DE19825419C2 - Verfahren zur Herstellung eines hochporösen Knochenersatzmaterials sowie dessen Verwendung - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines hochporösen Knochenersatzmaterials sowie dessen Verwendung.

Durch die Porenstruktur, die damit gegebene hohe, innere Oberfläche und durch die mögliche Variation des Feststoffgehaltes sind auch Anwendungen als Katalysator oder Katalysatorträger möglich.

In der Patentliteratur werden eine Vielzahl von porösen Keramiken als Knochenersatz beschrieben. Im Patent (US 5 133 756; 1992) wird die Keramik aus Rinderknochen hergestellt. Die gesamte, organische Matrix wird entfernt, und der keramische Anteil wird bei Temperaturen von 1100°C bis 1500°C getempert.

Ein anderes Verfahren (US 4 861 733; 1989) geht vom Gerüst natürlicher Korallen aus und wandelt das Kalziumcarbonat in einem hydrothermalen Prozeß in Kalziumphosphat um. Der Vorteil dieser Verfahren ist, daß die Porenstruktur (Größenverteilung, Morphologie) ideal zum Einwachsen des Knochengewebes ist.

Der entscheidende Nachteil dieser Keramiken ist, daß sie nicht resorbierbar sind. Gebildeter Knochen unterliegt einem ständigen Umbau, auch als Remodeling bezeichnet, wobei Osteoklasten den Knochen abbauen und die Osteoblasten ihn wieder aufbauen. Für die beschriebenen Materialien bedeutet das, daß das Knochengewebe zwar ausgezeichnet in die Porenstruktur hinein wächst. Der hochkristalline Hydroxylapatit der Keramik ist jedoch nicht am Knochenremodeling beteiligt. Er bleibt daher ein Fremdkörper und beeinflußt die mechanischen Eigenschaften. Insbesondere beim Knochenwachstum kommt es zu Entzündungen im Übergang vom Gewebe zur Keramik.

Poröses Hydroxylapatit oder poröse, auf Hydroxylapatit basierende Keramiken sind eigentlich ein idealer Knochenersatz, da sie durch eine spezielle Oberflächencharakteristik osteoinduktiv sein können. Das bedeutet, daß diese Materialien eine Knochenbildung induzieren können, wenn sie unter die Haut oder in Muskelgewebe implantiert werden, auch wenn keine osteoinduktiven Proteine eingebaut sind. Diese Eigenschaft wird besonders erreicht, wenn die Keramik ein Gemisch von Hydroxylapatit und resorbierbaren Kalziumphosphaten ist. Patent US 4654314; 1987 gibt einen weiten Zusammensetzungsbereich mit 10 bis 90 Gew.-% Hydroxylapatit und 90% bis 10% resorbierbarem Kalziumphosphat an. Als resorbierbares Kalziumphosphat wird β-Trikalziumphosphat verwendet.

Auch bei dieser Keramik wird eine Porenstruktur im Bereich von 300 bis 700 µm bevorzugt. Um die günstige Porenstruktur in der Keramik zu erzeugen, wird ein Verfahren angewandt, das durch Aufschäumen von Eiweiß, anschließendem Mischen mit keramischem Pulver (Hydroxylapatit-Trikalziumphosphat-Gemisch) und einer Temperaturbehandlung, die ein Härten des Eiweißes und eine anschließende Karbonisierung einschließt, gekennzeichnet ist. Ein Oxidieren des Kohlenstoffs und eine Sinterung des Kalziumphosphats komplettiert den Herstellungprozeß.

Wird dem Kalziumphosphat ein sublimierbares Material bestimmter Körnung zugesetzt, so ist auch eine definierte Porenstruktur zu erreichen (US 4 654 314; 1987).

Organische Fasern mit einem Durchmesser von 1-30 µm, die im Verlauf des Prozesses zersetzt werden, erzeugen für das Einwachsen des Knochengewebes günstige Strukturen (US 4 654 314; 1987).

Auch im Patent DE 34 25 182 C2 wird zur Erzeugung von Porenstrukturen eine aufschäumbare, organische Substanz verwendet, die in folgenden Schritten karbonisiert und durch eine Temperaturbehandlung in einer sauerstoffhaltigen Atmosphäre entfernt wird. Das Kalziumphosphatgerüst erhält bei solchen Verfahren immer durch eine Hochtemperatursinterung seine Festigkeit.

Als Knochensubstitution wird auch ein Kollagenvlies mit mineralischen Bestandteilen angegeben (US 4516276).

