DE69534740T2 - Analoge des thymosin alpha 1 - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung beinhaltet neue synthetische Verbindungen mit Bezug auf Thymosin α1 und neue Verfahren zu deren Synthese.
  • Beschreibung des Standes der Technik
  • Thymosine sind Polypeptid-Immunmodifikatoren, die aus der Thymusdrüse stammen. Es wurde gezeigt, dass Thymosine die T-Zelldifferenzierung einleiten und immunologische Funktionen verstärken.
  • Ein teilweise gereinigter Extrakt eines Kalbsthymus, der als Thymosinfraktion 5 bezeichnet wird, enthält eine Anzahl von Peptidprodukten der Thymusdrüse, einschließlich eines Bestandteils, der als Thymosin α1 bezeichnet wird.
  • Thymosin α1 wurde anfänglich aus der Thymosinfraktion 5 isoliert, und wurde sequenziert und chemisch synthetisiert (US Patent Nr. 4,079,127; 4,148,788 und 4,855,407).
  • Die Sequenz von Thymosin α1 ist in hohem Maße analog in Mäusen, Kälbern und Menschen. Thymosin α1 besitzt 28 Aminosäuren, und es wurde gezeigt, dass es eine Aktivität bei der Modulation des Immunsystems besitzt. Die immunologische Aktivität von Thymosin α1 umfasst eine Stimulation der alpha- und gamma-Interferonproduktion, eine Zunahme der Produktion des Macrophage migration inhibitory factor, eine Induktion der Expression der T-Zell-Marker, einschließlich der Interleukin-2-Rezeptoren, und eine Verbesserung der T-Helferzellen-Aktivität.
  • Es bleibt ein Bedürfnis im Stand der Technik für neue synthetische Verbindungen, welche wie natürliche Produkte der Thymusdrüse fungieren können, die stabil sind und die leicht zu synthetisieren sind.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung löst das vorstehend erwähnte Problem mit der Verbindung der Formel: Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Z (I)wobei Ac ein Acetylrest ist, und Z ist -Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Gly-NH2 (SEQ ID Nr. 3).
  • Darüber hinaus kommt auch die Verbindung mit der Formel in Betracht: X-Ala-Glu-Asn-Gly-NH2 wobei X Glu, Glu-Glu, Val-Glu-Glu, Val-Val-Glu-Glu, Glu-Val-Val-Glu-Glu, Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, oder Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu ist, wobei Ac eine Acetylgruppe ist.
  • GENAUE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die Verbindungen der Erfindung betreffen Thymosin α1 und sind Modulatoren des Immunsystems, die nützlich bei der Behandlung verschiedener Krankheiten und Indikationen sind, welche auf Modulatoren des Immunsystems reagieren. Die die Immunreaktion potenzierenden Verbindungen der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um die Immunfunktionen in immun-armen oder immun-unterdrückten Patienten wieder herzustellen, und sie können verwendet werden für die Behandlung von Immunschwäche-Krankheiten.
  • Ein konkretes Beispiel in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ist Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Gly-NH2, wobei Ac eine Acetylgruppe ist.
  • Die Erfindung umfasst ebenso neue Zwischenprodukte und Vorstufen in Übereinstimmung mit der vorstehenden Formel.
  • Beispiele für Zwischenprodukte und Vorstufen umfassen Verbindungen der Formel: X-Ala-Glu-Asn-Gly-NH2 (IV)wobei X Glu, Glu-Glu, Val-Glu-Glu, Val-Val-Glu-Glu, Glu-Val-Val-Glu-Glu, Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser- Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, oder Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu ist.
  • Die Verbindungen, Zwischenprodukte und Vorstufen der vorliegenden Erfindung, welche hier insgesamt als Thymosinpeptide bezeichnet werden, und einschließlich der Analoga und Derivate von Thymosin α1, können durch ein beliebiges, geeignetes Verfahren der Peptidsynthese bereitgestellt werden. Die Verbindungen werden vorzugsweise durch Festphasen-Peptidsynthese synthetisiert, und am meisten bevorzugt durch Festphasensynthese auf einem 4-Methylbenryhydrylamin-Harz.
