DE69730830T2

DE69730830T2 - Verwendung des "green-fluorescent-proteins" als screenung-marker für pflanzentransformation

Info

Publication number: DE69730830T2
Application number: DE69730830T
Authority: DE
Inventors: William Gordon-Kamm; A. Dortothy PIERCE; Benjamin Bowen; Dennis Bidney; Margit Ross; Christopher Scelonge; Mike Miller; Gary Sandahl; Lijuan Wang
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 1996-05-01
Filing date: 1997-05-01
Publication date: 2005-09-22
Anticipated expiration: 2017-05-02
Also published as: WO1997041228A3; CA2252412C; AU2998397A; ATE277177T1; EP0904371A2; AU730927B2; AR006928A1; CA2252412A1; US6486382B1; DE69730830D1; EP0904371B1; WO1997041228A2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Pflanzentransformation, bei dem ein DNA-Konstrukt, das ein Gen, codierend für das grün-fluoreszierende Protein (GFP) trägt, in Pflanzenzellen eingeführt wird, die dann auf die Anwesenheit des Proteins hin durchmustert werden, und transformierte Zellen in transgene Pflanzen regeneriert werden. Im Besonderen stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Umgehen der zellulären Toxizität des GFP durch Regulieren der Expression des für das Protein kodierenden Gens oder Lenken des Proteins zu einem subzellulären Kompartiment, wo es für die Zelle nicht-toxisch ist, bereit. Die vorliegende Erfindung stellt DNA-Konstrukte zur Zelltransformation bereit, bei denen die Expression eines für das GFP kodierenden Gens unter die Kontrolle eines induzierbaren, konstitutiven oder gewebespezifischen Promotors gestellt wird. Zusätzlich werden DNA-Konstrukte bereitgestellt, bei denen eine für das GFP kodierende Nucleotidsequenz funktionell mit einer Signal- oder Zielsequenz, die das exprimierte Protein an ein subzelluläres Kompartiment, wo das Protein für die Zelle nicht-toxisch ist, lenkt, verknüpft ist. Außerdem stellt die vorliegende Erfindung eine für GFP kodierende Nucleotidsequenz, die für die Expression des GFP-Gens in Pflanzen optimiert ist, und GFP-codierende Nucleotidsequenzen, die für lichtverschobene Versionen von GFP codieren, bereit. Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zum Selektieren von Pflanzenzellen, die mit einem Gen, codierend für einen durchmusterbaren Marker, der an den 5'- und 3'-Enden von einer Rekombinase-spezifischen Zielsequenz flankiert ist, transformiert sind, und Einführen eines für eine ortsspezifische Rekombinase-codierenden Gens in die transformierten Pflanzenzellen und Selektieren transformierter Pflanzenzellen, die den durchmusterbaren Marker nicht länger exprimieren, bereit. Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Reduzieren der GFP-Toxizität durch Transformieren von Pflanzenzellen mit einem das GFP codierenden Gen zusammen mit einem Gen, das für einen Sauerstofffänger wie z. B. Superoxiddismutase codiert, bereit.
2. HINTERGRUND
Expressionsvektoren schließen wenigstens einen genetischen Marker ein, der transformierten Zellen erlaubt, entweder durch negative Selektion wiedergewonnen zu werden, d. h. Verhindern des Wachstums von Zellen, die das selektierbare Marker nicht enthalten, oder durch Durchmustern nach einem durch den genetischen Marker codierten Produkt. Viele der allgemein verwendeten selektierbaren Markergene für die Pflanzentransformation wurden aus Bakterien isoliert und codieren für Enzyme, die metabolisch einen selektiven chemischen Wirkstoff, der ein Antibiotikum oder ein Herbizid sein kann, detoxifizieren. Andere selektive Markergene codieren für ein verändertes Ziel, das insensitiv auf den Inhibitor ist.
Das am allgemeinsten verwendete selektierbare Markergen für die Pflanzentransformation ist das Neomycinphosphotransferase II-Gen (nptII), isoliert von Tn5, das, wenn es unter die Kontrolle von regulatorischen Pflanzensignalen gestellt wird, Resistenz gegen Kanamycin verleiht. Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 4803 (1983). Ein anderes allgemein verwendetes selektierbares Markergen ist das Hygromycinphosphotransferasegen, das Resistenz gegen das Antibiotikum Hygromycin verleiht. Vanden Elzen et al., Plant Mol. Biol. 5: 299 (1985).
Zusätzliche selektierbare Markergene bakteriellen Ursprungs, die Resistenz gegen Antibiotika verleihen, schließen Gentamycinacetyltransferase, Streptomycinphosphotransferase, Aminoglycosid-3'-adenyltransferase, die Bleomycinresistenzdeterminante, ein. Hayford et al., Plant Physiol. 86: 1216 (1988), Jones et al., Mol. Gen. Genet., 210: 86 (1987), Svab et al., Plant Mol. Biol. 14: 197 (1990), Hille et al., Plant Mol. Biol. 7: 171 (1986). Andere selektierbare Markergene verleihen Resistenz gegen Herbizide wie z. B. Glyphosat, Glufosinat oder Broxynil. Comai et al., Nature 317: 741–744 (1985), Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603–618 (1990) und Stalker et al., Science 242: 419–423 (1988).
Andere selektierbare Markergene für die Pflanzentransformation sind nicht bakteriellen Ursprungs. Diese Gene schließen beispielsweise Maus-Dihydrofolatreduktase, Pflanzen-5-enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthase und Pflanzen-Acetolactatsynthase ein. Eichholtz et al., Somatic Cell Mol. Genet. 13: 67 (1987), Shah et al., Science 233: 478 (1986), Charest et al., Plant Cell Rep. 8: 643 (1990).
Obwohl viele dieser Markierer zum Selektieren transformierten Pflanzengewebes verwendet worden sind, können diese Selektionssysteme, die toxische chemische Wirkstoffe beinhalten, Nachteile oder Einschränkungen aufweisen. Ein Nachteil ist, dass es schwierig sein kann, normale lebensfähige transformierte Pflanzen direkt aus chemischer Selektion wiederzugewinnen. Everett et al., Bio/Technology 5: 1201–1204 (1987). Ein weiterer Nachteil ist, dass nicht alle selektierbaren Markersysteme für alle Gewebe und in allen Pflanzenarten funktionieren, was teilweise durch Unterschiede bei der Sensitivität eines speziellen Gewebes oder einer Pflanzenart auf den selektiven Wirkstoff, bedingt ist. Der Erfolg eines gegebenen Markers für die Transformation einer gegebenen Pflanzenart ist nicht leicht vorherzusagen. Außerdem sind potentielle regulatorische Fragen, die die Verwendung von Antibiotikaresistenzgenen und die Verwendung von Herbizidresistenzgenen für Pflanzenarten, die zum Kreuzen mit nicht verwandten Unkrautarten in der Lage sind, umgeben, zusätzliche Nachteile dieser Markierer.
Eine andere Klasse von Markergenen zur Pflanzentransformation erfordern das Durchmustern vermutlich transformierter Pflanzenzellen anstatt direkte genetische Selektion transformierter Zellen auf die Resistenz gegen eine toxische Substanz wie z. B. ein Antibiotikum. Diese Gene sind insbesondere verwendbar, um das räumliche Expressionsmuster eines Gens in spezifischen Geweben quantitativ zu bestimmen oder sichtbar zu machen. Sie werden häufig als Reportergene bezeichnet, weil sie an ein Gen oder eine regulatorische Gensequenz zur Untersuchung der Genexpression fusioniert werden können. Allgemein verwendete Gene zum Durchmustern vermutlich transformierter Zellen schließen β-Glucuronidase (GUS), β-Galactosidase, Luciferase und Chloramphenicolacetyltransferase ein. Jefferson R. A., Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387 (1987), Teeri et al., EMBO J. 8: 343 (1989), Koncz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 131 (1987), De Block et al., EMBO J., 3: 1681 (1984). Eine andere Herangehensweise zur Identifizierung relativ seltener Transformationsereignisse ist die Verwendung eines Gens gewesen, das einen dominant konstitutiven Regulator des Zea-Mais-Anthocyanin-Pigmentierungsstoffwechselwegs codiert. Ludwig et al., Science 247: 449 (1990).
Obwohl chemische Selektion von mit selektierbaren Markergenen transformierten Pflanzenzellen mit Pflanzenarten und -sorten, die in vitro leicht kultiviert werden, erfolgreich gewesen ist, ist die Auswahl von selektierbaren Markersystemen, die gezeigt worden sind, für Getreide und viele andere agronomisch wichtige Pflanzenarten erfolgreich zu sein, sehr beschränkt. Im Allgemeinen sind Pflanzenarten, die zu Organogenese und/oder Sprossausbreitung neigen, mittels chemischer Selektion schwierig zu transformieren gewesen. Die Erfolgsrate mit den Pflanzenarten fährt jedoch fort besser zu werden, wie durch kürzliche Fortschritte bei der Typ I-Selektion von Maisinzuchtlinien und kleinkörnigen Getreiden, wie z. B. Gerste, bewiesen. Koziel et al., Bio/Technology 11: 194–200 (1993) und Mendel et al. in "Transformation of Plants and Soil Microorganisms", Wang et al., Herausg., Cambridge Press.
Gleichermaßen bestand wenig Erfolg bei der Verwendung visueller Screeningverfahren zur Primäridentifikation von transformierten Zellen. Das GUS-Gen wurde verwendet, um die Keimbahntransmission zu untersuchen. McCabe et al., Plant Physiol., 87(3): 671 (1988) und McCabe et al., Plant Cell Tissue Organ Cult. 33(3): 227 (1993). Histochemisches Färben auf GUS-Aktivität wurde verwendet, um transgene Sektoren in Baumwoll- und Sojabohnentransformanten zu lokalisieren, die letztlich transgene Samen produzierten. Da histochemische Analyse auf GUS-Aktivität die Zerstörung von Anteilen des vermutlich transformierten Pflanzengewebes erfordert, ist dieses Verfahren arbeitsintensiv und unpraktisch für die Routineproduktion transgener Pflanzen. Dieses Verfahren ist insbesondere ungeeignet für Pflanzenarten, wie z. B. Mais und andere Getreide, bei denen Transformanten selbst unter Optimalbedingungen in geringer Häufigkeit wiedergewonnen werden. Die Rückgewinnung transformierter Nachkommen wurde einmal unter Verwendung von GUS-Expression als einem Durchmusterungswerkzeug in Gerste beschrieben, aber es wurde gefunden, dass das Verfahren sehr arbeitsintensiv ist. Ritala et al., Plant Mol. Biol. 24: 317–325 (1994). Es hat überhaupt keine Erfolgsberichte mit GUS oder anderen durchmusterbaren Markern mit Mais gegeben.
Vor kürzerer Zeit sind in vivo-Verfahren zum Visualisieren von GUS-Aktivität, die keine Zerstörung von Pflanzengewebe erfordern, verfügbar gemacht worden. Molecular Probes Publication 2908, Imagene Green^TM, S. 1–4 (1993) und Naleway et al., J. Cell Biol. 115: 151a (1991). Jedoch haben sich diese in vivo-Verfahren zum Visualisieren von GUS-Aktivität aufgrund niedriger Sensitivität und hoher Fluoreszenzhintergrundwerte als nicht für die Rückgewinnung transformierter Zellen verwendbar erwiesen.
Trotz der Tatsache, dass Luciferasegene viele Jahre lang verfügbar gewesen sind, ist diese Strategie zum Visualisieren transformierter Zellen auch nicht erfolgreich an die Routinerückgewinnung von Pflanzentransformanten angepasst worden. Die auf Luciferase basierenden Screeningverfahren sind durch die Tatsache limitiert, dass die meisten dieser Systeme die Anwesenheit von Luciferin, einer kompatiblen Luciferase und einem exogen bereitgestellten Co-Faktor bedürfen. In Abwesenheit des Substrats, Enzyms oder Co-Faktors bioluminesziert das System nicht. Mit einem Luciferasegen transformierte Zellen müssen Zellwände und Plasmamembranen aufweisen, die permeabel für ein kompatibles Luciferin sind oder dafür permeabel gemacht werden, um Biolumineszenz zu detektieren. Beispielsweise wiesen Tabakpflanzen, die aus Zellen regeneriert waren, die mit einem Glühwürmchen-Luciferasegen transformiert waren und einem Flüssigmedium, das Glühwürmchen-Luciferin enthielt, ausgesetzt waren, Biolumineszenz hauptsächlich entlang ihrer Hauptblattadern auf. Ow et al., Science 234: 856 (1986). Dementsprechend ist kein Durchmusterungsverfahren erfolgreich für Routinepflanzentransformation entwickelt worden, das keine chemische Selektion oder Assays, oft arbeitsintensiv, beinhaltet, die das Opfern oder die Zerstörung von Gewebeproben für die Analyse erfordern.
Ein für GFP codierendes Gen ist als Marker für die Genexpression in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen verwendet worden. Chalfie et al., Science 263: 802 (1994). Viele Cnidaria verwenden GFPs als Energietransferakzeptoren bei der Biolumineszenz. Ein aus Cnidaria isoliertes, für GFP codierendes Gen, exprimiert in einem heterologen prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt, produziert ein zur Fluoreszenz fähiges Protein. Eine cDNA, die für das Aequorea victoria GFP codiert, produzierte, wenn in Escherichia coli- oder Caenorhabditis elegans-Zellen exprimiert, ein fluoreszierendes Produkt. Grüne Fluoreszenz wurde in transformierten Zellen bei Beleuchtung mit einer langwelligen Ultraviolettlicht (UV)-Quelle beobachtet, ohne dass Substrate oder Co-Faktoren bereitgestellt werden mussten. Zudem war Fluoreszenz für mindest 10 Minuten stabil, wenn mit Licht von 450 bis 490 nm belichtet wurde. Die Transformation von Pflanzenzellen mit einem für GFP codierenden Gen und die Detektion von Fluoreszenz ist berichtet worden. Haseloff et al., TIG 11: 328–329 (1995). Transformierte Arabidopsis-Zellen konnten in ganze Pflanzen regeneriert werden. Jedoch wiesen die regenerierten, GFP exprimierenden Pflanzen Zeichen milder bis moderater Toxizität im Licht, verglichen zu kein GFP exprimierenden Pflanzen, auf. Die stärksten GFP-Exprimierer erwiesen sich als schwieriger zu regenerieren. Ähnlich beobachten Chiu et al., Current Biol. 6: 325–330 (1996), in einem kürzlichen Bericht, der GFP-Expression in Kanamycin-selektierten Tabaktransformanten beschreibt, dass hohe GFP-Expressionslevel die Regeneration transgener Pflanzen verhinderten.
Deshalb besteht ein Bedürfnis nach einem Zelltransformationsverfahren, das nicht oder das nicht ausschließlich auf der Selektion von Zellen beruht, die ein Gen tragen, das Resistenz gegen eine toxische Substanz verleiht. Es besteht ein Bedürfnis nach einem Verfahren, transformierte Pflanzenzellen mit einem sichtbaren, durchmusterbaren Marker wirksam und leicht zu identifizieren. Außerdem besteht ein Bedürfnis nach einem Verfahren zur Zelltransformation, das keine Zerstörung vermutlich transformierter Gewebe erfordert, um auf die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens hin zu untersuchen. Es besteht ein Bedürfnis nach einem Verfahren zur Zelltransformation, das ein selektierbares Markergen und ein durchmusterbares Markergen kombiniert. Zusätzlich besteht ein Bedürfnis nach einem Verfahren zur Zelltransformation, das keine exogene Bereitstellung eines Substrats oder Co-Faktors zur Detektion des durch ein selektierbares Markergen codierten Polypeptids erfordert. Ein wiederum anderes Bedürfnis besteht nach einem Verfahren zur Zelltransformation, das die zelluläre Toxizität des GFP umgeht.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Dementsprechend ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Zelltransformation bereitzustellen, das nicht von der Selektion von Zellen, die ein Gen tragen, das Resistenz gegen eine toxische Substanz verleiht, abhängig ist.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Zelltransformation bereitzustellen, das die Selektion von Zellen, die ein Gen tragen, das Resistenz gegen eine toxische Substanz verleiht, mit dem Durchmustern von Zellen auf die Anwesenheit einer Substanz hin, die transformierte Zellen identifizierbar macht, kombiniert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Zelltransformation bereitzustellen, das keine Zerstörung vermutlich transformierter Gewebe, um auf die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens hin zu untersuchen, erfordert.
Noch eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Zelltransformation bereitzustellen, welches nicht erfordert, dass ein exogenes/r Substrat oder Co-Faktor bereitgestellt wird, um auf ein von einem selektierbaren Markergen codiertes Polypeptid hin zu untersuchen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Zelltransformation bereitzustellen, das die zelluläre Toxizität des GFP umgeht.
Diese und andere Aufgaben werden, gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, durch Bereitstellen eines isolierten DNA-Moleküls, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für das GFP, funktionell verknüpft mit einem induzierbaren Promotor, codiert, erreicht. Der induzierbare Promotor kann aus der Gruppe, bestehend aus dem Östrogen-induzierbaren Promotor, dem Östradiol-induzierbaren Promotor, dem ACE1-Promotor, dem IN2-Promotor und dem Tetracyclinrepressor-Promotor ausgewählt, sein.
Außerdem wird ein isoliertes DNA-Molekül bereitgestellt, das eine Nucleotidsequenz, die für das GFP codiert, umfasst, wobei die Nucleotidsequenz funktionell mit einer Zielsequenz für eine subzelluläre Lokalisierung verknüpft ist, die ein Protein zu einem subzellulären Kompartiment lenkt.
Ein isoliertes DNA-Molekül wird bereitgestellt, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus (a) SEQ ID NO: 1; (b) eine Nucleotidsequenz, die eine substantielle Sequenzähnlichkeit mit SEQ ID NO: 1 aufweist; und (c) ein funktionales Fragment von (a) oder (b), wobei das DNA-Molekül für ein GFP codiert. Die ein GFP codierende Sequenz kann funktionell mit einer Nucleotidsequenz verknüpft sein, die für eine Zielsequenz für eine subzelluläre Lokalisierung codiert, welche ein Protein zu einem sub zellulären Kompartiment lenkt. Ferner kann die für ein GFP und eine Zielsequenz codierende Nucleotidsequenz einen Promotor, funktionell verknüpft mit der Nucleotidsequenz, umfassen.
Außerdem werden Expressionsvektoren bereitgestellt, die DNA-Moleküle umfassen, die für ein GFP, das funktionell mit einer induzierbaren Promotor- und/oder Zielsequenz verknüpft ist, codiert. Der Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung kann eine Nucleotidsequenz tragen, die für ein Fremdprotein, funktionell verknüpft mit einem zweiten Promotor, codiert.
