DE69534599T2 - Intrazellulare expression von carboxypeptidase g2 in enzyme-prodrug-therapie - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Gen-gerichtete Enzym-Prodrug-Therapie (GDEPT) und ihre Verwendung bei der Behandlung von Erkrankungen einschließlich Tumoren.
  • Ein therapeutischer Ansatz, bezeichnet als "Virus-gerichtete Enzym-Prodrug-Therapie" (VDEPT), wurde bereits als ein Verfahren zur Behandlung von Tumorzellen bei Patienten unter Verwendung von Prodrugs vorgeschlagen. Ein viraler Vektor, der ein für ein Enzym, das zur Aktivierung eines Prodrugs in der Lage ist, kodierendes Gen trägt, wird auf Tumorzellen gerichtet. Das Gen kann transkriptionell mit durch Gewebe-spezifische Promotor- oder Enhancer-Sequenzen reguliert werden. Der virale Vektor dringt in Tumorzellen ein und exprimiert das Enzym, sodass ein Prodrug innerhalb der Tumorzellen in einen aktiven Wirkstoff übergeführt wird (Huber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8039 (1991)). Alternativ dazu wurden bisher nicht-virale Verfahren zur Bereitstellung von Genen verwendet. Solche Verfahren umfassen Calciumphosphat-Co-Fällung; Mikroinjektion, Liposomen, direkte DNA-Aufnahme und Rezeptor-vermittelten DNA-Transfer. Diese werden in Morgan & French Anderson, Annu. Rev. Biochem. 62, 191 (1993), erörtert. Die Bezeichnung "GDEPT" (Gen-gerichtete Enzym-Prodrug-Therapie) wird verwendet, um sowohl virale als auch nicht-virale Zufuhrsysteme zu beschreiben.
  • Zahlreiche verschiedene Enzyme wurden als für die Verwendung bei GDEPT-Therapie geeignet vorgeschlagen. Im Allgemeinen wurden die Enzyme auf Grundlage ihrer Kompatibilität mit Prodrugs, die als wirksam gegen den zu behandelnden Tumortyp bekannt sind, selektiert. Für den erfolgreichen Einsatz von GDEPT ist auch wichtig, dass der Wirkstoff in der Lage ist, in die Zelle einzudringen.
  • Das Enzym Carboxypeptidase G2 (CPG2) wurde für die Verwendung in Systemen für Antikörper-gerichtete Enzym-Prodrug-Therapie (ADEPT) in Kombination mit zahlreichen Arten von Prodrugs, einschließlich Stickstofflost-Prodrugs, vorgeschlagen. Bei ADEPT wird das Prodrug außerhalb der Zelle oder an der Zelloberfläche aktiviert, und somit wurde vom Prodrug angenommen, dass es keine signifikante Fähigkeit besitzt, in die Zelle einzudringen. Auch enthält das Prodrug die hydrophile Glutaminsäure. Nun wurde überraschenderweise erkannt, dass solche Prodrugs nicht nur in die Zelle eindringen, sondern auch intrazellulär durch CPG2 aktiviert werden können. Darüber hinaus weisen die Wirkstoffe nach Aktivierung in der Zelle eine wirksame Nebenwirkung auf, wobei umliegende Zellen ebenfalls durch den aktivierten Wirkstoff getötet werden.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Um diesen Problemen beizukommen, stellt die vorliegende Erfindung nun ein Zweikomponenten-System für Gen-gerichtete Enzym-Prodrug-Therapie bereit, das: (a) einen Vektor, der für eine Carboxypeptidase kodiert, die innerhalb einer Zelle exprimiert wird; und (b) ein Stickstofflost-Prodrug, das durch diese Carboxypeptidase in einen aktiven Wirkstoff übergeführt werden kann, umfasst, worin das Stickstofflost-Prodrug aus der aus N-4-[(2-Chlorethyl)(2-mesyloxyethyl)amino]benzoyl-L-glutaminsäure und Salzen davon; und N-(4-[Bis(2-iodethyl)amino]phenoxycarbonyl)-L-glutaminsäure und Salzen davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  • Das Enzym ist vorzugsweise eine bakterielle Carboxypeptidase, insbesondere Carboxypeptidase CPG2 (Seq.-ID Nr. 1) oder Pseudomonas-γ-glutamylhydrolase EC3.4.22.12 (CC Levy & P Goldman, J. Biol. Chem. 242, 2933 (1967)).
  • Der Vektor kann ein RNA- oder DNA-Vektor sein. Er kann von einem viralen Vektor, einschließlich jedes geeigneten Vektors, der nach dem Stand der Technik zum Targeting von Tumorzellen erhältlich ist, abgeleitet sein.
  • Die Erfindung stellt auch das System der Erfindung zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung eines Patienten bereit sowie ein Verfahren zur Behandlung eines Tumors in einem Patienten, der einer Behandlung bedarf, die das Verabreichen einer wirksamen Menge eines Vektors, der für eine Carboxypeptidase kodiert, und eines Prodrugs, das in der Lage ist, durch das Enzym in einen aktiven Wirkstoff übergeführt zu werden, an den Patienten umfasst.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • 1. Expression von CPG2* in NIH3T3-Zellen (A) Immunoblot-Analyse. NIH3T3-Zellen wurden mit MLVβplink (Spur 1) oder mit MLVCPG2* (Spur 2) transfiziert. Die Zellen wurden in Puffer A extrahiert, und Proben wurden jeweils in 10 % (Gew./Vol.) Polyacrylamidgelen Elektrophorese unterzogen, auf Nitrocellulose transferiert und mit einem CPG2-spezifischen polyklonalen Antikörper sondiert. Die Migrationsposition von CPG2* ist gezeigt, und die Migrationspositionen von herkömmlichen Molekularmassen-Markern (in kDa) sind links von der Figur gezeigt. (B) CPG2-Enzymaktivitätstest. Die Zellextrakte aus Teil (A) wurden durch CPG2-Enzymaktivitätstest analysiert. Probennummern entsprechen den Spurennummern aus Teil (A). Die Enzymaktivität wird in willkürlichen Einheiten in Bezug auf Pufferkontrollen ausgedrückt.
  • 2. Zytotoxizitätstest NIH3T3-Zellen wurden mit MLVβplink (Proben 1, 3) oder MLVCPG2* (Spuren 2, 4) transfiziert. 42 h nach Transfektion wurden die Zellen mit CMDA-Prodrugvehikel als eine Kontrolle (Spuren 1, 2) oder mit CMDA-Prodrug 24 h lang (Spuren 3, 4) behandelt. Nach einer Erholungsphase wurden die Zellen in frische Gewebekulturschalen übertragen, und nach drei Tagen wurde die Lebensfähigkeit der Zellen durch Messen von [Methyl-3H]-Thymidin-Inkorporation bestimmt. Die Menge an inkorporiertem Thymidin ist in der Einheit dpm für jede Probe gezeigt.
  • 3A zeigt die konstitutive Expression von CPG2* in NIH3T3-Zellen.
