DE69831737T2

DE69831737T2 - Neurotrypsin

Info

Publication number: DE69831737T2
Application number: DE69831737T
Authority: DE
Inventors: Peter Sonderegger
Original assignee: Individual
Current assignee: Universitaet Zuerich
Priority date: 1997-04-26
Filing date: 1998-04-24
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2018-04-25
Also published as: DE69831737D1; WO1998049322A1; EP0977871B1; US20050032694A1; CH692507A5; DK0977871T3; ATE305517T1; ES2251077T3; AU6849198A; EP0977871A1; US7666613B2

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Neurotrypsine und eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche diese Substanzen enthält oder auf diese Substanzen einwirkt.
Beschreibung der Erfindung
Neurotrypsin ist eine neu entdeckte Serinprotease, welche vor allem im Gehirn und in der Lunge exprimiert wird; die Expression im Gehirn findet fast ausschliesslich in Nervenzellen statt.
Neurotrypsin hat. eine bisher nicht gefundene Domänenzusammensetzung: neben der Protease-Domäne findet man 3 oder 4 SRCR (Scavenger Receptor Cysteine-Rich)-Domänen und eine Kringel-Domäne. Es ist hervorzuheben, dass die Kombination von Kringel- und SRCR-Domänen bisher noch nie in Proteinen gefunden worden ist. Am Aminoterminus des Neurotrypsin-Proteins befindet sich ein Segment von über 60 Aminosäuren, welches einen ausserordentlich hohen Anteil von Prolin und basischen Aminosäuren (Arginin und Histidin) aufweist.
Die Erfindung ist durch die Merkmale in den unabhängigen Ansprüchen gekennzeichnet. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen definiert.
Die neu gefundenen Neurotrypsine

– Neurotrypsin des Menschen (Verbindung der Formel I),
– Neurotrypsin der Maus (Verbindung der Formel II)

Die Serinprotease, deren Protease-Domäne strukturell am nächsten mit der Protease-Domäne der neuen Verbindungen verwandt ist, nämlich Plasmin (des Menschen), weist eine Aminosäuresequenz-Identität von nur 44% auf.
Das Prolin-reiche, basische Segment am Aminoterminus weist eine gewisse Ähnlichkeit auf mit den basischen Segmenten der Netrine und der Semaphorine/Collapsine. Aufgrund dieses Segmentes ist es wahrscheinlich, dass Neurotrypsin mittels Heparin-Affinitätschromatographie angereichert werden kann.
Die Neurotrypsine des Menschen (Verbindung der Formel I) und der Maus (Verbindung der Formel II) weisen unter sich eine sehr hohe strukturelle Ähnlichkeit auf.
Die Identität der Aminosäuresequenzen der nativen Proteine der Verbindungen der Formeln I oder II beträgt 81%.
Das Neurotrypsin des Menschen (Verbindung der Formel I) hat eine kodierende Sequenz von 2625 Nukleotiden. Das kodierte Peptid der Verbindung der Formel I ist 875 Aminosäuren lang und enthält ein Signalpeptid von 20 Aminosäuren. Das Neurotrypsin der Maus (Verbindung der Formel II) hat eine kodierende Sequenz von 2283 Nukleotiden. Das kodierte Protein der Verbindung der Formel II ist 761 Aminosäuren lang und enthält ein Signalpeptid von 21 Aminosäuren. Der Grund für die grössere Länge des Neurotrypsins des Menschen liegt darin, dass das menschliche Neurotrypsin 4 SRCR-Domänen aufweist, während dem das Neurotrypsin der Maus nur 3 SRCR-Domänen hat.
Die Domänen, welche bei beiden Verbindungen (Verbindung der Formel I und Verbindung der Formel II) vorhanden sind, weisen einen hohen Grad von Sequenzähnlichkeit auf. Die einander entsprechenden SRCR-Domänen der Verbindungen der Formeln I und II weisen eine Aminosäuresequenzidentität von 81% bis 91% auf. Die entsprechenden Kringel-Domänen haben eine Aminosäuresequenzidentität von 75%. Ein hoher Grad von Ähnlichkeit besteht auch in der enzymatisch aktiven (d.h. proteolytischen) Domäne (90% Aminosäuresequenzidentität).
