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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein transdermales Zufuhrsystem, das
einen aktiven Bestandteil enthält,
der aus der Gruppe ausgewählt
wird, welche aus Peptiden, Proteinen und Mischungen derselben besteht. Insbesondere
betrifft die vorliegende Erfindung Systeme und Zusammensetzungen,
welche pharmazeutisch verträglich
sind, und leicht anzuwendende topische Systeme, die einen wirksamen
Bestandteil enthalten, der aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus Peptiden,
Proteinen und Mischungen derselben besteht. Diese Systeme enthalten
darüber
hinaus Bestandteile, welche bei der Stabilisierung des wirksamen
Materials helfen, zum Beispiel indem sie die Inaktivierung desselben
verhindern, und indem sie die Penetration als aktive Moleküle durch
die Hautschichten unterstützen.
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Es
wurde in der vorliegenden Erfindung entdeckt, dass oxidierende Mittel,
wie zum Beispiel Iod, Kaliumpermanganat, Peroxide und Silberprotein
die Anwendungen von Formulierungen, welche Proteine und Peptide
und insbesondere Insulin enthalten, auf der Haut ermöglichen.
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Hintergrund des Standes
der Technik
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Insulin
wird aus den β-Zellen
der Langerhans'schen
Inseln der Bauchspeicheldrüse
in seiner aktiven Form sezerniert. Das menschliche Insulin ist aus
zwei Polypeptiden zusammengesetzt, der A- und B-Kette, mit 21 bzw.
30 Aminosäure-Resten
und einem Molekulargewicht von etwa 5.800 Da. Die Peptide sind gegenseitig über Disulfid-Brücken der
Cysteinreste bei A7–B7,
A20–B19
und A6–A11
verknüpft.
Insulin übt
eine große
Vielzahl biologi scher Wirkungen aus, einschließlich der Kontrolle der Aufnahme,
der Verwendung und der Speicherung zellulärer Nährstoffe, wie zum Beispiel
Glukose, Aminosäuren
und Fettsäuren.
Die wichtigen Zielgewebe des Insulins sind die Leber, der Muskel
und das Fett, jedoch werden viele andere Zelltypen ebenso durch dieses
Hormon beeinflusst [Davis, SN; Granner, DK (1996) In: Goodman & Gilman's, The Pharmacological
Basis of Therapeutics, 9. Auflage (Hrsg.: Hardman, JG et al.) McGraw-Hill,
1487–1517].
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WO
90/00899 offenbart eine Zusammensetzung und ein Verfahren zur Behandlung
von Hautkrankheiten zur Förderung
der Wundheilung. Diese Zusammensetzungen enthalten einen aktivierten
Proteinbestandteil, ein damit verträgliches Reduktionsmittel, ein
Oxidationsmittel, und einen Bestandteil, der aus der Gruppe ausgewählt wird,
die aus Wasser, Säuren,
Basen, Puffermitteln, Emulgationsmitteln, Verdickungsmitteln, Lösungsmitteln,
Konservierungsmitteln, Färbemitteln
und Duftstoffen besteht. Diese therapeutischen Zusammensetzungen
sind besonders wirksam bei der Förderung
der Wundheilung, und bei der Inhibition bestimmter Hautkrankheiten,
einschließlich
des Ekzems und der Seborrhö,
Sklerodermie und Akne.
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Diabetes und Insulin:
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Eine
der physiologischen Hauptfunktionen des Insulins ist die Stimulation
des Glukosetransports in das Muskel- und Fettgewebe. Eine Störung in
diesem System führt
zum Syndrom des Diabetes mellitus, der durch Hyperglykämie, Veränderungen
im Stoffwechsel der Kohlenhydrate, Lipide und Proteine, und durch
ein erhöhtes
Auftreten von Gefäßkrankheiten
gekennzeichnet ist. Es gibt zwei Hauptarten der Zuckerkrankheit, den
Insulin-abhängigen
Diabetes mellitus (IDDM) mit einem Auftreten von 1–43 auf
100.000 Einwohner in den westlichen Ländern, und dem nicht Insulin-abhängigen Diabetes
mel litus (NIDDM), dessen Auftreten zwischen 100–800 auf 100.000 Einwohner
in den westlichen Ländern
liegt (siehe die obige Bezugnahme).
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Insulin
ist die Hauptbehandlung aller IDDM- und vieler NIDDM-Patienten. Die Langzeit-Behandlung beruht überwiegend
auf der subkutanen Verabreichung von Insulin-Formulierungen. Es
gibt Zubereitungen mit einer langen, kurzen und mittelmäßigen Wirkungsdauer,
welche den besonderen Erfordernissen des Patienten entsprechend
verwendet werden. Abgesehen von dem Unbehagen und dem unangenehmen
Gefühl
und der Möglichkeit
einer Infektion, die mit den täglichen
Injektionen während
des gesamten Lebens einhergeht (insbesondere bei IDDM, früher genannt
juveniler Diabetes mellitus) bringt diese Art der Therapie jedoch
ernsthafte klinische Probleme mit sich, hauptsächlich mit der Aufrechterhaltung
von geeigneten Blutwerten des Hormons, die zu nicht-physiologischen
Blutglukosewerten und anderen Komplikationen führen. Obwohl große Anstrengungen
bei der Entwicklung von Insulin-Analoga [Brange, J; et al. (1990)
Diabetes 13, 923–954]
und bei rekombinanten DNA-Technologien [Sutherland, DER et al. (1989)
Diabetes 38, Suppl. 1, 46–54]
unternommen wurden, gibt es keine erfolgreiche Entdeckung zur Lösung der
klinschen Probleme, die mit parenteralen Insulin-Injektionen einhergehen.