  • Die Spaltung des Peptids vom Harz kann durch ein beliebiges geeignetes Verfahren erreicht werden, zum Beispiel durch Acidolyse. Säuren, wie zum Beispiel Fluorwasserstoffsäure und Trifluormethansulfonsäure (CF3SO3H) sind geeignet. Die Säure, welche am meisten bevorzugt verwendet wird, ist Trifluormethansulfonsäure. Vorzugsweise wird ein Harz mit dem geschützten Peptid mit einer Lösung von Anisol (etwa 5 % bis etwa 25 %) und Thioanisol (etwa 5 % bis etwa 25 %) in Trifluoressigsäure gemischt, und die Acidolyse wird durch Behandlung mit etwa 5 % bis etwa 10 % Trifluormethansulfonsäure (CF3SO3H) erreicht. Am meisten bevorzugt wird Trifluormethansulfonsäure in Form einer 50 %igen Lösung in Trifluoressigsäure in einem zur Menge des zu spaltenden Peptid-Harzes annähernd gleichen Anteil verwendet.
  • Die Erfindung wird näher durch die folgenden Beispiele erläutert, welche nicht dahingehend auszulegen sind, als seien sie beschränkend.
  • BEISPIELE
  • VERGLEICHSBEISPIEL 1
  • Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-NH2 Thymosin α1-N16-Amid
  • 4-Methylbenzhydrylamin-Harz (2,01 g; 0,55 mmol/g) wurde in ein Gefäß für die Peptidsynthese gegeben, und mit 40 ml Dichlormethan dreimal gewaschen. Das Harz wurde anschließend mit 40 ml 10 %igem Triethylamin für 1 Minute und erneut für 10 Minuten neutralisiert, und anschließend dreimal mit Dichlormethan gewaschen. Das neutralisierte Harz zeigte eine stark positive Reaktion gegenüber dem Ninhydrin-Test. Es wurde anschließend mit 3,0 mmol t-Butyloxycarbonyl-L-leucin (Boc-Leu, 0,784 g) in Gegenwart von 3,0 mmol N,N'-Dicyclohexylcarbodümid (DCC, 0,618 g) in Dichlormethan für 150 Minuten gekoppelt. Die Synthese wurde fortgeführt, indem das Verfahren zur Festphasensynthese wie unten beschrieben durchgeführt wurde. [Die Schritte 1 bis 11 stellen alle Verfahrensschritte dar, die für einen Synthesezyklus notwendig sind, wobei ein Aminosäurerest in die wachsende Peptidkette eingebaut wird, die an das Harz gebunden ist]:
    • 1) Vorwaschen mit 50 % Trifluoressigsäure in Dichlormethan,
    • 2) Rühren in 50 % Trifluoressigsäure für 30 Minuten,
    • 3) dreimaliges Waschen mit Dichlormethan,
    • 4) Vorwaschen mit 10 % Triethylamin in Dichlormethan,
    • 5) Rühren in 10 % Triethylamin für 3 Minuten,
    • 6) dreimaliges Waschen mit Dichlormethan,
    • 7) Testen des Harzes mittels einer Ninhydrin-Reaktion (sie sollte stark positiv sein),
    • 8) Rühren des Harzes mit 0,970 g Boc-Asp(OBzl) (3,0 mmol) und 0,618 g DCC (3,0 mmol) in Dichlormethan für 120 Minuten,
    • 9) zweimaliges Waschen mit 50 % Isopropanol in Dichlormethan,
    • 10) dreimaliges Waschen mit Dichlormethan,
    • 11) Test mittels einer Ninhydrin-Reaktion. Falls sie negativ ist, kann man zum nächsten Synthesezyklus übergehen. Falls sie positiv ausfällt, sind die Schritte 8 bis 11 zu wiederholen.
