DE69216631T2

DE69216631T2 - Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Alpha-Glykosiden und deren Estern

Info

Publication number: DE69216631T2
Application number: DE69216631T
Authority: DE
Inventors: Pierre Frederic F-31700 Mondonville Monsan; Francois Marie Bernard Paul; Vincent Pascal F-31000 Toulouse Pelenc
Original assignee: Ulice SA
Current assignee: Ulice SA
Priority date: 1991-08-12
Filing date: 1992-08-07
Publication date: 1997-08-07
Anticipated expiration: 2012-08-08
Also published as: EP0605453A1; WO1993004185A1; ATE147435T1; FI940610A0; CA2115164A1; JPH07501208A; AU2490892A; JP3370670B2; AU675205B2; ES2098527T3; FR2680373A1; EP0605453B1; FR2680373B1; DE69216631D1; FI940610A; CA2115164C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein enzymatisches, stereospezifisches Herstellungsverfahren von α-Glucosiden, ausgehend von wenig teuren und in großer Menge verfügbaren Rohstoffen, nämlich der Stärke und den Maltodextrinen, sowie direkt, ausgehend von landwirtschaftlichen Rohstoffen, welche diese enthalten können, wie Mehl- oder Grießsorten. Ebenso betrifft die Erfindung ein Veresterungsverfahren von derart erhaltenen α-Glucosiden.
Die Stärke ist in der Natur sehr stark vertreten. In der Tat stellt sie eine wichtige Nahrung für die Pflanzen dar, und große Mengen werden von den Pflanzenorganismen gespeichert, um das Leben des Stiels oder der Wurzelknolle während der Winterruhe zu unterhalten und die Entwicklung des Keims während des Keimens zu gewährleisten.
Unter Berücksichtigung des Überflusses dieser Substanz wurden zahlreiche Versuche zur industriellen Verwertung durchgeführt, wobei die Mehrzahl dieser eine Hydrolysereaktion umfaßt. Die Stärke wird durch verdünnte Säuren hydrolysiert, wobei die vollständige saure Hydrolyse D-Glucose liefert. Fragmente mit höherem Molekulargewicht, die Dextrine, werden durch kontrollierte saure Hydrolyse und durch Temperatureinwirkung erhalten. Ebenso kann die Stärke durch Enzyme (Amylasen) hydrolysiert werden.
Die Hydrolyseprodukte der Stärke können zur Herstellung von Glucosiden dienen. Diese Verbindungen, insbesondere die Alkylglucoside, sind als nichtionische, biologisch abbaubare, grenzflächenaktive Substanzen und Detergentien nützlich. Sie können als Emulgiermittel bei pharmazeutischen, kosmetischen und Lebensmittelprodukten verwendet werden.
Die chemische Synthese von Alkylglucosiden, ausgehend von Glucose, wurde bereits beschrieben (beispielsweise in EP-A-0 301 298). Diese Art chemisches Verfahren kann jedoch eine sehr große Anzahl verschiedener Schritte umfassen und liefert stets ein Anomerengemisch von α/β-Alkylmono- und -Alkylpolyglucosiden. Diese Gemische besitzen nicht die genauen physikalisch-chemischen Eigenschaften, und weisen alle die Nachteile auf, die damit verbunden sind, nämlich kein genauer Schmelzpunkt, keine Ortsselektivität oder die Möglichkeit von Nebenreaktionen.
Die enzymatische Herstellung von Alkylglucosiden, ausgehend von Maltose, wurde ebenfalls vorgeschlagen (S. C. Pan, Biochemistry, 9(8) (1970), 1833 - 1838 und Itano K. et al., Carbohydrate Research, 87 (1990), 27 - 34). Pan beschreibt die Transglucosylierung eines Alkohols, wie Butanol, mit der Maltose als Glucose-Lieferant in Gegenwart eines Überstandes einer Aspergillus niger-Kultur. Die Identität des(der) Enzyms(Enzyme), das(die) in dem Überstand enthalten ist(sind) und für die Transglucosylierung verantwortlich ist(sind), wurde mcht untersucht. Die anomere Konfiguration (α oder β) der erhaltenen Alkylglucoside wurde nicht überprüft. Itano beschreibt die enzymatische Herstellung von α-Glucosid aus Cyclohexandiol, wobei als Glucose-Lieferant Maltose und als Glucose-Akzeptor trans-1,2-Cyclohexandiol eingesetzt werden. Diese Umsetzung verwendet ein Rohgemisch aus verschiedenen Enzymen, die in der Landwirtschafts- und Nahrungsmittelindustrie eingesetzt werden, von denen die Mehrzahl Hydrolasen sind. Diese Präparate enthalten unter anderem nicht identifizierte Enzyme.
Die nach diesen enzymatischen Verfahren erhaltenen Ausbeuten sind gering und ermöglichen keine Synthese von Alkylglucosiden im industriellen Maßstab. Außerdem ist die anomere Konfiguration der erhaltenen Produkte aufgrund der zahlreichen Enzyme, die während der Umsetzung zugegen sind, und insbesondere aufgrund einer nicht identifizierten β-Glucosidase-Aktivität manchmal unvorhersehbar.
Schließlich beschreiben Fogarty et al. (Biotechnology Letters, 4(1) (1982), 61 - 64) die Herstellung von α-Glyceringlucosid durch die enzymatische Transglucosylierung von Glycerin mit α-Methylglucosid als Glucose-Lieferant. Das in dieser Umsetzung eingesetzte Enzym ist die gereinigte Transglucosidase von A. niger. Unter den beschriebenen Bedingungen kann das Glycerin die Rolle des Glucose-Akzeptors nur mit einer sehr begrenzten Anzahl von Substraten spielen. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Transglucosidase, wie viele Transferasen, in der Lage ist, auf eine verhältnismäßig große Anzahl von Akzeptoren einzuwirken, aber dafür ist die Anzahl der Substrate oder Lieferanten, deren sie sich bedienen kann, sehr begrenzt.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zur stereospezifischen Herstellung von α-Glucosiden bereitzustellen, bei dem sich erhöhte Ausbeuten ergeben, die für eine Nutzung im industriellen Maßstab geeignet sind, und bei dem als Rohstoffe die Stärke oder Maltodextrine verwendet werden können, ebenso wie landwirtschaftliche Rohstoffe mit hohem Stärkegehalt, wie Mehl- oder Grießsorten. Das gesuchte Verfahren soll einfach, direkt und kostengünstig sein. Ein weitere Aufgabe der Erfindung ist, ein Behandlungsverfahren von stärkehaltigen Rohstoffen, wie der Stärke oder den Maltodextrinen, bereitzustellen, das die Produktion von höherwertigen Verbindungen, beispielsweise umfassend α-Glucosidester, ermöglicht.
Überraschenderweise haben die Erfinder nunmehr festgestellt, daß α-Glucoside im industriellen Maßstab durch enzymatische α-Transglucosylierung unter Verwendung der Stärke oder von Maltodextrinen als Substrate oder "Glucose-Lieferanten" und von Alkoholen als Co Substrate oder "Glucose-Akzeptoren" hergestellt werden können.
Vollkommen unerwarteterweise können in dieser Umsetzung polymere Moleküle, wie die Stärke oder die α-Maltodextrine, die Rolle von Glucose-Lieferanten spielen. Wie vorstehend angegeben, kann die α-Transglucosidase die Übertragung eines Glucosylrests auf eine verhältnismäßig große Anzahl von Akzeptoren (im vorliegenden Fall der Alkohol) bewirken, aber kann nur sehr wenige Molekule als Substrate verwenden.
Insbesondere betriffi die Erfindung ein enzymatisches Herstellungsverfahren von α-Glucosiden (ebenfalls unter dem Namen α-Glucopyranoside bekannt), gekennzeichnet durch Inkontaktbringen mindestens eines Alkohols, dessen einzige fünktionelle Gruppe(n) (eine) Hydroxylgruppe(n) ist(sind), mit Stärke, Maltodextrinen oder Maltose, die in einer Konzentration von mindestens etwa 100 g/l vorliegen, in Gegenwart einer gereinigten Enzympräparation, die eine α-Transglucosylierungs-Aktivität aufweist, aber keine α-Glucosidase-Aktivität.
