PT774005E - Expressao em superficie de enzimas em terapia com prodrogas dirigida por genes - Google Patents

Expressao em superficie de enzimas em terapia com prodrogas dirigida por genes Download PDF

Info

Publication number
PT774005E
PT774005E PT95927025T PT95927025T PT774005E PT 774005 E PT774005 E PT 774005E PT 95927025 T PT95927025 T PT 95927025T PT 95927025 T PT95927025 T PT 95927025T PT 774005 E PT774005 E PT 774005E
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
enzyme
cell
cpg2
prodrug
cells
Prior art date
Application number
PT95927025T
Other languages
English (en)
Inventor
Caroline Joy Springer
Richard Marais
Original Assignee
Cancer Res Campaign Tech
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cancer Res Campaign Tech filed Critical Cancer Res Campaign Tech
Publication of PT774005E publication Critical patent/PT774005E/pt

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/4813—Exopeptidases (3.4.11. to 3.4.19)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/66—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells
    • A61K47/665—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells the pre-targeting system, clearing therapy or rescue therapy involving biotin-(strept) avidin systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/66—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells
    • A61K47/67—Enzyme prodrug therapy, e.g. gene directed enzyme drug therapy [GDEPT] or VDEPT
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
    • A61K47/6899—Antibody-Directed Enzyme Prodrug Therapy [ADEPT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)