  • Die 3B und 3C zeigen in willkürlichen Einheiten die enzymatische Aktivität für β-Galactosidase (A) und CPG2 (B), exprimiert in NIH3T3-Zelllinien Nr. 3 (leerer Balken) und Nr. 9 (schwarzer Balken).
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • A. Vektorsysteme
  • Beispiele für geeignete Vektorsysteme umfassen Vektoren basierend auf dem Moloney-Maus-Leukämie-Virus, die bekannt sind (Z. Ram et al., Cancer Research 53, 83–88 (1993); Dalton & Treisman, Cell 68, 597–612 (1992)). Diese Vektoren enthalten den Maus-Leukämie-Virus- (MLV-) Enhancer, der stromauf an einem β-Globin-Minimalpromotor kloniert ist. Die β-Globin-5'-untranslatierte Region bis zum Start ATG wird zugeführt, um wirksame Translation des klonierten Proteins zu steuern. Der Initiator ATG spreizt eine Ncol-Restriktionsstelle und kann somit verwendet werden, um eine Protein-Kodiersequenz in den Vektor zu klonieren. Dieser Vektor enthält weiters einen Polylinker, um Klonieren zu erleichtern, gefolgt von der β-Globin-3'-untranslatierten Region und den Polyadenylierungsstellen. Der MLV-Enhancer ist besonders nützlich, da er ein sehr starker Enhancer und in den meisten Maus- und menschlichen Zelllinien aktiv ist.
  • Geeignete virale Vektoren umfassen weiters jene, die auf einem Retrovirus basieren. Solche Vektoren sind auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs erhältlich. Huber et al. (s.o.) berichten von der Verwendung amphotroper Retroviren zur Transformation von Hepatom-, Brust-, Kolon- oder Hautzellen. Culver et al. (Science 256, 1550–1552 (1992)) beschreiben auch die Verwendung von retroviralen Vektoren in GDEPT. Solche Vektoren oder Vektoren, die von solchen Vektoren abgeleitet sind, können verwendet werden. Andere Retroviren können auch verwendet werden, um Vektoren herzustellen, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Solche Retroviren umfassen Rous-Sarkom-Virus (RSV). Die Promotoren aus solchen Viren können in Vektoren auf analoge Weise wie zuvor für MLV beschrieben verwendet werden.
  • Engelhardt et al. (Nature Genetics 4, 27–34 (1993)) beschreiben die Verwendung von Adenovirus-basierten Vektoren bei der Zufuhr des "cystic fibrosis transmembrane conductance product" (CFTR-Protein) in Zellen, und solche Adenovirus-basierten Vektoren können auch verwendet werden. Vektoren, die Adenovirus-Promotor und andere Kontrollsequenzen verwenden, können für die Zufuhr eines Systems gemäß der Erfindung zu Zellen in der Lunge und somit zur Behandlung von Lungentumoren nützlich sein.
  • Vektoren, die für Carboxypeptidase kodieren, können unter Verwendung von DNA-Rekombinationsverfahren, die an sich auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, hergestellt werden. Die für das Enzym kodierenden Sequenzen können durch Spleißen synthetischer oder rekombinanter Nucleinsäuresequenzen zusammen oder durch Modifizieren bestehender Sequenzen durch Verfahren wie z. B. ortsgerichtete Mutagenese konstruiert werden. Für eine Erläuterung von Standard-DNA-Rekombinationsverfahren kann auf "Molecular Cloning" von Sambrook et al., Cold Spring Harbor (1989), verwiesen werden. Im Allgemeinen kann der Vektor jeder beliebige DNA- oder RNA-Vektor sein, der in VDEPT- oder GDEPT-Therapien verwendet wird.
  • B. Carboxypeptidase
  • Die Carboxypeptidase überführt üblicherweise das Prodrug in einen aktiven Wirkstoff durch Entfernen einer Schutzgruppe vom Prodrug. In den meisten Fällen wird die Schutzgruppe als Ganzes vom Prodrug abgespaltet. Es ist jedoch für das Enzym auch möglich, einen Teil der Schutzgruppe abzuspalten oder einfach einen Teil der Schutzgruppe zu verändern, was in einer teilweise gespalteten oder veränderten Schutzgruppe resultiert, die instabil ist, was wiederum zu spontaner Entfernung des Rests der Gruppe führt.
  • Carboxypeptidase G2 (CPG2) ist in der WO 88/07378 offenbart, und ihre Sequenz ist nachstehend auch als Seq.-ID Nr. 1 dargestellt. Obwohl die CPG2 mit der Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 1 bevorzugt ist, sind auch Änderungen an der Sequenz, die Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -insertionen (von z. B. etwa 1, 2, 3, 4, 5, 10 oder 20 Resten in jedem Fall) darstellen, ebenfalls möglich. Jedenfalls ist die Änderung so beschaffen, dass das Enzym seine Fähigkeit, ein Prodrug in einen aktiven Wirkstoff bei im Wesentlichen derselben Geschwindigkeit wie das native Enzym zu überführen, beibehält. In diesem Zusammenhang liegt "im Wesentlichen dieselbe Geschwindigkeit" wünschenswerterweise innerhalb 1 Größenordnung, und vorzugsweise von etwa 50-mal z. B. von etwa 2-mal weniger bis 2-, 5- oder 10-mal mehr.
  • Zusätzlich zu spezifischen Änderungen kann das Enzym auch anders durch Trunkierung, Substitution, Deletion oder Insertion verändert werden, solange die Aktivität des Enzyms im Wesentlichen wie zuvor definiert unverändert bleibt. Beispielsweise können geringe Trunkierungen in der N- und/oder C-terminalen Sequenz als ein Resultat der Manipulationen auftreten, die erforderlich sind, um einen Vektor zu produzieren, in dem eine Nucleinsäuresequenz, die für das Enzym kodiert, an einen geeigneten Promotor gebunden ist. Die Aktivität des geänderten Enzyms kann in Modellsystemen wie z. B. jenen, die in den Beispielen beschrieben werden, gemessen werden.
  • Ein Beispiel für ein trunkiertes System ist CGP2*, die die Aminosäuren 23 bis 415 von Seq.-ID Nr. 1 enthält.
  • C. Promotoren
  • Die Carboxypeptidase wird im Vektor unter Verwendung eines Promotors exprimiert, der in der Lage ist, in der Zelle exprimiert zu werden, auf die der Vektor gerichtet ist. Der Promotor ist operabel an die Sequenzen, die für das Enzym kodieren, und seine assoziierten Sequenzen gebunden. Beispielsweise wird das c-erbB2-proto-Onkogen in Brustgeweben in niedrigen Konzentrationen und auf eine Gewebe-beschränkte Weise exprimiert. In manchen Tumorstadien wird jedoch die Expression dieses Proteins aufgrund erhöhter Transkriptionsaktivität gesteigert. Nennenswerte Beispiele hierfür sind Brustgewebe- (etwa 30 % von Tumoren), Ovarial- (etwa 20 %) und Pankreas-Tumoren (etwa 50–75 %). In solchen Tumoren, in denen Expression von c-erbB2 aufgrund von erhöhter Transkription oder Translation gesteigert wird, kann der c-erbB2-Promotor verwendet werden, um Expression von Proteinen auf zellspezifische Weise zu steuern.