Die durch dieses Verfahren erhaltenen Produkte sind α-Glucoside, die aus wenigstens einem Glucosemolekul und einem Alkohol aufgebaut sind, deren Kohlenstoffkette gemäß der Art des an der Umsetzung beteiligten Alkohols in Länge und Struktur variabel ist. Das Produkt weist kein β-Glucosid auf. Die Biosynthese wird unter wenig aggressiven Reaktionsbedingungen bei gemäßigter Temperatur (20 bis 70ºC, beispielsweise zwischen 30 und 60ºC) und bei einem pH-Wert zwischen 3 und 7, vorzugsweise 4 und 6, durchgeführt. Dadurch wird die Erzeugung von Abbauprodukten der Glucose vermieden.
Im Zusammenhang mit der Erfindung bedeutet eine Enzympräparation, "die eine α- Transglucosylierungs-Aktivität aufweist", eine beliebige Enzympräparation, welche die Übertragung eines Glucosemoleküls (ausgehend von Rohstoffen, die aus Stärke aufgebaut sind oder Stärke enthalten oder aus Stärkehydrolysaten aufgebaut sind oder Stärkehydrolysate enthalten) auf Alkohol bewirken kann.
Unter gereinigt ist zu verstehen,
- daß die Enzympräparation keine weitere enzymatische Aktivität aufweist, die unter den angewandten Bedingungen die Herstellung weiterer Substanzen als der α-Glucoside katalysieren kann,
- daß die Enzympräparation derart ist, daß sie die Erzeugung von Nebenprodukten vermeidet,
- daß die Enzympräparation insbesondere keine α-Glucosidase-Aktivität aufweist.
Die Enzympräparation kann aus einem einzelnen Enzym, das eine α-Transglucosylierungs-Aktivität aufweist, aufgebaut sein.
Ebenso kann die Enzympräparation aus mehreren Enzymen aufgebaut sein, sei es derart, daß jedes eine α-Transglucosylierungs-Aktivität aufweist, oder derart, daß deren enzymatische Aktivitäten zusammengenommen so sind, daß sie der vorstehend genannten Enzympräparation eine α-Transglucosylierungs-Aktivität verleihen.
Es kann sich um eine "echte" α-Transglucosidase handeln, die gleichfalls als "α-Transglucosylase" bekannt ist, d.h. ein Enzym vom Transferase-Typ. Dieser Enzym-Typ ist üblicherweise für seine Fähigkeit bekannt, in verdünntem Medium (beispielsweise 100 g/l Maltose) Oligosaccharide zu synthetisieren.
Als α-Transglucosidasen können die α-Transglucosidasen aus Pilzen erwähnt werden, wie diejenigen, welche von Aspergillus niger, A. batatae, A. oryzae oder Talaromyces duponti stainmen. Die α-Transglucosidasen von Aspergillus niger und von Talaromyces duponti werden besonders bevorzugt. Es ist vorteilhaft, diese Enzyme in gereinigter Form zu verwenden, da die Präparation so keinerlei β-Glucosidase-Aktivität aufweist. Tatsächlich verhindert die Anwesenheit von β-Glucosidase in der Enzympräparation die stereospezifische Synthese von α-Glucosiden.
Die α-Transglucosidase von Aspergillus niger, unter dem Handelsnamen TRANSGLUCOSIDASE-L (Amano Pharmaceutical Corporation Ltd., Japan) erhältlich, enthält üblicherweise keine β-Glucosidase und kann im erfindungsgemäßen Verfahren ohne zusätzliche Reinigung eingesetzt werden. Dagegen wird bei deijenigen von Talaromyces duponti (ebenso unter dem Namen 1,4-α-D-Glucan-6-α-D-glucosyl-transferase bekannt) vorteilhafterweise ein zusätzlicher Reinigungsschritt mittels Ionenaustausch durchgeführt, um die β-Glucosidase zu entfernen, aber diese weist den Vorteil einer großen Thermostabilität auf Dieses Enzym wird in der Europäischen Patentanmeldung EP-A-0 219 673 beschrieben.
Ebenso ist es möglich, ein Gemisch gereinigter Enzyme einzusetzen, beispielsweise die α-Transglucosidasen verschiedener Pilzarten, unter der Bedingung, daß keine weiteren Enzyme vorhanden sind, und daß die verschiedenen Enzyme unter den gleichen Bedingungen wirken.
Ebenso kann das Enzym, das eine α-Transglucosylierungs-Aktivität aufweist, eine ge reinigte Hydrolase sein, die als "Nebeneigenschaft" die Fähigkeit besitzt, α-Transglucosylierungsreaktionen zu bewirken. Dieser Enzym-Typ kann im allgemeinen an seiner Fähigkeit, in verdünntem Medium (beispielsweise 100 g/l Maltose) Glucose zu erzeugen, erkannt werden. Als Beispiele dieses Enzym-Typs können die Hydrolasen, wie die α-Glucosidase, erwähnt werden.
Obwohl diese Enzyme andere Umsetzungstypen als die α-Transglucosylierung bewirken können, begünstigen das Reaktionsmedium, das lediglich aus Stärke, Maltodextrinen oder Maltose und dem Alkohol zusammengesetzt ist, die Erzeugung von α-Glucosiden.
Gemäß der Erfindung ist es möglich, als Substrate oder "Glucose-Lieferanten" Stärke, Maltodextrine oder Maltose oder ein Gemisch dieser Substanzen einzusetzen, ebenso wie die landwirtschaftlichen Rohstoffe, die diese Substanzen enthalten können.
Wird Maltose als Substrat eingesetzt, kann sie in Form eines Gemischs mit weiteren Substanzen, die von stärkehaltigen Stoffen stammen, vorhanden sein, beispielsweise wenn das Substrat ein partielles Stärkehydrolysat ist, kann die Maltose zusammen mit Maltodextrinen vorhanden sein. Die Maltose kann auch allein eingesetzt werden. Die Ausbeuten an erhalte nem α-Glucosid, ausgehend von Maltose, sind manchmal weniger bedeutend als diejenigenen, welche, ausgehend von anderen Substrat-Typen,erhalten werden, und liegen beispielsweise in der Größenordnung von 10 bis 15% (berechnet wie im nachstehenden Beispiel 1).
Die Maltodextrine stellen ein Substrat oder einen "Glucose-Lieferanten" dar, der gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren besonders bevorzugt ist. Dies sind die partiellen Stärkehydrolysate, die aus einem Gemisch von Oligosacchariden mit schwankendem Molekulargewicht aufgebaut sind und zwischen den Glucose-Einheiten lediglich α-1,4-Bindungen aufweisen. Die Maltodextrine können aus der partiellen sauren Hydrolyse der Stärke oder aus der thermischen oder enzymatischen Behandlung der Stärke hervorgehen. Dieser Produkt-Typ ist auch im Handel erhältlich und wird aufgrund seiner Reinheit besonders bevorzugt, wenn die erhaltenen α-Glucoside dafür bestimmt sind, in der pharmazeutischen Industrie verwendet zu werden.
Nach einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das Substrat oder der "Glucose-Lieferant" auch lösliche Stärke sein. Dieses Produkt, das den Maltodextrinen vergleichbar ist, besteht aus Stärke, die durch saure Prähydrolyse, beispielsweise nach dem Verfahren von Lintner, löslich gemacht wurde.
Nach einer weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besteht das Substrat aus nativer Stärke. Als native Stärkequellen können Getreidearten, Knollengewächse und Leguminosen ebenso wie jede andere Pflanze erwähnt werden. Unter den bevorzugten Getreidesorten können der Weizen, der Mais, die Gerste, der Hafer, der Reis, der Roggen, der Triticale (Hybrid aus Roggen und Weizen), der Buchweizen und das Sorghum erwähnt werden. Die bevorzugten Knollengewächse sind die Kartoffeln und der Maniok. Die Erbsen und die Saubohnen stellen Stärkequellen von Leguminosen dar. Die Getreidesorten können in Form ganzer Körner, als Teile von Körnern (die sich beispielsweise durch enzymatische, chemische, thermische oder mechanische Behandlung des Korns ergeben) oder als jedes andere Produkt verwendet werden, das als Ergebnis der Feinzerkleinerung des Korns, wie das Mehl oder der Grieß, entsteht.
