KR19990044355A - 골세포 활성을 지지하는데 특히 적합한 인산칼슘 상의 인공 안정화된 조성물 - Google Patents

골세포 활성을 지지하는데 특히 적합한 인산칼슘 상의 인공 안정화된 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 골 세포 활성을 일관되게 지지할 수 있는 형태를 제공하기 위한 생물활성적 인공 소결된 조성물에 관한 것이다. 조성물은 소결 온도에서 안정화 실재물의 존재하에서 수산화인회석 물질을 불용성화되고 안정화된 인산삼칼슘으로 전환시킴으로써 발달된 안정화된 인산칼슘 상으로 이루어진다. 본 발명은 생체외 뼈 이식 조직 공학뿐만 아니라 뼈 및 치아 조직 이식 및 회복을 포함하여 의학 용도 및 비정상 골 세포 활성의 평가를 위한 의학 진단 등 많은 용도를 가진다.

Description

골세포 활성을 지지하는데 특히 적합한 인산칼슘 상의 인공 안정화된 조성물
뼈는 무기 또는 미네랄 상, 유기 매트릭스 상 및 물로 구성된 복잡한 미네랄화된 체계이다. 무기 미네랄 상은 결정성 인산칼슘 염으로 구성된 반면 유기 매트릭스 상은 주로 콜라겐 및 다른 비콜라겐 단백질로 구성되어 있다. 뼈의 석회화는 미네랄화된 조직을 생성하는 무기 및 유기 상사이의 밀접한 결합에 달려있다.
뼈성장 과정은 구조적 및 기능적 요구를 충족시키기 위해 조절된다. 뼈형성, 유지 및 재흡수과정에 관련된 세포로는 조골세포(osteoblast), 골세포(osteocyte) 및 파골세포(osteoclast)가 있다. 조골세포는 인산칼슘결정성장 및 콜라겐 조립이 미네랄화된후 뼈의 유기 매트릭스인 유골(osteoid)을 합성한다. 골세포는 뼈 미네랄과 세포외 유체사이의 칼슘과 인산염의 흐름을 조절한다. 파골세포 기능은 뼈를 재흡수하고 뼈재형성 과정에 필수적이다. 뼈형성 및 재흡수의 자연적 평형의 방해는 다양한 뼈장애를 유도한다. 증가된 파골세포 활성은 골다공증, 섬유성골염 및 Paget 질환에서 나타나는 바와 같이 뼈밀도의 감소를 특징으로 하는 뼈질환을 유도함이 제시되었다. 모든 이들 질환은 증가된 뼈 재흡수의 결과이다.
골세포 기능을 조절하는 관련된 메카니즘을 이해하기 위해서, 골세포의 정상기능 및 또한 다양한 뼈질환에서 이 활성의 교란정도를 평가할수 있는 것이 중요하다. 이것이 비정상 골세포를 정상수치내로 다시 회복시키기 위해서 표적된 약제의 동정을 유도할 것이다. 비정상 및 정상 골세포 활성의 병인의 동정 및 이 활성의 평가와 함께, 골조직 손실을 유도하는 질환, 수술제거 또는 생리학적 외상의 결과로서 비정상 골세포 활성의 치료를 위한 조성물 및 방법을 발달시키는 것이 필요하고 요구된다. 뼈 이식의 사용과 같이 뼈조직의 치환 및 회복을 제공하는 치료가 매우 요구된다.
몇몇 연구그룹이 시험관내에서 분리한 파골세포의 활성을 직접적으로 관찰하는 방법을 발달시켰다. 골수세포집단으로부터 분리한 파골세포를 향유고래 상아질(Boyde et al Brit. Dent. J. 156, 216, 1984) 또는 뼈(Chambers et al J.Cell Sci. 66, 383, 1984)와 같은 천연물질의 얇은 슬라이스상에서 배양시켰다. 후자그룹은 이 재흡수 활성이 단핵 식세포 시리즈의 다른 세포에 의해 소유되지 않음을 제시할 수 있었다(Chambers & Horton, Calcif Tissue Int. 36, 556, 1984). 파골세포 계통을 연구하기 위해 다른 세포배양기법을 사용한 더욱 최근의 시도는 여전히 재흡수활성의 정량은 다양한 깊이의 재흡수 피트 영역의 이차원 분석 또는 재흡수 부피의 입체적 맵화에 있다는 것을 위해 피질 뼈 조각의 사용에 의존해야만 했다(Amano et al. & Kerby et al J. Bone & Min. Res. 7(3)). 이러한 기법은 비교적 두꺼운 기질의 재흡수를 평가할 때 최고 약 50%의 정확도를 제공한다. 게다가 이들 분석기법은 또한 시간낭비이며 매우 고도화된 장비 및 훈련을 요한다. 더욱이, 뼈 또는 상아질 조각의 제조 및 후속의 조사가 쉽지 않으며 파골세포 활성의 평가를 위한 실용적 방법이 아니다.
파골세포 배양을 위해 기질로서 인공 인산칼슘 제조의 사용은 또한 거의 성공적이지 않았다. Jones 등(Anat. Embryol 170, 247, 1984)은 파골세포가 시험관내에서 합성인회석을 재흡수하나 이 관찰을 뒷받침하는 실험적 증거를 제공하는데에 실패했음을 보고했다. Shimizu 등(Bone and Mineral 6, 261, 1989)은 분리한 파골세포가 활력상실한 뼈표면만 재흡수하고 합성칼슘수산화인회석은 재흡수하지 않음을 보고했다. 이 결과들은 기능적 파골세포는 시험관내에서 배양시키는 것이 어렵다는 것을 나타냈다.
몇몇 그룹이 또한 뼈조직의 치료적 치환에 적당한 조성물을 제공하는 것을 시도했다. US 특허 번호 4,817,578은 이식사용에 적당한 수산화인회석의 비공성 부드러운 코팅형성 과정을 개시하고 있다. US 특허번호 4,983,182는 지르코니아의 소결된 몸체 및 α-TCP와 지르코니아 또는 수산화인회석과 지르코니아의 코팅으로 이루어진 세라믹 이식을 개시하고 있다. US 특허번호 4,988,362는 다른 바이오세라믹에 바이오세라믹의 융합을 위한 조성물을 개시하고 있다. US 특허번호 4,990,163은 α-TCP 및 β-TCP로 구성되는 바이오세라믹의 생산을 위해 사용되는 코팅을 개시하고 있다. 이들 여러 조성물이 이식용 생화합성 코팅등으로 사용될수 있지만, 이들 조성물중 어느것도 골 매트릭스의 파골세포 재흡수 및 조골세포 분비의 특이활성의 정량적 평가를 허용하는 확실하고 재사용할 수 있는 방법으로 활성 파골세포 및 조골세포의 배양에 적당한 것으로 제시되지 않았다. 더욱이, 개발된 이전 조성물중 어느것도 생체내와 시험관내에서 유사한 생물활성적 기능을 유도하는 일반적 조성물 및 형태를 공유하는 어떤 범위의 필름, 두꺼운 코팅 및 벌크 세라믹조각을 확실하게 생산하기 위해서 조작할 수 없다.
출원인의 공개된 국제PCT특허출원 WO94/26872는 골세포기능이 일어나는 인산칼슘상의 얇은 필름을 형성하기 위한 소결과정을 기술하고 있다. 이것은 우선 파골세포가 확장된 활성을 나타낼수 있으며 조골세포가 골 매트릭스를 분비할 수 있는 합성물질의 얇은층이다. 이 출원에서 기술된 바와 같이, 다양한 인자가 인산삼칼슘에 대해 수산화인회석의 원하는 비율의 얇은 필름을 제공함에 있어서 고려되어야만 한다. 이러한 파라미터로는 다음을 포함한다.
1) 졸-겔 수산화인회석 물질을 제조하기 위한 시약량
2) 시약의 배합율
3) 졸-겔을 제조할 때 혼합기간 및 비율
4) 제조 및 분리비율 및 방법
5) 졸-겔의 제조동안 공정환경조건
6) 필름의 딥코팅에서 졸-겔로부터 기질의 제거속도
7) 소결온도
8) 비활성 가스, 진공 또는 수증기가 존재하는 분위기와 같은 조절된 분위기에서의 소결
9) 안정화된 인산칼슘 상을 가지는 코팅된 투명한 기질을 생성하기 위해서 바람직한 구체예인 석영을 가지는 기질의 상태.
이 초기의 PCT특허출원에서 석영기질상의 인산삼칼슘에 대한 수산화인회석의 비율에서 넓은 범위를 얻기위해서 많은 이들 파라미터들은 10:90 내지 90:10의 비율을 달성하기 위해서 고려될 필요가 있었다. 공기 분위기에서 제안된 소결온도는 약 800℃ 내지 1100℃였다. 800℃에서 필름은 주로 수산화인회석이었음을 확인했다. 약 900℃의 소결온도는 약 70:30의 비율을 제공했다. 1000℃에서, 이 비율은 약 10:90이였고 1100℃에서 필름은 주로 인산삼칼슘이었다. 또한 1000℃의 진공에서 소결은 약 66:34의 비율을 생성함이 제시되었다. 현재 바람직한 비율은 50:50 내지 20:80임이 발견되었다. 최적비율은 약 333:666이다. 이 비율을 달성하기 위해서, 상기 인자중 몇 개를 고려할 수 있다. 그러나, 상기 인자중 몇몇의 변화성을 최소화하고 정확한 재생방법으로 최적필름조성물에 대한 원하는 비율을 달성하는 것이 요구된다. 놀랍게도, 이 필름은 인산α-삼칼슘이 수용성인 것으로 가정할 때조차도 다양한 수성 배지의 존재에서 안정하다.