  • Mit dem GDEPT-System der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von c-erbB2-Promotoren zum Targeting solcher Tumoren wird die Spezifität von GDEPT gesteigert, da Transfektion von normalen Zellen durch einen Vektor mit einem c-erbB2-Promotor nur sehr eingeschränkte Mengen von Enzym oder kein Enzym bereitstellt und somit für eingeschränkte Aktivierung von Prodrug sorgt.
  • Der c-erbB-2-Promotor wurde bereits bis –1500 sequenziert und kann unter Bezugnahme auf Hudson et al., J. Biol. Chem. 265, 4389–4393 (1990), gewonnen werden. Die Haupt-Transkriptionsstartstelle wurde von Ishii et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 4374–4378 (1987), und Tal et al., Mol. Cell Biol. 7, 2597-–2601 (1987), bestimmt. Diese Startstelle wird als +1 bezeichnet, und auf diese Nummerierung wird hierin Bezug genommen. Translation von c-erbB-2 beginnt bei +178. Der Promotor weist eine CAAT-Box bei –75 und eine TATA-Box bei –25 auf.
  • Hollywood & Hurst, EMBO J. 12, 2369–2375 (1993), berichten, dass in Mammazellen Regionen des Promotors bei –100 und –213 für die Regulation von Transkription wichtig sind (siehe auch Sarkar et al., J. Biol. Chem. 269, 12285–12289 (1994)).
  • Um Expression aus einem Vektor unter Verwendung des c-erbB-2-Promotors zu erreichen, ist es wünschenswert, die c-erbB-2-Promotorregion aus der CAAT-Box, und vorzugsweise aus der TATA-Box, stromauf zu verwenden, um Sequenzelemente einzubinden, die für Expressionsspezifität in bestimmten Geweben verantwortlich sind, wie beispielsweise jene, die für Mammazellen von Hollywood & Hurst (s.o.) entdeckt wurden. Der Promotor umfasst somit wünschenswerterweise zumindest alle Nucleotide stromauf (5') der CAAT-Box bis etwa zum 250., z. B. 300., 400., 500., 600., 700., 800., 900. oder einem noch weiteren Nucleotid 5' zum Transkriptionsstart. Auch wird bevorzugt, die TATA-Box einzubinden. Gegebenenfalls können auch die c-erbB-2-Sequenzen stromab der TATA-Box bis zum Translationsstart bei +178 verwendet werden.
  • Obwohl die menschliche c-erbB-2-Promotorsequenz bevorzugt wird, können auch modifizierte Promotorsequenzen, die in der Lage sind, selektiv an die menschliche Sequenz zu hybridisieren, verwendet werden. Eine Promotorsequenz, die in der Lage ist, selektiv an die menschliche Promotorsequenz zu hybridisieren, ist im Allgemeinen zu zumindest 70 %, vorzugsweise zu zumindest 80 oder 90 %, und noch bevorzugter zu zumindest 95 %, homolog zur Promotorregion oder zu einem Fragment davon über eine Region von zumindest 20, vorzugsweise zumindest 30, beispielsweise 40, 60 oder 100 oder mehr, zusammenhängenden Nucleotiden.
  • Im Allgemeinen wird Fachleuten bekannt sein, dass manche Regionen des Promotors wie beispielsweise jene an –213 beibehalten werden müssen, um Tumor-Expressionsspezifität vom Vektor sicherzustellen, während andere Regionen des Promotors ohne signifikanten Spezifitätsverlust modifiziert oder deletiert werden können. Somit sind modifizierte Promotoren, die transkriptionell im Wesentlichen zum selben Grad wie menschlicher c-erbB-2 reguliert sind, bevorzugt. Der Regulationsgrad solcher Kandidatenpromotoren kann von Fachleuten unter Verwendung von beispielsweise CAT-Tests gemäß jenen, wie sie von Hollywood & Hurst (s.o.) beschrieben werden, getestet und bewertet werden.
  • "Operabel gebunden" bezieht sich auf eine Aneinanderlagerung, worin der Promotor und die für das Enzym kodierende Sequenz in Beziehung stehen, was ermöglicht, dass die Kodiersequenz unter der Steuerung des Promotors exprimiert wird. Somit können Elemente wie beispielsweise 5'-nicht-kodierende Sequenz zwischen dem Promotor und der Kodiersequenz liegen, die weder für den Promotor noch für die Kodiersequenz nativ ist. Solche Sequenzen können in den Vektor eingebunden werden, wenn sie die korrekte Steuerung der Kodiersequenz durch den Promotor nicht beeinträchtigen.
  • Andere geeignete Promotoren umfassen virale Promotoren wie beispielsweise Säugetier-Retrovirus- oder DNA-Virus-Promotoren. Geeignete Promotoren umfassen jene, die in den zuvor beschriebenen Vektoren verwendet werden, z. B. MLV-, CMV-, RSV- und Adenovirus-Promotoren. Bevorzugte Adenovirus-Promotoren sind die Adenovirus-Frühgen-Promotoren. Starke Säugetier-Promotoren können auch geeignet sein. Ein Beispiel für einen solchen Promotor ist der EF-1α-Promotor, der unter Be zugnahme auf Mizushima & Nagata, Nucl. Acids Res. 18, 5322 (1990), gewonnen werden kann. Varianten solcher Promotoren, die im Wesentlichen ähnliche Transkriptionsaktivitäten beibehalten, können auch verwendet werden.
  • Die Erfindung stellt einen viralen Vektor bereit, der einen c-erbB-2-Promotor umfasst, der operabel an ein Gen gebunden ist, das für ein Carboxypeptidase-Enzym kodiert, worin das Enzym in der Lage ist, ein Prodrug in einen aktiven Wirkstoff überzuführen. Die Erfindung stellt auch ein Set bereit, das einen Vektor wie zuvor definiert zusammen mit einem Prodrug umfasst, das in der Lage ist, durch das vom Vektor kodierte Enzym in einen aktiven Wirkstoff übergeführt zu werden. In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines Vektors wie zuvor definiert oder eines Sets wie zuvor definiert bei der Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung bei der Behandlung des menschlichen Körpers oder Tierkörpers, und insbesondere bei der Behandlung von Tumoren, in denen das c-erbB-2-proto-Onkogen überexprimiert wird, bereit. In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Tumoren, und insbesondere ein Verfahren zur Behandlung von Tumoren, in denen das c-erbB-2-proto-Onkogen überexprimiert wird, bereit, wobei dieses Verfahren die Verwendung (i) einer wirksamen Menge eines Vektors wie zuvor definiert und (ii) einer wirksamen Menge eines Prodrugs, das in der Lage ist, durch das durch den Vektor kodierte Enzym in einen aktiven Wirkstoff übergeführt zu werden, bei der Herstellung eines Medikamentes zur Verabreichung an ein Individuum mit einem Tumor umfasst.
