DE3718340A1 - Verfahren zur biotechnischen herstellung von glykosiden - Google Patents

Verfahren zur biotechnischen herstellung von glykosiden

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Glykosiden aus den Komponenten Aglycon und Zucker, wobei man in vitro kultivierte Pflanzenzel­ len in einem Nährmedium in Gegenwart des Aglycon submers inkubiert.
Glykoside sind eine natürliche Speicherform vieler Na­ turstoffe und bestehen aus einem Molekül, das sich aus dem Naturstoff (Aglycon) und einem oder mehreren Zuckern zusammensetzt. Glykoside sind als solche chemisch sta­ biler, weniger flüchtig und besser wasserlöslich als das freie Aglykon. Auch können Glykoside selbst physiologi­ sche Aktivitäten aufweisen, die für Anwendungen in den Bereichen Lebensmittel, Kosmetika und Pharmazeutika, insbesondere auch bei Aromen, von Interesse sind.
Viele sekundäre Metabolite des pflanzlichen Stoffwech­ sels werden in Pflanzenzellen in Form der Glykoside akkumuliert und transportiert. Auch in vitro kultivierte Pflanzenzellen sind prinzipiell zur Glykosidbiosynthese befähigt. Dies betrifft zum einen primäre Funktionen des Aufbaus von Gerüst- und Reservepolysacchariden, zum ande­ ren sekundäre Funktionen wie die Glykosidierung von phenolischen Verbindungen sowie von Terpenen, Chinonen, Steroiden, Alkaloiden und von Proteinen.
Der Einsatz von in vitro Pflanzenzellen in biotechnischen Produktionsverfahren wird diskutiert, seit es gelungen ist, stabil wachsende Zellkulturen zu etablieren. Trotz der bekannten Fähigkeit von in vitro Pflanzenzellen zur Bildung von Glykosiden sekundärer Metabolite ist bisher nur aus Biotechnol. Abstracts (Derwent) 1986, 10 607 das Verfahren der japanischen Patentveröffentlichung 2 43 579 bekannt geworden, nach dem man das Glykosid Arbutin mit einer Oberflächenkultur bzw. Kallus-Kultur von Vinca rosea erzeugt.
Als Gewinnungsmöglichkeiten von Glykosiden kommen derzeit nur die Chemosynthese und die Abtrennung aus vegetativem pflanzlichem Material (Feldanbau) in Frage. Die chemi­ schen Verfahren weisen häufig schlechte Ausbeuten durch Instabilität der Aglyca und Nebenreaktionen sowie man­ gelnde Spezifität auf; weiterhin ist ihre Verwendung insbesondere in Lebensmitteln als synthetisch gewonnene Produkte den natürlichen Verbindungen rechtlich nicht gleichgestellt. Die Gewinnung von Glykosiden aus vegeta­ tiven Pflanzenteilen ist aufgrund der Abhängigkeit des Feldanbaus von Klima, Geographie, Geologie, Pflanzen­ schutzmitteln und ökologischen Problemen sowie wegen der Inhomogenität der Rohstoffe und der geringen Konzentra­ tion der gesuchten Substanz sehr häufig undurchführbar oder unwirtschaftlich.
Das genannte Zitat aus Biotechnol. Abstracts (Derwent) 1986, 10 607 beschreibt ein Verfahren, in dem das Kallus- Gewebe anaerob unter Schütteln in flüssigem Medium kulti­ viert werden soll. Es ist äußerst zweifelhaft, ob unter solchen Bedingungen die Kultur des Kallus-Gewebes über­ haupt möglich ist. Ferner werden für das genannte Ver­ fahren keine Ausbeuten angegeben, so daß die Gewinnung von Arbutin in technischem Maßstab nach den bekannten Verfahren äußerst zweifelhaft ist.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von solchen Glykosiden zur Verfügung zu stellen, die für die Anwendung in den Be­ reichen Lebensmittel, Kosmetika und Pharmazeutika, insbe­ sondere bei Aromen, geeignet sind.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man bei einem Verfahren der eingangs genannten Gattung als Aglycon einen glykosidierbaren Naturstoff, insbeson­ dere einen Geruchs- und/oder Geschmacksstoff einsetzt und die Inkubation unter aeroben Bedingungen durchführt.