Ist das Substrat native Stärke, ist die Wirkung des Enzyms, das die α-Transglucosylierung durchführen kann, mit der Wirkung einer Hydrolase verknüpft, um die Stärke für die α-Transglucosylierung zugänglich zu machen. Die Hydrolase setzt im Medium, ausgehend von nativer Stärke, Maltodextrine und Maltose frei. Diese Substrate werden dann durch die α-Transglucosidase, welche die im Medium vorhandenen Alkohole glucosyliert, als Glucose- Lieferanten genutzt. Die Hydrolase wird vorzugsweise gleichzeitig mit der α-Transglucosidase eingesetzt.
Als Hydrolasen werden Endoamylasen bevorzugt eingesetzt, z.B. die α-Amylase (E.C: 3.2.1.1), die beispielsweise von Pilzen oder von Bacillus licheniformis stammt. Die Endoamylasen weisen den Vorteil auf, im Stärkemolekül die "Endo"-Spaltungen zu bewirken, ohne daß Moleküle mit geringem Molekulargewicht freigesetzt werden (d.h. die Glucose). In der Tat können die α-Transglucosidasen Glucose nicht als Substrat benutzen. Daher verhinderte die Herstellung von Glucose durch die Amylase die spätere Herstellung von α-Glucosiden. Bezüglich der Maltose ist, obwohl sie als Substrat für die α-Transglucosidase dienen könnte, die Ausbeute an so erhaltenem Alkylglucosid geringer als mit den Maltodextrinen oder der Stärke. Das Verhältnis zwischen übertragbarer Glucose und der nicht-verwendeten Glucose ist im Fall von Maltodextrin größer als im Fall von Maltose.
Eine gleichzeitige Verwendung der Amylase und der α-Transglucosidase wird bevorzugt, wobei es zur Kompetition um die löslichen Moleküle zwischen den beiden Enzymen kommt. Der gleichzeitige Ablauf der beiden enzymatischen Verfahren führt so zu einer Verbesserung der Ausbeute.
Die Wirksamkeit der Amylase auf die Stärke schwankt in Abhängigkeit von der botanischen Herkunft der Stärke und der Art der Amylase.
Die jeweiligen Konzentrationen an Substrat, Enzym und Alkohol betragen
- für das Substrat wenigstens etwa 100 g/l bis etwa 800 g/l und insbesondere wenigstens etwa 100 g/l bis etwa 400 g/l,
- für die Alkohole etwa 10 g/l bis etwa 800 g/l und insbesondere etwa 50 g/l bis etwa 400 g/l,
- für das Enzym etwa 5 U/ml bis etwa 1.000 U/ml und insbesondere etwa 50 U/ml bis etwa 200 U/ml.
Der erfindungsgemäße Glucose-Akzeptor ist ein Alkohol mit einfacher Funktion, d.h. ein Alkohol, der keine weiteren fünktionellen Gruppen als die Hydroxylgruppen besitzt. Ein Gemisch verschiedener Alkohole kann eingesetzt werden. Alle Alkohole, welche in der Umsetzung die Rolle der Glucose-Akzeptoren spielen können und welche die Aktivität des Enzyms nicht hemmen, können verwendet werden.
Die bevorzugten Alkohol sind die Alkanole, Ethylenalkohole, Acetylenalkohole, cyclischen Alkohole oder Phenole. Die acyclischen Alkohole werden besonders bevorzugt, insbesondere die gesättigten Alkanole, die beispielsweise zwischen 2 und 24 Kohlenstoffatome haben, und die gesättigten Polyole. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann der Alkohol ein einwertiger Alkohol sein oder ebenso kann er ein Polyol sein, beispielsweise ein Diol oder ein Triol. Die Diole werden besonders bevorzugt, wie die Propandiole und Butandiole. Die primaren, sekundären und tertiären Alkohole können in der erfindungsgemäßen Umsetzung dienen, wobei die primaren und sekundären besonders vorteilhaft sind.
Es kann sich um einen mit Wasser mischbaren oder um einen wenigstens teilweise in Wasser löslichen Alkohol handeln. In diesem Fall weist der Alkohol bei 20ºC vorteilhafterweise eine Löslichkeit von wenigstens 2,7% (Vol./Vol.) auf. In der Mehrzahl der Fälle besitzen diese Alkohole zwischen 1 und 6 und oftmals zwischen 1 und 5 Kohlenstoffatome.
Als Beispiele von bevorzugten löslichen Alkoholen können Isopropanol, n-Butanol, iso- Butanol, iso-Pentanol, Propanol, Pentandiol, Hexandiol, Buten-1-ol-3, Butin-1-ol-3, Cyclohexanol usw. oder ein Gemisch von wenigstens zwei dieser Alkohole genannt werden. Die Umsetzung erfolgt in wäßrigem Medium, wobei der Alkohol oftmals an der Grenze seiner Löslichkeit eingesetzt wird.
Ist der Alkohol in Wasser teilweise löslich, ist es möglich, das erfindungsgemäße Verfahren in einem Medium mit zwei Phasen durchzuführen, d.h. einer wäßrigen Phase, in welcher der oder die Alkohole bis zu einer Konzentration unterhalb ihrer Löslichkeitsgrenze gelöst ist oder sind, und einer organischen Phase, die mit der wäßrigen Phase im Gleichgewicht steht und aus dem mit Puffer gesättigten Alkohol besteht. Die Verwendung eines zweiphasigen Mediums übt einen günstigen Einfluß auf die Ausbeute an α-Glucosiden aus. Dieses System ist insbesondere vorteilhaft, wenn das durch die α-Transglucosylierungsreaktion erhaltene α-Glucosid, ausgehend von einer bestimmten Konzentration, ein Substrat für das Enzym darstellen kann. Beispielsweise kann das α-Butylglucosid die Rolle des Substrats für die α- Transglucosidase spielen. In diesem Fall läuft die Umsetzung in der wäßrigen Phase ab, und das α-Glucosid wird von der wäßrigen Phase in die organische Phase extrahiert, wodurch die Zersetzung des Glucosids durch das Enzym verhindert wird.
Die Verwendung eines Ethylenalkohols, wie Buten-1-ol-3, führt zum Vorhandensein einer nichtgesättigten Bindung im Glucosid. Dies ermöglicht die spätere Verwendung des Glucosids in Polymerisationsreaktionen oder bei der Herstellung von chiralen Synthonen (Zwischenproduktmoleküle) zur pharmazeutischen oder chemischen Verwendung.
Nach einer besonders vorteilhaften Ausführungsform ist der lösliche Alkohol ein einwertiges Alkanol mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen. Diese Alkohole ergeben α-Alkylglucoside, deren Alkylkette 1 bis 5 Kohlenstoffatome besitzt.
Ebenso ist es möglich, in Wasser unlösliche Alkohole, beispielsweise Alkanole mit mehr als 6 Kohlenstoffatomen, insbesondere zwischen 12 und 18 Kohlenstoffatomen, oder sogar Fettalkohole (primäre aliphatische Alkohole), wie Dodecylalkohol, Tetradecylalkohol, Hexadecylalkohol, Octadecylalkohol, Decylalkohol, Undecylalkohol und Tridecylalkohol usw., zu verwenden. Gleichfalls können als in Wasser unlösliche Alkohole die Steroide erwähnt werden. Die Verwendung der Fettalkohole wird vorteilhafterweise von der Verwendung von in Wasser teilweise löslichen kurzen Alkoholen (1 bis 6 Kohlenstoffatome) begleitet, welche die Rolle von Lösungsmitteln der Fettalkohole und des Glucose-Akzeptors spielen.
