DE69610841T2

DE69610841T2 - Verfahren zur papierleimung

Info

Publication number: DE69610841T2
Application number: DE69610841T
Authority: DE
Inventors: Robert Bates; John Branton; Tracey Crisp; John Hardman; Kenneth Lang; Jane Scherr; Howard Slater
Original assignee: Hercules LLC
Current assignee: Hercules LLC
Priority date: 1995-08-16
Filing date: 1996-08-16
Publication date: 2001-03-01
Anticipated expiration: 2016-08-17
Also published as: CA2229588A1; WO1997007203A1; JPH11510701A; EP0845060B1; CN1199421A; AU6824896A; BR9610219A; JPH11510861A; EP0845060A1; GB9516766D0; TW353092B; CA2229358A1; EP0845031A1; CN1199439A; WO1997007282A1; BR9610327A; PT845060E; AU6750296A; DE69610841D1

Description

1. TECHNISCHES GEBIET:

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Papierleimung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Proteins, das zur Bindung an Papier oder einen Bestandteil des Papiers fähig ist, um Papier zu leimen.

2. HINTERGRUND:

Obwohl es unzählige Einzelheiten zur Papierherstellung gibt, umfasst das Papierherstellungsverfahren herkömmlich die folgenden Schritte: (1) Bilden einer wässrigen Suspension von Cellulosefasern, üblicherweise bekannt als Zellstoff; (2) Zugabe verschiedener Verarbeitungs- und Papierverbesserungsstoffe, wie Verstärkungs- und/oder Leimungsmaterialien; (3) Bahnformen und Trocknen der Fasern zur Bildung einer gewünschten Cellulosebahn; und (4) Nachbehandeln der Bahn, um das resultierende Papier mit verschiedenen gewünschten Eigenschaften zu versehen, einschliesslich Oberflächenauftragung von Leimungsmaterialien und dergleichen.
Leimungsmaterialien sind typischerweise in der Form von wässrigen Lösungen, Dispersionen, Emulsionen oder Suspensionen, die das mit dem Leimungsmittel behandelte Papier, nämlich das geleimte Papier, gegenüber der Durchdringung oder Benetzung durch eine wässrige Flüssigkeit, einschliesslich anderer Behandlungsadditive, Drucktinten und dergleichen, resistent machen.
Ein Leimungsmittel kann auf die Oberfläche von Papier als "Oberflächen"-Leim aufgetragen werden oder kann in das Papier als "Masse"-Leim eingearbeitet werden. Viele chemische Leimungsmittel sind bekannt, einschliesslich Leimungszusammensetzungen auf Harzbasis und Ketendimer- Basis. US-A-3 222 245 offenbart die Leimung von Papier unter Verwendung von Glutinleimen. Es bleibt jedoch ein Bedarf an verbesserten Leimungszusammensetzungen und Verfahren zur Leimung.
Typischerweise ist der Hauptbestandteil von Papier Cellulose. Cellulose kann in Form von Holzfaser oder Faser einjähriger Kulturpflanzen (z. B. Hanf, Stroh, Reis, Flachs, Jute oder Baumwolle) sein. Andere Papierbestandteile können andere Polymermaterialien einschliessen, einschliesslich natürlich vorkommender Polymere wie Stärke, Pectin, Guar, Chitin, Lignin, Agar, Alginat, sowie andere Polysaccharide, einschliesslich Hemicellulosen wie Xylanose, Mannose und Arabinose. Xylanose ist die Hauptkomponente von Xylan, das auch als Hemicellulose bekannt ist, die in Gräsern, Getreidesorten, Stroh, Getreidehülsen und Holz vorkommt. Stärke kommt in Samen, Früchten, Blättern, Knollen usw. vor.
Enzyme, die zur Modifizierung eines Enzymsubstrats fähig sind, beruhen typischerweise auf einer nicht-kovalenten Bindungswechselwirkung mit dem Enzymsubstrat, um zu funktionieren. Eine solche Klasse von Enzymen umfasst Enzyme, die Polymere abbauen, z. B. Proteinasen, Keratinasen, Chitinasen, Ligninasen, Agarasen, Alginasen, Xylanasen, Mannasen, Amylasen, Cellulasen und Hemicellulasen. Zum Beispiel spalten Cellulasen und Hemicellulasen Saccharid- oder Polysaccharidmoleküle aus Cellulose bzw. Hemicellulose, und Amylasen spalten Glucose aus Stärke.
US-A-4 980 023 beschreibt die Zugabe von Cellulaseenzym zu Papier während der Herstellung, um eine Zersetzung des Papiers bei Feuchtigkeitsaussetzung zu verursachen.
Die Wechselwirkungen zwischen Cellulose und Cellulaseproteinen, insbesondere derjenigen, die an die Cellulosefasern als Voraussetzung für katalytische Aktivität binden, wurden beschrieben und beurteilt (Cellulase: Beguin, Annu. Rev. Microbiol., 44, 219-248, 1990; Cellulasen und Xylanasen: Gilbert und Hazelwood, Journal of General Microbiology, 139, 187-194, 1993). Diese Gruppe von Enzymen schliesst Cellulasen und Hemicellulasen ein, die funktionell unterschiedliche Proteindomänen umfassen. Insbesondere ist die für die katalytische Aktivität verantwortliche Domäne strukturell unterschiedlich von der Cellulose-Bindungsdomäne. Diese Domänen sind evolutionär bewahrte Sequenzen, die in allen solchen Proteinen sehr ähnlich sind (Gilkes et al., Microbiological Reviews, 303-315, Juni 1991).
Die Bindungsdomänen solcher Proteine können von den Domänen des aktiven Zentrums durch Proteolyse getrennt werden. Von den isolierten Bindungsdomänen wurde gezeigt, dass sie die Bindungsfähigkeiten beibehalten (Van Tilbeurgh et al., FEBS Letters, 204(2), 223-227, August 1986). Die Verwendung von Cellulose-Bindungsdomänen von Cellulasen wurde als Mittel zur Aufrauhung der Textur der Oberfläche von Celluloseträgern vorgeschlagen, während die Verwendung von Cellulase mit Domänen mit aktivem Zentrum als Mittel zur Glättung der Textur solcher Oberflächen vorgeschlagen wurde (internationale Patentanmeldung WO-A-93/05226).
Eine Anzahl von Bindungsdomänen wurde ebenfalls im genetischen Massstab charakterisiert (Ohmiya et al., Microbial Utilisation of Renewal Resources, 8, 162-181, 1993) und wurde zur Erzeugung neuer Fusionsproteine subkloniert (Kilburn et al., veröffentlichte internationale Patentanmeldung WO-A-90/00609; Ong et al., Enzyme Microb. Technol. 13, 59-65, Januar 1991; Shoseyov et al., veröffentlichte internationale Patentanmeldung WO-A-94/24158). Einige dieser Funktionsproteine wurden dann als Ankerproteine für spezifische Anwendungen verwendet. Solche Proteine wurden als Hilfe zur Proteinreinigung durch Adhäsion der Fusionsproteine an Celluloseträgermaterialien verwendet, die in Proteinreinigungsstrategien verwendet werden (Kilburn et al., US-A-5 137 819; Greenwood et al., Biotechnology and Bioengineering, 44, 1295-1305, 1994). Die Fähigkeit zur Immobilisierung von Fusionsproteinen auf Celluloseträgern wurde ebenfalls als Mittel zur Immobilisierung von Enzymbioreaktoren vorgeschlagen (Ong et al., Bio/Technology, 7, 604-607, Juni 1989; Le et al., Enzyme Microb. Technol., 16, 496-500, Juni 1994) und als Mittel zur Anheftung einer chemischen "Markierung" ("tag") an ein Cellulosematerial (internationale Patentanmeldung WO-A-93/21331).
Es wurde nun gefunden, dass Proteine, die zur Bindung an Papier oder einen Bestandteil von Papier fähig sind, zur Papierleimung verwendet werden können.

