PT845060E - Mtodos para acabamento de papel - Google Patents

Description

Descrição “Métodos para acabamento de papel” 1 Campo Técnico A presente invenção refere-se a métodos para acabamento de papel. Em particular, a presente invenção refere-se à utilização de uma proteína capaz de se ligar a papel ou a um constituinte de papel para acabar o papel. 2 Enquadramento Geral

Enquanto há uma miríada de pormenores para a fabricação de papel, o processo de fabricação de papel compreende convencionalmente as seguintes operações: (1) formar uma suspensão aquosa de fibras celulósicas, correntemente conhecida como pasta, (2) adicionar vários materiais de processamento e de reforço do papel, tais como materiais de aumento da resistência mecânica e/ou acabamento; (3) acamar e secar as fibras para formar uma teia celulósica pretendida; e (4) tratar posteriormente a teia para proporcionar várias características pretendidas ao papel resultante, incluindo aplicação superficial de materiais de acabamento, e semelhantes.

Os materiais de acabamento têm tipicamente a forma de soluções, dispersões, emulsões ou suspensões aquosas que tomam o papel tratado com agente de acabamento, nomeadamente papel acabado, resistente à penetração ou à molhagem por um líquido aquoso, incluindo outros aditivos de tratamento, tintas de impressão e semelhantes.

Pode aplicar-se um agente de acabamento à superfície do papel como um acabamento “superficial” ou pode ser incorporado dentro do papel como um acabamento “interno”. Conhecem-se muitos agentes químicos de acabamento ?

7H incluindo composições de acabamento à base de resina e à base de dímeros de ceteno. US-A-3 222 245 divulga o acabamento de papel utilizando colas animais.

No entanto, mantém-se a necessidade de composições de acabamento e métodos de acabamento aperfeiçoados.

Tipicamente, o principal constituinte do papel é celulose. A celulose pode estar sob a forma de fibras de madeira ou de fibras de colheitas anuais (por exemplo, cânhamo, palha, arroz, linho, juta ou algodão). Outros constituintes do papel podem incluir outros materiais poliméncos, incluindo polímeros de ocorrência natural tais como amido, pectina, guar, quitina, ligmna, agar, alginato, assim como outros polissacáridos que incluem hemiceluloses tais como xilanose, manose e arabinose. A xilanose é o principal constituinte de xilano. também conhecido como hemicelulose que ocorre em relva, cereal, palha, cascas de grãos e madeira. Amido ocorre em sementes, frutos, folhas, bolbos, etc.

Enzimas que são capazes de modificar um substrato de enzimas, tipicamente baseiam-se numa interacção de ligação não covalente com substrato da enzima a fim de funcionar. Uma dessas classes de enzimas compreende enzimas que degradam polímeros, por exemplo proteinases, queratinases, quitinases, ligninases, agarases, alginases, xilanases, manases, amilases, celulases e hemicelulases. Por exemplo, celulases e hemicelulases clivam moléculas de sacáridos ou de polissacáridos de celulose e hemicelulose, respectivamente, e amilases clivam glicose de amido. US-A-4 980 023 descreve a adição da enzima celulase a papel durante a fabricação para provocar a decomposição do papel quando exposto à humidade.

As interacções entre celulose e proteínas de celulase, em particular aquelas que se ligam às fibras de celulose como um pré-requisito da actividade catalítica 7ϋ foram descritas e revistas (celulase: Béguin, Annu. Rev. Microbiol., 44, 219-248, 1990; celulases e xilanases: Gilbert e Hazelwood, Journal of General Microbiology, 139, 187-194, 1993). Este grupo de enzimas inclui celulases e hemicelulases que compreendem domínios de proteína funcionalmente distintos. Em particular, o domínio responsável pela actividade catalítica é estruturalmente distinto do domínio de ligação da celulose. Estes domínios são sequências evolucionariamente conservadas que são muito semelhantes em todas essas proteínas (Gilkes et al., Microbiologícal Reviews, 303-315, Junho de 1991).

Os domínios de ligação dessas proteínas podem ser separados dos domínios dos sítios activos por proteólise. Os domínios de ligação isolados verificou-se que retêm as capacidades de ligação (Van Tilbeurgh, et al., FEBS Letters, 204(2). 223--227, Agosto de 1986). A utilização de domínios de ligação da celulose de celulases foi proposta como um meio para tomar áspera a textura das superfícies de suporte celulósico, enquanto o uso de domínios com sítios activos de celulase foi proposto como um meio para amaciar a textura dessas superfícies (pedido de patente internacional WO-A-93/05226).

Um certo número de domínios de ligação foi também caracterizado ao nível genético (Ohmiya et al., Microbial Utilisation of Renewal Resources, 8, 162-181, 1993) e foi subclonado para produzir novas proteínas de fusão (Kilburn et al., pedido de patente internacional publicado WO-A-90/00609; Ong et al., Enzyme Microb. Technol, 13, 59-65, Janeiro de 1991; Shoseyov et al., pedido de patente internacional publicado WO-A-94/24158. Algumas destas proteínas de fusão foram utilizadas como proteínas de ancoragem para aplicações especificas. Estas proteínas foram utilizadas como um auxiliar para a purificação das proteínas mediante a adesão das proteínas de fusão a materiais de suporte celulósicos utilizados em estratégias de purificação de proteínas (Kilbum et al.., US-A-5 137 819; Greenwood et al., Biotechnology and Bioengineering, 44, 1295-1305, 1994). A capacidade de imobilizar proteínas de fusão em suportes celulósicos foi também sugerida como um meio de imobilização para biorreactores de enzimas (Ong et al., Bio/Technology, 7, 604-607, Junho de 1989; Le et al., Enzyme Microb. Technol., J_6 496-500, Junho de 1994), e como um meio para ligar um “rótulo’’ químico a um material celulósico (pedido de patente internacional WO-A-93/21331).

Foi agora descoberto que proteínas capazes de se ligar a papel ou um constituinte de papel podem ser utilizadas para o acabamento do papel. 3 Sumário da Invenção

De acordo com a presente invenção proporciona-se um método para acabamento de papel que compreende os passos que consistem em a) contactar o referido papel ou um constitumte do mencionado papel com uma proteína capaz de se ligar ao citado papel ou ao referido constituinte do papel e b) desnaturar a mencionada proteína ligada ao citado papel.