Außerdem wird ein Verfahren zum Verwenden der Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung, um eine transformierte Pflanze herzustellen, bereitgestellt, das die Schritte des Einführens einer Expression, die ein für GFP codierendes Gen trägt, in regenerierbare Pflanzenzellen und Selektierens von Zellen, die das GFP enthalten, zur Regenerierung, umfasst. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann den Schritt des Induzierens von GFP-Expression beinhalten, wobei die für GFP codierende Nucleotidsequenz funktionell mit einem induzierbaren Promotor verknüpft ist. Die regenerierbaren Pflanzenzellen, die im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind aus der Gruppe, bestehend aus Zea-, Brassica- und Helianthus-Zellen ausgewählt.
Außerdem werden transgene Pflanzen bereitgestellt, die das isolierte DNA-Molekül, das für GFP codiert, exprimieren. Zusätzlich werden transgene Pflanzen, die einen Vektor umfassen, der eine Nucleotidsequenz trägt, die für GFP codiert, bereitgestellt.
Ein Verfahren zum Herstellen einer transgenen Pflanze wird bereitgestellt, das die Schritte (a) Konstruieren eines Expressionsvektors, umfassend (i) einen ersten Promotor, welcher ein induzierbarer Promotor, funktionell verknüpft mit einer Nucleotidsequenz, die für ein GFP codiert, ist, und (ii) einen zweiten Promotor, funktionell verknüpft mit einem Fremdgen; (b) Einführen des Expressionsvektors in regenerierbare Pflanzenzellen; (c) Induzieren der Expression des für das GFP codierenden Gens und Selektieren transformierter Pflanzenzellen, die das Protein enthalten; und (d) Regenerieren transformierter Pflanzen aus den selektierten transformierten Pflanzenzellen, umfasst. Der induzierbare Promotor kann aus der Gruppe, die den Östrogen-induzierbaren Promotor, den Östradiol-induzierbaren Promotor, den ACE1-Promotor, den IN2-Promotor und den Tetracyclinrepressor-Promotor einschließt, ausgewählt sein.
Außerdem wird ein Verfahren zum Herstellen einer transgenen Pflanze bereitgestellt, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Konstruieren eines Expressionsvektors, umfassend (i) einen ersten Promotor, funktionell verknüpft mit einer Nucleotidsequenz, codierend eine Sequenz für eine subzelluläre Lokalisierung, welche ein Protein zu einem subzellulären Kompartiment leitet, welche funktionell mit einer für GFP codierenden Nucleotidsequenz verknüpft ist, und (ii) einen zweiten Promotor, funktionell verknüpft mit einem Fremdgen; (b) Einführen des Expressionsvektors in regenerierbare Pflanzenzellen; (c) Selektieren transformierter Pflanzenzellen, die das GFP enthalten; und (d) Regenerieren transformierter Pflanzen aus den selektierten transformierten Pflanzenzellen. Die Zielsequenz für eine subzelluläre Lokalisierung lenkt das GFP zu den Mitochondrien, Chloroplasten, Peroxisomen, der Vakuole, dem endoplasmatischen Retikulum, der Zellwand oder allgemein in den Apoplasten zur Sekretion. Dieses Verfahren kann eine Nucleotidsequenz einschließen, die für ein GFP codiert, das aus der Gruppe, bestehend aus: (a) SEQ ID NO: 1; (b) einer Nucleotidsequenz, die eine substantielle Sequenzähnlichkeit mit SEQ ID NO: 1 aufweist; und (c) einem funktionalen Fragment von (a) oder (b), ausgewählt ist.
Außerdem wird ein Verfahren zum Herstellen einer transgenen Pflanze bereitgestellt, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Konstruieren eines Expressionsvektors, umfassend (i) einen ersten Promotor, der funktionell mit einer Nucleotidsequenz verknüpft ist, die für eine durchmusterbare Markierung codiert, die an den 5'- und 3'-Enden von einer Rekombinasespezifischen Zielsequenz flankiert ist, und (ii) einen zweiten Promotor, funktionell verknüpft mit einem Fremdgen; (b) Einführen des Expressionsvektors in regenerierbare Pflanzenzellen; (c) Selektieren transformierter Pflanzenzellen, die den durchmusterbarn Marker enthalten; (d) Transformieren der Pflanzenzellen mit einem zweiten Expressionsvektor, der ein Gen enthält, das für eine ortsspezifische Rekombinase codiert; (e) Selektieren von Pflanzenzellen, die nicht länger den durchmusterbarn Marker exprimieren; (f) Regenerieren transformierter Pflanzen aus den selektierten transformierten Pflanzenzellen; und (g) Isolieren des Fremdproteins. Die ortsspezifische Rekombinase kann ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den FLP/FRT-, Ac/DS- und cre/lox-Systemen, sein. Zudem kann der durchmusterbare Marker das GFP sein. Ein isoliertes DNA-Molekül, das eine für das GPF codierende Nucleotidsequenz, im Rahmen ("in frame") mit einer Nucleotidsequenz fusioniert, die für Superoxiddismutase codiert, umfasst, wird außerdem bereitgestellt. Zellen, die mit dem DNA-Molekül transformiert werden, enthalten ein Fusionsprotein, das (i) grüne Fluoreszenz in Anwesenheit von UV- bis blauem Licht produziert und (ii) Superoxiddismutase-Aktivität zeigt.
Außerdem wird ein Verfahren zum Herstellen einer transgenen Pflanze bereitgestellt, das umfasst: (a) Konstruieren eines Expressionsvektors, umfassend (i) einen ersten Promotor, der funktionell mit einer Sequenz verknüpft ist, die für ein GFP codiert, und (ii) einen zweiten Promotor, der funktionell mit einem Gen verknüpft ist, das für ein Enzym codiert, das ein Sauerstofffänger ("oxygen scavenger") ist, und (iii) einen dritten Promotor, funktionell verknüpft mit einem Fremdgen; (b) Einführen des Expressionsvektors in regenerierbare Pflanzenzellen; (c) Selektieren transformierer Pflanzenzellen, die das GFP enthalten; und (d) Regenerieren transformierter Pflanzen aus den selektierten transformierten Pflanzenzellen. Das Sauerstofffängerenzym kann Superoxiddismutase sein.
Alternativ wird ein Verfahren zum Herstellen einer transgenen Pflanze bereitgestellt, das umfasst: (a) Konstruieren eines Expressionsvektors, umfassend (i) einen ersten Promotor, der funktionell verknüpft mit einer Nucleotidsequenz ist, die für ein Fusionsprotein codiert, das das GPF- und ein im Rahmen ("in frame") fusioniertes Sauerstofffängerenzym umfasst, und (ii) einen zweiten Promotor, funktionell verknüpft mit einem Fremdgen; (b) Einführen des Expressionsvektors in regenerierbare Pflanzenzellen; (c) Selektieren transformierter Pflanzenzellen, die das GFP und die Sauerstofffängerenzym-Aktivität enthalten; und (d) Regenerieren transformierter Pflanzen aus den selektierten transformierten Pflanzenzellen. Das Sauerstofffängerenzym kann Superoxiddismutase sein.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 stellt die Nucleotidsequenz [SEQ ID NO: 1], die für ein GFP codiert, mit seiner korrespondierenden Aminosäuresequenz [SEQ ID NO: 2], dar.
2 zeigt die Plasmidkarte von PHP167.
3 zeigt die Plasmidkarte von PHP762.
4 zeigt die Plasmidkarte von PHP7921.
5 zeigt die Plasmidkarte von PHP8144.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
1. DEFINITIONEN
In der folgenden Beschreibung wird eine Anzahl von Ausdrücken ausgiebig verwendet. Die folgenden Definitionen werden bereitgestellt, um das Verständnis der Erfindung zu erleichtern.
Ein Strukturgen ist eine DNA-Sequenz, die in Messenger-RNA (mRNA) transkribiert wird, die dann in eine Sequenz von Aminosäuren translatiert wird, die für ein spezifisches Polypeptid charakteristisch sind.
Ein Promotor ist eine DNA-Sequenz, die die Transkription eines Strukturgens regelt. Typischerweise ist ein Promotor in der 5'-Region eines Gens, proximal zum Transkriptionsstartort eines Strukturgens, lokalisiert. Wenn ein Promotor ein induzierbarer Promotor ist, dann erhöht sich die Transkriptionsrate in Antwort auf ein induzierendes Mittel. Im Gegensatz wird die Transkriptionsrate nicht durch ein induzierendes Mittel reguliert, wenn der Promotor ein konstitutiver Promotor ist. Beispielsweise kann ein Promotor auf eine gewebespezifische oder gewebebevorzugte Art und Weise reguliert sein, so dass er nur in (einer) spezifischen Gewebeart(en), wie z. B. Blättern, Wurzeln oder Meristem, beim Transkribieren der assoziierten codierenden Region aktiv ist.
Ein zytoplasmatisch lokalisiertes Protein ist ein Protein, codiert durch ein Gen, das weder irgendein spezifisches Signal für das "Targeting" des Proteins in eine subzelluläre Organelle oder ein subzelluläres Kompartiment, noch irgendwelche Signale für eine Sekretion des Proteins, einschließt. Beispielsweise codiert das GFP-Strukturgen, das 5' funktionell mit einem Promotor verknüpft ist und funktionell mit einer geeigneten 3'-Sequenz verknüpft ist, für ein Protein, das im Zytoplasma kompartimentalisiert ist.
Eine Signal- oder Zielsequenz ("targeting sequence") ist eine strukturelle Peptiddomäne, die für das "Targeting" eines gegebenen Polypeptids an eine subzelluläre Organelle ein subzelluläres Kompartiment oder zur Sekretion aus der Zelle erforderlich ist. Wie hierin verwendet, soll der Ausdruck Sequenz für eine subzelluläre Lokalisierung kollektiv irgendeine Form von Signal-, Ziel- oder Retentionssequenz, wie hierin definiert, bezeichnen. Signalsequenzen für ein Polypeptid, das zum Chloroplasten oder Mitochondrium gelenkt wird, sind weitgehend am Aminoterminus des Polypeptids lokalisiert. Signalsequenzen für ein Polypeptid, das zu den Glyoxysomen und Peroxisomen gelenkt wird, sind weitgehend in den carboxyterminalen Domänen des Polypeptids lokalisiert. Entsprechend wird targetierter Transport des GFP-Proteins mittels chemischem Verbinden in geeignetem Leserahmen oder funktionellem Verknüpfen/Binden der eine Signalsequenz codierenden Nucleotidsequenz mit/an der/die 5'- und/oder 3'-Region des GFP-Strukturgens, erreicht.
Eine mitochondriale Zielsequenz ermöglicht den Transport eines Proteins zu einem mitochondrialen Kompartiment. Typischerweise ist die mitochondriale Zielsequenz am Aminoterminus eines Polypeptids lokalisiert.
Eine Sekretionszielsequenz targetiert ein Polypeptid zum Export in den extrazellulären Raum durch das ER. Beispielsweise targetiert funktionelles Verknüpfen einer Nucleotidsequenz, die die sekretorische Zielsequenz der Gersten-α-Amylase 1 (BAA = "barley alpha amylase 1") codiert, an das 5'-Ende eines Strukturgens das codierte Protein zum Export in den Extrazellularraum.
Eine Zellwandzielsequenz targetiert ein Polypeptid zum Export aus der Zelle, jedoch wird das Polypeptid spezifisch in der Zellwand lokalisiert. Beispielsweise wird Zellwandlokalisierung eines Polypeptids durch funktionelles Verknüpfen einer BAA-codierenden Sequenz 5', und funktionelles Verknüpfen einer Nucleotidsequenz, die einen Anteil des Mais-Hydroxyprolinreichen Glycoproteins codiert, 3' an ein Gen, das das Polypeptid codiert, bewerkstelligt. Steifel et al., Plant Cell 2: 785–793 (1990).
Eine vakuoläre Signalsequenz ermöglicht den Transport eines Proteins zu der Vakuole. Beispielsweise wird vakuoläres "Targeting" durch Fusionieren der sekretorischen Signalsequenz von BAA an den Aminoterminus des Proteins, und einer Sequenz, die für eine vakuoläre Signalsequenz codiert, an den Carboxyterminus, bewerkstelligt. Der Transport eines Polypeptids zur Vakuole wird deshalb mittels des funktionellen Verbindens einer Nucleotidsequenz, die BAA codiert, 5', und einer Nucleotidsequenz, die eine vakuoläre Signalsequenz codiert, 3' an ein Gen, das ein Polypeptid codiert, erreicht. Alternativ wird vakuoläres "Targeting" durch Konstruieren einer Nucleotidsequenz, die in 5'- bis 3'-Richtung Nucleotidsequenzen umfasst, die für eine Vakuolen-Signalsequenz, BAA und ein Polypeptid, codieren, erreicht.
Eine Endoplasmatisches Retikulum-Retentionssequenz targetiert ein Polypeptid zur Lokalisierung im Lumen des endoplasmatischen Retikulums. Beispielsweise wird ein Polypeptid zur Retention im endoplasmatischen Retikulum durch Anfügen der BAA-Sequenz am Aminoterminus und einer endoplasmatischen Retikulumsignalsequenz am Carboxyterminus des Polypeptids targetiert.
Eine Kernzielsequenz ermöglicht den Transport eines Polypeptids zum Zellkern bzw. Nucleus. Typischerweise ist die Kernsignalsequenz am Aminoterminus eines Polypeptids lokalisiert. Um das Kern-targetierte Protein im Zellkern zurückzubehalten, kann es notwendig sein, das Molekulargewicht des Proteins mittels Fusion an ein Protein ohne Beziehung dazu an den Carboxyterminus des targetierten Proteins zu erhöhen. Beispielsweise wurde GFP im Zellkern durch funktionelles Verknüpfen einer Nucleotidsequenz, die eine Kernsignalsequenz codiert, 5' und einer Nucleotidsequenz, die Mais-Acetolactatsynthase codiert, 3' an ein Gen, das ein Polypeptid codiert, zurückgehalten.
Eine peroxisomale Zielsequenz ermöglicht den Transport eines Polypeptids in das Peroxisom. Typischerweise ist die peroxisomale Signalsequenz ein Tripeptid, das am Carboxyterminus eines Polypeptids lokalisiert ist.
Eine Chloroplastenzielsequenz ermöglicht den Transport eines im Kern codierten Proteins zu einem Chloroplastenkompartiment. Typischerweise ist die Chloroplastensignalsequenz am Aminoterminus eines Polypeptids lokalisiert. Entsprechend wird Transport eines Polypeptids zu einem Chloroplastenkompartiment mittels funktionellem Verknüpfen der Nucleotidsequenz, die eine Chloroplastensignalsequenz codiert, an die 5'-Region eines Gens, das ein Polypeptid codiert, bewerkstelligt.
Ein isoliertes DNA-Molekül ist ein Fragment von DNA, das nicht in die genomische DNA eines Organismus integriert ist.
Komplementäre DNA (cDNA) ist ein einzelsträngiges DNA-Molekül, das von einer mRNA-Matrize durch das Enzym reverse Transkriptase gebildet wird. Typischerweise wird ein zu Teilen der mRNA komplementärer Primer für die Initiation der reversen Transkription eingesetzt. Der Fachmann verwendet den Ausdruck "cDNA" außerdem, um sich auf ein doppelsträngiges DNA-Molekül, das aus einem solchen einzelsträngigen DNA-Molekül und seinem komplementären DNA-Strang besteht, zu beziehen.
Der Ausdruck Expression bezieht sich auf die Biosynthese eines Genprodukts. Beispielsweise schließt Expression im Fall eines Strukturgens die Transkription des Strukturgens in mRNA und die Translation von mRNA in ein oder mehrere Polypeptide ein.
Ein Klonierungsvektor ist ein DNA-Molekül, wie z. B. ein Plasmid, Cosmid oder Bakteriophage, der die Fähigkeit aufweist, autonom in einer Wirtszelle zu replizieren. Klonierungsvektoren enthalten typischerweise eine oder eine kleine Anzahl von Restriktionsendonuclease-Erkennungsstellen, bei denen Fremd-DNA-Sequenzen auf eine bestimmbare Art und Weise, ohne Verlust einer essentiellen biologischen Funktion des Vektors, ebenso wie ein Markergen, das zur Verwendung bei der Identifizierung und Selektion von mit dem Klonierungsvektor transformierten Zellen geeignet ist, eingefügt werden können. Markergene schließen typischerweise z. B. Gene ein, die für Tetracyclinresistenz, Ampicillinresistenz oder Kanamycinresistenz sorgen.
Ein Expressionsvektor ist ein DNA-Molekül, das ein Gen umfasst, das in einer Wirtszelle exprimiert wird. Typischerweise wird Genexpression unter die Kontrolle gewisser regulatorischer Elemente, einschließlich konstitutiver oder induzierbarer Promotoren, gewebespezifischer regulatorischer Elemente und Enhancer, gestellt. Von solch einem Gen sagt man, dass es funktionell mit den regulatorischen Elementen verknüpft bzw. funktionell an die regulatorischen Elemente gebunden ist.
Transformation schließt das Einführen genetischen Materials in Pflanzenzellen ein, das in chromosomaler Integration und stabiler Vererbbarkeit durch Meiose resultiert. Transformation schließt außerdem das Einführen genetischen Materials in Pflanzenzellen, in der Form von Pflanzenvirenvektoren, die epichromosomale Replikation und Genexpression einschließen, ein, das verschiedene Eigenschaften bezüglich meiotischer Stabilität aufweisen kann.
Ein Fremdgen bezeichnet in der vorliegenden Erfindung eine DNA-Sequenz, die funktionell verknüpft mit wenigstens einem heterologen regulatorischen Element ist.
Ein rekombinanter Wirt kann irgendeine prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein, die entweder einen Klonierungsvektor oder einen Expressionsvektor enthält. Dieser Ausdruck schließt außerdem solche prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen ein, die gentechnisch verändert worden sind, um das klonierte Gen/die klonierten Gene im Chromosom oder Genom der Wirtszelle zu enthalten.
Eine transgene Pflanze ist eine Pflanze, die ein oder mehrere Pflanzenzellen aufweist, die einen Expressionsvektor enthalten.
Ein grün-fluoreszierendes Protein (GFP) oder ein funktionales Fragment eines GFP ist im Stande eine grüne Fluoreszenz zu produzieren. GFP absorbiert im UV- bis blauen Bereich mit einem Peak bei 395 nm und emittiert im Grünen mit einem Peak bei 510 nm. Die "rotverschobene" ("red-shifted") Version von GFP ist eine modifizierte Version von GFP, die zwischen 480 und 490 nm absorbiert und im Grünen mit einem Peak bei 510 nm emittiert. Rotverschobenes GFP wird als GFPr abgekürzt. Das "blau-fluoreszierende Protein" ("blue fluorescent protein") ist eine modifzierte Version von GFP, die um die 380 nm absorbiert und im Blauen mit einem Peak bei ungefähr 445 nm emittiert. Blau-fluoreszierendes Protein wird als BFP abgekürzt. GFP_m ist eine Nucleotidsequenz, die für GFP codiert, wobei die DNA-Sequenz, basierend auf der Codonpräferenz in Mais modifiziert worden ist (1).
