DE69720442T2 - Enzymatisches veresterungsverfahren - Google Patents

Enzymatisches veresterungsverfahren

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Monoestern von aliphatischen, gesättigten oder ungesättigten, geradkettigen oder verzweigten Monocarbonsäuren, die 2 bis 24 Kohlenstoffatome haben und mehrwertigen Alkoholen in Gegenwart einer Acylhydrolase.
  • Wenn eine Carbonsäure und ein Polyol für ein Veresterungsverfahren miteinander in Kontakt gebracht werden, wird ein Gemisch gebildet, das vollständig verestertes Polyol und Polyole, die teilweise zu verschieden Graden verestert sind: Monoester, Diester, usw., umfaßt. Es schien sehr schwierig, selektiv Monoester zu erhalten, wenn verschiedene Hydroxyl- Gruppen an dem Polyol für eine Reaktion verfügbar sind.
    • STAND DER TECHNIK
  • In der Vergangenheit gab es viele Untersuchungen zur Entwicklung eines zweckdienlichen Verfahrens für die selektive Herstellung von Monoestern von Polyolen. Es wurden sowohl enzymatisch katalysierte wie auch nicht-enzymatisch katalysierte Verfahren untersucht. Eine Übersicht über die verschiedenen Wege, nach denen dieses Problem unter Verwendung enzymatisch katalysierter Verfahren untersucht wurde, wird von U. T. Bornscheuer in "Enzyme and Microbial Technology", 17, 578-586, 1995 gegeben.
  • Ein Beispiel für ein derartiges Verfahren, das Enzyme mit Esterase-Aktivität, z. B. Lipasen oder Esterasen, verwendet, wird in der europäischen Patentschrift EP-B-0 215 038 (Novo Industri A/S) gegeben. In diesem Patent wurde ein Verfahren zur Herstellung von Monoglyceriden beschrieben, indem zuerst zwei Hydroxyl-Gruppen von Glycerin durch Umwandlung dieser in ein Ketal oder ein Acetal, z. B. Isopropylidenglycerin oder Glycerindiethylketal, blockiert werden. Dieses Ketal oder Acetal wird dann mit einer Carbonsäure oder einem Carbonsäureester in Gegenwart einer Esterase umgesetzt. Die Acetal- oder Ketal-Schutzgruppe wird dann durch Säurekatalyse aus dem resultierenden Ester unter Herstellung eines Monoglycerids entfernt. Diese Synthese stellt einen eher mühsamen Weg dar, da zuerst zwei benachbarte Hydroxyl-Gruppen des Glycerinmoleküls blockiert werden müssen, was eine chemische Reaktion beinhaltet, und die Blockierungsgruppe dann in einem abschließenden Schritt zur Entfernung der Schutzgruppe entfernt werden muß.
  • Daher besteht noch ein Bedarf für ein einfaches enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Fettsäuremonoestern von mehrwertigen Alkoholen, das bezüglich des Preises des Enzyms attraktiv ist und das zu hohen Ausbeuten an Monoglycerid und möglichst geringen Mengen an Diestern und höheren Estern führt.
  • Eine Gruppe von engverwandten Glycoproteinen, die als Patatin bekannt sind, ist für Lipidacylhydrolase-Aktivität, die in Kartoffelknollen gefunden wird, verantwortlich. Die Lipidacylhydrolase ist nur für ihre Aktivität, die Deacylierung (Hydrolyse) einer Reihe natürlich auftretender Lipide, z. B. Monoglyceride, Diglyceride und Phospholipide, zu katalysieren, bekannt (Biochem. J. 121 (3), 379-390 (1971)
  • Die Verwendung einer Lipidacylhydrolase für die Bildung von Wachsestern aus langkettigen Monocarbonsäuren und langkettigen einwertigen Alkoholen wurde gezeigt (S. Dennis und T. Galliard, Phytochemistry 13 [11], 2469-2473 [1974]). Es ist überraschend, daß die Synthese von Polyolmonoestern, z. B. Monoglyceriden, niemals nahegelegt oder vorgeschlagen worden ist.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Wir haben festgestellt, daß eine Lipidacylhydrolase, die inter alia in Kartoffelknollen auftritt, für die enzymatische Herstellung von Monoestern von aliphatischen Carbonsäuren und mehrwertigen Alkoholen besonders geeignet ist. Dieses Enzym ist in guten Mengen verfügbar, da es relativ einfach aus reichlich verfügbaren Rohmaterialien erhalten werden kann. Obgleich die Knollen die höchste Menge an diesem Enzym enthalten, können geringere Mengen auch in anderen Teilen der Kartoffelpflanze gefunden werden. Dieses Enzym kann auch durch Anwendung der Gentechnologie erhalten werden.