Die wie vorstehend erwähnten, hydrophoben Alkohole können an der enzymatischen α-Transglucosylierungsreaktion unter Verwendung eines Zweiphasensystems (d.h. Wasser und ein organisches Lösungsmittel) teilnehmen. Der hydrophobe Alkohol ist folglich in einem Lösungsmittel, wie Nitrobenzol, gelöst, während das Substrat und das Enzym in einer wäßrigen Lösung gelöst sind. Die beiden Lösungen werden anschließend gemischt und gerührt. Die α-Transglucosylierung erfolgt in der Interphase. Ebenso ist es möglich weitere organische Lösungsmittel einzusetzen, beispielsweise Aceton, unter der Bedingung, daß die Wirksamkeit des Enzyms nicht beeinträchtigt wird.
Aufgrund der grenzflächenaktiven Eigenschaften der α-Alkylglucoside, deren Alkylkette zwischen 12 und 18 Kohlenstoffatome aufiveist, wird die Verwendung von Fettalkoholen als Alkohol besonders bevorzugt.
Die Ausbeuten an durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen α-Glucosiden schwanken in Abhängigkeit von den Glucose-Lieferanten und dem Extraktionsverfahren. Die Ausbeuten können beispielsweise mit Maltodextrin oder Stärke als Substrat und einem zweiphasigen organischen Lösungsmittelsystem zur Extraktion des Produkts 20 bis 30% erreichen. Maltose ergibt Ausbeuten von 10 bis 15%. Die Ausbeuten werden in der folgenden Weise berechnet:
α-Glucosidprodukt (in Mol)/[α-Glucosidprodukt + Glucoseprodukt] (in Mol) x 100
Die durch das erlindungsgemäße Verfahren erhaltenen Produkte sind stereospezifisch (α) und sind üblicherweise Monoglucoside. Indem dem Reaktionsmedium beispielsweise ein α-Alkylglucosid als "zusätzliches" Substrat hinzugefügt wird, ist es möglich, die Erzeugung von Diglucosiden, d.h. von Maltosiden, hervorzurufen. Diese Maltoside besitzen Eigenschaften, die denen der Glucoside sehr nahe kommen.
Die Stereospezifität des Produkts kann überprüft werden, indem bei einer Probe die Hydrolyse mit einem Enzym durchgeführt wird, das nur auf die α-Anomeren wirken kann, beispielsweise die α-Glucosidase. Die Maltase ist ein Beispiel einer α-Glucosidase, die für diese Überprüfüng geeignet ist.
Aufgrund des Fehlens von β-Anomeren im erfindungsgemäßen Produkt sind bestimmte physikalische Eigenschaften, wie der Schmelzpunkt und die Löslichkeit des Glucosids, sehr genau definiert. Diese Genauigkeit ist für eine Verwendung in der pharmazeutischen, kosmetischen und chemischen Industrie im allgemeinen vorteilhaft.
Zudem liegt das während der α-Transglucosylierung verwendete Enzym in gereinigtem Zustand vor. Das erfindungsgemäße Produkt weist folglich keine durch enzymatische Nebenreaktionen entstandenen Verunreinigungen auf Folglich entfällt die Notwendigkeit zur Durchführung zahlreicher Reinigungsschritte der Reaktionsprodukte.
Die α-Glucoside, insbesondere die α-Alkylglucoside, wie diejenigen, welche durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten werden, sind dadurch gekennzeichnet, daß keine Verunreinigungen vorhanden sind, die üblicherweise mit Glucosiden, die auf chemischem Weg oder auf enzymatischem Weg unter Verwendung von Enzymgemischen hergestellt wurden, assoziert sind. Das α-Butylglucosid ist ein besonders bevorzugtes Produkt. Insbesondere sind die erfindungsgemäßen α-Glucoside, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten wurden, frei von β-Anomeren und jeglicher Verunreinigung, die durch enzymatische Nebenreaktionen entstehen.
Die Extraktion des Produkts aus dem Reaktionsmedium ist folglich um so leichter, da es außer überschüssigem Alkohol, dem restlichen Glucose-Lieferanten und dem Glucoseprodukt aus dem Verlauf der Umsetzung kein weiteres Produkt enthält. Die Extraktion kann in einem geeigneten organischen Lösungsmittel durchgeführt werden, das nach der Funktion der Löslichkeit des Produkts ausgewählt wird. Nach einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Extraktion des α-Glucosids, beispielsweise des α-Butylglucosids, kontinuierlich mittels einer Extraktionslösungsmittel-Flüssigkeitssäule, beispielsweise mit Butanol. Nach dieser Variante durchläuft das Reaktionsmedium zuerst eine erste Säule, welche die immobilisierte Transglucosidase enthält, und anschließend die Extraktions-Flüssigkeitssäule. Die Alkoholysereaktion und die Extraktion des Produkts erfolgen dann kontinuierlich. Das α-Butylglucosid wird nach dem Verdampfen von Butanol in Form von Sirup gewonnen, und das Butanol wird zur Verwendung als Substrat zurückgeführt. Unter Verwendung dieses zweiphasigen Extraktionstyps werden Produktausbeuten von 35 bis 40% erreicht.
Die Glucosidprodukte, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden, haben eine Vielzahl von Anwendungen.
Die Alkylglucoside, insbesondere diejenigen, deren Alkylkette bis zu 6 Kohlenstoffatome besitzt, beispielsweise α-Butylglucosid, können als Additive von flüssigen Detergentien, Emulsionen zum Modifizieren der Viskosität, ohne eine Phasentrennung hervorzurufen, oder als co-grenzflächenaktive Substanzen in Mikro-Emulsionen eingesetzt werden. In der Tat gestattet das Vorhandensein von hydrophoben und hydrophilen Resten in diesen Molekülen deren Verwendung in Emulsionen, beispielsweise in kosmetischen und pharmazeutischen Cremen, um die Eigenschaften einer Emulsion zu modifizieren, ohne diese zu destabilisieren. Die erfindungsgemäßen Glucoside wurden durch eine Biosynthese, ausgehend von Naturstoffen, hergestellt und sind insbesondere an die kosmetischen und pharmazeutischen Anwendungen dieses Typs angepaßt.
Die Alkylglucoside und insbesondere α-Butylglucosid können auch als Additive in der Kunststoffindustrie, bei Kautschuken und PVC, beispielsweise als Weichmacher in Melaminharzen, eingesetzt werden. Die Verwendung von α-Butylglucosid verhindert, daß das Harz eine übermäßig spröde Eigenschaft besitzt. Ebenso können sie als Additive in industriellen und Haushalts-Reiniungsmitteln oder Pflegeprodukten eingesetzt werden.
Die Alkylglucoside, deren Alkylkette wenigstens 8 Kohlenstoffatome besitzt, werden als nichtionische, biologisch abbaubare grenzflächenaktive Substanzen und Detergentien eingesetzt, die schäumende, schmierende, emulgierende und hydratisierende Eigenschaften aufweisen.
Da sie stereospezifisch sind und durch ein enzymatisches Syntheseverfahren, ausgehend von pflanzlichen Stoffen, erhalten werden, sind die durch das erfindungsgemäße Verfahren derart erhaltenen Produkte für eine pharmazeutische oder kosmetische Verwendung oder eine Verwendung in Nahrungsmitteln, beispielsweise als ungiftige und nichtreizende Emulgiermittel, besonders geeignet.
Die so durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen Glucoside stellen auch einen ausgezeichneten Rohstoff für die Herstellung von Polyetherpolyolen, beispielsweise für starre Schäume auf Polyurethan-Basis, dar. Die so erhaltenen Produkte besitzen eine verbesserte Thermostabilität und ausgezeichnete physikalische Eigenschaften. Ebenso können die Glucoside, insbesondere die Alkylglucoside, als Polyole in der Herstellung von Alkydharzen und Polyestem oder als chemische Zwischenprodukte für die Synthese von Monomeren, die in Polymerisationsreaktionen einsetzbar sind, verwendet werden.