3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG:

Erfindungsgemäss wird ein Verfahren zur Papierleimung bereitgestellt, das die Schritte aus (a) In-Kontakt- Bringen des Papiers oder eines Bestandteils des Papiers mit einem Protein, das zur Bindung an das Papier oder an den Bestandteil des Papiers fähig ist, und (b) Denaturieren des an das Papier gebundenen Proteins umfasst.
Gemäss einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Papierleimung bereitgestellt, umfassend (a) In-Kontakt-Bringen des Papiers oder eines Bestandteils des Papiers mit einem Protein, das zur Bindung an das Papier oder an den Bestandteil des Papiers fähig ist, und (b) Denaturieren des an das Papier gebundenen Proteins durch Erhitzen des Papiers.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung von geleimtem Papier wie in Anspruch 16 beschrieben.
Die Erfindung stellt ausserdem Papier bereit, das gemäss einem erfindungsgemässen Verfahren geleimt wurde.

4. AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Papierleimung. Der hier verwendete Begriff "Papier" bezeichnet jedes Material in Form einer zusammenhängenden Bahn oder Fläche, umfassend ein verflochtenes Netzwerk von cellulosehaltigen Fasern, die aus pflanzlichen Quellen stammen, gegebenenfalls vermischt mit Fasern aus pflanzlichen, mineralischen, tierischen oder synthetischen Quellen in unterschiedlichen Anteilen und gegebenenfalls vermischt mit feinen Teilchen anorganischer Materialien wie Oxiden, Carbonaten und Sulfaten metallischer Elemente in unterschiedlichen Anteilen. Der Begriff "Papier" schliesst Pappe ein, die Papier bezeichnet, wenn das Gewicht der Papierbahn oder -fläche grösser als 200 g/m² ist.
Pflanzliche Quellen von Cellulose schliessen Holz, Strohsorten, Bargasse, Esparto, Bambus, Kanaf, Gras, Jute, Ramie, Hanf, Baumwolle und Flachs ein. Die rohe, aus Pflanzen stammende Cellulose wird zur Bildung von Zellstoff, dem Material, aus dem Papier hergestellt wird, entweder mechanisch, chemisch oder durch beides verarbeitet wird. Cellulosehaltige Zellstoffe können als mechanisch, chemiemechanisch und chemiethermomechanisch, halbchemisch, chemisch mit hoher Ausbeute, vollchemisch (siehe "Pulp and Paper, Chemistry and Chemical Technology", 3. Auflage, Band 1, Seiten 164, 165, herausgegeben von James P. Cassay, ISBN 0-471-03175-5 (v.1)) gemäss dem Verfahren der Zellstoffzubereitung und -reinigung beschrieben werden.
Papier kann ebenfalls andere natürlich vorkommende Polymere wie Proteine, wie Keratin, Stärke (einschliesslich anionischer, kationischer oder amphoterer Stärke), Pectin, Guar, Chitin, Lignin, Agar, Alginat, sowie andere Polysaccharide, einschliesslich Hemicellulosen wie Xylanose, Mannose und Arabinose, umfassen.
Das erfindungsgemässe Verfahren umfasst das In-Kontakt- Bringen von Papier oder einem Bestandteil von Papier mit einem Protein, das zur Bindung an das Papier oder einen Bestandteil des Papiers fähig ist, gefolgt von Denaturieren des Proteins.
Das in der vorliegenden Erfindung eingesetzte Protein kann jedes Protein umfassen, das zur Bindung an das Papier oder einen Bestandteil von Papier fähig ist. Das Protein kann z. B. ein Protein umfassen, das zur Bindung an Cellulose oder jede andere polymere Substanz fähig ist, die als Bestandteil des Papiers vorliegt. Bevorzugt ist das Protein fähig zur spezifischen Bindung an Cellulose oder eine andere polymere Substanz, die als Bestandteil von Papier vorliegt. Besonders bevorzugt ist das Protein zur Bindung mit einer Dissoziationskonstante (Kd) von weniger als 1 · 10&supmin;³ M fähig. Der hier verwendete Begriff "Protein" schliesst Peptide, Oligopeptide und Polypeptide sowie Proteinreste, proteinhaltige Typen, Ketten von Aminosäuren und Moleküle, die eine Peptidbindung enthalten, ein. Wenn es der Zusammenhang erfordert (z. B. wenn das Protein an ein anderes Molekül gebunden ist), meint ein Verweis auf ein Protein einen Proteinrest. Das Protein kann ein natürlich vorkommendes Protein oder Fragment davon oder ein modifiziertes Protein umfassen, das durch chemische Modifizierung oder Synthese oder durch Expression eines genetisch modifizierten Gens, das für das Protein kodiert, erhältlich ist. Der hier verwendete Begriff "modifiziertes Protein" schliesst chemische Analoga von Proteinen ein, die zur Bindung an Papier oder einen Bestandteil davon fähig sind. Bevorzugt umfasst das Protein ein natürlich vorkommendes Enzym oder Fragment davon, das zur Bindung an Papier oder einen Bestandteil von Papier fähig ist. Beispiele für Proteine, die zur Bindung an Papier oder einen Bestandteil von Papier fähig sind, sind wohlbekannt und schliessen Enzyme ein, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die Cellulasen, Hemicellulasen, Mannasen, Xylanasen, Chitinasen, Ligninasen, Agarasen, Alginasen und Amylasen umfassen.
Das Protein kann z. B. eine Amylase oder ein Fragment davon umfassen, die zur Bindung an Stärke (wie anionische, kationische oder amphotere Stärke) bei Vorliegen als Bestandteil von Papier oder Papierzellstoff fähig sind. Beispiele für Amylasen schliessen α-Amylasen, z. B. aus Aspergillus oryzae (erhältlich als eine Rohzubereitung vom Typ X-A von Sigma Aldrich Co., Ltd.), und Amyloglucosidasen ein, z. B. aus Aspergillus niger (erhältlich von Sigma Aldrich Co., Ltd.).
Bevorzugt umfasst das Protein ein Protein, das zur Bindung an Cellulose fähig ist. Besonders bevorzugt umfasst das Protein eine Cellulase oder ein Fragment davon. Die Cellulase kann eine natürlich vorkommende Cellulase oder ein Fragment davon oder modifizierte Cellulase umfassen, die durch chemische Modifizierung einer natürlich vorkommenden Cellulase oder Synthese oder durch Expression eines genetisch modifizierten Gens erhältlich ist, das für eine Cellulase kodiert. Die Cellulase kann z. B. zur Entfernung oder Deaktivierung der Domäne mit aktivem Zentrum modifiziert sein. Eine Vielzahl von Cellulasen sind bekannt, die an Cellulose binden. Beispiele für solche Cellulasen sind diejenigen, die aus bakteriellen Organismen wie Cellulomonas fimi und Pilzorganismen wie Trichoderma viride, Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, Penicillium funiculosum, Trichoderma reesei und Humicola insolens isolierbar sind, erhältlich als kommerzielle Zubereitungen von Sigma Chemical Sigma-Aldrich