De acordo com um posterior aspecto da presente invenção, proporciona-se um método de acabamento do papel que compreende a) contactar o referido papel ou um constituinte do mencionado papel com uma proteína capaz de se ligar ao citado papel ou ao referido constituinte de papel e b) desnaturar a mencionada proteína ligada ao citado papel por aquecimento do referido papel. A invenção também se refere a um método para fabricação de papel acabado como se descreve na reivindicação 16. A invenção, além disso, proporciona papel acabado de acordo com um 3 77f método da presente invenção. 4 Descrição Pormenorizada da Invenção A presente invenção proporciona um método para acabamento de papel. Como utilizado na presente memória descritiva, o termo “papel” refere-se a qualquer material com a forma de folha ou de teia coerente que compreende uma rede entrelaçada de fibras que contêm celulose derivadas de origens vegetais, opcionalmente misturadas com fibras de origens vegetais, minerais, animais ou sintéticas em várias proporções e opcionalmente misturadas com finas partículas de materiais inorgânicos tais como óxidos, carbonatos e sulfatos de elementos metálicos em várias proporções. O termo “papel” inclui cartão que se refere a papel quando o peso da folha ou da teia de papel é maior que 200 g/m2.

Fontes vegetais de celulose incluem madeira, palha, bagaço, esparto, bambu, quenafe, capim, juta, rami, cânhamo, algodão, linho. A celulose derivada de vegetais brutos é processada para formar pasta, o material a partir do qual se faz o papel ou mecanicamente, ou quimicamente, ou mecânica e quimicamente. As pastas que contêm papel podem ser descritas como mecânicas, quimimecânicas e quimitermomecânicas, semiquimicas, químicas de alto rendimento, completamente químicas (ver “Pulp and Paper, Chemistry and Chemical Technology”, Terceira Edição, Volume 1 páginas 164, 165 editado por James P. Cassay ISBN 0-471 -03175-5-(v. 1)) de acordo com o método de preparação e purificação da pasta. O papel pode também compreender outros polímeros de ocorrência natural tais como proteínas como queratina, amido (incluindo amido aniónico, catiónico ou anfotérico), pectina, guar, quitina, lignina, agar, alginato, assim como outros polissacáridos incluindo hemiceluloses tais como xilanose, manose e arabinose. 6 τα Ο método da presente invenção compreende contactar papel ou um constituinte de papel com uma proteína capaz de se ligar ao papel ou constituinte de papel seguido por desnaturação da proteína. A proteína empregada na presente invenção pode compreender qualquer proteína capaz de se ligar ao papel ou ao constituinte de papel. A proteína pode por exemplo compreender uma proteína capaz de se ligar à celulose ou qualquer outra substância polimérica presente como constituinte do papel. Preferivelmente, a proteína é capaz de ligação específica a celulose ou qualquer outra substância polimérica presente como constituinte do papel. Mais preferivelmente, a proteína é capaz de se ligar com uma constante de dissociação (Kd) menor do que 1 x 10'3M.

Tal como usado na presente memória descritiva, o termo “proteína” inclui péptidos, oligopéptidos e polipéptidos, assim como resíduos de proteína, espécies que contém proteína, cadeias de ammoácidos e moléculas que contêm uma ligação peptídica. Quando o contexto o requerer (por exemplo, quando a proteína está ligada a outra molécula), a referência a uma proteína significa um resíduo de proteína. A proteína pode compreender uma proteína de ocorrência natural ou um seu fragmento ou proteína modificada que se pode obter por modificação química ou síntese ou por expressão de um gene geneticamente modificado que codifica a proteína. Tal como utilizada na presente memória descritiva, a expressão “proteína modificada” inclui análogos químicos de proteínas capazes de se ligar a papel ou a um seu constituinte. Preferivelmente, a proteína compreende uma enzima de ocorrência natural ou um seu fragmento que é capaz de se ligar a papel ou a um constituinte de papel. Exemplos de proteínas capazes de se ligar a papel ou a um constituinte de papel são conhecidos e incluem enzimas escolhidas do grupo que compreende celulases. 7 hemicelulases, manases, xilanases, quitinases, hgninases, agarases, alginases e amilases. A proteína pode por exemplo compreender uma amilase ou um seu fragmento capaz de se ligar a amido (tal como amido aniónico, catiónico ou anfotérico) quando presente como um constituinte de papel ou da pasta de papel. Exemplos de amilases incluem α-amilases, por exemplo de Aspergillus oryzae (disponível como preparação bruta Tipo X-A de Sigma Aldrich Co Ltd), e amiloglucosidases, por exemplo de Aspergillus niger (disponível de Sigma Aldrich Co Ltd).

Preferivelmente, a proteína compreende uma proteína capaz de se ligar a celulose. Mais preferivelmente, a proteína compreende uma celulase ou um seu fragmento. A celulase pode compreender uma celulase de ocorrência natural, ou um seu fragmento, ou celulase modificada que se pode obter por modificação química de uma celulase que ocorre naturalmente ou síntese ou por expressão de um gene modificado geneticamente que codifica uma celulase. A celulase pode, por exemplo, ser modificada para remover ou desactivar o domínio do sítio activo. Conhece-se uma variedade de celulases que se ligam à celulose. Exemplos dessas celulases são as que se podem isolar de organismos bacterianos tais como Cellulomonas fimi e de organismos fúngicos tais como Trichoderma viride, Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, Penicillium fúniculosum, Trichoderma reesei e Humicola insolens, disponíveis como preparações comerciais de Sigma Chemical Sigma-Aldnch Company Ltd., Novo Nordisk A/S, BDH Ltd. ou ICN Biomedicals Ltd. (Fusarium oxysporum é disponível por exemplo sob o N° de depósito DSM 2672). Altemativamente, a proteína pode ser produzida por técnicas de DNA recombinantes 8 como divulgado, por exemplo, no pedido de patente internacional WO-A-94/24158. As celulases geralmente compreendem um domínio de ligação de celulase e um domínio responsável pela actividade de celulase. A presente invenção pode empregar a celulase como um todo ou um seu fragmento capaz de se ligar à celulose. Pode obter-se um domínio de ligação da celulase a partir da celulase global por tratamento com protease(s). como papaína. A celulase pode compreender uma exo-celulase ou uma endo-celulase. Exo-celulases (também conhecidas como celobio-hidrolases, CBH; exoglucanases, 1,4-beta-D-glucano-celobio-hidrolases; EC 3.2.1.91) actuam sobre a extremidade não redutora de uma molécula de celulose. Exo-celulases podem libertar unidades terminais de celobiose (um dissacándo) ou libertam unidades terminais de glucose (monossacárido). Exemplos de exo-celulases incluem a celulase que se pode obter a partir de Humicola isolens. Endo-celulases (também conhecidas como Beta-l,4-Endoglucanases; Endo-l,4-D-glucanases; 1,4-Beta-D-glucano glucano-hidrolases; EC 3.2.1.4) clivam as ligações internas beta-1.4-glicosídicas originando uma mistura de glucose, celobiose e outros celo--oligossacáridos. Exemplos de endo celulases incluem a celulase que se pode obter a partir de Trichoderma reesei. A proteína pode também compreender celulosomas. Celulosomas compreendem um sistema de celulase que compreende complexos de multienzimas discretos, multifuncionais. Tipicamente contêm pelo menos 14 polipéptidos distintos que incluem numerosas endoglucanases (endocelulases) e xilanases e pelo menos uma beta-glucanase. Elas são associadas com proteínas de formação do esqueleto. Celulosomas são descritos pormenorizadamente em Bayer E.A., Moag E, Lamed R. (1994), “The cellulosome - a treasuretrove for biotechnology”, Trends in Μ

Biotechnology 12:379-386.

