DE69634384T2

DE69634384T2 - Zur unterstützung der knochenzellenaktivität besonders geeignete stabilisierte zusammensetzung aus kalziumphosphatphasen

Info

Publication number: DE69634384T2
Application number: DE69634384T
Authority: DE
Inventors: M. Sydney PUGH; J. Timothy Smith; Michael Sayer; Dorthea Sarah LANGSTAFF
Original assignee: Millenium Biologix Inc
Current assignee: Warsaw Orthopedic Inc
Priority date: 1995-09-01
Filing date: 1996-08-30
Publication date: 2006-01-12
Anticipated expiration: 2016-08-31
Also published as: DE69634384D1; ATE289572T1; EP0847376A1; CA2230057C; NZ315995A; JP4465046B2; US6585992B2; US20070184035A1; US20020042657A1; BR9610357A; JPH11512069A; KR19990044355A; AU6783296A; CN1183058C; WO1997009286A1; USRE41251E1; BR9610357B1; ES2236746T3; JP5172795B2; EP0847376B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft bioaktive, künstliche, stabilisierte gesinterte Zusammensetzungen von Calciumphosphatphasen, die in der Lage sind, Knochenzellaktivität darauf zu unterstützen. Diese Erfindung findet in medizinischer Diagnostik für die Bewertung von normaler und abnormaler Knochenzellaktivität sowie in medizinischer Therapeutik Anwendung, die Ersatz und Reparatur von Knochen- und Zahngewebe sowie die ex vivo Knochentransplantatsgewebekonstruktion einschließen.
Knochen ist ein komplexes mineralisierendes System, das aus einer anorganischen oder mineralischen Phase, einer organischen Matrixphase und Wasser zusammengesetzt ist. Die anorganische Mineralphase ist zusammengesetzt aus kristallinen Calciumphosphatsalzen, während die organische Matrixphase hauptsächlich aus Kollagen und anderen nicht kollagenösen Proteinen besteht. Die Kalzifizierung von Knochen hängt von der engen Assoziation zwischen den organischen und anorganischen Phasen ab, um ein mineralisiertes Gewebe zu erzeugen.
Der Knochenwachstumsprozess ist so geregelt, dass er sowohl strukturelle als auch funktionelle Erfordernisse erfüllt. Die Zellen, die in die Prozesse von Knochenaufbau, -erhalt und -resorption involviert sind, sind Osteoblasten, Osteozyten und Osteoklasten. Osteoblasten synthetisieren die organische Knochenmatrix, Osteoid, die nach dem Calciumphosphat-Kristallwachstum und der Kollagenassemblierung mineralisiert wird. Die Osteozyten regulieren den Calcium- und Phosphatfluss zwischen dem Knochenmineral und dem extrazellulären Fluid. Osteoklasten resorbieren Knochen und sind beim Knochenumgestaltungsprozess essentiell. Eine Störung der natürlichen Balance zwischen Knochenbildung und Resorption führt zu verschiedenartigen Knochenerkrankungen. Es konnte gezeigt werden, dass eine erhöhte Osteoklastenaktivität zu einer Knochenerkrankung führt, die durch ein Abnehmen der Knochendichte charakterisiert ist, wie sie beispielsweise bei Osteoporose, Osteitis Fibrosa und der Pagetschen Krankheit beobachtet wird. All diese Erkrankungen sind eine Folge von erhöhter Knochenresorption.
Um die involvierten Mechanismen zu verstehen, die die Knochenzellfunktion regulieren, ist es wichtig, dass man imstande ist, die normale Knochenzellfunktion sowie den Perturbationsgrad dieser Aktivität bei verschiedenen Knochenerkrankungen zu bewerten. Dies wird zur Identifikation von Medikamenten führen, die darauf abzielen, die abnormale Knochenzellaktivität wieder auf ein normales Maß zurückzuversetzen. Zusammen mit der Identifikation der Ätiologie abnormaler und normaler Knochenzellaktivität und der Bewertung dieser Aktivität besteht der Wunsch und der Bedarf, Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung abnormaler Knochenzellaktivität zu entwickeln, die Folge einer Erkrankung, chirurgischen Amputation oder eines physiologischen Traumas ist, die alle zu Knochengewebsverlust führen. Therapeutik, die den Ersatz und die Reparatur von Knochengewebe ermöglicht, beispielsweise bei der Verwendung von Knochenimplantaten, sind hocherwünscht.
Mehrere Forschungsgruppen haben Verfahren entwickelt, um die Aktivität isolierter Osteoklasten in vitro direkt zu beobachten. Osteoklasten, die aus Knochenmarkszellpopulationen isoliert wurden, wurden auf dünnen Scheiben natürlicher Materialien, wie beispielsweise Pottwal-Dentin (Boyde et al. Brit. Dent. J. 156, 216, 1984) oder Knochen (Chambers et al. J. Cell Sci. 66, 383, 1984) kultiviert. Die letztgenannte Gruppe konnte nachweisen, dass andere Zellen der mononukleären Phagozytenreihe nicht über diese resorptive Aktivität verfügen (Chambers & Horton, Calcif Tissue Int. 36, 556, 1984). In jüngerer Zeit waren Versuche, andere Zellkulturtechniken anzuwenden, um Osteoklastenabstammung zu untersuchen, noch immer auf die Verwendung von Knochenrindenscheiben angewiesen (Amano et al. and Kerby et al. J. Bone & Min. Res. 7(3)), wobei sich eine quantitative Bestimmung der Resorptionsaktivität entweder auf eine zweidimensionale Analyse von Resorptionsgrubenbereichen unterschiedlicher Tiefe oder eine Stereokartierung des Resorptionsvolumens stützt. Solche Techniken erzielen bei der Bewertung der Resorption verhältnismäßig dicker Substrate bestenfalls eine Genauigkeit von etwa 50 %. Zudem sind diese Analysetechniken sehr zeitaufwändig und setzen eine hochspezialisierte Ausrüstung und Schulung voraus. Ferner ist die Präparation und nachfolgende Untersuchung von Knochen- oder Dentinscheiben weder eine einfache noch praktische Methode zur Bewertung der Osteoklastenaktivität.
Die Verwendung künstlicher Calciumphosphatpräparationen als Substrate für Osteoklastenkulturen war ebenfalls wenig erfolgreich. Jones et al. (Anat. Embryol 170, 247, 1984) berichteten zwar, dass Osteoklasten synthetische Apatite in vitro resorbieren, versäumten es jedoch, einen experimentellen Nachweis zu erbringen, um diese Beobachtung zu bestätigen. Shimizu et al. (Bone and Mineral 6, 261, 1989) berichteten, dass isolierte Osteoklasten nur devitale Knochenoberflächen und nicht synthetisches Calciumhydroxyapatit resorbieren. Diese Ergebnisse würden darauf hinweisen, dass funktionelle Osteoklasten schwer in vitro zu kultivieren sind.
Mehrere Forschungsgruppen haben ebenso versucht, Zusammensetzungen zur Verfügung zu stellen, die für den therapeutischen Knochengewebsersatz geeignet sind. U.S. Patent Nr. 4,871,578 offenbart einen Prozess zur Bildung einer nicht porösen, glatten Hydroxyapatit-Beschichtung, die für die Implantatverwendung geeignet ist. U.S. Patent Nr. 4,983,182 offenbart ein keramisches Implantat, das einen gesinterten Zirkondioxidkörper und eine Beschichtung aus α-TCP und Zirkondioxid, oder Hydroxyapatit und Zirkondioxid umfasst. U.S. Patent Nr. 4,988,362 offenbart eine Zusammensetzung für die Fusion einer Biokeramik an eine weitere Biokeramik. U.S. Patent Nr. 4,990,163 offenbart eine Beschichtung, die für die Produktion von Biokeramiken verwendet wird, die aus α-TCP und β-TCP bestehen. Obwohl diese unterschiedlichen Zusammensetzungen als biokompatible Beschichtungen für Implantate und dergleichen benutzt werden können, konnte für keine dieser Zusammensetzungen gezeigt werden, dass sie in einer so verlässlichen und reproduzierbaren Weise für die Kultur sowohl von aktiven Osteoklasten als auch Osteoblasten geeignet ist, dass sie die quantitative Bestimmung der spezifischen Aktivität der Osteoklastenresorption und Osteoblastensekretion von Knochenmatrix erlaubt. Ferner kann keine der bisher entwickelten Zusammensetzungen dahingehend manipuliert werden, dass sie verlässlich eine Bandbreite an Filmen, dickeren Beschichtungen und Bulkkeramikstücken produzieren, die eine gemeinsame Zusammensetzung und Morphologie aufweisen, was zu einer ähnlichen bioaktiven in vivo und in vitro Leistung führt.
Die von der Anmelderin veröffentlichte internationale PCT-Patentanmeldung WO94/26872 beschreibt einen Sinterungsprozess zur Bildung dünner Calciumphosphatphasen-Filme, auf denen Knochenzellfunktion erfolgt. Dies ist die erste Dünnschicht aus synthetischem Material, auf dem Osteoklasten ausgedehnte Aktivität zeigen können und auf dem Osteoblasten Knochenmatrix sekretieren können. Wie in dieser Anmeldung beschrieben, sollte eine Anzahl von Faktoren bei der Bereitstellung eines Dünnfilms mit einem gewünschten Verhältnis von Hydroxyapatit zu Tricalciumphosphat berücksichtigt werden. Derartige Parameter schließen ein:

1) Menge der Reagenzien zur Herstellung der Sol-Gel-Hydroxyapatit-Substanz;
2) Kombinationsgeschwindigkeit der Reagenzien;
3) Mischdauer und -geschwindigkeit bei der Herstellung des Sol-Gels;
4) Geschwindigkeit und Verfahren von Präzipitation und Separation;
5) Prozessumweltbedingungen während der Herstellung des Sol-Gels;
6) Entnahmegeschwindigkeit des Substrats vom Sol-Gel beim Tauchbeschichten eines Film darauf;
7) Sinterungstemperatur;
8) Sintern in einer kontrollierten Atmosphäre, wie beispielsweise inertes Gas, Vakuum oder eine Atmosphäre mit Wasserdampf;
9) Beschaffenheit des Substrats, wobei Quarz eine bevorzugte Ausführungsform zur Erzeugung eines transparenten Substrats darstellt, das mit stabilisierten Calciumphosphatphasen beschichtet ist.