Zur Entwicklung einer resorbierbaren Keramik wurde der Einfluß verschiedener Kalziumphosphate und Kombinationen von Kalziumphosphaten auf die Entwicklung von Osteoblasten in vitro untersucht.

Sun et al. (Sun, J. S.; Tsuang, Y. H.; Liao, C. J.; Liu, H. C.; Hang, Y. S.; Lin, F. H.: "The effects of calcium phosphate particles on the growth of osteoblasts J. Biomed. Mater Res.", 1997., 37 (3) 324-334) stellt dabei fest, daß eine Kombination von Hydroxylapatit und Beta- Trikalziumphosphat eine hemmende Wirkung auf das Wachstum der Osteoblasten hat (im Widerspruch zu den Ergebnissen von US 4 654 314; 1987).

Auch wird der Einfluß verschiedener, resorbierbarer Keramiken, wie z. B. CaNaPO₄, CaNaPO₄ + MgNaPO₄, CaNaPO₄ + Mg₂SiO₄ u. a. auf das Wachstum der Osteoblasten in vitro untersucht (Knabe, C.; Gildenhaar, R.; Berger, G.; Ostapowicz, W.; Fitzner, R.; Radlanski, R. J.; Gross, U.: "Morphological evaluation of osteoblasts cultured on different calcium phosphate ceramics, Biomaterials", 1997, 18 (20) 1339-1347).

Die beste Unterstützung des Wachstums der Osteoblasten wurde bei CaNaPO₄ + MgNaPO₄ und bei Ca₂KNa(PO₄)₂ gefunden. Werden von der Keramik zuviele Ca-Ionen abgegeben, wird das Zellwachstum gehemmt.

Um den Prozeß des Knochenremodeling unter Einbeziehung des Knochenersatzmaterials zu optimieren, besteht die Aufgabe, die mineralische Phase des Knochenersatzmaterials der des natürlichen Knochens anzupassen und gleichzeitig eine optimale Porenstruktur zu schaffen. Der Mineralgehalt des gesunden Knochens beträgt ca. 65 Gew.-%. Der organische Anteil liegt bei 25 Gew.-%. Der Rest ist absorbiertes Wasser.

Die mineralische Phase des Knochens wird im allgemeinen mit Hydroxylapatit beschrieben (Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂). Biologischer Apatit unterscheidet sich jedoch von dem "puren" Hydroxylapatit in der Stöchiometrie, der Zusammensetzung, und insbesondere spielt der Grad der Kristallinität (Kristallitgröße, Gitterdefekte) eine wichtige Rolle. Hierdurch unterscheidet sich der biologische Apatit in vielen physikalischen und chemischen Eigenschaften von der reinen, kristallinen Phase.

Hervorzuheben ist die Substitution von PO₄ ^3- durch CO₃ ^2- und die Substitution von Ca²⁺ durch Mg²⁺ im biologischen Apatit, wodurch "Unordnung" in die Kristallstruktur gelangt und damit verschiedene Eigenschaften determiniert werden.

Für die Mineralresorption beim Remodeling, die durch Osteoklasten erfolgt, sind aus physikalisch-chemischer Sicht die Löslichkeitseigenschaften sehr interessant.

Zahnschmelz-Apatit ist viel weniger löslich als Dentin, was wiederum eine geringere Löslichkeit als der biologische Apatit des Knochens besitzt. Keramisches Hydroxylapatit hat eine noch geringere Löslichkeit.

Die Löslichkeit des Apatites steht im direkten Verhältnis zum Ordnungsgrad der Kristalle (Hench, L.; Wilson, J.: "An introduction to bioceramics. Singapore: World Scientific" (1993)).

Der biologische Apatit des Knochens ist durch sehr kleine Kristallitgrößen gekennzeichnet. Im allgemeinen werden plättchenförmige Kristallite mit Abmessungen von ca. 25 nm × (2,5-5,0) nm (Richtung der kristallographischen a-Achse × Richtung der kristallographischen c- Achse) beschrieben (Moradian-Oldak, J.; Weiner, S.; Addadi, L.; Landis, W. J.; Traub, W.: "Electron imaging and diffraction study of individual crystals of bone, mineralized tendon and synthetic carbonate apatite; Connect Tissue Res.", 1991, 25 (3-4) 219-228).

Biologischer Apatit ist durch einen hohen Grad an Kristalldefekten gekennzeichnet.