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Eine
der Vorgehensweisen, die darauf gerichtet waren, mit den vorstehend
erwähnten
Schwierigkeiten fertig zu werden, bestand darin, das Hormon über einen
transdermalen Verabreichungsweg nicht invasiv zuzuführen. Durch
dieses Verfahren können
die Belästigung
und die Unannehmlichkeit der parenteralen Injektionen vermieden
werden, und darüber
hinaus können
viel gleichmäßigere Bluthormonwerte
aufgrund der verlängerten
Zufuhr des Arzneimittels erreicht werden. Einige Arzneimittel von
niederem Molekulargewicht sind formuliert worden und werden klinisch
als transdermale Zubereitungen verwendet. Abgesehen von wenigen Arzneimitteln
wurden viele Wirkstoffe, insbesondere Peptide und Proteine, jedoch
nicht erfolgreich für
die transdermale Zufuhr formuliert. In vitro Experimente haben gezeigt,
dass das Hormon zur Stimulation von α-Melanocyten in analoger Weise
durch die Haut von Menschen und Mäusen penetrieren kann, nicht
jedoch durch die Haut von Ratten [Dawson, BV et al. (1990) J. Invest.
Dermatol. 94, 432–435;
Dawson, BV et al. (1988) Life Sci. 43, 1111–1117], und dass Enkephalin
die haarlose Mäusehaut
penetrieren kann, jedoch in Gegenwart des Verstärkers n-Decylmethylsulfoxid
und von Proteinase-Inhibitoren [Choi, HK et al. (1990) Pharm. Res.
7, 1099–1106].
Abgesehen von einer Studie mit einer geringen Zahl von Mäusen, welche
reduzierte Werte von Blutglukose nach 4 Wochen cutaner Anwendung
von Insulin mit einem Verstärker
zeigte [Liedtke, RK et al. (1990) Drug Res. 40, 880–883], wurde
keine effiziente transdermale Penetration in vivo der Peptide und Proteine
durch chemische Mittel (beispielsweise Verstärker oder Proteinase-Inhibitoren)
veröffentlicht.
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Die
transdermale Penetration verschiedener Peptide und Proteine kann
durch Iontophorese unter Verwendung von elektrischem Strom für die Zufuhr
geladener Mittel durch die Haut verstärkt werden. Zahlreiche Peptide
und kleine Proteine, einschließlich
Insulin, Calcitonin, Vasopressin, Gelbkörper-Hormon-Freisetzungs-Hormon
(luteinizing hormone-releasing hormon, LHRH), Leuprolid, Thyrotropin-Freisetzungs-Hormon (thyrotropin
releasing hormon, TRH), und Cholecystokinin, wurden in Iontophorese-Assays
in vitro getestet, und manche von ihnen auch in in vivo Systemen
[Heit, MC et al. (1993) J. Pharm. Sci. 82 (3), 240–243; Srinivasan,
V et al. (1990) J. Pharm. Sci. 79, 588–591; Burnette, RR & Marrero, D (1986)
J. Pharm. Sci. 75, 738–743;
Banga, AK & Chien,
YW (1993) Pharm. Res. 10, 697–702;
Mao, XM et al. (1995) Yao. Hsueh. Hsueh. Pao. 30, 302–306; Mao,
XM et al. (1995) Yao. Hsueh. Hsueh. Pao. 30, 881–885; Meyer, BR et al. (1989)
Am. J. Med. Sci. 297, 321–325].
Zusätzliche
Technologien zur Erleichterung der transdermalen Zufuhr von Insulin durch
Ultraschallschwingung, genannt Sonophorese, wurden sowohl bei in
vitro als auch bei in vivo Systemen verwendet [Tachibana, K & Tachibana, S
(1991) J. Pharm. Pharmacol. 43, 270–271; Tachibana, K (1992) Pharm.
Res. 9, 952–954;
Mitragotri, S et al. (1995) Science 269 (5225), 850–853]. Obwohl
die transdermale Penetration des Insulins und anderer Proteine und
Peptide durch sonophoretische und iontophoretische Technologien
verstärkt
wurde, erfordern diese Verfahren eine komplizierte und unbehagliche
Durchführung.
Darüber
hinaus wurde die Sicherheit der täglichen Verwendung dieser Technologien über einen
langen Zeitraum nicht bestätigt.
Die Tatsache, dass lediglich ein Bericht, welcher ungenügende Ergebnisse
bei der Verwendung von Penetrationsverstärkern bei Diabetes-Patienten
vom Typ II beschreibt [Liedtke, RK et al. (1990) Drug Res. 40, 884–886], veröffentlicht
wurde, weist auf die problematischen Punkte der vorstehenden Verfahren
hin.
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Offenbarung
der Erfindung
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Entsprechend
der vorliegenden Erfindung wird nunmehr ein transdermales Zufuhrsystem
bereitgestellt, das einen wirksamen Bestandteil umfasst, welcher
aus der Gruppe ausgewählt
wird, die aus Peptiden, Proteinen mit einer S-S-Bindung und Mischungen
derselben und einem pharmazeutisch verträglichen Oxidationsmittel besteht,
wobei das Oxidationsmittel die Penetration des wirksamen Bestandteils
durch die Hautschichten und in den Blutstrom ermöglicht und erleichtert, wobei
kein Reduktionsmittel anwesend ist.
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Wie
nachfolgend diskutiert werden wird, glaubt man, dass dieses Oxidationsmittel
dazu dient, reduziertes Glutathion zu oxidieren, um dadurch seine
Funktion als Inaktivierungsmittel zu verhindern.
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Wenn
man annimmt, dass diese Hypothese korrekt ist, dann kann auch ein
Bestandteil, wie zum Beispiel Buthioninsulfoximin, welches ebenso
die Bildung von Glutathion verhindert, in der vorliegenden Erfindung allein
oder in Kombination mit einem Oxidationsmittel verwendet werden,
um die gewünschte
Wirkung zu erzielen.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung ist der wirksame Bestandteil Insulin.