Company Ltd., Novo Nordisk A/S, BDH Ltd. oder ICN Biochemicals Ltd. (Fusarium oxysporum ist z. B. unter der Hinterlegungsnummer DSM 2672 erhältlich). Alternativ kann das Protein durch rekombinante DNA-Techniken erzeugt werden, wie sie z. B. in der internationalen Patentanmeldung WO-A-94/24158 offenbart sind. Cellulasen umfassen allgemein eine Cellulase-Bindungsdomäne und eine für die Cellulaseaktivität verantwortliche Domäne. Die vorliegende Erfindung kann die Cellulase als Ganzes oder als ein Fragment davon einsetzen, das zur Bindung an Cellulose fähig ist. Eine Cellulase-Bindungsdomäne kann aus der ganzen Cellulase durch Behandlung mit Protease(n) wie Papain erhalten werden. Die Cellulase kann eine Exocellulase oder eine Endocellulase umfassen. Exocellulasen (ebenfalls bekannt als Cellobiohydrolasen, CBH; Exoglucanasen; 1,4-Beta-D-glucan-cellobiohydrolasen; EC 3.2.1.91) wirken auf das nicht-reduzierende Ende eines Cellulosemoleküls. Exocellulasen können terminale Cellobioseeinheiten (ein Disaccharid) freisetzen oder terminale Glucoseeinheiten (Monosaccharid) freisetzen. Beispiele für Exocellulasen schliessen aus Humicola insolens erhältliche Cellulase ein. Endocellulasen (ebenfalls bekannt als Beta-1,4-endoglucanasen; Endo-1,4- D-glucanasen; 1,4-Beta-D-glucan-glucanohydrolasen; EC 3.2.1.4) spalten innere beta-1,4-glykosidische Bindungen unter Erhalt einer Mischung aus Glucose, Cellobiose und anderen löslichen Zell-Oligosacchariden. Beispiele für Endocellulasen schliessen aus Trichoderma reesei erhältliche Cellulase ein.
Das Protein kann ebenfalls Cellulosomen umfassen. Cellulosomen umfassen ein Cellulasesystem, das diskrete, multifunktionelle Multienzymkomplexe umfasst. Sie enthalten typischerweise wenigstens 14 unterschiedliche Polypeptide, einschliesslich zahlreicher Endoglucanasen (Endocellulasen) und Xylanasen, und wenigstens eine Betaglucanase. Diese sind mit Gerüstproteinen verbunden. Cellulosomen werden ausführlich beschrieben in E.A. Bayer, E. Morag, R. Lamed (1994), "The Cellulosome - a treasuretrove for biotechnology", Trends in Biotechnology 12: 379-386.
Bevorzugt umfasst das in der vorliegenden Erfindung eingesetzte Protein eine aus Humicola insolens erhältliche Cellulase (erhältlich als Celluzyme® von Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark) oder eine aus Trichoderma reesei erhältliche Cellulase (erhältlich als Celluclast® von Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark). Besonders bevorzugt umfasst das Protein aus Humicola insolens erhältliche Cellulase.
Das Protein kann zum Papier in jeder geeigneten Stufe in der Herstellung und Verarbeitung des Papiers zugegeben werden. Es kann in der Zellstoffstufe oder in jeder Stufe während der Bildung der nassen Zellstoffmatrix oder während des Pressens und Walzens der Matrix zur Bildung von Papier zugegeben werden. Somit wird erfindungsgemäss ein Verfahren zur Herstellung von geleimtem Papier bereitgestellt, welches die Schritte aus (a) Herstellen eines Papierzellstoffs, (b) Zugabe eines Proteins, das zur Bindung an einen Bestandteil des Zellstoffs fähig ist, (c) Bilden von Papier aus dem Zellstoff und (d) Erhitzen des Papiers zur Denaturierung des Proteins umfasst.
Alternativ kann das Protein zum gebildeten Papierprodukt hinzugegeben werden, z. B. durch Eintauchen des Papiers in ein Bad, das das Protein enthält, oder durch jedes geeignete Sprüh-, Ausbreitungs-, Bürst-, Streich- oder Druckverfahren. Somit stellt die Erfindung ausserdem ein Verfahren zur Herstellung von geleimtem Papier bereit, das die Schritte aus (a) Auftragen eines Proteins, das zur Bindung an das Papier fähig ist, auf das Papier und (b) Erhitzen des Papiers zur Denaturierung des Proteins umfasst.
Durch Auswahl des Punktes in der Herstellung des Papiers, an dem das Protein zugegeben wird, kann eine Kontrolle dahingehend ausgeübt werden, ob das Protein im Papier verteilt oder im wesentlichen auf die Oberflächenbereiche des Papiers beschränkt wird.
Das Protein sollte mit dem Papier oder Papierzellstoff für eine ausreichende Zeit inkubiert werden, um die Bindung des Proteins an das Papier oder den Papierzellstoff zu erlauben. Typischerweise wurden 15 Minuten als angemessen aufgefunden, obwohl kürzere Inkubationszeiten geeignet sein können.
Das Protein kann in einer Menge zugegeben werden, die zum Erreichen des gewünschten Leimungsgrades geeignet ist. Das Protein kann in einer Menge von 0,01 bis 40 Gew.-% des Trockengewichts des Papierzellstoffs zugegeben werden. Bevorzugt wird das Protein in einer Menge von 0,1 bis 20 Gew.-%, besonders bevorzugt 1 bis 10 Gew.-%, zugegeben.
Im Anschluss an die Einmischung des Proteins in das Papier oder die Auftragung des Proteins auf die Oberfläche des Papiers wird die Leimung des Papiers durch Denaturierung des Proteins erreicht. Das Protein kann durch Auftragung eines chemischen Proteindenaturierungsmittels auf das Papier denaturiert werden. Chemische Proteindenaturierungsmittel schliessen Harnstoff, Guanidin, Säuren, Alkalien, Detergenzien (wie Tween®), wasserlösliche organische Stoffe (wie aliphatische Alkohole) und chaotrope Ionen (wie I&supmin;, ClO&sup4;&supmin;, SCN&supmin;, Li&spplus;, Mg²&spplus;, Ca²&spplus; und Ba²&spplus;) ein.
Bevorzugt wird die Leimung durch Erhitzen des Papiers erreicht. Bevorzugt kann das Papier auf eine Temperatur von 50 bis 200ºC erhitzt werden, besonders bevorzugt 70 bis 170ºC, besonders bevorzugt 80 bis 110ºC, besonders bevorzugt 100 bis 110ºC. Typischerweise kann das Papier auf ca. 105ºC auf dampfbeheizten Walzen erhitzt werden. Das Papier kann einer oder mehreren Wärmebehandlungen bei unterschiedlichen Temperaturen unterworfen werden.
Die erforderliche Dauer der Erhitzung hängt von der Temperatur ab, auf die das Papier erhitzt wird, wobei längere Zeiten bei geringerer Temperatur erforderlich sind. Typischerweise kann das Papier für zwischen 15 und 500 Sekunden erhitzt werden, bevorzugt zwischen 25 und 300 Sekunden. Das Papier kann ebenfalls Wärmebehandlungen nach der Herstellung zur Alterung oder Aushärtung des Papiers unterworfen werden.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben.
Es ist ersichtlich, dass das Folgende allein ein Beispiel ist und eine Abweichung im Detail innerhalb des Erfindungsumfangs vorgenommen werden kann.