  • Demnach betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Monoestern von aliphatischen, gesättigten oder ungesättigten, geradkettigen oder verzweigten C&sub2;-C&sub2;&sub4;- Monocarbonsäuren und mehrwertigen Alkoholen in Gegenwart eines Enzyms, wobei das Enzym Kartoffelipidacylhydrolase ist, was bedeutet, daß die Hydrolase aus Kartoffeln erhältlich ist oder mit dieser bezüglich der Substratspezifität identisch ist. Die Enzymselektivität katalysiert die Bildung von Monoglyceriden. Es werden auch höhere Ester gebildet, aber nur in sehr geringen Mengen.
    • BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • Fig. 1 zeigt den Anstieg des Acylgylcerin-Gehalts, wenn die enzymatische Veresterung von Carbonsäure und Polyol fortschreitet. MG ist Monoglycerid, DG ist Diglycerid. Die Temperatur ist 40ºC, der Wassergehalt ist 3,3 Gew.-%.
  • Fig. 2 zeigt die Erhöhung des Acylglycerin-Gehalts, wenn die enzymatische Veresterung von Carbonsäure und Polyol fortschreitet, und zwar mit und ohne Anwendung eines Vakuums. MG ist Monoglycerid, DG ist Diglycerid.
    • DETAILS DER ERFINDUNG
  • Vorzugsweise werden aliphatische gesättigte geradkettige Monocarbonsäuren mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen verwendet.
  • Der mehrwertige Alkohol wird aus der Gruppe bestehend aus zweiwertigen Alkoholen, z. B. Glycolen wie Ethylenglycol, Propylenglycol, Dipropylenglycol, dreiwertigen Alkoholen, z. B. Glycerin, vierwertigen Alkoholen, z. B. Diglycerin, fünfwertigen Alkoholen, sechwertigen Alkoholen, z. B. den Zuckeralkoholen und weiteren Zuckern, Zuckeralkylethern, z. B. die Alkylglycoside und Gemischen davon ausgewählt. Die Verwendung von Glycerin, Diglycerin und C&sub1;-C&sub1;&sub8;-Alkylglycosiden, z. B. Ethylglycosid, ist bevorzugt.
  • Die Lipidacylhydrolase gemäß der Erfindung kann in Form eines Protein-Extrakts, der aus Kartoffelknollen isoliert wird, verwendet werden, wobei der Extrakt angereichert sein kann. Eine spezifische Acylhydrolase, die aus Kartoffeln extrahiert wird, ist als Patatin bekannt. Der Protein-Extrakt kann auch aus dem Kartoffellaub erhalten werden. Das Protein kann auch unter Anwendung der Gen-Technologie erhalten werden. Die Gene, die für Patatin codieren, wurden erfolgreich kloniert. Demnach ist die fermentative Produktion von Patatin unter Verwendung von genetisch modifizierter Hefe oder genetisch modifiziertem Schimmel auch in hohen Ausbeuten möglich.
  • Der Gesamtwassergehalt des Reaktionsgemisches wird vorzugsweise unter 10 Gew.-%, vorzugsweise bei 0,01 bis 5 Gew.-% gehalten. Nach einer bevorzugten Möglichkeit wird das während der Reaktion gebildete Wasser entfernt. Dies kann unter Verwendung einer beliebigen Technik, die auf dem Gebiet bekannt ist, erreicht werden, z. B. durch Pervaporation und Vakuumverdampfung.