  • D. Prodrugs
  • Das Prodrug zur Verwendung im System wird so ausgewählt, dass es mit dem Enzym kompatibel ist, d.h. so, dass das Enzym in der Lage ist, das Prodrug in einen aktiven Wirkstoff überzuführen. Wünschenswerterweise ist die Toxizität des Prodrugs gegenüber einem behandelten Patienten um zumindest eine Größenordnung weniger toxisch als der aktive Wirkstoff. Vorzugsweise ist der aktive Wirkstoff um mehrere, z. B. 2, 3, 4 oder mehr, Größenordnungen stärker toxisch. Geeignete Prodrugs umfassen Stickstofflost-Prodrugs und andere Verbindungen wie jene, die in der WO 88/07378, WO 89/10140, WO 90/02729, WO 91/03460, der EP-A-540.263, der WO 94/02450, WO 95/02420 oder WO 95/03830, die hierin durch Verweis aufgenommen sind, beschrieben sind.
  • E(i) – Stickstofflost-Prodrugs
  • Stickstofflost-Prodrugs umfassen Verbindungen der Formel: M-Ar-CONH-R worin Ar für ein(en) gegebenenfalls substituierten/s Ring oder aromatisches Ringsystem steht, R-NH für den Rest eines α-Aminosäure-R-NH2 oder Oligopeptid-R-NH2 steht und zumindest eine Carbonsäuregruppe enthält und M für eine Stickstofflost-Gruppe steht.
  • Der Rest des Aminosäure-R-NH ist vorzugsweise der Rest von Glutaminsäure. In der WO 88/07378 ist offenbart, dass die Enzym-Carboxypeptidase G2 in der Lage ist, die Glutaminsäuregruppierung aus Verbindungen des zuvor gezeigten Typs zu entfernen, und die Entfernung der Glutaminsäuregruppierung führt zur Produktion eines aktiven Stickstofflost-Wirkstoffs.
  • Somit umfassen Stickstofflost-Prodrugs, die in der Erfindung Verwendung finden, die Prodrugs der allgemeinen Formel I aus der WO 94/02450 und Salze davon, und insbesondere jene der Formel (I):
    Figure 00100001
    worin R1 und R2 jeweils unabhängig voneinander für Chlor, Brom, Iod, OSO2Me oder OSO2-Phenyl (worin Phenyl gegebenenfalls mit 1, 2, 3, 4 oder 5 Substituenten, unabhängig voneinander ausgewählt aus C1-4-Alkyl, Halogen, -CN oder NOZ, substituiert ist) stehen;
    R1a und R2a jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, C1-4-Alkyl oder C1-4-Halogenalkyl stehen;
    R3 und R4 jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, C1-4-Alkyl oder C1-4-Halogenalkyl stehen;
    n eine Ganzzahl von 0 bis 4 ist;
    jeder R5 unabhängig voneinander für Wasserstoff, C1-4-Alkyl, das gegebenenfalls eine Doppelbindung oder eine Dreifachbindung enthält, C1-4-Alkoxy, Halogen, Cyano, -NH2, -CONR7R8 (worin R7 und R8 unabhängig voneinander Wasserstoff, C1-6-Alkyl oder C3- 6-Cycloalkyl sind) steht oder zwei benachbarte R5-Gruppen zusammen für
    a) C4-Alkylen, gegebenenfalls mit einer Doppelbindung;
    b) C3-Alkylen; oder
    c) -CH=CH-CH=CH-, -CH-CH-CH2- oder -CH2-CH=CH-, jedes gegebenenfalls mit 1, 2, 3 oder 4 Substituenten substituiert, worin die Substituenten jeweils unabhängig voneinander aus der aus C1-4-Alkyl, C1-4-Alkoxy, Halogen, Cyano und Nitro bestehenden Gruppe ausgewählt sind, stehen;
    X eine Gruppe -C(O)-, -O-C(O)-, -NH-C(O)- oder -CH2-C(O)- ist; und
    Z eine Gruppe -CH2-T-C(O)-OR6 ist, worin T für CH2, -O-, -S-, -(SO)- oder -(SO2)- steht und R6 Wasserstoff, C1-6-Alkyl, C3- 6-Cycloalkyl, Amino, Mono- oder Di-C1-6-Alkylamino oder Mono- oder Di-C3- 6-Cycloalkylamino ist, mit der Maßgabe, dass, wenn R6 Wasserstoff ist, T -CH2- ist; und physiologisch annehmbare Derivate, einschließlich Salze, der Verbindungen nach Formel (I).
  • Halogen umfasst Fluor, Chlor, Brom und Iod. Bevorzugte Werte für die Gruppen R1a und R2a sind Methyl und Wasserstoff, insbesondere Wasserstoff. Bevorzugte Werte für die Gruppen R3 und R4 sind Wasserstoff, Methyl und Trifluormethyl, insbesondere Wasserstoff. Bevorzugte Werte für die Gruppen R1 und R2 sind I, Br, Cl, OSO2Me und OSO2Phenyl, worin Phenyl mit einem oder zwei Substituenten an der/den 2- und/oder 4-Position(en) substituiert ist. I, Cl und OSO2Me sind besonders bevorzugt.
  • Bevorzugte Werte für R5, wenn n eine Ganzzahl von 1 bis 4 ist, sind Fluor, Chlor, Methyl-CONH2 und Cyano. Vorzugsweise ist n = 0, 1 oder 2. Ist n gleich 1 oder 2, so wird bevorzugt, dass R5 Fluor an der/den 3- und/oder 5-Position(en) des Rings ist.
  • Die Gruppe X ist vorzugsweise -C(O)-, -O-C(O)- oder -NH-C(O)-. Z ist vorzugsweise eine Gruppe -CH2CH2-COOH.
  • Bevorzugte spezifische Verbindungen umfassen:
    N-4-[(2-Chlorethyl)(2-mesyloxyethyl)amino]benzoyl-L-glutaminsäure (als "CMDA" bezeichnet) und Salzen davon; und
    N-(4-[Bis(2-iodethyl)amino]phenoxycarbonyl)-L-glutaminsäure und Salzen davon.
  • F. Anwendungen der Erfindung
  • Das System der Erfindung kann in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen Körpers oder Tierkörpers verwendet werden. Solch eine Behandlung umfasst ein Verfahren zum Behandeln des Wachstums neoplastischer Zellen, das die Verabreichung des Systems der Erfindung an einen Patienten, der solch einer Behandlung bedarf, umfasst. Auch ist es möglich, dass die Erfindung verwendet werden kann, um Zellen zu behandeln, die durch Infektion des menschlichen Körpers oder Tierkörpers durch Bakterien, Viren oder Parasiten erkrankt sind. Späte virale Promotoren hängen oft von viralen Proteinen ab, die früh im Laufe der Infektion gebildet werden. Die viralen Hüllproteine, die an der Oberfläche einer infizierten Zelle exprimiert werden, können als ein Target verwendet werden, um das Gen in die Zelle zu bekommen. Wird dann ein später viraler Promotor verwendet, um Expression des GDEPT-Enzyms zu steuern, so exprimieren jegliche infizierten Zellen, und insbesondere jene Zellen, die bereits längere Zeit infiziert sind, das Protein. Dies kann ausreichend sein, um die infizierten Zellen zu töten. Im Fall von Parasiten können ein parasitärer Promotor und Parasiten-Oberflächenproteine verwendet werden, um Expression zu steuern bzw. die Parasiten zu infizieren.