출원인은 안정화 실재물(entity)의 존재가 조성물을 안정화시키며 생리학적 유체에서 분해를 방지할 수 있음을 발견하였다. 따라서, 이 조성물의 필름, 코팅 또는 벌크 세라미조각으로부터 인산칼슘실재물의 소실은 실질적으로 파골세포 활성때문이고 용해과정때문이 아니다. 안정화된 인공 생물활성적 조성물은 먼저 파골세포 및 조골세포 활성을 유지하고 진단 및 치료계획의 발달뿐만 아니라 양쪽 세포유형의 생리학적 활성의 확실한 평가를 허용하는 그러한 조성물이다. 안정화 실재물은 소결동안 형성되는 인산칼슘 상내의 인산α-삼칼슘을 안정화시켜 생리학적 유체에서 분해되지 않고 골세포 활성을 지지 및 촉진시키는 세포 화합성 형태를 가지는 인산칼슘 상을 형성하는 인산α-삼칼슘의 안정한 형태를 제공한다.
발명의 개요
본 발명은 광범위한 진단 및 치료적 용도를 제공하는 안정화된 조성물을 제공한다. 본 발명의 한 양태에 따라 안정화된 조성물은 일반적인 표면 구형 미공성 및 내부 미공성을 공유하는 일정범위의 얇은 필름, 코팅, 분말 및 벌크 세라믹 조각을 제공하기 위해서 사용될 수 있다. 게다가, 벌크 세라믹은 또한 생체내에서 발견되는 것과 유사한 인공 삼차원 골조직을 제공하기 위해서 구조물내에 대공성을 가질 수 있다. 어떤 형태로 만들어진 조성물은 배양된 골수세포의 활성을 촉진시키고 또한 뼈이식으로서 사용하기 위해 생체외 조작된 인공 뼈조직의 개발을 허용한다.
본 발명의 한 양태에 따라 골세포 활성을 견실히 지지할 수 있는 형태를 제공하기 위한 생물활성적 인공 소결된 조성물로서, 소결온도에서 안정화 실재물의 존재하에서 수산화인회석 물질을 불용성이고 안정화된 인산삼칼슘으로 전환시킴으로써 발달된 안정화된 인산칼슘 상으로 이루어지는 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따라 골세포활성을 유지하기위해 적당한 형태를 가지는 인산칼슘 상의 인공 소결된 조성물을 안정화시키기 위한 방법으로서, 수산화인회석 물질을 소결에 의해 주로 인산알파삼칼슘으로 전환시키고, 인산염 상내에서 형성된 인산알파삼칼슘을 안정화하고 불용성화시키는 안정화 실재물을 제공하는 것으로 이루어지는 방법을 제공한다.
본 발명의 더욱 다른 양태에 따라 골세포 활성을 지지하기 위한 소결된 인공 미공성 다결정구조물로서, 구조물내에 상호연결된 미공을 가지는 느슨하게 상호연결된 둥근미립의 구형 표면형태를 가지는 소결된 안정화된 인산칼슘 상으로 이루어진 구조물을 제공한다.
본 발명의 더욱 다른 양태에 따라
a) 매트릭스를 지지하기 위한 구조물;
b) 소결온도에서 인산칼슘 상을 불용성화하고 안정화시키는 안정화 실재물의 존재하에서 수산화인회석 물질을 인산삼칼슘으로 전환시킴으로써 발달된 안정화된 인산칼슘 상의 층;
c) 안정화된 인산칼슘 상의 층에서 배양된 조골세포에 의해 축적된 경계층; 및
d) 이러한 배양된 조골세포에 의해 분비되는 미네랄화 콜라겐성 매트릭스로 이루어지는 이식용 석회화된 골 매트릭스에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태에 따라 기능적 골세포의 배양방법으로서,
-생리학적 배지중의 골세포의 현탁액을 안정화되고 불용성화된 인산알파삼칼슘으로 이루어지는 기질상의 안정화된 인산칼슘 상의 인공 소결된 필름에 적용시키는 것으로 이루어지는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태에 따라 골세포 활성을 모니터하고 정량화하기 위한 키트로서,
-안정화되고 불용성화된 인산알파삼칼슘을 함유하는 인산칼슘 상의 소결된 필름을 지니는 기질,
-기질에 부착된 멀티웰 골세포 배양장치로 이루어지는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태에 따라서 미네랄화된 콜라겐성 매트릭스의 생체외 조직공학을 위한 방법으로서,
-상호연결된 미공을 지닌 느슨하게 상호연결된 둥근미립의 구형 표면 형태를 지니는 인공 안정화된 조성물을 제공하는 단계,
-생리학적 배지중의 조골세포의 현탁액을 조성물에 적용하는 단계,
-배양으로부터 조골세포에 의해 선택된 미네랄화된 골라겐성 골 매트릭스를 배양하는 단계, 및
-분리한 콜라겐성 골 매트릭스를 환자에게 이식하는 단계로 이루어지는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 골세포 활성을 지지할 수 있는 인산칼슘 상의 생물활성적 인공 안정화된 소결된 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 생체외 뼈 이식조직 공학뿐만 아니라 뼈 및 치아조직 치환 및 회복을 포함하여 의학치료 뿐만 아니라 정상 및 비정상 골세포 활성의 평가를 위한 의학 진단용도를 가진다.
도 1은 수산화인회석 및 인산삼칼슘의 안정성에서 CaO 활성의 효과를 나타내는 우세영역 도표이다.
도 2는 본 발명의 수산화인회석 물질의 전환으로부터 안정화 규소 실재물의 존재하에서 형성된 인산칼슘 실재물의 상을 나타내는 플롯이다.
도 3은 CaO의 활성에 대한 CaO/Al2O3의 효과를 나타내는 플롯이다.
도 4는 CaO의 활성에 대한 CaO/TiO2및 CaO/B2O3비율의 효과를 나타내는 플롯이다.
도 5는 (a) 기질과 조성물의 경계면, (b) 단지 상기 경계면 및 (c) 필름의 꼭대기에서 에너지 분산 x-레이 분광의 결과를 나타내는 그래프 (a), (b) 및 (c)로 이루어진다.
도 6은 활성 조골세포에 의해 본 발명의 안정화된 얇은 필름 조성물에 축적된 미네랄화된 콜라겐성 골 매트릭스의 단면 SEM이다.
도 7(a)는 안정화된 조성물에서 배양된 조골세포에 의해 생성되는 형광 석회화된 골 매트릭스의 축적을 나타내는 사진이다.
도 7(b)는 조골세포가 안정화된 얇은 필름 조성물에서 배양되지 않고 형광 석회화된 골 매트릭스가 관찰되지 않는 대조구를 나타내는 사진이다.
도 8은 인공 생물활성적 안정화된 조성물로 구성된 벌크 삼차원 고체 세라믹에 대한 파골세포 재흡수 피트의 SEM이다.
도 9는 인공 생물활성적 안정화된 조성물의 얇은 필름에 대한 파골세포 재흡수 피트의 SEM이다.
도 10은 형태를 나타내는 석영기질에서 인공 안정화된 조성물의 얇은 층의 단면 TEM 확대한 현미경사진이다.
도 11은 표면 미공 구조를 나타내는 얇은 필름으로서 적용된 안정화된 조성물의 SEM 현미경사진이다.
도 12(a)는 안정화 실재물의 부재하에서 시판용 소결된 수산화인회석의 SEM 현미경사진이다.
도 12(b)는 규소 안정화 실재물의 부재하에서 시판용 소결된 수산화인회석의 SEM 현미경사진이다.
도 13은 자연적 재흡수 피트를 나타내는 자연 뼈에서 파골세포의 SEM이다.
도 14는 본 발명의 방법에 의해 만들어진 벌크 세라믹의 구형 표면 형태를 나타내는 SEM 현미경사진이다.
인산칼슘물질의 조성물은 출원인의 계류중인 공보된 PCT 출원 WO94/26872에 기술된 것에 따라서 제공된 것이다. 본 방법은 인산α-삼칼슘에 대해 수산화인회석의 비율이 50:50 내지 20:80의 원하는 범위내에 있는 일관된 기준인 인산칼슘 상의 얇은 필름을 제공한다. 현재 안정화 실재물의 존재가 인산칼슘 상내의 α-TCP를 상당히 그리고 기대되지 않게 안정화시켜 조골세포와 파골세포의 활성을 지지 및 촉진시키고 재생가능한 방법으로 이러한 활성의 정량화를 허용하며 골조직 손실을 위한 진단 및 치료계획의 발달을 제공하는 생물활성적 조성물을 제공한다.
용어 "안정화된"은 주위조건 또는 생리학적 환경 생체내 또는 시험관내에 놓여질 때 일관된 결정그래프 및 화학구조를 유지하는 수산화인회석의 전환상에서 형성된 인산칼슘 상을 나타내는 것으로 이해된다. 또한 용어 "생물활성적"은 정상 뼈교체와 매우 유사한 방법으로 비특이 화학 및/또는 새포 용해 및/또는 분해를 피하면서, 실질적으로 또는 배타적으로 본 조성물로 만들어진 구조물상에서 조골세포 뼈 성장을 지지하고 동시에 파골세포에 의해 조성물의 자연 조절된 세포외 재흡수를 촉진시키는 능력을 나타내는 것으로 이해되어야 할 것이다. 시험관내 및 생체내동안 존재하는 이러한 생물활성은 골세포가 존재하는 물질을 사용한다. 용어 "인산칼슘 상"은 수산화인회석 α-TCP, β-TCP, 팔인산칼슘, 인산사칼슘 및 인산이칼슘과 같이 소결된 생성물에서 다양한 인산칼슘종류를 포함하는 것으로 여겨진다.