  • Die Reaktionstemperatur liegt zwischen 10ºC und 90ºC, vorzugsweise zwischen 25ºC und 55ºC.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch zur Qualitätsverbesserung von Monoglyceriden technischer Qualität, die freie Fettsäuren enthalten, geeignet. Demnach besteht eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung in einem Verfahren zur Entacidifizierung eines rohen Monoglycerids, das Umsetzen des Monoglycerids in Gegenwart von Glycerin und einer katalytischen Menge von Kartoffellipidacylhydrolase unter ähnlichen Bedingungen wie sie oben beschrieben wurden, umfaßt.
  • Das Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung kann effektiv in einer immobilisierter Form, z. B. auf Diatomeenerde-Partikel getragen, eingesetzt werden.
  • Die vorliegende Erfindung wird mit den folgenden Beispielen erläutert.
    • BEISPIEL 1 HERSTELLUNG VON KARTOFFEL-PROTEIN-EXTRAKTE
  • Kartoffelknollen (Varietät Sante) (1,8 kg) wurden gewaschen, geschält und in Stücke gehackt, die unverzüglich in 0,01 Gew.-% Natriummetabisulfit-Lösung, die 10 Gew.-% Polyvinylpyrrolidon (PVPP) (von Sigma Chemical Co.) enthielt, eingetaucht werden. Nach Ablaufen des wäßrigen Gemisches und PVPP wurden die Kartoffelstücke in Kunststoffbeutel gegeben und bei -18ºC gefroren.
  • Ein Aliquot der Kartoffelstücke (1,6 kg) wurde dann auftauen gelassen und in einem Waring-Mischer bei 4ºC für 1 Minute mit 1,5 l 100 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7,0), der 0,02 Gew.-% Natriummetabisulfit und 1 Gew.-% PVPP enthielt, homogenisiert. Das Homogenat wurde durch drei Musslineschichten filtriert und das Filtrat wurde mit 8000 g 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde über Nacht bei 4ºC gegen 10 l entionisiertes Wasser dialysiert. Das resultierende dialysierte Gemisch wurde bei 18 000 g für eine Stunde zentrifugiert und der Überstand wurde unter Verwendung einer Gefriertrocknungsvorrichtung einem Roll-Schicht-Frosten unterzogen und auf ein Volumen von etwa 100 ml reduziert. Nach dem Tauen wurde die konzentrierte Lösung bei 18 000 g für eine Stunde zentrifugiert und der Überstand wurde einem Roll-Schicht-Frosten unterzogen und gefriergetrocknet, wodurch ein Pulver (7,2 g) erhalten wurde, das etwa 50 Gew.-% Protein enthält.
    • BEISPIEL 2 MONOGLYCERID-SYNTHESE AUS OLEINSÄURE
  • Gemische, die Ölsäure (90%, von Aldrich Chemical Co.) (1,41 g = 5 mmol), Glycerin (PricerinTM 9098, von Unichema International) (0,56 g = 6,1 mmol), Kartoffelproteinextrakt (100 mg) und verschiedene Mengen an Wasser (0-70 ul) enthielten, wurden in zugestöpselten Teströhrchen bei verschiedenen Temperaturen (40-60ºC) gerührt. Aus den Reaktionsgemischen wurden periodisch Proben zur Analyse durch GC und TLC entnommen.
  • Eine typische Reaktionsablaufkurve für die Reaktion, die bei 40ºC ablief, ist in Fig. 1 gezeigt. Die Hauptprodukte der Reaktionen waren Monoglyceride (MG) mit nur geringen Leveln an Diglyceriden (DG). Die Untersuchung der Endprodukte durch TLC zeigte, daß keine Triglyceride gebildet wurden.