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Eine
erste Reihe von Experimenten unter Verwendung von Franz-Zellen in vitro zeigte,
dass Insulin die Haut von einigen Spezies, einschließlich der
Ratte, der haarlosen Maus und des Menschen, penetriert. In einem
parallelen in vivo System, welches einen Insulin-enthaltenden Behälter auf
der abdominalen Haut der Ratte verwendet, wurde jedoch keine Reduktion
der Blutglukosewerte beobachtet. Dieser Zwiespalt in vivo/in vitro
kann mit der Fähigkeit
des reduzierten Glutathions (GSH) (und anderer zellulärer SH-Gruppen)
in Zusammenhang gebracht werden, Insulin durch Reduktion seiner
Disulfidbindung(en) zu inaktivieren [Rafter, GW (1990) Biochem.
Int. 20, 817–820],
gefolgt von einer Aggregation einiger Peptidmoleküle über eine
zufällige Erzeugung
von Disulfidbindungen in dem in vivo System. Nachdem die Haut ausgeschnitten
wurde, kann das in vitro System jedoch an einer zellulären Energieabreicherung
leiden, das heißt
an reduzierten Werten von NADPH. Dies ist ein Schlüssel-Cofaktor
für die
Aktivität
der Glutathionreduktase, welche oxidiertes Glutathion (GSSG) zu
aktivem, reduziertem Glutathion (GSH) umsetzt. NADPH-Abreicherung
reduziert die Werte des GSH, und infolge dessen kann Insulin nicht
durch Hautzellen inaktiviert werden, so dass es zu seiner Penetration
in das Blutkreislaufsystem kommt.
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Die
Bestätigung
dieser Hypothese wurde aus der Tatsache erhalten, dass die Zugabe
einer Energiequelle, wie zum Beispiel Glukose, zu dem Medium der
Franz-Zellen in vitro zu einer reduzierten Penetration des Insulins
führte.
Die gegenteilige Situation trat jedoch in dem in vivo System auf,
das heißt,
die Wirkung hoher Werte von GSH (und anderer SH-Gruppen) konnte
durch eine topische Vorbehandlung der Haut mit Oxidationsmitteln
(wie zum Beispiel Povidon-Iod und Silberprotein) überwunden
werden, so dass es zu einer Oxidation des zellulären GSH (und anderer R-SH-Gruppen)
kommt, um das inaktive GSSG (und/oder R-SS-R) zu bilden. Reduzierte
Werte des ersteren verhindern die Inaktivierung des Insulins, und
ermöglichen
die Penetration des Hormons über
die Haut in den Blutstrom und die Reduktion der Blutglukosewerte.
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Alle
getesteten Oxidationsmittel führten
zu einer zeitabhängigen
Reduktion in den Blutglukosewerten, während Ratten ohne solche Vorbehandlung
oder Behandlung nicht imstande waren, dieses Phänomen zu zeigen.
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Povidon-Iod
(PI) (Polyvinylpyrrolidon-Iod-Komplex)-Salbe ist als ein antiseptisches
Mittel weit verbreitet. Die erfolgreiche Kombination von Sicherheit
und fehlender Reizung, zusammen mit einem effizienten antiseptischen
Mittel wurde bereits 40 Jahre früher
gezeigt [Shelanski, HA & Shelanski,
MV (1956) J. Int. Coll. Surg. 25, 727–734]. Die Tatsache, dass PI
gewöhnlicherweise
in Krankenhäusern,
Kliniken und für
die Anwendung zuhause verwendet wird, ist eine weitere Bestätigung für seine vorteilhaften
Eigenschaften. Andere Oxidationsmittel, wie zum Beispiel Silberprotein
(mild oder stark) und Permanganate wurden seit vielen Jahren verwendet
und können
ebenso in den Zusammensetzungen dieser Erfindung verwendet werden.
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In
der Praxis dieser Erfindung werden topische Proteine, wie zum Beispiel
Insulin, in therapeutisch wirksamen Dosen in pharmazeutisch verträgliche Träger eingearbeitet,
wie zum Beispiel Gele, Salben, Lösungen,
Pasten, Puder und Heftpflaster. Die erhaltenen Formulierungen werden
je nach Anzahl der benötigten
Anwendungen auf die Haut von Patienten aufgetragen, vorzugsweise
einmal am Tag. Die neuen Träger
enthalten Insulin oder andere Proteinarzneimittel, die nicht in
vivo in der lebenden Haut stabil sind, und somit ein Schutzmittel
gegen die Biotransformation in der Haut benötigen, ehe sie den systemischen
Blutkreislauf erreichen. Die vorliegende Erfindung ist eine Herausforderung
für den
Stand der Technik, welcher die Haut als eine physikalische Barriere
für Proteine,
wie zum Beispiel Insulin, ansieht. Es wurde klar bewiesen, dass
das 5.807 Da schwere menschliche Insulin quantitativ eine ausgeschnittene
Haut in vitro und in vivo penetriert, jedoch wird es durch den in
vivo Transport inaktiviert. Diese Inaktivierung kann durch Verwendung
von Oxidationsmitteln, wie zum Beispiel Povidon-Iod oder Silberprotein,
vermindert werden. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass diese
milden Oxidationsmittel zu einer Herabsetzung der Hautwerte von
Glutathion und anderen Reduktionsmitteln führen, und somit die Inaktivierung
des Insulins verhindern, welche durch Dimerisierung, Aggregation, Spaltung
in zwei gesonderte Ketten, Spaltung einer S-S-Bindung, und dergleichen verursacht
wird.