초기에 시험관내 골세포 활성을 지지하기 위해, 적당한 인산칼슘 생성물은 순수하거나 또는 본질적으로 순수한 수산화인회석이어야 한다고 생각하였고 필름제조시 선택한 인산칼슘 실재물인 것으로 이해되었다. 현재 주로 수산화인회석인 물질은 파골세포 및 조골세포의 정상기능을 촉진시키지 않으며, 실제 파골세포의 존재에서는 거의 활성을 관찰할 수 없음이 측정되었다. 그러나, 수산화인회석과 인산α-삼칼슘을 포함하는 인산칼슘 상의 혼합물을 제공함으로써, 주로 인산α-삼칼슘으로 된 필름은 가장 높은 재흡수도를 제공하는 반면, 주로 수산화인회석으로 된 필름은 무시할만한 재흡수도를 제공하여 재흡수도가 광범위하게 촉진됨이 발견되었다. 이 사실은 인산α-삼칼슘의 존재에 대해, 현재 개발된 인산칼슘물질이 이러한 물질상에서 배양되는 골세포의 기능적특성을 촉진시키는 이유를 부분적으로 제시한다. 이 양태는 예를들어, 광 또는 광반사의 투과를 허용하는 얇은 필름의 형태로 안정화된 인산칼슘상을 제공함에 있어서, 이러한 필름상에서 배양되는 골세포의 몇몇 기능적 특성을 평가하기 위해서 진단방법을 수행하는 것을 허용한다.
놀랍게도, 수산화인회석 졸-겔 물질의 제조를 표준화하고 매우 특정범위의 소결온도를 선별하는 것은 원하는 비율을 달성할 수 있을 뿐만 아니라 최적 조성물이 졸-겔 방법으로 제조되는 바와 같이 수산화인회석을 인산α-삼칼슘으로 전환시킴으로써 형성됨을 발견하였다. 인산β-삼칼슘은 이들 바람직한 최적화된 필름 조성물에서 거의 검출되지 않았다. 개별적 상의 수산화인회석 및 인산α-삼칼슘 제조의 혼합물을 제조할 필요가 없다. 대신, 공개된 PCT 출원 WO94/26872에 기술된 기법이 졸-겔 수산화인회석 물질을 제조하는데 충분하다. 증가된 pH의 배지에서 이러한 수산화인회석 물질을 제조하기 위한 화학반응은 다음과 같다.
5Ca(NO3)2+ 3NH4H2PO4+ 7NH4OH
→ Ca5(PO4)3OH + 10NH4NO3+ 6H2O
출발용액은 반응물이 충분히 용해되고 잘 혼합될 수 있는 수용액으로 구성된다. 수산화인회석은 현탁액중의 미세입자로 형성되고 크기는 광분산실험에 의해 제조후에 24시간동안 졸-겔 물질을 숙성시킬 때 평균 약 0.3 μm에서 1μm이상으로 성장하는 것으로 제시된다.
수산화인회석 물질은 중성 및/또는 알칼리성 배지에 적당하다. 바람직하게는 반응배지는 보통 약 12의 범위로 증가된 pH를 가져온다. 제1 인산염 용액을 제2 칼슘 용액으로 적가하여 삼인산일수소사칼슘의 형성을 방지함으로써 원하는 수산화인회석 생성물을 얻는다. 졸-겔 물질을 여과하고, 분말로 건조시키고, 하소시키고 1000℃의 알루미나 도가니에서 점화시켜 칼슘수산화인회석 상을 형성할 수 있으며, 이것은 대기습도의 정상조건하에서 안정하다. 1200℃이상의 소결온도에서 이 상은 β-TCP, 팔인산칼슘, 인산사칼슘 또는 인산이칼슘과 같이 또한 형성되는 소량의 일부 다른 상과 함께 주로 인산α-삼칼슘으로 전환된다. 다른 "불순"물질이 또한 소결된 안정화된 인산칼슘 상에서 형성될수 있다는 것이 본 분야의 숙련가에게 이해될 것이다. 이러한 물질이 또한 소결전에 수산화인회석 물질에 가해질수 있다. 이러한 불순물의 존재 또는 첨가는 바람직하게 조성물과 골세포 활성의 지지에 영향을 미칠 어떤 방식으로 안정화된 조성물의 형태에 영향을 미치지 않는다.
소결방법에 대하여, 수산화인회석 물질의 건조된 필름의 소결은 표준형의 고온오븐에서 오븐의 분위기를 조절할 필요없이 수행할 수 있음이 또한 발견되었다. 새오븐 또는 다른 목적을 위해 이전의 사용으로 오염된 오븐을 사용할 때, 오븐이 비어있는동안 몇번 소결온도 범위를 통하여 오븐을 순환시키는 것이 바람직하다. 이러한 오븐의 예비조건화는 어떤 휘발성 물질을 제거하고 사용할 준비를 시킨다. 추가단계가 요구되지 않는다. 주위공기가 침입기간동안 그리고 코팅된 기질을 소결하기위한 정상사용동안 오븐에 존재할 수 있으며 주위공기의 존재는 과정을 방해하지 않으며 원하는 비율에 대한 일관된 결과를 생성한다. 이 조건하에서, 소결온도는 석영기질의 존재하에서 50:50에서 20:80까지의 원하는 비율을 제공하는데 920℃ 내지 1100℃까지의 범위일 것이다. 온도가 증가함에 따라, 수산화인회석의 인산α-삼칼슘으로의 전환이 또한 증가됨이 발견되었다. 920℃내지 950℃범위까지의 소결온도에서 비율은 50:50으로부터 333:666으로 다양할 것이다. 950℃ 내지 1000℃범위의 선택된 소결온도에서 비율은 약 333:666이다. 1000℃이상 1100℃까지 온도의 증가는 더욱 전환을 증가시키고 333:666 내지 20:80 범위의 비율을 가지는 조성물을 생성한다. 바람직한 소결온도는 약 975℃이고 여기서 333:666의 비율이 달성된다.
수산화인회석의 인산삼칼슘으로의 전환은 다음 반응을 거쳐 일어난다.
2Ca5(OH)(PO4)3→ 3Ca3(PO4)2+ CaO + H2O
어떤 온도에서 전환정도는 주위 분위기에서 물분압 및 CaO 농도를 변형시키는 인자에 민감하다.
형성되는 인산삼칼슘의 상태는 중요하다. 1.5-1.60의 Ca/P비를 가지는 비화학량론적 수산화인회석(Nakamura, Thermochimica Acta, Vol. 165, 1990) 및 많은 시판 공급되는 수산화인회석 분말(Aldrich Chem Co.)에 대해, 분말을 1100℃로 가열한후 온도를 1000℃이하로 냉각시킬 때 인산β-삼칼슘이 종종 형성된다. β-TCP는 미네랄 Whitlockite로 자연적으로 나타나는 안정한, 불용성 화합물이다. 여기 기술된 바와 같이 수용액으로부터 형성된 졸-겔 유래 수산화인회석 물질의 전환 및 대체적 침전 반응으로부터 형성된 칼슘 수산화인회석 분말에서, 인산α-삼칼슘의 형성은 안정화 실재물의 존재하에서 1000℃이하의 온도에서 증가됨이 발견된다. 인산칼슘에 기초한 코팅의 발달에 있어서, α-TCP는 비교적 높은 용해도 때문에 생리학적 유체에서 분해 때문에 그리고 이것이 단지 1250℃이상의 온도에서 순수한 수산화인회석의 고온전환으로부터의 결과라는 사실로 인해 중요한 주제가 되지 않았다.
전환방정식으로부터, 시스템에서 CaO의 활성을 조절하는 어떤 인자가 온도 및 수산화인회석 전환의 가역성을 변형시킬 것이라는 것이 기대된다. SiO2와 같은 안정화 실재물의 첨가는 다음 반응에 의하여 CaO와 반응하는 것으로 여겨진다.
CaO + SiO2→ CaSiO3
이로써 전환반응이 저온으로 된다. 이 반응은 반응에서 생성되는 1몰 CaO당 1몰 SiO2에 대해 종결되어야만 한다. 다른 CaO/SiO2비를 가지는 여러 실리게이트를 형성하는 다른 반응이 가능할 수 있다.
CaO가 실리카의 작용으로 제거되어 칼슘 실리케이트를 형성할 때, TCP 상 형태가 감소되는 온도는 도1에 도시한 바와 같이 제조된 수산화인회석 조성물의 전환으로부터의 데이터와 일치한다. 규소 실재물의 첨가는 전환선을 오른쪽 즉, 주로 α-TCP 형성을 가지는 저온으로 유도한다.