Bei einer Wärmebehandlung von ca. 700°C beginnt der biologische Apatit des Knochens an zu rekristallisieren und zu sintern. Es entsteht reiner, kristalliner Hydroxylapatit (hoher Ordnung) und CaO (Hench, L.; Wilson: "J. An introduction to bioceramics. Singapore: World Scientific" (1993)).

Soll die mineralische Phase der Knochenersatzkeramik der des natürlichen Knochens angepaßt werden, entfallen dementsprechend Sinterprozesse, wie sie bei den meisten Verfahren üblich sind.

Sol-Gel-Verfahren werden ebenfalls zur Herstellung von Knochenersatzmaterialien genutzt. Üblich ist es über solche Verfahren, Glaskeramiken herzustellen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass kristalline Kalziumphosphatphasen in einer Glasmatrix eingeschlossen sind. In der WO 91/17965 A2 wird z. B. SiO₂ im Bereich von 60 bis 86 Gew.-% als Glasbildner genutzt.

In JP 02184563 A wird ein Sol-Gel-Verfahren dazu verwendet, eine dichte Aluminiumoxidkeramik herzustellen, die von porösem Hydroxylapatit umgeben ist.

Sol-Gel-Verfahren finden auch bei der Herstellung von Keramiken, die nicht als Knochenersatz genutzt werden sollen, Verwendung.

SiO₂- oder -Al₂O₃-Alkoxide werden als Bindemittel zur Herstellung von Grünkörpern für die Produktion von feuerfesten Formkörpern oder Keramiken genutzt (siehe z. B. EP 0297827 A2). Die Struktur des fertigen Materials wird durch den Brennprozess und damit durch das Sintern der Hauptbestandteile erreicht. Eine hohe Porosität ist nicht erwünscht.

Ein Verfahren zur Herstellung eines porösen Siliziummonoxid-Formkörpers wird im Patent DE 195 14 254 C1 beschrieben. Hierbei wird Siliziumpulver und Siliziumdioxidpulver mit einem wässrigen, ammoniakalischen Kieselsol vermischt, sodass ein Si : O-Verhältnis von 1 : 1 entsteht. Durch Änderung des pH-Wertes setzt eine Gelbildung ein, die zu einem räumlich vernetzten Gel führt. Das feuchte Gel mit dem Pulver wird bevorzugt bei Raumtemperatur getrocknet. Es wird ein poröser Formkörper erhalten, der ohne thermische Nachbehandlung bei hohen Temperaturen herstellbar ist. Ziel des Verfahrens ist die Herstellung von Ausgangsmaterial zum Aufdampfen von Siliziummonoxidschichten.

Der vorliegenden Erfindung liegt demgegenüber die Aufgabe zugrunde, ein hochporöses Knochenersatzmaterial herzustellen, in dem sich in vivo und auch bei Bedarf schon in vitro Knochengewebe bildet und das vollständig resorbierbar ist, d. h. das den Remodelierungs­ prozeß unterstützt. Es besteht die Aufgabe, den Feststoffgehalt zu minimieren und die Porenstruktur dem Prozeß des Knochenremodelings anzupassen.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Hestellung hochporösen Knochenersatzmaterials gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, daß Kalziumphosphatpulver oder -granulat, das durch die verwendete Komponente, die Korngrößenverteilung, die Morphologie, den Kristallinitätsgrad und vorhandene Gitterdefekte variierbar ist, mit einem Sol eines oder mehrerer Oxide des Elementes X (X = Al, Ca, Mg, P, Si, Ti, Zr) möglichst homogen vermischt in beliebige Formen gebracht wird und durch die einsetzende Gelbildung fixiert wird.

Die Gelbildung des Sols wird durch Katalysatoren, den pH-Wert o. ä. so gesteuert, daß sie möglichst schnell nach der Verteilung des Pulvers (oder Granulats) erfolgt. Wird ein molekularer Precursor verwendet, wie z. B. Alkoxide des Elementes X, so ist natürlich durch Zugabe einer genügenden Menge Wasser für eine Hydrolyse zu sorgen.

Bevorzugt werden alle Parameter (Katalysator, gegebenenfalls Wasser für die Hydrolyse, pH- Wert u. ä.) für eine schnelle Gelbildung vor dem Zumischen des Pulvers oder Granulats eingestellt, so daß das Pulver oder Granulat in ein instabiles Sol gemischt wird. Die Reihenfolge ist aber nicht zwingend.

Als Lösungsmittel werden bevorzugt H₂O, Alkohole oder Mischungen dieser Substanzen, bevorzugt ein Ethanol-Wasser Gemisch, verwendet.