Die Proteasedomänen der Neurotrypsine des Menschen (Verbindung der Formel I) und der Maus (Verbindung der Formel II) sind im Folgenden gegeneinander aufgereiht, um den hohen Grad von Sequenzidentität zu illustrieren.
Von 258 Aminosäuresequenzpositionen, welche in den Vergleich einbezogenen worden sind, sind 233 Aminosäuren in beiden Verbindungen identisch (obere Sequenz: Verbindung der Formel I; untere Sequenz: Verbindung der Formel II; identische Aminosäuren sind mit senkrechten Strichen gekennzeichnet).
Die erfindungsgemässen Neurotrypsine sind verglichen mit den bekannten Serinproteasen einzigartig, weil sie gemäss gegenwärtigen Erkenntnissen in ausgeprägtem Masse von Nervenzellen exprimiert werden. Ein anderes Organ mit starker Expression von Neurotrypsin ist die Lunge (siehe Gschwend et al., Mol. Cell. Neurosci. 9, Seiten 207–219, 1997).
Die den Strukturen der Verbindungen der Formeln I oder II am stärksten gleichenden Proteine sind Serinproteasen, wie etwa Gewebe-Plasminogenaktivator (tPA), Urokinase-Typ-Plasminogenaktivator (uPA), Plasmin, Trypsin, Apolipoprotein (a), Coagulation-Factor XI, Neuropsin, und Acrosin.
Im erwachsenen Gehirn werden die erfindungsgemässen Verbindungen vorwiegend in der Grosshirnrinde, dem Hippocampus, und der Amygdala exprimiert.
Im erwachsenen Hirnstamm und Rückenmark werden die erfindungsgemässen Verbindungen vorwiegend in den motorischen Nervenzellen exprimiert. Eine etwas schwächere Expression ist in den Nervenzellen der oberflächlichen Schichten des Hinterhorns des Rückenmarks zu finden.
Im erwachsenen peripheren Nervensystem werden die erfindungsgemässen Verbindungen in einer Subpopulation der Spinalganglienneurone exprimiert.
Die erfindungsgemässen Verbindungen wurden im Rahmen einer Studie gefunden, welche zum Ziel hatte, Trypsin-ähnliche Serinproteasen im Nervensystem aufzuspüren.
Die erste Verbindung, die gefunden und charakterisiert wurde, war die Verbindung der Formel II (siehe Gschwend et al., Mol. Cell. Neurosci., 9, Seiten 207– 219, 1997).
Durch ein "Alignment" der Proteasedomänen von 7 bekannten Serinproteasen (Gewebe-Typ Plasminogenaktivator, Urokinase-Typ Plasminogenaktivator, Thrombin, Plasmin, Trypsin, Chymotrypsin und pankreatische Elastase) in der Nähe des Histidins und des Serins der katalytischen Triade der aktiven Stelle wurden die Sequenzen von so genannten "Primer-Oligonukleotiden" für die Polymerasen-Kettenreaktion ermittelt.
Die Primer-Oligonukleotiden wurden in einer Polymerasen-Kettenreaktion (PCR) zusammen mit ss-cDNA aus Total-RNA aus Gehirnen von 10 Tage alten Mäusen eingesetzt und führten zur Amplifizierung eines cDNA-Fragments mit einer Länge von ungefähr 500 Basenpaaren.
Dieses cDNA-Fragment wurde erfolgreich zur Isolierung von weiteren cDNA-Fragmenten mittels der Durchsuche von im Handel erhältlichen cDNA-Bibliotheken eingesetzt. Zusammen erstreckten sich die isolierten cDNA-Fragmente über die volle Länge des kodierenden Teils der Verbindung der Formel II.