Preferivelmente, a proteína empregada na presente inverição compreende celulase que se pode obter a partir de Humicola isolens (disponível como Celluzyme® de Novo Nordisk AIS, Bagsvaerd, Dinamarca) ou celulase que se pode obter a partir de Trichoderma reesei (disponível como Celluclast® de Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca). Mais preferivelmente, a proteína compreende celulase que se pode obter a partir de Humicola isolens. A proteína pode ser adicionada ao papel em qualquer fase apropriada na fabricação e processamento de papel. Pode ser adicionada na fase de pasta ou em qualquer fase durante a formação da matriz de pasta húmida ou durante a prensagem e laminagem da matriz para formar papel. Assim, de acordo com a presente invenção, proporciona-se um método de fabricação de papel com acabamento que compreende as operações que consistem em a) preparar uma pasta de papel, b) adicionar uma proteína capaz de se ligar a um constituinte da referida pasta, c) formar papel a partir da mencionada pasta e d) aquecer o citado papel para desnaturar a referida proteína.

Como variante, a proteína pode ser adicionada ao produto de papel formado, por exemplo, mergulhando o papel num banho que contém a proteína ou por qualquer processo de pulverização, espalhamento, aplicação à escova, revestimento ou impressão apropriado. Assim, a invenção proporciona ainda um método para fabricação de papel acabado que compreende as operações que consistem em a) aplicar ao papel uma proteína capaz de se ligar ao mencionado papel e b) aquecer o citado papel para desnaturar a referida proteína.

Escolhendo o momento na fabricação do papel em que se adiciona a proteína. ΙΟ pode exercer-se o controlo para verificar se a proteína está ou não distribuída através do papel ou se está substancialmente restringida aos níveis da superfície do papel. A proteína deve ser incubada com o papel ou com a pasta de papel durante tempo suficiente para permitir a ligação da proteína ao papel ou à pasta de papel. Tipicamente, verificou-se ser adequado 15 minutos, embora possam ser apropriados tempos de incubação mais curtos. A proteína pode ser adicionada numa quantidade apropriada para atingir o nível de acabamento pretendido. A proteína pode ser adicionada numa quantidade de 0,01-40% em peso do peso seco da pasta de papel. Preferivelmente a proteína é adicionada numa quantidade de 0,1 a 20% em peso, mais preferivelmente 1 a 10% em peso. A seguir à incorporação da proteína no papel ou à aplicação da proteína na superfície do papel, realiza-se o acabamento de papel desnaturando a proteína. A proteína pode ser desnaturada pela aplicação ao papel de um desnaturante químico da proteína. Os desnaturantes químicos das proteínas incluem ureia, guanidina, ácidos, álcoois, detergentes (como Tween®), substâncias orgânicas solúveis em água (como álcoois alifáticos) e iões caotrópicos (tais como Γ, ClOf, SCN', Lf, Mg2+, Ca2 e Ba2').

Preferivelmente, o acabamento realiza-se aquecendo o papel, Preferivelmente, o papel pode ser aquecido a uma temperatura de 50CC a 200°C, mais preferivelmente 70°C a 170°C, mais preferivelmente 80°C a 110CC, mais preferivelmente ainda 100°C a 110CC Tipicamente, o papel pode ser aquecido aproximadamente a 105°C em rolos aquecidos por vapor. O papel pode ser submetido a um ou mais tratamentos térmicos a diferentes temperaturas. Μ Ο intervalo de tempo de aquecimento necessário depende da temperatura à qual o papel é aquecido, sendo necessários maiores intervalos de tempo a temperatura mais baixa. Tipicamente, o papel pode ser aquecido durante entre 15 e 500 segundos, preferivelmente entre 25 e 300 segundos. O papel pode também ser submetido a tratamentos térmicos pós-manufactura para envelhecer ou endurecer o papel. A invenção é seguidamente descrita com referência aos seguintes exemplos.

Pretende-se que a seguinte descrição só seja referida a título de exemplo e que se possam realizar modificações de pormenor dentro do âmbito da invenção.

EXPERIMENTAL

Materiais e Protocolos

Com excepção do que se indica abaixo, os seguintes materiais e protocolos foram utilizados nos exemplos para caracterizar a utilização de proteínas como agentes de bioacabamento.

Pasta: Preparou-se pasta de papel em folha/água adicionando 10 g de papel para folhas-água (70:30 de madeira dura (bétula) : madeira macia (pinheiro)) a 100 ml de água destilada. Depois de 5 minutos, o papel estava misturado de maneira a obter-se uma pasta homogénea. Pesaram-se amostras da suspensão de pasta (correspondendo a 0,2 g de papel seco) para balões Universal.

Incubação: A cada frasco de 10,0 ml adicionou-se uma das seguintes soluções tampão de incubação: (a) Tns-HCI, 50 mM, pH 7,5 (b) Solução salina tamponizada com fosfato (PBS) 500 mM, pH 7,5

Celulases: A suspensão de incubação adicionou-se uma celulase escolhida 12 7ii das seguintes: 1. Humicola insolens - Celulase derivada de Humicola insolens disponível como Celluzime® de Novo Nordisk A'S, Bagsvaerd, Dinamarca (875 μΐ que correspondem a 8,7% em peso por peso de proteína que se liga à celulose peso seco de pasta). 2. Trichoderma reesei - Celulase derivada de Trichoderma reesei disponível como Celluclast® de Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca (70 μΐ que correspondem a 0,28 pmoles de proteína que correspondem a 4,4% em peso por peso de proteína que se liga a celulose para pasta seca em peso). 3. Trichoderma viride - celulase derivada de Trichoderma vivi.de disponível de BDH Ltd UK.

Também se realizaram experiências de controlo na ausência de celulase.

Incubação: Incubaram-se as misturas durante 15 minutos à temperatura ambiente com ligeira agitação.