Beim Trocknen des Pulver(oder Granulat)-Gel-Gemisches kommt es zur Schrumpfung des Formkörpers, deren Grad von verschiedenen Parametern abhängt, wie es in der Abb. 1 dargestellt ist. Die Schrumpfung kann durch eine entsprechende Wahl des Verhältnisses von Lösungsmittel, Pulver (oder Granulat) und Gelprecursor auf einen Wert unter 10% reduziert werden.

Das Entweichen des Lösungsmittels beim Trocknen, das die beschriebene Schrumpfung des Formkörpers zur Folge hat, bewirkt außerdem die Bildung von Poren, die durch die Wahl der Pulverkörnung (Granulat) und durch die Wahl des Verhältnisses von Pulver (Granulat) zu Lösungsmittel und Gelprecursor beeinflußt werden kann.

Diese durch die Gelbildung und den Trocknungsprozeß systematisch erzeugte Porosität, die durch Poren im Bereich von einigen Nanometern bis in den Bereich von einigen 100 µm gekennzeichnet ist, ist die entscheidende Eigenschaft für die Anwendung des Materials.

Das Feststoffgerüst des Gels verbindet die Körner des Pulvers, wobei der Feststoffgehalt des Gels (bzw. des Sols) einen bestimmten Wert nicht unterschreiten darf, da sonst der Formkörper brüchig wird.

Eine Temperaturbehandlung bei bevorzugt 200°C, die bevorzugt 2 h dauert und bevorzugt durch ein vorsichtiges Aufheizen mit 1 K/min eingeleitet wird, vervollständigt den Trocknungsprozeß.

Durch diesen Herstellungsprozeß entsteht ein hochporöser, stabiler Formkörper mit einer Porosität bis 70 Vol% und einer Porengrößenverteilung von einigen nm bis zu 100 µm.

Eine Temperaturbehandlung, bei der die Morphologie, der Kristallinitätsgrad, Gitterdefekte o. ä. geändert werden, ist nicht erforderlich. Dadurch können diese Parameter auf die Funktion insbesondere auf eine Unterstützung des Knochenremodelings abgestimmt werden.

Eine zweite Porenstruktur im Größenbereich von einigen hundert µm bis in den mm-Bereich, die ein Einwachsen von Blutgefäßen ermöglichen sollen, werden in dem Formkörper erzeugt, indem dem Sol zusätzlich Pulver mit einer Korngröße in der später gewünschten Porengröße zugegeben werden, die nach der Gelbildung oder nach dem Trocknungsprozeß herausgelöst werden.

Bevorzugt werden durchgehend Poren (Kanäle) erzeugt, indem Fasern des gewünschten Durchmessers in das Sol eingebracht werden, die nach der Gelbildung oder nach dem Trocknungsprozeß herausgelöst werden.

Beispiel 1

20 ml Tetraethoxysilan werden unter Rühren mit 2 ml Ethanol (70%-ig) vermischt. Anschließend werden 5 ml Wasser zugegeben und 0,15 ml konz. Salzsäure zugetropft. Nach der Hydrolyse wird dieser Ansatz mittels Phosphatpuffer auf einen pH-Wert um 6 eingestellt.

Unter Rühren wird diesem Ansatz ca. 25 g Hydroxylapatit zugegeben.

Nach der Gelbildung wird mittels Phosphatpuffer ein pH-Wert um 7 eingestellt.

Die Proben werden an der Luft getrocknet, später bei 200°C (Aufheizrate: 1 K/min; Dauer: 3 Stunden) getrocknet.

Das Material wird 2 h bei 200°C sterilisiert, unter sterilen Bedingungen mit einer humanen Osteoblasten-Zellösung benetzt und mit sterilem Medium bedeckt. Nach einer Kulturdauer von 10 Tagen wird die Probe mit Glutaraldehyd fixiert, mit isotonischer Kochsalzlösung gespült. Es folgt ein Lösungsmittelaustausch mit Aceton und eine Trocknung bei 150°C (Dauer: 2 h).

Das Material weist eine geringe Porosität und Porengrößen im Bereich von 1-10 µm auf. Die Osteoblastenzellen bleiben auf der Materialoberfläche haften, aterieren und bilden zytoplasmatische Ausläufer. Die Abb. 2 zeigt eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme des Materials mit humanen Osteoblasten.

Beispiel 2

5 ml Tetraethoxysilan werden unter Rühren mit 13 ml absolutem Ethanol vermischt. Anschließend werden 1,5 ml 0,1 N Salzsäure zugetropft. Nach der Hydrolyse wird dieser Ansatz mittels Phosphatpuffer auf einen pH-Wert um 6 eingestellt.