In dieser früheren PCT-Patentanmeldung wurde angedeutet, dass, um eine große Bandbreite an Verhältnissen von Hydroxyapatit zu Tricalciumphosphat auf Quarzsubstraten zu erhalten, viele dieser Parameter berücksichtigt werden müssen, um ein Verhältnis von 10:90 bis hin zu 90:10 zu erzielen. Die vorgeschlagenen Sinterungstemperaturen in einer Luftatmosphäre reichten von etwa 800°C bis etwa 1100°C. Es wurde festgestellt, dass der Film bei 800°C vorwiegend aus Hydroxyapatit bestand. Eine Sinterungstemperatur von etwa 900°C lieferte Verhältnisse von etwa 70:30. Bei 1000°C betrug das Verhältnis etwa 10:90 und bei 1100°C bestand der Film vorwiegend aus Tricalciumphosphat. Weiterhin wurde angedeutet, dass Sintern unter Vakuum bei 1000°C ein Verhältnis von etwa 66:34 ergab. Es wurde jetzt herausgefunden, dass die bevorzugten Verhältnisse zwischen 50:50 und 20:80 liegen. Das optimale Verhältnis ist etwa 333:666. Um diese Verhältnisse zu erreichen, können einige der oben genannten Faktoren in Betracht gezogen werden. Trotzdem ist es wünschenswert die Variabilität in mehreren der oben genannten Faktoren zu minimieren und die gewünschten Verhältnisse für optimale Filmzusammensetzungen in einer streng reproduzierbaren Art und Weise zu erreichen. Überraschenderweise ist dieser Film in Anwesenheit verschiedener wässriger Medien stabil, obwohl α-Tricalciumphosphat in Wasser löslich sein soll.
Die Anmelder haben herausgefunden, dass die Anwesenheit stabilisierender Entitäten die Zusammensetzung stabilisieren und ihre Degradation in physiologischen Fluiden verhindern kann. Daraus folgt, dass das Verschwinden von Calciumphosphat-Entitäten aus einem Film, einer Beschichtung oder einem Bulkkeramikstück dieser Zusammensetzung im Wesentlichen auf die Aktivität der Osteoklasten und nicht auf einen Auflösungsvorgang zurückzuführen ist. Die stabilisierte, künstliche, bioaktive Zusammensetzung ist die erste derartige Zusammensetzung, die sowohl die Osteoklasten- als auch die Osteoblastenaktivität unterstützt, und die die verlässliche Bewertung der physiologischen Aktivitäten beider Zelltypen sowie die Entwicklung sowohl von diagnostischen als auch therapeutischen Strategien ermöglicht. Die stabilisierenden Entitäten stabilisieren das α-Tricalciumphosphat innerhalb der Calciumphosphatphasen, die während des Sinterns gebildet werden, um eine stabile Form des α-Tricalciumphosphats bereitzustellen, das in physiologischen Fluiden nicht degradiert und das Calciumphosphatphasen ausbildet, die eine zellkompatible Morphologie aufweisen, die die Knochenzellaktivität darauf unterstützt und fördert.
Die vorliegende Erfindung stellt eine stabilisierte Zusammensetzung zur Verfügung, die eine große Anzahl an diagnostischen und therapeutischen Anwendungen bereitstellt. Die stabilisierte Zusammensetzung kann gemäß eines Aspekts der Erfindung verwendet werden, um eine Bandbreite von Dünnfilmen, Beschichtungen, Pulvern und Bulkkeramikstücken bereitzustellen, die eine gemeinsame Kugeloberflächenmikroporosität und eine innere Mikroporosität aufweisen. Darüber hinaus können die Bulkkeramiken eine Makroporosität innerhalb der Struktur aufweisen, um ein künstliches dreidimensionales Knochengewebe bereitzustellen, das dem in vivo vorkommenden ähnelt. Jede Form der Zusammensetzung fördert die Aktivität der darauf kultivierten Knochenzellen und erlaubt zudem die Entwicklung eines ex vivo konstruierten künstlichen Knochengewebes zur Verwendung als Knochentransplantate.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird eine bioaktive, künstliche, gesinterte Zusammensetzung zur beständigen Unterstützung der Knochenzellaktivität bereitgestellt, wobei die Zusammensetzung umfasst: mit stabilisierenden Entitäten stabilisiertes Tricalciumphosphat, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus Silicium-Entitäten, Aluminium-Entitäten, Zirkonium-Entitäten, Barium-Entitäten, Titan-Entitäten, Germanium-Entitäten, Chrom-Entitäten, Vanadium-Entitäten, Niobium-Entitäten, Bor-Entitäten und Mischungen davon, wobei das stabilisierte Tricalciumphosphat in physiologischen Fluiden mit einem pH-Wert von ca. 6,4 bis 7,3 unlöslich ist und wobei die Zusammensetzung durch die Umwandlung einer mit den stabilisierenden Entitäten gleichmäßig dotierten Hydroxyapatit-Sol-Gel-Substanz mittels Sintern erhältlich ist.
In einer Ausführungsform ist die Zusammensetzung durch die Umwandlung einer mit einer metallorganischen Lösung der stabilisierenden Entitäten gleichmäßig dotierten Hydroxyapatit-Sol-Gel-Substanz mittels Sintern erhältlich.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Prozess zur Herstellung einer stabilisierten, künstlichen, gesinterten Zusammensetzung aus Calciumphosphatphasen bereitgestellt, die eine Morphologie aufweisen, die zur Unterstützung der Knochenzellaktivität darauf geeignet ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Dotieren einer Hydroxyapatit-Substanz mit stabilisierenden Entitäten, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus Silicium-Entitäten, Aluminium-Entitäten, Zirkonium-Entitäten, Barium-Entitäten, Titan-Entitäten, Germanium-Entitäten, Chrom-Entitäten, Vanadium-Entitäten, Niobium-Entitäten, Bor-Entitäten und Mischungen davon; Sintern der dotierten Hydroxyapaptitsubstanz, wobei das Sintern die dotierte Hydroxyapatitsubstanz in hauptsächlich α-Tricalciumphosphat mit Phosphatphasen umwandelt, wobei das stabilisierte α-Tricalciumphosphat in physiologischen Fluiden mit einem pH-Wert von etwa 6,4 bis 7,3 unlöslich ist, durch Osteoklasten resorbierbar ist und die Sekretion von mineralisierender kollagenöser Matrix durch Osteoblasten fördert, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass die Hydroxyapatitsubstanz in der Form eines Sol-Gels vorliegt und das Hydroxyapatit-Sol-Gel mit den stabilisierenden Entitäten gleichmäßig dotiert ist.
Auch wird hier eine bioaktive, gesinterte, künstliche, mikroporöse, polykristalline Struktur zum beständigen Unterstützen der Knochenzellaktivität darauf beschrieben, deren Struktur gesinterte, im wesentlichen gleichmäßig stabilisierte Calciumphosphatphasen umfasst, die eine kugelförmige Oberflächenmorphologie aus lose verbundenen, abgerundeten Körnchen mit verbundenen Mikroporen in der Struktur aufweist, wobei die genannten im wesentlichen gleichmäßig stabilisierten Calciumphosphatphasen durch die Umwandlung einer im wesentlichen gleichmäßig mit stabilisierenden Entitäten dotierten Hydroxyapatitsubstanz bei Sinterungstemperaturen zu Tricalciumphosphat hergestellt werden, wobei das im wesentlichen gleichmäßig stabilisierte α-Tricalciumphosphat in physiologischen Fluiden unlöslich ist und wobei die stabilisierenden Entitäten dem Hydroxyapatit vor dem Sintern zugesetzt werden.
1 ist ein Prädominanzflächen-Diagramm, das die Wirkung von CaO-Aktivität auf die Stabilitäten von Hydroxyapatit und Tricalciumphosphat zeigt.
2 ist ein Diagramm, das die Phasen der Calciumphosphat-Entitäten zeigt, die in Anwesenheit von stabilisierenden Silicium-Entitäten bei Umwandlung der erfindungsgemäßen Hydroxyapatitsubstanz ausgebildet werden.
3 ist ein Diagramm, das die Wirkung von CaO/Al₂O₃ auf die Aktivität von CaO zeigt.
4 ist ein Diagramm, das die Wirkung von CaO/TiO₂- und CaO/B₂O₃-Verhältnissen auf die Aktivität von CaO zeigt.
5 enthält die Graphen (a) (b) und (c), die die Ergebnisse einer energiedispersiven Röntgenspektroskopie (a) an der Übergangsstelle von der Zusammensetzung zum Substrat; (b) kurz oberhalb der Übergangsstelle und (c) auf der Oberfläche eines Films, der durch Diffusion von Siliciumdioxid-Entitäten aus dem Substrat hergestellt ist, zeigen.
6 ist ein REM-Querschnitt mineralisierter kollagenöser Knochenmatrix, die auf einer stabilisierten erfindungsgemäßen Dünnfilmzusammensetzung von aktiven Osteoblasten abgelagert wurde.
7(a) ist eine Photographie, die die Ablagerung von fluoreszierender kalzifizierter Knochmatrix zeigt, die von Osteoblasten, die auf der stabilisierten Zusammensetzung kultiviert wurden, gebildet wurde.
7(b) ist eine Photographie, die eine Kontrolle, in der keine Osteoblasten auf der stabilisierten Dünnfilmzusammensetzung kultiviert wurden und keine fluoreszierende kalzifizierte Knochenmatrix dargestellt ist.
8 ist ein REM von Osteoklastenresorptionsgruben auf dreidimensionaler, fester Bulkkeramik, die aus künstlichen, bioaktiven, stabilisierten Zusammensetzungen zusammengesetzt ist.
9 ist ein REM von Osteoklastenresorptiongruben auf Dünnfilmen aus künstlichen, bioaktiven, stabilisierten Zusammensetzungen.
10 ist eine vergrößerte Querschnitts-TEM-Aufnahme einer Dünnschicht der künstlichen stabilisierten Zusammensetzung auf einem Quarzsubstrat, die die Morphologie zeigt.
11 ist eine REM-Aufnahme, die die mikroporöse Oberflächenstruktur der als Dünnfilm angelegten stabilisierten Zusammensetzung zeigt.
12(a) ist eine REM-Aufnahme eines kommerziellen gesinterten Hydroxyapatits in der Abwesenheit von stabilisierenden Entitäten.
12(b) ist eine REM-Aufnahme eines kommerziellen gesinterten Hydroxyapatits in der Anwesenheit stabilisierender Silicium-Entitäten.
13 ist ein REM eines Osteoklasten auf natürlichem Knochen, der eine natürliche Resorptionsgrube zeigt.
14 ist eine REM-Aufnahme, die die kugelförmige Oberflächenmorphologie der Bulkkeramik, die durch die Prozesse der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, veranschaulicht.
Die Zusammensetzung der Calciumphosphatsubstanz entspricht jener, die vom Anmelder in der publizierten PCT-Anmeldung WO 94/26872 beschrieben ist. Dieser Prozess stellt auf einer beständigen Basis einen Dünnfilm aus Calciumphosphatphasen mit einem Verhältnis von Hydroxyapatit zu α-Tricalciumphosphat innerhalb des gewünschten Bereichs von 50:50 bis 20:80 bereit. Nunmehr wurde herausgefunden, dass die Anwesenheit von stabilisierenden Entitäten das α-TCP innerhalb der Calciumphosphatphasen signifikant und unerwartet stabilisiert, um eine bioaktive Zusammensetzung bereitzustellen, die die Aktivität sowohl von Osteoblasten als auch Osteoklasten unterstützt und fördert, und die Quantifizierung dieser Aktivität auf eine reproduzierbare Art und Weise erlaubt und die Entwicklung diagnostischer und therapeutischer Strategien für Knochengewebsverlust ermöglicht.