Zwei Nucleinsäuremoleküle werden angesehen, eine substantielle Sequenzähnlichkeit zu haben, wenn ihre Nucleotidsequenzen eine Ähnlichkeit von wenigstens 50% teilen. Sequenzähnlichkeitsbestimmungen können beispielsweise unter Verwendung des FASTA-Programms (Genetics Computer Group; Madison, WI) durchgeführt werden. Alternativ können Sequenzähnlichkeitsbestimmungen unter Verwendung von BLAST ("Basic Local Alignment Search Tool") des "Experimental GENIFO(R) BLAST Network Service" durchgeführt werden. Siehe Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990). Außerdem siehe Pasternak et al., "Sequence Similarity Searches, Multiple Sequence Alignments, and Molecular Tree Building", in METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Glick et al., (Herausg.), Seiten 251–267 (CRC Press 1993).
2. REDUZIEREN VON GFP-TOXIZITÄT IN TRANSFORMIERTEN PFLANZEN
Es ist vorgeschlagen worden, dass oxidativer Stress, assoziiert mit GFP-Fluoreszenz, zelluläre Toxizität verursacht. Haseloff et al., TIG 11: 328–329 (1995). Wenn GFP als ein durchmusterbarer Marker für die Pflanzentransformation, sowie als ein Reportergen zur Detektion von Genexpression, verwendbar sein soll, müssen Strategien zum Reduzieren von GFP-Toxizität verfügbar sein. Das GFP-codierende Gen kann funktionell mit einem induzierbaren Promotor verknüpft werden, so dass GFP transient exprimiert und transformierte Zellen identifiziert werden können. Alternativ kann das für GFP codierende Gen funktionell mit einer Signalsequenz für das "Targeting" zu einer Organelle oder einem subzellulären Kompartiment oder für die Sekretion zum Apoplasten verknüpft werden, wo GFP für die Zelle nicht-toxisch ist.
Oxidativer Stress kann durch Transformieren GFP-enthaltender Zellen mit einem Enzym, das als ein Sauerstofffänger dient, verbessert werden. Derartige Enzyme sind im Fachgebiet gut bekannt. Beispielsweise können Gene, die für das Enzym Superoxiddismutase codieren, gegen den primären oxidativen Stress schützen, der mit GFP-Fluoreszenz assoziiert ist. Balzan et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 92: 4219–4223 (1995). Andere Enzyme, die an der Antwort auf oxidativen Stress beteiligt sind, wie z. B. Ascorbatperoxidase oder Glutathion-S-transferase, könnten helfen, Sekundäreffekte in der Zelle zu mildern. Conklin, Plant Physiol. 109: 203–212 (1995). Spezifischer, kann oxidativer Stress durch Transformieren von Zellen mit einem DNA-Konstrukt, das Gene, die GFP und SOD codieren, enthält, verbessert werden.
Alternativ kann das GFP-codierende Gen im Rahmen ("in frame") an das SOD-codierende Gen fusioniert werden. Zellen, die mit diesem DNA-Konstrukt transformiert werden, produzieren ein Fusionsprotein, das Zellen dazu bringt, in Gegenwart von UV- bis blauem Licht zu fluoreszieren und SOD-Aktivität zu exprimieren.
Die Toxizität von GFP in transformierten Pflanzen kann durch, auf die Detektion transformierter Zellen oder Sektoren folgendes, Ausschneiden der durchmusterbaren Markergene eliminiert werden. Das FLP/FRT-System wird in Verbindung mit GFPm als ein sichtbarer praktikabler Marker für die FRT-Exzision verwendet. Das FLP/FRT-System wurde in Suspensionsmaiszellen unter Verwendung von GUS-Expression als einem Indikator für FRT-Exzision gezeigt. Lysnik et al., NAR 21: 969–975 (1993). Beispielsweise werden Pflanzenzellen mit einem DNA-Konstrukt beschossen, dass das GFP-Gen, flankiert von FRT-Sequenzen, sowie ein interessierendes Fremd- oder agronomisches Gen, enthält. Das GFP-Gen kann funktionell verknüpft mit einem konstitutiven Promotor oder einem induzierbaren Promotor sein. Zudem kann das GFP-Gen funktionell mit einer Signalsequenz verknüpft sein. Stabile Transformanten werden mittels Durchmustern nach GFP detektiert.
Transgene Callusstücke werden auf Medium ausgebreitet und ein zweites Mal mit einem FLP-Recombinasekonstruktur beschossen. Callus wird periodisch unter UV- bis blauer Beleuchtung beobachtet, um Zellen zu dektieren, die nicht mehr länger GFP exprimieren. Callusstücke, die nicht länger GFP exprimieren, werden regeneriert und auf die Expression des Fremd- oder agronomischen Gens hin analysiert. Agronomisch verwendbare transgene Pflanzen, die kein Markergen enthalten, werden dadurch hergestellt.
Die Sensitivität des Durchmusterungsverfahrens kann durch Platzieren zweier Markergene zwischen die FRT-Sequenzen weiter erhöht werden. Beispielsweise werden Pflanzenzellen mit einem DNA-Konstrukt beschossen, das die PAT- und GFP-Gene, flankiert von FRT-Sequenzen, und ein Fremd- oder agronomisches Gen, enthält. Stabile Transformanten werden auf Bialaphos-enthaltendem Medium wiedergewonnen und positive GFP-Expression wird bestätigt. Der transformierte Callus wird dann mit FLP beschossen. Der Callus wird dann 2 bis 6 Wochen lang ohne Selektion angezogen, bis klare GFP-freie Sektoren ("GFP-null sectors") identifiziert werden können. Diese Sektoren können auf Bialaphos/Chlorphenolrot-Vielvertiefungstestplatten ("multiwell test plates") überführt werden, um Bialaphossensitivität zu bestätigen (d. h. innerhalb von 3 bis 5 Tagen). Callusteile, die nicht länger GFP oder PAT exprimieren, werden regeneriert und auf die Expression des Fremd- oder agronomischen Gens hin analysiert. Dies erlaubt Rückgewinnung agronomisch verwendbarer Transformanten ohne irgendwelche Markergene im Endprodukt.
Gleichermaßen kann auch das Ac/Ds-System von Mais in transgenen Pflanzen verwendet werden, um das durchmusterbare Markergen, das zusammen mit einem Fremd- oder agronomischen Gen transformiert wird, auszuschneiden. Mobilisierung von Ac und/oder Ds ist in verschiedenen Pflanzen, wie z. B. Tomate, Tabak und Arabidopsis gezeigt worden. Yoder et al., In "Tomato Technology", Alan R. Liss, Inc., Seiten 189–198 (1987); Yoder et al., US-Patent Nr. 5,225,341; Baker et al., EMBO J. 6: 1547–1554 (1987) und Lawson et al. Mol. Gen. Genet., 245: 608–615 (1994).
Gleichermaßen könnte außerdem das cre/lox-Rekombinasesystem von Bakteriophage P1 in Verbindung mit GFP verwendet werden. Die Exzision von Transgenen in Pflanzen unter Verwendung des cre/lox-Systems wurde zuerst in Tabak gezeigt. Odell et al., Mol. Gen. Genet., 223: 369–378 (1990) und Dale und Ow, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10558–10562 (1991). Ähnlich zu den oben beschriebenen FLP- und Ac-Systemen liefert GFP-Expression einen effizienten, leicht auswertbaren ("scorable") Phänotyp zum Kontrollieren der Exzision.
3. ISOLIERUNG DER GFP-CODIERENDEN NUCLEOTIDSEQUENZEN
Peptidsequenzen gereinigter GFPs werden verwendet, um degenerierte Oligonucleotidprimer für Polymerasekettenreaktionen und Genklonierung zu entwerfen. Proteinextrakte können von Cnidaria-Zellen durch im Fachgebiet bekannte Standardverfahren hergestellt werden. Siehe beispielsweise Harlow und Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, (1988). In einer bevorzugten Ausführungsform, werden Cnidaria-Zellen in einen Puffer extrahiert, und die Extrakte in Membran- und lösliche Fraktionen getrennt. Jede Fraktion wird auf Grünfluoreszenz-Aktivität in Gegenwart von blauem Licht geprüft.
Fraktionen, die GFP-Aktivität enthalten, werden dann weiter gereinigt, um zu bestimmen, welche Bestandteile für die Aktivität verantwortlich sind. Reinigung der aktiven Fraktionen kann durch im Fachgebiet bekannte Verfahren durchgeführt werden. Siehe beispielsweise PROTEIN PURIFICATION METHODS – A PRACTICAL APPROACH, Harris et al., Herausg. (IRL Press, Oxford, 1989). Extrakte, zubereitet wie oben beschrieben, werden der Reihe nach durch Größenausschluss-Chromatographie, isoelektrische Fokussierung, HPLC-Größenausschluss-Chromatographie und Chromatographie auf einer Affinitätssäule gereinigt. Fraktionen, welche GFP-Aktivität zeigen, können durch SDS-PAGE-Analyse weiter analysiert werden, um die ungefähre Molekülmasse der aktiven Komponente zu bestimmen.
Gereinigte GFPs, präpariert durch die oben beschriebenen Verfahren, können unter Verwendung von im Fachgebiet gut bekannten Verfahren, beispielsweise unter Verwendung eines Gasphasenpeptid-Sequenziergeräts (Applied Biosystems, Foster City, CA) sequenziert werden. Um von der Peptidsequenz so viel wie möglich zu bestimmen, wird bevorzugt, dass die Proteine der vorliegenden Erfindung in kleinere Fragmente gespalten werden, die geeigneter für die Gasphasensequenzanalyse sind. Dies kann durch Behandlung eines gereinigten GFPs mit selektiven Peptidasen, und in einer besonders bevorzugten Ausführungsform mit Endoproteinase Lys-C (Boehringer) erreicht werden. Die so hergestellten Fragmente können durch HPLC-Umkehrphasenchromatographie getrennt werden.
Die wie oben bestimmten Peptidsequenzen der Proteine können verwendet werden, um die DNA-Sequenz, die für das Protein codiert, zu bestimmen. Verfahren, um diese Bestimmung durchzuführen, sind im Fachgebiet gut bekannt. Siehe beispielsweise Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. Auflage (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Peptidsequenzen verwendet, um degenerierte Oligonucleotidprimer für Polymerasekettenreaktionen zu entwerfen. Jeder Satz degenerierter Primer wird vorzugsweise jede mögliche DNA-Sequenz, die für die entsprechenden Peptidsequenzen codiert, enthalten. Primersätze werden sowohl in der Sinn-, als auch Gegensinnorientierung ("sense and antisense orientation") hergestellt. Geeignete Oligonucleotidprimer können unter Verwendung kommerzieller Synthetisiergeräte, wie jene, bereitgestellt von Applied Biosystems (Foster City, CA), synthetisiert werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform schließen die Primer zusätzliche Nucleotidsequenzen ein, die Restriktionsendonucleasenspaltstellen enthalten. Die Gegenwart solcher Stellen erlaubt das gerichtete Klonieren von PCR-Produkten in geeignete Klonierungsvektoren nach Behandlung mit einem geeigneten Restriktionsenzym. Siehe Finney, "Molecular Cloning of PCR Products" in CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel et al., Herausg. (John Wiley & Sons, New York, 1987), S.15.7.1.
Matrizen-DNA für die PCR kann von geeigneten Cnidaria-Zellen oder Geweben unter Verwendung im Fachgebiet gut bekannter Verfahren präpariert werden. Siehe Sambrook et al., supra. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Wirtszellen unter flüssigem Stickstoff zerrieben und mRNA wird unter Verwendung eines kommerziell verfügbaren Kits (Pharmacia, Piscataway, NJ) extrahiert.
Die mRNA-Präparation kann dann als eine Matrize für cDNA-Synthese durch Standardverfahren unter Verwendung von Poly(dT)- oder Zufallshexamerprimern verwendet werden. Siehe Sambrook et al., supra. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird cDNA-Synthese unter Verwendung eines kommerziell verfügbaren Kits (Pharmacia) durchgeführt.
Die cDNA kann dann direkt für PCR unter Verwendung des Verfahrens nach Saiki et al., Science 239: 487 (1988) verwendet werden. Die cDNA wird außerdem verwendet, um eine cDNA-Bibliothek durch Standardverfahren zu erstellen. Siehe Sambrook et al., supra. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die cDNA unter Verwendung eines kommerziell verfügbaren Kits (Promega, Madison, WI) in Bakteriophagenpartikel verpackt. Die verpackte cDNA wird dann in E. coli transfiziert, um eine cDNA-Bibliothek herzustellen.
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform kann genomische DNA von Cnidaria-Zellen oder -geweben als die Matrizen-DNA für die PCR verwendet werden. Genomische DNA kann durch Standardverfahren präpariert werden, und dann kann PCR verwendet werden, um doppelsträngige DNA-Moleküle herzustellen, um die cDNA-Bibliothek und die genomische DNA nach dem Gen/den Genen, das/die für GFP codiert/codieren, zu sondieren. In einer bevorzugten Ausführungsform werden degenierte Primer erstellt, die den Termini der längsten, durch Peptidsequenzierung bestimmten, Peptidsequenz entsprechen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden Primer in einer PCR mit Erststrang-cDNA als Matrize verwendet, um die für das Peptid codierende DNA zu amplifizieren. PCR wird unter Standardbedingungen durchgeführt. Sie Sakai et al., supra.
PCR-Amplifikationsprodukte werden durch Polyacrylamidgelelektrophorese unter Verwendung von Standardverfahren analysiert. Falls ein Amplifikationsprodukt der erwarteten Größe (basierend auf der Peptidsequenz) gefunden wird, wird das Produkt mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, in einen Klonierungsvektor ligiert und durch Standardverfahren kloniert. Siehe Sambrook et al., supra. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Klone sequenziert, um zu bestätigen, dass Sequenzen entsprechend den erwarteten Peptidsequenzen anwesend sind.
Sobald die DNA-Sequenz, die für das Peptid codiert, bekannt ist, kann sie verwendet werden, um nicht-degenerierte Primer, die dieser Sequenz entsprechen, zu erstellen, die wiederum Restriktionsenzymerkennungssequenzen enthalten, um beim Klonieren von DNA-Produkten hilfreich zu sein. Diese Primer werden in Kombination mit degenerierten Primern, die anderen Peptidsequenzen entsprechen, verwendet, um PCR-Amplifikationsprodukte zu erzeugen, die kloniert werden können und dann wie oben analysiert werden können. Auf diese Weise können Fragmente der Gensequenz des Proteins bestimmt werden. Alternative Verfahren zum Durchführen dieser PCR-Analyse schließen die Verwendung der 5'- oder 3'-RACE-Verfahren unter Verwendung kommerziell verfügbarer Kits, wie z. B. jener hergestellt durch Life Technologies (Gaithersburg, MD) oder Clontech (Palo Alto, CA), ein. Primer für dieses Verfahren werden gemäß den Herstelleranweisungen ausgewählt.
Wie oben hergestellte Genfragmente werden durch Restriktionsenzymverdau aus dem Klonierungsvektor ausgeschnitten, durch konventionelle Verfahren mit ³²P markiert und als Sonden verwendet, um das vollständige Gen, das für das Protein codiert, von innerhalb einer cDNA- oder genomischen Bibliothek zu identifizieren. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Sonde derart ausgewählt, dass sie lang genug ist, um Hybridisierungsspezifität zu gewährleisten, während sie kurz genug verbleibt, um angemessene Hybridisierungsraten an das Zielgen zu erlauben.
Eine genomische Cnidaria-DNA-Bibliothek kann durch im Fachgebiet gut bekannte Mittel hergestellt werden. Siehe beispielsweise Slightom et al. "Construction of λ Clone Banks", in METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Glick et al. (Herausg.), Seiten 121–146 (CRC Press, 1993). Genomische DNA kann aus Cnidaria-Gewebe beispielsweise durch Lysieren von Pflanzengewebe mit dem Detergens Sarkosyl, Verdauen des Lysats mit Proteinase K, Klären unlöslicher Debris aus dem Lysat durch Zentrifugation, Fällen der Nucleinsäure aus dem Lysat unter Verwendung von Isopropanol, und Reinigen resuspendierter DNA auf einem Cäsiumchloriddichtegradienten, isoliert werden. Siehe beispielsweise Ausubel et al. (Herausg.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Seiten 2.3.1–2.3.3 (Wiley Interscience 1990) ["Ausubel"].
DNA-Fragmente, die für die Herstellung einer genomischen Bibliothek geeignet sind, können durch das Zufallsscheren genomischer DNA oder durch teilweisen Verdau genomischer DNA mit Restriktionsendonuclasen erhalten werden. Siehe beispielsweise Ausubel auf den Seiten 5.3.2–5.4.4, und Slightom et al., supra. Genomische DNA-Fragmente können in einen Vektor, wie z. B. einen Bakteriophagen oder Cosmid-Vektor gemäß konventioneller Verfahren, wie z. B. der Verwendung von Restriktionsenzymverdau, um geeignete Termini bereitzustellen, der Verwendung von alkalischer Phosphatasebehandlung, um das unerwünschte Verbinden von DNA-Molekülen zu vermeiden, und Ligation mit geeigneten Ligasen, eingefügt werden. Verfahren für derartige Manipulation werden von Slightom et al., supra, offenbart, und sind im Fachgebiet gut bekannt. Siehe außerdem Ausubel auf den Seiten 3.0.5–3.17.5.
Durchmustern der cDNA- oder genomischen Bibliotheken wird durch konventionelle Verfahren durchgeführt. Siehe Sambrook et al., supra. Klone, die mit der Sonde hybridisieren, werden gereinigt und ihre Sequenzen bestimmt. Um die Sequenzierung zu erleichtern, können in den Klonen durch Verwendung von Standardprotokollen oder durch kommerziell verfügbare Kits, wie z. B. "Erase-a-base" (Promega, Madison, WI) oder "The Deletion Factory" (Life Technologies, Gaithersburg, MD) verschachtelte ("nested") Deletionen erzeugt werden, wobei den Herstelleranweisungen Folge geleistet wird. Die erhaltenen Sequenzen werden auf die Anwesenheit von offenen Leserahmen durch konventionale Verfahren analysiert, und um nachzuprüfen, ob die gesamte Gensequenz gefunden worden ist. In einer bevorzugten Ausführungsform werden cDNA-Bibliotheken sowohl durch Zufallshexamer- als auch Poly(dT)-Priming von Proben erstellt, und werden verwendet, um die Chancen des Auffindens der kompletten codierenden Sequenz des gewünschten Gens zu maximieren.