Durch herkömmliche DNA-Sequenzierung wurden die vollständige Nukleotidsequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz erhalten.
Die Verbindung der Formel I wurde aufgrund ihrer ausgeprägten Ähnlichkeit mit der Verbindung der Formel II kloniert.
Die eingesetzten Primer-Oligonukleotide wurden gemäss der bekannten Sequenz der Verbindung der Formel II synthetisiert.
Die Klonierung der Verbindung der Formel I wurde mittels zweier im Handel erhältlicher cDNA-Bibliotheken aus fötalem menschlichem Gehirn durchgeführt.
Diese Art der Klonierung kann auch zur Isolierung der homologen Verbindung anderer Spezies, wie Ratte, Kaninchen, Meerschweinchen, Rind, Schaf, Schwein, Primaten, Vögel, Zebrafisch (Brachydanio rerio), Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans etc., verwendet werden.
Die kodierenden Nukleotidsequenzen können eingesetzt werden zur Erzeugung von Proteinen mit den kodierten Aminosäuresequenzen der Verbindungen der Formeln I oder II. Ein in unserem Labor praktiziertes Verfahren erlaubt die Produktion von rekombinanten Proteinen in Myelomazellen als Fusionsproteine mit einer Immunoglobulin-Domäne (konstante Domäne der Leichten-Kette-Kappa). Das Konstruktionsprinzip ist im Detail beschrieben durch Rader et al. (Rader et al., Eur. J. Biochem. 215, Seiten 133–141, 1993). Das so von den Myelomazellen synthetisierte Fusionsprotein wurde durch Immunoaffinitätschromatographie mittels eines monoklonalen Antikörpers gegen die Ig-Domäne der Leichten-Kette-Kappa isoliert. Mit der gleichen Expressionsmethode kann auch das native Protein einer Verbindung, ausgehend von der kodierenden Sequenz, produziert werden.
Die kodierenden Sequenzen der Verbindungen der Formeln I oder II können als Ausgangsverbindungen dienen für das Aufspüren und die Isolierung von Allelen der Verbindungen der Formeln I oder II. Sowohl die Polymerasen-Kettenreaktion als auch die Nukleinsäure-Hybridisierung können zu diesem Zweck eingesetzt werden.
Die kodierenden Sequenzen der Verbindungen der Formeln I oder II können als Ausgangsverbindungen dienen für so genannte "site-directed mutagenesis", um Nukleotidsequenzen zu generieren, welche die durch die Verbindungen der Formeln I oder II kodierten Proteine, oder Teile davon, kodieren, aber deren Nukleotidsequenz im Bezug auf die Verbindungen der Formeln I oder II degeneriert sind, bedingt durch die Verwendung alternativer Codons.
Die kodierenden Sequenzen der Verbindungen der Formeln I oder II können verwendet werden als Ausgangsverbindungen für die Herstellung von Sequenzvarianten durch so genannte "site-directed mutagenesis".
Beste Arten zur Ausführung der Erfindung (Beispiele)
cDNA-Klonierung der Verbindung der Formel II (Neurotrypsin der Maus)
Totale RNA wurde aus dem Gehirn von 10 Tage alten Mäusen (ICR-ZUR) gemäss der Methode von Chomczynski und Sacchi (1987) isoliert. Die Herstellung von einzelsträngiger cDNA erfolgte unter Benützung von Oligo(dT)-Primer" und einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase (Superscript RNase H^–-Reverse Transcriptase; Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) gemäss den Instruktionen des Herstellers. Für die Durchführung der Polymerasen-Kettenreaktion wurden ein vorwärts-gerichteter "Primer", gemäss der Aminosäuresequenz der Region des konservierten Histidins der katalytischen Triade, und ein rückwärts-gerichteter "Primer", gemäss der Aminosäuresequenz der Region des konservierten Serins der katalytischen Triade der Serinproteasen, synthetisiert. Die Aminosäuresequenzen, welche für die Bestimmung der Oligonukleotid-„Primer" verwendet wurden, wurden von 7 bekannten Serinproteasen entnommen. Sie sind im Folgenden dargestellt.