EXPERIMENTELLER TEIL:

Materialien und Protokolle:
Ausser wie unten angegeben wurden die folgenden Materialien und Protokolle in den Beispielen zur Charakterisierung der Verwendung von Proteinen als Bioleimungsmittel verwendet.
Zellstoff: Wasserblatt-Papierzellstoff ("water-leafpaper pulp") wurde hergestellt durch Zugabe von 10 g Wasserblatt-Papier [70 : 30 Hartholz (Birke): Nadelholz (Kiefer)] auf 100 ml destilliertes Wasser. Nach 5 Minuten wurde das Papier zu einem homogenen Zellstoff vermengt. Proben der Zellstoffsuspension (entsprechend 0,2 g trockenem Papier) wurden in Universal-Flaschen eingewogen.
Inkubierung: Zu jeder Flasche wurden 10 ml einer der folgenden Inkubationspufferlösungen gegeben:
(a) Tris-HCl, 50 mM, pH 7,5
(b) phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 500 mM, pH 7,5
Cellulasen: Zur Inkubationssuspension wurde eine aus den folgenden ausgewählte Cellulase gegeben:
1. Humicola insolens: Aus Humicola insolens stammende Cellulase, erhältlich als Celluzymes von Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark (875 ul, entsprechend 8,7% G/G cellulosebindendem Protein auf Trockengewicht- Zellstoff).
2. Trichoderma reesei: Aus Trichoderma reesei stammende Cellulase, erhältlich als Celluclast® von Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark (70 ul, entsprechend 0,28 umol Protein, entsprechend 4,4% G/G cellulosebindendem Protein auf Trockengewicht-Zellstoff).
3. Trichoderma viride: aus Trichoderma viride stammende Cellulase, erhältlich von BDH Ltd. UK.
Kontrollexperimente in Abwesenheit von Cellulase wurden ebenfalls durchgeführt.
Inkubierung: Die Mischungen wurden für 15 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert.
Testblattherstellung: Zur Erzeugung der Papiertestblätter wurde das Volumen auf 100 ml mit destilliertem Wasser erhöht und Papierblätter (6 cm²) unter Verwendung einer für das Labor entwickelten Papierherstellungsvorrichtung erzeugt, die in der folgenden Weise betrieben wurde: Eine Suspension aus Papierzellstoff (0,2% G/V) wurde in einen Kunststoff-Filterhalter gegossen, der ein feines Nylon- Filtersieb beherbergt. Durch Anlegen eines Vakuums für einige Sekunden wurde der Zellstoff zu einem Papierblatt auf dem Sieb gebildet. Das Filtersieb wurde aus der Vorrichtung entfernt und das Papierblatt sandwichartig zwischen ein zweites Nylonsieb gelegt und zwischen Fliesspapier abgezogen. Das Papierblatt wurde sorgfältig vom Papierherstellungssieb entfernt, durch Walzen geglättet und dann getrocknet.
Testblatttroaknung/-erhitzung: Papierblätter wurden auf einem der folgenden Wege getrocknet:
(a) Lufttrocknung;
(b) Trommeltrockner: typischerweise betrieben bei einer konstanten Temperatur von 80 bis 108ºC bei einer Kontaktzeit von 40 bis 250 Sekunden;
(c) Warmblechpresse: typischerweise unter Erzeugung einer maximalen Oberflächentemperatur von 160ºC bei einer Kontaktzeit von 30 Sekunden. Ein flaches Aluminiumblech wurde verwendet, um die Papiertestblätter (sandwichartig zwischen Fliesspapier gelegt) gegen das heisse Blech zu pressen.
Testprotokolle: Die getrockneten Blätter wurden auf Leimung durch einen oder mehrere der folgenden Tests beurteilt:
(a) Tintentropfentest ("ink drop test", IDT): worin ein 15 ul-Tropfen von Parker Super Quick Ink (Permanent Blue-Black) auf das Teststück des Papiers getropft wurde und die für die vollständige Absorption erforderliche Zeit gemessen und aufgezeichnet wurde. Die Ergebnisse wurden in Sekunden auf einer empirischen Skala von 0 bis ++++ aufgezeichnet, worin bedeutet:
0 bedeutet weniger als 100 Sekunden zur vollständigen Absorption.
+ bedeutet 100 bis 500 Sekunden zur vollständigen Absorption.
++ bedeutet 500 bis 1.000 Sekunden zur vollständigen Absorption.
+++ bedeutet 1.000 bis 2.000 Sekunden zur vollständigen Absorption.
++++ bedeutet mehr als 2.000 Sekunden zur vollständigen Absorption.
(b) Hercules Size Test (Hercules-Leimungstest, HST): Definiert in "Tappi Test Methods", herausgegeben von TAPPI, Technology Park, Atlanta, PO Box 105113, GA 30348, USA, ISBN 0-89852-200-5 (Band 1 und 2), (1987). Der HST wird als Leimungstest für Papier durch Tintenbeständigkeit, T530 um-83, definiert. Die Daten werden in Sekunden aufgezeichnet; je höher der Wert ist, desto besser ist die Leimung. Bevorzugt wird ein HST- Wert von mehr als 20 Sekunden, besonders bevorzugt von mehr als 120 Sekunden und besonders bevorzugt von mehr als 200 Sekunden erhalten.
(c) Cobb Size Test (Cobb-Leimungstest): definiert in "TAPPI Test Methods" (siehe oben) durch T441om-84. Die Daten werden in g/m² aufgezeichnet. "Völlig gesättigt" bedeutet, dass das Papier überhaupt keine Leimung zeigte. Je niedriger der Cobb-Wert ist, desto besser ist die Leimung. Bevorzugt wird ein Cobb-Wert von weniger als 30 g/m², besonders bevorzugt von weniger als 21 g/m² erhalten.