Der Begriff "stabilisiert" bezieht sich auf die Calciumphosphatphasen, die mittels Umwandlung des Calciumhydroxyapatits gebildet werden, die eine beständige kristallographische und chemische Struktur beibehalten, wenn sie in vivo oder in vitro in Umgebungsbedingungen oder physiologische Umgebung eingebracht werden. Auch bezieht sich der Begriff "bioaktiv" auf die Fähigkeit, osteoblastisches Knochenwachstum über und durch Strukturen hindurch zu unterstützen, die im wesentlichen oder exklusiv aus der vorliegenden Zusammensetzung hergestellt sind, und gleichzeitig die natürliche, kontrollierte, extrazelluläre Resorption der Zusammensetzung durch Osteoklasten zu fördern, während unspezifische chemische und/oder zelluläre Auflösung und/oder Degradation in einem Prozess, der stark demjenigen von normalem Knochenstoffumsatz ähnelt, vermieden wird. Derlei Bioaktivität liegt bei der in vitro und in vivo Verwendungen der Materialien vor, wenn Knochenzellen anwesend sind. Der Begriff "Calciumphosphatphasen" umfasst verschiedene Calciumphosphatspezies in dem gesinterten Produkt, wie beispielsweise Hydroxyapatit, α-TCP, β-TCP, Calciumoktophosphat, Tetracalciumphosphat und Dicalciumphosphat.
Es wurde ursprünglich angenommen, dass reines oder im wesentlichen reines Hydroxyapatit das für die in vitro Unterstützung der Knochenzellaktivität geeignete Calciumphosphatprodukt ist und wurde für die Calciumphosphat-Entität der Wahl bei Herstellung eines Films gehalten. Nunmehr wurde festgestellte, dass Materialien, die vorwiegend aus Hydroxyapatit bestehen, normale Osteoklasten- und Osteoblastenfunktion nicht fördern und in Anwesenheit von Osteoklasten tatsächlich nur eine sehr geringe Aktivität beobachtet werden kann. Es wurde jedoch herausgefunden, dass bei Bereitstellung einer Mischung aus Calciumphos phatphasen, die Hydroxyapatit und α-Tricalciumphosphat enthält, der Resorptionsgrad über einen breiten Bereich gefördert wird, wobei der vorwiegend aus α-Tricalciumphosphat bestehende Film den höchsten Resorptionsgrad ergibt, während ein Film, der vorwiegend aus Hydroxyapatit besteht, einen vernachlässigbaren Resorptionsgrad ergibt. Es ist diese Erkenntnis in Bezug auf die Anwesenheit von α-Tricalciumphosphat, die teilweise erklärt, warum die vorliegenden entwickelten Calciumphosphatmaterialien die funktionellen Eigenschaften in Knochenzellen, die auf solchen Materialen kultiviert werden, fördern. Durch Bereitstellung stabilisierter Calciumphosphatphasen in Form eines Dünnfilms, der z.B. lichtdurchlässig ist oder Licht reflektiert, ermöglicht dieser Aspekt die Durchführung diagnostischer Verfahren zur Bewertung verschiedener funktioneller Eigenschaften von Knochenzellen, die auf einem solchen Film kultiviert werden.
Es wurde überraschenderweise herausgefunden, dass Standardisieren der Hydroxyapatit-Sol-Gel-Substanzherstellung und Auswählen eines sehr spezifischen Sinterungstemperaturbereichs, nicht nur die gewünschten Verhältnisse erzielt, sondern auch zeigt, dass die optimale Zusammensetzung ausgebildet wird, indem das beim Sol-Gel Prozess hergestellte Hydroxyapatit in α-Tricalciumphosphat umgewandelt wird. In diesen bevorzugten optimierten Filmzusammensetzungen wurde wenig oder kein β-Tricalciumphosphat nachgewiesen. Es besteht kein Bedarf zur Herstellung von Mischungen aus Hydroxyapatit und α-Tricalciumphosphatpräparationen der individuellen Phasen. Vielmehr ist die in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 94/26872 beschriebene Technik zum Herstellen einer Sol-Gel-Hydroxyapatit-Substanz ausreichend. Die chemische Reaktion zur Herstellung einer derartigen Hydroxyapatit-Substanz in einem Medium mit erhöhtem pH-Wert lautet wie folgt: 5 Ca(NO₃)₂ + 3 NH₄H₂PO₄ + 7 NH₄OH -> Ca₅(PO₄)₃OH + 10 NH₄NO₃ + 6 H₂O
Die Ausgangslösungen bestehen aus wässrigen Lösungen, in denen die Recktanten vollständig gelöst sind und die gut gemischt werden können. Das Hydroxyapatit bildet sich als feine Partikel in Suspension aus, deren Größe, wie durch Lichtstreuungsexperimente gezeigt wurde, beim Altern der Gel-Sol Substanz über 24 Stunden nach der Herstellung von einem Durchschnitt von etwa 0,3 μm auf über 1 μm anwächst.
Die Hydroxyapatit-Substanz ist in neutralen und/oder alkalischen Medien stabil. Das Reaktionsmedium wird vorzugsweise auf einen erhöhten pH-Wert, üblicherweise im Bereich von etwa 12, eingestellt. Eine erste Phosphatlösung wird tropfenweise in eine zweite Calciumlösung gegeben, um die Bildung von Tetracalcium-Monohydrogentriphosphat zu verhindern und dadurch ein Produkt des gewünschten Hydroxyapatits zu erhalten. Die Sol-Gel Substanz kann gefiltert, als Pulver getrocknet, kalziniert und in einem Aluminiumschmelztiegel auf 1000°C gebrannt werden, um Calciumhydroxyapatit-Phasen auszubilden, die unter normalen Luftfeuchtigkeitsbedingungen stabil sind. Bei Umwandlung dieser Phase bei Sinterungstemperaturen von über 1200°C entsteht hauptsächlich α-Tricalciumphosphat, wobei ebenso kleinere Mengen einiger anderer Phasen gebildet werden, wie beispielsweise β-TCP, Calciumoktophosphat, Tetracalciumphosphat oder Dicalciumphosphat. Es ist für Fachleute selbstverständlich, dass in den gesinterten stabilisierten Calciumphosphatphasen ebenso andere "kontaminierende" Materialien ausgebildet werden können. Solche Materialien können der Hydroxyapatit-Substanz auch vor dem Sintern zugesetzt werden. Vorzugsweise beeinträchtigt die Anwesenheit oder Zugabe solcher Verunreinigungen die Zusammensetzung und die Morphologie der stabilisierten Zusammensetzung nicht auf eine Weise, die die Unterstützung der Knochenzellaktivität darauf beeinträchtigt.
In Bezug auf den Sinterungsprozess, wurde weiterhin herausgefunden, dass Sintern eines getrockneten Hydroxyapatit-Substanzfilms in einem Standardhochtemperaturofen durchgeführt werden kann, ohne dass es der Steuerung der Atmosphäre im Ofen bedarf. Wenn ein neuer Ofen oder ein Ofen, der durch vorherige Verwendung für andere Zwecke kontaminiert wurde, benutzt wird, ist es bevorzugt, den Ofen mehrmals den Sinterungstemperaturbereich durchlaufen zu lassen, während der Ofen leer ist. Diese Vorbehandlung des Ofens entfernt alle flüchtigen Stoffe und bereitet ihn für die Verwendung vor. Weitere Schritte sind nicht erforderlich. Im Ofen kann während der Einfahrzeitspanne und während der normalen Verwendung für das Sintern beschichteter Substrate Umgebungsluft vorliegen, wobei das Vorliegen von Umgebungsluft den Prozess nicht beeinträchtigt und beständige Resultate für die gewünschten Verhältnisse erzielt werden. Unter diesen Bedingungen kann die Sinterungstemperatur bei der Bereitstellung der gewünschten Verhältnisse von 50:50 bis zu 20:80 in der Anwesenheit eines Quarzsubstrats im Bereich von 920°C bis hin zu 1100°C betragen. Es wurde herausgefunden, dass bei einer Erhöhung der Temperatur die Umwandlung von Hydroxyapatit zu α-Tricalciumphosphat ebenso zunimmt. Bei Sinterungstemperaturen im Bereich von 920°C bis zu 950°C kann das Verhältnis von 50:50 bis hin zu 333:666 schwanken. Bei ausgewählten Sinterungstemperaturen im Bereich von 950°C bis 1000°C beträgt das Verhältnis etwa 333:666. Die Erhöhung der Temperatur über 1000°C und bis zu 1100°C erhöht die Umwandlung weiter und erzeugt Zusammensetzungen mit Verhältnissen im Bereich von 333:666 bis 20:80. Die bevorzugte Sinterungstemperatur beträgt etwa 975°C, wobei das Verhältnis 333:666 erhalten wird.
Die Umwandlung des Hydroxyapatits zu Tricalciumphosphat erfolgt durch folgende Reaktion: 2 Ca₅(OH)(PO₄)₃ -> 3 Ca₃(PO₄)₂ + CaO + H₂O, wobei der Umwandlungsgrad bei jeder Temperatur sensitiv ist gegenüber dem Wasserpartialdruck in der umgebenden Atmosphäre und gegenüber Faktoren, die die Konzentration von CaO modifizieren.
Die Beschaffenheit des gebildeten Tricalciumphosphats ist von Bedeutung. Bei nichtstöchiometrischem Hydroxyapatit mit einem Ca/P Verhältnis von 1,5 bis 1,60 (Nakamura, Thermochimica Acta, Vol. 165, 1990), und bei vielen kommerziell angebotenen Hydroxyapatit-Pulvern (Aldrich Chem Co.), wird oftmals β-Tricalciumphosphat gebildet, wenn das Pulver auf 1100°C erhitzt und anschließend auf Temperaturen unter 1000°C gekühlt wird. β-TCP ist eine stabile, unlösliche Verbindung, die in der Natur als das Mineral Whitlockit vorkommt. Bei der Umwandlung der vom Sol-Gel abstammenden Hydroxyapatit-Substanz, die wie hier beschrieben aus wässrigen Lösungen ausgebildet wird, und bei Calciumhydroxyapatit-Pulvern, die in alternativen Präzipitationsreaktionen gebildet wer den, wurde gefunden, dass die Ausbildung von α-Tricalciumphosphat bei einer Temperatur unter 1000°C in der Anwesenheit stabilisierender Entitäten verstärkt wird. Bei der Entwicklung von auf Calciumphosphat-basierenden Beschichtungen wurde α-TCP wegen seiner Degradation in physiologischen Fluiden aufgrund seiner relativ hohen Löslichkeit und aufgrund der Tatsache, dass es ausschließlich bei der Hochtemperaturumwandlung von reinem Hydroxyapatit bei Temperaturen von über 1250°C entsteht, keine besondere Bedeutung beigemessen.