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Die
Erfindung ist zum Teil von der Entdeckung abgeleitet, dass die Zufuhr
von topisch angewendeten Proteinarzneimitteln in den Blutkreislauf
nur möglich
ist, falls Oxidationsmittel vor oder während der Anwendung beteiligt
sind.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine transdermale Zufuhr von Peptid/Protein-Arzneimitteln
und insbesondere solche mit einer S-S-Bindung. Die bevorzugten Zusammensetzungen
umfassen sichere und wirksame Mengen von: (a) einem therapeutischen
Protein/Peptid, (b) einem Oxidationsmittel, wie zum Beispiel Iod oder
Silberprotein oder Kombinationen solcher Oxidationsmittel, (c) ein
geeignetes Vehikelsystem, welches Hautpenetrationsverstärker enthalten
kann, die aus jenen ausgewählt
werden, die im Stand der Technik bekannt sind (siehe zum Beispiel
Chien Y. W. (1987) Transdermal Controlled Systemic Medication, Marcel & Decker, 83–90).
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Wirksame
Mengen von Proteinarzneimitteln werden durch die neuen Zusammensetzungen
zugeführt. Eine „wirksame" Menge bezeichnet
eine Konzentration eines Arzneimittels, die hoch genug ist, damit
sie bei der Behandlung der Krankheit wirksam ist, für die das
Arzneimittel zur Behandlung vorgesehen ist. Beispiele für Proteinarzneimittel
sind: Insulin, α-, β- und γ-Interferon, human
growth hormon, α-
und β-1
transforming growth factor, granulocyte colony stimulating factor
(G-CSF), granulocyte macrophage colony stimulating factor (G-MCSF),
Parathyroid Hormon (PTH), Calcitonin aus Mensch oder Lachs, Glucagon,
Somatostatin, vasoactive intestinal peptide (VIP) und LHRH-Analoga.
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Zusätzlich zu
der bevorzugten Verwendung von Iod und Silberprotein können andere
Oxidationsmittel allein oder in Kombinationen verwendet werden.
Zum Beispiel können
Kaliumpermanganat, Wasserstoffperoxid, Benzoylperoxid, Harnstoffperoxid,
Eisen-III und Kupfer-II-Salze, aktiver Sauerstoff und Natrium peroxyborat
entsprechend ihrer Wirksamkeit beim Schutz und bei der Zufuhr der
Peptidarzneimittel durch die Haut ausgewählt werden. Wie vorstehend
erwähnt
werden Povidon-Iod und Silberprotein bevorzugt als sichere und wirksame „Hautprotein-Stabilisatoren" in einem Verfahren
zur Vorbehandlung oder in einer Zusammensetzung für die Behandlung
bei Konzentrationen von 0,01 % bis 80 % ausgewählt.
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Die
therapeutischen Proteine und ihre Schutzmittel/Stabilisatoren in
vivo können
als eine topische Formulierung, wie zum Beispiel als Creme (Öl/Wasser
oder Wasser/Öl),
Salbe, filmbildende Flüssigkeit,
Spray oder Gel verwendet werden, unter Verwendung eines verschließenden oder
nicht-verschliessenden Verbands. Eine Zusammensetzung in einem geeigneten
polymeren Pflaster ist als transdermale Proteinzufuhr bevorzugt, und
sie besteht aus verträglichen,
haftenden Polymeren, die im Stand der Technik bekannt sind. Das
Polymer kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Acrylpolymeren,
Cellulosepolymeren, Polyurethanen, Polymilchsäure/Polyglykolsäuren, Polyaminosäuren, Polysacchariden,
Polyharnstoff, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon (Povidon) und
natürlichen
Proteinen besteht.
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Ein
transdermales Pflaster kann aus mehreren Schichten bestehen. Auf
der Innenseite wird eine abziehbare Plastikfolie die Arzneimittelschicht
schützen,
welche das haftende Polymer, den Weichmacher, die Oxidationsmittel,
die Penetrationsverstärker
und andere Trägerstoffe
enthält.
Die äußeren Schichten
(das heißt
die externen Schichten) sind so gestaltet, dass sie das Arzneimittel
vor der Diffusion nach außen
schützen
und das Pflaster durch ihre Ränder
auf der Haut befestigen, so dass die Arzneimittelschicht von allen
Seiten abgeschlossen ist, mit Ausnahme der Hautseite, wo sie in
engem Kontakt steht (siehe zum Beispiel Chien YW (1987) Transdermal
Controlled Systemic Medication, Marcel & Decker, 93–120, 365–378).
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Während die
Erfindung nunmehr in Verbindung mit bestimmten bevorzugten Ausführungsformen
in den folgenden Beispielen und mit Bezugnahme auf die begleitenden
Figuren beschrieben wird, so dass deren Gesichtspunkte vollständig verstanden
und gewürdigt
werden können,
ist es nicht beabsichtigt, die Erfindung auf diese besonderen Ausführungsformen
zu begrenzen. Im Gegenteil ist es beabsichtigt, sämtliche
Alternativen, Änderungen
und Äquivalente
abzudecken, wie sie im Rahmen der Erfindung umfasst sind, die durch
die anhängenden
Ansprüche
abgegrenzt wird. Somit werden die folgenden Beispiele, welche die
bevorzugten Ausführungsformen
umfassen, dazu dienen, die Praxis dieser Erfindung zu erläutern, wobei
sie so zu verstehen ist, dass die gezeigten Besonderheiten beispielhaft
sind und lediglich zum Zwecke einer erläuternden Diskussion der bevorzugten
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung dienen, und in der Sache der Bereitstellung
dessen vorgetragen werden, von dem man glaubt, dass es das am meisten
nützliche
sei, sowie eine leicht verständliche
Beschreibung der Verfahren zur Formulierung, sowie der Prinzipien
und der konzeptionellen Gesichtspunkte der Erfindung.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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In
den Zeichnungen:
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1 ist
eine grafische Darstellung der Hautpermeation von menschlichem Insulin;
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2 ist
eine grafische Darstellung des Insulinstransports durch die haarlose
Haut einer Maus;
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3 ist
eine grafische Darstellung der Verteilung des Insulins über die
Rattenhaut;
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4 ist
eine grafische Darstellung der Wirkung des dermal angewandten Insulins
auf die Plasmaglukosewerte;
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5a–5d sind
grafische Darstellungen der Wirkung verschiedener Oxidationsmittel
auf die transdermale Insulinzufuhr, wie anhand der Plasmaglukosewerte
bewertet;
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6 ist
eine grafische Darstellung der Wirkung der dermalen Anwendung von
Insulin auf die Plasmaglukosewerte von mit DEM behandelten nicht
fastenden Ratten;
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7a und 7b sind
grafische Darstellungen einer optimierten Behandlung für dermales
Insulin im Vergleich zu einer unbehandelten Kontrolle;
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8a und 8b sind
grafische Darstellungen der Optimierung einer dermalen Insulinbehandlung, im
Vergleich zu unbehandelten Kontrollratten; und
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9 ist
eine grafische Darstellung der Permeation von humanem Insulin durch
die Haut.