  • Der Zyklus für eine Festphasen-Peptidsynthese wurde der Reihe nach in Schritt 8 eines jeden Zyklus jeweils einmal in dieser Reihenfolge mit den folgenden Aminosäure-Derivaten wiederholt, bis die gewünschte Aminosäuresequenz aufgebaut war: Boc-Lys(CIZ) (1.244 g); Boc-Thr(Bzl) (0,928 g); Boc-Thr(Bzl) (0,928 g); Boc-Ile (0,720 g); Boc-Glu(OBzl) (1,01 g); Boc-Ser(Bzl) (0,886 g); Boc-Ser(Bzl) (0,886 g); Boc-Thr(Bzl) (0,928 g); Boc-Asp(OBzl) (0,970 g); Boc-Val (0,652 g); Boc-Ala (0,568 g); Boc-Ala (0,568 g); Boc-Asp(OBzl) (0,970 g); Boc-Ser(Bzl) (0,886 g) und Essigsäure (0,180 g). Das erhaltene, geschützte Acetylhexadeca-Peptid-Harz, Ac-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(CIZ)-Asp(OBzl)-Leu-MBHA-Harz, welches auf diese Weise erhalten wurde, wog 4,25 g.
  • Ein Teil dieses geschützten Hexadeca-Peptid-Harzes (1,08 g) wurde mit 2 ml Anisol gemischt und mit 10 ml flüssiger Fluorwasserstoffsäure 45 Minuten lang bei 0 °C gerührt. Die überschüssige Säure wurde durch Verdampfung bei 0 °C im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mit Ether gewaschen. Das Peptidmaterial wurde in 50 ml 2 % Ammoniumacetat extrahiert, und auf einer Sephadex G-10 Säule (0,1 M Essigsäure) entsalzt. Eine Lyophilisation des im Peak enthaltenen Peptids lieferte 0,204 g des rohen Peptidamids.
  • Ein Anteil des rohen Peptids (100 mg) wurde auf einer Hamilton PRP-1 Säule gereinigt (2,15 × 25 cm, 10 μ) und mit einem gepufferten Lösungsmittel von 53,5 g/l Isopropanol in 0,035 M Kaliumphosphat, pH 5 (Fließgeschwindigkeit = 5 ml/Minute; Beobachtung bei 227 nm) eluiert. Die Fraktionen, welche das reine Peptid enthielten, wurden gesammelt, auf einer Sephadex G-10 Säule entsalzt, und lyophilisiert, um 26 mg Thymosin α1-N16 Amid zu ergeben. Es wurde gefunden, dass das Material auf einer Hochleistungs-Kapillar-Elektrophorese homogen ist. Aminosäurenanalyse: Asp, 3,00 (3); Thr, 2,68 (3); Ser, 2,67 (3); Glu, 1,04 (1); Ala, 1,88 (2); Val, 0,97 (1); Ile, 1,01 (1); Leu, 1,02 (1); Lys, 1,00 (1). Die massenspektrometrische Analyse zeigte, dass die Verbindung das erwartete Molekulargewicht besaß; MH+ = 1.693,8, MNa+ = 1.716,9 (berechnetes Molekulargewicht = 1.693,8).