Preparação de folha de ensaio: Para produzir as folhas de papel para ensaio, aumentou-se o volume para 100 ml com água destilada e produziram-se folhas de papel (6 cm“) usando uma máquina de fabricação de papel concebida para laboratório operada da seguinte maneira: despejou-se uma suspensão de pasta de papel (0,2 % em peso/volume) num suporte de filtro de plástico que aloja uma fina rede de filtração de nylon. Aplicando vácuo durante alguns segundos, a pasta foi transformada numa folha de papel suportada pela rede. A rede de filtro foi retirada da máquina e a folha de papel ensanduichada entre uma segunda rede de nylon e enxugada entre papel mata borrão. A folha de papel foi cuidadosamente retirada da rede de formação de papel, alisada por passagem entre rolos e em seguida seca. 13

Secagem da Folha de Ensaio/Aquecimento: Folhas de papel foram secas de acordo com uma das seguintes maneiras (a) secagem ao ar; (b) secador em tambor - trabalhando tipicamente a uma temperatura constante de 80°C a 108°C com um tempo de contacto de 40 a 250 s; (c) prensa de chapa quente - que tipicamente produz uma temperatura superficial máxima de 160°C com um tempo de contacto de 30 s. Utilizou-se uma chapa de alumínio plana para prensar as folhas de papel de ensaio (ensanduichadas entre papel mata borrão) de encontro à chapa quente.

Protocolos de Ensaio: As folhas secas foram avaliadas relativamente ao acabamento por um ou mais dos seguintes ensaios: (a) Ensaio da gota de tinta (IDT) - em que uma gota de 15 μΐ de tinta Parker Super Quink Ink (.Azul-escuro Permanente) sobre a amostra de papel a ensaiar e o tempo que demora a completa absorção foi medido e registado. Os resultados foram registados em segundos ou numa escala empírica de 0 a em que: 0 significa menos de 100 s para a absorção completa. + significa 100-500 s para a absorção completa. -H- significa 500-1000 s para a absorção completa. +-H- significa 1000-2000 s para a absorção completa. +-H—r significa mais do que 2000 s para a absorção completa

(b) Ensaio de Acabamento Hercules (HST) - definido em “Tappi Test Methods” publicado por TAPPI, Technology Park, Atlanta, PO Box 105113, GA 14 30348, USA, ISBN 0-89852-200-5 (Vo! 1 and 2), (1987). O HST é definido como um ensaio de acabamento para papel por resistência à tinta T530pm-83. Os dados são registados em segundos; quanto maior for o seu valor, melhor é o acabamento. Preferivelmente obtém-se um valor de HST maior do que 20 segundos, mais preferivelmente maior do que 120 segundos e mais preferivelmente ainda maior do que 200 segundos. (c) Ensaio do Acabamento Cobb - definido em “Tappi Test Methods” (Ibid) por T441om-84. Os dados são registados em gramas/m2. “Completamente saturado” significa que o papel não possui qualquer acabamento. Quanto menor for o valor de Cobb, melhor é o acabamento. Preferivelmente obtém-se um valor do índice de Cobb menor do que 30 g/m\ mais preferivelmente menor do que 21 g/m2. Exemplo 1

Realizou-se uma investigação sobre o efeito da temperatura no acabamento conferido por uma preparação de celulase de Trichoderma reesei (Celluclast®, Novo Nordisk A/S, Bagsvaer, Dinamarca). Para estes estudos utilizou-se um secador de tambor em associação com uma placa quente de temperatura variável. O secador de tambor originou uma temperatura constante de 80°C com um tempo de contacto de 250 s e a placa quente originou uma temperatura superficial máxima de 160°C com um tempo de contacto de 30 s. Usou-se uma placa de alumínio plana para prensar as folhas de papel (ensanduichadas entre papel mata borrão) de encontro à placa quente. A preparação de celulase de Trichoderma reesei (70 ul de Celluclast®, correspondendo a 4,4% em peso/peso de proteína que liga celulose, com base no peso seco de fibra de celulose) e as misturas foram incubadas durante 15 minutos à temperatura ambiente com ligeira agitação. Também se realizaram experiências de controlo sem celulase.

As folhas de papel para ensaio foram preparadas como se descreveu antes. As folhas de ensaio foram inicialmente prensadas entre papel mata borrão e depois secas de acordo com uma das seguintes maneiras: (a) secagem ao ar; (b) secador de tambor: 80°C/250 s; ou (c) prensa de placa quente: 160°C/30 s seguida por secador de tambor 80°C/250 s.

As folhas secas foram então ensaiadas relativamente ao acabamento por meio do Ensaio de Gota de Tinta (IDT).

Obtiveram-se os seguintes resultados do acabamento a partir de papéis de ensaio preparados em regimes de secagem diferentes.

Quadro 1: Efeito do regime de secagem do papel sobre o sistema de acabamento com base em celulase

Regime de secagem Adição à pasta Seco no ar 80°C/250 s 160°C/30 s + 80°C/250 s Celluclast® + Tris-HCl 0 -l 1 1 1 ' 1 1 1 1 1 Celluclasí® + PBS - - -H- Tris-HCl - 0 0 PBS - 0 0 PEO _=___ - 0 0 = Não ensaiado. Não se observou qualquer acabamento quando os papéis foram feitos sem enzima, excluindo a possibilidade de os sais de tampão estarem a interactuar com a

celulose de tal maneira que se afectasse o acabamento. Observou-se a existência de acabamento com incubações com Tns-celulase de T. Reesei (Celluclast®) e observou-se um maior grau de acabamento quando os papéis foram secos inicialmente à temperatura mais alta seguida por secagem em tambor à temperatura mais baixa. O papel de celulase/PBS também originou um acabamento à temperatura mais alta mas o grau de acabamento era menor do que o obtido na presença de Tris-HCl.

Exemplo 2

Investigou-se o efeito do tempo de incubação sobre os níveis de acabamento conferidos utilizando uma preparação de celulase de Humicola insolens (Celluzyme®, Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca).

Adicionou-se Tris-HCl (50 mM. pH 7,5, 10 ml) a 0,2 g de pasta em água destilada e adicionou-se a preparação de celulase de Humicola insolens (875 μΐ) e incubou-se a mistura durante 15 minutos ou 90 minutos à temperatura ambiente. No fím do período de incubação, as amostras de pasta foram misturadas por meio de vórtex e diluídas a 100 ml. Prepararam-se papéis para ensaio de maneira usual e secaram-se por meio de uma única passagem através de um secador de tambor 100°C/250 s.

Avaliou-se o grau de acabamento conseguido com os diferentes métodos usando o processo de IDT. 17 7>f

Quadro 2:

Enzima Peso seco de papel da amostra ensaiada (g) Acabamento IDT Período de incubação (min) Celluzvme® (875 μΐ) 0,207 -Γ++ 15 Celluzyme® (875 μΐ) 0,157 j +++ 90 Controlo 0,218 j 0 90

Aumentando o tempo de incubação de 15 minutos para 90 minutos, o nive) de acabamento não aumenta significativamente.