  • Im Fall einer Bakterie müssen alle Zufuhrsysteme wahrscheinlich geändert werden, um bakterielle Viren zu verwenden, wobei ein spezifischer Promotor leichter zu definieren sein sollte.
  • Zur Verwendung der Vektoren in Therapieanwendungen werden die Vektoren üblicherweise in virale Partikel gepackt, und die Partikel werden zur Stelle des Tumors zugeführt, wie beispielsweise in Ram et al. (s.o.) beschrieben wird. Die viralen Partikel können modifiziert werden, sodass sie einen Antikörper, ein Fragment davon (einschließlich einer einzelnen Kette) oder Tumor-gerichteten Liganden umfassen, um Targeting auf den Tumor zu steigern. Alternativ dazu können die Vektoren in Liposomen gepackt sein. Die Liposomen können auf einen bestimmten Tumor gerichtet werden. Dies kann durch Binden eines Tumor-gerichteten Antikörpers an das Liposom erreicht werden. Virale Partikel können auch in Liposomen inkorporiert sein. Die Partikel können zum Tumor durch jegliches geeignete Mittel, über das der Arzt verfügt, zugeführt werden. Vorzugsweise sind die viralen Partikel in der Lage, die Tumorzellen selektiv zu infizieren. Unter "selektiv infizieren" wird verstanden, dass die viralen Partikel primär Tumorzellen infizieren und dass der Anteil an Nicht-Tumorzellen, die infiziert werden, so klein ist, dass der Schaden an Nicht-Tumorzellen durch Verabreichung eines Prodrugs in Anbetracht der zu behandelnden Erkrankung annehmbar gering ist. Schließlich wird dies durch den Arzt bestimmt.
  • Geeignete Liposomen umfassen beispielsweise jene, die positiv geladenes Lipid (N[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-triethylammonium (DOTMA)) umfassen, jene, die Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) umfassen, und jene, die 3β[N-(n',N'-Dimethylaminoethan)carbamoyl]cholesterin (DC-Chol) umfassen.
  • Ein geeigneter Verabreichungsweg ist jener mittels Injektion der Partikel in einer sterilen Lösung. Wenn es für die Prodrugs auch möglich ist, alleine verabreicht zu werden, wird bevorzugt, sie in Form von pharmazeutischen Formulierungen zuzuführen. Die Formulierungen umfassen ein Prodrug zusammen mit einem oder mehreren annehmbaren Trägern dafür und gegebenenfalls anderen therapeutischen Bestandteilen. Der oder die Träger müssen in dem Sinne "annehmbar" sein, als dass sie mit anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel und gegenüber den Rezipienten, beispielsweise Liposomen, nicht schädlich sind. Geeignete Liposomen umfassen beispielsweise jene, die das positiv geladene Lipid (N[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-triethylammonium (DOTMA)) umfassen, jene, die Dioleoylphosphatidylethano lamin (DOPE) umfassen, und jene, die 3β[N-(n',N'-Dimethylaminoethan)carbamoyl]cholesterin (DC-Chol) umfassen.
  • Viren, beispielsweise isoliert von Verpackungs-Zelllinien, können auch durch regionale Perfusion oder direkte intratumorale Injektion oder Injektion in eine Körperhöhle (intrakavitäre Verabreichung), beispielsweise durch intraperitoneale Injektion, verabreicht werden.
  • Auch ist bekannt, dass Muskelzellen nackte DNA aufnehmen können und somit Sarkome unter Verwendung eines Vektorsystems der Erfindung, worin nackte DNA direkt in das Sarkom injiziert wird, behandelt werden können.
  • Formulierungen, die für parenterale oder intramuskuläre Verabreichung geeignet sind, umfassen wässrige und nicht-wässrige sterile Injektionslösungen, die Antioxidanzien, Puffer, Bakteriostatika, bakterizide Antibiotika und Gelöststoffe umfassen, die die Formulierung mit dem Blut des beabsichtigten Rezipienten isotonisch machen; und wässrige und nicht-wässrige sterile Suspensionen, die Suspensionsmittel und Verdickungsmittel umfassen können, und Liposomen oder andere Mikropartikelsysteme, die darauf abzielen, die Verbindung gegen Blutkomponenten oder ein oder mehrere Organe zu richten. Die Formulierungen können in Einheitsdosis- oder Mehrfachdosis-Behältnissen, beispielsweise in versiegelten Ampullen und Phiolen, vorhanden sein und können in einem gefriergetrockneten (lyophilisierten) Zustand gelagert werden, der für Injektionen nur den Zusatz des sterilen flüssigen Trägers, beispielsweise Wasser, unmittelbar vor der Verwendung bedarf. Injektionslösungen und -suspensionen können spontan aus sterilen Pulvern, Granulaten und Tabletten des zuvor beschriebenen Typs hergestellt werden.
  • Es gilt zu verstehen, dass die Formulierungen zusätzlich zu den zuvor speziell genannten Bestandteilen auch andere Mittel umfassen können, die auf dem Gebiet der Erfindung in Bezug auf den Typ der betreffenden Formulierung herkömmlich sind. Von den möglichen Formulierungen werden sterile, pyrogenfreie, wässrige und nicht-wässrige Lösungen bevorzugt.
  • Die Dosierungen können nacheinander, d.h. in täglichen, wöchentlichen oder monatlichen Intervallen, oder in Abstimmung mit einem besonderen Bedarf des Patienten verabreicht werden.
  • Bevorzugte Verabreichungswege sind orale Zufuhr und Injektion, typischerweise parenterale oder intramuskuläre Injektion oder intratumorale Injektion.
  • Bei der Verwendung des Systems der vorliegenden Erfindung wird das Prodrug üblicherweise nach der Verabreichung des für ein Enzym kodierenden Vektors verabreicht. Typischerweise wird der Vektor dem Patienten verabreicht, und dann wird die Aufnahme des Vektors durch die transfizierten oder infizierten (im Fall von viralen Vektoren) Zellen beobachtet, beispielsweise durch Entnahme und Analyse einer Biopsieprobe von Target-Gewebe.
  • Der exakte Dosierungsplan muss selbstverständlich von den einzelnen Ärzten für jeden Patienten neu bestimmt werden, und dies hängt wiederum unmittelbar von der exakten Beschaffenheit des Prodrugs und des zytotoxischen Mittels, das es aus dem Prodrug freizusetzen gilt, ab, wobei jedoch allgemeine Richtlinien vorgegeben werden können. Chemotherapie von diesem Typ umfasst normalerweise parenterale Verabreichung sowohl des Prodrugs als auch des modifizierten Virus, und intravenöse Verabreichung erweist sich hier häufig als die praktischste Art der Verabreichung. Im Fall von Glioblastomen erfolgt die Verabreichung häufig intratumoral. Ein typischer Dosierungsbereich von Prodrug liegt im Allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 150 mg pro kg Körpergewicht des Patienten pro Tag, die in einzelnen oder Mehrfachdosen verabreicht werden können. Vorzugsweise reicht der Dosierungsbereich von etwa 10 bis 75, z. B. von etwa 10 bis 40, mg pro kg Körpergewicht des Patienten pro Tag. Andere Dosen können gemäß dem Leiden des Patienten und anderen Faktoren je nach Ermessen des Arztes verwendet werden.