Die Protease-Domänen von 7 bekannten Serinproteasen (Gewebe-Typ-Plasminogenaktivator, Urokinase-typ Plasminogenaktivator, Thrombin, Plasmin, Trypsin, Chymotrypsin und pankreatische Elastase) wurden im Bereich des konservierten Histidins und Serins der katalytischen Triade der aktiven Stelle aufgereiht. Die in diesen Regionen konservierten Aminosäuren wurden als Basis für die Bestimmung der degenerierten "Primer" benutzt. Die Primersequenzen sind nach der Empfehlung der IUB-Nomenklatur (Nomenclature Committee, 1985) angegeben.
Die in der PCR eingesetzten Primer trugen zur Erleichterung einer späteren Klonierung die Restriktionsstellen für EcoRI und BamHI an ihren 5'-Enden.
Folgende Primer wurden eingesetzt:
In Leserichtung (sense primers):
5'-GGGGAATTCTGGGTI(C/G)(T/C)I(T/A)(G/C)IGCIGCICA(T/C)TG-3'
In Gegenrichtung (antisense primers):
5'-GGGGGATCCCCICCI(G/C)(A/T)(A/G)TCICC(C/T)T(G/C/T)(G/A)CA-3'.
Die Polymerasen-Kettenreaktion wurde unter Standard-Bedingungen mittels der DNA-Polymerase AmpliTaq (Perkin Elmer) gemäss den Empfehlungen des Produzenten durchgeführt. Das folgende PCR-Profil wurde eingesetzt: 93°C für 3 Minuten, gefolgt von 35 Zyklen von 93°C für 1 Minute, 48°C für 2 Minuten und 72°C für 2 Minuten. Im Anschluss an den letzten Zyklus wurde die Inkubation bei 72°C während weiteren 10 Minuten fortgesetzt.
Die amplifizierten Fragmente hatten eine ungefähre Länge von 500 Basenpaaren. Sie wurden mit EcoRI und BamHI geschnitten und in einen Bluescript-Vektor eingefügt (Bluescript SK(–), Stratagene). Die resultierenden Klone wurden durch DNA-Sequenzbestimmung mittels der Didesoxy-Kettenterminations-Methode (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, Seiten 2163–2167, 1977) auf einem automatisierten DNA-Sequenziergerät (LI-COR, Modell 4000L; Lincoln, NE) unter Benützung eines kommerziellen Sequenzierkits (SequiTherm long-read cycle sequencing kit-LC; Epicentre Technologies, Madison, WI) analysiert. Die Analyse führte zu einer Sequenz von 474 Basenpaaren der katalytischen Region der Serinprotease-Domäne der Verbindung der Formel II.
Das 474 Basenpaar lange PCR-Fragment wurde zum Absuchen einer Oligo(dT)-"primed" Uni-ZAP-XR-cDNA-Bibliothek aus dem Gehirn von 20 Tage alten Mäusen (Stratagene; Cat. No. 937 319) eingesetzt. Es wurden 3 × 10⁶ Lambda-Plaques mittels des radioaktiv markierten PCR-Fragments als Sonde unter hochstringenten Bedingungen (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) abgesucht und es wurden 24 positive Klone gefunden.
Aus den positiven Lambda-Uni-ZAP-XR-Phagemid-Klonen wurde das entsprechende Bluescript-Plasmid nach der Standardmethode gemäss den Empfehlungen des Herstellers (Stratagene) durch in vivo-Exzision herausgeschnitten. Um die Länge der eingefügten Fragmente zu bestimmen, wurden die entsprechenden Bluescript-Plasmid-Klone mit SacI und KpnI verdaut. Die Klone, welche die längsten Fragmente enthielten, wurden mittels DNA-Sequenzierung (wie oben beschrieben) analysiert, und für die anschliessende Daten-Auswertung wurde die GCG-Software (Version 8.1, Unix; Silicon Graphics, Inc.) verwendet.