Exemplo 3

Efectuou-se um outro conjunto de experiências para estabelecer uma relação quantitativa entre o acabamento conseguido em papéis de ensaio e a quantidade de preparação de celulase de Trichoderma reesei ou Humicola insolens adicionadas.

Empregaram-se condições e standardizadas de ligação de papel seguintes: a uma amostra de pasta de água destilada (equivalente a 0,2 g de papel seco) adicionaram-se 10,0 ml de tampão (50 mM Tns-HCl, pH 7,5). Adicionaram-se várias quantidades de celulase (Trichoderma reesei ou Humicola insolens; Quadro 3) e misturou-se por meio de vórtex. Incubou-se a pasta com ligeiro sacudimento à temperatura ambiente durante 15 minutos, depois do que se dilui a mistura a 150 ml com água destilada e preparam-se as folhas de papel para ensaio. Cada folha para ensaio foi retirada da rede e prensada entre uma folha dobrada de papel mata borrão 3 MM seco usando um rolador manual. Passou-se a folha (ainda dobrada no papel mata borrão) uma vez através do secador de tambor a 100-104°C com um tempo de contacto de 250 s. Os resultados obtidos são indicados no Quadro 3.

Quadro 3: Acabamento conseguido utilizando preparação de celulase ou de Trichoderma reesei (Celluclast®, Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) ou de Humicola insolens (Celluzyme®, Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca)

Celluzyme® (ul) como recebido Celluzyme® (Proteína ligante adicionado (baseado no peso do libra) °i> pcso'peso Avaliação do acabamento por IDT Celluclast® (μΐ) como recebida Celluclast® (Proteína liganlc adicionada (baseada no peso de fibra) % peso peso Avaliação do acabamento por IDT 0 0 0 0 0 0 50 0.5 + 25 1.6 *r 70 0.7 + 50 3.1 + 100 1.0 + 70 4.4 150 1.5 ++ 200* 6.3 + 200 2.0 +-H- 150 9.4 250 2.5 +-r+ 200 12.5 + 300 3.0 +++ 1 300 18.8 +-Γ 625* 6.2 +-H- | -400 25.1 ++ 875 8.7 +-H- 1 600 37.6 T- * Representa níveis de adição equivalentes.

Os resultados mostram que, enquanto ambas as celulase conferem o acabamento, a preparação de celulase de H. insolens conferiu maiores níveis de acabamento do que a celulase de T. reesei sob as condições utilizadas.

Exemplo 4

Investigaram-se os efeitos da omissão do tampão e da secagem a elevada temperatura (160°C) sobre os níveis de acabamento conseguidos com ou uma preparação de celulase de Trichoderma reesei (Celluclast®, Novo Nordisk A/S,

Bagsvaerd, Dinamarca) ou de uma preparação de celulase de Humicola insolens (Celluzyme®, Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca).

Prepararam-se folhas de papel como se descreveu antes, com as várias condições descritas no Quadro 4. Mediu-se o acabamento no dia seguinte pelo método padrão IDT.

Os resultados mostram que Celluclast® beneficia de maiores temperaturas de secagem (160°C) mais do que Celluzyme® para conferir bom acabamento.

Quadro 4: Efeito de temperatura sobre o acabamento realizado ou pela celulase de Trichoderma reesei (Celluclast®, Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) ou pela celulase de Humicola insolens (Celluzyme®, Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca)

Enzima (150 μΐ) Proteína ligante adicionada (baseada no peso da fibra) % peso/peso Tampão de incubação Regime de secagem Avaliação do acabamento IDT Celluclast® 9,4 dH,0 160°C/30s + 108°C/250 s Ι-γτ-γ Celluclast® 9,4 Tris-HCl 160°C/30 s 108°C/250 s 1 1 1 ' Celluclast® 9,4 dH20 160°C/250 s 1 : , Celluclast® 9,4 Tris-HCl 160°C/250 s ‘ Sem enzima 0 Tris-HCl 160°C/30 s + 108°C/250 s 0 Sem enzima 0 dH20 160°C/30 s + 108°C/250 s 0 Celluzyme® ' 1,5 dH20 160°C/30 s + 108°C/250 s -Hf- ί 1 l i i i Celluzyme® 1,5 Tris-HCl 160°C/30 s + 108°C/250 s ! Celluzyme® 1,5 dH20 108°C/250 s MM Celluzyme® 1,5 Tris-HCl 108°C/250 s _L ‘ 1

Exemplo 5 O Ensaio de Acabamento Hercules (HST) foi utilizado para determinar o grau de acabamento conseguido por ou celulase de Trichoderma reesei (Celluclast®. Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) ou celulase de Humicola insolens 20

(Celluzyne®, Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) com e sem a adição de Tris. Para preparar as folhas incubou-se material de pasta a 2% (peso/volume) com 5% (peso/peso) de proteína de celulase (com base no peso seco de fibra) durante 5 minutos a 25°C antes de formar as folhas de papel. As folhas foram secas num secador de tambor a 105°C durante 40, 80, 160 ou 240 s e foram submetidas a um dos seguintes tratamentos térmicos pós-manufactura: envelhecimento natural durante 24 h; 80°C durante 10 minutos e 105°C durante 10 minutos.

Os resultados mostram que as celulases de Humicola insolens e Trichoderma reesei conferem um moderado acabamento como medido por HST depois da secagem em tambor a 105°C.

Quadro 5: Determinação de HST de folhas de papel acabadas com ou celulase de Trichoderma reesei (Cellusclast®, Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) ou celulase de Humicola msolens (Celluzyme®, Novo Nordisk A/S Bagsvaerd, Dinamarca). HSj Γ (s) dH;0 25 mmoles de Tris Celulase Tempo de contacto com o secador de tambor (s) N/A 80°C 105°C N/A 80°C 105°C Celluclast® 40 10 13 18 10 11 15 80 13 15 22 10 14 16 160 19 18 23 16 16 20 240 25 23 50 19 17 22 Celluzyme 40 121 118 127 131 121 93 80 137 141 149 134 128 104 160 134 135 138 155 103 126 240 111 106 117 1 12 98 1 13

Exemplo 6

Ensaiou-se uma preparação de celulase de Trichoderma viride (BDH Ltd.) como agente de acabamento. Adicionaram-se amostras a alíquotas de material de pasta (0,2 g de peso de seco de fibra em 15 ml de água destilada). O nível de adição de celulase foi ajustado de tal maneira que fossem adicionadas concentrações de proteína ligante de celulose equivalente (correspondendo 8,7% em peso/peso com base no peso da fibra) para permitir a comparação directa com celulase de Humicola insolens (Celluzyme®, Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca).

As amostras de pasta e celulase foram incubadas à temperatura ambiente durante 15 minutos antes da preparação das folhas para a limpeza das mãos. As folhas foram secas por uma única passagem através de um secador de tambor a 105°C e deixadas à temperatura ambiente durante a noite antes de ensaiar o acabamento utilizando o IDT. Os resultados estão reunidos no Quadro 6.