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Beschreibung der bevorzugten
Ausführungsformen
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Beispiel 1
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Eine
pharmazeutische Formulierung für
transdermale Zwecke, die Silberprotein enthält:
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Beispiel 2
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Eine
pharmazeutische Formulierung für
transdermale Zwecke, die einen Penetrationsverstärker enthält, und die angewendet wird,
nachdem die Haut mit Povidon-Iod vorbehandelt wurde:
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Beispiel 3
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Eine
pharmazeutische Formulierung für
transdermale Zwecke, die Silberprotein und einen Penetrationsverstärker enthält, und
die verabreicht wird, nachdem die Haut mit Povidon-Iod vorbehandelt
wurde:
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Vergleichsbeispiel 4
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In vitro Hautpenetration
von Insulin
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Diffusionszellen:
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Die
Permeation von Insulin durch verschiedene Arten von Haut wurde gemessen
unter Verwendung des in vitro Diffusionszellsystems nach Franz.
Die Diffusionsfläche
betrug 1,767 cm2 (15 mm Durchmesser der Öffnung)
und die Volu mina des Rezeptorteils schwankten zwischen 11,8 bis
12,4 ml. Die Lösungen
auf der Empfängerseite
wurden durch äußerlich
angetriebene, mit Teflon beschichtete, magnetische Stäbe gerührt.
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Hautvorbereitung:
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Haut
mit voller Dicke wurde aus frischen Leichen von Tieren (CD1 haarlose
Mäuse,
und Sprague-Dawley Ratten) ausgeschnitten, die mit Ethyläther getötet wurden.
Das subcutane Fett wurde mit dem Skalpell entfernt, und die Haut
wurde in Diffusionszellen befestigt (n = 6 für jedes Experiment). Die abdominale
Haut wurde geschnitten und so angeordnet, dass das stratum corneum
nach oben zu den Empfängerkammern
zeigte; anschließend
wurden Donor-Kammern mit einer Klammer befestigt. Die überschüssige Haut
wurde zurechtgeschnitten, und die Empfängerkammer, welche definiert
ist als diejenige Seite, die der Dermis gegenüber liegt, wurde mit 0,05 M
Phosphatpuffer oder PBS (pH 7,4) befüllt. Menschliche Haut wurde
von der Plastischen Chirurgie Abteilung des Soroka Hospital, Beer-Sheva,
erhalten.
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Permeation:
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Nach
30 Minuten Hautwaschen, das bei 37 °C durchgeführt wurde, wurde der Puffer
von den Zellen entfernt. Aliquots von 0,5 ml Humulin R (humanes
Insulin 100 IU/ml Injektion, Eli Lilly & Co., Fegersheim, Frankreich) oder
Rinderinsulin (2 mg/ml Lösung,
Fluka, Schweiz) wurden genau auf die Haut im Donor-Abteil pipettiert,
und Phosphatpuffer wurde in die Empfängerseiten gefüllt. Proben
(2 ml) wurden aus der Empfängerlösung zu
vorbestimmten Zeitintervallen entnommen, und die Zellen wurden bis
zu ihren markierten Volumina mit frischer Pufferlösung aufgefüllt. Eine
sorgfältige
Zugabe der Lösung
in den Empfänger-Abteilen
fand statt, um das Einfangen von Luft unterhalb der Dermis zu vermeiden.
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Berechnungen:
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Als
Folge des großen
Volumens, das als Probe aus der Empfängerlösung entnommen und durch gleiche
Volumina ersetzt wurde, wurde die Lösung konstant verdünnt. Zieht
man dies in Betracht, wurde eine kumulative Arzneimittelpermeation
(Q
t) aus der folgenden Gleichung berechnet:
wobei C
t die
Arzneimittelkonzentration in der Empfängerlösung zum jeweiligen Zeitpunkt
der Probennahme ist, C
i die Arzneimittelkonzentration
in der i. Probe ist, und V
r bzw. V
S Volumina der Empfängerlösung bzw. der Probe sind. Die
Daten wurden als kumulative Permeation (Q
t)
in Prozent des in Bezug auf die gegebene Hautoberfläche (S =
1,767 cm
2) angewendeten Insulins ausgedrückt.
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Test zur Wiedergewinnung
des Insulins:
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Die
abdominale Haut von Ratten wurde ausgeschnitten, nachdem die Haare
entfernt wurden, und in 4 Diffusionszellen befestigt, die Phosphatpuffer
(pH 7,4) in der Empfängerkammer
enthielten. Humulin R (0,5 ml, 50 IU) wurde im Donor-Abteil aufgetragen,
und nach einer 3-stündigen Diffusion
wurden von den Empfänger-
und Donor-Lösungen
Proben genommen. Die Haut wurde sorgfältig mit Phosphatpuffer gewaschen,
und 2x mit 1 ml Ethanol extrahiert. Die Extrakte und die Probenlösungen wurden
in Bezug auf Insulin wie nachfolgend beschrieben analysiert.