Gegenüber den bisher angewandten Verfahren zur Produktion von Glykosiden durch Chemosynthese oder durch Abtrennung aus vegetativen Pflanzenteilen können nach dem erfin­ dungsgemäßen Verfahren durch geeignete Wahl der Verfah­ rensparameter die folgenden Anforderungen weitestgehend erfüllt werden:
Beim erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Bioreaktion mit optimaler Produktivität und Spezifität. Dabei ist Sicherheit gegen Infektionen über den Inkubationszeitraum hin gewährleistet. Weiterhin läßt sich beim erfindungs­ gemäßen Verfahren ein Bioreaktionsgefäß mit einfacher konstruktiver Auslegung einsetzen.
Das Verfahren zur Herstellung von Submerskulturen von in vitro Pflanzenzellen kann nach an sich bekannten Ver­ fahrensschritten erfolgen. Als Startmaterial für die pflanzliche Zellkultur sind steril entnommene Explantate aus beliebigen Pflanzenteilen, wie Wurzel, Stengel, Blatt oder Frucht oder auch Samen und Keimling anwendbar. Aus dem induzierten Wundkallus wird eine Oberflächenkultur (= Kallus) etabliert, die nach bekannten Verfahren in eine Submerskultur überführt wird (vergleiche H.E. Street (Hrsg.) Plant Tissue And Cell Culture, Blackwell, Oxford 1977). Nach ausreichender Stabilisierung der Zellkultur wird nach einer Kultivierungszeit von mindestens 24 Stunden das Aglycon der Zellkultur semikontinuierlich oder kontinuierlich zudosiert. Das Aglycon kann grund­ sätzlich in festem, flüssigem oder gasförmigem Zustand zugegeben werden. In der Praxis wird der flüssige Zustand bevorzugt. Nach möglichst vollständig abgelaufener Bio­ transformationsreaktion (24 bis 48 Stunden) wird die Zellmasse mechanisch vom Inkubationsmedium getrennt, durch Homogenisierung aufgeschlossen und die biosynthe­ tisierten Glykoside aus dem Überstand des zentrifugierten Homogenats isoliert.
Erfindungsgemäß als Geruchs- und Geschmacksstoffe bevor­ zugt eingesetzte Aglyca sind aliphatische mittelkettige C3-C7-Alkohole, aromatische Alkohole mit 1 oder mehre­ ren Ringen, lineare oder zyklische Monoterpenalkohole, lineare oder zyklische Sesquiterpenalkohole, pyranoide und furanoide Alkohole und Ionole. Als Zucker wird erfindungsgemäß vorzugsweise Glukose, Mannose, Galactose, Fructose, Arabinose, Ribose oder Xylose eingesetzt. In vielen Fällen hat sich Glukose als Zuckerbestandteil besonders bewährt.
Die erfindungsgemäß erhaltenen Glykoside können Mono­ glykoside oder Oligoglykoside sein.
Vorzugsweise hält man beim erfindungsgemäßen Verfahren aerobe Bedingungen ein, indem man dem Nährmedium Sauer­ stoff zuführt. Die Sauerstoffzufuhr kann z. B. durch Einleiten von Luft in einen im wesentlichen von Pflan­ zenzellen freien Anteil des Kulturmediums erfolgen. Diese Verfahrensvariante hat den Vorteil, daß jederzeit aus­ reichend Sauerstoff für den Energiestoffwechsel der Pflanzenzellen und dadurch auch für die Glykosidbiosyn­ these zur Verfügung steht. Gleichzeitig wird der Austrag flüchtiger Aglyca während des Bioprozesses minimiert.