Aufgrund der Umwandlungsgleichung wird erwartet, dass jeder Faktor, der die Aktivität von CaO in dem System steuert, sowohl die Temperatur als auch die Reversibilität der Hydroxyapatit-Umwandlung modifiziert. Von der Zugabe einer stabilisierenden Entität, wie beispielsweise SiO₂, wird angenommen, dass sie mit CaO unter folgender Reaktion reagiert: CaO + SiO₂ -> CaSiO₃ und dadurch die Umwandlung bei niedrigeren Temperaturen ablaufen lässt. Diese Reaktion sollte vollständig sein für 1 mol SiO₂ pro 1 mol CaO, die in der Reaktion produziert wurden. Andere Reaktionen zur Ausbildung anderer Silikate mit anderen CaO/SiO₂ Verhältnissen können möglich sein.
Wenn CaO durch die Einwirkung von Siliciumdioxid entfernt wird, um Calciumsilicate zu bilden, wird die Temperatur, bei der sich die TCP-Phasen ausbilden, auf Temperaturen reduziert, die mit den in 1 dargestellten Daten aus der Umwandlung der erzeugten Hydroxyapatit-Zusammensetzung übereinstimmen. Die Zugabe von Silicium-Entitäten verlagert die Umwandlungslinie nach rechts, d. h. hin zu niedrigeren Temperaturen mit Bildung von hauptsächlich α-TCP.
Der vorgeschlagene Mechanismus, bei dem Siliciumdioxid eine direkte Rolle bei der Förderung der Ausbildung von α-Tricalciumphosphat gegenüber anderen Phasen spielt, wie beispielsweise beta-Tricalciumphosphat, besteht darin, dass Silicium-Entitäten in die Hydroxyapatit-Kristallstruktur eintreten und die alpha-Phase in Bezug auf beta stabilisieren. Es wurde gemäß einer bevorzugten Ausführungsform nunmehr ebenso gezeigt, dass die Beschaffenheit der Hydroxyapa tit-Ausgangssubstanz und die Art und Weise, in der Siliciumdioxid zugegeben wird, von Bedeutung ist. Wenn Siliciumdioxid in der Form eines Pulvers zu einem kommerziellen reinen Hydroxyapatit-Pulver zugegeben wird und zusammen zerkleinert wird, um das Mischen zu erleichtern, war das bei hohen Sinterungstemperaturen von über 1000°C beobachtete Umwandlungsprodukt β-TCP. Demgegenüber wandelten sich Pulver, die gemäß der vorliegenden Erfindung mit Siliciumdioxid hergestellt wurden, das als metallorganische Lösung zugegeben wurde, im Wesentlichen zu einer stabilisierten α-Tricalciumphosphatphase um, die bei niedrigen Temperaturen, wie in 2 dargestellt, an der 950°C Linie beibehalten wurde. Diese Umwandlung ist nicht reversibel. Die dotierten Pulver zeigen bei hohen Temperaturen eine Verringerung der Umwandlungstemperatur von über 1200°C für reine Pulver auf etwa 950°C für mit Siliciumdioxid dotierte Pulver. Wie angemerkt wurde, wird angenommen, dass diese Entwicklung auf die Bildung von Calciumsilicaten zurückzuführen ist, wobei die erhaltene stabilisierte Phasenzusammensetzung beim Kühlen auf niedrige Temperaturen beibehalten wird.
Ein Grund warum Pulver mit stabilisierenden Entitäten, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, reproduzierbare und stabile Phasenzusammensetzungen mit einer gewünschten Oberflächenmorphologie und einer inneren mikroporösen Struktur aufweisen, besteht darin, dass die Hydroxyapatit-Substanz ursprünglich im Sol-Gel Prozess als sehr feine Partikel hergestellt werden. Die Zugabe von stabilisierenden Entitäten, wie beispielsweise Silicium-Entitäten in der Form einer metallorganischen Lösung, erlaubt jedem dieser Partikel in engem Kontakt mit einer Schicht aus Silicium-Entitäten zu treten, was zu einer intensiven Vermischung führt. Beim Sintern befindet sich das Siliciumdioxid in großer Nähe zum CaO, das bei der Umwandlungsreaktion freigesetzt wird. Es wird angenommen, dass die Bildung von unlöslichen Calciumsilicat-Entitäten auf der Oberfläche jedes einzelnen Partikels die Umkehrbarkeit der Reaktion beschränkt und eine Rolle beim Verhindern der Löslichkeit von α-Tricalciumphosphat in wässrigen physiologischen Medien spielt.
Auf ähnliche Weise wie für Siliciumdioxid wird für Titan, Aluminium und Bor vorhergesagt, dass sie die Umwandlungstemperatur reduzieren und somit als Stabi lisatoren, d.h. Dotierungsmittel, verwendet werden können. 3 und 4 stellen die Temperaturverringerung bei der Bildung von CaO/Al/Ti/Ba-Komplexen dar. Diese Metalle können zum Entfernen des CaO aus dem Hydroxyapatit verwendet werden und ergeben ein stabilisiertes α-TCP. Die Faktoren, die für die Auswahl des Stabilisators (Dotierungsmittel) und der Verbindung, durch die dieser dispergiert wird, wichtig sind, lauten: (a) er bedarf der Interaktion mit gebildetem CaO, das eine stabile Calciumverbindung bildet, (b) er muss imstande sein, gleichmäßig überall in der Sol-Gel-Substanz dispergiert zu werden, vorzugsweise in einer Art und Weise, die die äußeren Oberflächen der neu gebildeten Partikel umgibt, (c) er soll unerwünschte Phasen innerhalb des Calciumphosphatsystems nicht stabilisieren, und (d) der darf, sofern er für biologische Applikationen integriert wird, nicht toxisch sein. Stabilisierende Entitäten, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind diejenigen, die Oxide, vorzugsweise Metalloxide ausbilden. Die ausgewählten Metalloxide produzieren die gewünschte Zusammensetzung und Morphologie und sind aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus Aluminium, Zirkonium, Germanium, Chrom, Vanadium und Niobium und sind besonders bevorzugt ausgewählt aus Silicium und Titanoxiden. Mischungen solcher stabilisierenden Entitäten können sich ebenso als zweckdienlich erweisen.
Das Sintern wird in der Anwesenheit stabilisierender Entitäten durchgeführt. Die stabilisierenden Entitäten werden aufgrund der Zugabe stabilisierender Entitäten zu der Hydroxyapatit-Substanz vor dem Sintern bereitgestellt. Die stabilisierenden Entitäten werden in einer Menge bereitgestellt, die ausreichend ist, Calciumphosphatphasen zu stabilisieren, die in Form von Dünnfilmen, Pulvern, dickeren Beschichtungen, Bulkkeramikstücken sowie in Bulkkeramikstücken, die eine innere Makroporosität ausgebildet haben, vorliegen. Für die Unterstützung und Förderung der Knochenzellaktivität wird die resultierende, einheitliche, bioaktive Oberflächenmorphologie und innere mikroporöse Struktur bevorzugt, die reproduzierbar und eine Funktion der Anwesenheit stabilisierender Entitäten während der Sinterungsprozesses sind.
Abhängig von ihrer beabsichtigten Verwendung kann die Zusammensetzung in Form verschiedenartiger Strukturen bereitgestellt werden, wie beispielsweise in der Form von Dünnfilmen für Diagnostik oder als dickere Beschichtungen, die auf Knochen- oder Zahnimplantaten verwendet werden. Hier können Dünnfilme als solche mit einer Dicke von 0,1 μm bis 5 μm beschrieben werden, dickere Beschichtungen sind jene, die eine Dicke von mehr als 5 μm aufweisen und zur Anwendung bei anderen Substraten vorgesehen sind. Bulkkeramikstücke beziehen sich auf größere dreidimensionale Strukturen, die beim Sintern eines Hydroxyapatit-Substanzfilms auf einer Quarzsubstratfläche von einem Substrat funktionell unabhängig sind.
Beim Sintern eines Hydroxyapatit-Substanzfilms auf der Quarzsubstrat-Oberfläche stellt das Quarzsubstrat eine ausreichende Quelle an Silicium-Entitäten bereit, die durch die Calciumphosphatphasen hindurch diffundieren können und einen ausreichenden Gehalt an Silicium-Entitäten erzeugen. 5(a) zeigt die Übergangsstelle der Zusammensetzung bei dem Substrat, 5(b) kurz oberhalb der Übergangsstelle und 5(c) auf der Oberfläche des Films, wobei jedoch die Silicium-Entitäten ungleichmäßig über die Filmzusammensetzung verteilt sind. Während der Sinterungsdauer werden Silicium-Entitäten aus der Quarzoberfläche freigesetzt und diffundieren durch die Oberfläche der Hydroxyapatit-Substanzschicht.
Die stabilisierenden Entitäten der vorliegenden Erfindung sind ausgewählt aus Metall- und Nichtmetalloxiden von Silicium, Aluminium, Zirkonium, Bor, Titan, Germanium, Chrom, Vanadium, Niobium und Mischungen davon. Substrate, die Aluminium, Zirkonium, Bor, Titan und verschiedenen Mischungen dieser Komponenten enthalten oder daraus hergestellt sind, können zum Bereitstellen der Quelle an stabilisierenden Entitäten geeignet sein.
Der Dünnfilm, der gemäß dieser Erfindung auf einem geeigneten Träger bereitgestellt wird, verbessert die Untersuchung und das Verständnis von Knochenzellfunktionseigenschaften wesentlich. Der Aufbau der stabilisierten Filme, wie sie gemäß dieser Erfindung bereitgestellt werden, erlaubt die Kultur verschiedener Knochenzelltypen darauf. Der Oberflächenaufbau kann angepasst werden, um einen signifikanten Resorptionsgrad der Calciumphosphat-Entitäten des Filmmaterials bis einschließlich eines vernachlässigbaren Resorptionsgrads der Calcium phosphat-Entitäten bei der Untersuchung der Osteoklastenaktivität zu fördern. In ähnlicher Weise kann die Osteoblastenaktivität durch die Detektion eines Aufbaus von kalzifizierter Knochenmatrix untersucht werden. Die Fähigkeit, das Material als einem Film bereitzustellen, der ausreichend dünn ist, so dass die Resorption der Entitäten durch Osteoklasten durch das Verschwinden resorbierter Calciumphosphat-Entitäten detektiert werden kann, stellt ein gegenüber den Techniken des Stands der Technik einfaches kostengünstiges Analyseformat bereit. Der Filmaufbau, wie er gemäß dieser Erfindung erzeugt wird, unterstützt die biologische Knochenzellfunktion. Der Vorteil der Bereitstellung des Films auf einem transparenten halternden Substrat, wie beispielsweise Quarz oder Glas, führt zu einfachen Bewertungstechniken des diagnostischen Verfahrens, einschließlich des automatisierten Ablesens der Messwerte durch Maschinen.
Im Idealfall ist die Filmdicke größer als 0,1 μm, da festgestellt wurde, dass es bei Filmdicken von weniger als 0,1 μm schwierig ist, eine gleichmäßige Filmschicht zu erhalten, die frei von diskreten Lücken ist. Was die obere Dickengrenze des Films betrifft, so kann sie je nach ihrem endgültigen Gebrauch jede beliebige Dicke aufweisen. Wie erörtert wird, kann der Resorptionsgrad anhand der Lichtdurchlässigkeit ermittelt werden, was vorzugsweise einen Film mit einer Dicke von weniger als 10 μm erfordert. Das Substrat besteht aus Quarz, das den erforderlichen Sinterungstemperaturen ohne weiteres standhält und verfügt über den gewünschten Transparenzgrad, damit Lichtdurchlässigkeitstests durchgeführt werden können, um das Ausmaß der Resorption von Calciumphosphat-Entitäten vom Filmmaterial zu bestimmen.