BEISPIEL 1

Eine Untersuchung über die Wirkung der Temperatur auf die Leimung, die durch eine Trichoderma reesei- Cellulasezubereitung hervorgerufen wird (Celluclast®, Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark), wurde durchgeführt. Für diese Untersuchungen wurde ein Trommeltrockner in Verbindung mit einer Wärmeplatte mit variabler Temperatur verwendet. Der Trommeltrockner ergab eine konstante Temperatur von 80ºC bei einer Kontaktzeit von 250 Sekunden, und die Wärmeplatte ergab eine maximale Oberflächentemperatur von 160ºC bei einer Kontaktzeit von 30 Sekunden. Ein flaches Aluminiumblech wurde verwendet, um die Papierblätter (sandwichartig zwischen Fliesspapier gelegt) gegen die Wärmeplatte zu pressen.
Die Trichoderma reesei-Cellulasezubereitung (70 ul Celluclast®, entsprechend 4, 4% G/G Cellulose- Bindungsprotein, bezogen auf das Trockengewicht der Cellulosefaser) wurde verwendet, und die Mischungen wurden für 15 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert. Kontrollexperimente ohne Cellulase wurden ebenfalls durchgeführt.
Papiertestblätter wurden wie oben beschrieben hergestellt. Testblätter wurden zunächst zwischen Fliesspapier gepresst und dann auf einem der drei folgenden Wege getrocknet.
(a) Lufttrocknung;
(b) Trommeltrockner: 80ºC/250 Sekunden; oder
(c) Warmblechpresse: 160ºC/30 Sekunden, gefolgt vom Trommeltrockner, 80ºC/250 Sekunden
Die getrockneten Blätter wurden dann auf Leimung durch den Ink Drop Test (IDT) untersucht.
Die folgenden Leimungsergebnisse wurden für Testpapiere erhalten, die unter unterschiedlichen Trocknungsbedingungen hergestellt wurden. TABELLE 1 Wirkung der Papiertrocknungsbedingung auf das Leimungssystem auf Cellulasebasis
- = nicht untersucht
Keine Leimung wurde beobachtet, wenn Papiere ohne Enzym hergestellt wurden, was die Möglichkeit ausschliesst, dass die Puffersalze mit der Cellulose in einer solchen Weise wechselwirken, dass sie die Leimung beeinflussen. Eine Leimung wurde mit Tris-T. reesei-Cellulase (Celluclast®)- Inkubierungen beobachtet, und ein höherer Leimungsgrad wurde beobachtet, wenn die Papiere zunächst bei der höheren Temperatur getrocknet wurden, gefolgt von Trommeltrocknung bei der niedrigeren Temperatur.
Cellulase/PBS-Papier ergab ebenfalls eine Leimung bei der höheren Temperatur, aber der Leimungsgrad war geringer als der in Gegenwart von Tris-HCl erhaltene.

BEISPIEL 2

Die Wirkung der Inkubierungszeit auf die Leimungsgrade, die unter Verwendung einer Humicola insolens- Cellulasezubereitung (Celluzyme®, Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark) erhalten wurden, wurde untersucht.
Tris-HCl (50 mM, pH 7,5, 10 ml) wurde zu 0,2 g Zellstoff in destilliertem Wasser gegeben, und die Humicola insolens-Cellulasezubereitung (875 ul) wurde hinzugegeben, und die Mischungen wurden für entweder 15 oder 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Am Ende des Inkubierungszeitraums wurden die Zellstoffproben verwirbelt und auf 100 ml verdünnt. Testpapiere wurden auf die Standardweise hergestellt und durch einen einzelnen Durchgang durch einen Trommeltrockner bei 100ºC/250 Sekunden getrocknet.
Der durch die unterschiedlichen Methoden erreichte Leimungsgrad wurde unter Verwendung der IDT-Methode beurteilt. TABELLE 2
Eine Erhöhung der Inkubierungszeit von 15 auf 90 Minuten erhöhte den Leimungsgrad nicht signifikant.

BEISPIEL 3

Zum Erhalt einer quantitativen Beziehung zwischen der in den Testpapieren erreichten Leimung und der hinzugegebenen Menge von Trichoderma reesei- oder Humicola insolens- Cellulasezubereitung wurde ein weiterer Satz Experimente durchgeführt.
Standardisierte Papierherstellungsbedingungen wurden wie folgt eingesetzt: Zu einer Zellstoffprobe in destilliertem Wasser (entsprechend 0,2 g trockenem Papier) wurden 10,0 ml Puffer gegeben (50 mM Tris-HCl, pH 7,5). Unterschiedliche Mengen von Cellulase (Trichoderma reesei oder Humicola insolens; Tabelle 3) wurden hinzugegeben, und die Mischung wurde verwirbelt. Der Zellstoff wurde unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubiert, und danach wurde die Mischung auf 150 ml mit destilliertem Wasser verdünnt und die Testpapierblätter hergestellt. Jedes Testblatt wurde vom Sieb entfernt und zwischen einem gefalteten Blatt von trockenem 3 mm Fliesspapier unter Verwendung einer Handwalze gepresst. Das Blatt (noch im Fliesspapier gefaltet) wurde einmal durch einen Trommeltrockner bei 100 bis 104ºC bei einer Kontaktzeit von 250 Sekunden geführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben. TABELLE 3 Unter Verwendung von entweder Trichoderma reesei- (Celluclast®, Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark) oder Humicola insolens- (Celluzyme®, Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark) Cellulasezubereitung erreichte Leimung
* Stellt äquivalente Zugabemengen dar
Die Ergebnisse zeigen, dass, obwohl beide Cellulasen eine Leimung ausüben, die H. insolens-Cellulasezubereitung höhere Leimungsgrade als die T. reesei-Cellulase unter den verwendeten Bedingungen verlieh.

BEISPIEL 4

Die Wirkungen der Auslassung von Puffer und Hochtemperaturtrocknung (160ºC) auf die mit entweder einer Trichoderma reesei-Cellulasezubereitung (Celluclast®, Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark) oder einer Humicola insolens-Cellulasezubereitung (Celluzyme®, Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark) erreichten Leimungsgrade wurde untersucht.
Papierblätter wurden wie zuvor beschrieben mit den in Tabelle 4 beschriebenen unterschiedlichen Bedingungen hergestellt. Die Leimung wurde am folgenden Tag durch das Standärd-IDT-Verfahren gemessen.
Die Ergebnisse zeigen, dass Celluclast® einen Nutzen aus den höheren Trocknungstemperaturen (160ºC) gegenüber Celluzyme® zieht, wodurch eine gute Leimung ausgeübt wird. TABELLE 4 Wirkung der Temperatur auf die entweder durch Trichoderma reesei-Cellulase (Celluclast®, Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark) oder Humicola insolens-Cellulase (Celluzyme®, Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark) erreichte Leimung

BEISPIEL 5

Der Hercules Sizing-Test (HST) wurde verwendet, um den entweder durch Trichoderma reesei-Cellulase (Celluclast®, Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark) oder Humicola insolens-Cellulase (Celluzyme®, Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark) mit und ohne Zugabe von Tris ausgeübten Leimungsgrad zu bestimmen. Zur Herstellung der Blätter wurden 2% (G/V) Papierstoff mit 5% (G/G) Cellulaseprotein (bezogen auf das Trockengewicht der Faser) für 5 Minuten bei 25ºC vor der Bildung der Papierblätter inkubiert. Die Blätter wurden auf einem Trommeltrockner bei 105ºC für 40, 80, 160 oder 240 Sekunden getrocknet und wurden einer der folgenden Nachherstellungs-Wärmebehandlungen unterzogen: natürlich gealtert für 24 Stunden; 80ºC für 10 Minuten und 105ºC für 10 Minuten.
Die Ergebnisse zeigen, dass Humicola insolens- und Trichoderma reesei-Cellulasen eine moderate Leimung nach Messung durch den HST nach der Trommeltrocknung bei 105ºC ausüben. TABELLE 5 HST-Bestimmung von mit entweder Trichoderma reesei-Cellulase (Celluclast®, Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark) oder Humicola insolens-Cellulase (Celluzyme®, Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark) geleimten Papierblättern