Sobald die gesamte codierende Sequenz des Gens für GFP bestimmt worden ist, kann das Gen in ein geeignetes Expressionssystem eingeführt werden. Das Gen kann in einer beliebigen Zahl verschiedener rekombinanter DNA-Expressionssystems exprimiert werden, um große Menge des Proteins zu erzeugen, die dann gereinigt werden können.
4. CHEMISCHE SYNTHESE VON FÜR GFP CODIERENDEN GENEN
Sobald die Aminosäuresequenz eines GFP bekannt ist, kann ein für dieses GFP codierendes Gen synthetisiert werden. Zudem kann die Nucleotidsequenz eines synthetischen, GFP-codierenden, Gens für die Expression in Pflanzen durch Modifizieren der Codonverwendung, um von Pflanzen bevorzugte Codons einzuschließen, optimiert werden. Siehe beispielsweise Murray et al., NAR 17: 477 (1989). Sogar noch spezifischer kann die Nucleotidsequenz eines synthetischen, GFP-codierenden Gens zur Expression in monocotyledonen oder dicotyledonen Pflanzen optimiert werden. Siehe beispielsweise Campbell et al., Plant Physiol. 92: 1 (1990).
GFP-codierende Gene können beispielsweise durch Synthetisieren der Gene mit langen, sich wechselseitig anlagernden Oligonucleotiden ("mutually priming long oligonucleotides") erhalten werden. Siehe beispielsweise Ausubel auf den Seiten 8.2.8 bis 8.2.13. Außerdem siehe Wosnick et al., Gene 60: 115 (1987). Außerdem stellen gegenwärtige Techniken unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion die Fähigkeit zum Synthetisieren von Genen von bis zu 1,8 Kilobasen Länge bereit. Adang et al., Plant Molec. Biol. 21: 1131 (1993); Bambot et al., PCR Methods and Applications 2: 266 (1993).
5. IDENTIFIKATION FUNKTIONALER FRAGMENTE DES GFP
DNA-Klone können unter Verwendung einer Vielfalt von Techniken, wie z. B. Restriktionsanalyse, Southern-Analyse, Primerverlängerungsanalyse und DNA-Sequenzanalyse analysiert werden. Zum Beispiel kann Primerverlängerungsanalyse oder S1-Nucleaseschutzanalyse ("S1 nuclease protection analysis") verwendet werden, um den mutmaßlichen Transkriptionsstartort des klonierten Gens zu lokalisieren. Ausubel auf den Seiten 4.8.1–4.8.5; Walmsley et al., "Quantitative and Qualitative Analysis of Exogenous Gene Expression by the S1 Nuclease Protection Assay" in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 7: GENE TRANSFER AND EXPRESSION PROTOCOLS, Murray (Herausg.), Seiten 271–281 (Humana Press Inc., 1991). Funktionale Fragmente des GFP-Proteins werden durch das Erzeugen grüner Fluoreszenz in Gegenwart von blauem UV-Licht identifiziert.
Die allgemeine Vorgehensweise derartiger funktionaler Analyse involviert das Subklonieren von DNA-Fragmenten eines genomischen Klons, cDNA-Klon oder einer synthetischen Gensequenz in einen Expressionsvektor, Einführen des Expressionsvektors in einen heterologen Wirt und Durchmustern, um grüne Fluoreszenz in Gegenwart von UV- bis blauem Licht nachzuweisen. Verfahren zum Erzeugen von Fragmenten eines cDNA- oder genomischen Klons sind gut bekannt. Varianten einer isolierten DNA, die für GFP codiert, können durch Deletieren, Addieren und/oder Substituieren von Nucleotiden bei den isolierten Nucleotiden, wie z. B. der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 1, hergestellt werden. Solche Varianten können beispielsweise durch Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese, Linker-Scanning-Mutagenese, Mutagenese unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion und dergleichen erhalten werden. Siehe beispielsweise Ausubel, Seiten 8.0.3–8.5.9. Außerdem siehe allgemein, McPherson (Herausg.), DIRECTED MUTAGENESIS: A PRACTICAL APPROACH, (IRL Press 1991). Folglich umfasst die vorliegende Erfindung außerdem DNA-Moleküle, die Nucleotidsequenzen umfassen, die substantielle Sequenzähnlichkeiten mit SEQ ID NO: 1 aufweisen und ein GFP codieren.
6. VERFAHREN ZUR PFLANZENTRANSFORMATION
Das auf GFP basierende Durchmusterungsverfahren der vorliegenden Erfindung nach Pflanzentransformation kann in Verbindung mit einem beliebigen Verfahren der Pflanzentransformation und -regeneration verwendet werden. Zahlreiche Verfahren zur Pflanzentransformation, einschließlich biologischer und physikalischer Pflanzentransformationsprotokolle, sind entwickelt worden. Siehe beispielsweise Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, B. R. Glick und J. E. Thompson (Herausg.) (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993), Seiten 67–88. Ferner sind Expressionsvektoren und in vitro-Kulturverfahren zur Pflanzenzell- oder Gewebetransformation und Regeneration von Pflanzen verfügbar. Siehe beispielsweise Gruber et al., "Vectors for Plant Transformation" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, B. R. Glick und J. E. Thompson, Herausg. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993), Seiten 89–119.
A. AGROBACTERIUM-VERMITTELTE TRANSFORMATION
Das am weitesten verwendete Verfahren zum Einführen eines Expressionsvektors in Pflanzen basiert auf dem natürlichen Transformationssystem von Agrobacterium. Siehe beispielsweise Horsch et al., Science 227: 1229 (1985). A. tumefaciens und A. rhizogenes sind für Pflanzen pathogene Bodenbakterien, die Pflanzenzellen genetisch transformieren. Die Ti- und Ri-Plasmide von A. tumefaciens bzw. A. rhizogenes tragen für die genetische Transformation der Pflanze verantwortliche Gene. Siehe beispielsweise C. I. Kado, Crit. Rev. Plant. Sci. 10: 1 (1991). Beschreibungen von Agrobacterium-Vektorsystemen und Verfahren zum Agrobacterium-vermittelten Gentransfer werden von Gruber et al., supra, Miki et al., supra und Moloney et al., Plant Cell Reports, 8: 238 (1989) bereitgestellt.
B. DIREKTER GENTRANSFER
Trotz der Tatsache, dass der Wirtsbereich für Agrobacterium-vermittelte Transformation weit ist, sind manche Hauptgetreidekulturarten und Naktsamer im Allgemeinen schwer zugänglich zu dieser Art des Gentransfers gewesen, obgleich kürzlich manch ein Erfolg bei Reis erreicht wurde. Hiei et al., The Plant Journal 6: 271–282 (1994). Mehrere Verfahren der Pflanzentransformation, kollektiv als direkter Gentransfer bezeichnet, sind als eine Alternative zu Agrobacterium-vermittelter Transformation entwickelt worden.
Ein allgemein anwendbares Verfahren der Pflanzentransformation ist Mikroprojektilvermittelte Transformation, wobei DNA auf der Oberfläche von Mikroprojektilen, die 1 bis 4 μm messen, getragen wird. Der Expressionsvektor wird in Pflanzengewebe mit einer biolistischen Vorrichtung, die die Mikroprojektile auf Geschwindigkeiten von 300 bis 600 m/s beschleunigt, welche ausreicht, um in Pflanzenzellwänden und -membranen einzudringen, eingeführt. Sanford et al., Part. Sci. Technol. 5: 27 (1987), J. C. Sanford, Trends Biotech. 6: 299 (1988), J. C. Sanford, Physiol. Plant 79: 206 (1990), Klein et al., Biotechnology 10: 268 (1992).
Ein weiteres Verfahren zum physikalischen Abliefern von DNA an Pflanzen ist die Beschallung von Zielzellen. Zhang et al., Bio/Technology 9: 996 (1991). Alternativ sind Liposomen- oder Sphäroblastenfusionen verwendet worden, um Expressionsvektoren in Pflanzen einzuführen. Deshayes et al., EMBO J., 4: 2731 (1985), Christou et al., Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 3962 (1987). Direkte Aufnahme von DNA in Protoplasten unter Verwendung von CaCl₂-Präzipitation, Polyvinylalkohol oder Poly-L-ornithin sind auch beschrieben worden. Hain et al., Mol. Gen. Genet. 199: 161 (1985) und Draper et al., Plant Cell Physiol. 23: 451 (1982). Elektroporation von Protoplasten und gesamten Zellen und Geweben ist auch beschrieben worden. Donn et al., In Abstracts of VIIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, S. 53 (1990); D'Halluin et al., Plant Cell 4: 1495–1505 (1992) und Spencer et al., Plant Mol. Biol. 24: 51–61 (1994).
Ein bevorzugtes Verfahren ist Mikroprojektil-vermittelter Beschuss unreifer Embryos. Die Embryos können auf der Seite der Embryonalachse bombardiert werden, um auf das Meristem zu einer sehr früheren Entwicklungsstufe zu zielen, oder auf der Seite des Scutellum bombardiert werden, um auf Zellen zu zielen, die typischerweise Callus und somatische Embryos formen. Das Zielen auf das Scutellum unter Verwendung von Projektilbeschuss ist denen im Fachgebiet der Getreidegewebekultur gut bekannt. Klein et al., Bio/Technol., 6: 559–563 (1988); Kartha et al., Plant Cell Rep. 8: 429–432 (1989); Sautter et al., Bio/Technol., 9: 1080–1085 (1991); Chibbar et al., Genome, 34: 435–460 (1991). Der scutellare Ursprung regenerierbaren Callus' aus Getreiden ist bekannt. Green et al., Crop Sci., 15: 417–421 (1975); Lu et al., TAG 62: 109–112 (1982); und Thomas und Scott, J. Plant Physiol. 121: 159–169 (1985). Das Zielen auf das Scutellum und anschließende Verwendung chemischer Selektion, um transgene Pflanzen wiederzugewinnen, ist in Getreiden gut etabliert. D/Halluin et al., Plant Cell 4: 1495–1505 (1992); Perl et al., MGG 235: 279–284 (1992); Cristou et al., Bio/Technol. 9: 957–962 (1991). Diese Literatur beschreibt DNA-"Targeting" des Scutellum und Rückgewinnung von transgenem/n Callus, Pflanzen und Nachkommenschaft, basierend auf einem chemischen Selektionssystem. Keine dieser Referenzen lehrt erfolgreiche Pflanzentransformation, wobei transformierte Zellen mit einem durchmusterbaren Marker, wie z. B. GUS, visualisiert werden.
Ein bevorzugtes Transformationsverfahren involviert Beschuss der scutellaren Oberfläche unreifer Embryonen, um eine fGP-Expressionskassette und beliebige andere cotransformierten Gene einzuführen. Embroys können 1 bis 48 Stunden lang mit einem hochosmotischen Medium vorbehandelt werden oder können auf einem hochosmotischen Medium 24 bis 48 Stunden lang nach Beschuss stehen gelassen werden, um Zellüberleben und Transformationshäufigkeiten zu verbessern. Unreife Embryos werden dann auf typischem Callus-induzierenden Medium ohne selektiven Wirkstoff kultiviert. Bei jedem Subkultur-Transfer, d. h., alle 2 Wochen, wird die Kultur unter Verwendung von UV-blauem Licht auf GFP-Fluoreszenz untersucht. Fluoreszierende Calli werden von nicht-fluoreszierendem Callus getrennt und bis zu dem Punkt kultiviert, an dem Pflanzen durch Standardmedium-Progressionen regeneriert werden können.
Viele beispielhafte Variationen im Hinblick auf Zielzellen und Gewebekulturrouten, die mit GFP auf diese Art und Weise verwendet werden könnten, sind im Fachgebiet bekannt. Manche dieser Variationen beinhalten das Einführen von GFP-Expression in Protoplasten, Suspensionszellen, Typ II-Callus und Typ I-Callus, wie in Morocz et al., Theor. Appl. Genet. 80: 721–726 (1990), Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603–618 (1990), Fromm et al., Bio/Technol. 8: 833–839 (1990) und D'Halluin et al., Plant Cell 4: 1495–1505 (1992) beschrieben. Mikrosporen und von Mikrosporen stammender embryogener Callus stellen außerdem eine denkbare alternative Ziel/Kultivierungsroute für die Verwendung von GFP-Durchmustern, um Transformanten zurückzugewinnen, dar. Siehe Sun et al., Plant Cell Rep. 8: 313–316 (1989) und Mitchell et al., J. Plant Physiol. 37: 530–536 (1991). Außerdem wird erwartet, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung auch auf eine beliebige dicotyledone Art anwendbar ist, die dafür bekannt ist, ein Callusstadium aufzuweisen, beispielsweise Tabak, Raps ("canola") oder Sojabohne.
Im Fall des Maismeristemziels bedingt das Verfahren selektive Vergrößerung transgener Sektoren zu genetischer Homogenität hin in Zellschichten, die zu Keimbahntransmission beitragen. Dieses Verfahren wird in gleichzeitig anhängiger US-Patentanmeldung 08/483,091, die hierin durch Referenz eingeschlossen ist, beschrieben und umfasst die Schritte: (A) Einführen von Fremd-DNA in ein Meristem, das nicht von Blattscheide-Blättern eingeschlossen ist; (B) Induzieren der Umgestaltung des Meristems, um die Größe des transgenen Sektors zu vergrößern, wodurch die Wahrscheinlichkeit, dass ein transgener Sektor zur Keimbahntransmission beitragen wird, erhöht wird; und (C) das Aussetzen des Meristems gegenüber Bedingungen, unter denen es sich differenziert, um einen Setzling zu bilden, wobei der Setzling den transgenen Sektor enthält oder homogen mit der Fremd-DNA transformiert ist, so dass der Setzling zu einer transformierten Getreidepflanze herangezogen werden kann, die die Fremd-DNA an die Nachkommenschaft übertragen wird. Die Fremd-DNA kann in eine Vielzahl von Meristemen eingeführt werden, von denen sich wenigstens manche in Schritt (C) differenzieren, um eine Vielzahl von Setzlingen auszubilden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird Reorganisation durch wenigstens eine Manipulation, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus (i) Auferlegen eines nicht-lethalen Selektionsdrucks auf die Meristeme, (ii) mechanisch-induzierte Meristemreorganisation, und (iii) hormoninduzierte Sprossvermehrung, bewirkt. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die Bedingungen in Schritt (C) dergestalt, dass die Meristeme Reifung und Pflanzendifferenzierung durchleben, um Sprossscheitel auszubilden, und das Verfahren umfasst ferner das Bewirken der Umgestaltung von Meristemgewebe in den Sprossscheiteln, um transformierte Sektoren zu vergrößern oder um L2-Periclinalchimären zu produzieren. Die Umgestaltung kann in dieser Hinsicht beispielsweise durch Aussetzen der Sprossscheitel gegenüber nicht-lethalem Selektionsdruck, so dass das transformierte Zellen in den Sprossscheiteln einen kompetitiven Wachstumsvorteil gegenüber nicht-transformierten Zellen aufweisen und der Anteil transformierter Zellen in den Sprossscheiteln erhöht wird, bewirkt werden. In einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner einen Schritt vor Schritt (B), z. B. vor Schritt (A), des selektiven Verwundens des Wachstumskegels. Ein Verfahren der vorliegenden Erfindung kann außerdem die weiteren Schritte (i) Herausschneiden einer Seitenknospe von oberhalb der Basis eines Blattes des Setzlings, wenn ein chimärer Sektor in einem wesentlichen Anteil des Blattes beobachtet wird, und dann (ii) Keimen der Seitenknospe in eine gesamte Pflanze oder Unterziehen der Seitenknospe einer Sprossvermehrung, umfassen.
Gleichermaßen stellt das Einführen GFP-codierender DNA in dicotyledone Meristeme ein wirksames Verfahren der Kartierung transgener Sektoren und Weiterverfolgen dieser in eine Keimbahn und in die Nachkommenschaft, bereit. Unter Verwendung reifer imbibierter Samen als Ausgangsmaterial wird das Meristem durch Entfernen der Keimblätter bloßgelegt, und wird DNA in Meristemzellen eingeführt. Ein bevorzugtes Verfahren zum Einführen von DNA in Meristemzellen ist Agrobacterium-vermittelte Zuführung, allerdings können andere DNA-Zuführungsverfahren, wie z. B. Beschuss mit DNA-beschichteten Partikeln oder Siliziumcarbidfaser ("silicon carbide fiber")-vermittelte Zuführung, verwendet werden. Kaeppler et al., Plant Cell Rep. 9: 415–418 (1990). Nach der Einführung von DNA werden die Meristemexplantate kultiviert.
Pflanzen können beispielsweise durch Entfernen des apicalen Meristems manipuliert werden, um Seiten- oder Zweitknospen zu stimulieren, die relativ zum Primärspross gesehen, größere transgene Sektoren aufweisen können. Blüten oberhalb transgener Sprosse werden bestäubt und die Nachkommenschaft wird auf transgene Präsenz und Expression hin analysiert. Eine Vielfalt von Ausgangsexplantaten kann Sprosse bei der Sonnenblume regenerieren und folglich alternative Ziele für die Zuführung GFP-codierender DNA und deren Transmission an die Nachkommenschaft darstellen. Diese schließen das Keimlingmeristem (wie oben), außerdem das Keimlingshypocotyl, das reife Keimblatt, das unreife Keimblatt, zygotische unreife Embryos, somatische Embryos und Primärblättchen ein. Siehe beispielsweise jeweils Greco et al., Plant Sci. Lett. 36: 73–77 (1984); Krauter et al., Helia 14: 117–122 (1991); Power Am. J. Bot. 74: 497–503 (1987); Krauter et al., Theor. Appl. Genet. 82: 521–525 (1991); Finer, Plant Cell Rep. 6: 372–374 (1987) und Greco et al., Plant Sci. Lett. 36: 73–77 (1984).
