidade de estimular a produção de anticorpos contra Chlamydia. Lisboa,28 de Novembro de 2007 1