Die derart durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen Alkylglucoside mit kurzen Alkylketten (C&sub1; bis C&sub6;) können als Rohstoffe in der Herstellung von grenzflächenaktiven Mitteln dienen, beispielsweise indem die Alkylkette durch eine Alkylkette mit wenigstens 8 und vorzugsweise wenigstens 12 Kohlenstoffatomen ersetzt wird. Diese Alkylglucoside mit langer Alkylkette weisen ausgezeichnete emulgierende und schäumende Eigenschaften auf und sind biologisch abbaubar.
Ein weiterer Typ eines grenzflächenaktiven Mittels kann durch Veresterung, vorzugsweise an den C&sub2;- und C&sub6;-Positionen der erfindungsgemäßen Niederalkylglucoside hergestellt werden. Die derart erhaltenen Emulgiermittel besitzen hydratisierende Eigenschaften und sind ebenfalls biologisch abbaubar.
Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Veresterung der α-Glucoside auf enzymatischem Weg durchgeführt, indem das α-Glucosid mit einer Fettsäure oder mit einem Gemisch verschiedener Fettsäuren und einer Enzympräparation, das eine Lipase-Aktivität besitzt, in Kontakt gebracht wird. Dieser Reaktionstyp wurde von Björkling et al. (J. Chem. Soc., Chem. Comm., (1989), 934 - 935) beschrieben. Die Verknüpfüng dieser enzymatischen Veresterungsreaktion mit der erfindungsgemäßen Alkoholysereaktion ermöglicht die Herstellung von reinen α-Glucosidestern, ausgehend von Stärke, Maltodextrin oder Maltose. Die Veresterung kann nach der Alkoholysereaktion oder gleichzeitig mit der Alkoholyse durchgeführt werden.
Nach dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das eingesetzte α-Glucosid vorzugsweise ein Alkylglucosid, das zwischen 1 und 5 Kohlenstoffatome besitzt, oder ein Gemisch dieser α-Alkylglucoside. α-Butylglucosid wird besonders bevorzugt. Die Fettsäure besitzt vorteilhafterweise zwischen 8 und 20 Kohlenstoffatome. Caprylsäure (C&sub8;), Caprinsäure (C&sub1;&sub0;), Laurinsäure (C&sub1;&sub2;) und Palmitinsäure (C&sub1;&sub6;) werden besonders bevorzugt. Ebenso ist es möglich, ein Gemisch mehrerer Fettsäuren einzusetzen.
Die Veresterung wird nach dieser Ausführungsform durch eine Enzympräparation mit Lipase-Aktivität, beispielsweise eine Lipase, die von Mucor miehei (beispielsweise Lipozyme ), Candida antarctica, Humicola sp., Candida cylindracea und Pseudomonas sp. stammt, katalysiert. Es kann jede Lipase verwendet werden, die in der Lage ist, die Umsetzung mit der gewählten Fettsäure zu bewirken. Es kann sich um eine gereinigte Präparation, die ein einzelnes Enzym enthält, oder in einer anderen Ausführungsform um ein Gemisch aus mehreren Enzymen mit einer Lipase-Aktivität handeln. Das Enzym mit einer Lipase-Aktivität kann auf einem festen Träger immobilisiert sein.
Die Veresterungsreaktion wird bei einer Temperatur, die zwischen Umgebungstemperatur und etwa 80ºC liegt, durchgeführt, unter der Bedingung, daß es sich um eine Temperatur handelt, bei welcher die gewählte Fettsäure in flüssiger Form vorliegt, und bei welcher das Enzym stabil ist. Die Abwesenheit von Lösungsmittel stellt einen bedeutenden Vorteil hinsichtlich der Ökonomie und der Umwelt dar.
Die Produkte, welche ohne Lösungsmittel durch enzymatische Veresterung der erfindungsgemäßen α-Glucoside erhalten werden, sind Gemische von Mono- und Diestern. Die Arbeitsbedingungen können optimiert werden, um den Erhalt von etwa 80% Monoestern zu ermöglichen. Die Umsetzung ist ortsspezifisch, wobei die Veresterung zuerst an der C&sub6;-Position und anschließend an der C&sub2;-, C&sub3;- oder C&sub4;-Position in Abhängigkeit vom Enzym erfolgt. Der Diester kann ein Gemisch von 2,6-, 3,6- und 4,6-Diestern sein. In diesem Fall umfaßt das Produkt den Monoester und ein Gemisch von Diestem. Der Diester ist vorzugsweise ein 2,6- Diester. Die Herstellung eines Anteils an Diestern ist unvermeidlich, da das Enzym, ausgehend von einer bestimmten Konzentration an Monoestern, den Monoester eher als Substrat als das α-Glucosid erkennt. Wenn lediglich eine einzelne Fettsäure in der Veresterung eingesetzt wird, trägt der Diester zwei identische Gruppen. Wenn dagegen ein Gemisch zweier Fettsäuren verwendet wird, ist der Diester ein gemischter Diester, beispielsweise Butyl-2-O- lauryl-6-O-stearyl-α-D-glucopyranosid. Die Wahl der Fettsäuren ermöglicht, die Eigenschaften der hergestellten Ester zu variieren, insbesondere das hydrophile-lipophile Gleichgewicht (HLB).
Das Produkt der Veresterung kann aus dem Reaktionsmedium durch ein geeignetes organisches Lösungsmittel, wie Diethylether oder im industriellen Maßstab Hexan, extrahiert werden. Jedes Lösungsmittel, in dem das α-Glucosid und die Fettsäure nicht löslich sind, kann verwendet werden. Die Gewinnung der Ester ist gleichfalls ohne Zugabe von organischem Lösungsmittel möglich. Das Produkt kann als solches ohne Reinigung nach der Abtrennung des immobilisierten Enzyms eingesetzt werden.
Die so hergestellten α-Glucosidester sind frei von α-Anomeren und Produkten aus Nebenreaktionen, die üblicherweise zusammen mit Estern, die, ausgehend von weniger reinen Glucosiden oder auf chemischem Weg erhalten werden, vorkommen. Diese Ester besitzen ein Vielzahl von industriellen Anwendungen und können für jede herkömmliche Anwendung der Ester dieses Typs verwendet werden. Die α-Glucosidester und insbesondere die α-Alkylglucosidester sind nichtionische, nichtreizende, ungiftige grenzflächenaktive Substanzen und sind biologisch abbaubar, wobei sie Eigenschaften beistzen, wie schäumende, emulgierende, solubilisierende, hydratisierende, dispergierende, benetzende oder schmierende Eigenschaften besitzen. Sie werden vorteilhafterweise als Additive in kosmetischen und pharmazeutischen Produkten und landwirtschaftlichen Nahrungsmitteln oder sogar in der Chemie oder in der Reinigungsmittel(detergent)-Industrie als grenzflächenaktive Substanzen oder Vorstufen von Bleichmitteln eingesetzt. In der Landwirtschaft können sie als inerte Zusatzmittel zur Steigerung der Wirksamkeit von Pflanzenschutz-Produkten, insbesondere von Herbiziden, Fungiziden, Insektiziden, und zur Behandlung von Kulturen und von landwirtschaftlichen Produkten im allgemeinen eingesetzt werden.
Die Figuren zeigen verschiedene Gesichtpunkte der Erfindung, nämlich:
- die Figur 1 zeigt die Herstellung von Glucose und α-Butylglucosid, ausgehend von Maltodextrinen, mit Hilfe der α-Transglucosidase von Talaromyces duponti.
- die Figur 2 illustriert die HPLC-Chromatogramme des Synthesemediums von α-Butylglucosid mit der Transglucosidase von Aspergillus niger, ausgehend von unlöslicher Stärke Medium aus einer flüssigen Phase.
a) Umsetzungsdauer: 10 Minuten
b) Umsetzungsdauer: 23 Stunden
c) α-β-Butylglucosid-Gemisch.
- die Figur 3 illustriert die HPLC-Chromatogramme des Synthesemediums von α-Butylglucosid mit der Transglucosidase von Aspergillus niger, ausgehend von unlöslicher Stärke Medium aus zwei flüssigen Phasen.
a) Umsetzungsdauer: 10 Minuten
b) Umsetzungsdauer: 7 Stunden