  • Tabelle 1 zeigt die Zusammensetzungen der Produkten, die nach 72 Stunden Reaktion bei verschiedenen Temperaturen und verschiedenen Wassermengen gebildet worden waren. Sie zeigt auch die Anfangsreaktionsraten, berechnet aus den Ablaufkurven. Die Reaktionsraten werden als Mikromol Produkt pro Minute und pro Gramm Extrakt ausgedrückt. Bei 40ºC hatte der Wasserzusatz nur einen geringen Effekt auf die Endproduktausbeute, er verursachte aber eine leichte Stimulation der Anfangsreaktionsrate. Ein Ansteigen der Reaktionstemperatur führte zu einem Ansteigen der Anfnangsreaktionsrate. Mit 3,3 Gew.-% Wasser wurde eine Höchstumwandlung bei 50ºC beobachtet. Bei 60ºC war die Anfangsreaktionsrate höher, allerdings war die Endumwandlung niedriger, was nahe legt, daß während einer Reaktion bei dieser höheren Temperatur eine Enzyminaktivierung auftrat. Bei 50ºC mit 313 Gew.-% Wasser wurden 75% der Ölsäure in ein Acylglycerin-Gemisch, bestehend aus 96 mol-% MG und 4 mol-% DG, umgewandelt.
  • In Abwesenheit von Kartoffelextrakt war die Rate der Acylglycerin-Bildung sehr langsam (< 0,01 umol·min&supmin;¹ pro Gramm Extrakt bei 60ºC).
    • BEISPIEL 3 SYNTHESE VON MONOOLEIN UNTER ANWENDUNG VON VAKUUM ZUR VERBESSERUNG DER AUSBEUTE
  • Ein Gemisch aus Ölsäure (1,5 g = 5,32 mmol), Glycerin (0,57 g = 6,2 mmol), Wasser (70 ul) und Kartoffelprotein- Extrakt (100 mg) wurde bei 50ºC gerührt und es wurde ein Vakuum (< 50 mbar) an das System angelegt, wobei eine Ölpumpe verwendet wurde, um Wasser aus dem Gemisch zu entfernen. Zum Vergleich wurde eine entsprechende Reaktion ohne Vakuum in einem zugestöpselten Rohr durchgeführt. Periodisch wurden Proben aus den Reaktionsgemischen zur Analyse durch GC entnommen. Die Ablaufkurven für die Reaktionen sind in Fig. 2 angegeben. Bei der unter Vakuum durchgeführten Reaktion wurden 4,43 mmol MG und 0,1 mmol DG nach 72 h gebildet. 87% der Ölsäure wurde in Acylglycerine umgewandelt. In der Vergleichsreaktion waren nach 72 Stunden 3,51 mmol MG und 0,14 mmol DG gebildet worden. Die endgültige Umwandlung von Ölsäure in Acylglycerine war 71%.
    • BEISPIEL 4 SYNTHESE VON MONOGLYCERIDEN AUS VERSCHIEDENEN FETTSÄUREN
  • Gemische aus Fettsäure (5,1 mmol), Glycerin (6,1 mmol), Wasser (70 ul) und Kartoffelprotein-Extrakt (50 mg) wurden bei verschiedenen Temperaturen in zugestöpselten Röhrchen gerührt. Die Produkte, die nach 6 Stunden gebildet worden waren, wurden durch GC analysiert. Tabelle 2 zeigt die Ausbeuten an Mono- und Diglyceriden für eine Reihe gesättigter und ungesättigter Fettsäuren. Für langkettige gesättigte Fettsäuren war eine hohe Reaktionstemperatur (70ºC) notwendig, um die Reaktanten zu schmelzen. Es wurde eine geringere Ausbeute an MG erhalten, und zwar vermutlich wegen der Inaktivierung des Protein-Katalysators bei der hohen Reaktionstemperatur.