Os resultados indicam que, quando se utiliza concentrações de proteína equivalentes e se comparam com celulase de Humicola insolens, a celulase de Trichoderma viride conferiu um efeito de acabamento moderado.

Quadro 6: Acabamento conseguido por diferentes celulases como se determina para o ensaio CHL-IDT.

Fonte de celulase Fornecedor Avaliação do acabamento IDT Trichoderma viride BDH Ltd + Humicola insolens Novo Nordisk A/S +++ Controlo o

Exemplo 7

Para ensaiar a aplicação de celulosomas de Clostridium thermocellum como ?? agente de acabamento, desenvolveu-se Cl. thermocellum (NCIMB 10682) em pasta a 1,0 % (peso/volume) em meio da cultura que compreende: 1000 ml de meio de base (g/1) de extracto de levedura, 10; KH2P04, 1,5; K2HP04.3H20, 2,9; (NH4)2S04, 1,3, e FeS04.7H20, (1,0 % em peso/volume) 1,0 ml'1) (pasta a 1% em peso/volume) que é então tratada em autoclave para esterilizar. 25 ml de solução de sais (MgCl2, 2% em peso/volume; CaCl2 0,2% em peso/volume, aquecidos em autoclave para esterilizar). 15 ml de solução de cisteína (50 gl'1, estirilizada por filtração). O meio de desenvolvimento (11 num balão de Duran) foi purgado por azoto durante 5 minutos e aquecido a 60°C antes da inoculação. Incubou-se então a cultura durante 240 horas. A cultura foi colectada e as células e os resíduos de pasta foram separados do fluido de cultura por centrifugação. Adicionou-se azida de sódio (0,02% (peso/volume)) tanto ao fluido da cultura como aos resíduos de pasta para evitar posterior desenvolvimento microbiano.

Ensaiou-se o fluido de cultura como agente de acabamento fazendo papel utilizando as culturas de Cl. thermocellum. Pesou-se pasta para folhas e água (10% (peso/volume); 2,16 g) para cinco balões de 250 ml. Adicionou-se então fluido da cultura de Cl. thermocellum (200; 100; 50; 25, e 0 ml) a cada balão e ajustou-se o volume a 200 ml com água destilada. Agitou-se então a mistura à temperatura ambiente durante 15 minutos e fabricou-se uma folha de papel a partir do conteúdo de cada balão usando o método corrente de fabricação de papel. Secou-se o papel a 80°C durante 250 s usando o secador de tambor. Mediu-se o acabamento no dia seguinte usando o método IDT padrão.

Prepararam-se também folhas de papel para controlo e ensaiaram-se como mencionado antes mas em que à pasta para as folhas se adicionou meio de 23 desenvolvimento de Cl. thermocellum não inoculado em vez do fluido de cultura de

Cl. thermocellum.

Foi também decidido ensaiar o acabamento utilizando os resíduos de pasta peletizados e células. Pesaram-se os resíduos de pasta e células (2,16 g; percentagem de pasta agora desconhecida) em dois balões de 250 ml. A um balão adicionaram-se 200 ml de meio de desenvolvimento de Cl. thermocellum para ressuspender os fragmentos de pasta e ao outro balão adicionaram-se 200 ml de água destilada. Agitaram-se ambos os balões à temperatura ambiente durante 15 minutos e fez-se uma folha de papel a partir do conteúdo de ambos os balões utilizando o método de fabricação de papel corrente. O papel foi seco a 90°C durante 250 s utilizando um secador de tambor. Mediu-se o acabamento no dia seguinte utilizando o método IDT. O fluido de cultura de Cl. thermocellum não conferiu acabamento ao papel supondo-se devido aos baixos níveis de celulosomas livres no fluido de cultura. Folhas de papel feitas a partir de resíduos de pasta mostraram acabamento (Quadro 4) e notou-se uma significativa diminuição do grau de acabamento quando se utilizou água destilada em comparação com o meio de desenvolvimento de Cl. thermocellum. Supõe-se que a utilização de água destilada provoca uma diminuição da força iónica/salina da água destilada em comparação com o uso do meio de crescimento, resultando na eluição de celulosomas da superfície da pasta reduzindo dessa forma o grau de acabamento. Os resultados confirmam que a presença da preparação de celulosoma de Cl. thermocellum confere acabamento à folha de papel. 24

Quadro 7: Ensaio de acabamento: pasta hidrolisada por Cl. thermocellum

Diluente (ml) Ensaio da gota de tinta (s) Resíduos da pasta + células (2,16 g) Meio de desenvolvimento de Cl. thermocellum (200 ml) 140/175* Resíduos da pasta + células (2,16 g) dH20 (200 ml) 37/35* * Ensaios em duplicado. Exemplo 8

Realizou-se uma série posterior de experiências para determinar o efeito de celulase sobre o acabamento de papel. Nas experiências empregaram-se os seguintes materiais e protocolos gerais:

Celulase

Empregou-se uma composição aquosa de celulase de Trichoderma reesei (“Celluclast 1,5L” fornecida por Novo Nordisk Bioindustry S.A. 92017 Nanterre Cedex, França).

Em adição utilizou-se celulase derivada de Penicillium funiculosum disponível como um pó bronzeado de Sigma Aldrich Co. Ltd. Poole, Dorset, Reino Unido.

Preparação da Reserva

Excepto quando se indica de outra forma, o material utilizado foi uma mistura de pastas de madeira dura e de madeira macia branqueadas ECF (proporção de 70:30 HW/SW). A reserva foi preparada com 1/3 PBS e não se adicionaram cargas. A maneira de proceder foi a seguinte: 280 g de pasta de madeira dura branqueada e 120 g de pasta de madeira macia branqueada são adicionados a 18 litros de 1/3 PBS. As fibras foram dispersadas por agitação vigorosa. Esta reserva foi então transferida para o 25 τα

Hollander e batida até se atingir um valor de libertação igual a 25oSR (o tempo necessário foi usualmente 30 a 35 minutos). Ajustou-se então o material de reserva a uma consistência final de 2% com mais 1 /3 PBS de acordo com as necessidades.

Adicão/Incubação de Aditivos A solução de celulase foi adicionada ao material de reserva espesso (consistência 2%). Dois litros do material de reserva espesso (contendo 40 g de fibra) foram colocados num recipiente metálico e agitados com a velocidade de agitação menor possível para conseguir um movimento lento do material de reserva. Deve evitar-se agitação vigorosa pois, caso contrário, pode ocorrer a desnaturação da enzima durante o período de incubação. O material de reserva encontrava-se a temperaturas ambientes (20-25°C). O tempo de incubação foi igual a 15 minutos. Durante este período de incubação, o movimento de material de reserva pode parecer tomar-se mais fácil/mais rápido. Se isto é evidente, então reduz-se a velocidade do agitador o mais possível.