  • Tumoren, die unter Verwendung des Systems der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, umfassen jegliche Tumoren, die in der Lage sind, durch ein GDEPT- oder VDEPT-System behandelt zu werden, und sind somit nicht auf eine bestimmte Klasse von Tumoren eingeschränkt. Besonders geeignete Tumortypen umfassen Brust-, Kolorektal- und Ovarialtumoren sowie Pankreastumoren, Melanom, Glioblastom, Hepatom, kleinzellige Lungentumoren, nicht-kleinzellige Lungentumoren, Muskel- und Prostatatumoren.
  • Das System der Erfindung kann auch verwendet werden, um beispielsweise Infektionskrankheiten und jedes andere Leiden, das das Auslöschen einer Zellpopulation erfordert, zu behandeln.
  • Es gilt zu verstehen, dass im Zusammenhang mit der Behandlung von Tumoren die Behandlung jegliche Maßnahme umfasst, die der Arzt vornimmt, um die Wirkung des Tumors auf den Patienten zu lindern. Somit umfasst eine wirksame Behandlung, auch wenn vollständige Remission des Tumors ein wünschenswertes Ziel ist, auch jegliche Maßnahmen, die in der Lage sind, teilweise Remission des Tumors sowie ein Verlangsamen der Wachstumsgeschwindigkeit eines Tumors einschließlich Metastasen zu erreichen. Solche Maßnahmen können zur Verlängerung der Lebenserwartung und/oder Verbesserung der Lebensqualität sowie zur Erleichterung der Symptome der jeweiligen Erkrankung wirksam sein.
  • Die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung der Erfindung.
  • HERSTELLUNGSBEISPIEL 1
  • Das native CPG2-Protein enthält ein Signalpeptid, das dazu dient, es aus bakteriellen Zellen in die extrazelluläre Umgebung zu transportieren. Um sicherzustellen, dass das Signalpeptid den Export von CPG2 aus Säugetierzellen nicht steuerte, wurde PCR-gerichtete, ortsspezifische Mutagenese verwendet, um das Signalpeptid aus dem CPG2-Gen zu deletieren. Dies wurde unter Verwendung des PCR-Primers Nr. 4.476:
    5'>CGC GGA TCC GCC CTG GCC CAG AAG CGC<3'
    in Verbindung mit Primer Nr. 4.477:
    5'>CGC GAA TTC CTT GCC GGC GCC CAG ATC<3'
    erreicht.
  • Primer Nr. 4.476 wurde verwendet, um Codons 21 und 22 des CPG2-Gens zu einer BamH1-Restriktionsendonucleasestelle zu ändern. Primer Nr. 4.477 wurde verwendet, um Codon 416 (das natürliche Stoppcodon von CPG2) zu einer EcoR1-Restriktionsendonucleasestelle zu ändern. Ein mittels PCR gebildetes Fragment, das den gesamten offenen CPG2-Leseraster enthielt, wurde gebildet und mit BamH1 und EcoR1 verdaut und in jene Stellen des Plasmids MLVβplink kloniert (Dalton & Treisman, Cell 68, 597–612 (1992)). Dies resultiert in einem CPG2-Protein, das die Struktur: Met-Ala-Gly-Ser- (CPG2-Codons 23 bis 415) -Glu-Phe-Leu-Glu-Ile-Asp aufweist und dem daher das Signalpeptid fehlt. Das Plasmid wird als "MLVCPG2*" bezeichnet und das aus diesem produzierte Protein als "CPG2*".
  • NIH3T3-Zellen wurden mit MLVCPG2* oder mit MLVβplink als eine Kontrolle transfiziert, um zu bestimmen, ob CPG2 in Säugetierzellen produziert werden konnte. Transfektion wurde unter Verwendung des Lipidreagens lipofectAMINE (GibcoBRL) durchgeführt. Zur Transfektion wurden 1 × 105 Zellen in 35-mm-Gewebekulturschalen ausplattiert und bei 37 °C über Nacht inkubiert. Am darauf folgenden Tag wurden lipofectAMINE:DNA-Komplexe durch Kombinieren von 0,4 μg Plasmid mit 6 μl lipofectAMINE-Reagens (GibcoBRL) in einem Gesamtvolumen von 32 μl PBSA hergestellt; die Komplexe wurden bei Raumtemperatur 15 min lang inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit 2 ml serumfreiem DMEM-Medium gewaschen und in 0,8 ml serumfreies DMEM gegeben. Die lipofectAMINE:DNA-Komplexe wurden in 0,2 ml serumfreies Medium verdünnt und zu den Zellen zugesetzt. Die Zellen wurden mit den IipofectA-MINE:DNA-Komplexen 6 h lang bei 37 °C inkubiert, zweimal mit 2 ml DMEM-Medium, das 10 % fötales Kälberserum (FCS) enthielt, gewaschen und in 2,5 ml 10 % FCS/DMEM gegeben. Nach einer weiteren Inkubationsphase, die 42 h lang andauerte, wurden die Zellen zweimal mit 5 ml PBSA gewaschen und auf den Ge webekulturschalen in 50 μl Puffer A (250 mM Tris.HCl, 10 Vol.-% Glycerin, 1 Vol.-% Triton X-100, pH 7,5) extrahiert. Das Extrakt wurde in 1,5-ml-Röhrchen transferiert, bei 13.000 U/min in einer Mikro-Zentrifuge zentrifugiert, und die Überstände wurden gesammelt; die Proteinkonzentration wurde mit dem Bio-Rad-Proteintestset mit BSA als Standard bestimmt.
  • Zur Protein-Immunoblot-Analyse wurden 10 μl von jedem Extrakt mit 10 μl von SDS-Probenpuffer kombiniert, und die Proteine wurden an einem 10%igen SDS-Polyacrylamidgel (U.K. Laemmli, Nature 227, 680–685 (1970)) getrennt. Die Proteine im Gel wurden durch Elektroelution auf Nitrocellulose transferiert, und die Zellextrakte wurden durch Protein-Immunoblotting (J.M. Gershoni & G.E. Palade, Anal. Biochemistry 131, 1–15 (1983)) unter Verwendung eines CPG2-spezifischen polyklonalen Kaninchen-Antikörpers, der gegen CPG2, das in Sf9-Insektenzellen exprimiert wurde, gezüchtet wurde, analysiert. Der Antikörper wurde bei einer Verdünnung von 1:1.000 verwendet, und die Immunokomplexe wurden unter Verwendung des ECL-Immunoblotting-Sets gemäß den Anweisungen des Herstellers (Amersham) nachgewiesenen.