Die entwickelten Dünnfilme können in "Kits" und dergleichen verwendet werden, um die Bewertung der Knochenzellaktivität bereitzustellen. Der Film kann in Form eines "Kits" ausgeführt sein, der Quarzsubstrate umfasst, die mit einem adhärenten Calciumphosphat-Dünnfilm vorbeschichtet sind, und die in einem Zellkulturgefäß (möglicherweise eine wahlweise sterilisierte Mehrmuldenplatte mit 24 Mulden mit einem Durchmesser von je etwa 15 mm) als System verwendet werden können, das für die Kultur von gemischten Knochenzellpopulationen geeignet ist. Die Vorrichtung ist einfach und setzt zur Verwendung lediglich Routinelaborausrüstung und -techniken voraus, ist für eine quantitative Analyse geeignet und in der Herstellung kostengünstig, jedoch stabil genug, um einer normalen Handhabung standzuhalten, und kann in Losgrößen von (z.B.) 24 Proben in eine Kunststoffpräsentationsbox verpackt werden. Die Dünnfilmoberflächen weisen eine bestimmte und reproduzierbare Chemie auf und sind mechanisch stabil genug, einen Transport auszuhalten, wenn sie mit einem geeigneten Verpackungsmaterial verpackt werden.
In jedem Fall können die Kulturbedingungen derart sein, dass man von den Osteoklasten, in entweder mononukleärer oder multinukleärer Form, erwarten kann, dass sie in einem funktionellen Zustand überleben und das künstliche Calciumphosphat des Films resorbieren. Auf ähnliche Weise sind Osteoblasten auch in der Lage, kalzifizierte Knochenmatrix unter derartigen Kulturbedingungen aktiv zu sekretieren.
Diese Substrate können verwendet werden, um die Resorptionsaktivität von Osteoklasten zu bewerten und um die Veränderung dieses Resorptionsaktivitätsgrads zu überwachen, die entweder die Folge eines Erkrankungsprozesses oder der Einbeziehung eines Mittels in das Kulturmedium ist, wie beispielsweise ein Medikament, das die Osteoklastenresorptionsaktivität entweder direkt oder indirekt beeinflusst. Die Substrate sind auch geeignet zur Kultur aktiver Osteoblasten, um die Sekretion von Knochenmatrix darauf zu beobachten und zu bewerten, sowie zur Verwendung der abgelagerten mineralisierten Matrix für in vivo Transplantationen. Wie in 6 dargestellt ist, wird die mineralisierte kollagenöse Matrix 10 durch kultivierte Osteoblasten auf der Oberfläche des stabilisierten Dünnfilms 12, der auf einem Quarzsubstrat 14 bereitgestellt wurde, abgelagert. Dargestellt ist eine gut integrierte Grenzschicht 16, die einer Zementlinie gleicht und die dem selben Zementlinientypus ähnelt, der von Osteoblasten in vivo an der Übergangsstelle zwischen neuem Knochen und altem Knochen ausgebildet wird. Dies legt eindeutig nahe, dass die druckstabilisierte Zusammensetzung eine physiologische Osteoblastenaktivität erlaubt und dabei weiter die Rolle der stabilisierten Zusammensetzung als wichtiges Knochenumgestaltungsprodukt stützt.
Die Vorrichtung kann als ein Mittel zur Quantifizierung der Resorptionsaktivität von Osteoklasten oder des Aufbaus von knochenähnlichem Material durch die Aktivität von Osteoblasten verwendet werden. Eine solche Aktivitätsanalyse kann im Rahmen einer kontinuierlichen Echtzeitüberwachung, von Zeitrafferintervallen oder einer Endpunktsbestimmung erfolgen. Die Schritte zur Ermittlung der Knochenzellaktivität stimmen in den einzelnen obigen Überwachungsprogrammen darin überein, dass Knochenzellen (entweder tierische oder menschliche) unter bestimmten Bedingungen auf einer oder mehreren der Vorrichtungen kultiviert werden. Die Kulturdauer liegt zwischen mehreren Stunden und vielen Tagen und vorzugsweise zwischen etwa 2 bis 10 Tagen (die optimale Zeit ist von Zellspezies und Protokoll abhängig), wobei während dieser Zeit das Ausmaß der Osteoklastenaktivität kontinuierlich überwacht, periodisch überwacht oder auch einfach nicht auf fortlaufender Basis zugunsten einer endgültigen Endpunktsbestimmung überwacht werden kann. Auf ähnliche Weise kann die Osteoblastenaktivität durch die Bestimmung des Ausmaßes des kalzifizierten Knochenmatrixaufbaus überwacht werden. 7 zeigt eine mit einem stabilisierten Film der vorliegenden Erfindung beschichtete, und gleichzeitig mit Osteoblasten (a) kultivierte Quarzscheibe, die stark fluoresziert, was die Anwesenheit mineralisierter Knochenmatrix anzeigt. Im Gegensatz dazu zeigt ein stabilisierter Film, der auf Quarz in ausschließlicher Anwesenheit von Medium aufgebracht wurde (b) keine Fluoreszenz. Die Menge an kalzifizierter Knochenmatrix ist direkt proportional zur messbaren emittierten Fluoreszenz. Tetracyclin ist ein natürlich fluoreszierendes Material. Da die Zellen Tetracyclin aufnehmen, wird es metabolisiert und seine Metabolite werden sekretiert und in die neu ausgebildete Knochenmatrix inkorporiert. Das Tetracyclin fluoresziert dabei nur so lange, bis es von den Osteoblasten metabolisiert wird. Dies zeigt, dass Osteoblasten aktiv Knochenmatrix auf der stabilisierten Zusammensetzung sekretieren.
Sobald die Sol-Gel-Hydroxyapatit-Substanz bereitgestellt ist, kann sie als Dünnfilm mittels verschiedener Techniken auf das gewünschte Substrat aufgebracht werden. Beispielsweise besteht das Tauchbeschichtungsverfahren (C.). Brinker et al., Fundamentals of Sol-Gel Dip Coating, Thin Solid Films, Vol. 201, No. 1, 97–108, 1991) aus einer Reihe von Verfahren: Entnehmen des Substrats aus einem Sol oder einer Lösung mit einer konstanten Geschwindigkeit, Trocknen des auf gezogenen Flüssigkeitsfilms bei einer geeigneten Temperatur und Brennen des Films zu einer endgültigen Keramik.
Beim Spin-Coating wird die Lösung auf eine Platte getropft, die sich mit einer Geschwindigkeit dreht, die ausreicht, um die Lösung durch Zentrifugalwirkung gleichmäßig zu verteilen. Nachfolgende Behandlungen stimmen mit denen der Tauchbeschichtung überein.
Es ist bekannt, dass es eine Vielzahl anderer Techniken gibt, die zum Aufbringen eines Sol-Gel-Dünnfilms auf das Substrat angewendet werden können. Andere Techniken schließen ein Aufsprühen des Sol-Gels, Aufrollen des Sol-Gels, Aufstreichen des Sol-Gels und Aufmalen des Sol-Gels.
Als Alternative zur Beschichtung einzelner Scheiben singulärer Größe kann ein größeres Substrat mit einem Film des Sol-Gels beschichtet werden. Der gesamte Film auf dem Substrat wird dann gesintert. Eine Vorrichtung, wie beispielsweise ein Gitter, kann dann über den Film gelegt werden, um diesen in eine Mehrzahl diskreter Testzonen zu unterteilen.
Bei diesen verschiedenen Techniken der Sol-Gel Applikation werden die Dicke und Qualität (Porosität, Mikrostruktur, kristalliner Zustand und Gleichförmigkeit) der ausgebildeten Filme durch viele Faktoren beeinflusst. Dazu gehören die physikalischen Eigenschaften, Zusammensetzung und Konzentration des Ausgangs-Sols, die Reinheit der Substratoberfläche, Entnahmegeschwindigkeit des Substrats und die Brenntemperatur. Im Allgemeinen ist die Dicke in einem Tauchbeschichtungsprozess in erster Linie von der Entnahmegeschwindigkeit und der Sol-Viskosität abhängig. Da Heterogenität im Sol für die Ausbildung von Makroporen und Rissen verantwortlich ist, sollte der Beschichtungsvorgang in einem Reinraum durchgeführt werden, um eine Verunreinigung des Sols durch Partikel zu vermeiden. In der Wärmebehandlungsstufe sind hohe Temperaturen für die Entwicklung der benötigten Mikrostruktur und der gewünschten Umwandlung von Hydroxyiapatit zu α-Tricalciumphosphat erforderlich.
Das Tauchbeschichtungsverfahren wird aus zweierlei Gründen zur Herstellung von Calciumphosphatfilmen angewandt: (a) um Filme mit der erforderlichen Qualität herzustellen (Gleichförmigkeit, Dicke, Porosität, usw.); und (b) um lichtdurchlässige Calciumphosphatfilme auf transparenten Substraten für biologische Experimente herzustellen.
Es wurde auch herausgefunden, dass die stabilisierte künstliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung nicht nur für die Produktion von Dünnfilmen und dickeren Beschichtungen geeignet ist, sondern auch von Pulvern und Bulkkeramik. Keramik wird aus gesinterten Pulvern hergestellt, die durch das hier beschriebene Sol-Gel-Verfahren unter Zugabe von Siliciumdioxid hergestellt wurden, um eine gewünschte stabilisierte Hydroxyapatit/α-Tricalciumphosphatphasen-Mischung zu erzeugen. In einer Ausführungsform ist das gesinterte Pulver in einer Menge fein zerkleinert die ausreichend ist, um eine Scheibe von 0,5 bis 1 mm Dicke zu produzieren, die anschließend mit einem Tropfen zurückgehaltener Sol-Gel-Substanz der selben Dotierungsmittel-Zusammensetzung gemischt wird, um ein feuchtes Pulver zu erzeugen, wodurch der Zusammenhalt der Partikel gefördert wird. Das feuchte Pulver wird bei einem Druck von etwa 5 Tonnen/cm² einachsig in eine Labormodellform gepresst. Das resultierende Bulkmaterial weist gute Rohbruchfestigkeit auf und wird eine Stunde bei 1000°C an Luft gebrannt. Diese Keramik bewahrt die gleichen Eigenschaften wie die stabilisierte Zusammensetzung, die als Dünnfilm oder Beschichtung verwendet wird. Bei SiO₂ stabilisierten Zusammensetzungen zeigt die Röntgenbeugungsanalyse geringfügige Veränderungen in der Phasenzusammensetzung zwischen dem ursprünglichen Pulver und der endgültigen Keramik. Die Oberflächentopographie, die in 8 als Draufsicht gezeigt ist, ist der der Zusammensetzung, die auf ein Quarzsubstrat aufgebracht wurde, dargestellt in 9, auffallend ähnlich. Die Resorptionskapazität der Osteoklasten auf Dünnfilmen und der Bulkkeramik ist sehr ähnlich. Osteoklastenresorption wird bei Anwesenheit von Resorptionsgruben 18 auf der Bulkkeramik beobachtet, wobei diese den auf den Dünnfilmen festgestellten Resorptionsgruben 18 (8 und 9) ähnlich sind.