    • BEISPIEL 5 HERSTELLUNG EINES IMMOBILISIERTEN ENZYMS
  • Kartoffelprotein-Extrakt (500 mg) wurde in 1,5 ml Phosphatpuffer (pH 7,0, 10 mM) gelöst. Säuregewaschene, schmelzcalcinierte Diatomeenerde (1,0 g) (CeliteTM von Manville Corporation) wurde zu der Protein-Lösung gegeben. Nach dem Mischen wurde eine dicke Paste erhalten. Diese Paste wurde über Nacht bei Raumtemperatur in einem Vakuumofen unter Erhalt eines immobilisierten Enzympulvers getrocknet.
    • BEISPIEL 6 SYNTHESE VON MONOGLYCERIDEN UNTER VERWENDUNG VON IMMOBILISIERTEM ENZYMPULVER
  • Ein Gemisch aus Ölsäure (1,42 g = 5,04 mmol), Glycerin (0,57 g = 6,2 mmol), Wasser (70 ul) und Pulver aus immobilisiertem Enzym (100 mg) wurden in einem zugestöpselten Röhrchen bei 40ºC für AS Stunden gerührt. Eine Analyse des Reaktionsproduktes durch GC zeigte die Bildung von 3,31 mmol Monoolein und 0,24 mmol Diolein. Das Pulver aus immobilisiertem Enzym erwies sich als effektiver Katalysator für eine MG-Synthese. TABELLE I Effekt von Temperatur und zugesetzter Wassermenge auf die Monoglycerid- und Diglycerid-Synthese
    • BEISPIEL 7 SYNTHESE VON DIOLMONOESTERN VON ÖLSÄURE
  • Gemische aus Ölsäure (7,05 g = 25 mmol), Diol (von Aldrich Chemcal Co.) (25 mmol), Wasser (350 ul) und Kartoffelprotein- Extrakt (500 mg) wurden bei 30ºC in zugestöpfselten Schläuchen 6 Stunden lang gerührt. Die resultierenden Reaktionsgemische wurden durch GC analysiert. Die Resultate, die in Tabelle III angegeben werden, zeigen, daß Monoester die Hauptreaktionsprodukte waren und nur geringe Konzentrationen an Diestern gebildet wurden. TABELLE II Monoglycerid- und Diglycerid-Synthese aus verschiedenen Fettsäuren TABELLE III Synthese von Ölsäureestern von Diolen
    • BEISPIEL 8 SYNTHESE VON DIGLYCERINESTERN VON ÖLSÄURE
  • Ein Gemisch aus Ölsäure (1,45 g = 5,14 mmol), Diglycerin (von Unichema International: enthält 92% Diglycerine, 4% Glycerin, 4% andere Polyole) (0,9 g), Wasser (70 ul) und Kartoffelprotein-Extrakt (100 mg) wurden bei 50ºC gerührt und es wurde ein Vakuum (< 50 mbar) unter Verwendung einer Ölpumpe an das System angelegt. Nach 48 Stunden wurde die Reaktion gestoppt und die Produkte durch GC analysiert. Die Hauptreaktionsprodukte waren Diglycerinmonoester (2,60 mmol). Geringere Mengen an Diglycerindiestern (0,56 mmol) und MG (0,18 mmol) wurden ebenfalls gebildet.
    • BEISPIEL 9 SYNTHESE VON PROPANDIOLMONOESTERN VON CAPRINSÄURE
  • Gemische von Caprinsäure (von Fluka) (0,85 g = 5 mmol) und entweder Propan-1,2-diol oder Propan-1,3-diol (von Aldrich Chemical Co.) (0,38 g = 5 mmol), Wasser (70 ul) und Kartoffelprotein-Extrakt (100 mg) wurden bei 35ºC in zugestöpselten Röhrchen 24 Stunden gerührt. Die Reaktionsprodukte wurden durch GC analysiert. Mit Propan-1,2-diol wurden 0,28 mmol Caprinsäuremonoester gebildet, während mit Propan-1,3-diol 1,02 mmol Monoester produziert wurden. In den Reaktionsprodukten wurden nur geringe Konzentrationen an Diestern nachgewiesen.