Da keiner der Klone die kodierende Sequenz in voller Länge enthielt, wurde eine zweite cDNA-Bibliothek abgesucht. Die in dieser Absuche eingesetzte Bibliothek war eine Oligo(dT)- und "Random-Primed" cDNA Bibliothek in einem Lambda-Phagen (Lambda gt10), welche auf mRNA aus 15 Tage alten Maus-Embryonen basierte (oligo(dT)- and random-primed Lambda gt10 cDNA library; Clontech, Palo Alto, CA; Kat. No. ML 3002a). Als Sonde wurde ein radioaktiv markiertes DNA-Fragment (AvaI/AatII) vom 5'-Ende des längsten Klones der ersten Suche eingesetzt, und es wurden ungefähr 2 × 10⁶ Plaques abgesucht. Diese Absuche ergab 14 positive Klone. Die cDNA-Fragmente wurden mittels EcoRI herausgeschnitten und in den Bluescript-Vektor (KS(+); Stratagene) kloniert. Die Sequenzanalyse wurde wie oben beschrieben ausgeführt.
Man erhielt so die Nukleotidsequenz über die volle Länge der cDNA von 2361 resp. 2376 Basenpaaren der Verbindung der Formel II. Mit dem beschriebenen Verfahren der PCR-Klonierung ist es möglich, auch Varianten-Formen der Verbindungen der Formeln I und II zu finden und zu isolieren, beispielsweise deren Allele, oder deren Splice-Varianten. Das beschriebene Verfahren des Absuchens einer cDNA-Bibliothek ermöglicht auch das Auffinden und die Isolierung von Verbindungen, welche unter stringenten Bedingungen an die kodierenden Sequenzen der Formeln I und II hybridisieren.
Klonierung der cDNA der Verbindung der Formel I (Neurotrycisin des Menschen)
Die Klonierung der cDNA der Verbindung der Formel I wurde auf der Grundlage der Nukleotidsequenz der Verbindung der Formel II durchgeführt. Als erster Schritt wurde ein Fragment der Verbindung der Formel I mittels Polymerasenkettenreaktion (PCR) amplifiziert. Als Matrize wurde die DNA verwendet, welche aus einer cDNA-Bibliothek vom Gehirn eines menschlichen Fötus (17.–18. Schwangerschaftswoche) erhalten wurde, welche auf dem Markt erhältlich ist (Oligo(dT)- and random-primed, human fetal brain cDNA library in the Lambda ZAP II vector, Cat. No. 936206, Stratagene). Die synthetischen PCR-Primer enthielten, zur Erleichterung der nachfolgenden Klonierung, die Restriktionsstellen HindIII und XhoI am 5'-Ende.
In Leserichtung (sense primers):
5'-GGGAAGCTTGGICA(A/G)TGGGGIACI(A/G)TITG(C/T)GA(C/T)-3'
In Gegenrichtung (antisense primer):
5'-GGGCTCGAGCCCCAICCTGTTATGTAAIAGTTG-3'
Die PCR wurde unter Standard-Bedingungen mittels der DNA-Polymerase Amplitaq (Perkin Elmer) gemäss den Empfehlungen des Produzenten durchgeführt. Das entstandene Fragment von 1116 Basenpaaren wurde in den Bluescript-Vektor (Bluescript SK(–), Stratagene) eingefügt. Ein 600 Basenpaare-langes HindIII/StuI-Fragment, entsprechend der 5'-Hälfte des 1116 Basenpaare-langen PCR-Fragments, wurde zum Absuchen einer Lambda-cDNA-Bibliothek aus menschlichem fötalem Gehirn (Human Fetal Brain 5'-STRETCH PLUS cDNA library; Lambda gt10; Cat. No. HL3003a; Clontech) eingesetzt. Es wurden 2 × 10⁶ Lambda-Plaques mittels des radioaktiv markierten PCR-Fragments unter hochstringenten Bedingungen (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) abgesucht, und es wurden 23 positive Klone gefunden und isoliert.