Unter Rühren wird diesem Ansatz 20 g Hydroxylapatit zugegeben.

Nach der Gelbildung wird dieser Ansatz mittels Phosphatpuffer auf einen pH-Wert um 7 eingestellt.

Die Proben werden an der Luft vorgetrocknet, später bei 200°C (Aufheizrate: 1 K/min; Dauer: 3 Stunden) getrocknet.

Das Material wird 2 h bei 200°C sterilisiert, unter sterilen Bedingungen mit einer humanen Osteoblasten-Zellösung benetzt und mit sterilem Medium bedeckt. Nach einer Kulturdauer von 10 Tagen wird die Probe mit Glutaraldehyd fixiert, mit isotonischer Kochsalzlösung gespült. Es folgt ein Lösungsmittelaustausch mit Aceton und eine Trocknung bei 150°C (Dauer: 2 h).

Das Material weist eine große Porosität und Porengrößen im Bereich von 2-25 µm auf. Die Osteoblastenzellen werden vom Material zunächst aufgesogen, bilden später zytoplasmatische Ausläufer, die sich an der Oberfläche nachweisen lassen. Die Abb. 3 zeigt eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme des Materials mit humanen Osteoblasten.

Claims (6)

1. Verfahren zur Herstellung eines hochporösen Knochenersatzmaterials mit folgenden Schritten:

• a) ein Kalziumphosphatpulver oder -granulat, das durch seine chemische Zusammensetzung, Körnigkeit, Morphologie, den Kristallinitätsgrad und vorhandene Gitterdefekte variierbar ist, wird mit einem Sol eines oder mehrerer Oxide des Elementes X (X = Al, Ca, Mg, P, Si, Ti, Zr) oder eines Precursors des Elementes X möglichst homogen vermischt, wobei
  • 1. als Lösungsmittel für das Sol Wasser, Alkohole oder ein Gemisch davon verwendet wird;
  • 2. auf 1 ml Sol 0,2 g bis 12 g Pulver oder Granulat gegeben werden;
  • 3. der Feststoffgehalt des Sols (Oxid) im molaren Verhältnis zum Lösungsmittel des Sols im Bereich von 1 : 4 bis 1 : 30 gewählt wird;
• b) die Mischung wird in beliebige Formen gebracht und durch einsetzende Gelbildung fixiert;
• c) das feuchte Gel mit dem enthaltenen Pulver oder Granulat wird bei Raumtemperatur getrocknet, bis ca. 90% des Lösungsmittels entwichen sind;
• d) anschließend wird eine Temperaturbehandlung bei 200°C mit einer Aufheizgeschwindigkeit von 1 K/min durchgeführt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem als Gelprecursor Alkoxide, bevorzugt mit Ethylgruppen, verwendet werden, wobei ein Molverhältnis von Wasser zu Alkoxid von 4 bis 10 : 1 und ein Molverhältnis von Alkohol, bevorzugt Ethanol, zu Alkoxid zwischen 0 und 20 : 1 gewählt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem der Ausgangsmischung ein weiteres Pulver, das nur in einem Lösungsmittel löslich ist, das weder das Kalziumphosphatpulver oder -granulat noch das oder die Oxid(e) des Sols löst, zugegeben wird, und das weitere Pulver nach dem Gelbildungsprozess oder nach der Trocknung herausgelöst wird, um eine zweite Porenstruktur im Größenbereich von einigen hundert µm bis in den mm-Bereich zu erreichen.

4. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, bei dem in das Sol Fäden oder Fasern, die nur in einem Lösungsmittel löslich sind, das weder das Kalziumphosphatpulver oder -granulat noch das oder die Oxid(e) des Sols löst, eingebracht werden, und die Fäden oder Fasern nach dem Gelbildungsprozess oder nach der Trocknung herausgelöst werden, um durchgehende Kanäle im Formkörper zu erreichen.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem als Kalziumphosphatpulver oder -granulat Hydroxylapatit, der in den Strukturparametern dem biologischen Apatit der humanen Knochenspongiosa angepaßt ist, ausgewählt wird.

6. Verwendung des nach einem der Ansprüche 1 bis 5 hergestellten Knochenersatzmaterials zur in-vitro-Züchtung von Knochengewebe vor einer Implantation, wobei das hochporöse Material mit humanen Osteoblasten besiedelt wird, die von dem Patienten, für den der Knochenersatz bestimmt ist, gewonnen werden.