  • VERGLEICHSBEISPIEL 2
  • Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-NH2
  • Thymosin α1-Pro-Amid
  • 4-Methylbenzhydrylamin-Harz (1,0 g; 0,55 mmol/g) wurde in ein Gefäß für eine Peptidsynthese gegeben, und mit 20 ml Dichlormethan dreimal gewaschen. Das Harz wurde anschließend mit 10 % Triethylamin für 1 Minute und erneut für 10 Minuten neutralisiert, und anschließend dreimal mit Dichlormethan gewaschen. Das neutralisierte Harz zeigte eine stark positive Reaktion gegenüber dem Ninhydrin-Test. Es wurde anschließend mit 1,5 mmol Boc-Pro (0,322 g) in Gegenwart von 1,5 mmol DCC (0,309 g) in Dichlormethan für 120 Minuten gekoppelt. Die Synthese wurde fortgeführt, indem die Zyklen für eine Festphasen-Peptidsynthese wie in Beispiel 1 dargestellt durchgeführt wurden, wobei die folgenden Aminosäure-Derivate jeweils einmal in dieser Reihenfolge in Schritt 8 eines jeden Zyklus der Reihe nach eingesetzt wurden, bis die gewünschte Peptidsequenz auf dem Harz aufgebaut war: Boc- Asn, (0,348, g mit Zugabe von 0,405 g HOBT in Dimethylformamid), Boc-Glu(OBzl) (0,506 g); Boc-Ala (0,284 g); Boc-Glu(OBzl) (0,506 g); Boc-Glu(OBzl) (0,506 g); Boc-Val (0,326 g); Boc-Val (0,326 9); Boc-Glu(OBzl) (0,506 g); Boc-Lys(CIZ) (0,622 g); Boc-Lys(CIZ) (0,622 g); Boc-Glu(OBzl) (0,506 g); Boc-Lys(CIZ) (0,622 g); Boc-Leu (0,374 g); Boc-Asp(OBzl) (0,486 g); Boc-Lys(CIZ) (0,602 g); Boc-Thr(Bzl) (0,464 g); Boc-Thr(Bzl) (0,464 g); Boc-Ile (0,360 g); Boc-Glu(OBzl) (0,506 g); Boc-Ser(Bzl) (0,443 g); Boc-Ser(Bzl) (0,443 g); Boc-Thr(Bzl) (0,464 g); Boc-Asp(OBzl) (0,485 g); Boc-Val (0,326 g); Boc-Ala (0,284 g); Boc-Ala (0,284 g); Boc-Asp(OBzl) (0,485 g); Boc-Ser(Bzl) (0,443 g) und Essigsäure (0,090 g). Das erhaltene, geschützte Acetylnonacosa-Peptid-Harz, Ac-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(CIZ)-Asp(OBzl)-Leu-Lys(CIZ)-Glu(OBzl)-Lys(CIZ)-Lys(CIZ)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-Pro-MBHA-Harz, welches auf diese Weise erhalten wurde, wog 2,89 g.
  • Ein Teil des vorstehenden, geschützten Peptidharzes (0,995 g) wurde gespalten, und wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt, um 0,335 g rohes Thymosin α1 Pro-NH2 zu ergeben. Es wurde auf einer Hamilton PRP-1 Säule wie in Beispiel 1 beschrieben gereinigt, um 51 mg Thymosin α1 Pro-Amid zu ergeben. Es wurde gefunden, dass das Material auf einer analytischen Hochleistungs-Flüssigchromatographie und Kapillarelektrophorese homogen ist. Aminosäureanalyse: 24 Stunden Hydrolyse: Asp, 4,00 (4); Thr, 3,06 (3); Ser, 2,85 (3); Glu, 6,06 (6); Pro, 1,12 (1); Ala, 2,94 (3); Val, 1,88 (3); Ile, 0,98 (1); Leu, 1,00 (1); Lys, 3,98 (4). 100 Stunden Hydrolyse: Asp, 4,00 (4); Thr, 2,69 (3); Ser, 2,12 (3); Glu, 6,17 (6); Pro, 1,04 (1); Ala, 3,01 (3); Val, 2,96 (3); Ile, 1,08 (1); Leu, 1,08 (1); Lys, 4,12 (4). Die massenspektrometrische Analyse zeigte, dass das Peptid das erwartete Molekulargewicht besaß; MH+ = 3.205,1 (berechnetes Molekulargewicht MW = 3.204,5).