Auf ähnliche Art und Weise könnte GFP-Expression in anderen Dicotyledonenarten, wie z. B. Sojabohne, verwendet werden, um Sektoren zu kartieren und/oder Transformanten zu identifizieren und die Transgene bis zur Nachkommenschaft weiter zu verfolgen. Eine GFP-codierende Kassette und andere co-transformierte Gene können in Sojabohnen-Cotyledonarknotenzellen unter Verwendung von Agrobacterium eingeführt werden. Die Explantate werden auf Gambrog (B5)-Medium mit oder ohne Kanamycinselektion kultiviert. Ohne Selektion wird GFP-Expression verwendet, um transgene chimäre oder homogen transformierte Setzlinge zu identifizieren, welche bewurzelt sind, bis zur Reife kultiviert werden und im Gewächshaus bestäubt werden. Die Samen der Nachkommenschaft werden zur Analyse gesammelt. Die Verwendung von Cotyledonarknoten und Agrobacterium ist nur als Beispiel aufgezeigt, jedoch könnten andere Zielzellen und Kultivierungsverfahren mit GFP für Sojabohne verwendet werden. Zusätzlich zu den Cotyledonarknotenzellen sind sowohl reife als auch unreife Cotyledonen zur Transformation verwendet worden. Siehe Hinchee et al., Bio/Technol. 6: 915–922 (1988) und Parrott et al., Plant Cell Rep. 7: 615–617 (1989). Meristeme unreifer Sojabohnensamen-Embryonalachsen sind außerdem für Beschuss-vermittelte Sojabohnentransformation verwendet werden. Siehe Christou et al., Plant Physiol. 87: 671–674 (1988) und McCabe et al., Bio/Technol. 6: 923–926 (1988).
7. PROMOTOREN
A. INDUZIERBARE PROMOTOREN
Ein induzierbarer Promotor wird funktionell an eine GFP-codierende Nucleotidsequenz gebunden. Wahlweise wird der induzierbare Promotor funktionell an eine Nucleotidsequenz gebunden, die eine Signalsequenz codiert, die funktionell an eine Nucleotidsequenz, die GFP codiert, gebunden ist. Mit einem induzierbaren Promotor erhöht sich die Transkriptionsrate in Antwort auf ein induzierendes Mittel.
Ein beliebiger induzierbarer Promotor kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Siehe Ward et al., Plant Mol. Biol. 22: 361–366 (1993). Exemplarische induzierbare Promotoren schließen den aus dem ACE1-System, das auf Kupfer reagiert (Mett et al., PNAS 90: 4567–4571 (1993)); das In2-Gen aus Mais, das auf Benzolsulfonamidherbizid-Gegenmittel reagiert (Hershey et al., Mol. Gen. Genetics 227: 229–237 (1991) und Gatz et al., Mol. Gen. Genetics 243: 32–38 (1994)) oder den Tet-Repressor von Tn10 (Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227: 229–237 (1991)), ein. Ein besonders bevorzugter induzierbarer Promotor ist ein Promotor, der auf ein induzierendes Mittel reagiert, auf das Pflanzen normalerweise nicht reagieren. Ein beispielhafter induzierbarer Promotor ist der induzierbare Promotor von einem Steroidhormongen, dessen transkriptionale Aktivität durch ein Glucocorticosteroidhormon induziert wird. Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88: 10421 (1991).
Der Expressionsvektor umfasst einen induzierbaren Promotor, der funktionell an eine GFP-codierende Nucleotidsequenz gebunden ist. Der Expressionsvektor wird in Pflanzenzellen eingeführt, und vermutlich transformierte Zellen werden einem Induktor des induzierbaren Promotors ausgesetzt. Die Zellen werden auf die Anwesenheit von GFP-Protein hin mittels Beleuchten der Zellen mit UV- bis blauem Licht und Durchmustern nach der Gegenwart grüner Fluoreszenz, durchmustert.
B. GEWEBE-SPEZIFISCHE ODER GEWEBE-BEVORZUGTE PROMOTOREN
Ein Gewebe-spezifischer Promotor wird funktionell an eine Nucleotidsequenz, die GFP codiert, gebunden. Wahlweise wird der Gewebe-spezifische Promotor funktionell an eine Nucleotidsequenz, die eine Signalsequenz codiert, die funktionell an eine Nucleotidsequenz, die GFP codiert, gebunden ist, gebunden. Pflanzen, transformiert mit einem GFP-codierenden Gen, die funktionell an einen Gewebe-spezifischen Promotor gebunden sind, produzieren das GFP-Protein ausschließlich oder vorzugsweise in einem spezifischen Gewebe.
In der vorliegenden Erfindung kann ein beliebiger Gewebe-spezifischer oder Gewebe-bevorzugter Promotor verwendet werden. Beispielhafte Gewebe-spezifische oder Gewebe-bevorzugte Promotoren schließen einen Wurzel-bevorzugten Promotor, wie z. B. den von dem Phaseolingen (Murai et al., Science 23: 476–482 (1983) und Sengupta-Gopalan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3320–3324 (1985)); einen Blatt-spezifischen und Licht-induzierten Promotor, wie z. B. den von cab oder Rubisco (Simpson et al., EMBO J. 4(11): 2723–2729 (1985) und Timko et al., Nature 318: 579–582 (1985)); einen Antheren-spezifischen Promotor, wie z. B. den von LAT52 (Twell et al., Mol. Gen. Genet. 217: 240–245 (1989)); einen Pollen-spezifischen Promotor, wie z. B. den von Zm13 (Guerrero et al., Mol. Gen. Genet. 224: 161–168 (1993)) oder einen Mikrosporen-bevorzugten Promotor, wie z. B. den von apg (Twell et al., Sex. Plant Reprod. 6: 217–224 (1993)), ein.
Der Expressionsvektor umfasst einen Gewebe-spezifischen oder Gewebe-bevorzugten Promotor, der funktionell an eine Nucleotidsequenz, die GFP codiert, gebunden ist. Der Expressionsvektor wird in Pflanzenzellen eingeführt. Die Zellen werden auf die Anwesenheit von GFP-Protein hin mittels Beleuchten der Zellen mit UV- bis blauem Licht und Durchmustern nach Gegenwart von grüner Fluoreszenz, durchmustert.
C. KONSTITUTIVE PROMOTOREN
Ein konstitutiver Promotor wird funktionell an eine GFP-codierende Nucleotidsequenz gebunden oder der konstitutive Promotor wird funktionell an eine Nucleotidsequenz, die eine Signalsequenz codiert, die funktionell an eine Nucleotidsequenz gebunden ist, die GFP codiert, gebunden.
Viele verschiedene konstitutive Promotoren können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Beispielhafte konstitutive Promotoren schließen die Promotoren von Pflanzenviren, wie z. B. den 35S-Promotor aus CaMV (Odell et al., Nature 313: 810–812 (1985) und die Promotoren von solchen Genen wie Reisactin (McElroy et al., Plant Cell 2: 163–171 (1990)); Ubiquitin (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 12: 619–632 (1989) und Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675–689 (1992)); pEMU (Last et al., Theor. Appl. Genet. 81: 581–588 (1991)); MAS (Velten et al., EMBO J. 3: 2723–2730 (1984)) und Maishiston H3 (Lepetit et al., Mol. Gen. Genet. 231: 276–285 (1992) und Atanassova et al., Plant Journal 2(3): 291–300 (1992)), ein.
Der ALS-Promotor, ein XbaI/NcoI-Fragment, 5' zu dem Brassica napus ALS3-Strukturgen (oder eine Nucleotidsequenz, die eine substantielle Sequenzähnlichkeit mit dem XbaI/NcoI-Fragment aufweist), stellt einen besonders nützlichen konsitutiven Promotor dar. Gleichzeitig anhängige US-Patentanmeldung 08/409,297 von Pioneer Hi-Bred International.
Der Expressionsvektor umfasst einen konstitutiven Promotor, der funktionell an eine GFP-codierende Nucleotidsequenz gebunden ist. Der Expressionsvektor wird in Pflanzenzellen eingeführt, und vermutlich transformierte Zellen werden auf die Anwesenheit des GFP-Proteins hin mittels Beleuchtung der Zellen mit UV- bis blauem Licht und Durchmustern nach der Gegenwart grüner Fluoreszenz, durchmustert.
8. SIGNALSEQUENZEN ZUM TARGETIEREN VON PROTEINEN ZU SUBZELLULÄREN KOMPARTIMENTE
Transport von GFP zu einem subzellulären Kompartiment, wie z. B. dem Chloroplasten, der Vakuole, dem Peroxisom, dem Glyoxysom, der Zellwand oder dem Mitochondrium oder zur Sekretion in den Apoplasten, wird mittels funktionellem Binden der Nucleotidsequenz, die eine Signalsequenz codiert, an die 5'- und/oder 3'-Region eines Gens, das GFP codiert, erreicht. Zielsequenzen am 5'- und/oder 3'-Ende des Strukturgens kann während Proteinsynthese und Prozessierung bestimmen, wo das codierte Protein letztendlich kompatimentalisiert wird. Die Anwesenheit einer Signalsequenz lenkt ein Polypeptid entweder zu einer intrazellulären Organelle oder zu einem subzellulären Kompartiment oder zur Sekretion an den Apoplasten.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Zielsequenzen kann die Addition von Aminosäuren an das codierte Protein (Fusionieren von GFP an entweder ein anderes Protein, ein Proteinfragment oder ein Peptid) das Schicksal von GFP weiter beeinflussen. Beispielsweise reicht ein Kernlokalisierungssignal (NLS, "nuclear localization signal") allein nicht aus, um GFP im Nucleus zu akkumulieren. Das GFP-Protein ist hinreichend klein, dass es aus dem Nucleus frei in das Zytoplasma, wahrscheinlich durch die Kernporen, diffundiert. Die Fusion von GFP an ein hinreichend großes Protein erlaubt Akkumulation im Nucleus, wenn das GFP-Protein außerdem ein NLS am Aminoterminus enthält. GFP kann außerdem durch Fusionieren von GFP an Proteine, die normalerweise zum Nucleus zielgeleitet werden, zum Nucleus targetiert werden.
Die folgenden exemplarischen Signalsequenzen wurden zum "Targeting" des GFP verwendet. Jedoch umfasst die Erfindung die Verwendung einer beliebigen Signalsequenz oder Kombination von Signalsequenzen, um den Transport von GFP zu einem subzellulären Kompartiment oder dem Apoplasten, wo das Protein für die Zelle nicht-toxisch ist, aber detektiert werden kann, zu ermöglichen.
Spezifischer wird GFP in Pflanzenzellen exprimiert, die mit einem Expressionsvektor transformiert sind, der eine Nucleotidsequenz trägt, die für eine Signalsequenz/für Signalsequenzen codiert, welche ein Protein zu einem subzellulären Kompartiment oder zum Apoplasten lenkt, die funktionell an ein GFP-codierendes Gen gebunden ist. Dieses GFP-Genkonstrukt kann von einem konstitutiven Gewebe-spezifischen, Gewebe-bevorzugten oder induzierbaren Promotor exprimiert werden. GFP wird zu einem subzellulären Kompartiment oder dem Apoplasten, wo es für die Pflanzenzelle nicht-toxisch ist, transportiert. Zellen, illuminiert mit UV- bis blauem Licht, können delektiert werden, weil sie grüne Fluoreszenz emittieren. Die transformierten Zellen werden zur Regeneration selektiert. Falls der Expressionsvektor außerdem ein Gen trägt, das ein Fremdprotein oder agronomisch nützliches Protein codiert, kann die regenerierte Pflanze zur Produktion dieses Proteins verwendet werden.
A. PHP8080 – Ubi::CTP-GFPm
Eine Chloroplasten-Signalsequenz von dem Mais cab-m7 ist charaktisiert worden, und die Nucleotidsequenz ist unten gezeigt. Becker et al., Plant Mol. Biol. 20: 49 (1992). Die Signalsequenz enthält 21 Aminosäuren des cab-m7-Proteins hinausreichend über die Processing-Stelle (durch * markiert).
B. PHP8087 – CPN60::GFPm
Die mitochondriale Signalsequenz vom Maischaperonin 60-Gen ist unten gezeigt. P. S. Close, Arbeiten für den Grad eines "Masters" ("Master's Theses"), Iowa State University (1993). Die Signalsequenz enthält Intron 1 von cpn60II (durch – markiert) und enthält zwei Aminosäuren des cpn60II-Proteins jenseits der Processing-Stelle (durch markiert).
C. PHP8144 – Ubi::BAA-GFPm – Klonierte Sequenz enthält eine Aminosäure jenseits der Processing-Stelle (durch * markiert, Basen in Kleinbuchstaben zeigen die Linkersequenz)
Die Gersten alpha-Amylase 1-Signalsequenz ist unten gezeigt. C. Knox et al., "Structure and Organization of Two Divergent Alpha-Amylase Genes From Barley", Plant Mol. Biol. 9: 3–17 (1987). Die klonierte Sequenz enthält die Sequenz nur bis zur Processing-Stelle.
D. PHP8757 – Ubi::BAA-GFPm-BLVT – Signalsequenz beginnt bei *, Basen in Kleinbuchstaben zeigen die Linkersequenz
Die Gerstenlectinvakuolen-Signalsequenz ist unten gezeigt. Lerner et al., Plant Physiol. 91: 124–129 (1989).
E. PHP8758 – Ubi::BAA-GFPm-HDEL – Signalsequenz beginnt bei *, Basen in Kleinbuchstaben zeigen die Linkersequenz
Das endoplasmatische Retikulum HDEL-Retentionssignal von Mais b-70 ist unten gezeigt. Fontes et al., Plant Cell 3: 483–496 (1991).
F. PHP8759 – Ubi::BAA-SVT-GFPm – durch ^ markiert, Basen in Kleinbuchstaben zeigen die Linkersequenz
Die Süßkartoffel ("sweet potato")-Sporaminvakuolen-Signalsequenz ist unten gezeigt. Matsuoka et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 834 (1991). Die gezeigte Sequenz enthält vier zusätzliche Sporaminaminosäuren jenseits der Processing-Stelle (durch markiert).
G. PHP8882 – Ubi::GFPm-SKL – (durch * markiert)
Die Peroxisomen-Consensus-Signalsequenz, bezeichnet als SLK, ist unten gezeigt. Gould et al., J. Cell Biol 108: 1657 (1989).
H. Ubi::GR-GFPm
Die Mitochrondrien- und Chloroplasten-Signalsequenz für Erbsen-Glutathionreduktase ist unten gezeigt. Creissen et al., Plant J. 2: 129 (1991). Die gezeigte Sequenz enthält 20 zusätzliche Aminosäuren jenseits der putativen Processing-Stelle (durch markiert).
I. PHP9053 – Ubi::NLS-GFPm-MALS
Das Kernlokalisierungssignal von Affenvirus 40 (SV40, "simian virus 40") wurde an den N-Terminus von GFPm fusioniert. Um das Protein im Nukleus zurückzubehalten, wurde das Molekulargewicht von NLS-GFPm erhöht, indem eine Carboxy-terminale Addition des großen, unverwandten Proteins Mais-Acetolactatsynthase (ALS) vorgenommen wurde (Basen in Kleinbuchstaben zeigen Linkersequenz). D. Kalderon, B. Robers, W. Richardson und A. Smith, "A short amino acid sequence able to specify nuclear location", Cell 39: 499–509 (1984).
J. Ubi::GFPm-HRGP
Eine Carboxy-terminale Fusion eines Anteils der Mais-HRGP-codierenden Sequenz an GFPm wurde verwendet, um das GFP in der Zellwand zu verankern. Sequenz, codierend die Aminosäuren 177 bis 328, wurde verwendet. V. Stiefel, L. Ruiz-Avila, R. Raz, M. Valles, J. Gomez, M. Pages, J. Martinez-Izquierdo, M. Ludevid, J. Landale, T. Nelson und P. Puigdomenech, "Expression of a maize cell wall hydroxyproline-rich glycoprotein gene in early leaf and root vascular differentiation", Plant Cell 2: 785–793 (1990).
K. Ubi::GFPm-SOD
Superoxiddismutase-codierende Sequenz, fusioniert an GFPm. D. Alcendor, G. Chapman und B. Beaman, "Isolation, sequencing and expression of the superoxide dismutase-encoding gene (sod) of Nocardia asteroides strain GUH-2", Gene 164; 143–147 (1995).
9. DETEKTION VON GFP IN TRANSFORMIERTEN PFLANZENZELLEN
GFP wird in transformierten Pflanzenzellen durch spektrophotometrische Verfahren detektiert. Die transformierten Zellen oder Geweben werden auf die Anwesenheit von GFP-Protein mittels Beleuchten der Zellen mit UV- bis blauem Licht und Durchmustern nach der Gegenwart grüner Fluoreszenz, durchmustert.
Verbund- und Präpariermikroskope ("compound and dissecting microscopes") wurden mit geeigneten Filterkombinationen zur fluoreszenten Proteinanregung ausgestattet. Beleuchtung mit UV-blauem Licht (Anregen, um das Absorptionsmaximum von 395 nm herum oder um den geringeren Peak bei ungefähr 475 nm für GFP; um 480–490 nm für die rotverschobene Version und um 380 nm für das blau-fluoreszierende Protein) ist zur Visualisierung erforderlich. Eine von Hand gehaltene Lampe für Arbeit auf dem Labortisch ermöglicht ebenfalls gute Visualisierung. "Cut-off"-Filter oder Bandpass-Filter zwischen dem fluoreszierenden Gewebe und dem Beobachter (d. h. um das mittlere Objektiv oder die Okulare des Mikroskops herum, oder Hand gehalten vor den Augen, wenn man auf dem Labortisch arbeitet) reduziert Hintergrundautofluoreszenz von dem Gewebe außerordentlich. Für GFP und das rotverschobene GFP erlaubt dieser "Cutt-off"- oder Bandpass-Filter Licht zwischen 500–550 nm den Beobachter zu erreichen. Für das blau-fluoreszierende Protein erlaubte dieser Filter den Durchtritt von Licht von 420–450 nm. Verwendbare Filter und Wellenlängen sind nicht auf jene beschränkt, die oben beschrieben sind, und ferner ist eine allgemeine Beschreibung der optischen Eigenschaften dieses Systems verfügbar. Heim et al., Currently Biology 6: 178–182 (1996).
10. FREMDPROTEINGENE UND AGRONOMISCHE GENE
Mit den erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen kann ein Fremdprotein in kommerziellen Mengen produziert werden. Demnach ergeben die oben beschriebenen Selektions- und Propagationstechniken eine Vielzahl transgener Pflanzen, die auf gewöhnliche Art und Weise geerntet werden, und ein Fremdprotein wird dann aus einem interessierenden Gewebe oder von Gesamtbiomasse extrahiert. Proteinextraktion von Pflanzenbiomasse kann durch bekannte Verfahren erreicht werden, die beispielsweise von Heney und Orr, Anal. Biochem. 114: 92–6 (1981) erörtert werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die für kommerzielle Produktion von Fremdprotein bereitgestellte transgene Pflanze Mais. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die interessierende Biomasse Samen. Für die relativ geringe Anzahl von transgenen Pflanzen, die höhere Expressionslevel zeigen, kann eine genetische Karte, vorwiegend über gewöhnliche RFLP- und PCR-Analyse, erzeugt werden, die die ungefähre chromosomale Lokalisierung des integrierten DNA-Moleküls identifiziert. Für beispielhafte Methodologien in dieser Hinsicht, siehe Glick und Thompson, METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, 269–284 (CRC Press, 1993). Kartierungsinformationen, betreffend die chromosomale Lokalisierung, sind für den Eigentumsschutz eines transgenen Pflanzensubjekts verwendbar. Falls unautorisierte Vermehrung vorgenommen wird und Kreuzungen mit anderem Kernplasma durchgeführt wird, kann die Karte der Integrationsregion mit ähnlichen Karten verdächtigter Pflanzen verglichen werden, um zu bestimmen, ob letztere eine gemeinsame Abstammung mit der Pflanze des Subjekts haben. Kartenvergleiche würden Hybridisierungen, RFLP, PCR und Sequenzierung enthalten, von denen alle konventionelle Techniken sind.