Wie von einem Fachmann erkannt wird, können größere Keramikbulkstücke zur Verwendung in gewünschten Anwendungen durch Formen der Keramik ausgebildet werden. Die hergestellten Bulkstücke behalten die gewünschte stabilisierte Calciumphosphatphasen-Zusammensetzung ebenso, wie die mikroporöse Kugeloberflächenmorphologie und innere mikroporöse Struktur, die beide die Knochenzellaktivität darauf erleichtern.
Ein besonderer Aspekt der Keramikherstellung zur Verwendung in biologischen Anwendungen ist die Fabrikation von Keramikstücken mit einer feinen Kugeloberflächenmikroporosität und inneren Mikroporosität, die zu Bioaktivität führt und einer innerhalb der inneren Struktur liegenden größeren Makrostruktur von Poren mit Größen von 50 bis 1000 μm oder mehr. Dies fördert die Knochengestaltung in einem System, das stärker der physiologischen in vivo Knochengestaltung ähnelt. Diese Makroporosität am unteren Ende des Bereichs ist besonders geeignet für Anwendungen, bei denen schnelles Einwachsen von Knochenmatrix erwünscht ist, während Makroporosität am oben Ende des Bereichs bei Verwendungen, wie beispielsweise der ex vivo Gewebegestaltung bei Herstellung von Knochentransplantaten, den Zellen erlaubt, auf den Innenbereich zuzugreifen. Poröse Keramik kann hergestellt werden durch Verwendung von Pulvern, die mit stabilisierenden Entitäten, wie beispielsweise Siliciumdioxid dotiert sind, und vor der Verwendung gesintert wurden, indem die Pulver mit Styrolkugeln einer gewünschten Größe gemischt werden. Nach dem Pressen des feuchten, dotierten, mit Styrolkugeln versetzten Pulvers wird das Styrol anschließend durch Pyrolyse bei Temperaturen von etwa 400°C bis 600°C unter erforderlichem Druck entfernt. Die poröse Keramik wird dann bei 1000°C auf normale Art und Weise, wie vorhergehend beschrieben, gebrannt. Dieses Arbeitsverfahren führt zu der Ausbildung einer Bulkkeramik, die eine äußere, kugelförmige, mikroporöse Struktur, eine darunter liegende innere mikroporöse Struktur und eine innere makroporöse Struktur aufweist, die es den Zellen erlaubt zu wandern und durch die gesamte Bulkkeramikeinheit hindurch zu wirken.
Nach dem Verständnis von Fachleuten können zum Erzeugen von Makroporosität innerhalb der Keramikstruktur Styrol-ähnliche Materialien verwendet werden. Andere Materialien, die in der Lage sind, sich bei Temperaturen unterhalb der normalen Sinterungstemperatur thermisch zu zersetzen, sind ebenso verwendbar, um die makroporöse Struktur auszubilden. Die verwendeten Materialien sollten zudem keinerlei toxische Rückstände hinterlassen. Weiterhin ist es selbstverständlich, dass andere Verfahren zur Ausbildung der Makrostruktur, wie beispielsweise mechanisches Bohren von Löchern, die Verwendung von Lasern oder eine Verwendung schaumerzeugender Mittel ebenso verwendet werden können.
Da der signifikante Aspekt der vorliegenden Erfindung die Mischung von Hydroxyapatit und alpha-Tricalciumphosphatphasen ist, die an die Oberflächenmorphologie, welche durch dotierte Pulver aus der Gel-Sol-Hydroxyapatit-Substanz gebildet wurde, gekoppelt sind, sind nach dem Verständnis des Fachmanns andere Verfahren zur Fabrikation von Filmen, Beschichtungen und Bulkstrukturen aus diesem Pulver ebenso gemäß der vorliegenden Erfindung verwendbar. Dies schließt die Verwendung bekannter Techniken, wie beispielsweise Plasma- oder Heißnebelsprühen oder elektrophoretische Abscheidung ein.
Unter Bezug auf 10 zeigt eine TEM-Aufnahme einen Gradienten von Schichten in der Form von Quarzsubstrat (a), der Übergangsschicht (b), die kleine Körner enthält, und (c) die obere Schicht, die die Oberfläche des Films beinhaltet, welche aus kleinen Kristalliten zusammengesetzt ist, die in Körnchen eingebettet sind, die die kugelige mikroporöse Struktur bereitstellen. Während des Sinterungsprozesses werden Silicium-Entitäten vom Quarz (a) freigesetzt, die durch das Hydroxyapatit diffundieren, während dieses beim Ausbilden der gesinterten Dünnschicht zu α-Tricalciumphosphat umgewandelt wird. Die Übergangsschicht (b) hat eine kleinere kristalline Struktur als die Oberfläche, die größere polykristalline Körnchen der Calciumphosphatphasen aufweist.
Die Morphologie der künstlichen gesinterten Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist einheitlich und ist bisher nicht beschrieben oder nachgewiesen worden. Wir haben jetzt eine Oberflächenmorphologie entdeckt, die eine lose untereinander verbundene kugelige Struktur von gerundeten Körnchen aufweist, die eine mikroporöse Struktur untereinander verbundener Poren aufweist. Gemäß einem bevorzugten Aspekt dieser Erfindung unterstützt die Morphologie die Kulturen funktioneller Osteoklasten und Osteoblasten erfolgreich.
Die Oberflächenmorphologie der Beschichtung hat eine charakteristische Form, die eine lose untereinander verbundene kugelige Struktur aufweist, die einer Koralle ähnelt (11). Die Größe der Körnchen variiert zwischen etwa 0,5 bis 1 μm in der Querabmessung. Die Beschichtung ist in senkrechter Richtung zum Substrat porös und von einer Flächendichtigkeit, die in Oberflächennähe größer ist als in Substratnähe. Diese Morphologie kann den Durchfluss flüssiger Medien und anderer physiologischer Fluide innerhalb der Beschichtung ermöglichen. Im Gegensatz dazu führt die Oberflächenmorphologie von Hydroxyapatit, das mittels anderer Kopräzipitationsverfahren hergestellt wird, nicht zu einer mikroporösen Struktur, wie sie durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird. Wie aus 12(a) und 12(b) ersichtlich, ist die Oberflächenmorphologie derart hergestellter Hydroxyapatit-Filme im Vergleich zu der in 11 dargestellten vorliegenden Zusammensetzung bei der Abwesenheit (a) und Anwesenheit (b) von stabilisierenden Entitäten nicht mikroporös. Ferner wurde berichtet, dass synthetisches polykristallines Hydroxyapatit von Osteoklasten nicht resorbiert wird (Shimizu, Bone and Minerology, Vol. 6, 1989).
Die kugelförmige Oberflächenmorphologie besteht aus gerundeten Körnchen, die in der Größe vergleichbar sind mit aggregierten Ablagerungen, die von einer Osteoblastenzelle zu Beginn des Prozesses gemacht werden, der zur Knochenbildung führt. Die vorliegende Zusammensetzung stellt eine Oberflächenmorphologie bereit, die mit dem Morphologietyp kompatibel ist, den die Zelle in vivo zu begegnen erwartet. 13 zeigt eine typische Osteoklastenresorptionsgrube in der das Substrat Knochen ist. Wie in 9 dargestellt, sind die Resorptionsgruben 18, die von Osteoklasten 20 auf der vorliegenden künstlichen Zusammensetzung ausgebildet werden, denjenigen äußerst ähnlich, die auf natürlichem Knochen in 13 zu sehen sind, was nahe legt, dass Osteoklasten in beiden Systemen ähnlich wirken. Dies impliziert, dass die Oberflächenmorphologie der künstlich gesinterten Zusammensetzung mit dem Morphologietyp kompatibel ist, den die Zelle in vivo zu begegnen erwartet.
Die Bulkmikroporosität der stabilisierten Zusammensetzung kann gewährleisten, dass die Calcium- oder Phosphationenkonzentrationen nahe der Oberfläche des künstlichen Materials innerhalb der erwarteten Grenze liegen, die die Zelle bei in vivo Begegnungen mit natürlichem Knochen, der aus Hydroxyapatit, Kollagen und anderen fibrösen Geweben besteht, erwartet. Während Osteoklasten-vermittelter extrazellulärer Dissolutionsprozesse, die zur Resorption führen, führt das komplexe Material zu einer besonderen lokalen Konzentration von Dissolutionsprodukten. Während der Dissolution oder Resorption von vollständig anorganischem künstlichem Hydroxyapatit oder α-TCP sind die resultierenden Konzentrationsgrenzen für bestimmte zelluläre Verhaltensweisen sehr eng definiert, weshalb Mittel verfügbar sein müssen, um die lokalen Konzentrationsniveaus von Elementen, wie beispielsweise Calcium, einzustellen, damit die Zelle auf der künstlichen Oberfläche eine Aktivität erreichen kann, die mit der auf natürlichem Knochen vergleichbar ist. Die Porosität der Zusammensetzung erlaubt dies durch Medienfluss oder -diffusion.
Die stabilisierte, bioaktive, künstliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung stellt eine einheitliche chemische Zusammensetzung zusammen mit einer einheitlichen Oberflächermorphologie und einer inneren mikroporösen Struktur bereit, die bisher nicht gezeigt worden war. Zusammensetzungen, die beständige Knochenzellbioaktivität in vivo und in vitro aufweisen und die in vitro leicht, genau und repetitiv quantifiziert werden können, wurden bislang nicht beschrieben. Die Beschaffenheit der stabilisierten Zusammensetzung ist vielfältig, indem sie als ein Pulver, Dünnfilm, dicke Beschichtung, Bulkkeramikstück oder makroporöses Bulkkeramikstück bereitgestellt werden kann. In jedem Fall wird die einheitliche Oberflächenmorphologie und innere Mikroporosität ebenso aufrechterhalten, wie die stabilisierte Calciumphosphatphasen-Zusammensetzung. Wie in 14 zu sehen, wird die mikroporöse Oberflächenmorphologie auf einer Bulkkeramik, die aus der vorliegenden stabilisierten Zusammensetzung hergestellt wurde, aufrechterhalten.
Die stabilisierte Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung eignet sich idealerweise für in vitro Diagnostik, um abnormale Knochenzellfunktion in großem Maßstab und auf automatisierte Art und Weise zu charakterisieren. Die stabilisierte künstliche Zusammensetzung ist ebenso gut als Beschichtung für Knochen- oder Dentalimplantate geeignet, um Geweberegeneration und -reparatur zu fördern. Die Struktur der Zusammensetzung ist derart, dass sie sehr ähnlich und dadurch kompatibel mit Knochengeweben und Zellen in vivo ist, wodurch Probleme der Abstoßung fremder Materialien vermieden werden.