Aus den positiven Lambda-gt10-Klonen wurden die entsprechenden cDNA-Fragmente mit EcoRI herausgeschnitten und in einen Bluescript-Vektor (Bluescript KS(+), Stratagene) eingefügt. Die Sequenzierung erfolgte mittels der Didesoxy-Kettenterminations-Methode (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, Seiten 2163–2167, 1977), unter Verwendung eines kommerziellen Sequenzierkits (Sequi Therm long-read cycle sequencing kit-LC; Epicentre Technologies, Madison, WI) und Bluescript-spezifischen Primern.
In einer alternativen Sequenzier-Strategie wurden die cDNA-Fragmente der positiven Lambda-gt10-Klone, unter Verwendung Lambda-spezifischer Primer, mittels PCR amplifiziert. Die Sequenzierung wurde wie oben beschrieben durchgeführt.
Die computerisierte Analyse der Sequenzen wurde mittels des Programmpakets GCG (Version 8.1, Unix; Silicon Graphics Inc.) durchgeführt.
Man erhielt so die Nukleotidsequenz über die volle Länge der cDNA von 3350 Basenpaaren. Mit dem beschriebenen Verfahren der PCR-Klonierung ist es möglich, auch Varianten-Formen der Verbindungen der Formeln I oder II zu finden und zu isolieren, beispielsweise deren Allele, oder deren Splice-Varianten. Das beschriebene Verfahren des Absuchens einer cDNA-Bibliothek ermöglicht auch das Auffinden und die Isolierung von Verbindungen, welche unter stringenten Bedingungen mit den codierenden Sequenzen der Formeln I oder II hybridisieren.
Visualisierung der codierten Sequenzen der Verbindungen I oder II mittels Antikörpern
Das mehr als 60 Aminosäuren lange Prolin-reiche, basische Segment am Aminoterminus der codierten Sequenz der Verbindungen der Formeln I oder II eignet sich gut für die Herstellung von Antikörpern mittels der Synthese von Peptiden und deren Einsatz zur Immunisierung. Wir haben aus dem Prolin-reichen, basischen Segment am Aminoterminus der kodierten Sequenz der Verbindung der Formel II zwei Peptidsequenzen mit einer Länge von 19 und 13 Aminosäuren zur Erzeugung von Antikörpern ausgewählt. Die Peptide hatten die folgenden Sequenzen:
Peptid 1: H₂N-SRS PLH RPH PSP PRS QX-CONH₂
Peptid 2: H₂N-LPS SRR PPR TPR F-COOH
Die beiden Peptide wurden chemisch synthetisiert, an eine makromolekulare Trägersubstanz (Keyhole Limpet Hemacyanin) gekoppelt, und zur Immunisierung in 2 Kaninchen injiziert. Die erzeugten Antiseren wiesen einen hohen Antikörper-Titer auf und konnten erfolgreich sowohl zur Identifizierung von nativem Neurotrypsin aus Gehirnextrakt der Maus als auch zur Identifizierung von rekombinantem Neurotrypsin verwendet werden. Das angewandte Verfahren zur Erzeugung von Antikörpern kann auch zur Erzeugung von Antikörpern gegen die kodierte Sequenz der Verbindung der Formel I angewendet werden.
Die resultierenden Antikörper gegen die Teilsequenzen der kodierten Sequenzen der Formeln I oder II können zur Aufspürung und zur Isolierung von Varianten-Formen der Verbindungen der Formeln I oder II, wie beispielsweise Allele oder Splice-Varianten, eingesetzt werden. Solche Antikörper können auch verwendet werden für die Auffindung und Isolierung von gentechnisch erzeugten Varianten der Verbindungen der Formeln I oder II.