Gleichermaßen können mittels der vorliegenden Erfindung agronomische Gene in transformierten Pflanzen exprimiert werden. Insbesondere können Pflanzen gentechnisch verändert werden, um verschiedene Phänotypen von agronomischem Interesse zu exprimieren. Die in dieser Hinsicht einbezogenen Gene schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf jene, die unten kategorisiert sind.
1. Gene, die Resistenz gegen Schädlinge oder Krankheiten verleihen und die codieren

(A) Pflanzenkrankheitsresistenzgene. Abwehrmechanismen von Pflanzen werden oft durch spezifische Wechselwirkung zwischen dem Produkt eines Krankheitsresistenzgens (R) in der Pflanze und dem Produkt eines entsprechenden Avirulenzgens (Avr) im Pathogen aktiviert. Eine Vielfalt von Pflanzen kann mit kloniertem Resistenzgen transformiert werden, um Pflanzen zu konstruieren, die gegen spezifische Pathogenstämme resistent sind. Siehe beispielsweise Jones et al., Science 266: 789 (1994) (Klonieren des Tomaten-Cf-9-Gens für Resistenz gegen Cladosporium fulvum); Martin et al., Science 262: 1432 (1993) (Tomaten-Pto-Gen für Resistenz gegen Pseudomonas syringae pv. tomato codiert eine Proteinkinase); Mindrinos et al., Cell 78 1089 (1994) (Arabidopsis RSP2-Gen für Resistenz gegen Pseudomonas syringae).
(B) Ein Bacillus thuringiensis-Protein, ein Derivat davon oder ein darauf modelliertes synthetisches Polypeptid. Siehe beispielsweise Geiser et al., Gene 48: 109 (1986), die das Klonieren und die Nucleotidsequenz eines Bt δ-Endotoxingens offenbaren. Außerdem können DNA-Moleküle, die für δ-Endotoxingene codieren, von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) unter den ATCC-Eingangsnummern 40098, 67136, 31995 und 31998 käuflich erworben werden.
(C) Ein Lectin. Siehe beispielsweise die Offenbarung durch Van Damme et al., Plant Molec. Biol. 24: 825 (1994), die die Nucleotidsequenz mehrerer Clivia miniata-Mannose-Bindungslectingene offenbaren.
(D) Ein Vitamin-bindendes Protein, wie z. B. Avidin. Siehe US-Patentanmeldung Seriennummer 07/911864, deren Inhalte hiermit durch Referenz einbezogen sind. Die Anmeldung lehrt die Verwendung von Avidin und Avidinhomologen als Larvizide gegen Insektenschädlinge.
(E) Ein Enzyminhibitor, beispielsweise ein Proteaseinhibitor oder ein Amylaseinhibitor. Siehe beispielsweise Abe et al., J. Biol. Chem. 262: 16793 (1987) (Nucleotidsequenz von Reis-Cysteinproteinaseinhibitor), Huub et al., Plant Molec. Biol. 21: 985 (1993) (Nucleotidsequenz von cDNA, die für Tabak-Proteinaseinhibitor I codiert), und Sumitani et al., Biotech. Biotech. Biochem. 57: 1243 (1993) (Nucleotidsequenz von Streptomyces nitrosporeus- α-Amylaseinhibitor).
(F) Ein Insekten-spezifisches Hormon oder Pheromon, wie z. B. ein Ecdysteroid und Juvenilhormon, eine Variante davon, eine darauf basierende Nachahmung ("mimetic") oder ein Antagonist oder Agonist davon. Siehe beispielsweise die Offenbarung durch Hammock et al., Nature 344: 458 (1990) von Baculovirusexpression klonierter Juvenilhormonesterase, einem Inaktivator von Juvenilhormon.
(G) Ein Insekten-spezifisches Peptid oder Neuropeptid, das bei Expression die Physiologie des betroffenen Schädlings stört. Siehe beispielsweise die Offenbarungen von Regan, J. Biol. Chem. 269: 9 (1994) (Expressionsklonieren ergibt DNA, die Insektendiuretisches Hormon-Rezeptor ("insect diuretic hormone receptor") codiert und Pratt et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 163: 1243 (1989) (ein Allostatin wird in Diploptera puntata identifiziert). Siehe auch US-Patent Nr. 5266317 an Tomalski et al., die Gene offenbaren, die insektenspezifische, paralytische Neurotoxine codieren.
(H) Ein Insekten-spezifisches Gift, das in der Natur von einer Schlange, einer Wespe etc. produziert wird. Siehe z. B. Pang et al., Gene 116: 165 (1992), für die Offenbarung der heterologen Expression eines Gens, das für ein insektotoxisches Peptid des Skorpions codiert, in Pflanzen.
(I) Ein Enzym, verantwortlich für eine Hyperakkumulierung von einem Monoterpen, einem Sesquiterpen, einem Steroid, Hydroxamsäure, einem Phenylpropanoidderivat oder eines anderen Nicht-Proteinmoleküls mit insektizider Aktivität.
(J) Ein Enzym, beteiligt bei der Modifikation, einschließlich der post-translationalen Modifikation, eines biologisch aktiven Moleküls; beispielsweise ein glycolytisches Enzym, ein proteolytisches Enzym, ein lipolytisches Enzym, eine Nuclease, eine Cyclase, eine Transaminase, eine Esterase, eine Hydrolase, eine Phosphatase, eine Kinase, eine Phosphorylase, eine Polymerase, eine Elastase, eine Chitinase und eine Glucanase, ob natürlich oder synthetisch. Siehe PCT-Anmeldung WO 93/02197 im Namen von Scott et al., die die Nucleotidsequenz eines Callasegens offenbart. DNA-Moleküle, die Chitinase-codierende Sequenzen enthalten, können beispielsweise von der ATCC unter Eingangsnummern 39637 und 67152 erhalten werden. Siehe auch Kramer et al., Insect Biochem. Molec. Biol. 23: 691 (1993), die die Nucleotidsequenz einer cDNA, die für Tabakhakenwurmchitinase codiert, lehren, und Kawalleck et al., Plant Molec. Biol. 21: 673 (1993), die die Nucleotidsequenz des Petersilie ubi4-2 Polyubiquitingens bereitstellen.
(K) Ein Molekül, das die Signaltransduktion stimuliert. Siehe beispielsweise die Offenbarung durch Botella et al., Plant Molec. Biol. 24: 757 (1994) von Nucleotidsequenzen für Mungbohnen-Calmodulin cDNA-Klone, und Griess et al., Plant Physiol. 104: 1467 (1994), die die Nucleotidsequenz eines Maiscalmodulin-cDNA-Klons bereitstellen.
(L) Ein Peptid mit hydrophobem Moment ("hydrophobic moment peptide"). Siehe US-Patentanmeldungen Serien-Nr. 08/168,809 (Offenbarung von Peptidderivaten von Tachyplesin, die fungale Pflanzenpathogene inhibieren) und Serien-Nr. 08/179,632 (lehrt synthetische antimikrobielle Peptide, die Krankheitsresistenz verleihen), deren jeweilige Inhalte hiermit durch Referenz einbezogen sind.
(M) Eine Membranpermease, ein Kanalbildner oder ein Kanalblocker. Siehe beispielsweise die Offenbarung durch Jaynes et al., Plant Sci. 89: 43 (1993), bezüglich heterologer Expression eines Cecropin-β-lytisches Peptid-Analogon, um transgene Tabakpflanzen gegen Pseudomonas solanacearum resistent zu machen.
(N) Ein viral-invasives Protein oder ein davon stammendes Komplextoxin. Beispielsweise vermittelt die Akkumulation viraler Hüllproteine in transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegen virale Infektion und/oder Krankheitsentwicklung, ausgelöst durch das Virus, von dem das Hüllproteingen stammt, sowie von verwandten Viren. Siehe Beachy et al., Ann. Rev. Phytopathol. 28: 451 (1990). Hüllprotein-vermittelte Resistenz ist bei transformierten Pflanzen gegen Luzernenmosaikvirus, Gurkenmosaikvirus, Tabakstrichelvirus, Kartoffelvirus X, Kartoffelvirus Y, Tabakätzvirus, Tabakmauchevirus und Takabmosaikvirus verliehen worden. Id.
(O) Einen Insekten-spezifischen Antikörper oder ein davon stammendes Immunotoxin. Folglich würde ein gegen eine kritische metabolische Funktion im Insektendarm gerichteter Antikörper ein beteiligtes Enzym inaktivieren, wodurch das Insekt getötet würde. Vgl. Taylor et al., Abstract #497, SEVENTH INT'L SYMPOSIUM ON MOLECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS (1994) (enzymatische Inaktivierung in transgenem Tabak via Produktion von Einzelketten-Antikörperfragmenten).
(P) Einen Virus-spezifischen Antikörper. Siehe beispielsweise Tavladoraki et al., Nature 366: 469 (1993), die zeigen, dass transgene Pflanzen, die rekombinante Antikörpergene exprimieren, vor Virusangriff geschützt sind.
(Q) Ein Entwicklungs-arretierendes Protein, in der Natur hergestellt durch ein Pathogen oder einen Parasit. Folglich ermöglichen Pilz-Endo-α-1,4-D-polygalacturonasen Pilzkolonisation und Pflanzennährstofffreisetzung durch Solubilisieren von Pflanzenzellwand-Homo-α-1,4-D-galacturonase. Siehe Lamb et al., Bio/Technology 10: 1436 (1992). Die Klonierung und Charakterisierung eines Gens, das ein Bohnen-Endopolygalacturonase-inhibierendes Protein codiert, ist von Toubart et al., Plant J. 2: 367 (1992) beschrieben.
(R) Ein Entwicklungs-arretierendes Protein, in der Natur von einer Pflanze hergestellt. Zum Beispiel haben Logemann et al., Bio/Technolgy 10: 305 (1992) gezeigt, dass transgene Pflanzen, die das Gerste-Ribosom-inaktivierende Gen exprimieren, erhöhte Resistenz gegen Pilzkrankheiten aufweisen.

2. Gene, die Resistenz gegen ein Herbizid verleihen, z. B.

(A) Ein Herbizid, das den Wachstumspunkt oder das Meristem inhibiert, wie z. B. ein Imidazolinon oder einen Sulfonylharnstoff. Beispielhafte Gene in dieser Kategorie codieren für mutiertes ALS- und AHAS-Enzym, wie beispielsweise von Lee et al., EMBO J., 7: 1241 (1988) bzw. Miki et al., Theor. Appl. Genet. 80: 449 (1990) beschrieben.
(B) Glyphosat (Resistenz vermittelt durch mutierte EPSP-Synthase bzw. aroA-Gene) und andere Phosphonoverbindungen, wie Glufosinat (PAT- und bar-Gene) und Pyridinoxy- oder Phenoxypropionsäuren und "Cycloshexones" (ACCase-Inhibitor-codierende Gene). Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4,940,835 an Shah et al., welche die Nucleotidsequenz einer Form von EPSP offenbart, die Glyphosatresistenz verleihen kann. Ein DNA-Molekül, das für ein mutiertes aroA-Gen codiert, kann unter ATCC-Eingangsnummer 39256 erhalten werden, und die Nucleotidsequenz des mutierten Gens ist in US-Patent Nr. 4,769,061 an Comai offenbart. Europäische Patentanmeldung Nr. 0 333 033 an Kumada et al. und US-Patent Nr. 4,975,374 an Goodman et al. offenbaren Nucleotidsequenzen von Glutaminsynthetasegenen, die Resistenz gegen Herbizide, wie z. B. L-Phosphinothricin verleihen. Die Nucleotidsequenz eines Phosphinothricin-acetyl-transferasegens wird in Europäischer Patentanmeldung Nr. 0 242 246 an Leemans et al. bereitgestellt. De Greef et al., Bio/Technology 7: 61 (1989) beschreiben die Produktion transgener Pflanzen, die chimäre bar-Gene, die für Phosphinothricin-acetyl transferase-Aktivität codieren, exprimieren. Beispielhaft für Gene, die Resistenz gegen Phenoxypropionsäuren und "Cycloshexones", wie z. B. Sethoxydim und Haloxyfop, verleihen, sind die Acc1-S1-, Acc1-S2- und Acc1-S3-Gene, beschrieben von Marshall et al., Theor. Appl. Genet. 83: 435 (1992).
(C) ein Herbizid, das die Photosynthese inhibiert, wie z. B. ein Triazin (psbA– und gs+-Gene) und ein Benzonitril (Nitrilasegen). Przibilla et al., Plant Cell 3: 169 (1991) beschreiben die Transformation von Chlamydomonas mit Plasmiden, die mutierte psbA-Gene codieren. Nucleotidsequenzen für Nitrilasegene sind in US-Patent Nr. 4,810,648 an Stalker offenbart, und DNA-Moleküle, die diese Gene enthalten, sind unter ATCC-Eingangsnummern 53435, 67441 und 67442 verfügbar. Klonierung und Expression von DNA, die für eine Glutathion-S-transferase codiert, ist von Hayes et al., Biochem. J. 285: 173 (1992) beschrieben.

3. Gene, die ein Wertzuwachs-Merkmal verleihen oder dazu beitragen, wie z. B.

A) Modifizierter Fettsäurestoffwechsel, beispielsweise durch Transformieren einer Pflanze mit einem Antisense-Gen von Stearoyl-ACP-desaturase, um den Stearinsäuregehalt der Pflanze zu erhöhen. Siehe Knultzon et al., Proc. Nat'1 Acad Sci. USA 89: 2624 (1992).
(B) Verringerter Phytatgehalt:
(1) Einführen eines Phytase-codierenden Gens würde den Abbau von Phytat, was der transformierten Pflanze mehr freies Phosphat hinzufügen würde, erhöhen. Siehe beispielsweise Van Hartingsveldt et al., Gene 127: 87 (1993) für eine Offenbarung der Nucleotidsequenz eines Aspergillus niger-Phytasegens.
(2) Ein Gen, das den Phytatgehalt reduziert, könnte eingeführt werden. In Mais könnte dies beispielsweise erreicht werden, indem DNA, assoziiert mit dem einzelnen Allel, das für Maismutanten verantwortlich ist, die durch geringe Level von Phytinsäure charakterisiert sind, kloniert und dann wieder eingeführt wird. Siehe Raboy et al., Maydica 35: 383 (1990).
(C) Modifizierte Kohlenhydratzusammensetzung, beispielsweise bewirkt durch Transformieren von Pflanzen mit einem Gen, das für ein Enzym codiert, das das Verzweigungsmuster von Stärke verändert. Siehe Shiroza et al., J. Bacteriol. 170: 810 (1988) (Nucleotidsequenz von Streptococcus mutans Fructosyl-Transferasegen), Steinmetz et al., Mol. Gen. Genet. 200: 220 (1985) (Nucleotidsequenz von Bacillus subtilis-Levansucrasegen), Pen et al., Bio/Technology 10: 292 (1992) (Herstellung transgener Pflanzen, die Bacillus licheniformis-α-Amylase exprimieren), Elliot et al., Plant Molec. Biol. 21: 515 (1993) (Nucleotidsequenzen von Tomateninvertasegenen), Søgaard et al., J. Biol. Chem. 268: 22480 (1993) ortsgerichtete Mutagenese von Gerstenamylasegen) und Fisher et al., Plant Physiol. 102: 1045 (1993) (Maisendosperm-Stärkeverzweigungsenzym II).

BEISPIEL 1
Konstruktion von Genen und Vektoren
Die GFPm-Nucleotidsequenz wurde von einer Rücktranslation der Proteinsequenz unter Verwendung Mais-bevorzugter Codons abgeleitet. Sequenzanalyse wurde unter Verwendung des Wisconsin Sequence Analysis Package von Genetics Computer Group, Madison, WI, durchgeführt. Die Nucleotidsequenz wurde aus einer Reihe synthetischer Oligonucleotide zusammengesetzt. Klonierungsstellen schließen eine 5'-flankierende BamHI-Restriktionsstelle, eine AflIII-Stelle am Startcodon, eine 3'-flankierende HpaI-Stelle oder eine BglII-Stelle, die das Stopcodon in eine Isoleucin umwandelt, ein (1).
Amino-terminale Fusionen an GFPm wurden unter Verwendung synthetischer Oligonucleotide, die die Signalsequenz, flankiert von einer 5'-BamHI- oder BglII-Restriktionsstelle, und 3'-NcoI-Stelle codieren, erzeugt. Die synthetischen Signalsequenzen wurden in PHP7921 (4) unter Verwendung der 5'-flankierenden BamHI- und AflIII-Restriktionsstellen von GFPm kloniert, um Fusionen im Leserahmen zu erzeugen. Auf diese Weise klonierte Sequenzen schließen die Maischloroplastensignalsequenz, Gersten-Alpha-Amylasesignalsequenz, Erbsenglutathionreductasesignalsequenz und SV40-Kernlokalisierungssignalsequenz ein. Die Sporaminvakuolensignalsequenz wurde mit einer 5'-BspEI- und 3'-BamHI-Stelle zur Insertion zwischen der BAA-Präsequenz und GFPm-codierenden Sequenz von pHP8144 (5) synthetisiert. Die CPN60-Promotorstelle, erzeugt durch ortsgerichtete Mutagenese, wurde mit der GFPm AflIII-Stelle verwendet, um die Fusionssequenz zu erzeugen. Jedes der Plasmide PHP7921 und PHP8144 basiert auf pUC18.
Carboxy-terminale Sequenzen wurden mit einer 5'-BglII- und 3'-HpaI-Stelle synthetsiert und in pHP7921 oder pHP8144 unter Verwendung der 3'-BflII- und HpaI-Stellen von GFPm kloniert. Die Fusionen mit dem Gerstenlectinvakuolenziel, dem HDEL-ER-Retentionssignal, dem SKL-Peroxisomensignal, der ALS-codierenden Sequenz und HRGP-codierenden Sequenz wurden unter Verwendung dieser Strategie angefertigt.