Besonders günstige Produktionsbedingungen kann man da­ durch erreichen, daß man aus einem Gemisch der in vitro kultivierten Pflanzenzellen unterschiedlicher Aggregat­ größe die Fraktion mit einem Durchmesser kleiner als 500 Mikrometer abtrennt und mit einer Anfangszelldichte von 50 bis 100 g Feuchtgewicht pro Liter Nährmedium einsetzt.
Als Nährmedien für die Kultur der Pflanzenzellen können die Basisrezepturen der üblichen Nährmedien verwendet werden. Auxine und Cytokinine werden im Konzentrations­ bereich von je 0,1 bis 10 mg/L verwendet. Das Nährmedium enthält mindestens 1 Kohlenhydrat und kann ferner ent­ halten Inosit, Aminosäuren, Thioharnstoff und Ascorbin­ säure.
Nach beendeter Reaktion werden die Pflanzenzellen vom Kulturmedium abgetrennt und die Glykoside durch bekannte extraktive und/oder chromatographische Verfahrensschritte gewonnen.
Um bei der Durchführung des vorgeschlagenen Biosynthese­ verfahrens einen vorzeitigen Austrag der mehr oder weni­ ger flüchtigen Aglyca vor Beendigung der Biotransforma­ tion zu minimieren, wird erfindungsgemäß eine blasenfreie Belüftung bevorzugt. Im Maßstab bis 400 ml Reaktionslö­ sung können Schüttelkulturen in Erlenmeyerkolben bei 100 bis 130 UpM je nach Gesamtvolumen verwendet werden. Vo­ lumina über 400 ml, insbesondere solche im halbtechni­ schen und technischen Maßstab können gemäß einer bevor­ zugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens nach einem der folgenden Verfahren A oder B belüftet werden:
A) Externer By-Pass (Fig. 1)
Gemäß Fig. 1 enthält der Bioreaktor 1 ein Rührwerk 2 so­ wie einen Absetztrichter 3. Ein kleiner Volumenteil des durch das Rührwerk 2 bewegten Nährmediums 4 befindet sich in dem Absetztrichter 3, aus dem Flüssigkeit in ein Ne­ bengefäß 5 strömt. Der Anteil des flüssigen Nährmediums 4, der sich in dem Nebengefäß 5 befindet, wird dort durch eine Fritte 6 belüftet und sofort in den Bioreaktor 1 zurückgepumpt. Flüchtige Anteile werden im Kondensator 7 kondensiert und somit aus dem Abluftstrom 8 entfernt.
B) Interner By-Pass (Fig. 2)
Der verwendete Bioreaktor 1 enthält ein allseits ge­ schlossenes zylindrisches Siebgewebe 2, auf dessen Boden sich eine Fritte 3 befindet. Ein kleiner Volumenteil des Nährmediums 4 befindet sich innerhalb des geschlossenen zylindrischen Siebgewebes 2 und wird durch die Fritte 3 belüftet. Der Stofftransfer wird durch ein Rührwerk 5 beschleunigt. Flüchtige Produkte werden im Kondensator 6 kondensiert und so aus dem Abluftstrom 7 entfernt.
Das vorgeschlagene biotechnische Verfahren unter Verwen­ dung von submers und in vitro kultivierten Pflanzenzellen vermeidet die Nachteile der bekannten Verfahren Chemo­ synthese und Gewinnung aus Feldpflanzen. Durch die enzy­ matische Bildungsweise erfolgt die Glykosidbildung in guter Ausbeute bei Raumtemperatur und Umgebungsdruck ohne erkennbare Nebenprodukte. Dies ist besonders für die er­ findungsgemäß hergestellten Geruchs- und Geschmacksstoffe von ausschlaggebender Bedeutung. Denn häufig machen schon geringste Spurenanteile von unerwünschten Nebenprodukten künstlich erzeugte Geruchs- und Geschmacksstoffe für die beabsichtigte Anwendung unbrauchbar. Durch die Gleich­ förmigkeit des biokatalytischen Materials wird eine re­ produzierbare Produktivität erreicht. Äußere negative Einflüsse werden durch die kontrollierten, sterilen Kul­ tivierungsbedingungen im Bioreaktor ausgeschaltet.