Depois de ter decorrido o período de incubação de 15 minutos, o material de reserva espesso foi então adicionado ao proporcionador.

Proporei onador O material de reserva espesso no proporcionador foi então diluído até uma consistência de 0,25% utilizando apenas água desmineralizada. Empregaram-se as velocidades de agitação normais no proporcionador para misturar o material de reserva.

Formação de toalhetes de papel

Encheu-se a caixa de água branca com água desmineralizada (DEMl) para a 26 formação de toalhetes para limpeza das mãos. Com a rede de formação de folhas de toalhetes no sitio no conjunto do molde, adicionou-se um litro do material de reserva proveniente do proporcionador à Caixa de Deckle, conjuntamente com água proveniente da caixa de água branca. Agitou-se o conteúdo da Caixa de Deckle com o agitador perfurado (movimentado para cima e para baixo cinco vezes). Depois do quinto curso, o agitador foi assente na superfície da água para ajudar a amortecer o movimento da água na Caixa de Deckle. Bombeou-se então a água para trás para a caixa de água branca e formou-se a esteira húmida inicial.

Dependendo do vigor da agitação, pode ocorrer alguma formação de espuma na Caixa Deckle. Esta espuma pode ainda persistir depois de se ter formado a esteira húmida inicial e pode ser muito substancial. Alguma desta espuma pode ser dispersa se a bomba for conservada ligada durante alguns segundos depois de a água ter sido retirada de modo que ar pode ser aspirado através da esteira.

Prensagem e Secagem de Toalhetes A esteira molhada e a rede de folhas para toalhetes manuais foram retirados do molde para a prensa. O teor de humidade da folha prensada deve ser 70%. A folha prensada foi então seca num secador de tambor aquecido electricamente. A temperatura da superfície do secador era 105°C e a velocidade do secador era tal que a folha prensada estava em contacto com a superfície quente durante 35 segundos. O teor de humidade final da folha devia estar compreendido entre 4 e 7% (tipicamente 5%).

Se o teor de humidade da folha depois da prensagem for menor do que 70%, então a folha pode agarrar-se à superfície do secador de tambor quando se empregam as condições mencionadas antes. Isso pode ocorrer por causa de serem 27 τα aplicadas pressões de prensagem nào uniformes através da largura da folha. Devem--se tomar as precauções necessárias para evitar isto.

Quando a temperatura da superfície do secador de tambor é menor do que 105°C mas é igual a 70°C ou maior, para que a folha do toalhete manual tenha um teor de humidade final de 5%.

Se a temperatura da superfície do secador de tambor for inferior a 70°C, é necessário prolongar o tempo de contacto ainda mais ou aumentar a prensagem inicial sobre a esteira molhada para retirar mais água ou fazer as duas coisas. E possível reduzir o teor de humidade da folha prensada para um valor inferior a 60%.

Ensaios O condicionamento do papel faz-se de acordo com os procedimentos descritos em “Tappi Test Methods” publicado por ΤΑΡΡΪ, Technology Park Atlanta, PO Box 105113, Atlanta GA 30348, USA, ISBN 0 - 89852 - 200 - 5 (Vol. 1 e 2). O HST (Hercules Sizrng Test) é definido como o ensaio de acabamento para papel por resistência à tinta T 530 pm - 83; e o ensaio de Cobb é definido por T 441 om - 84.

Realizou-se uma série de experiência em que a concentração de celulase, o tempo de envelhecimento e a temperatura foram variados. Os resultados são apresentados nos seguintes quadros em que. “envelhecido naturalmente” refere-se a armazenagem durante o tempo especificado a 23°C + 1°C e à humidade relativa de 50,0 + 2% como especificado em T402om-83; “endurecido em estufa” refere-se ao tratamento a 80°C durante 30 minutos. 28

Comportamento do acabamento de folhas para toalhas manuais feitas com celulase e secas sob condições especificadas “HST (segundos) de toalhetes manuais feitos com Penicillium funiculosum”

Proteína adicionada Condições de envelhecimento Envelhecimento natural durante 24 horas Envelhecimento natural durante 2 semanas Reticulação em estufa Nada 1 l 1 10% 1 7 6 15% 3 11 18 “HST (segundos) de toalhetes manuais feitos com Trichoderma reesei”

Proteína adicionada Condições de envelhecimento Envelhecimento natural durante 24 horas Envelhecimento natural durante 2 semanas Reticulação em esrufa Nada 1 1 1 5% 13 27 28 10% 34 53 61 “Cobb (g/nT) de toalhetes manuais feitos com Trichoderma reesei”

Proteína adicionada Condições de envelhecimento Envelhecimento natural durante 24 horas Envelhecimento natural durante 2 semanas Reticulação em estufa Nada Completamente saturado Completamente saturado Completamente saturado 5% 78,6 67,2 74,2 10% 68,5 51,2 50,7

Exemplo 9

Numa série subsequente de expenências realizadas sob os protocolos descritos no Exemplo 8, investigou-se o grau com a que proteína adicionada é retida pelo papel.

Em experiências separadas adicionaram-se Celluclast e Celluzyme a pasta de 29 7% papel e às folhas de ensaio preparadas como se descreveu antes (envelhecidas naturalmente durante 24 horas). A quantidade de proteína retida no papel (ao contrário do que permanece no sobrenadante da pasta quando se forma a teia de papel) foi calculada à base do teor de nitrogénio do papel, supondo que o teor de nitrogénio de ambas as proteínas é 16% em peso/peso. Mediu-se o teor de nitrogénio por micropirolise Antec.

Os resultados estão apresentados no quadro seguinte.

Aditivo Nível de adição em peso/peso de fibra db % de nitrogénio em papel seco peso/peso % de proteína retida em papel peso/peso de fibra db HST (segundos) Cobb (g de água/nT) Nada “ 0,007 I Completament e saturado Celluclast 20 0,356 2,225 273 15,5 Celluzyme 5 0,374 2,3375 263 28,6

Os resultados mostram que os níveis de adição de Celluzyme iguais a um quarto dos de Celluclast originam níveis de proteína semelhantes. A níveis de retenção de proteínas semelhantes, ambas as celuloses deram efeitos de acabamento semelhantes.

Exemplo 10

No exemplo seguinte, mostra-se o efeito de enzimas de amilase que se ligam ao amido. Caracterizaram-se duas enzimas de amilase usando HPLC: uma a-amilase (preparação bruta do Tipo X-A) de Aspergillus oryzae e amiloglucosidase proveniente de A. niger (disponível de Sigma Aldnch Co. Ltd., Poole, Dorset, Reino Unido). Os picos catalíticos principais de cada preparação foram determinadas utilizando um ensaio de libertação de glucose de amido. As eficiências de ligação de 30 cada proteína foram determinadas em relação a uma gama de amidos com controlos de BSA incluídos na avaliação.