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HPLC-Analyse von Insulin:
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Aliquots
von 10 ml einer jeden Probenröhre
wurden in das HPLC-System eingespritzt, welches mit einer gepackten
C18 Säule
(Lichrospher 60 RP-select B, 5 mm, 125 × 4 mm) ausgestattet war. Der
Nachweis des Insulins wurde bei 270 nm durchgeführt. Die Proben wurden unter
Verwendung einer isokratischen mobilen Phase chromatographiert,
die aus Acetonitril und 0,1 % Trifluoressigsäure (Verhältnis 3:7) bestand. Eine Fließgeschwindigkeit
von 1 ml/min wurde verwendet. Die Daten wurden unter Verwendung
von Standardlösungen bei
zwei unterschiedlichen Konzentrationen analysiert, welche man für jede der
Reihen der chromatographierten Proben laufen ließ. Die Plots der Eichkurve
(Peakfläche
gegen Arnzeimittelkonzentration) über den Bereich von 0,125 bis
2,5 IU/ml waren linear.
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Ergebnisse:
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1 zeigt
die kumulativen Penetrationsprofile in vitro (Flüsse durch die Haut) von humanem
Insulin durch abdominale und dorsale Rattenhaut, im Vergleich zu
dem Transport durch die menschliche Haut. Der Unterschied in der
Penetration, der zwischen der dorsalen Haut und der abdominalen
Haut beobachtet wurde, ist augenscheinlich, da die dorsale Haut
etwa fünfmal
dicker ist. Es ist wichtig, zu bemerken, dass die menschliche Hautpermeabilität für Insulin
weitgehend äquivalent
zur Permeabilität
der abdominalen Haut der Ratte ist. 2 stellt
eine ähnliche
Penetration des Insulins von zwei verschiedenen Ursprüngen (rekombinantes,
humanes und Rinder-Insulin)
durch die haarlose Haut einer Maus dar. Durch Auswertung beider
Figuren und auch der Tabelle 1 haben wir den Eindruck erhalten,
dass Insulin quantitativ penetrieren kann und nahezu vollständig wieder
gewonnen werden kann. 3 zeigt, dass 92,1 % des unversehrten
Insulins aus dem in vitro Permeationsverfahren wieder gewonnen werden,
wobei sich 33,42 % bzw. 5,76 % des Arzneimittels nach nur 3 Stunden
im Empfänger
bzw. in der Haut anhäufen.
Diese Ergebnisse geben zu der bedeutenden Frage Anlass, weshalb
Insulin angeblich als „impermeabel" in vivo in den Blutkreislauf
angesehen wird, wie in der Literatur berichtet (siehe Hintergrund).
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Tabelle
1 Bestimmung
des Insulins sowohl im Empfänger-
als auch im Donor-Abteil nach etwa 20 Stunden einer in vitro Diffusion
durch die Haut
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Vergleichsbeispiel 5
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In vivo Bewertung von
dermal angewandtem Insulin und Povidon-Iod
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Tiere:
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Lokal
aufgezogene Ratten (Sprague-Dawley Stamm) wurden nach nächtlichem
Fasten betäubt
(15 mg/ml Natriumpentobarbital, 0,2–0,3 ml i.p.). Die Ratten wurden
auf ihren Rücken
gelegt, das abdominale Haar wurde abgeschnitten, anschließend wurde
die Haut sanft mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Tiere wurden
in einem Zustand von 0,1 ml Pentobarbitallösung (15 mg/ml) belassen, um
sie kontinuierlich während
des Experiments im Schlaf zu halten.
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Insulinanwendung:
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Kleine
Zylinder (13 mm Öffnung)
wurden am Mittelteil des Rattenabdomens mit einem Silikonkleber befestigt.
Dosen von 0,5 ml Humulin R Lösung
für die
Injektion (entsprechend 50 IU Humaninsulin) wurden in die offenen
Zylin der pipettiert. Bei manchen Experimenten enthielt die Insulinlösung andere
Bestandteile, wie zum Beispiel Penetrationsverstärker (das heißt Natriumoleat,
Propylenglykol) oder ein Oxidationsmittel (das heißt mildes
Silberprotein BPC-Argirol, Givaudan, Frankreich). Umsichtige Aufmerksamkeit
wurde darauf verwendet, dass die Flüssigkeit die gesamte Hautfläche in dem
Zylinder bedeckte, und dass keine Leckage auftrat.
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Vorbehandlung:
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Vor
der Insulinanwendung (in Fällen,
in denen eine kombinierte Behandlung nicht studiert wurde) wurde
die Haut mit Antioxidationsmitteln durch Aufstreichen der Povidon-Iodsalbe (PI, Polydine-Fischer,
Israel) für 0,5
bis 3 Stunden behandelt, oder sie wurde einem Oxidationsmittel in
einer wässrigen
Lösung
ausgesetzt, unter Verwendung des vorstehenden Verfahrens durch Befestigen
eines Zylinders.
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Probennahme aus dem Blut
und Beobachten der Plasmaglukosewerte:
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Blutproben
(ca. 200 μl)
wurden aus der Schwanzvene entnommen und in 0,5 ml Röhrchen gegeben, die
5 μl Heparinlösung enthielten
(5000 i.u./ml, Laboratoire Choay, Frankreich). Die Röhrchen wurden
zentrifugiert (5000 UpM, 5 Minuten), und 10 ml abgetrenntes Plasma
wurde auf 1 ml GOD/PAP Reagenzlösung
(Glukose PAP Kit, Hoffmann La Roche, Basel, Schweiz) übertragen.
Die Absorption der entwickelten Farbe wurde bei 500 nm Wellenlänge gegen
einen Nullwert und eine geeignete Eichkurve gemessen und abgelesen.
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Ergebnisse:
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4 zeigt
den ersten Hinweis für
das Wesentliche dieser Erfindung. Es wurde in definierter Weise gezeigt,
dass in einem in vivo Experiment eine Vorbehandlung mit einem Oxidationsmittel,
Povidon-Iod (PI) Salbe, und einer Insulinanwendung auf der Haut
eine signifikante Verminderung der Plasmaglukosewerte hervorbringt.