Der Ubiquitinpromotor ist in Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675–689 (1992), beschrieben. Der 4 × ERE-Promotor ist in Klein-Hitpass et al., Cell 46: 1053–1061 (1986) beschrieben. Die CPN60; 2 × 35S und ALS-Promotoren sind in P. Close, PH.D-Dissertation, Iowa State University; Gardner et al., Nucl. Acid Res. 9: 2871–2888 (1981) bzw. PHI-Patentanmeldung 08/409,297 beschrieben. Die Omega' (O')-5'-Sequenz ist von Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15: 3257–3273 (1987) beschrieben, während das Adh 1 Intron I von Dennis et al., Nucl. Acids Res. 12: 3983–3990 (1984) beschrieben ist. Bei 3'-Sequenz pinII ist in An et al., Plant Cell 1: 115–122 (1989) beschrieben. In der Konstruktion der Vektoren verwendete Strukturgene schließen das GFP-Gen (native Qualle), beschrieben von Prasher et al., Gene 111: 229–233 (1992); das Mais ALS-Gen, beschrieben von Fromm et al., Bio/Technol. 8: 883 (1990) und das Mais HPRG, beschrieben von Steifel et al., Plant Mol. Biol. 11: 483–493 (1988), ein. Das FLP/FRT-System, enthalten in Plasmiden PHP8674 und PHP8007 ist in O'Gorman et al., Science 251: 1351–1355 (1991) und M. Jayaram, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5875–5879 (1985), beschrieben. Das Ac/Ds-System ist von Muller-Neumann et al., Mol. Gen. Genet. 198: 19–24 (1984), beschrieben.
Für Agrobacterium-vermittelte Transformation von Sonnenblume ist das Rückgrat von PHP8011 ein bin 19-basierter Vektor. Beven, Nucl. Acids Res. 12: 8711–8721 (1984). Die NPT-II-Kassette wurde von bin 19 entfernt und das Folgende zwischen den linken und rechten Grenzsequenzen kloniert; der Doppel-35S-Promotor, Omega', die GFPm-codierende Sequenz und die pinII 3'-Region (alle oben beschrieben) wurden stromabwärts von der linken Grenzsequenz kloniert, gefolgt in einer Kopf-an-Schwanz-Orientierung von dem BnALS3-Promotor, der NPT-II-codierenden Sequenz und der pinII 3'-Region. Beven, "Binary Agrobacterium Vectors for Plant Transformation", Nucl. Acids Res. 12: 8711–8721 (1984).
GFPr, BFP und GFPs (lösliches GFP) wurden mittels Oligonucleotid-gerichteter Mutagenese der GFPm-Nucleotidsequenz, gezeigt in 1, wie von Ausubel, supra, beschrieben, konstruiert. Bezüglich GFPr wurde TCC in ACG geändert, was in der S65T-Substitution in der GFP-Aminosäuresequenz resultierte. Bezüglich BFP wurde TAC in CAC geändert, was in der Y66H-Substitution in der GFP-Aminosäuresequenz resultierte.
Bezüglich GFPs wurden die folgenden Sequenzänderungen in GFPm durchgeführt. TTC wurde in AGC geändert, was in einer F99S-Substitution in der GFP-Aminosäuresequenz resultierte. Das Oligonucleotid, verwendet um diese Mutation einzuführen, verursachte außerdem eine stille Mutation bei R96 (AGC geändert in CGG), wodurch eine BsrBI-Restriktionsstelle hinzugefügt wurde. ATG wurde in ACC geändert, was in einer M153T-Substitution in der GFP-Aminosäuresequenz resultierte. GTG wurde in GCC geändert, was in einer V163A-Substitution in der GFP-Aminosäuresequenz resultierte. Ein einzelnes Oligonucleotid wurde verwendet, um die Aminosäuren bei 153 und 163 zu ändern. Dieses Oligonucleotid verursachte außerdem eine stille Mutation bei A154 (GCC verändert in GCG), was eine SacII-Restriktionsstelle hinzufügte. Wie von Crameri et al., supra, berichtet, veränderten diese drei Aminosäureänderungen die Absorptions-/Emissionscharakteristika von GFP nicht. Diese drei Aminosäuresubstitutionen erhöhten jedoch die Solubilität von GFP. Maiszellen, transformiert mit dem GFPs-Gen, fluoreszieren in blauem bis UV-Licht, basierend auf transienten Assays.
BEISPIEL 2
Maistransformation mit GFP-Durchmustern oder Bialaphosselektion
Unreife Mais HI-II-Embryos wurden via Mikroprojektilbeschuss mit einem Gemisch aus PHP7814 (ubi::PAT::pinII) und PHP8409 co-transformiert. Plasmid PHP7814 trägt das PAT-Gen, das Resistenz gegen Bialaphos codiert, funktionell an den Ubiquitinpromotor gebunden, und den Terminator von dem pinII-Gen. Standard-CaCl₂/Spermidin-Präzipitation von DNA auf Wolframmikroprojektilen wurde verwendet, um die DNA-Partikel zu erstellen. Vor dem Beschuss wurden die Embryos von ungefähr 1,5 bis 2,0 mm Länge auf 560P Medium, das N6 Salze, Erikksons Vitamine, 0,69 mg/L Prolin, 2 mg/L 2,4-D, und 3% Saccharose einschloss, kultiviert. Nach 4–5 Tagen Inkubation im Dunklen bei 28°C wurden Embryos von 560P Medium entfernt und mit dem coleorhizalen Ende nach oben auf 560L Medium kultiviert, das äquivalent zu 560P ist, bis auf dass es 12% Sacchrose enthält. Embryos wurde erlaubt, sich an dieses Medium 3 Stunden lang vor der Transformation zu akklimatisieren.
Embryos wurden unter Verwendung der PDS-1000 Helium Gun von Bio-Rad bei einem Schuss pro Probe unter Verwendung von 650 PSI-Rupturscheiben ("rupture disks") transformiert. Im Durchschnitt wurden ungefähr 0,0067 μg DNA pro Schuss abgegeben. Für jede Behandlung (pat-Gen mit Bialaphosselektion oder GFP-Gen mit Durchmustern nach GFP) wurden 447 Embryos verwendet. Für die Bialaphosselektionsbehandlung; folgend auf die Bombardierung, wurden Embryos auf 560L-Medium 48 Stunden lang gehalten, bevor Transfer auf 560R-Selektionsmedium, das N6-Salze, Erikksons Vitamine, 2 mg/L 2,4-D, 3% Saccharose und 3 mg/L Bialaphos enthielt. Platten wurden bei 28°C im Dunklen gehalten und auf Kolonierückgewinnung hin beobachtet. Transfer von Kolonien in frisches Medium fand alle 2 Wochen statt. Rückgewinnung transgener Kolonien unter Bialaphosselektion wurde erreicht, indem die gesunden, wachsenden transgenen Calli aus der Mitte des inhibierten Hintergrund nicht-transgenen Gewebes ausgewählt wurden, weil das Material fortschreitend auf frische Medien transferiert wurde. Für die GFP-Durchmusterungsbehandlung wurde nach dem Beschuss und der zweitägigen Erholung auf 560L, 560P-Medium verwendet. Calli wurden alle zwei Wochen in frisches, nicht-selektives 560P-Medium übertragen. Durchmustern nach GFP-Expression wurde bei jedem Transfer unter Verwendung einer Xenon- und/oder Quecksilberlichtquelle mit den geeigneten Filtern zur GFP-Visualisierung geführt.
TABELLE 2 Rückgewinnung transgener Ereignisse in Mais Hi-II Callus unter Verwendung von entweder GFP-Visualisierung oder Bialaphosselektion
Transgene Ereignisse wurden von jeder Behandlung rückgewonnen. Die größte Anzahl transgener Ereignisse wurde konsistent mittels Bialaphosselektion erhalten. Jedoch war die Rückgewinnungshäufigkeit transgener Ereignisse mit GFP-Durchmustern ungefähr die Hälfte der Rückgewinnungsrate mit Bialaphosselektion, was überraschend hoch war, wenn man bedenkt, dass GFP-Durchmustern nicht auf Selektion transgener Ereignisse in Gegenwart eines zellulären Toxins beruht.
Sobald GFP-exprimierende Kolonien identifiziert waren, wurden sie regelmäßig auf neue(s) Wachstum und Expression unter Verwendung der Xenonlichtquelle beobachtet. Pflanzenzellen, die GFP enthielten, wurden regeneriert, indem der Callus auf 288-Medium, das MS-Salze, 1 mg/L IAA, 0,5 mg/L Zeatin und 4% Saccharose enthielt, übertragen. Der Callus wurde im Licht platziert. So wie sich Pflänzchen entwickelten, wurden sie in Röhrchen, die 272K, hormonfreies MS-Medium und 3% Saccharose enthielten, transferiert. Der Prozentsatz grün fluoreszierender Kolonien, die in gesamte Pflanzen regenerierten, wurden bestimmt.
Blattproben wurden von TO-transgenen Pflanzen von Ereignissen, die mittels Bialaphosselektion rückgewonnen wurden, oder für Ereignisse, die mittels GFP-Visualisierung (nicht-selektiert) zurückgewonnen wurden, gesammelt. Genomische DNA wurde aus allen Blattproben gewonnen und Southern-Analyse wurde unter Verwendung der PAT- und GFP-Gene als Hybridisierungssonden durchgeführt. Hybridisierungen für das PAT-Gen und das GFP-Gen wurden der Reihe nach auf denselben Blots durch Strippen und Rehybridisieren mit Sonde ("reprobing") für das andere Transgen durchgeführt. Für das PAT-Gen und für das GFP-Gen hybridisierende Banden wurden in allen acht getesteten GFP-durchmusterten Ereignissen und in allen 12 der getesteten Bialaphos-selektierten Ereignisse beobachtet. Kopienzahlen und Integrationsmuster für beide Behandlungen erschienen ähnlich und waren konsistent zu früheren Experimenten der Erfinder unter Verwendung von Bialaphosselektion von Callus. Kopienzahlen reichten von niedrig (einzelne oder zwei Kopien für jedes Gen) bis zahlreich (d. h., > 5 Kopien pro Gen). Integrationsereignisse waren vorwiegend an einzelnen Integrationsstellen, allerdings wurde in manchen Fällen Integration bei mehreren Orten im Genom beobachtet.
Bialaphos ist der effizienteste chemische selektive Wirkstoff für Mais. Infolgedessen war die hohe Häufigkeit, mit der transgene Ereignisse mit GFP-Durchmustern erhalten wurden, im Vergleich zu Bialaphosselektion unerwartet. Ein Vorteil des GFP-Durchmusterns gegenüber Bialaphosselektion ist, dass nicht-transformiertes Gewebe nicht getötet wird. Dementsprechend entwickeln sich transgene Sektoren, die das GFP-Gen enthalten, in einer gesünderen Umgebung für Wachstum und Entwicklung.
BEISPIEL 3
Der GFP-Marker in Maiszytoplasma, Chloroplast und Mitochondrien
Mais A188 × B73-abgeleitete Zellen wurden mit Plasmiden PHP8080, PHP7921 und PHP8087 transformiert. Jedes dieser Plasmide ist in Beispiel 1 und Tabelle 1 beschrieben. Plasmid PHP8080 trägt das GFPm-Gen, funktionell gebunden an den Ubiquitinpromotor und eine Chloroplastensignalsequenz. GFP wird zu den Chloroplasten der Zellen, die mit PHP8080 transformiert sind, gelenkt. Plasmid PHP7921 trägt das GFPm-Gen, funktionell gebunden an den Ubiquitinpromotor. GFP verbleibt im Zytoplasma der Zellen, die mit pPGP7921 transformiert sind. Plasmid PHP8087 trägt das GFPm-Gen, funktionell gebunden an den CPN60-Promotor und die CPN60-Signalsequenz. GFP wird zu Mitochondrien von Zellen gelenkt, die mit pPGP8087 transformiert sind.
Die Zellen wurden transformiert durch Kultivieren von Maisembryos von ungefähr 1,5 bis 2 mm Länge auf 560P-Medium, das N6-Salze, Erikksons Vitamine, 0,69 g/L Prolin, 2 mg/L 2,4-D und 3% Saccharose enthielt. Nach 4–5 Tagen Inkubation im Dunklen bei 28°C wurden die Embryos von dem 560P-Medium entfernt und mit dem coleorhizalen Ende nach oben auf 560L-Medium, das äquivalent zu 560P ist, aber 12% Saccharose enthält, kultiviert. Embryos wurde erlaubt, in diesem Medium 3 Stunden vor der Transformation zu akklimatisieren. Embryos wurden unter Verwendung der PDS-1000 Helium Gun von Bio-Rad bei einem Schuss pro Probe unter Verwendung von 650PSI Rupturscheiben transformiert. Pro Schuss abgegebene DNA belief sich im Durchschnitt auf 0,0667 μg. Folgend auf den Beschuss wurden alle Embryos 48 Stunden lang auf 560L Medium gehalten, bevor Transfer auf 3% Saccharose und 3 mg/L Bialaphos stattfand. Platten wurden bei 28°C im Dunklen gehalten und wurden auf Kolonierückgewinnung hin beobachtet, wobei Überführungen auf frisches Medium alle 2 Wochen stattfanden. Die Rückgewinnung transgener Kolonien wurde anfänglich als wachsendes Callusgewebe mit einem gesunden Phänotyp bei der Selektion bemerkt. Durchmustern nach GFP-Expression wurde bei jedem Transfer unter Verwendung einer Xenon-Lichtquelle mit UV-Filteraufsätzen absolviert.
GFP-Lokalisierung wurde durch Analyse von TO-Callus bestätigt. Callusproben der targetierten GPF-Transformationen wurden im FAA fixiert und dann unter Verwendung eines invertierten Mikroskops mit UV-Filtern untersucht, um GFP zu visualisieren. Für jedes targetierte Konstrukt wurde GFP-Expression auf das festgelegte Organell lokalisiert.
Sobald GFP-exprimierende Kolonien identifiziert waren, wurden sie regelmäßig auf neue(s) Wachstum und Expression unter Verwendung der Xenon-Lichtquelle beobachtet. Pflanzenzellen, die GFP enthielten, wurden durch Übertragen des Callus auf 288 Medium, das MS-Salze, 1 mg/L IAA, 0,5 mg/L Zeatin und 4% Saccharose enthielt, regeneriert. Der Callus wurde im Licht platziert. So wie sich Pflänzchen entwickelten, wurden sie in Röhrchen transferiert, die 272K, hormonfreies MS Medium und 3% Saccharose enthielten. Der Prozentsatz grün-fluoreszierender Kolonien, der in gesamte Pflanzen regenerierte, wurde bestimmt.
Regeneration von Pflanzen aus mit PHP8080, PHP7921 und PHP8087 transformiertem Callus schien unter den Konstrukten zu variieren; Pflanzen wurden erfolgreich aus unabhängig transformierten Calli zu jeweiligen Frequenzen von 35, 54 und 86% regeneriert. Transformation wurde durch Southern-Blot-Analysen unter Verwendung sowohl der BAR- als auch GFP-Gene als Hybridisierungssonden bestätigt. GFP-Lokalisierung in verschiedenen subzellulären Kompartimenten wurde in stabilen transgenen Maiszellen unter Verwendung von Epifluoreszenzmikroskopie und Bildverstärkungssoftware bestätigt.
TABELLE 3 Regenerationshäufigkeit von Mais, transformiert mit GFP, das zu verschiedenen subzellulären Kompartimenten gelenkt wird
Transformierte Pflanzen, die GFP in dem mitrochondrialen subzellulären Kompartiment enthielten, wuchsen kräftiger als Pflanzen, die GFP im Zytoplasma oder im Chloroplasten enthielten. Die transformierten Pflanzen, die GFP in den Mitochondrien enthielten, waren gleichwertig zu den Kontrollen im Hinblick auf Wachstumsrate und Aussehen.
Im Gegensatz waren transformierte Pflanzen, die GFP im Chloroplasten enthielten, schwierig zu regenerieren. Dieser Callus produzierte ein Übergewicht an Wurzeln mit wenigen Sprossen. Nahezu alle Pflanzen, die GFP im Chloroplasten enthielten, und die regeneriert wurden und die Reife erlangten, wiesen bei engen und etwas schlaffen Blättern, reduzierter Gestalt, gelben Blättern (vermutlich durch reduzierte Chlorophyll-Level verursacht) und männliche Sterilität auf.
Keimungen von T1-Embryos sind auf die folgende Art und Weise getestet worden. Aliquots der Saat einer Anzahl von unabhängigen Transformanten wurde imbibiert, und die Embryos ausgeschnitten und auf hormonfreiem MS Medium mit 3% Saccharose zur Keimung platziert (dieser in vitro-Test machte es leichter, den Keimling sichtbar zu machen). Alle Embryos wurden im Dunklen ausgekeimt und dann nach visueller GFP-Expression unter Verwendung UV-blauer Anregung unter dem Seziermikroskop ausgezählt.
Für jedes getestete Ereignis wurden Aliquots von 5 oder 10 Samen/Ereignis imbibiert, ausgeschnitten und auf Keimung und Fluoreszenz ausgezählt. Die Keimungshäufigkeit für ausgeschnittene Nachkommen, produziert auf Pflanzen, die mit PHP7921 und PHP8080 transformiert waren, war gut. Die Keimungshäufigkeit für ausgeschnittene Nachkommen, produziert auf Pflanzen, die mit PHP8087 transformiert waren, war für zwei Ereignisse gut (10/10), und niedrig für ein Ereignis (2/10). Für zwei Ereignisse wurde keine nachweisbare Keimung beobachtet. Diese erniedrigte Keimungshäufigkeit könnte durch mitochondrialexprimierte GFP-Expression per se bedingt sein, könnte aber auch das Ergebnis von Ereignis zu Ereignisvariation, die manchmal in transgenen Linien beobachtet wird, sein.
Die Keimung von einem einzelnen Ereignis von mit PHP7921 transformierten Pflanzen wurde unterschiedlich getestet. Samen wurden unter Verwendung einer UV-blau-Lichtquelle durchmustert, und 10 Samen mit GFP-exprimierenden Samen (Embryos und Endosperm) wurden ausgewählt. Fünf dieser Samen wurden in Erde gepflanzt und die anderen fünf Embryos wurden ausgeschnitten und auf Medium ausgekeimt. Keiner der Samen in der Erde keimte aus, während alle ausgeschnitten Embryos auskeimten, wuchsen und die Keimlinge weiter fluoreszierten. Für Ereignisse, wo die Keimung negativ beeinflusst zu sein scheint, könnte dies durch erhöhte GFP-Konzentrationen während Samenreifung und "Dry-down" bedingt sein. Hohe GFP-Konzentrationen und Aggregation des Proteins ist gefunden worden, in E. coli toxisch zu sein. Crameri et al., Nature Biotechnol. 14: 315–319 (1995).