Beispiele

Beispiel 1

Herstellung von α-Butylglucosid, ausgehend von löslichen stärkehaltigen Substraten, in Gegenwart von Butanol mit Hilfe der α-Transglucosidase von Talaromyces duponti

a) Dosierung der α-Transglucosidase-Aktivität

Die Dosierung der α-Transglucosidase-Aktivität wird bei 60ºC im folgenden Medium durchgeführt:
- Maltose: 100 g/l
- Natriumacetatpuffer pH-Wert 4,5: 50 mM
- α-Transglucosidase: 1 U/ml
Das Medium wird nach 15- und 24-stündiger Umsetzung mittels HPLC-Technik (DIONEX Carbopack-Säule, amperometrische Detektion) analysiert, wodurch die Abtrennung und die Detektion der im Lauf der Umsetzung erzeugten Panose möglich wird.
1 Einheit an α-Transglucosidase (U) ist die Menge an Enzym, das die Herstellung von 1 Mikromol Panose (6-O-α-D-Glucopyranosyl-maltose) pro Stunde unter den vorstehenden Bedingungen katalysiert.

b) Herstellung von α-Butylglucosid

Die Herstellung von α-Butylglucosid wird im wäßrigen Medium der folgenden Zusammensetzung durchgeführt:
- Butanol: 9% (Vol./Vol.)
- Natriumacetatpuffer pH-Wert 4,5: 50 mM
- α-Transglucosidase von Talaromyces duponti: 100 U/ml
- Substrat: 1009 g/l
Dieses Medium wird 70 Stunden bei einer Temperatur von 50ºC inkubiert. Es werden Proben entnommen, mit Wasser verdünnt (1/10), auf 90ºC erhitzt, um die Umsetzung zu stoppen, und dann durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) auf einer Ionenaustauscherharzsäule in der Calciumform analysiert. Das Elutionsmittel ist ultrareines Wasser.
Unter diesen Analysebedingungen wird α-Butylglucosid von α-Butylglucosid und den Mono- und Oligosacchariden abgetrennt. Der Flächeninhalt des entsprechenden Peaks ermöglicht, die Konzentration an α-Butylglucosid im Reaktionsmedium zu berechnen, und die Ausbeute der Ubertragung von Glucose ist in der folgenden Weise definiert:
α-Butylglucosid (in mM)/[α-Butylglucosid + Glucose] (in mM)
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1 α-Butylglucosid Produkt, ausgehend von löslichen Substraten, und Ausbeuten der Übertragung nach 70-stündiger Umsetzung
Die Herstellung von α-Butylglucosid und Glucose wurde im Lauf der Umsetzung verfolgt. Die Entwicklung der Konzentration der beiden Produkte ist in Figur 1 gezeigt.
Die Herstellung von α-Butylglucosid erfolgt mit den vier in diesem Beispiel untersuchten stärkehaltigen Substraten Mit den Maltodextrinen liegt die Konzentration an α-Butylglucosid oberhalb von 10 g/l.

Beispiel 2

Herstellung von α-Butylglucosid, ausgehend von unlöslicher Stärke, in Gegenwart von Butanol mit Hilfe der α-Transglucosidase von Talaromyces duponti
Das Reaktionsmedium ist wie in Beispiel 1 zusammengesetzt. Das Substrat ist hier unlösliche Stärke. Dem Medium wird wieder α-Amylase von Bacillus licheniformis (5 U/ml) hinzugefügt, wodurch die Verwendung der unlöslichen Substrate möglich wird.
Die entnommenen Proben des Reaktionsmediums werden wie in Beispiel 1 behandelt, aber vor der HPLC-Injektion zentrifügiert und filtriert.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2 α-Butylglucosid Produkt, ausgehend von unlöslicher Stärke, und Ausbeuten der Übertragung nach 70-stündiger Umsetzung.
Die unlösliche Stärke kann ebenfalls als Substrat der Umsetzung eingesetzt werden.