실리카가 인산베타삼칼슘과 같은 다른 상과 비교하여 인산알파삼칼슘 형성의 촉진에 직접적 역할을 나타내는 제안된 기작은 규소 실재물이 수산화인회석 결정구조물로 들어가고 베타에 대해 알파 상을 안정화시킨다는 것이다. 현재 또한 바람직한 구체예에 따라 출발 수산화인회석 물질의 상태 및 실리카가 첨가되는 방법이 중요하다는 것이 제시되었다. 분말형태의 실리카가 시판용 순수한 수산화인회석 분말에 첨가되고 혼합을 촉진하기 위해 함께 분쇄될 때, 1000℃이상의 고온소결온도에서 관찰되는 전환생성물은 β-TCP였다. 반대로, 금속-유기 용액으로서 첨가된 실리카와 함께 본 발명에 따라 제조된 분말은 도2에 도시한 바와 같이 950℃선의 저온에서 유지되는 주로 안정화된 인산알파삼칼슘으로 전환되었다. 이 전환은 가역적이지 않다. 고온에서, 도핑된 분말은 순수한 분말의 경우 1200℃이상의 전환온도를 실리카 도핑된 분말의 경우 약 950℃로 감소시킴을 나타낸다. 지적된 바와 같이, 이 개발은 칼슘실리케이트의 형성으로 인한 것으로 여겨지기 때문에, 안정화된 결과적인 상 조성물은 저온으로 냉각시 유지된다.
본 발명에 따라 제조된 안정화 실재물을 가지는 분말이 원하는 표면 형태 및 내부 미공구조를 갖는 재생가능하고 안정한 상 조성물을 가지는 하나의 이유는 수산화인회석 물질이 근본적으로 매우 미세 입자로서 졸-겔 과정에서 제조된다는 것이다. 금속유기용액의 형태로 규소 실재물과 같은 안정화 실재물의 첨가는 각각의 이들 입자들이 규소 실재물의 층과 완전히 접촉하여 결과적인 완전한 혼합을 허용한다. 소결시, 실리카는 전환반응에서 방출된 CaO에 매우 근접하게 존재한다. 각 입자의 표면에 불용성 칼슘 실리케이트 실재물의 형성은 반응의 가역성을 제안하고 수성 생리학적 배지에서 인산알파삼칼슘의 용해성을 방지하는 역할을 나타냄이 제안된다.
실리카와 유사한 방법으로, 티타늄, 알루미늄 및 붕소가 전환온도를 감소시킴이 예상되었고 따라서 안정화제, 즉 도핑제로서 사용될 수 있다. 도 3 및 4는 CaO/Al/Ti/Ba 착체의 형성에 따른 온도감소를 나타낸다. 이 금속들은 수산화인회석으로부터 CaO를 제거하기 위해 사용될 수 있으며 결과의 안정화된 α-TCP를 가져온다. 안정화제(도핑제)및 이것이 분산되는 화합물의 선발에 중요한 인자로는 다음과 같다. (a) 이것이 안정한 칼슘 화합물을 형성하는 형성된 CaO와 상호작용하는 것이 필요하고, (b) 이것은 바람직하게는 새롭게 형성된 입자의 외표면을 둘러싸는 방법으로 졸-겔 물질을 완전히 균일하게 분산될 수 있어야 하고, (c) 이것은 인산칼슘 시스템내에서 원하지않는 상을 안정화시켜서는 안되고, (d) 이것이 생물학적 용도로 통합될 때 비독성이어야 한다. 본 발명에서 사용하기에 적당한 안정화 실재물은 산화물, 바람직하게는 금속산화물을 형성하는 것들이다. 바람직한 금속산화물은 알루미늄, 지르코늄, 게르마늄, 크롬, 바나듐 및 니오븀의 산화물과 같이 원하는 조성물 및 형태를 생성하는 것들로부터 선택되며 더욱 바람직하게는 규소 및 티타늄 산화물로부터 선택된다. 이러한 안정화 실재물의 혼합물이 또한 유용한 것으로 증명될 것이다.
소결은 안정화 실재물의 존재하에서 수행된다. 안정화 실재물은 소결과정동안 수산화인회석 물질을 통하여 기질로부터의 확산 또는 소결전에 수산화인회석 물질에 안정화 실재물의 첨가에 의해 제공될 수 있다. 확산 또는 첨가이든지 간에, 안정화 실재물은 얇은 필름, 분말, 두꺼운 코팅, 벌크 세라믹 조각의 형태로 그리고 내부 미공이 형성된 벌크 세라믹 조각으로 인산칼슘상을 안정화시키기에 충분한 양으로 제공된다. 바람직하게는 골세포 활성의 지지 및 촉진을 위하여 재생가능하고 소결과정동안 안정화 실재물의 존재의 기능이 있는 결과적인 독특한 생물활성적 표면 형태 및 내부 미공구조물이다.
제안된 사용에 따라, 조성물은 진단용 얇은 필름 또는 뼈 또는 치아 이식에 사용될 두꺼운 코팅의 형태와 같이 다양한 구조물로 제공될 수 있다. 여기서, 얇은 필름은 두께 0.1 미크론 내지 5 미크론을 가지는 것들로 기술될 수 있고, 두꺼운 코팅은 다른 기질에 적용될 것으로 고안된 5 미크론 이상의 두께를 가지는 것들이다. 벌크 세라믹조각은 기질과 기능적으로 독립된 더큰 삼차원 구조물을 말한다.
바람직한 구체예는 석영 기질면에 수산화인회석 물질의 필름을 소결함으로써 제공된다. 석영기질은 인산칼슘 상을 완전히 확산시켜 충분한 규소 실재물 내용물을 생성할 수 있는 충분한 규소 실재물 원료를 제공한다. 도 5(a) 기질과 조성물의 경계면, 도 5(b) 단지 상기 경계면 및 도 5(c) 필름의 꼭대기의 경계면에 도시한 바와 같이, 규소 실재물은 필름 조성물을 완전히 이용할 수 있다. 소결기간동안, 규소 실재물은 석영의 표면으로 방출되고 수산화인회석 물질층의 표면을 통하여 확산된다. 인산α-삼칼슘에 대한 수산화인회석 비율에 대한 바람직한 범위내에서 수산화인회석의 인산α-삼칼슘으로의 전환동안, 규소 실재물은 CaO와 반응하여 칼슘실리케이트를 형성하여 인산α-삼칼슘과 안정한 착체를 형성한다. 소결시, 발달하는 인산칼슘 상으로 안정화 실재물을 방출하는 다른 기질 또는 첨가제가 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있다는 것이 본 분야의 숙련가에게 이해된다. 안정화 실재물은 금속 및 비금속 산화물, 예를들면, 규소, 알루미늄, 지르코늄, 붕소, 티타늄, 게르마늄, 크롬, 바나듐, 니오븀 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 알루미늄, 지르코늄, 붕소, 티타늄 및 이들 성분의 다양한 혼합물을 함유하는 기질이 안정화 실재물의 원료를 제공하는데 적당할 것이다.
본 발명에 따라 적당한 지지체상으로 제공되는 얇은 필름은 골세포 기능성의 연구 및 이해를 상당히 향상시킨다. 본 발명에 따라 제공되는 안정화된 필름의 제작은 다양한 유형의 골세포 배양을 허용한다. 표면제작은 파골세포 활성연구에서 무시할만한 인산칼슘 실재물의 재흡수도를 필름물질의 상당한 인산칼슘 실재물의 재흡수도를 촉진시키기 위해서 조정될 수 있다. 유사하게, 파골세포 활성은 석회화된 골 매트릭스의 축적을 검출함으로써 연구될 수 있다. 파골세포에 의한 실재물의 재흡수가 재흡수된 인산칼슘 실재물의 소실에 의해 검출될 수 있는 충분히 얇은 필름에 물질을 제공하는 능력은 종래 기술과 비교하여 단순하고 값싼 분석용 포맷을 제공한다. 본 발명에 따라 만들어진 필름 제작은 골세포의 생물학적 기능을 지지한다. 석영 또는 유리와 같은 투명한 지지기질상으로 필름을 제공하는데에 있어서 이점은 자동기계판독을 포함하여 진단과정의 평가기술을 쉽게한다.
이상적으로 필름두께는, 0.1 미크론 미만의 필름두께에서 분리된 공간으로부터 자유로운 균일한 필름 적용범위를 얻는 것이 어렵다는 것이 발견되었기 때문에 0.1 미크론이상이다. 필름의 상한두께에 관해, 이것은 최종사용에 따라 어떤 원하는 두께일 수 있다. 논의되는 바와 같이, 재흡수도는 광투과로 검출할 수 있으며 바람직하게 10 미크론 미만 두께의 필름을 요구한다. 기질은 요구되는 소결온도에 쉽게 견디고 필름물질로부터 인산칼슘 실재물의 재흡수 정도를 결정하기 위해서 광투과 시험을 허용하는 원하는 투명도를 가지는 석영으로 이루어진다.
개발된 얇은 필름은 골세포 활성의 평가를 제공하기 위해서 키트등에 사용될 수 있다. 필름은 부착성 인산칼슘 얇은 필름으로 미리코팅된 석영기질로 이루어지는 "키트"의 형태로 구체화될 수 있으며, 이것은 혼합된 골세포집단의 배양에 적당한 시스템으로서 세포배양용기(약 직경 15mm의 가능한한 24-웰의 선택적으로 멸균된 멀티웰 플레이트)에서 사용될 수 있다. 이 장치는 간단하고 단지 일상적 실험장비이며 사용기법은 정량분석에 적당하며, 제작하는데 저렴하지만 정상수치의 조작을 견딜만큼 충분히 강하며 플라스틱 보존박스에 24 샘플(예를들면)같이 많이 포장될 수 있다. 얇은 필름 표면은 확인된 재생가능한 화학성을 가지며 적당한 포장물질과 함께 사용될 때 이동을 견딜수 있을 만큼 기계적으로 충분히 강하다.