    • Beispiel 10 SYNTHESE VON DIGLYCERINESTERN VON CAPRINSÄURE
  • Ein Gemisch aus Caprinsäure (0,86 g = S mmol), Diglycerin (0,82 g), Wasser (70 ul) und Kartoffelprotein-Extrakt (100 mg) wurde bei 35ºC in einem zugestöpselten Rohr für 8 Stunde gerührt. Eine Analyse des resultierenden Gemisches durch GC zeigte, daß die Hauptreaktionsprodukte Caprinsäuremonoester von Diglycerin waren (1,72 mmol). Geringere Mengen an Diglycerindiester (0,24 mmol) und Monoglyceriden (0,11 mmol) wurden auch gebildet.
    • BEISPIEL 11 SYNTHESE VON ETHYLGLUCOSIDMONOCAPRAT
  • Ein Gemisch aus Caprinsäure (0,86 g = 5 mmol), Ethylglucosid (von Unichema International: enthaltend -80% Ethylglucoside, 7% Glucose und 10% Diglucoside) (1,04 g), Wasser (70 ul) und Kartoffelprotein-Extrakte (100 mg), wurde in einem zugestöpselten Rohr 72 Stunden bei 35ºC gerührt. Eine Analyse des resultierenden Reaktionsgemisches durch GC zeigte, daß 0,21 mol Ethylglucosidmonocaprat produziert worden waren. Es wurden nur Spurenmengen an Ethylglucosiddiestern nachgewiesen.
    • BEISPIEL 12 SYNTHESE VON SORBITESTERN
  • Ein Gemisch aus Caprinsäure (0,86 g = 5 mmol), Sorbit (von Aldrich Chemical Co.) (,91 g = 5 mmol), t-Butanol (500 ul), Wasser (70 ul) und Kartoffelprotein-Extrakt (100 mg), wurde bei 35ºC in einem zugestöpselten Rohr für 72 Stunden gerührt. Eine Analyse des resultierenden Reaktionsgemischs zeigte, daß Sorbitmonocaprat (0,12 mmol) und Sorbitdicaprat (0,04 mmol) gebildet worden waren.

Claims (11)

1. Verfahren zur Herstellung von Monoestern von aliphatischen gesättigten oder ungesättigten geradkettigen oder verzweigten C&sub2;-C&sub2;&sub4;-Monocarbonsäuren und mehrwertigen Alkoholen in Gegenwart eines Enzyms, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Kartoffellipidacylhydroläse ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine aliphatische gesättigte geradkettige C&sub6;-C&sub2;&sub2;-Monocarbonsäure verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der mehrwertige Alkohol aus der Gruppe bestehend aus zweiwertigen Alkoholen, dreiwertigen Alkoholen, vierwertigen Alkoholen, fünfwertigen Alkoholen, sechswertigen Alkoholen, Zuckern, Zuckeralkylethern und Gemischen davon ausgewählt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der mehrwertige Alkohol Glycerin oder Diglycerin ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der mehrwertige Alkohol ein C&sub1;-C&sub1;&sub6;-Alkylglycosid ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Kartoffellipidacylhydrolase Patatin ist.
7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Kartoffelverfahren nach Anspruch 1, wobei die Kartoffellipidacylhydrolase ein Protein-Extrakt ist, der aus Kartoffelknollen isoliert wurde.
8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Lipidacylhydrolase durch Fermentation unter Verwendung einer genetisch modifizierten Hefe oder eines genetisch modifizierten Schimmels erhalten wird.
9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Gesamtwassergehalt des Reaktionsgemisches weniger als 10 Gew.-% beträgt.
10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Reaktionstemperatur zwischen 10ºC und 90ºC liegt.
11. Verfahren zur Endacidifizierung eines rohes Monoglycerid und freie Fettsäuren enthaltenden Gemisches, wobei das Gemisch in Gegenwart von Glycerin und einer katalytischen Menge von Patatin bei einer Temperatur von 25ºC bis 50ºC umgesetzt wird.
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