Preparou-se uma solução de 32 mg ml'1 (peso seco) de α-amilase em PBS 0,1 M (pH 7,0). 100 μΐ desta solução foram carregados para uma coluna de HPLC usando gel Bio-Sil e fazendo passar tampão de fosfato 0,1 Mal ml min'1. Colectaram-se fracções (1 ml) e ensaiaram-se relativamente a açúcares redutores libertados a partir de uma suspensão de amido usando o ensaio de microtitulação padrão (para glucose).

Utilizou-se o seguinte ensaio qualitativo para detectar glucose e celobiose nas amostras de ensaio. Realizou-se o ensaio numa cápsula de mitrotitulação à temperatura ambiente.

Componentes reagentes:

10 μΐ de reagente fenol (fenol 0,128 M em tampão de fosfato 0,1 M de pH 7,0) 10 μΐ de reagente de amino pirina (4-amino fenazona 19,7 mM em tampão de fosfato 0,1 M de pH 7,0) 10 μΐ de peroxidase em tampão de fosfato 0,1 M de pH 7,0 (para originar 800

Eu/ml) 10 μΐ de glucose oxidase em tampão de fosfato 0,1 M de pH 7,0 (para originar 250 Eu/ml) 60 μΐ de tampão de fosfato 0,1 M de pH 7,0.

Misturaram-se estes componentes reagentes e adicionaram-se aos poços de uma placa de microtitulação. Adicionaram-se amostras de ensaio de 100 μΐ seguidas por um excesso de substrato (amido). O aparecimento de uma cor vermelha era indicativo da presença de amilase.

Utilizaram-se também os mesmos métodos para produzir um perfil de HPLC para a amiloglucosidase. A amiloglucosidase era uma preparação líquida contendo aproximadamente 262 mg/ml de proteína como medido pela técnica do Azul de Coomassie. Carregou-se um volume de 100 μΐ de uma diluição a 0,007 em PBS 0,1 M (pH 7,0) para a HPLC e monitonzou-se a 230 nm 0,1 AUS. Colectaram-se fracções de 1 ml e ensaiaram-se relativamente à presença de açúcares redutores libertados a partir das suspensões de amido como se referiu acima.

Avaliou-se a capacidade de α-amilase e de amiloglucosidase se ligar em ao amido normal em suspensão. Adicionou-se amido (0,2 g; Roquette) a 9 ml de PBS 0,1 M (pH 7,0) e adicionou-se 1 ml de solução de a-amilase (9,5 mg/ml por ensaio com Azul de Coomassie). Incubou-se num sacudidor durante 20 minutos.

Centrifugou-se a amostra a 13 000 rpm durante 5 minutos e carregaram-se amostras de 100 μΐ para a coluna de HPLC. Comparou-se o perfil do pico da a--amilase ligada ao fim de 20 minutos com uma amostra de T = 0. A partir destes dados, calculou-se a percentagem de ligação da enzima. Ensaiou-se também a ligação de amiloglucosidase em relação a amido catiónico. Utilizou-se também BSA da mesma maneira que um controlo. A concentração final do BSA utilizado era 0,2% (peso/volume) em PBS 0,1 M.

Os resultados das experiências de ligação são reunidos no seguinte Quadro. Perfis de ligação de amido

Enzima Substrato % ligada cc-Amilase Amido 32 Amiloglucosidase Amido 27 Amiloglucosidase Amido catiónico 45 BSA Amido 7 BSA Amido catiónico 6

Estes resultados indicam que tanto as α-amilases como as amiloglucosidases se ligam especificamente tanto a amido como a amido catiónico.

Lisboa, 12 de Dezembro de 2000 O Agente Oficial da Propriedade Industrial

A.Q.P.I.

Rua do Salitre, 195, r/c-Drt. 1250 LISBOA

Claims (17)

1. Reivindicações 1. Método para acabamento de papel que compreende as fases que consistem em a) contactar o mencionado papel ou um constituinte do citado papel com uma proteína capaz de se ligar ao referido papel ou ao mencionado constituinte de papel, e b) desnaturar a citada proteína ligada ao referido papel.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína é desnaturada por meio do calor.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o papel é aquecido a uma temperatura compreendida entre 70°C e 170°C.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o papel é aquecido a uma temperatura compreendida entre 80°C e 110°C.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína é desnaturada por meio de tratamento com um agente desnaturante químico.
6. 6. Método de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a proteína é capaz de ligar um polissacárido.
7. 7. Método de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a proteína é capaz de ligar celulose.
8. 8. Método de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a proteína é uma celulase ou um seu fragmento.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a proteína é uma celulase escolhida do grupo que compreende Cellumonas fími, Trichoderma viride, Trichoderma reesei, Aspergillus niger, Fusarum Oxysporum, Penicillium funiculosum e Humicola insolens.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 8 em que a proteína é uma exo celulase ou um seu fragmento.
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a proteína é celulase derivada de Humicola isolens.
12. 12. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a proteína é uma endo celulase ou um seu fragmento.
13. 13. Método de acordo com a reivindicação 12, em que a proteína é celulase derivada de Trichoderma reesei.
14. 14. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, em que a proteína é capaz de ligação especifica a amido.
15. 15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que a proteína é uma amilase ou um seu fragmento.
16. 16. Método para fabricação de papel com acabamento que compreende as operações que consistem em a) preparar uma pasta de papel, b) adicionar uma proteína que é capaz de ligar um constituinte da mencionada pasta, c) formar papel a partir da citada pasta, e d) aquecer o papel para desnaturar a proteína.
17. 17. Papel acabado de acordo com um método de qualquer das reivindicações 1 a 16.

    Lisboa, 12 de Dezembro de 2000 O Agente Oficial da Propriedade Industrial

    A.O.P.l. Rua do Salitre, Í95. r/c-Drt. 1250 LISBOA 1 Resumo “Métodos para acabamento de papel” A presente invenção refere-se a métodos e composições para acabamento de papel. Em particular, a invenção refere-se a um método de acabamento de papel que compreende os passos que consistem em a) contactar o referido papel ou um constituinte do mencionado papel com uma proteína capaz de se ligar ao citado papel ou ao referido constituinte de papel; e b) desnaturar ou aquecer a mencionada proteína ligada ao citado papel. Lisboa, 12 de Dezembro de 2000

    O Agente Oficial da Propriedade Industrial

    JOSÉ BE SAMPAJO A.O.P.1. Rua do Salitre, 195, r/t-Drt. 1250 LISBOA