Beispiel 1 Mentholglukoside
Suspendierte in vitro Zellen von Mentha sp. werden in ein Nährmedium inokuliert, das die Mineralsalze und Vitamine des SH-Mediums (R.H. Schenk, A.C. Hildebrandt, Can. J. Bot., 1972, 50, 199-204) enthält, sowie ferner
2,4-Dichlorphenoxyessigsäure 0,5 mg/l p-Chlorphenoxyessigsäure 2,0 mg/l Kinetin 0,1 mg/l Saccharose30 g/l Inosit 1 g/l
Nach 72 Stunden Kultivierungszeit wird semikontinuierlich oder kontinuierlich eine sterilfiltrierte wässrige Lösung von e-Menthol zugegeben. Bei einmaliger Dosierung von 100 Mikromol pro 150 ml werden nach 24 Stunden Inkubations­ zeit 70% des Menthols in glukosidisch gebundener Form gefunden. Das Verhältnis von Monoglucose- und Oligo­ glucose-Glukosid wird durch die Inkubationsdauer be­ stimmt. So wurden nach 12stündiger Inkubation ein Ver­ hältnis von Monoglucose-Glukosid zu Oligoglucose-Glukosid von 95 zu 5 gefunden, während dieses Verhältnis nach 72stündiger Inkubation 50 zu 50 betrug.
Die Reaktion verläuft spezifisch und ohne sonstige Trans­ formationsreaktionen des Aglycons, wie chromatographisch festgestellt wurde. Bei Dosierung von d-Menthol wird aus­ schließlich das d-isomere Glukosid gebildet. Das Zellal­ ter für optimale Produktivität betrug bei verschiedenen Ansätzen 3 bis 7, vorzugsweise 4 Tage. Die Biotransfor­ mation wurde bei Umgebungslicht und Temperaturen von 20- 30°C, vorzugsweise 27°C, durchgeführt.
Beispiel 2 Linaloolglukosid, Methylsalicylsäureglukosid, Benzylglu­ kosid, Phenylethylglukosid
In gleicher Weise wie in Beispiel 1 werden anstelle von Menthol Linalool, Methylsalicylsäure, Benzylalkohol bzw. Phenylethanol dosiert und zu den korrespondierenden Glu­ kosiden transformiert. Die Reaktion verläuft spezifisch und ohne Isomerisierungsreaktionen. Chromatographisch und sensorisch wurde ein einheitliches Produkt ohne ge­ ruchlich oder geschmacklich störende Nebenprodukte fest­ gestellt. Die Ausbeuten betrugen, bezogen auf die einge­ setzten Aglyca, 85, 60, 65 bzw. 75 Gew.-%.
Beispiel 3 Butylglukosid, iso-Pentylglukosid, Hexylglukosid, Heptylglukosid, Octylglukosid
In gleicher Weise wie in Beispiel 1, jedoch mit Zellma­ terial einer anderen Pflanzenspezies, werden durch sus­ pendierte in vitro-Zellen von Malus sylvestris nach Do­ sierung von Butanol, iso-Pentanol, Hexanol, Heptanol oder Octanol die korrespondierenden Glukoside gebildet. Das verwendete Nährmedium enthält die Mineralsalze und Vita­ mine des MS-Mediums (T. Murashige, F. Skoog, Physiol. Plant. 1962, 15, 473-497) sowie ferner
Asparagin180 mg/l Thioharnstoff 25 mg/l Ascorbinsäure 50 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure  1 mg/l Benzyladenin  0,1 mg/l Saccharose 30 g/l Inosit  3 g/l.
Die chromatische und sensorische Überprüfung der erhal­ tenen Glukoside ergab, daß diese vollständig frei von geruchlich oder geschmacklich störenden Nebenprodukten waren.