  • BEISPIEL 3
  • Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-GIy-NH2
  • Thymosin α1-Gly-Amid
  • 4-Methylbenzhydrylamin-Harz (1,0 g; 0,55 mmol/g) wurde in ein Gefäß für die Peptidsynthese gegeben, und mit 20 ml Dichlormethan dreimal gewaschen. Das Harz wurde anschließend mit 10 % Triethylamin für 1 Minute und erneut für 10 Minuten neutralisiert, und anschlie ßend dreimal mit Dichlormethan gewaschen. Das neutralisierte Harz zeigte eine stark positive Reaktion gegenüber dem Ninhydrin-Test. Es wurde mit 1,5 mmol Boc-Gly (0,263 g) in Gegenwart von 1,5 mmol DCC (0,309 g) in Dichlormethan für 120 Minuten gekoppelt. Die Synthese wurde fortgeführt, indem die Zyklen für die Festphasen-Peptidsynthese wie in Beispiel 1 dargestellt ausgeführt wurden, wobei die folgenden Aminosäure-Derivate jeweils einmal in dieser Reihenfolge in Schritt 8 eines jeden Zyklus der Reihe nach eingesetzt wurden, bis das gewünschte Peptid auf dem Harz aufgebaut war: Boc-Asn (0,348 g mit Zugabe von 0,405 g HOBT in Dimethylformamid), Boc-Glu(OBzl) (0,506 g); Boc-Ala (0,284 g); Boc-Glu(OBzl) (0,506 9); Boc-Glu(OBzl) (0,506 g), Boc-Val (0,326 g), Boc-Val (0,326 g), Boc-Glu(OBzl) (0,506 g), Boc-Lys(CIZ) (0,622 g), Boc-Lys(CIZ) (0,622 g), Boc-Glu(OBzl) (0,506 g), Boc-Lys(CIZ) (0,622 g), Boc-Leu (0,374 g), Boc-Asp(OBzl) (0,485 g), Boc-Lys(CIZ) (0,622 g), Boc-Thr(Bzl) (0,464 g), Boc-Thr(Bzl) (0,464 g), Boc-Ile (0,360 g), Boc-Glu(OBzl) (0,506 g), Boc-Ser(Bzl) (0,443 g), Boc-Ser(Bzl) (0,443 g), Boc-Thr(Bzl) (0,464 g), Boc-Asp(OBzl) (0,485 g), Boc-Val (0,326 g), Boc-Ala (0,284 g), Boc-Ala (0,284 g), Boc-Asp(OBzl) (0,485 g), Boc-Ser(Bzl) (0,443 g) und Essigsäure (0,090 g). Das erhaltene geschützte Acetylnonacosa-Peptid-Harz, Ac-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(CIZ)-Asp(OBzl)-Leu-Lys(CIZ)-Glu(OBzl)-Lys(CIZ)-Lys(CIZ)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBZl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-GIy-MBHA-Harz, welches auf diese Weise erhalten wurde, wog 2,70 g.
  • Ein Teil des vorstehenden geschützten Peptidharzes (0,996 g) wurde mit 2 ml Anisol, 2 ml Thioanisol und 6 ml Trifluoressigsäure gemischt. Während des Rührens wurde 1,1 ml 50 % CF3SO3H in Trifluoressigsäure zugegeben und das Rühren wurde 35 Minuten lang fortgesetzt. Die Mischung wurde anschließend in 100 ml Ether gegossen. Das so gebildete, gummiartige Präzipitat wurde kurz mit etwas gekühltem Ether gewaschen. Das Peptidmaterial wurde anschließend in 50 ml 30 % Ammoniumacetat extrahiert, gefolgt von 20 ml Wasser. Die vereinigten Extrakte wurden auf ein kleineres Volumen eingeengt, auf einer Sephadex G-10 Säule (2,6 × 85 cm, 0,1 M Essigsäure) entsalzt und lyophilisiert, um 0,323 g rohes Nonacosa-Peptid zu ergeben.