Beispiel 3

Herstellung von α-Butylglucosid, ausgehend von unlöslichen stärkehaltigen Substraten, in einem Medium aus zwei flüssigen Phasen mit Hilfe der α-Transglucosidase von Talaromyces duponti

Das Reaktionsmedium setzt sich aus zwei flüssigen Phasen der folgenden Zusammensetzung zusammen:
wäßrige Phase (Volumen: 0,5 ml):
- Butanol: 9% (Vol./Vol.)
- Natriumacetatpuffer pH-Wert 4,5: 50 mM
- α-Transglucosidase von Talaromyces duponti: 100 U/ml
- α-Amylase: 5bissoou/mi
- Substrat: 1009/l
organische Phase (Volumen: 0,5 oder 2 ml)
- mit Natriumacetatpuffer gesättigtes Butanol, 50 mM, pH-Wert 4,5. Die Reaktionsmedien werden vor jeder Probenentnahme heftig gerührt, danach wie in Beispiel 2 behandelt.
Mehrere Medien wurden mit zwei Reaktionsvolumina und mit zwei α-Amylase-Präparationen experimentell untersucht. Der Einlluß des α-Amylasegehalts im Medium wurde ebenfalls untersucht.
Die HPLC-Analyseergebnisse der Reaktionsmedien sind in den Tabellen 3 und 4 aufgeführt. Tabelle 3 α-Butylglucosid-Produkt und Ausbeuten der Übertragung nach 70-stündiger Umsetzung im Medium aus zwei flüssigen Phasen (α-Amylase von Bacillus licheniformis, 5 U/ml) Tabelle 4 α-Butylglucosid-Produkt und Ausbeuten der Übertragung, ausgehend von Maismehl, mit Hilfe der α-Transglucosidase von Talaromyces duponti im Medium aus zwei flüssigen Phasen (Reaktionsvolumen: 1 ml)
Die Verwendung von unbearbeitetem Getreidemehl für die Synthese von α-Butylglucosid mit Hilfe der α-Transglucosidase von Talaromyces duponti ist vollständig möglich.
Die Verwendung eines Mediums aus zwei flüssigen Phasen ermöglicht es, die Herstellung von α-Butylglucosid zu verbessern. In Tabelle 3 ist zu sehen, daß 46 µMol α-Butylglucosid im Medium mit einem Volumen von 1 ml synthetisiert wurden, während im Medium mit 2,5 ml, ausgehend von der gleichen Menge an Substrat und Enzym, 62,5 µMol synthetisiert wurden.

Beispiel 4

Herstellung von α-Alkylglucosiden, ausgehend von löslichen stärkehaltigen Substraten, mit Hilfe der α-Transglucosidase von Talaromyces duponti in Gegenwart eines Alkoholgemisches

Drei Medien waren in der folgenden Weise zusammengesetzt:
- Maltodextrine: 100 g/l
- α-Transglucosidase von Talaromyces duponti: 100 U/ml
- Natriumacetatpuffer pH-Wert 4,5: 50 mM
Die drei Medien enthielten ein Gemisch aus einwertigen Alkoholen:
Die Medien wurden 120 Stunden bei 50ºC inkubiert und anschließend nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren analysiert. Die Analysenergebnisse sind in Tabelle 5 angegeben. Tabelle 5 Alkylglucosid-Produkte in Gegenwart von Alkoholgemischen (Reaktionsvolumen: 1 ml)

Beispiel 5

Herstellung von α-Butylglucosid, ausgehend von unlöslicher Stärke, mit Hilfe der α-Transglucosidase von Aspergillus niger

Zwei Medien wurden zusammengesetzt und anschließend nach der in Beispiel 3 angegebenen Vorgehensweise inkubiert.
Medium aus einer wäßrigen Phase (Volumen: 20 ml)
- Butanol: 9% (Vol./Vol.)
- Natriumacetatpuffer pH-Wert 5,5: 50 mM
- α-Transglucosidase von Aspergillus niger: 100 U/mi
- a-Amylase von Bacillus licheniformis: 5 U/ml
- unlösliche Stärke: 1009/l
Medium aus zwei flüssigen Phasen (Volumen: 40 mi) wäßrige Phase (Volumen: 20 ml):
- Butanol: 9%
- Natriumacetatpuffer pH-Wert 5,5: 50 mM
- α-Transglucosidase von Aspergillus niger: 100 U/ml
- α-Amylase von Bacillus licheniformis: 5 U/ml
- unlösliche Stärke: 100 g/l
organische Phase (Volumen: 20 ml):
- mit Natriumacetatpuffer gesättigtes Butanol, 50 mM, pH-Wert 5,5
Diese Medien wurden wie in Beispiel 3 analysiert. Die erhaltenen Chromatogramme sind in den Figuren 2 und 3 dargestellt. Die Konzentration an α-Butylglucosid beträgt 12 g/l (51 mM) im Medium aus einer flüssigen Phase und 7 g/l (30 mM) im Medium aus zwei flüssigen Phasen.
Die α-Transglucosidase von Aspergillus niger ist für die Synthese von α-Alkylglucosid vollständig wirksam.

Beispiel 6

Herstellung der Palmitinsäureester von α-Butylglucosid durch enzymatische Veresterung von α-Butylglucosid

Ein Medium war in der folgenden Weise zusammengesetzt:
- Palmitinsäure (PROLABO, Frankreich): 10,85 g
- α-D-Butylglucosid: 10 g
Das α-D-Butylglucosid wurde nach dem Verfahren des Beispiels 1 hergestellt.
Das Gemisch wird bei 75ºC, dem Schmelzpunkt der Palmitinsäure, gehalten. Nach der Homogenisierung wird 1 g Lipozymeor, auf einem festen Träger immobilisierte Lipase von Mucor miehei (NOVO INDUSTRI, Dänemark), zugegeben.
Nach 3tägiger Inkübation wird das Reaktionsmedium mit 210 ml Diethylether (SDS, Frankreich) verdünnt, anschließend derart filtriert, daß Lipozyme abgetrennt wird. Nach der Filtration werden 50 ml Natronlauge (NaOH 0,02 N) so hinzugefügt, daß die restliche Palmitinsäure in der wäßrigen Phase in der Form eines Natriumsalzes ebenso wie das restliche α-Butylglucosid solubilisiert werden.
Die organische Phase (Diethylether), welche die Palmitinsäureester enthält, wird im Vakuum eingedampft, wodurch jegliche Spur von restlichem Lösungsmittel entfernt wird. Schließlich werden 16,5 g der Ester erhalten (Gemisch aus Monoestern und Diestern des α-D-Butylglucopyranosids: Butyl-6-O-palmityl-α,D-glycopyranosid und Butyl-2,6-di-O- palmityl-α,D-glucopyranosid). Die Charakterisierung der Reaktionsprodukte erfolgte mittels DC und mittels Protonen- und ¹³C-NMR.