각각의 경우에 배양조건은 단핵 또는 다핵형태의 파골세포가 기능적 상태로 생존하고 필름의 인공 인산칼슘을 재흡수할 수 있어야 한다. 유사하게, 조골세포 또한 이러한 배양조건하에서 석회화된 골 매트릭스를 활성적으로 분비할 수 있다.
이 기질들은 질병과정의 결과 또는 배양배지에서 직간접적으로 파골세포 재흡수 활성에 영향을 미치는 약과 같은 시약의 함입에 의해 파골세포의 재흡수 활성을 평가하고 재흡수 활성수치의 변화를 모니터하기 위해서 사용될 수 있다. 기질은 또한 생체내 이식을 위한 축적된 미네랄화된 기질을 사용하기 위해서 뿐만 아니라 골수분비를 관찰 및 평가하기 위해서 활성적인 조골세포의 배양에 적당하다. 도 6에 도시한 바와 같이, 미네랄화된 콜라겐성 기질(10)이 석영기질(14)상으로 제공된 안정화된 얇은 필름(12)의 표면상으로 배양된 조골세포에 의해 축적된다. 시멘트선과 유사한 잘 통합된 경계층(16)이 나타나고 새로운 뼈와 오래된 뼈사이의 경계면에서 생체내 조골세포에 의해 형성되는 동일한 유형의 시멘트선과 유사하다. 이것은 압력 안정화된 조성물이 중요한 뼈 재형성 생성물로서 안정화된 조성물의 역할을 더욱 지지하는 생리학적 조골세포 활성을 허용함을 제시한다.
이 장치는 파골세포의 재흡수 활성 또는 조골세포 활성에 의한 뼈-유사 물질 축적의 정량수단으로서 사용될 수 있다. 이러한 활성분석은 연속적인 실시간 모니터링, 시간-경과 간격 또는 종점결정하에서 일어날 것이다. 골세포 활성을 확립하는데에 있어서 단계는 골세포(동물 또는 사람)가 하나이상의 장치상의 특이 조건에서 배양되는 상기 각각의 모니터링 스케쥴에 일반적이다. 배양기간은 몇시간에서 며칠이며, 바람직하게는 약 2 내지 10일(최적 시간은 세포종류 및 프로토콜에 달려있다)이며, 이 시간동안 파골세포 활성정도를 연속적으로 모니터링, 주기적으로 모니터링하거나, 또는 단순히 최종-종점 결정을 위하여 진행기초상에서 모니터링되지 않을 수도 있다. 유사하게, 조골세포 활성을 석회화된 골 매트릭스 축적정도를 결정함으로써 관찰할 수 있다. 도 7에 도시한 바와 같이, 본 발명의 안정화된 필름으로 코팅되고 동시에 조골세포와 배양된 석영 디스크(a)는 미네랄화된 골 매트릭스의 존재를 나타내는 매우 형광성이다. 반대로, 배지 단독의 존재하에서 석영상으로 코팅된 안정화된 필름(b)은 형광성을 나타내지 않는다. 석회화된 골 매트릭스의 양은 직접적으로 방사되는 측정가능한 형광성에 비례한다. 테트라사이클린은 자연적인 형광물질이다. 세포가 테트라사이클린을 흡수하면, 이것은 대사되고 대사산물이 분비되어 새롭게 형성된 골 매트릭스로 통합된다. 테트라사이클린은 단지 조골세포에 의해 대사될 때에만 형광을 나타낸다. 이것은 조골세포가 안정화된 조성물 상에서 활성적으로 골 매트릭스를 분비함을 제시한다.
졸-겔 수산화인회석 물질이 제조되면, 이것은 다양한 기법으로 원하는 기질에 얇은 필름으로 적용될 것이다. 예를들면, 딥-코팅 방법(C.J. Brinker et al., Fundamentals of Sol-Gel Dip Coating, Thin Solid Films, Vol. 201, No. 1, 97-108, 1991)은 다음과 같은 일련의 과정으로 구성된다. 항속으로 졸 또는 용액으로부터 기질의 회수, 적당한 온도에서 코팅된 액체 필름을 건조 및 최종 세라믹으로 필름을 점화.
스핀-코팅에서 졸-겔은 원심분리 작용에 의해 용액을 균질하게 분포시키기에 충분한 속도로 회전하는 플레이트상으로 적가된다. 그후의 처리는 딥 코팅과 동일하다.
졸-겔의 얇은 필름을 기질에 적용하기 위해서 사용되는 다양한 다른 기법이 있다는 것이 이해된다. 다른 기법으로는 졸-겔의 분무, 졸-겔의 롤러 적용, 졸-겔의 살포 및 졸-겔의 착색을 포함한다.
단일크기의 다른 디스크를 코팅하는 대안은 확장된 기질을 졸-겔의 필름으로 코팅하는 것이다. 기질상의 전체 필름은 그후 소결된다. 석쇠와 같은 장치가 그후 복수의 분리된 시험 존으로 나누기 위해서 필름상으로 적용될 수 있다.
졸-겔 물질 적용의 이러한 다양한 기법에 있어서, 형성된 필름의 두께 및 질(다공성, 미세구조, 결정상태 및 균질성)은 많은 인자에 의해 영향받는다. 이것에는 출발졸의 물리적 특성, 조성 및 농도, 기질표면의 청결, 기질의 회수속도 및 점화온도를 포함한다. 일반적으로 두께는 딥코팅 과정의 경우 주로 회수율 및 졸점도에 달려있다. 졸의 이질성은 대공 및 틈의 형성때문이기 때문에, 코팅 조작은 졸의 특별한 오염을 피하기 위해서 무균실에서 행해져야만 한다. 열처리 단계에서, 요구되는 미세구조 및 수산화인회석의 인산α-삼칼슘으로의 원하는 전환을 발달시키기 위해서 고온이 요구된다.
인산칼슘 필름을 제작하기 위해서 딥코팅 방법의 적용목적은 (a)요구되는 질(균질성, 두께, 다공성 등)을 갖는 필름을 만들기 위해서; 그리고 (b) 생물학적 실험을 위해 투명한 기질상에 반투명 인산칼슘 필름을 만들기 위해서다.
또한 본 발명의 안정화된 인공 조성물은 얇은 필름 및 두꺼운 코팅뿐만 아니라 분말 및 벌크 세라믹의 제조에 적당하다는 것이 발견되었다. 세라믹은 원하는 안정화된 수산화인회석/인산알파삼칼슘 상 혼합물을 생성하기 위해서 실리카의 첨가로 여기에 기술된 졸-겔 방법으로 제조된 소결된 분말로부터 제조된다. 한 구체예에서 소결된 분말은 0.5-1mm 두께의 디스크를 생성하기에 충분한 양으로 미세하게 분쇄된후 동일한 도핑제 조성의 유지되는 졸-겔 물질 한 방울과 혼합하여 함께 입자를 유지하는 것을 돕는 습한 분말을 생성한다. 습한 분말은 약 5 톤/㎠의 압력에서 실험다이로 단축적으로 가압한다. 결과적인 벌크 물질은 양호한 녹색강도를 나타내며 공기중에서 1시간동안 1000℃에서 점화된다. 이러한 세라믹은 얇은 필름, 또는 코팅으로 사용된 안정화된 조성물로서 모두 동일한 특성을 유지한다. SiO2안정화된 조성물의 경우, X-레이 회절은 초기 분말과 최종 세라믹 사이의 상 조성에서 거의 변화가 없었다. 도 8에 제시된 도면의 표면해부는 도 9에 제시한 석영기질상에 코팅된 조성물과 현저하게 유사하다. 얇은 필름과 벌크 세라믹상에서 파골세포의 재흡수능은 매우 유사하다. 파골세포 재흡수는 벌크 세라믹 상에서 재흡수 피트(18)의 존재로서 관찰되며 얇은 필름상에서 증명된 재흡수 피트(18)와 유사하다(도 8 및 9).
본 분야의 숙련가에게 인지된 바와 같이, 큰 세라믹 벌크 조각은 원하는 용도로 사용을 위한 벌크 조각을 형성하기 위해서 세라믹의 형태를 만듬으로써 형성될 수 있다. 제조된 벌크 조각은 원하는 안정화된 인산칼슘 상 조성물뿐만 아니라 골세포 활성을 쉽게하는 미공성 구형 표면형태 및 내부 미공성 구조를 보유한다.
생물학적 용도로 사용하기 위한 세라믹 제조의 특별한 양태는 생물활성을 유도하는 미세한 구형 표면 미공성과 내부 미공성 및 내부 구조물내에 면적 50-1000μm이상의 큰 거대구조의 구멍을 갖는 세라믹 조각의 제작이다. 이것은 생리학적 생체내 뼈 재형성과 매우 유사하게 시스템에서 뼈 재형성을 촉진시킨다. 이 범위의 하한에서 이러한 대공성은 골 매트릭스의 빠른 성장을 원하는 용도에 특히 적합한 반면, 범위의 상한에서 대공성은 세포가 뼈이식의 생체외 조직 공학 제조를 위한 것과 같은 사용을 위한 내부를 평가하는 것을 허용한다. 실리카와 같은 안정화 실재물로 도핑되고 사용전에 소결된 분말을 사용하여, 다공성 세라믹은 원하는 크기의 스티렌 볼과 이러한 분말을 혼합함으로써 제조될 수 있다. 습화된 도핑된 분말을 스티렌 볼로 가압한 후에, 요구되는 압력에서, 스티렌을 약 400℃-600℃의 온도에서 열분해로 제거시킨다. 다공성 세라믹을 그후 상기 기술한 정상 방법으로 1000℃까지 점화시킨다. 이 방법은 외부의 구형 미공구조, 기본적인 내부 미공구조 및 세포가 이동하는 것을 허용하고 전체 벌크 세라믹 단위를 통하여 기능하는 내부 대공구조를 갖는 벌크 세라믹의 형성을 가져온다.