Zum Vergleich wurden Plasmawerte in Kontrolltieren, welche nicht
mit PI behandelt wurden, nicht durch dermales Insulin beeinflusst. Überraschenderweise
zeigt die nachfolgende Tabelle II keinen Unterschied zwischen den
Gruppen bezüglich
der Menge des Insulins, das durch den Körper penetrierte. Dieser Umstand stützt die
vorstehenden in vitro Studien, welche klar auf eine fließende Insulinpermeation
durch die Haut hinweisen.
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Wie
bereits im Absatz „Hintergrund" beschrieben wurde überraschenderweise
gefunden, dass die Haut entsprechend dieser Erfindung keine physikalische
Barriere für
Insulin und andere Polypeptide ist. Es scheint, dass der Proteinstoffwechsel
oder die Biotransformation der Haut während des Transports der Moleküle auftritt.
Es wurde bewiesen, dass diese Biotransformation nur in lebenden
Tieren und nicht in ausgeschnittenem Hautgewebe auftritt, unabhängig davon,
wie frisch das Hautgewebe ist.
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Tabelle
II Insulin,
das nach 3 Stunden in vivo Penetration auf der Haut verbleibt
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Vergleichsbeispiel 6
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In vivo Bewertung
des dermal angewendeten Insulins und verschiedener Oxidationsmittel
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Acht
(8) lokal aufgezogene Ratten (Sprague-Dawley Stamm) wurden nach
nächtlichem
Fasten betäubt
(15 mg/ml Natriumpentobarbital, 0,2–0,3 ml i.p.). Die Ratten wurden
auf ihren Rücken
gelegt, das abdominale Haar wurde abgeschnitten, und die Haut wurde
sanft mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Tiere wurden in einem
Zustand von 0,1 ml Pentobarbitallösung (15 mg/ml) belassen, um
sie kontinuierlich während des
Experiments im Schlaf zu halten. Bei sechs der Ratten wurden kleine
Zylinder (Durchmesser der Öffnung 13
mm) auf dem Mittelteil des Abdomens der Ratte mit einem Silikonkleber
befestigt. Die Zylinder wurden mit wässrigen Aliquots (0,5 ml) von
Oxidationsmitteln befüllt – 2 Zylinder
mit 5 % Silberproteinlösung,
2 Zylinder mit 0,01 % Kaliumpermanganat, und 2 Zylinder mit 9 %
Wasserstoffperoxid. Die zwei verbleibenden Tiere wurden mit Povidon-Iod vorbehandelt,
wie bereits in Beispiel 5 beschrieben. Nach 3 Stunden wurden die
Zylinder entleert, oder das Iod wurde aus der Haut gewaschen, und
anschließend
wurden Dosen von 0,5 ml Humulin R Lösung für die Injektion (entsprechend
50 IU Humaninsulin) in die offenen Zylinder pipettiert.
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Die
Probennahme aus dem Blut und die Glukosemessung wurden wie in Beispiel
5 beschrieben durchgeführt.
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Ergebnisse:
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5 zeigt die Wirksamkeit der vier Oxidationsmittel
bei der Unterstützung
der Verminderung der Plasmaglukose durch dermal angewendetes Insulin.
Es kann ersehen werden, dass die Glukosewerte in Ratten, die mit
Silberprotein, KMnO4 und Povidon-Iod vorbehandelt
wurden, signifikant reduziert wurden. Keine Glukosereduktion trat
in Ratten auf, die mit 9 % Wasserstoffperoxidlösung vorbehandelt wurden, wahrscheinlich
deswegen, weil Peroxide empfindlich für enzymatische Reaktionen der
Peroxidase und Katalase sind. Falls Peroxide ausgewählt werden,
sollten für
diesen Zweck weniger empfindliche und länger anhaltende Verbindungen
verwendet werden (das heißt
Carbamidperoxide).
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Vergleichsbeispiel 7
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In vivo Bewertung von
dermal angewendetem Insulin nach einer Vorbehandlung mit Diethylmaleat
(DEM)
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Zwei
nicht fastende, lokal aufgezogene Ratten (Sprague-Dawley Stamm)
wurden betäubt
(15 mg/ml Natriumpentobarbital, 0,2–0,3 ml i.p.). Die Ratten wurden
auf ihren Rücken
gelegt, das abdominale Haar wurde abgeschnitten, und die Haut wurde
sanft mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Tiere wurden in einem
Zustand von 0,1 ml Pentobarbitallösung (15 mg/ml) belassen, um
sie kontinuierlich während
des Experiments im Schlaf zu halten. Diethylmaleat, ein Mittel zur
Abreicherung von Glutathion, wurde für nur eine Ratte intraperitoneal
eingespritzt (0,5 ml, 20 % v/v ethanolische Lösung). Kleine Zylinder (Durchmesser
der Öffnung
13 mm) wurden auf dem mittleren Teil des Abdomens der Ratte mit
einem Silikonkleber befestigt. Die Zylinder wurden mit wässrigen
Lösungen
(0,5 ml) Humulin R Lösung
für die
Injektion (entsprechend 50 IU Humaninsulin) befüllt.
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Die
Probennahme aus dem Blut und die Glukosemessung wurden wie in Beispiel
5 beschrieben durchgeführt.
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Ergebnisse:
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6 zeigt
die plötzliche
Reduktion der Plasmaglukose in den mit DEM behandelten Ratten, welche durch
den Hauttransport des aktiven Insulins zustande gebracht wurde.
Im Vergleich nahm die Plasmaglukose in der unbehandelten Ratte verhältnismäßig langsam
ab, eine Verminderung, die von dem endogenen Insulin in der fastenden
Ratte getrieben wurde.