  • Ein Teil dieses rohen Peptids (0,161 g) wurden auf einer Hamilton PRP-1 Säule wie in Beispiel 1 beschrieben gereinigt, um 40,2 mg Thymosin α1-Gly-Amid zu ergeben. Es wurde gefunden, dass das Material auf einer analytischen Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie homogen ist. Aminosäureanalyse: 24 Stunden Hydrolyse: Asp, 4,00 (4); Thr, 2,96 (3); Ser, 2,75 (3); Glu, 5,97 (6); Gly, 1,03 (1); Ala, 2,96 (3); Val, 1,84 (3); Ile, 1,05 (1); Leu, 1,04 (1); Lys, 3,96 (4). 100 Stunden Hydrolyse: Asp, 4,00 (4); Thr, 3,00 (3); Ser, 2,41 (3); Glu, 6,18 (6); Gly, 1,03 (1); Ala, 2,87 (3); Val, 2,82 (3); Ile, 1,06 (1); Leu, 1,05 (1); Lys, 3,79 (4). Die massenspektrometrische Analyse zeigte, dass das Peptid das gewünschte Molekulargewicht besaß; MH+ = 3.165,5 (berechnetes Molekulargewicht = 3.164,4).
  • VERGLEICHSBEISPIEL 4
  • Glp-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn
  • Pyroglutamyl-desacetyl-Thymosin α1
  • 4-Methylbenzhydrylamin-Harz (1,0 g; 0,55 mmol/g) wurde in ein Gefäß für eine Peptidsynthese gegeben, und mit 20 ml Dichlormethan dreimal gewaschen. Das Harz wurde anschließend mit 10 % Triethylamin für 1 Minute und erneut für 10 Minuten neutralisiert, und anschließend dreimal mit Dichlormethan gewaschen. Das neutralisierte Harz zeigte eine stark positive Reaktion gegenüber dem Ninhydrin-Test. Es wurde anschließend mit 1,5 mmol t-Butyloxycarbonyl-L-asparaginsäure-ß-benzylester (0,485 g) in Gegenwart von 1,5 mmol DCC (0,309 g) für 60 Minuten gekoppelt. Die Kopplungsreaktion wurde einmal wiederholt, um ein negatives Ergebnis des Ninhydrin-Tests zu erbringen. Die Synthese wurde fortgeführt, indem die Zyklen für eine Festphasen-Peptidsynthese wie in Beispiel 1 dargestellt durchgeführt wurden, wobei die folgenden Aminosäure-Derivate jeweils einmal in dieser Reihenfolge in Schritt 8 eines jeden Zyklus der Reihe nach eingesetzt wurden, bis die gewünschte Peptidsequenz auf dem Harz aufgebaut war: Boc-Glu(OBzl) (0,506 g), Boc-Ala (0,284 g), Boc-Glu(OBzl) (0,506 g), Boc-Glu(OBzl) (0,506 g), Boc-Val (0,326 g), Boc-Val (0,326 g), Boc-Glu(OBzl) (0,506 g), Boc-Lys(CIZ) (0,622 g), Boc-Lys(CIZ) (0,622 g), Boc-Glu(OBzl) (0,506 g), Boc-Lys(CIZ) (0,622 g), Boc-Leu (0,374 g), Boc-Asp(OBzl) (0,485 g), Boc-Lys(CIZ) (0,622 g), Boc-Thr(Bzl) (0,464 g), Boc-Thr(Bzl) (0,464 g), Boc-Ile (0,360 g), Boc-Glu(OBzl) (0,506 g), Boc-Ser(Bzl) (0,443 g), Boc-Ser(Bzl) (0,443 g), Boc-Thr(Bzl) (0,464 g), Boc-Asp(OBzl) (0,485 g), Boc-Val (0,326 g), Boc-Ala (0,284 g), Boc-Ala (0,284 g), Boc-Asp(OBzl) (0,485 g), Boc-Ser(Bzl) (0,443 g) und Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutaminsäure (Z-Glp) (0,395 g). Das erhaltene, geschützte Nonacosa-Peptid-Harz, Z-Glp-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(CIZ)-Asp(OBzl)-Leu-Lys(CIZ)- Glu(OBzl)-Lys(CIZ)-Lys(CIZ)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asp(MBHA-Harz)-OBzl, welches auf diese Weise erhalten wurde, wog 2,67 g.