  • Die Extrakte wurden auch durch Messen ihrer Fähigkeit, das CMDA-Prodrug zu aktivem Wirkstoff zu spalten, der durch Messen der Änderung von OD-Absorption bei 305 nm nachgewiesen werden kann, auf CPG2-Enzymaktivität getestet. Für den Test wurden 5 μg NIH3T3-Protein, extrahiert in Puffer A, in 1 ml Testpuffer (20 mM Tris.HCl, 1 mM MgCl2, 60 μM ZnCl2, pH 7,4), der 50 μM CMDA-Prodrug enthielt, bei 37 °C 15 min lang inkubiert. Nach Inkubation wurde EDTA zu einer Endkonzentration von 10 mM zugesetzt, und Änderung der Absorption bei 305 nm wurde beobachtet und mit jener der Ausgangslösung verglichen. Ein Rückgang der Absorption weist auf Umsetzung des Prodrugs zum Wirkstoff hin und zeigt folglich die Gegenwart von CPG2 auf; die Enzymaktivität wird in willkürlichen Einheiten, verglichen mit Extraktionspufferkontrollen, dargestellt.
  • Aus der Immunoblotanalyse ist ersichtlich, dass Extrakte aus Zellen, die mit MLVCPG2* transfiziert sind, ein Protein mit einer scheinbaren Mr von ~ 40.000 ent hielten, das durch den CPG2-Antikörper erkannt wurde und das in Zellen, die mit MLVβplink transfiziert sind, nicht vorhanden ist (1A). Wurde die enzymatische Aktivität dieser Extrakte untersucht, so wurde CPG2-Aktivität in Zellextrakten aus Zellen, die mit MLVCPG2* transfiziert waren, nachgewiesen, jedoch nicht in Extrakten aus Zellen, die mit MLVβplink transfiziert waren (1B). Diese Daten zeigen, dass es möglich ist, CPG2* innerhalb von Säugetierzellen in einer Form zu exprimieren, die enzymatisch aktiv ist.
  • BEISPIEL 1
  • Das intern exprimierte CPG2* wurde auf seine Fähigkeit getestet, Zelltod in NIH3T3-Zellen, die mit Prodrugs behandelt wurden, zu steuern. Zwei Reihen an Zellen wurden hergestellt, von denen jede eine Schale mit Zellen enthielt, die mit MLVβplink transfiziert waren, und eine Schale mit Zellen, die mit MLVCPG2* transfiziert waren. Die Zellen wurden 42 h lang nach der Transfektion inkubiert, und dann wurde Reihe 1 in Gegenwart von Prodrugvehikel (5 mM Hepes, 0,5 Vol.-% DMSO, pH 7,0; Endkonzentrationen) 24 h lang inkubiert, und Reihe 2 wurde mit dem CMDA-Prodrug (0,5 mM Endkonzentration) 24 h lang inkubiert. Nach Prodrug-Behandlung wurden die Zellen zweimal mit 5 ml frischem Medium gewaschen und weitere 24 n lang inkubiert. Sie wurden dann in frische Kulturschalen übertragen und mit 1 × 105 Zellen/35-mm-Schale in 2 ml 10 % FCS/DMEM ausgesät. Nach weiteren 72 h Inkubation wurde Zellwachstum durch Thymidininkorporation bewertet. Für Thymidininkorporation wurde 1 μCi von [Methyl-3H]-Thymidin zu jedem Well (2 ml Medium) zugesetzt und 5 h lang bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit PBSA (4 °C) gewaschen und mit 5 % (Gew./Vol.) Trichloressigsäure (TCA) in Wasser bei 4 °C 20 min lang fixiert. Die TCA wurde entfernt, und die Zellen wurden zweimal mit 2 ml Methanol gewaschen und luftgetrocknet. Die DNA wurde mit 1 ml 0,1 M NaOH, 1 % SDS bei Raumtemperatur 5 min lang extrahiert, zu 4 ml Szintillationsflüssigkeit gegeben, und das inkorporierte Thymidin wurde durch Szintillationszählung bestimmt.
  • Zellen, die mit MLVCPG2* transfiziert waren, wuchsen mit derselben Geschwindigkeit wie Zellen, die mit MLVβplink transfiziert waren, was darauf hinweist, dass Expression von CPG2* in den Zellen das Wachstum dieser Zellen nicht beeinflusste (2, vergleiche Proben 1 u. 2). Die Behandlung von Kontrollzellen mit CMDA hatte nur eine geringe Wirkung auf ihre Wachstumsgeschwindigkeit (2, vergleiche Proben 1 u. 3). Dahingegen resultierte Behandlung der Zellen, die CPG2* exprimierten, mit CMDA in vollständiger Inhibition von Thymidininkorporation und Zelltod (2, vergleiche Proben 2 u. 4). Somit zeigen diese Daten, dass das Enzym CPG2 in NIH3T3-Zellen in einer aktiven Form exprimiert werden kann, die die Wachstumsgeschwindigkeit dieser Zellen nicht beeinflusst. Werden Zellen, die CPG2* exprimieren, mit 0,5 mM CMDA 24 h lang behandelt, so werden 100 % der Zellen getötet.
  • HERSTELLUNGSBEISPIEL 2
  • 1. Konstruktion des Vektors
  • Eine Expressionskassette wurde durch Fusionieren des 1,2-kb-HindIII/EcoR1-Fragments aus dem Plasmid pEF-Bos (Mizishuma & Nasgata, NAR 18, 5322 (1990)), das den EF1a-Promotor, das erste Exon, erste Intron und einen Abschnitt des zweiten Exons enthält, an das β-Globingen an Position -4 in Bezug auf den Transkriptionsstart des β-Globingens kosntruiert. Das Nco-1/HindIII-Fragment aus dem Plasmid MLVβ-Plink, das den Polylinker und die 3'-untranslatierte β-Globin-Region enthielt, wurde an die Nco-1-Stelle des β-Globingens fusioniert, das über dem β-Globin-Translationsstart angeordnet ist (Position +50 in Bezug auf den Transkriptionsstart), um einen Polylinker und eine 3'-untranslatierte Region für korrekte mRNA-Verarbeitung bereitzustellen.
  • Diese gesamte Kassette musste in den Vektor pMC1Neo-PolyA (Stratagene) kloniert werden. pMC1Neo-PolyA wurde zuerst modifiziert, um die im NeoR-Gen angeordnete Nco1-Stelle zu zerstören und um die BamHi-, HincII- und Sal1-Stellen, die am 3'-Ende des NeoR-Gens angeordnet sind, zu entfernen. Die EF1α-Expressionskassette wurde als ein HindIII-Fragment (end-repariert) in die Xho1-Stelle (end-repariert) im modifizierten pMC1Neo-PolyA-Plasmid kloniert. Ein Vektor mit dem EF1α-Promotor und dem TK-Promotor (der Expression des NeoR-Gens steuert), die in entgegengesetzte Richtung ausgerichtet sind, wurde zur Expression von CPG2* ausgewählt; der Vektor wird als pMCEF-Plink bezeichnet. CPG2* wurde aus pMLVCPG2* als ein Nco1/Xba1-Fragment in die Nco1/Xba1-Stellen von pMCEF-Plink kloniert; dieses Plasmid wird als pMCEFCPG2* bezeichnet. Als ein Kontrollplasmid wurde das IacZ-Gen auch in die Nco1/Xba1-Stellen pMCEF-Plink als ein Nco1/Xba-Fragment aus dem Plasmid MLVBIacZ kloniert; dieses wird als pMCEFIacZ bezeichnet.