BEISPIEL 6

Eine Cellulasezubereitung aus Trichoderma viride (BDH Ltd.) wurde als Bioleimungsmittel untersucht. Proben wurden zu Aliquoten von Papierstoff (0,2 g Trockengewichtfaser in 15 ml destilliertem Wasser) gegeben. Die Cellulase-Zugabemenge wurde so eingestellt, dass äquivalente Cellulose-Bindungsproteinkonzentrationen (entsprechend 8,7% G/G, bezogen auf Fasergewicht) zugegeben wurden, um einen direkten Vergleich mit Humicola insolens-Cellulase (Celluzyme®, Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark) zu ermöglichen.
Die Zellstoff- und Cellulaseproben wurden bei Raumtemperatur für 15 Minuten vor der Herstellung der Handmuster inkubiert. Die Blätter wurden durch einen einzelnen Durchgang durch einen Trommeltrockner bei 105ºC getrocknet und über Nacht bei Raumtemperatur vor der Untersuchung auf Leimung unter Verwendung des IDT belassen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt.
Die Ergebnisse zeigen, dass bei Verwendung von äquivalenten Proteinkonzentrationen und im Vergleich mit Humicola insolens-Cellulase die Trichoderma viridi- Cellulase einen moderaten Leimungseffekt ausübte. TABELLE 6 Durch unterschiedliche Cellulasen nach Bestimmung durch den CHL-IDT-Test erreichte Leimung

BEISPIEL 7

Zur Untersuchung der Anwendung von Clostridium thermocellum-Cellulosomen als Leimungsmittel wurde Cl. thermocellum (NCIMB 10682) auf einem 1,0% (G/V)-Zellstoff in Wachstumsmedium herangezogen, das umfasst: 1.000 ml Basalmedium (gl-1)-Hefeextrakt, 10; KH&sub2;PO&sub4;, 1,5; K&sub2;HPO&sub4;·3H&sub2;O, 2,9; (NH&sub4;)2SO&sub4;, 1,3; und FeSO&sub4;·7H&sub2;O (1,0% G/V) 1,0 ml&supmin;¹), mit einer Cellulosequelle (Zellstoff mit 1% G/V), die dann zur Sterilisierung autoklaviert wird. 25 ml Salzlösung (MgCl&sub2;, 2% G/V, CaCl&sub2;, 0,2% G/V, autoklaviert zur Sterilisierung). 15 ml Cysteinlösung (50 g/l, filtersterilisiert). Das Wachstumsmedium (1 l in einer Duranflasche) wurde mit Stickstoff für 5 Minuten gespült und vor der Überimpfung auf 60ºC erwärmt. Die Kultur wurde dann für 240 Stunden inkubiert. Die Kultur wurde geerntet und die Zellen und Zellstofftrümmer von der Kulturflüssigkeit durch Zentrifugieren abgetrennt. Natriumazid (0,02% G/V) wurde sowohl zur Kulturflüssigkeit als auch zu den Zellstofftrümmern gegeben, um weiteres mikrobielles Wachstum zu verhindern.
Die Kulturflüssigkeit wurde als Leimungsmittel untersucht, indem Papier unter Verwendung der Cl. thermocellum- Kulturen hergestellt wurde. Wasserblatt-Zellstoff (10% G/V; 2,16 g) wurde in fünf 250 ml-Kolben eingewogen. Cl. thermocellum-Kulturflüssigkeit (200; 100; 50; 25 und 0 ml) wurde dann zu jedem Kolben gegeben und das Volumen mit destilliertem Wasser auf 200 ml eingestellt. Die Mischung wurde dann bei Raumtemperatur für 15 Minuten gerührt, und ein Papierblatt wurde aus den Inhalten jedes Kolbens unter Verwendung des Standard- Papierherstellungsverfahrens hergestellt. Das Papier wurde bei 80ºC für 250 Sekunden unter Verwendung des Trommeltrockners getrocknet. Die Leimung wurde am folgenden Tag unter Verwendung des Standard-IDT-Verfahrens gemessen.
Kontroll-Papierblätter wurden ebenfalls hergestellt und wie oben untersucht, in denen nicht-übergeimpftes Cl. thermocellum-Wachstumsmedium anstelle der Cl. thermocellum-Kulturflüssigkeit zum Wasserblatt-Zellstoff gegeben wurde.
Es wurde ebenfalls entschieden, auf Leimung unter Verwendung der pelletierten Zellstofftrümmer und Zellen zu untersuchen. Die Zellstofftrümmer und Zellen (2,16 g; Prozentanteil Zellstoff jetzt unbekannt) wurden in zwei 250 ml-Kolben eingewogen. Zu einem Kolben wurden 200 ml Cl. thermocellum-Wachstumsmedium gegeben, um die Zellstofftrümmer erneut zu suspendieren, und zum anderen Kolben wurden 200 ml destilliertes Wasser gegeben. Beide Kolben wurden bei Raumtemperatur für 15 Minuten gerührt und ein Papierblatt aus den Inhalten beider Kolben unter Verwendung des Standard-Papierherstellungsverfahrens hergestellt. Das Papier wurde bei 90ºC für 250 Sekunden unter Verwendung des Trommeltrockners getrocknet. Die Leimung wurde am folgenden Tag unter Verwendung des IDT- Verfahrens gemessen.
Die Cl. thermocellum-Kulturflüssigkeit verlieh dem Papier keine Leimung, und es wird angenommen, dass dies an den sehr geringen Mengen von freien Cellulosomen in der Kulturflüssigkeit lag. Aus den Zellstofftrümmern hergestellte Papierblätter zeigten eine Leimung (Tabelle 4), und eine signifikante Verringerung des Leimungsgrades wurde bemerkt, wenn destilliertes Wasser verwendet wurde, verglichen zum Cl. thermocellum-Wachstumsmedium. Es wird angenommen, dass die Verwendung von destilliertem Wasser eine Verringerung der Salz-/Ionenstärke des destillierten Wassers verursacht, verglichen mit der Verwendung des Wachstumsmediums, was in einer Elution der Cellulosomen aus der Zellstoffoberfläche resultiert, wodurch der Leimungsgrad reduziert wird. Die Ergebnisse bestätigen, das die Gegenwart von Cl. thermocellum- Cellulosomenzubereitung dem Papierblatt eine Leimung verleiht. TABELLE 7 Leimungstest: Durch Cl. thermocellum hydrolysierter Zellstoff
* Doppelte Untersuchungen

BEISPIEL 8

Eine weitere Reihe von Experimenten wurde durchgeführt, um die Wirkung von Cellulase auf die Papierleimung zu bestimmen. In den Experimenten wurden die folgenden Materialien und allgemeinen Protokolle eingesetzt:

Cellulase:

Eine wässrige Trichoderma reesei-Cellulasezubereitung wurde eingesetzt ("Celluclast 1.5L", bereitgestellt von Novo Nordisk Bioindustry S.A., 92017 Nanterre Cedex, Frankreich).
Zusätzlich wurde aus Penicillium funiculosum stammende Cellulase verwendet, erhältlich als braunes Pulver von Sigma Aldrich Co., Ltd., Poole, Dorset, UK.