Reinigung der kodierten Sequenzen der Verbindungen der Formeln I oder II
Neben konventionellen chromatographischen Methoden, wie beispielsweise Ionenaustauscher-Chromatographie, kann die Reinigung der kodierten Sequenzen der Verbindungen der Formeln I oder II, auch erreicht werden unter der Verwendung von zwei affinitätschromatographischen Reinigungsverfahren. Eine affinitätschromatographische Reinigungsprozedur basiert auf der Verfügbarkeit von Antikörpern. Durch Kopplung der Antikörper an eine chromatographische Matrix resultiert ein Reinigungsverfahren, in welchem ein sehr hoher Grad an Reinheit der entsprechenden Verbindung in einem Schritt erzielt werden kann.
Ein anderes wichtiges Merkmal, welches für die Reinigung der kodierten Sequenzen der Verbindungen der Formeln I und II verwendet werden kann, ist das Prolin-reiche, basische Segment am Aminoterminus. Es ist zu erwarten, dass, aufgrund der hohen Dichte an positiven Ladungen, dieses Segment die Bindung der kodierten Sequenzen der Verbindungen der Formeln I oder II an Heparin und Heparin-ähnliche Affinitätsmatrices vermittelt. Dieses Prinzip ermöglicht auch die Isolierung, oder zumindest die Anreicherung, von Varianten-Formen der kodierten Sequenzen der Formeln I oder II, beispielsweise deren Allele oder Splice-Varianten. Gleichermassen kann die Heparin-Affinitätschromatographie auch zur Isolierung, oder zumindest zur Anreicherung, von spezieshomologen Proteinen der Verbindungen der Formeln I oder II eingesetzt werden.
Industrielle Anwendbarkeit
Die kodierenden Sequenzen der Verbindungen der Formeln I und II können verwendet werden für die Herstellung der kodierten Proteine, oder Teilen davon, der Formeln I und II. Die Herstellung der kodierten Proteine kann in prokaryotischen oder eukaryotischen Expressionssystemen erzielt werden.
Das Gen-Expressionsmuster der erfindungsgemässen Verbindungen im Gehirn ist äusserst interessant, weil diese Moleküle im adulten Nervensystem vor allem in Nervenzellen derjenigen Regionen exprimiert werden, denen eine wichtige Rolle bei Lern- und Gedächtnisfunktionen zugeschrieben wird. Zusammen mit der kürzlich gefundenen Evidenz für eine Rolle von extrazellulären Proteasen bei der neuralen Plastizität, lässt das Expressionsmuster vermuten, dass die proteolytische Wirkung von Neurotrypsin eine Rolle innehat bei strukturellen Reorganisationen im Zusammenhang mit Lern- und Gedächtnis-Operationen, zum Beispiel Operationen, welche an der Verarbeitung und Speicherung von erlernten Verhaltensweisen, erlernten Gefühlen oder von Gedächtnisinhalten beteiligt sind. Die erfindungsgemässen Verbindungen können deshalb Ziele für pharmazeutische Interventionen bei Funktionsstörungen des Gehirns sein.
Das Gen-Expressionsmuster der erfindungsgemässen Verbindungen in der Grosshirnrinde (vor allem Schichten V und VI) ist äusserst interessant, weil eine Reduktion der zellulären Differenzierung in der Grosshirnrinde in Assoziation mit Schizophrenie gefunden wurde. Die erfindungsgemässen Verbindungen können deshalb Ziele für pharmazeutische Interventionen bei Schizophrenie und verwandten psychiatrischen Krankheiten sein.
Es ist gefunden worden, dass die kodierenden Sequenzen der erfindungsgemässen Verbindungen in Neuronen erhöht sind, welche an das beschädigte Gewebe eines fokalen ischämischen Hirnschlags angrenzen, was darauf hinweist, dass die erfindungsgemässen Verbindungen eine Rolle in der Gewebereaktion in verletztem zerebralem Gewebe spielen. Die erfindungsgemässen Verbindungen können deshalb Ziele für pharmazeutische Interventionen nach einem ischämischen Hirnschlag und anderen Formen von Beschädigungen von neuralem Gewebe sein.