Beispiel 4 Geranylglukosid, Citronellylglukosid
In gleicher Weise wie in Beispiel 3, jedoch mit Zellma­ terial einer anderen Pflanzenspezies, werden durch sus­ pendierte in vitro Zellen von Citrus sp. bzw. Artemisia sp. nach Dosierung von Geraniol oder Citronellol die korrespondierenden Glukoside gebildet. Das verwendete Nährmedium entspricht in der Zusammensetzung dem LS-Me­ dium (E.M. Linsmeier, F. Skoog, Physiol. Plant., 1965, 18, 100-127) mit
2,4-Dichlorphenoxyessigsäure  0,22 mg/l 1-Naphthylessigsäure  0,19 mg/l Inosit100 mg/l.
Eine chromatographische und sensorische Prüfung der erhaltenen Glukoside ergab, daß diese frei von geruchlich und geschmacklich störenden Nebenprodukten waren.
Beispiel 5 Nerolglukosid
In gleicher Weise wie in Beispiel 3, jedoch mit Zell­ material einer anderen Pflanzenspezies, werden durch suspendierte in vitro Zellen von Rosmarinus officinalis nach Dosierung von Nerol die korrespondierenden Glukoside gebildet. Das verwendete Nährmedium entspricht in der Zusammensetzung dem B5-Medium (O.L. Gambsborg, R.A. Miller, K. Ojima, Exp. Cell Res., 1968, 50, 151-158) mit
2,4-Dichlorphenoxyessigsäure  2,0 mg/l 1-Naphthylessigsäure  0,5 mg/l Indolessigsäure  0,5 mg/l Kinetin  0,2 mg/l Inosit100 mg/l.
Die chromatographische und sensorische Überprüfung er­ gab, daß das erhaltene Produkt vollständig frei von sensorisch störenden Nebenprodukten war.

Claims (10)

1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Glykosiden aus den Komponenten Aglycon und Zucker, wobei man in vitro kultivierte Pflanzenzellen in einem Nährmedium in Gegenwart des Aglycons submers inkubiert, dadurch gekennzeichnet, daß man als Aglycon einen glykosidierbaren Naturstoff, insbesondere einen Geruchs- und/oder Geschmacksstoff einsetzt und die Inkubation unter aeroben Bedingun­ gen durchführt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Geruchs- und/oder Geschmacksstoff einen aliphatischen mittelkettigen (C3 bis C7)-Alkohol, einen aromatischen Alkohol mit 1 oder mehreren Rin­ gen, einen linearen oder zyklischen Monoterpenalko­ hol, einen linearen oder zyklischen Sesquiterpenal­ kohol, pyranoide oder furanoide Alkohole oder Ionole einsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man als Zucker Glucose, Mannose, Galactose, Fructose, Arabinose, Ribose oder Xylose einsetzt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zucker Glukose einsetzt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Oligosaccharidglykosid herstellt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium Sauerstoff bis zum Erreichen eines geeigneten Partialdruckes zuführt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Sauerstoffzufuhr durch Einleiten von Luft in einen im wesentlichen von Pflanzenzellen freien An­ teil des Kulturmediums erfolgt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man aus einem Gemisch der in vitro kultivierten Pflanzenzellen unterschiedlicher Aggregatgrößen die Fraktion mit einem Durchmesser kleiner als 500 Mikrometer abtrennt und mit einer Anfangszelldichte von 50 bis 100 g Feuchtgewicht pro Liter Nährmedium einsetzt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es bei Umgebungslicht oder zusätzlicher Belichtung der Zellen mit 2000 bis 6000 lux durchgeführt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man nach beendeter Reaktion die Pflanzenzellen vom Kulturmedium abtrennt und die Glykoside durch extraktive und chromatographische Verfahrensschritte gewinnt.
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Zusätzlich sind zur Einsicht für jedermann die Cheromatogramme (Blatt 1-8) sowie die Beispiele 6 und 7, eingegangen am 13.11.89, bereitzuhalten. *

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