  • Ein Teil des vorstehenden geschützten Peptidharzes (0,995 g) wurde mit 2 ml Anisol, 2,2 ml Thioanisol und 6 ml Trifluoressigsäure gemischt. Während des Rührens wurde 1,1 ml 50 % CF3SO3H in Trifluoressigsäure zugegeben, und das Rühren würde für 35 Minuten fortgesetzt. Die Mischung wurde anschließend in 100 ml Ether gegossen. Das so gebildete, gummiartige Präzipitat wurde kurz mit etwas gekühltem Ether gewaschen. Das Peptidmaterial wurde anschließend in 50 ml 4 % Ammoniumacetat extrahiert, auf einer Sephadex G-10 Säule (2,6 × 85 cm, 0,1 M Essigsäure) entsalzt, und lyophilisiert, um 0,229 g rohes Nonacosa-Peptid zu liefern.
  • Ein Teil dieses rohen Peptids (0,150 g) wurde auf einer Hamilton PRP-1 Säule wie in Beispiel 1 beschrieben gereinigt, um 46,2 mg Pyroglutamyl-desacetyl-Thymosin α1 zu ergeben. Es wurde gefunden, dass das Material auf einer analytischen Hochleistungs-Flüssigchromatographie homogen ist. Aminosäureanalyse: 24 Stunden Hydrolyse: Asp, 4,00 (4); Thr, 3,04 (3); Ser, 2,69 (3); Glu, 6,92 (7); Ala, 2,90 (3); Val, 1,80 (3); Ile, 1,00 (1),; Leu, 1,00 (1); Lys, 3,90 (4). 100 Stunden Hydrolyse: Asp, 4,00 (4); Thr, 3,09 (3); Ser, 2,67 (3); Glu, 7,50 (7); Ala, 3,14 (3); Val, 2,83 (3); Ile, 1,04 (1); Leu, 1,08 (1); Lys, 4,05 (4). Die massenspektrometrische Analyse zeigte, dass das Peptid das erwartete Molekulargewicht besaß; MH+ = 3.177,1; MNa+ = 3.200,2 (berechnetes Molekulargewicht = 3.177,4).
  • BEISPIEL 5
  • Swiss-Webster Mäuse wurden in fünf Gruppen behandelt: Endotoxische Mäuse (Mäuse, denen 60 mg/kg Lipopolysaccharid-Endotoxin aus E. coli injiziert wurde), die sonst unbehandelt waren, und endotoxische Mäuse, die mit 3 Injektionen 100 g Thymosin α1-N16-Amid (Tα1-N16-NH2) behandelt wurden, wurden in zwei Gruppen behandelt. Pyroglutamyl-desacetyl-Thymosin α1 ([Glp]-Tα1) oder Thymosin α1-Gly-Amid (Tα1-Gly-NH2) wurden nach 5 Minuten, bzw. 2 und 4 Stunden nach Verabreichung des Endotoxins verabreicht.
  • Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle dargestellt. Wie ersehen werden kann, erhöhte Tα1 und seine Analoga, welche dreimal nach der Verabreichung des Endotoxins verabreicht wurden, die Überlebensrate der Mäuse, denen Endotoxin injiziert wurde. Tabelle
    Figure 00110001
    Sequenzliste
    Figure 00120001
    Figure 00130001
    Figure 00140001
    Figure 00150001
    Figure 00160001

Claims (2)

  1. Verbindung mit der Formel: Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Gu Ala-Glu-Asn-Gly-NH2 (SEQ ID Nr. 3),worin es sich bei Ac um eine Acetylgruppe handelt.
  2. Verbindung mit der Formel: X-Ala-Glu-Asn-Gly-NH2, worin es sich bei X handelt um Glu, Glu-Glu, Val-Glu-Glu, Val-Val-Glu-Glu, Glu-Val-Val-Glu-Glu, Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Asp-Thr-Sex-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, Sex-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, oder Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys- Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu, und worin es sich bei Ac um eine Acetylgruppe handelt.
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