Die vorliegende Zusammensetzung weist die erforderlichen physikalischen Eigenschaften und Affinität/Kompatibilität mit harten Geweben in vivo auf, so dass sie für eine große Vielfalt an therapeutischen Anwendungen, wie beispielsweise zur Bereitstellung von Implantaten in vivo, ebenso wie für die Regeneration und Reparatur von Knochengewebe in vivo, wie beispielsweise bei Hüft- und Knieersatz, Brüchen und Dentalimplantaten, verwendet werden kann. Die Zusammensetzung kann ebenso für verschiedene Gewebegestaltungsanwendungen, die ex vivo durchgeführt werden, verwendet werden, um künstlich produziertes Knochenmaterial bereitzustellen, das anschließend als Knochentransplantat in vivo zum Knochengewebsersatz, Regeneration und Reparatur transplantiert werden kann. Patienten können den Bedarf an Osteoklasten und Osteoblasten, die für die Kultur auf der Zusammensetzung verwendet werden, bereitstellen, um die Gefahr der Gewebeabstoßung zu verringern, wodurch vollständig kompatible Knochentransplantate hergestellt werden. Alternativ dazu können zu diesem Zweck auch Spenderknochenzellen verwendet werden. Diese Transplantate können für den Gewebeersatz in Abwesenheit oder Anwesenheit der Knochenzellen, die für die Produktion des Knochengewebes verwendet wurden, erzeugt werden. Es ist jedoch bevorzugt, dass Transplantate, die Zellen enthalten, von autologen Spendern stammen, um mit Gewebeabstoßung verbundene Probleme zu minimieren. Die Pulverform der stabilisierten Zusammensetzung kann auch für medizinische Therapeutik verwendet werden. Stabilisierte Pulver können mit polymeren Substanzen, die gewebekompatibel und nicht toxisch sind, gemischt und darin suspendiert werden und anschließend in vivo zum Auffüllen von Hohlräumen in Knochengeweben appliziert werden.
All diese Anwendungen, in denen die vorliegende Zusammensetzung verwendet werden kann, weisen den Vorteil auf, dass sowohl Osteoklasten als auch Osteoblasten aktiv mit jeglicher Form der Zusammensetzung funktionieren, und somit ein Knochengewebssystem bereitgestellt wird, das dem in vivo vorkommenden sehr ähnlich ist. Die künstliche bioaktive Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung fördert sowohl Osteokonduktion und Resorption, so dass normale Gewebsheilung und Regeneration stattfinden kann, während es dem künstlichen Material gleichzeitig ermöglicht wird, im normalen Knochengewebsumgestaltungsprozess resorbiert zu werden.
Die folgenden Verfahren veranschaulichen Aspekte der Erfindung zur Bereitstellung einer bioaktiven, künstlichen, gesinterten Zusammensetzung, die stabilisierte Calciumphosphat-Entitäten darin aufweist, und die ebenso eine einheitliche Morphologie zeigt, die in der Lage ist, Knochenzellaktivität darauf zu unterstützen.
Verfahren 1 – Herstellung einer Hydroxyapatit-Sol-Gel Substanz
Das folgenden Verfahren basiert auf der Herstellung einer ausreichenden Menge an Sol-Gel-Hydroxyapatit für Herstellungszwecke. Lösung A enthält ein Calciumnitrat-Tetrahydrat und Lösung B ein Ammoniumdihydrogen-Orthophosphat (monobasisch). Lösung A wird mit Lösung B gemischt, um das gewünschte Sol-Gel, Lösung C, zu erzeugen. Lösung A wird durch die Zugabe von 40 ml zweifach destillierten Wassers zu 4,722 g Calciumnitrat, Ca(NO₃) ₂ , hergestellt. Die Lösung wird bei mäßiger Geschwindigkeit über eine Zeit gerührt, die ausreicht, um das gesamte Calciumnitrat aufzulösen, normalerweise etwa drei Minuten. Dieser Lösung werden 3 ml Ammoniumhydroxid (NH₄OH) zugesetzt, und für etwa weitere drei Minuten gerührt. Der pH-Wert der Lösung wird geprüft, wobei ein pH-Wert von etwa 12 erwünscht ist. Dieser Lösung werden 37 ml zweifach destillierten Wassers zugesetzt, um ein Gesamtlösungsvolumen von etwa 80 ml zu erhalten. Die Lösung wir weitere 7 Minuten lang gerührt und abgedeckt.
Lösung B wird dadurch hergestellt, dass 60 ml zweifach destilliertes Wasser in einen 250 ml Becher gegeben werden, der 1,382 g NH₄H₂PO₄ enthält. Der Becher wird abgedeckt und bei mäßiger Geschwindigkeit 3 bis 4 Minuten lang gerührt, bis das gesamte NH₄H₂PO₄ gelöst ist. Dieser Lösung werden 71 ml NH₄OH zugesetzt, und der Becher anschließend abgedeckt und der Rührvorgang für etwa weitere 7 Minuten fortgesetzt. Der pH-Wert der Lösung wird geprüft, wobei ein pH-Wert von etwa 12 erwünscht ist. Es werden weitere 61 ml zweifach destilliertes Wasser dazugegeben und der Becher wird abgedeckt, um ein Gesamtlösungsvolumen von etwa 192 ml zu ergeben. Die Lösung wird anschließend für weitere 7 Minuten gerührt und abgedeckt.
Das gewünschte Sol-Gel wird anschließend durch Kombinieren von Lösung B mit Lösung A hergestellt. Die gesamte Lösung A wird in eine 500 ml Reagenzienflasche gegeben. Der Rührvorgang beginnt mit mäßiger Geschwindigkeit und Lösung B wird mit einer Geschwindigkeit von etwa 256 ml/Stunde in die Reagenzienflasche gegeben, bis die gesamten 192 ml der Lösung B Lösung A zugesetzt wurden. Ein Überschuss an Lösung B kann dazu verwendet werden, um Lösung, die im 250 ml Becher oder im Schlauchmaterial, das für den Transferprozess benutzt wurde, zurückbleibt, auszugleichen. Nach Abschluss dieses Zugabevorgangs und der Kombination von Lösung A und Lösung B wird die resultierende Lösung weiterhin bei mäßiger Geschwindigkeit für etwa 23 bis 24 Stunden gerührt. Das resultierende Sol-Gel wird auf abnorme Präzipitation oder Agglomeration hin untersucht. Fand eine abnorme Präzipitation oder Agglomeration statt, so muss die Lösung verworfen und der Herstellungsvorgang wiederholt werden. Das Sol wird anschließend vorsichtig in eine andere 500 ml Reagenzienflasche übertragen, um den Einschluss von Partikelagglomerationen zu verhindern, die an den Wänden der ursprünglichen Reagenzienflasche vorhanden sein können. Etwa 240 ml von Lösung C, dem resultierenden Sol-Gel, werden in eine Zentrifugenflasche gegeben und bei Raumtemperatur 20 Minuten lang bei etwa 500 U/min zentrifugiert. Nach der Zentrifugation werden 180 ml des Überstands verworfen, ohne dabei die Sedimente zu zerstören. Die Sedimente werden durch sanftes rotierendes Vermischen für eine Zeit von etwa 30 Minuten vorsichtig resuspendiert. Anschließend wird die Viskosität des Sol-Gels gemessen, die vorzugsweise zwischen 20 und 60 cP liegt. Das Sol ist dann zum Tauchbeschichten des ausgewählten Substrats oder für andere Anwendungen bereit.
Verfahren 2 – Herstellung einer Siliciumdioxid-dotierten Hydroxyapatit-Substanz
Eine Siliciumdioxid-Lösung wird wie folgt hergestellt. Die ermittelten Mengen ergeben etwa 0,168 g SiO₂/4 ml Lösung. 4 ml der Siliciumdioxid-Lösung wird zu 60 ml der zentrifugierten Hydroxyapatit-Sol-Gel-Substanz gegeben, die in Verfahren 1 hergestellt wurde, und mit 0,168 g CaO, das in der Umwandlungsreaktion hergestellt wurde, umgesetzt. Komponenten der Silicium-Lösung

Tetrapropyl-Orthosilicate Si(OC₃H₇)₄ 7,32 g

2-Methoxyethanol CH₃OCH₂CH₂OH 34,5 g
Die Siliciumdioxid-Lösung wird der in Verfahren 1 hergestellten Hydroxyapatit-Substanz derart zugesetzt, dass die SiO₂-Konzentration ein Verhältnis von 1M SiO₂/1 mol CaO, das bei der Umwandlung während der Sinterung hergestellt wurde, aufweist.
Verfahren 3 – Herstellung des Dünnfilmformats
Vor der Applikation des Dünnfilms auf das Substrat ist das Substrat gründlich zu reinigen, um eine zufriedenstellende Filmbedeckung zu gewährleisten. Im Falle von Quarzsubstraten erfolgt die Reinigung durch das Platzieren der Scheiben in einem Glasbecher und Zuführen von Chromsäure-Reinigungslösung in den Glasbecher, um alle Scheiben zu bedecken. Der Becher wird anschließend abgedeckt. Die Scheiben werden dann in einem Wasserbad 1 Stunde lang beschallt. Die Säure wird mit Leitungswasser 20 Minuten lang abgewaschen. Das restliche Leitungswasser wird mit zweifach destilliertem Wasser entfernt, das dreimal gewechselt wird. Nach dem letzten Wechsel des zweifach destillierten Wassers wird jede einzelne Scheibe mit einem flusenfreien Tuch getrocknet und auf Mängel in der Quarzoberfläche kontrolliert. Alle restlichen Partikel auf der Oberfläche werden bei Bedarf mit Druckstickstoff oder -luft entfernt. Die Scheiben werden in abgedeckten Tabletts in einer aseptischen Umgebung aufbewahrt. Dieses Verfahren kann zur Reinigung aller Arten von Quarzsubstrat verwendet werden.
Das Quarzscheiben-Substrat oder andere Substrate, die eine geeignete Zusammensetzung aufweisen, wird in das im Verfahren 2 hergestellte Sol-Gel getaucht. Die Scheibe wird an den Rändern festgehalten, um eine Berührung der Oberfläche zu vermeiden. Die Scheibe wird vorzugsweise maschinell in das Sol getaucht. Die Scheibe wird mit einer vorgeschriebenen Entnahmegeschwindigkeit aus dem Sol genommen. Von einer Seite der Scheibe wird die Beschichtung entfernt. Das beschichtete Substrat wird anschließend in eine saubere Petrischale gegeben, abgedeckt und bei Raumtemperatur getrocknet. Der vor dem Sintern gebildete Film muss gleichförmig sein, ohne Risse, Klumpen oder Lücken. Es ist selbstverständlich, dass das Tauchbeschichtungsverfahren, das auf die Deckschicht einer Scheibe angewandt wird, ebenso auf andere Substratformen, wie beispielsweise flache rechtwinklig geformte Quarzsubstrate, angewandt werden kann.