  • 2. Herstellung stabiler Zelllinien
  • Stabile Zelllinien wurden mit NIH3T3-Zellen hergestellt, um CPG2* konstitutiv oder als eine Kontrolle des IacZ-Genprodukts (β-Galactosidase) zu exprimieren. Um dies zu erreichen, wurden NIH3T3-Zellen mit pMCEF-CPG2* oder pMCEFIacZ wie in Herstellungsbeispiel 1 beschrieben transfiziert, und zwei Tage nach Transfektion wurden die Zellen bei geringer Dichte in Medium ausplattiert, das G418 bei 1 mg/ml enthielt. Kolonien, die aus einzelnen Zellen entstanden, konnten etwa zwei Wochen später beobachtet werden, und diese wurden kloniert und einzeln gezüchtet. Die Expression von CPG2* wurde durch Immunoprotein-Blotting von 30 μl Zellextrakt (extrahiert wie in Herstellungsbeispiel 1 beschrieben) aus jeder der G418-resistenten Kolonien mit einem CPG2-spezifischen polyklonalen Antikörper bestimmt. Die Zelllinie Nr. 9, die hohe Konzentrationen an CPG2* exprimiert (3A), und die Zelllinie Nr. 3, die die β-Galactosidase exprimiert (siehe unten), wurden für weitere Untersuchungen selektiert. Die Expression von CPG2* und β-Galactosidase wurde in den Zelllinien durch enzymatischen Test überprüft. Für diese Tests wurden 1 × 105 Zellen für die Linien Nr. 3 und Nr. 9 in 35-mm-Gewebekulturschalen ausplattiert und 4 Tage lang inkubiert. Zellextrakte wurden wie in Herstellungsbeispiel 1 beschrieben hergestellt, und 5 μg Protein wurden einem CMDA-Abbautest und einem β-Galactosidase-Test (der CMDA-Test ist in Herstellungsbeispiel 1 beschrieben) unterzogen. Für den Test zu β-Galactosidase-Aktivität in Zellen wurden 5 μg von extrahiertem Protein zu 600 μl Testpuffer (40 mM Na2PO4, 26,7 mM NaH2PO4, 6,5 mM KCl, 1 mM MgSO4, 25 mM 2-Mercaptoethanol, 50 mM Tris.HCl, 0,06 Vol.-% Triton X-100, 2,2 mM o- Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid) zugesetzt und bei 37 °C 60 min lang inkubiert. 250 μl von 1 M Na2CO3 wurden zur Probe zugesetzt, und die OD420 wurde gemessen. Die Resultate in den 3B und 3C zeigen, dass Extrakte aus Linie Nr. 3 (leere Säulen) einen hohen Grad an β-Galactosidase-Aktivität enthalten, jedoch keine CPG2-Aktivität. Der Extrakt aus Linie Nr. 9 enthält keine nachweisbare β-Galactosidase-Aktivität, enthält jedoch einen nachweisbaren Grad an CPG2-Aktivität.
  • BEISPIEL 2
  • Zelllinien Nr. 3 und Nr. 9, die in Herstellungsbeispiel 2 gewonnen wurden, wurden auf Zytotoxizität mit dem CMDA-Prodrug getestet. 1 × 105 Zellen wurden in jedem Well von 24-Well-Schalen ausplattiert, 40 h lang inkubiert und dann mit steigenden Konzentrationen von CMDA bei 37 °C 60 min lang behandelt. Nach weiteren 6 h Inkubation wurden 10 % der Zellen in 24-Well-Schalen neuerlich ausplattiert, weitere 5 Tage lang inkubiert, und Zellüberleben wurde durch [3H]-Thymidininkorporation bestimmt. Die Resultate in 4 zeigen, dass Zelllinie Nr. 3 (schwarze Symbole) sogar gegenüber der höchsten getesteten Konzentration von CMDA nicht empfindlich ist, während Nr. 9 (leere Symbole) je nach Dosis empfindlich ist und eine IC50 von bis 125 μM zeigt.
  • BEISPIEL 3
  • Die Nebenwirkung wurde durch Vermischen von Zelllinien Nr. 3 und Nr. 9, gewonnen in Herstellungsbeispiel 2, bei verschiedenen Konzentrationen (wie angegeben) bestimmt, und insgesamt wurden 1 × 105 Zellen pro Well in 24-Well-Platten ausplattiert und über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden mit 250 μM CMDA 60 min lang wie angegeben behandelt, und Zellüberleben wurde wie in Beispiel 2 bestimmt. Die Resultate in 5 zeigen, dass unter diesen Bedingungen mehr als 95 % der Zellen getötet wurden, wenn nur 5 % der gesamten Zellpopulation CPG2* exprimieren: Somit zeigen sie, dass es eine wesentliche Nebenwirkung mit diesem System gibt.
  • SEQUENZINFORMATION
  • Seq.-ID Nr. 1: Genomische DNA- und Proteinsequenz von CPG2
    Figure 00230001
  • Figure 00240001
  • Figure 00250001

Claims (7)

  1. Zweikomponenten-System für Gen-gerichtete Enzym-Prodrug-Therapie, umfassend (a) einen Vektor, der für eine Carboxypeptidase kodiert, die innerhalb einer Zelle exprimiert wird; und (b) ein Stickstofflost-Prodrug, das durch diese Carboxypeptidase in einen aktiven Wirkstoff übergeführt werden kann, worin das Stickstofflost-Prodrug aus der aus: N-4-[(2-Chlorethyl)(2-mesyloxyethyl)amino]benzoyl-L-glutaminsäure und Salzen davon; und N-(4-[Bis(2-iodethyl)amino]phenoxycarbonyl)-L-glutaminsäure und Salzen davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  2. System nach Anspruch 1, worin das Enzym eine bakterielle Carboxypeptidase ist.
  3. System nach Anspruch 2, worin die Carboxypeptidase Carboxypeptidase G2 (CPG2) ist.
  4. System nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Vektor einen Promotor umfasst, der in einer auf bestimmtes Gewebe eingeschränkten Weise exprimiert werden kann.
  5. System nach Anspruch 4, worin der Promotor ein c-erbB2-Promotor ist.
  6. System nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung oder Therapie des menschlichen oder eines Tierkörpers.
  7. Verwendung eines Vektors, der für ein Carboxypeptidase-Enzym, das innerhalb einer Zelle exprimiert werden kann, und für ein Stickstofflost-Prodrug, das durch dieses Enzym in einen aktiven Wirkstoff übergeführt werden kann, kodiert, worin das Stickstofflost-Prodrug aus der aus: N-4-[(2-Chlorethyl)(2-mesyloxyethyl)amino]benzoyl-L-glutaminsäure und Salzen davon; und N-(4-[Bis(2-iodethyl)amino]phenoxycarbonyl)-L-glutaminsäure und Salzen davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist, bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung eines Tumors.
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