Beispiel 7

Herstellung der Laurinsäureester des α-Butylglucosids durch enzymatische Veresterung von α-Butylglucosid

Ein Medium war in der folgenden Weise zusammengesetzt:
- Laurinsäure (MERCK, Deutschland): 8,5 g
- α-D-Butylglucosid: 10 g
Das α-D-Butylglucosid wurde nach dem Verfahren des Beispiels 1 hergestellt.
Das Gemisch wird bei 45ºC, dem Schmelzpunkt der Launnsaure, gehalten. Nach der Homogenisierung wird 1 g Lipozyme , auf einem festen Träger immobilisierte Lipase von Mucor miehei (NOVO INDUSTRI, Dänemark), zugegeben.
Nach 3tägiger Inkubation wird das Reaktionsmedium mit 210 ml Diethylether (SDS, Frankreich) verdünnt, anschließend derart filtriert, daß Lipozyme abgetrennt wird. Nach der Filtration werden 50 ml Natronlauge (NaOH 0,02 N) so hinzugefügt, daß die restliche Laurin säure in der wäßrigen Phase in der Form eines Natriumsalzes, ebenso wie das restliche α-Butylglucosid solubilisiert werden.
Die organische Phase (Diethylether), welche die Laurinsäureester enthält, wird im Vakuum eingedampft, wodurch jegliche Spur von restlichem Lösungsmittel entfernt wird.
Schließlich werden 15 g der Ester erhalten (Gemisch aus Monoestern und Diestern des α-D-Butylglucopyranosids: Butyl-6-O-lauryl-α,D-glucopyranosid und Butyl-2,6-di-O-lauryl- α,D-glucopyranosids). Die Charakterisierung der Reaktionsprodukte erfolgte mittels DC und mittels Protonen- und ¹³C-NMR.

Beispiel 8

Herstellung der Stearinsäureester des α-Butylglucosids

Das Verfahren des Beispiels 7 wurde wiederholt unter Verwendung von:
- Stearinsäure 1,2 g
- α-D-Butylglucosid: 1 g
Das Gemisch wird bei 78ºC gehalten, und es werden 0,15 g Lipozyme hinzugefügt.
Das Produkt wurde mittels ¹³C-NMR analysiert. Es handelte sich um ein Gemisch, das hauptsächlich aus Butyl-6-O-stearyl-α,D-glucopyranosid (etwa 80%) und Butyl-2,6-di-O- stearyl-α,D-glucopyranosid (etwa 20%) bestand.

Claims

1. Verfahren zur enzymatischen Herstellung von α-Glucosiden, gekennzeichnet durch das Inkontaktbringen mindestens eines Alkohols, dessen einzige funktionelle Gruppe(n) (eine) Hydroxylgruppe(n) ist (sind), mit Stärke, Maltodextrinen oder Maltose, die in einer Konzentration von mindestens etwa 100 g/l vorliegen, in Gegenwart einer gereinigten Enzympräparation, die eine α- Transglucosylierungs-Aktivität aufweist, aber keine β- Glucosidase-Aktivität.

2. Verfahren nach Anspruch 11 dadurch gekennzeichnet, daß die Enzyrripräparation aus einem Enzym besteht, das eine α-Transglucosylierungs-Aktivität aufweist, oder aus mehreren Enzymen, von denen jedes eine α-Transglucosylierungs-Eigenschaft hat oder, deren enzymatische Aktivität zusammengenommen der Enzympräparation eine α-Transglucosylierungs-Aktivität verleiht.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das oder die Enzyme α-Transglucosidasen sind, vorzugsweise solche, die von einem Pilz, wie Talaromyces duponti, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae oder Aspergillus batatae, stammen.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Stärke in Form nativer Stärke vorliegt, und dadurch, daß die Aktivität der Enzympräparation, die es ermöglicht, die α-Transglucosylierung durchzuführen, verbunden ist mit der Aktivität einer Hydrolase, wie einer Endoamylase, z.B. der α-Amylase.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden enzymatischen Reaktionen gleichzeitig ablaufen, z.B. durch die gleichzeitige Verwendung einer Endoamylase und einer α-Transglucosidase.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeich net, daß die native Stärke von Getreiden wie Weizen, Mais, Gerste, Hafer, Reis, Roggen, Buchweizen, Sorghum und Triticale stammt oder von Knollen, wie Kartoffel oder Maniok, oder von Leguminosen, wie Erbsen oder Saubohnen, oder von beliebigen anderen Pflanzen.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Getreide in Form ganzer Körner vorliegen oder als Teile von Körnern, die z.B. aus einer enzymatischen, chemischen, thermischen oder mechanischen Behandlung des Korns resultieren, oder auch als irgendein Produkt, das als Ergebnis der Feinzerkleinerung des Korns entsteht, wie Mehl oder Grieß.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Stärke in Form löslicher Stärke vorliegt, beispielsweise als Resultat einer sauren oder enzymatischen Prähydrolyse.

9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkohql ein Alkanol, ein Ethylenalkohol, ein Acetylalkohol, ein cyclischer Alkohol oder ein Phenol ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkohol ein einfacher Alkohol oder ein Polyol ist, vorzugsweise ein Diol.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkohol 1 bis 6 C-Atome enthält, mindestens teilweise in Wasser löslich ist und vorzugsweise eine Löslichkeit von mindestens 2,7 % (Vol./Vol.) bei 20ºC aufweist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkohol aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Isopropanol, n-Butanol, Isobutanol, tert-Butanol, Isopentanol, Hexandiol, Buten-1-ol-3, Butin-1-ol-3 oder einem Gemisch von mindestens zwei dieser Alkolhole.

13. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkohol ein Alkanol mit 1 bis 5, und insbesondere 4, Kohlenstoffatomen ist, so daß das Produkt des Verfahrens ein α-Alkylglucosid, insbesondere das α-Butylglucosid, ist.

14. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkohol ein primärer aliphatischer Alkohol ist, z.B. ein Fettalkohol, der zwischen 12 und 18 Kohlenstoffatome enthält.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es zwischen 20 und 70ºC, vorzugsweise zwischen 20ºC und 50ºC, durchgeführt wird und bei einem pH zwischen 3 und 7, vorzugsweise zwischen 4 und 6.

16. Verfahren zur enzymatischen Herstellung von oα-Glucosidestern ausgehend von Stärke, Maltodextrinen oder Maltose, gekennzeichnet durch die Herstellung von oα-Glucosiden nach einem der Ansprüche 1 bis 15 und das Inkontaktbringen (des) der so erhaltenen α-Glucoside(s) mit zumindestens einer Fettsäure und einer Enzympräparation mit Lipaseaktivität, gefolgt von der Gewinnung der so erhaltenen Ester.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Inkontaktbringen des α-Glucosids mit der oder den Fettsäure(n) und der Lipase bei einer Temperatur stattfindet, bei der die Fettsäure(n) flüssig ist (sind), wobei das Reaktionsmilieu kein Lösungsmittel enthält.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das α-Glucosid ein α-Alkylglucosid mit vorzugsweise zwischen 1 und 5 Kohlenstoffatomen ist, und dadurch, daß die Fettsäure zwischen 8 und 20 Kohlenstoffatome enthält, vorzugsweise zwischen 8 und 16.

19. Verfahren zur Behandlung nativer Stärke, von Getreidemehl oder von Maltodextrinen, gekennzeichnet durch das Inkontaktbringen dieser Substrate mit einem Alkohol, dessen einzige funktionelle Gruppe(n) (eine) Hydroxylgruppe(n) ist (sind), in Gegenwart einer gereinigten Enzympräparation, die eine α-Transglucosylierungs-Aktivität aufweist, aber keine β-Glucosidase-Aktivität.