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Vergleichsbeispiel 8
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In vivo Bewertung von
dermal angewendetem Insulin, das gleichzeitig mit Silberprotein
verabreicht wurde, und das einer Vorbehandlung mit Povidon-Iod folgte
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Sechs
(6) lokal aufgezogene Ratten (Sprague-Dawley Stamm) wurden nach
nächtlichem
Fasten betäubt
(15 mg/ml Natriumpentobarbital, 0,2–0,3 ml i.p.). Die Die Ratten
wurden auf ihren Rücken
gelegt, das abdominale Haar wurde abgeschnitten, und die Haut wurde
sanft mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Tiere wurden in einem
Zustand von 0,1 ml Pentobarbitallösung (15 mg/ml) belassen, um
sie kontinuierlich während
des Experiments im Schlaf zu halten. Drei der Tiere wurden als unbehandelte
Kontrollgruppe verwendet, während
der Rest mit einer Povidon-Iod-Salbe,
wie in Beispiel 5 beschrieben, vorbehandelt wurde, mit der Ausnahme,
dass nur eine 30-minütige
Anwendung anstelle von 3 Stunden erfolgte. Nachdem die Salbe sanft
abgewaschen wurde, wurden kleine Zylinder (Durchmesser der Öffnung 13
mm) auf dem mittleren Teil des Abdomens der Ratte mit einem Silikonkleber
befestigt. Die Zylinder wurden mit 0,5 ml Humulin R Lösung für die Injektion
(entsprechend 50 IU Humaninsulin) in der Kontrollgruppe, und mit
0,5 ml Humulin R Lösung,
die 5 % Silberprotein enthielt, in der Behandlungsgruppe befüllt.
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Die
Probennahme aus dem Blut und die Glukosemessung wurden wie in Beispiel
5 beschrieben durchgeführt.
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Ergebnisse:
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7 zeigt die Wirksamkeit der Behandlung
zur Unterstützung
der Reduktion der Plasmaglukose durch dermal an gewendetes Insulin.
Wie es in der Figur gezeigt wird, wurde eine übereinstimmende Reduktionsgeschwindigkeit
in den Glukosewerten bei den behandelten Ratten beobachtet, während die
unbehandelten Ratten nahezu die gleichen Werte ohne eine Veränderung
zeigten.
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Vergleichsbeispiel 9
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In vivo Bewertung von
dermal angewendetem Insulin und Povidon-Iod
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Dieses
Experiment verwendete dasselbe Protokoll wie in Beispiel 5, und
es ist tatsächlich
eine Wiederholung der Studie, welche zum Ziel hatte, den Beitrag
des Povidon-Iods bei der Zufuhr eines unveränderten und aktiven Insulins
durch die Haut zu untersuchen.
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Ergebnisse:
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8 zeigt die Wirksamkeit der Behandlung
mit Povidon-Iod bei der Unterstützung
der Reduktion der Plasmaglukose durch dermal angewendetes Insulin.
Während
keine Veränderung
in den Kontrollratten auftrat, nahm die Plasmaglukose in den mit
Povidon-Iod behandelten Tieren signifikant ab.
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Vergleichsbeispiel 10
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In vitro Hautpenetration
des Insulins-Einfluß der
Glukose
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Die
Verwendung von Glukose in der Empfängerkammer der Diffusionszellen
nach Franz kann die Energie bereitstellen, welche notwendig ist,
um oxidiertes Glutathion in seine reduzierte Form in der nicht von
Blut durchströmten
Haut umzusetzen. Dieses Experiment wurde in der Absicht durchgeführt, die
in vivo Situation nachzuahmen, und Hinweise für einen möglichen Mechanismus zu erhalten,
bei dem Insulin in der Haut inaktiviert wird.
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Das
in vitro Verfahren wurde, wie in Beispiel 4 beschrieben, anhand
des gleichen Protokolls durchgeführt,
mit der Ausnahme, dass 100 mg% Glukose in der Pufferlösung in
die Empfängerkammern
der dafür
bestimmten Zellen gegeben wurde. Zellen, die lediglich Puffer enthielten,
wurden als Kontrolle verwendet.
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Ergebnisse:
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9 zeigt
den signifikanten Unterschied, der zwischen den Penetrationsprofilen
für Insulin
durch eine Haut, die der Glukose ausgesetzt wurde, und einer Haut,
die lediglich dem Puffer ausgesetzt wurde, beobachtet wurde. Die
Abnahme in der Insulinpermeation durch die Haut in den Glukose enthaltenden
Zellen weist darauf hin, dass das Insulin einem Glukose-abhängigen Bioabbau
oder einer Transformation in der Haut unterliegen kann.
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Dieses
Beispiel, zusammen mit dem Beispiel 7, legt den Schluss nahe, dass
signifikante Konzentrationen an Reduktionsmitteln, wie zum Beispiel
reduziertes Glutathion, in der lebenden Haut vorhanden sind, welche
für die
Inaktivierung des Insulins während
seines Transports zum systemischen Blutkreislauf verantwortlich
sind. Diese Reduktionsmittel können
durch Oxidationsmittel im Rahmen gemäß dem Umfang und den neuen
Befunden der vorliegenden Erfindung oxidiert werden, und unterstützen somit
die transdermale Zufuhr des aktiven Insulins.
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Vergleichsbeispiel 11
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In vivo Hautaufnahme von
dermal angewendetem Insulin nach Behandlung mit Povidon-Iod
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Es
wurde gefunden, dass die Insulinkonzentration in einer Haut einer
Ratte höher
war, die dem Insulin ausgesetzt war und mit Povidon-Iod-Salbe behandelt
wurde, im Vergleich zu einer unbehandelten Haut, die dem Insulin
ausgesetzt war (Tabelle III). Dies ist ebenfalls eine Stützung für den Beweis
der „Inaktivierungs"-Reaktionen des unversehrten
Insulinmoleküls
durch Reduktionsmittel in vivo.
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- *Anmerkung: Konzentrationswerte
des Insulins im Gewebe wurden durch Extraktion mit Ethanol und Analyse mit
einem HPLC-Assay bestimmt.