스티렌과 유사한 물질이 세라믹 구조물내에 대공성을 발달시키기 위해서 사용될 수 있다는 것이 본 분야의 숙련가에게 이해될 것이다. 정상 소결 온도이하의 온도에서 열분해할 수 있는 다른 물질이 대공 구조물을 형성하기 위해서 또한 유용하다. 사용되는 물질은 또한 어떤 독성 잔사를 남겨서는 안된다. 다른 방법이 또한 구멍의 기계적 드릴, 레이저의 사용, 거품제의 사용과 같이 거대구조를 형성하기 위해 사용될 수 있다는 것이 이해된다.
본 발명의 중요한 양태는 수산화인회석과 졸-겔 수산화인회석 물질로부터 형성된 도핑된 분말에 의해 생성되는 표면 형태와 거플링되는 인산알파삼칼슘 상의 혼합물이기 때문에, 본 분야의 숙련가는 이 분말로부터 필름, 코팅 및 벌크구조물을 제작하는 다른 방법이 본 발명에 따라 또한 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이것은 플라즈마 또는 열분무 또는 전기영동적 침전과 같은 공지된 기법을 포함한다.
도 10을 참고하여, 단면 TEM 현미경사진은 석영기질 형태로 층구배(a), 소립으로 이루어지는 경계층(b) 및 구형 미공구조를 제공하는 미립에 함입된 작은 결정체로 구성되는 필름의 표면을 포함하는 상층(c)을 도시하고 있다. 소결 과정동안, 규소 실재물은 석영(a)으로 방출되고 수산화인회석을 통해 확산되어 소결된 얇은층을 형성함에 있어서 인산α-삼칼슘으로 전환된다. 경계층(b)은 큰 다결정 미립의 인산칼슘 상을 가지는 표면보다 작은 결정구조물을 갖는다.
인공 소결된 조성물의 형태는 독특하며 이전에 보고되거나 제시되지 않았다. 우리는 이제 상호연결된 구멍의 미공구조를 가지는 둥근 미립의 느슨하게 상호연결된 구형 구조물을 나타내는 표면형태를 발견하였다. 본 발명의 바람직한 양태에 따라서, 형태는 성공적으로 기능적 파골세포 및 조골세포의 배양을 지지한다.
코팅의 표면형태는 산호와 유사한 느슨하게 상호연결된 구형구조물을 포함하는 특징적 형태를 갖는다(도 11). 미립의 크기는 측면치수에서 약 0.5-1 μm로 다양하다. 코팅은 기질근처보다 표면에 가깝게 큰 평면밀도를 가지는 기질에 수직한 방향으로 다공성이다. 이 형태는 코팅내에서 액체배지 및 다른 생리학적 유체의 침투를 허용한다. 반대로, 다른 공침전 방법으로 제조된 수산화인회석의 표면형태는 본 발명에 의해 제공된 바와 같은 미공구조를 가져오지 않는다. 도 12(a) 및 12(b)에 도시한 바와 같이, 안정화 실재물의 부재(a) 및 존재(b)하에서 이렇게 제조된 수산화인회석의 표면형태는 도 11에 도시한 본 조성과 비교하여 미공성이 아니다. 게다가, 합성 다결정 수산화인회석은 파골세포에 의해 재흡수되지 않음이 보고되었다(Shimizu, Bone and Minerology, Vol. 6, 1989).
구형 표면 형태는 뼈형성을 유도하는 과정에서 조골세포에의해 초기에 만들어진 응집축적물에 크기에서 비교할 만한 둥근미립으로 구성된다. 본 조성은 생체내에서 기대되는 세포형태에 화합성인 표면형태를 제공한다. 전형적인 파골세포 재흡수 피트는 도 13에 도시되어 있으며, 여기서 기질은 뼈이다. 도 9에 제시한 바와 같이, 본 인공 조성물상에서 파골세포(20)에 의해 형성되는 재흡수 피트(18)는 도 13의 자연 뼈상에서 도시한 것과 매우 유사하며 이것은 파골세포 기능이 양쪽 시스템에서 유사하다는 것을 제시한다. 이것은 인공 소결된 조성물의 표면형태는 생체내에서 기대되는 세포형태와 화합가능하다는 것을 함축한다.
안정화된 조성물의 벌크 미공성은 인공물질의 표면부근의 칼슘 또는 인산이온 농도가 수산화인회석, 콜라겐 및 다른 섬유조직으로 구성된 자연뼈로 생체내의 세포에 의해 기대되는 한계내에 있다는 것을 보증할 것이다. 재흡수를 유도하는 파골세포 매개 세포외 용해 과정동안, 이 복잡한 물질은 용해생성물의 특별한 국부농도를 유도한다. 충분히 무기 인공 수산화인회석 또는 α-TCP의 용해 또는 재흡수동안, 어떤 세포행동을 제한하는 결과적인 농도는 자연 뼈와 비교가능한 인공표면상에서 활성을 달성하기위한 세포에 대해 좁게 한정되며, 칼슘과 같은 요소의 국부농도수치를 조정하는데 이용할 수 있어야 한다. 이 조성의 다공성은 이것이 배지의 흐름 또는 확산을 통하여 발생하는 것을 허용한다.
본 발명의 안정화된 생물활성적 인공 조성물은 이전에 제시되지 않았던 독특한 표면형태 및 내부미공구조와 함께 독특한 화학조성물을 제공한다. 생체내 및 시험관내에서 일정한 골세포 생물활성을 나타내고 시험관내에서 쉽게, 정확하게 그리고 반복적으로 정량할 수 있는 조성물이 이전에 보고되지 않았다. 안정화된 조성물의 상태는 분말, 얇은 필름, 두꺼운 코팅, 벌크 세라믹 조각 또는 대공성 벌크 세라믹 조각으로 제공될 수 있는 점에서 다용도이다. 각 경우에, 안정화된 인산칼슘상 조성물뿐만 아니라 독특한 표면형태 및 내부 미공성이 유지된다. 도 14에 도시한 바와 같이, 미공표면형태는 본 안정화된 조성물로부터 제조된 벌크 세라믹상에서 유지된다.
본 발명의 안정화된 조성물은 대규모 및 자동화 방법으로 비정상 뼈세포 기능을 특징화하기 위해서 시험관내 진단에 이상적이다. 안정화된 인공 조성물은 또한 조직 재생 및 회복을 촉진하기 위해서 뼈 및 치아이식을 위한 코팅으로서 쉽게 이용할 수 있다. 조성물의 구조는 매우 유사함으로 생체내 뼈조직 및 세포와 화합가능하여 외래물질의 거부문제를 피할수 있는 것이다.
본 조성물은 예를들면 엉덩이 및 관절 치환, 골절 및 치아 이식으로서 생체내 뼈 조직의 재생 및 회복뿐만 아니라 생체내 이식을 제공하기 위한 것같은 다양한 치료적 용도를 위해 사용될 수 있는 것과 같이 생체내 단단한 조직을 갖는 요구되는 물리적 특성 및 친화성/화합성을 갖는다. 이 조성물은 또한 인공적으로 제조된 뼈 물질을 제공하기 위해서 생체외에서 수행되는 다양한 조직공학 용도에 사용될 수 있으며 그후 뼈 조직 치환, 재생 및 회복을 위해 생체내 뼈 이식조직으로 이식될 수 있다. 환자는 조직거부 변화를 줄이기 위해서 조성물상의 배양에 사용되는 파골세포 및 조골세포의 공급을 제공함으로써 충분히 화합성인 뼈 이식조직을 생성할 수 있다. 대안으로, 공여 뼈 세포는 또한 이 목적을 위해 사용될 수 있다. 이러한 조직이식은 뼈 조직을 생성하는데 사용되는 뼈 세포의 부재 또는 존재하에서 조직 치환을 위해 제조될 수 있다. 그러나, 세포 함유 이식조직은 조직 거부와 관련된 문제를 최소화하기 위해서 자가 공여체로부터 온 것이 바람직하다. 분발 형태의 안정화된 조성물은 또한 의학치료를 위해 사용될 수 있다. 안정화된 분말은 조직과 화합성이고 비독성인 중합물질내에서 혼합되고 현탁된 후 뼈 조직내의 공간 충전을 위해 생체내로 적용될 수 있다.
본 발명이 사용될 수 있는 모든 용도는 양쪽 파골세포 및 조골세포가 어떤 형태의 조성물과 활성적으로 기능하여 생체내에서 발견되는 것과 매우 유사한 뼈 조직 시스템을 제공하는 이점이 있다. 본 발명의 인공 생물활성적 조성물이 양쪽 뼈전도 및 재흡수를 촉진하여 정상조직 치유 및 재생이 동시에 정상 뼈 조직 재형성의 과정에서 재흡수될 인공 물질을 허용하면서 발생할 수 있다.
다음 방법들은 안정화된 인산칼슘 실재물을 가지며 또한 골세포 활성을 지지할 수 있는 독특한 형태를 나타내는 생물활성적 인공 소결된 조성물을 제공하기 위한 본 발명의 양태를 예시화한다.