Vom Gewebe-Typ Plasminogenaktivator, eine Serinprotease, welche mit den erfindungsgemässen Verbindungen verwandt ist, wurde kürzlich gefunden, dass er in Excitotoxizitäts-vermittelten neuronalen Zelltod involviert ist. Eine ähnliche Funktion ist denkbar für die erfindungsgemässen Verbindungen und, folglich, stellen die erfindungsgemässen Verbindungen ein mögliches Ziel für pharmakologische Interventionen bei Krankheiten dar, in welchen der Zelltod auftritt.
Das Gen-Expressionsmuster der erfindungsgemässen Verbindungen im Rückenmark und in den sensorische Ganglien ist interessant, weil diese Moleküle im adulten Nervensystem in Neuronen derjenigen Gehirnregionen exprimiert werden, denen eine Rolle bei der Verarbeitung von Schmerz, sowie bei der Entstehung pathologischer Schmerzzustände, zugeschrieben wird. Die erfindungsgemässen Verbindungen können deshalb Ziele für pharmazeutische Interventionen bei pathologischem Schmerz sein.
Im folgenden Teil werden Angaben bezüglich der Verbindungen der Formeln I oder II gemacht:
(1) ANGABEN ZUR VERBINDUNG DER FORMEL I (Neurotrypsin des Menschen)
Verbindung der Formel I (Neurotrypsin des Menschen)
(1) ANGABEN ZUR VERBINDUNG DER FORMEL II (Neurotrypsin der Maus)
Verbindung der Formel II (Neurotrypsin der Maus)
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Neurotrypsine der Formeln I oder II I: Neurotrypsin des Menschen II: Neurotrypsin der Maus
Nukleotidsequenzen, welche die Neurotrypsine gemäss Anspruch 1 kodieren, dadurch gekennzeichnet, dass sie die kodierenden Nukleotidsequenzen der Verbindungen der Formeln I oder II umfassen.
Verwendung der kodierenden Nukleotidsequenzen der Verbindungen der Formeln I oder II für die Herstellung von rekombinanten Proteinen.
Verwendung der Proteine mit den kodierten Aminosäuresequenzen der Verbindungen der Formeln I oder II als Ziele für die Entwicklung von pharmazeutischen Arzneimitteln, beispielsweise für die Hemmung oder die Förderung der katalytischen Aktivität der kodierten Proteine der Formeln I oder II.
Verwendung der Proteine mit den kodierten Aminsäuresequenzen der Verbindungen der Formeln I oder II für die Bestimmung der Raumstruktur, beispielsweise für die Bestimmung der Raumstruktur mittels Kristallographie oder mittels kernmagnetischer Resonanzspektroskopie (NMR).
Verwendung der kodierten Aminosäuresequenzen der Verbindungen der Formeln I oder II für die Voraussage der Proteinstruktur mittels computerisierter Proteinstruktur-Voraussagungs-Methoden.
Verwendung der kodierten Aminosäuresequenzen der Verbindungen der Formeln I oder II als Antigene für die Herstellung von Antikörpern, wie beispielsweise Antikörper, welche die Protease-Funktion hemmen oder fördern, oder Antikörper, welche für immunohistochemische Studien verwendet werden können.
Verwendung der kodierenden Nukleotidsequenzen der Verbindungen der Formeln I oder II für die Herstellung von nicht-menschlichen transgenen Tieren, wie beispielsweise transgene Mäuse.
Verwendung der kodierenden Nukleotidsequenzen der Verbindungen der Formeln I oder II für die Inaktivierung oder die Mutation des entsprechenden Gens mittels in vitro „Gene Targeting"-Techniken, wie beispielsweise die Eliminierung des Gens in der Maus durch homologe Rekombination.