Papierstockzubereitung:

Ausser wenn anders angegeben, war der verwendete Eintrag eine Mischung aus ECF-gebleichten Hartholz- und Nadelholz- Zellstoffen (Verhältnis von 70 : 30 Hartholz/Nadelholz). Der Papierstoff wurde mit 1/3 PBS hergestellt, und keine Füllstoffe wurden zugegeben. Das Verfahren war wie folgt:
280 g gebleichter Hartholz-Zellstoff und 120 g gebleichter Nadelholz-Zellstoff wurden zu 18 l von 1/3 PBS gegeben. Die Fasern wurden durch kräftiges Rühren dispergiert. Dieser Papierstoff wurde dann in den Holländer überführt und bis zu einer Stoffdurchlässigkeit von 25oSR gemahlen (die erforderliche Zeit betrug gewöhnlich 30 bis 35 Minuten). Der Papierstoff wurde dann auf eine Endstoffdichte von 2% mit weiterem 1/3 PBS je nach Bedarf eingestellt.

Zugabe/Inkubierung der Additive:

Die Cellulaselösung wurde zum dicken Papierstoff (2% Stoffdichte) gegeben. 2 l des dicken Papierstoffs (enthaltend 40 g Faser) wurden in ein Metallgefäss gegeben und bei der geringstmöglichen Geschwindigkeit gerührt, um eine langsame Bewegung des Papierstoffs zu erreichen. Kräftiges Rühren sollte vermieden werden, da anderenfalls eine Denaturierung des Enzyms während des Inkubierungszeitraums auftreten kann. Der Papierstoff befand sich auf Umgebungstemperaturen (20 bis 25ºC).
Die Inkubierungszeit betrug 15 Minuten. Während dieses Inkubierungszeitraums kann es sein, dass die Bewegung des Papierstoffs leichter/schneller zu werden scheint. Falls dies auftritt, dann sollte die Rührgeschwindigkeit soweit wie möglich reduziert werden.
Nachdem der Inkubierungszeitraum von 15 Minuten vergangen war, wurde der dicke Papierstoff zum Dosierer gegeben.

Dosierer:

Der dicke Papierstoff im Dosierer wurde dann auf eine Stoffdichte von 0,25% unter alleiniger Verwendung von DEMI-Wasser verdünnt. Normale Rührgeschwindigkeiten im Dosierer wurden zum Mischen des Papierstoffs eingesetzt.

Handmusterbildung:

Der Siebwasserkasten wurde mit DEMI-Wasser zur Handmusterbildung gefüllt. Mit dem Handmuster-Formsieb an der Verwendungsstelle im Formaufbau wurde 1 l Papierstoff aus dem Dosierer zum Schöpfrahmenkasten zusammen mit Wasser aus dem Siebwasserkasten gegeben. Die Inhalte des Schöpfrahmenkastens wurden mit dem perforierten Rührer gerührt (fünf mal auf- und abbewegt). Nach der fünften Bewegung wurde der Rührer an der Oberfläche des Wassers angehalten, um die Bewegung des Wassers im Schöpfrahmenkasten zu dämpfen. Das Wasser wurde dann zum Siebwasserkasten zurückgepumpt, und das nasse Anfangsvlies wurde gebildet.
Abhängig von der Stärke des Rührens kann etwas Schäumung im Schöpfrahmenkasten auftreten. Dieser Schaum kann noch bestehen bleiben, nachdem das nasse Anfangsvlies gebildet wurde und kann relativ substantiell sein. Ein wenig dieses Schaums kann dispergiert werden, falls die Pumpe für einige Sekunden angestellt bleibt, nachdem das Wasser entfernt wurde, so dass Luft durch das Vlies gezogen werden kann.

Handmusterpressen und -trocknen:

Das nasse Vlies und das Handmustersieb wurden zum Pressen aus der Form entfernt. Der Feuchtigkeitsgehalt des gepressten Blattes sollte 70% sein. Das gepresste Blatt wurde dann auf einem elektrisch geheizten Trommeltrockner getrocknet. Die Oberflächentemperatur des Trockners betrug 105ºC, und die Geschwindigkeit des Trockners war derart, dass das gepresste Blatt für 35 Sekunden mit der heissen Oberfläche in Kontakt war. Der Feuchtigkeitsendgehalt des Blattes sollte zwischen 4 und 7% (typischerweise 5%) sein.
Falls der Feuchtigkeitsgehalt des Blattes nach dem Pressen weniger als 70% ist, dann kann das Blatt an der Oberfläche des Trommeltrockners kleben, wenn die obigen Bedingungen eingesetzt werden. Dies kann auftreten, weil ungleichförmige Pressdrücke über die Breite des Blattes angelegt werden. Massnahmen sollten getroffen werden, um dies zu vermeiden.
Wenn die Oberflächentemperatur des Trommeltrockners geringer als 105ºC, aber 70ºC oder höher ist, sind längere Kontaktzeiten erforderlich, damit das Handmuster einen Feuchtigkeitsendgehalt von 5% aufweist.
Falls die Oberflächentemperatur des Trommeltrockners unter 70ºC ist, ist es notwendig, die Kontaktzeit weiter auszudehnen oder das Anfangspressen auf dem nassen Vlies zu erhöhen, um mehr Wasser zu entfernen, oder beides zu tun. Es ist möglich, den Feuchtigkeitsgehalt des gepressten Blattes auf weniger als 60% zu reduzieren.

Untersuchung:

Vorbereitung und Untersuchung des Papiers werden gemäss den Verfahren durchgeführt, die niedergelegt sind in "Tappi Test Methods", herausgegeben von TAPPI, Technology Park Atlanta, PO Box 105113, Atlanta GA 30348, USA, ISBN 0-89852-200-5 (Band 1 und 2). Der HST (Hercules Sizing Test) wird als Leimungstest für Papier durch Tintenbeständigkeit T530 um-83 definiert; und der Cobb-Test wird durch T441om-84 definiert.
Eine Reihe von Experimenten wurde durchgeführt, in denen die Cellulasekonzentration, Alterungszeit und Temperatur jeweils variiert wurden. Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen dargestellt, worin gilt:
"natürlich gealtert" bezeichnet die Lagerung für die angegebene Zeit bei 23 ± 1ºC bei einer relativen Feuchtigkeit von 50,0 ± 2%, wie in T402om-83 angegeben;
"ofengehärtet" bezeichnet die Behandlung bei 80ºC für 30 Minuten LEIMUNGSEIGENSCHAFTEN VON HANDMUSTERN, HERGESTELLT MIT CELLULASE UND GETROCKNET UNTER STANDARDBEDINGUNGEN: "HST (Sekunden) von mit Penicillium funiculosum hergestellten Handmustern" "HST (Sekunden) von mit Trichoderma reesei hergestellten Handmustern" "Cobb (g/m²) von mit Trichoderma reesei hergestellten Handmustern"

BEISPIEL 9

In einer weiteren Reihe von Experimenten, die unter den oben in Beispiel 8 beschriebenen Protokollen durchgeführt wurden, wurde der Grad untersucht, mit dem das zugegebene Protein [Celluclast (Trichoderma reesei, Novo Nordisk) und Celluzyme (Humicola insolens, Novo Nordisk)] durch das Papier zurückgehalten wird.
In separaten Experimenten wurden Celluclast und Celluzyme zu Papierzellstoff gegeben und Testblätter wie oben beschrieben hergestellt (24 h natürlich gealtert). Die Menge des im Papier zurückgehaltenen Proteins (im Gegensatz zu demjenigen, das im Zellstoffüberstand bei der Bildung der Papierfläche zurückbleibt) wurde auf der Basis des Stickstoffgehalts des Papiers abgeschätzt, wobei angenommen wird, dass der Stickstoffgehalt beider Proteine 16% G/G beträgt. Der Stickstoffgehalt wurde durch Antec- Mikropyrolyse gemessen.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Zugabemengen von Celluzyme mit einem Viertel derjenigen von Celluclast zu ähnlichen Protein-Retentionsgraden führten. Bei ähnlichen Protein- Retentionsgraden ergaben beide Cellulasen ähnliche Leimungswirkungen.