방법 1- 수산화인회석 졸-겔 물질의 제조
다음 방법은 제조 목적을 위한 충분한 졸-겔 수산화인회석의 제조에 기초한다. 용액 A는 칼슘니트레이트 테트라히드레이트로 이루어지고 용액 B는 암모늄디히드로겐오르토포스페이트(일염기성)로 이루어진다. 용액 A를 용액 B와 혼합하여 원하는 졸-겔인 용액 C를 생성한다. 용액 A를 칼슘니트레이트, Ca(NO3)24.722 그램에 이차 증류수 40 ml을 가함으로써 제조한다. 용액을 보통 3분 범위인 충분한 시간동안 적당한 속도로 교반하여 모든 칼슘니트레이트를 용해시킨다. 이 용액에, 3 ml의 수산화암모니아(NH4OH)를 가하고 약 3분간 더 교반한다. 용액의 pH를 검사하는데 약 12의 pH가 바람직하다. 이 용액에 37 ml의 이차증류수를 가하여 약 80 ml의 총용액 부피를 제공한다. 이 용액을 다시 7분간 교반하고 덮개를 씌운다.
용액 B를 NH4H2PO41.382 그램을 함유하는 250 ml 비이커에 이차증류수 60 ml을 가함으로써 제조한다. 비이커에 덮개를 씌우고 NH4H2PO4가 용해될 때까지 3 내지 4분간 적당한 속도로 교반한다. 이 용액에 NH4OH 71 ml을 가한후 비이커에 뚜껑을 씌우고 약 7분간 더 교반을 계속한다. 여기에 다시 이차증류수 61 ml을 가하고 비이커에 덮개를 씌워 약 192 ml의 총용액 부피를 제공한다. 이 용액을 그후 7분간 더 교반하고 덮개를 씌운다.
원하는 졸-겔을 그후 용액 A와 용액 B를 합함으로써 제조한다. 용액 A 모두를 500 ml 시약병으로 도입시킨다. 교반을 적당한 속도로 시작하고 용액 B 192 ml모두가 용액 A로 전달될 때까지 용액 B를 시간당 약 256 ml의 속도로 시약병으로 도입시킨다. 과잉의 용액 B가 이동과정에서 사용되는 250 ml 비이커 또는 어떤 관류에 남아있는 용액을 보충하기 위해서 사용될 수 있다. 이 첨가 및 용액 A와 용액 B의 조합을 종료한 후에, 결과적인 용액을 약 23 내지 24시간동안 적당한 속도에서 교반을 계속하였다. 결과적인 졸-겔을 어떤 비정상 침전 또는 덩어리에 대해 점검한다. 만약 어떤 비정상 침전 또는 덩어리가 발생했다면, 용액을 버리고 침전을 다시 시작해야만 한다. 졸을 그후 오리지날 시약병의 벽에 존재하는 어떤 입자 덩어리의 혼입을 피하기 위해서 다른 500 ml 시약병으로 조심스럽게 옮긴다. 결과적인 졸-겔인 약 240 ml의 용액 C를 원심분리병으로 옮기고 실온에서 약 500 rpm에서 20분간 원심분리한다. 원심분리후에, 180 ml의 상층액을 침전물을 교란하지 않고 버린다. 침전물을 약 30분간 부드러운 회전방식으로 혼합함으로써 부드럽게 재현탁시킨다. 그후 졸-겔의 점도를 측정하고 바람직하게는 20 내지 60 cP이다. 졸-겔을 그후 선택된 기질의 딥코팅 또는 다른 용도를 위해 준비시킨다.
방법 2-실리카 도핑된 수산화인회석 물질의 제조
실리카 용액을 다음과 같이 제조한다. 결정된 양이 약 0.168 g SiO2/4 ml 용액을 생성한다. 4 ml의 실리카 용액을 방법 1에서 생성한 60 ml의 원심분리한 수산화인회석 졸-겔 물질에 가하고 전환반응에서 생성된 0.168 g CaO와 반응시킨다.
실리카 용액 성분
테트라프로필 오르토실리케이트 Si(OC3H7)47.32 gm
2-메톡시에탄올 CH3OCH2CH2OH 34.5 gm
실리카 용액을 SiO2의 농도가 소결동안 전환상에서 제조된 SiO21M/1몰 CaO의 비율이 되도록 방법 1에 의해 제조한 수산화인회석 물질에 가한다.
방법 3-얇은 필름 포맷의 제조
기질상태에 따라, 얇은 필름의 제조는 수산화인회석 졸-겔 물질의 제조를 위해 방법 1 또는 방법 2를 사용할 수 있다. 기질이 소결된 필름내에서 필요한 안정화 실재물의 이용성에 기여한다면 방법 1이 채택될 수 있다. 기질이 이러한 안정화 실재물의 이용성을 제공하지 않는다면 도핑제로 방법 2가 요구된다.
필름을 기질에 적용하기 전에, 기질을 만족스러운 필름 적용범위를 보장하기 위해서 완전히 깨끗하게 하는 것이 필요하다. 석영 기질의 경우에, 클리닝은 디스크를 유리 비이커에 놓고 크롬산 클리닝 용액을 유리 비이커로 공급하고 디스크를 모두 덮음으로써 달성된다. 이 비이커에 그후 덮개를 씌운다. 디스크를 그후 1시간동안 수욕에서 초음파처리 한다. 산을 20분간 수돗물을 사용하여 씻어낸다. 남아있는 수돗물을 이차증류수로 3번 교환함으로써 제거한다. 이차증류수로 최종 교환후에, 모든 단일 디스크를 보풀 없는 수건으로 건조시키고 석영 표면에 흠에 대해 점검한다. 표면상의 어떤 잔여 미립자를 압축 질소 또는 공기로 필요한 만큼 제거시킨다. 디스크를 무균환경에서 덮개가 있는 트레이에 저장시킨다. 이 방법을 어떤 유형의 석영 기질을 클리닝하기 위해서 사용할수 있다.
석영 디스크 기질 또는 적당한 조성을 가지는 다른 기질을 방법 1에서 제조한 졸-겔에 담근다. 디스크를 표면에 접촉하는 것을 피하기 위해서 가장자리에서 잡는다. 디스크를 바람직하게는 기계로 졸에 담근다. 디스크를 전술한 회수 점도로 졸로부터 제거시킨다. 디스크의 한면에서 코팅을 제거한다. 코팅된 기질을 그후 무균 페트리디쉬에 놓고 실온에서 건조시킨다. 소결전에 형성된 필름을 틈, 덩어리 또는 공극없이 균일하게 한다. 디스크면에 적용되는 딥코팅방법이 또한 석영의 납작한 직사각형 형태의 기질과 같은 어떤 다른 형태의 기질에 적용될 수 있다.
방법 4-건조 수산화인회석 분말의 제조
방법 1 또는 2에 의해 제조한 졸-겔 물질을 약 8시간동안 100℃에서 건조시킨다. 건조된 물질을 그후 막자사발과 막자 또는 분쇄할 수 있는 어떤 다른 기작을 사용하여 분쇄하여 미세한 분말을 생성한다. 그후 분말을 도가니에서 소결한후 다시 냉각한후에 분쇄하는 것을 제외하고 분말은 방법 7에서 기술한 표준소결방법에 따라 소결될 수 있다. 동일한 방법이 도핑된 또는 안정화된 수산화인회석의 제조에 따를 수 있다.
방법 5-벌크 세라믹 조각의 생산
세라믹(삼차원 벌크 조각)을 다음과 같이 실리카 도핑된 수산화인회석 분말로부터 생성하였다. 도핑된 졸-겔 물질을 방법 2에 따라 제조하였다. 졸-겔 물질의 일부를 저장하고 나머지를 여과하였다. 분말을 120℃에서 건조시키고 분쇄하여 미세 분말을 생성하였다. 약 0.09 gm의 분말을 플라스틱 디쉬에 놓았다. 유리 점적기를 초기 졸-겔 물질의 방울을 형성하기 위해서 사용하였고, 이것은 분말과 혼합되었을 때 약 0.055 gm이 되었다. 졸을 분말과 혼합하여 습한 그러나 젖지 않은 페이스트를 형성하였다. 습한 페이스를 직경 6.25 mm의 스테인레스강 다이로 팩킹하고 1분간 2 메트릭 톤에서 가압하였다. 벌크 조각을 압축으로부터 제거하고, 공기 건조시키고 방법 7에 따라 덮개가 있는 알루미나 도가니에서 점화시켰다. 표면 형태가 도 14에 도시한 바와 같이 인공 소결된 얇은 필름과 매우 유사하였다.
방법 6-거대구조의 구멍을 가지는 벌크 세라믹 조각의 제조
방법 2에서와 같이 실리카와 같은 안정화 실재물로 도핑되고 1000℃에서 소결된 수산화인회석 제조된 분말을 원하는 크기의 스티렌 볼과 혼합하고, 분말을 추가 졸-겔 물질로 습기화하고, 스티렌이 배제되지 않도록 약 1 톤/㎤의 압력에서 가압시킨다. 강화된 녹색 강도는 유지되는 졸과 2.5wt% 용액의 폴리비닐알코올의 습한 혼합물을 사용하여 이렇게 가압된 분말/스티렌 콤펙트로 달성된다. 스티렌을 공기 또는 산소에서 550℃까지 가열함으로써 열분해에 의해 제거한다. 거대공 세라믹을 그후 방법 7의 정상 소결에 대해 기술된 방법으로 1000℃까지 점화시킨다.