Verfahren 4 – Herstellung eines getrockneten Hydroxyapatit-Pulvers
Die in Verfahren 2 hergestellte Sol-Gel-Substanz wird bei 100°C über etwa 8 Stunden getrocknet. Die getrocknete Substanz wird anschließend unter Verwendung eines Mörsers und Pistills oder eines anderen Mechanismus, der Zerkleinern und ein Pulver produzieren kann, zerkleinert. Das Pulver kann anschließend in Anlehnung an den Standardsinterungsprozess, wie in Verfahren 7 beschrieben, gesintert, mit der Ausnahme, dass das Pulver in einem Schmelztiegel gesintert wird und anschließend nach dem Abkühlen wieder zerkleinert wird. Die gleiche Prozedur kann für die Herstellung eines dotierten oder stabilisierten Hydroxyapatits angewandt werden.
Verfahren 5 – Herstellung von Bulkkeramikstücken
Keramik (dreidimensionale Bulkstücke) wurde aus Siliciumdioxid-dotierten Hydroxyapatit-Pulvern wie folgt hergestellt. Eine dotierte Sol-Gel-Substanz wurde gemäß Verfahren 2 hergestellt. Ein Teil der Sol-Gel-Substanz wurde zurückbehalten und der Rest gefiltert. Das Pulver wurde bei 120°C getrocknet und zerkleinert, um ein feines Pulver herzustellen. Etwa 0,09 g des Pulvers wurden in einer Plastikschale gegeben. Unter Verwendung eines gläsernen Tropfglases wurde ein Tropfen der Ausgangs-Sol-Gel-Substanz geformt, der beim Mischen mit dem Pulver etwa 0,055 g wog. Das Sol wurde mit dem Pulver gemischt um eine feuchte, aber nicht nasse Paste zu formen. Die feuchte Paste wurde in eine Edelstahlmodellform mit einem Durchmesser von 6,25 mm eingebracht und 1 Minute bei 2 metrischen Tonnen gepresst. Das Bulkstück wurde aus der Presse entfernt, luftgetrocknet und in einem abgedecktem Aluminium-Schmelztiegel gemäß Verfahren 7 gebrannt. Die Oberflächenmorphologie war der der in 14 dargestellten künstlichen gesinterten Dünnfilme sehr ähnlich.
Verfahren 6 – Herstellung von Bulkkeramikstücken die eine Porenmakrostruktur aufweisen
Aus Hydroxyapatit hergestellte Pulver, die mit einer stabilisierenden Entität, wie beispielsweise Siliciumdioxid wie in Verfahren 2 dotiert sind, und bei 1000°C gesintert wurden, werden mit Styrolkugeln einer gewünschten Größe gemischt, das Pulver wird mit zusätzlicher Sol-Gel-Substanz befeuchtet, und bei einem Druck von etwa 1 Tonne/cm² gepresst, so dass das Styrol nicht extrudiert wird. Verbesserte Rohbruchfestigkeit wird dadurch erreicht, dass das Pulver/Styrol-Formteil unter Verwendung einer anfeuchtenden Mischung des zurückgehaltenen Sols und 2,5 Gewichts-% Polyphenylalkohollösung gepresst wird. Das Styrol wird durch Pyrolyse durch Erhitzen in Luft oder Sauerstoff auf 550°C entfernt. Die makroporöse Keramik wird anschließend bei 1000°C so gebrannt, wie es für normales Sintern in Verfahren 7 beschrieben ist.
Verfahren 7 – Sintern der Hydroxyapatit-Substanz
Der folgende Sinterungsprozess kann in Standardlaboröfen verschiedener Größe durchgeführt werden, die von Umgebungstemperaturen bis zu wenigstens 1100°C betrieben werden können, und vorgesehen sind, exakte und stabile innere Temperaturen, insbesondere zwischen 800°C und 1100°C beizubehalten, wie beispielsweise Lindberg Modelle 51744 oder 894-Blue M. Die Komponenten, die in den Verfahren 3, 4, 5 oder 6 hergestellt wurden, werden vorsichtig auf Standardkeramikplatten (wie es üblicherweise im Lindberg-Ofen praktiziert wird) transferiert. Die Keramikplatte wird während des Sinterungsverfahrens als Träger verwendet, um ein leichtes Beladen oder Entfernen der verschiedenen Substrate aus dem Ofen zu gewährleisten. Die Ofentemperatur wird auf die Temperatur eingestellt, die für das Erzielen der gewünschten HA:α-TCP-Verhältnisse erforderlich ist. Bei Verwendung eines programmierbaren Ofens, wie beispielsweise das Lindberg Model 894-Blue M, kann der Ofen so programmiert werden, dass er die gewünschte Temperatur, die normalerweise aus dem Bereich von 920°C bis 1100°C ausgewählt wird, für maximal 1 Stunde hält, um die gewünschte Diffusion der Silicium-Entitäten durch die entwickelten Gradientenschichten von Hydroxyapatit und α-Tricalciumphosphat zu gewährleisten. Im Falle von nicht-programmierbaren Öfen, muss ein separater Zeitmesser benutzt werden, um den Betreiber zu warnen, den Ofen am Ende der bei der ausgewählten Temperatur erforderlichen Sinterungszeit auszuschalten. Die Keramikplatte, die die gesinterten Substrate trägt, kann zu jeder Zeit entfernt werden, nachdem die Ofeninnentemperatur auf eine akzeptable und berührungssichere Temperatur von etwa 60°C abgekühlt wurde. Einzelne Substrate können dann gelagert oder für die Endverwendung verpackt werden.
Diesem Verfahren entsprechend können Hydroxyapatit/α-Tricalciumphosphat-Dünnfilme und dickere Beschichtungen auf einer beständigen Basis produziert werden, die die gewünschte Zusammensetzung aufweisen, wobei die Veränderung verschiedener Verfahrensparameter minimiert wurden, um die entsprechende Beständigkeit zu gewährleisten.
Obwohl hier bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung ausführlich beschrieben sind, ist es für den Fachmann selbstverständlich, dass Variationen davon vorgenommen werden können, ohne den Bereich der folgenden Ansprüche zu verlassen.

Claims

Bioaktive künstliche, gesinterte Zusammensetzung zur beständigen Unterstützung der Knochenzellaktivität, wobei genannte Zusammensetzung Folgendes umfasst: – stabilisiertes Tricalciumphosphat, das durch stabilisierende Entitäten stabilisiert ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus Silicium-Entitäten, Aluminium-Entitäten, Zirconium-Entitäten, Barium-Entitäten, Titan-Entitäten, Germanium-Entitäten, Chrom-Entitäten, Vanadium-Entitäten, Niobium-Entitäten, Bor-Entitäten und Gemischen davon, worin genanntes stabilisiertes Tricalciumphosphat in physiologischen Flüssigkeiten mit einem pH von ca. 6,4 bis 7,3 unlöslich ist, dadurch gekennzeichnet, dass genannte Zusammensetzung durch die Umwandlung mittels Sintern einer mit genannten stabilisierenden Entitäten gleichmäßig dotierten Hydroxyapatit-Sol-Gel-Substanz erhaltbar ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Sintern bei einer Temperatur zwischen 900 °C und 1100 °C durchgeführt wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, worin genanntes stabilisiertes Tricalciumphosphat hauptsächlich α-Tricalciumphosphat darstellt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin genannte Zusammensetzung in der Form eines Pulvers, einer Beschichtung oder eines dreidimensionalen Bulkmaterials vorliegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, worin die genannten stabilisierenden Entitäten in der Form einer metallorganischen Lösung bereitgestellt sind.
Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die genannten stabilisierenden Entitäten Silicium-Entitäten darstellen.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, worin die genannten Silicium-Entitäten Tetrapropylorthosilicat darstellen.
Verfahren zur Herstellung einer stabilisierten, künstlichen, gesinterten Zusammensetzung aus Calciumphosphatphasen mit einer Morphologie, die zur Unterstützung der Knochenzellaktivität darauf geeignet ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: – Dotieren einer Hydroxyapatit-Substanz mit stabilisierenden Entitäten, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus Silicium-Entitäten, Aluminium-Entitäten, Zirconium-Entitäten, Barium-Entitäten, Titan-Entitäten, Germanium-Entitäten, Chrom-Entitäten, Vanadium-Entitäten, Niobium-Entitäten, Bor-Entitäten und Gemischen davon; – Sintern genannter dotierter Hydroxyapatit-Substanz, worin das Sintern die genannte dotierte Hydroxyapatit-Substanz in hauptsächlich α-Tricalciumphosphat in Phosphatphasen umwandelt, worin genanntes stabilisiertes α-Tricalciumphosphat in physiologischen Flüssigkeiten mit einem pH von ca. 6,4 bis 7,3 unlöslich ist, durch Osteoklasten resorbierbar ist und die Sekretion von mineralisierender Kollagenmatrix durch Osteoblasten fördert, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass genannte Hydroxyapatit-Substanz in der Form eines Sol-Gels vorliegt und dass genanntes Hydroxyapatit-Sol-Gel mit genannten stabilisierenden Entitäten gleichmäßig dotiert ist.
Verfahren nach Anspruch 8, worin genannte stabilisierende Entitäten in der Form einer metallorganischen Lösung vorliegen.
Verfahren nach Anspruch 9, worin der Dotierschritt das Dispergieren genannter stabilisierender Entitäten durch genanntes Sol-Gel hindurch auf eine Weise umfasst, die die Außenflächen von genannten Phosphatphasen umgibt.
Verfahren nach Anspruch 8, 9 oder 10, worin das Hydroxyapatit-Sol-Gel durch das Mischen einer Calciumnitrattetrahydrat-Lösung und einer Ammoniumdihydrogenorthophosphat-Lösung hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 8, 9, 10 oder 11, worin die gebildete Zusammensetzung ein Pulver, eine Beschichtung oder ein dreidimensionales Bulkmaterial darstellt.
Verfahren nach Anspruch 8, 9, 10, 11 oder 12, worin genannte Silicium-Entitäten Tetrapropylorthosilikat darstellen.
Verfahren nach Anspruch 13, worin sich genanntes Tetrapropylorthosilicat in Lösung mit 2-Methoxyethanol befindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 14, worin genannte Calciumphosphatphasen in einem Verhältnis von 50 : 50 bis 20 : 80 für das Verhältnis von Hydroxyapatit zu α-Tricalciumphosphat vorliegen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 15, worin das Sintern der Hydroxyapatit-Substanz bei Temperaturen von ca. 900 °C bis 1100 °C durchgeführt wird.
Gesinterte, künstliche, mikroporöse, polykristalline Struktur zur Unterstützung der Knochenzellaktivität, wobei genannte Struktur mithilfe des Verfahrens nach einem der Ansprüche 8 bis 15 hergestellt wird.
Polykristalline Struktur nach Anspruch 17, worin genannte Struktur ein Implantat darstellt.
In-vitro-Verfahren zum Kultivieren funktionsfähiger Knochenzellen, wobei genanntes Verfahren das Applizieren einer Suspension aus Knochenzellen in physiologischen Medien auf eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, die auf einem Substrat bereitgestellt ist, umfasst.