TABELLE 4 T1-Nachkommenanalyse Pflanzenkeimung und GFPm-Expression
BEISPIEL 4
Sonnenblumentransformation mit GFP-Durchmustern, GUS-Durchmustern und Kanamycinselektion
Experimente wurden durchgeführt, um GFP, GUS und NPTII als Markergene für die Sonnenblumentransformation zu prüfen. Zwei verschiedene Arten von Meristemsystemen (gespaltenes Meristem; intaktes Meristem) und zwei verschiedene Arten von Partikelsystemen (FG, Fokussierkanone ("focusing gun"): He, Heliumkanone ("helium gun")) wurden verwendet. Die durchmusterbaren Marker GFP und GUS wurden mit dem intakten Meristemsystem unter Bedingungen geprüft, die keine chemische Selektion, sondern vielmehr Selektion von Transformanten, basierend auf visueller (GFP) oder untersuchbarer (GUS) Expression in transformierten Sektoren beinhalteten. Das NPTII-Markergen wurde mit der gespaltenes Meristem-Methode unter Verwendung von Kanamycin zur chemischen Selektion von Transformanten und Assays auf NPII-Expression geprüft, um transformierte Sektoren zu identifizieren. In manchen Fällen wurden die Experimente nur so weit durchgeführt, bis transformierte Sektoren identifiziert wurden, während andere Experimente bis ganz zum Ende durchgeführt wurden, um auf Samentransmission des Markergens auf die Nachkommenschaft zu testen. Transmission auf die Nachkommenschaft wurde durch NPTII ELISA bestätigt.
Ungeachtet des genauen Meristemsystems oder der Art der verwendeten Teilchenkanone, schloss das elementare Transformationsprotokoll eine Kombination von Verwunden durch Teilchenbeschuss, gefolgt von der Verwendung von Agrobacterium zum Abliefern von DNA wie von Bidney et al., Plant Mol. Biol. 18: 301–313 (1992) beschrieben, ein. Die für die Pflanzentransformation verwendeten Plasmide waren in diesen Experimenten PHP 167, enthaltend GUS als den durchmusterbaren Marker, PHP8011, enthaltend GFP als den durchmusterbaren Marker sowie das NPTII-Gen, und PHP762, enthaltend NPTII als den selektierbaren Marker. Sowohl PHP167 als auch PHP762 sind binäre, von pGA473 stammende Vektoren. Siehe An et al., EMBO J. 4: 277–284 (1985). Das binäre Rückgrad für PHP8011 ist bin 19. Siehe Bevan, NAR 12: 8711–8721 (1984).
Verfahren zur Präparation von Agrobacterium und Präparation von Partikeln für alle Experimente sind in Bidney et al., supra, beschrieben. Die Pioneer-Sonnenblumenlinie SMF3 wurde in allen Experimenten verwendet. Siehe Burrus et al., Plant Cell Rep. 10: 161–166 (1991) für SMF3 betreffende Informationen. Der Agrobacteriumstamm EHA101 ist in Bidney et al., supra, beschrieben und Stamm EHA105 ist in Hood et al., Transgen. Res. 2: 208–218 (1993) beschrieben. Verfahren für die Verwendung der Heliumkanone, die Präparation intakten Meristems, Gewebekultur- und Co-Kultivierungsbedingungen, und Rückgewinnung transgener Pflanzen für die Experimente mit intaktem Meristem sind auch in Bidney et al., supra, beschrieben. Verfahren für die Verwendung der Fokussierkanone, d. h. wie in den Experimenten mit intaktem Meristem, sind in Sautter et al., Bio/Technol. 9: 1080–1085 (1991), beschrieben. Verfahren für die Verwendung der Heliumkanone, Präparation gespaltenen Meristems, Gewebekultur, Co-Kultivierung, Kanamycinselektion und Rückgewinnung transgener Pflanzen für die Experimente mit gespaltenem Meristem sind in Malone-Schoneberg et al., Plant Sci. 103: 199–207 (1994), beschrieben.
Parameter und allgemeine Verwendung der Fokussierkanone waren ähnlich zu jenen 1,4 μm, beschrieben in Sautter et al., supra. Goldpartikel, messend bei einer Konzentration von 0,5 × 10⁶/μl und 80 bar Stickstoff wurden typischerweise verwendet, obwohl verschieden große Partikel (0,25 bis 2,5 μm) und verschiedene Stickstoffdrücke (40 bis 160 bar) geprüft wurden. Für das Helium-angetriebene Partikelbeschussgerät Dupont PDS-1000 wurden die Meristeme zweimal auf der höchsten Ablage mit 600 psi Rupturscheiben und einem Vakuum von 26 Inch Hg und 1,8 μm Wolframpartikeln beschossen. Das Transformationsverfahren mit intaktem Meristem schloss Imbibieren der Samen für 24 Stunden im Dunklen, Entfernen der Cotyledonen und des Wurzelrests, gefolgt von Kultivieren der Meristemexplantate, ein. 24 Stunden später wurden die Primärblätter entfernt, um das apicale Meristem freizulegen. Die Explantate wurden mit der Wachstumskegelseite nach oben platziert und zweimal mit Partikeln beschossen, was von Co-Kultivierung mit Agrobacterium gefolgt wurde. Um die Co-Kultivierung für intakte Meristeme zu beginnen, wurde ein Tropfen von 0,5 μl mit OD⁶⁰⁰ 4,0 Agrobacterium auf dem Meristem platziert. Nach 3-tägiger Co-Kultivierung wurden die Meristeme in Kulturmedium mit 250 μg/ml Cefotaxim (+100 mg/l Kanamycin für die NPTII-Selektionsexperimente) transferiert. Selektion ist auch unter Verwendung von 50 gm/l Kanamycin durchgeführt worden. Das Verfahren mit gespaltenem Meristem schloss Imbibieren der Samen, Brechen der Cotyledonen, um eine saubere Fraktur bei der Ebene der Embryonalachse zu erzeugen, Ausschneiden der Wurzelspitze und anschließendes Halbieren der Explantate longitudinal zwischen den Primordialblättern, ein. Die beiden Hälften wurden mit der geschnittenen Oberfläche nach oben auf dem Medium platziert, dann zweimal mit Partikeln beschossen, was von Co-Kultivieren mit Agrobacterium gefolgt wurde. Für gespaltene Meristeme wurden die Meristeme nach Beschuss 30 Minuten lang in eine OD⁶⁰⁰ 0,6 Agrobacterium-Suspension platziert. Sie wurden dann von der Suspension entfernt auf festes Kulturmedium zur 3-tägigen Co-Kultivierung. Nach diesem Zeitraum wurden die Meristeme auf frisches Medium mit 250 μg/ml Cefotaxim (+100 mg/l Kanamycin zur Selektion) übertragen. Selektion ist auch unter Verwendung von 50 gm/l Kanamycin durchgeführt worden.
Tabelle 5 fasst die Ergebnisse der Experimente zusammen und betrachtet die Häufigkeit transformierter Sektoren in Primärsprossen und Sekundärzweigen. Tabelle 6 fasst die Ergebnisse von Experimenten zusammen, die zur Analyse der Samentransmission bis zur Nachkommenschaft hin durchgeführt wurden. Transformanten wurden entweder in Samen oder Pflanzen durch Untersuchen auf Markergenexpression identifiziert. Für GUS-Expression wurde die Aktivität unter Verwendung von entweder histochemischem Färben oder dem fluorometrischen Assay, siehe Jefferson et al., EMBO J. 6: 3901–3907 (1987) bestimmt. Vererbung der Transgenexpression wurde unter Verwendung eines NPTII ELISAs festgestellt.
TABELLE 5 Gesamthäufigkeiten transformierter Sektoren für Sonnenblumentransformation
TABELLE 6 Gesamtsektor- und Samentransmission für Sonnenblumentransformation
Betreffend die Auswertung der Anfangssektorhäufigkeiten, schien GUS das effektivste Markergen zu sein (Tabellen 5 und 6). Jedoch trugen, basierend auf Durchmustern allein (keine Selektion), die beobachteten GUS-Sektoren nicht wesentlich zur Keimbahn bei, und übertrugen sich folglich nicht an die Nachkommenschaft (Tabelle 6). Es war unwahrscheinlich, dass dies durch die Verwendung der Fokussierkanone bedingt war, weil das Kartieren der GUS-Sektoren nach Verwendung jeder Art von Kanonesowohl quantitativ als auch qualitativ vergleichbar war. GFP war signifikant besser als NPTII (7,5% im Vergleich zu 1,8%, siehe Tabelle 6) für sowohl Sektorhäufigkeit als auch Samentransmission, wenn unter Verwendung der Heliumkanone verglichen. Die Nachkommenschaft von GFP-exprimierenden (keine chemische Selektion, aber stattdessen visuelles Auswählen unter Verwendung von GFP) TO-Pflanzen wurde auf NPTII-Expression analysiert (Tabelle 6). Die Nachkommenschaft von 10 Pflanzen wurde geprüft und 9 zeigten Vererbung von NPTII-Aktivität. Von Kanamycin-selektierten TO-Pflanzen zeigten 6 von 8 getesteten Transmission von NPTII-Expression an die Nachkommenschaft. Nicht nur hat "visuelle" GFP-"Selektion" unerwartet gut zum Zurückgewinnen der Primärtransformanten funktioniert (d. h. vergleiche Tabellen 3 und 4), sondern waren außerdem Co-Transformation und Vererbung von Transgenexpression sehr effizient.
TABELLE 7: Nachkommenanalyse von Transformationsexperimenten von SMF3 mit GFP (PHP8011: CaMV-GFPm, ALS-NPTII)
Parallele Experimente, die GFP-Durchmustern, GUS-Durchmustern und NPTII/Kanamycin-Selektion vergleichen, können unter Verwendung intakten Meristems, des Agrobacterium-Stamms EHA105 und der Heliumkanone, in Seite-an-Seite-Vergleichen, durchgeführt werden. Plasmid PHP8011 kann für die GFP/NPII-Vergleiche verwendet werden. Ein identisches Plasmid, wobei das GUS-Strukturgen mit GFP ersetzt wird, kann für GUS/NPTII-Vergleiche verwendet werden, und beide Plasmide können in Seite-an-Seite-Experimenten für GUS/GFP-Vergleiche verwendet werden. Sektorenhäufigkeit in Primärsprossen und Sekundärsprossen kann untersucht werden und wie oben beschrieben berechnet werden. Vererbung und Expression von Transgenen kann außerdem in diesen Experimenten analysiert werden.
BEISPIEL 5
GFP als eine FLP-vermittelter Excisionsmarker in Mais
Unreife Embryos des Hi-II-Genotyps wurden mit PHP8674 beschossen, das ein GFPm-Reportergen enthält, das bei FLP-Rekombinase-vermittelter FRT-Excision aktiviert wird. Plasmid PHP8674 trägt außerdem ein konstitutiv exprimiertes Gen für Bialaphosresistenz. Stabil transformierter Callus wurde auf Bialaphos selektiert und unter UV-blauem Licht auf GFP-Expression untersucht. Keine GFP-Expression wurde in diesem primären Transformanten beobachtet. Callusstücke, transformiert mit PHP8674, wurden dann mit PHP8007 beschossen. Plasmid PHP8007 enthält das FLP-Rekombinasegen, funktionell an den Ubiquitinpromotor gebunden. Callussektoren, die GFP exprimieren, wurden erstmals 10 Tage nach dem zweiten Beschuss beobachtet. Diese GFP-exprimierten Sektoren wuchsen und exprimierten das Transgen nach einem Monat Kultur weiterhin. Als eine Negativkontrolle wurde der stabil mit FRT/GFPm transformierte Callus außerdem mit einem kein FLP-enthaltenden Plasmid beschossen. Diese Behandlung erzeugte keine GFP-exprimierenden Sektoren.
Als eine zweite Kontrolle für dieses Experiment wurden die aufeinander folgenden Behandlungen in entgegengesetzter Reihenfolge durchgeführt. Unreife Hi-II-Embroys wurden mit PHP8007 beschossen, welches das FLP-Rekombinasegen und ein Bialaphosresistenzgen trägt. Stabile Transformanten wurden auf die Selektion auf Bialaphos-enthaltendem Medium folgend rückgewonnen. Diese Calli wurden mit PHP8674 erneut beschossen. GFP-Expression wurde im Callus beobachtet, aber diese ließ über 5 bis 10 Tage nach, bis sie nicht länger nachgewiesen werden konnte. Der stabil transformierte Callus exprimiert FLP-Rekombinase. Einführung von PHP8674 stellte wahrscheinlich das Substrat zur Excision (die FRT-Stellen zusammen mit Spacer DNA zwischen den Stellen) bereit, welche die GFP-Kassette, während immer noch auf dem Plasmid, aktivierte. Diese "aktivierte Expression" war nur transient und verschwand, während das Plasmid abgebaut wurde.
BEISPIEL 6
GFP-Targeting zum Nucleus als ein Fusionsprotein
Plasmid PHP9053 wurde konstruiert, bei dem das GFP-Protein an das ALS-Enzym (als MALS für Mais-ALS bezeichnet) fusioniert war. Das ALS-Gen, welches ein normalerweise im Zytoplasma gefundenes Protein codiert, wird typischerweise verwendet, um Herbizidresistenz zu verleihen. Fang et al., Plant Mol. Biol. 18: 1185–1187 (1992). Ein Kernlokalisierungssignal von Affenvirus 40 wurde an den N-Terminus von GFPm fusioniert, wie in Beispiel 1 beschrieben (Kalderon et al., Cell 39: 499–509 (1984)) wobei das ALS-Enzym an den C-Terminus fusioniert wurde. Die dieses Kern-targetierte Fusionsprotein (im Konstrukt PHP9053) codierende Sequenz wurde in Maiszellen unter Verwendung von Partikelbeschuss, wie zuvor beschrieben, eingeführt. Sobald Genexpression durch GFP-Fluoreszenz unter dem Mikroskop bestätigt war, wurde Gewebe, wie früher beschrieben, fixiert und untersucht, um die subzelluläre Lokalisierung von GFP zu bestimmen. Fluoreszenz wurde im Nucleus lokalisiert. Pflanzenregeneration und Abschätzung der Toxizität ist für dieses Experiment noch nicht durchgeführt worden.
GFP wurde zum Nucleus durch Fusionieren des Proteins an ein anderes Polypeptid, das normalerweise im Nucleus kompartimentalisiert ist, targetiert. Beispielsweise enthält die GFPZm~RAD51-Fusion, gefunden in Plasmid PHP8744, RAD51, ein Protein, das für mitotische und meiotische Rekombination und Doppelstrangbruchreparatur erforderlich ist, an GFP fusioniert. Das RAD51-codierende Gen wurde aus Hefe kloniert. Haaf et al., Proc. Nat Acad. Sci. 92: 2298–2302 (1995). Degenerierte Primer, basierend auf der Nucleotidsequenz des RAD51-Gens, kloniert von Hefe, wurden verwendet, um Klone zu identifizieren und isolieren, die das RAD51-Gen aus Mais enthalten. Der Carboxy-Terminus von GFPm wurde an den Aminoterminus von ZmRAD51a fusioniert. Maiszellen wurden mit der GFPm Zm~RAD51-Fusion transformiert und Fluoreszenz wurde im Nucleus lokalisiert. Pflanzenregeneration und Einschätzung der Toxizität ist für dieses Experiment noch nicht durchgeführt worden.
Obwohl sich das Vorangehende auf besonders bevorzugte Ausführungsformen bezieht, wird verstanden werden, dass die vorliegende Erfindung damit nicht limitiert ist. Es wird denjenigen mit gewöhnlicher Fähigkeit im Fachgebiet in den Sinn kommen, dass verschiedene Modifikationen an den offenbarten Ausführungsformen durchgeführt werden können und dass solche Modifikationen beabsichtigt sind, innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung zu sein, der durch die folgenden Ansprüche definiert wird.
Alle Publikationen und Patentanmeldungen, die in dieser Beschreibung erwähnt sind, sind Beispiele für den Grad des Fachkönnens jener im Fachgebiet, die diese Erfindung betrifft.

Claims

Isoliertes DNA-Molekül, das eine Nucleotid-Sequenz umfasst, die aus der Gruppe, bestehend aus: (a) der in 1 dargestellten Nucleotid-Sequenz (GFPm); (b) der in 1 dargestellten Nucleotid-Sequenz, worin die Nucleotide TCC in Positionen 193–195 in ACG geändert sind, (GFPr); (c) der in 1 dargestellten Nucleotid-Sequenz, in der die Nucleotide TAC in den Positionen 196–198 in CAC geändert sind, (BFP); und (d) der in 1 dargestellten Nucleotid-Sequenz, in der die Nucleotide TTC in den Positionen 295–297 in AGC geändert sind, die Nucleotide ATG in den Positionen 457–459 in ACC geändert sind und die Nucleotide GTG in den Positionen 487–489 in GCC geändert sind, (GFPs), ausgewählt ist, wobei das isolierte DNA-Molekül funktionell an eine Nucleotid-Sequenz gebunden ist, die für eine Signal-Sequenz für eine subzelluläre Lokalisierung codiert, welche das durch dieses DNA-Molekül codierte Protein zu einem subzellulärem Kompartiment lenkt.
Expressionsvektor, der das DNA-Molekül nach Anspruch 1 umfasst.
Verfahren unter Verwendung des Expressionsvektors nach Anspruch 2 zur Herstellung einer transformierten Pflanze, umfassend die Schritte: Einführen des Expressionsvektors in regenerierbare Pflanzenzellen, Durchmustern nach Zellen, die GFPm, GFPr, BFP oder GFPs enthalten, und Regenerieren einer transformierten Pflanze aus den transformierten Zellen, die durch das Durchmustern als solche identifiziert wurden, die GFPm, GFPr, BFP oder GFPs enthalten.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die regenerierbaren Pflanzenzellen aus der Gruppe, bestehend aus Zea-, Brassica- und Helianthus-Zellen, ausgewählt sind.
Transgene Pflanze, die das DNA-Molekül nach Anspruch 1 enthält.
Transgene Pflanze, die das DNA-Molekül nach Anspruch 1 enthält, wobei die Pflanze aus der Gruppe, bestehend aus den Gattungen Zea, Brassica und Helianthus, ausgewählt ist.
Transgene Zeamays-Pflanze, die das DNA-Molekül nach Anspruch 1 enthält.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die transformierte Pflanze ohne Selektion von Zellen, die ein Gen tragen, welches Resistenz gegenüber einer toxischen Substanz verleiht, produziert wird.