방법 7-수산화인회석 물질의 소결
다음과 같은 소결공정을 Lindberg models 51744 또는 894-Blue M과 같은 특히 800℃와 1100℃사이의 정확하고 적당한 내부 온도를 유지하기 위해 고안되고 주변온도에서 적어도 1100℃까지의 온도에서 작동할 수 있는 다양한 크기의 표준실험 용광로에서 수행할 수 있다. 방법 3,4,5 또는 6에 의해 제조된 성분을 조심스럽게 표준 세라믹 플레이트로 옮겼다(Lindberg oven에서 일반적 실습임). 세라믹 플레이트를 용광로로부터 다수 기질의 로딩 및 회수를 쉽게 하기 위해서 소결과정동안 보조제로서 사용된다. 용광로 온도를 원하는 비율의 HA:α-TCP를 달성하기 위해 요구되는 온도로 설정한다. Lindberg 모델 894-Blue M과 같은 프로그램할수 있는 용광로를 이용하여, 용광로를 원하는 온도를 보유하기 위하여 프로그램할 수 있는데, 이것은 수산화인회석과 인산α-삼칼슘의 발달된 구배층을 통하여 규소 실재물의 원하는 확산을 보장하기 위해서 최대 1시간동안 보통 920℃ 내지 1100℃의 범위로 선택될 것이다. 프로그램할 수 없는 용광로의 경우에, 분리 타이머를 작동자가 선택된 온도에서 요구되는 소결시간의 끝에 용광로를 끄는 것을 경고하기 위해서 사용될 수 있다. 소결 기질을 수반하는 세라믹 플레이트를 내부 용광로 온도를 약 60℃의 허용가능하고 안전한 접촉온도로 냉각시킨후 어느때 제거시킨다. 각 기질을 그후 최종 사용을 위해 저장하거나 포장할 수 있다.
이 방법에 따라서, 수산화인회석/인산α-삼칼슘의 얇은 필름 및 두꺼운 코팅을 다양한 공정 매개변수의 다양성이 이러한 일치성을 보장하기 위해서 최소화된 원하는 조성물을 가지는 일관된 기초상으로 제조할 수 있다.
비록 본 발명의 바람직한 구체예가 상세히 여기에 기술되었지만, 변형이 본 발명의 정신 또는 첨부된 청구범위의 영역을 벗어남이 없이 만들어 질 수 있다는 것이 본 분야의 숙련가에게 이해될 것이다.

Claims (36)

  1. 골세포 활성을 일관되게 지지할수 있는 형태를 제공하기 위한 생물활성적 인공 소결된 조성물에 있어서, 소결 온도에서 안정화 실재물의 존재하에서 수산화인회석 물질을 불용성화되고 안정화된 인산삼칼슘으로 전환시킴으로써 발달된 안정화된 인산칼슘 상으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 안정화된 인산삼칼슘은 주로 인산알파삼칼슘인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 조성물은 분말, 필름, 두꺼운 코팅 또는 삼차원 벌크물질의 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 필름은 약 0.1 μm 내지 10 μm의 두께를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 수산화인회석 물질은 소결전에 규소 실재물, 알루미늄 실재물, 지르코늄 실재물, 바륨 실재물, 티타늄 실재물 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 성분으로 이루어지는 기질에 제공되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 안정화 실재물은 소결동안 상기 기질로부터 방출되거나 또는 소결전에 수산화인회석 물질에 용액으로 첨가되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 3 항, 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 상기 안정화 실재물은 규소, 게르마늄, 크롬, 바나듐, 니오븀, 티타늄, 붕소, 알루미늄, 지르코늄 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 2 항에 있어서, 상기 조성물은 석영 기질에 코팅되고, 규소 실재물이 소결시 석영으로부터, 형성되는 인산칼슘 상으로 방출되어 인산알파삼칼슘을 안정화시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 3 항에 있어서, 상기 규소 실재물은 소결전에 수산화인회석 물질에 용액으로 첨가되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 1 항 또는 제 9 항에 있어서, 상기 규소 실재물은 테트라프로필 오르토실리케이트인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 인산칼슘 상은 수산화인회석 대 인산알파삼칼슘이 50:50 내지 20:80의 비율인 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 약 6.4 내지 7.3의 pH 생리학적 유체에서 불용성인 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 골세포 활성을 지지하기에 적당한 형태를 가지는 인산칼슘 상의 인공 소결된 조성물을 안정화시키는 방법에 있어서, 수산화인회석 물질을 소결에 의해 주로 인산알파삼칼슘으로 전환시키고, 인산염 상내에서 형성된 인산알파삼칼슘을 안정화하고 불용성화시키는 안정화 실재물을 제공하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 형성된 조성물은 분말, 필름, 코팅 또는 삼차원 고체인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 수산화인회석 물질은 규소 실재물, 알루미늄 실재물, 지르코늄 실재물, 티타늄 실재물, 붕소 실재물, 게르마늄 실재물, 크롬 실재물, 바나듐 실재물, 니오븀 실재물 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 성분으로 이루어지는 기질에 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 안정화 실재물은 상기 기질로부터 소결동안 발달된 수산화인회석 상으로 방출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 14 항 또는 제 16 항에 있어서, 상기 안정화 실재물은 규소, 알루미늄, 지르코늄, 티타늄, 붕소, 게르마늄, 크롬, 바나듐, 니오븀 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 수산화인회석 물질은 석영 기질에 적용되고, 규소 실재물이 소결동안 석영으로부터, 형성되는 인산칼슘상으로 방출되어 인산알파삼칼슘을 안정화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 13 항에 있어서, 규소 실재물은 소결전에 수산화인회석 물질에 용액으로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 13 항 또는 제 19 항에 있어서, 상기 규소 실재물은 테트라프로필 오르토실리케이트인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 13 항에 있어서, 상기 인산칼슘 상은 수산화인회석 대 인산알파삼칼슘의 비율이 50:50 내지 20:80인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 13 항에 있어서, 수산화인회석 물질의 소결은 약 900℃ 내지 1100℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 골세포 활성을 지지하기 위한 소결된 인공 미공성 다결정구조물에 있어서, 상기 구조물내에 상호연결된 미공을 가지는 느슨하게 상호연결된 둥근미립의 구형 표면 형태를 가지는 소결된 안정화된 인산칼슘 상으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 구조물.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 구조물은 도 10의 상기 구형 표면 형태를 가지는 것을 특징으로 하는 다결정구조물.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 둥근 미립은 0.5 내지 1 μm 범위의 측면치수를 가지는 것을 특징으로 하는 다결정구조물.
  26. a) 골 매트릭스를 지지하기 위한 구조물;
    b) 소결 온도에서 인산칼슘 상을 불용성화하고 안정화시키는 안정화 실재물의 존재하에서 수산화인회석 물질을 인산삼칼슘으로 전환시킴으로써 발달된 안정화된 인산칼슘 상의 층;
    c) 안정화된 인산칼슘 상의 상기 층에서 배양된 조골세포에 의해 축적된 경계층; 및
    d) 이러한 배양된 조골세포에 의해 분비되는 미네랄화 콜라겐성 매트릭스로 이루어지는 것을 특징으로 하는 이식용 석회화된 골 매트릭스.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 매트릭스는 조골세포를 포함하여 골세포가 없는 것을 특징으로 하는 이식용 석회화된 골 매트릭스.
  28. 제 26 항에 있어서, 상기 매트릭스는 조골세포를 포함하여 환자 골세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 이식용 석회화된 골 매트릭스.
  29. 제 26 항에 있어서, 상기 매트릭스는 파골세포에 의해 재흡수될 수 있는 것을 특징으로 하는 이식용 석회화된 골 매트릭스.
  30. 제 1 항 또는 제 2 항의 조성물로 제조된 벌크 세라믹 미공성 구조물.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 구조물은 내부 대공성을 가지는 것을 특징으로 하는 벌크 세라믹 미공성 구조물.
  32. 제 1 항 또는 제 2 항의 소결된 조성물로 코팅된 이식용 장치.
  33. 본질적으로 제 1 항의 조성물로 구성되는 이식용 장치.
  34. 기능성 골세포를 배양하기 위한 방법에 있어서,
    -생리학적 배지중의 골세포의 현탁액을 안정화되고 불용성화된 인산알파삼칼슘 착체로 이루어진 기질상의 안정화된 인산칼슘 상의 인공 소결된 필름에 적용시키는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 골세포의 활성을 모니터하고 정량하기 위한 키트에 있어서,
    -안정화되고 불용성화된 인산알파삼칼슘을 함유하는 인산칼슘 상의 소결된 필름을 가지는 기질
    -상기 기질에 부착된 멀티웰 골세포 배양 장치로 이루어지는 것을 특징으로 하는 키트.
  36. 미네랄화된 콜라겐성 매트릭스의 생체외 공학을 위한 방법에 있어서,
    -상호연결된 미공을 가지는 느슨하게 상호연결된 둥근 미립의 구형 표면 형태를 가지는 인공 안정화된 조성물을 제공하는 단계,
    -생리학적 배지중의 조골세포 현탁액을 조성물에 적용시키는 단계,
    - 배양으로부터 조골세포에 의해 선택된 미네랄화된 콜라겐성 골 매트릭스를 배양하는 단계 및
    -분리한 콜라겐성 골 매트릭스를 환자에게 이식하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
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