BEISPIEL 10

Im folgenden Beispiel wird die Bindung von Amylaseenzymen an Stärke gezeigt. Zwei Amylaseenzyme wurden unter Verwendung von HPLC charakterisiert: Eine α-Amylase (Typ X-A Rohzubereitung) aus Aspergillus oryzae und Amyloglucosidase aus A. niger (erhältlich von Sigma Aldrich Co. Ltd., Poole, Dorset, Grossbritannien). Die katalytischen Haupt-Peaks jeder Zubereitung wurden unter Verwendung eines Stärkeglucose-Freisetzungsassays bestimmt. Die Bindungswirksamkeiten jedes Proteins wurden gegen eine Reihe von Stärken bestimmt, wobei BSA- Kontrollen in der Untersuchung eingeschlossen wurden.
Eine Lösung von 32 mg/ml (Trockengewicht) α-Amylase wurde in 0,1 M PBS (pH 7,0) hergestellt. 100 ul davon wurden auf eine HPLC unter Verwendung einer Bio-Sil SEC- Gelpermeationssäule aufgetragen, die mit 0,1 M Phosphatpuffer bei 1 ml/min lief. Fraktionen (1 ml) wurden aufgefangen und unter Verwendung des Standard- Mikrotiterassays (für Glucose) auf aus einer Stärkesuspension freigesetzte reduzierende Zucker untersucht.
Der folgende qualitative Test wurde zur Bestimmung von Glucose und Cellobiose in den Testproben verwendet. Der Test wurde in einer Mikrotiterschale bei Raumtemperatur durchgeführt.

Reagensbestandteile:

10 ul Phenolreagens (0,128 M Phenol in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0)
10 ul Aminopyrinreagens (19,7 mM 4-Aminophenazon in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0)
10 ul Peroxidase in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0 (zum Erhalt von 800 EU/ml)
10 ul Glucoseoxidase in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0 (zum Erhalt von 250 Eu/ml)
60 ul 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0.
Diese Reagenzienbestandteile wurden vermischt und auf die Wände einer Mikrotiterschale gegeben. Testproben mit 100 ul wurden hinzugegeben, gefolgt von einem Überschuss Substrat (Stärke). Das Erscheinen einer roten Färbung war Indiz für die Gegenwart von Amylase.
Die gleichen Verfahren wurden ebenfalls zur Herstellung eines HPLC-Profils für die Amyloglucosidase verwendet. Die Amyloglucosidase war eine flüssige Zubereitung, die ca. 262 mg/ml Protein enthielt, gemessen durch die Coomassie Blau-Technik. 100 ul einer 0,007-Verdünnung in 0,1 M PBS (pH 7,0) wurden auf die HPLC aufgetragen und bei 230 nm, 0,1 AUS überwacht. 1 ml-Fraktionen wurden aufgefangen und auf aus Stärkesuspensionen freigesetzte reduzierende Zucker wie oben untersucht.
Die Fähigkeit von α-Amylase und Aminoglucosidase zur Bindung an normale Stärke in Suspension wurde untersucht. Stärke (0,2 g; Roquette) wurde zu 9 ml 0,1 M PBS (pH 7,0) gegeben, und 1 ml α-Amylaselösung (9,5 mg/ml nach Coomassie Blau-Assay) wurde hinzugegeben. Dies wurde auf einem Schüttler für 20 Minuten inkubiert.
Die Probe wurde bei 13.000 U/min für 5 Minuten zentrifugiert und 100 ul-Proben auf die HPLC-Säule aufgetragen. Das Peak-Profil der nach 20 Minuten gebundenen α-Amylase wurde mit einer Probe bei T = 0 verglichen. Aus diesen Daten wurde die prozentuale Bindung des Enzyms berechnet. Die Bindung von Amyloglucosidase wurde ebenfalls gegen kationische Stärke untersucht. BSA wurde ebenfalls in der gleichen Weise als Kontrolle verwendet. Die Endkonzentration des verwendeten BSA betrug 0,2% G/V in 0,1 M PBS.
Die Ergebnisse der Bindungsexperimente sind in der folgenden Tabelle gezeigt. STÄRKEBINDUNGSPROFILE
Diese Ergebnisse zeigen, dass sowohl α-Amylasen als auch Amyloglucosidasen spezifisch an sowohl Stärke als auch kationische Stärke binden.

Claims

1. Verfahren zur Papierleimung, umfassend die Schritte aus a) Inkontaktbringen des Papiers oder eines Bestandteils des Papiers mit einem Protein, das zur Bindung an das Papier oder an den Bestandteil des Papiers fähig ist; und b) Denaturieren des an das Papier gebundenen Proteins.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Protein mittels Wärme denaturiert wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, worin das Papier auf eine Temperatur von 70 bis 170ºC erhitzt wird.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, worin das Papier auf eine Temperatur von 80 bis 110ºC erhitzt wird.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Protein mittels Behandlung mit einem chemischen Denaturierungsmittel denaturiert wird.

6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Protein zur Bindung eines Polysaccharids fähig ist.

7. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Protein zur Bindung von Cellulose fähig ist.

8. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Protein eine Cellulase oder ein Fragment davon ist.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, worin das Protein eine Cellulase ist, ausgewählt aus der Gruppe, die Cellumonas fimi, Trichoderma viride, Trichoderma reesei, Aspergillus niger, Füsarum oxysporum, Penicillium funiculosum und Humicola insolens umfaßt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 8, worin das Protein eine Exo-Cellulase oder ein Fragment davon ist.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, worin das Protein von Humicola isolens stammende Cellulase ist.

12. Verfahren gemäß Anspruch 8, worin das Protein eine Endo-Cellulase oder ein Fragment davon ist.

13. Verfahren gemäß Anspruch 12, worin das Protein von Trichoderma reesei stammende Cellulase ist.

14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Protein zur spezifischen Bindung an Stärke fähig ist.

15. Verfahren gemäß Anspruch 14, worin das Protein eine Amylase oder ein Fragment davon ist.

16. Verfahren zur Herstellung von geleimtem Papier, umfassend die Schritte aus a) Herstellen eines Papierzellstoffs, b) Zugeben eines Proteins, das zur Bindung an einen Bestandteil des Zellstoffs fähig ist, c) Bilden von Papier aus dem Zellstoff und d) Erhitzen des Papiers zur Denaturierung des Proteins.

17. Papier, geleimt gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16.