Description

84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ
DESCRICÃO "Expressão em superfície de enzimas em terapia com prodrogas dirigida por genes"
Introdução e antecedentes do invento. 0 presente invento refere-se a terapia com prodrogas e enzimas dirigida por genes (GDEPT) e sua utilização no tratamento de doenças, incluindo tumores.
Foi proposta uma abordagem terapêutica designada "terapia com prodrogas e enzimas dirigida por vírus" (VDEPT) como método para tratamento de células tumorais em doentes utilizando prodrogas. As células tumorais são alvo de um vector virai transportando um gene que codifica uma enzima capaz de activar uma prodroga. O gene pode ser regulado na transcrição por promotores específicos do tecido ou por sequências estimuladoras. O vector virai entra em células tumorais e expressa a enzima, para que uma prodroga seja convertida numa droga activa dentro das células tumorais (Huber et a!., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1991) 88. 8039). Alternativamente, foram utilizados métodos não virais para a entrega de genes. Tais métodos incluem co-precipitação com fosfato de cálcio, micro-injecção, lipossomas, tomada directa de ADN e transferência de ADN mediada por receptores. Estes são revistos em Morgan & French Anderson, Annu. Rev. Biochem., 1993, 62; 191. O termo "GDEPT" (terapia com prodrogas e enzimas dirigida por genes" é utilizado para incluir tanto os sistemas de distribuição virais como os não virais. O sucesso de um sistema de GDEPT depende de dois factores limitantes. O sistema requer células que precisam de ser alvos do vector para serem infectadas. Se uma célula não for infectada então não será produzida droga activa no seu interior de forma que para ser morta a droga activa precisa de entrar nela através de um efeito de proximidade, tendo sido produzido noutra célula infectada. Nem todas as drogas activas produzidas dentro de uma célula serão capazes de abandonar essa célula para que isto se efectue. Além disso, é um requisito que a prodroga entre na célula. Algumas prodrogas podem não ser capazes de atravessar a membrana de uma célula. 2 84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ
Descricão do invento.
De forma a superar estes problemas, o presente invento proporciona um sistema de dois componentes para utilização em associação um com o outro compreendendo: (a) um vector capaz de expressar uma enzima à superfície de uma célula; e (b) uma prodroga que pode ser convertida numa droga activa pela referida enzima. 0 vector pode ser um vector de ARN ou de ADN. Pode ser derivado de um vector virai, incluindo qualquer vector adequado disponível na arte que tenha como alvo células tumorais. 0 invento proporciona também o sistema do invento para utilização num método de tratamento de um doente. 0 sistema pode ser utilizado num método de tratamento de um tumor num doente a necessitar de tratamento que compreende a administração ao referido doente de uma quantidade eficaz de um vector que codifica uma enzima capaz de ser expressa à superfície de uma célula, e de uma prodroga capaz de ser convertida pela referida enzima numa droga activa. O invento proporciona também um método in vitro de conversão de uma prodroga numa droga activa à superfície de uma célula e um estojo, tal como exposto nas reivindicações em anexo.
Breve Descricão dos Desenhos
Fiaura 1. Expressão de CPG2(superfície) em células NIH3T3. Foram transfectadas células NIH3T3 com MLVppIink (pista 1) ou com MLVCPG2(superfície) (pista 2). As células foram extraídas para tampão A e amostras de cada uma foram sujeitas a electroforese em geles de poliacrilamida a 10% p/v, transferidas para nitrocelulose e sondadas com um anticorpo policlonal específico para CPG2. É mostrada a posição de migração da CPG2(superfície) e as posições de migração dos marcadores de peso molecular 84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 3
padrão (em kDa) à esquerda da figura.
Figura 2. Efeito da tunicamicina na expressão de CPG2(superfície) em células NIH3T3 (A) Análise de imunomarcação. Foram transfectadas células NIH3T3 com MLVCPG2(superfícieF/S) (pistas 1, 3) e com MLVCPG2(superfície) (pistas 2, 4). As células foram incubadas na ausência de tunicamicina (pistas 1, 2) e na presença de tunicamicina (pistas 3, 4). Foram preparados e analisados extractos tal como descrito na Figura 1. A posição de migração de CPG2(superfície) está indicada, tal como o está a posição de migração dos marcadores de peso molecular padrão (em kDa), à esquerda da figura. (B) Ensaio da actividade enzimática da CPG2. Os extractos de enzima das células na parte (A) foram analisados quanto à actividade enzimática da CPG2. Os números das amostras correspondem aos números das pistas da parte (A); a amostra 5 contém tampão de extracção em vez de extracto celular como controlo negativo. A actividade está expressa em valores arbitrários relativos aos controlos de tampão.
Fiaura 3. Efeito de mutações de alicosilacão na CPG2(superfície) expressa (A) análise de imunomarcação. Foram transfectadas células NIH3T3 com MLVCPG2(superfície) (pistas 1, 5); MLVCPG2(superfície)LNN (pistas 2, 6); MLVCPG2(superfície)NLN (pistas 3, 7); MLVCPG2(superfície)NNL (pistas 4, 8) MLVppIink (pistas 9, 10). As amostras são tanto de células de controlo (pistas 1, 2, 3, 4, 9) como de células tratadas com tunicamicina (pistas 5, 6, 7, 8, 10). As amostras foram analisadas tal como na Figura 1. A posição de migração das várias formas de CPG2(superfície) está indicada, bem como a posição de migração dos marcadores de peso molecular padrão (em kDa), à esquerda da figura. (B) ensaio da actividade enzimática da CPG2. Os extractos celulares da parte (A) foram analisados através do ensaio da actividade enzimática da CPG2. Os números das amostras correspondem aos números das pistas da parte (A). A actividade está expressa em valores arbitrários, relativos aos controlos de tampão.
Figura 4. Efeito da mutação de todos os locais potenciais de glicosilacão em CPG2(suDerffcie) (A) análise de imunomarcação de proteínas. Foram transfectadas células NIH3T3 com MLVCPG2(superfície) (pistas 1, 3) e com MLVCPG2(superfície)LNLL (pistas 2, 4). Os extractos são de células de controlo
84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ (pistas 1, 2) ou de células tratadas com tunicamicina (pistas 3, 4). As amostras foram analisadas tal como na Figura 1. A posição de migração das proteínas CPG2(superfície) está indicada, bem como a posição de migração dos marcadores de peso molecular padrão (em kDa), à esquerda das pistas. (B^ ensaio da actividade enzimática de CPG2. Os extractos celulares da parte (A) foram analisados através do ensaio da actividade enzimática de CPG2. Os números das amostras correspondem aos números das pistas da parte (A); adicionalmente, as amostras das células transfectadas com MLVPpIink (amostras 5, 6) tanto de células de controlo (Amostra 5) como de células tratadas com tunicamicina (amostra 6) estão incluídas como controlos negativos. Os resultados estão expressos em valores arbitrários, relativos aos controlos de tampão.
Figura 5. Ensaio de citotoxicidade Foram transfectadas células NIH3T3 com MLVPpIink (amostras 1, 4, 7); MLVCPG2(superfície) (pistas 2, 5, 8) e MLVCPG2(superfície)LNLL (pistas 3, 6, 9). Quarenta e duas horas após a transfecção, as células foram tratadas com o veículo da prodroga durante 24 horas como controlo (pistas 1-3), com prodroga CMDA durante 3 horas (pistas 4-6) e com prodroga CMDA durante 24 horas (pistas 7-9). Após um período de recuperação, as células foram passadas para placas de cultura de tecidos frescas e após 3 dias foi determinada a viabilidade das células medindo a incorporação de [metil-3H]timidina. A quantidade de timidina incorporada é mostrada em termos de dpm para cada amostra.
Fiaura 6 (A) análise de imunomarcação. A figura mostra a expressão constitutiva de CPG2(superfície)LNLL em células NIH3T3. A posição de migração da CPG2(superfície)LNLL está indicada, bem como a posição de migração dos marcadores de peso molecular padrão (em kDa), à esquerda da figura. As pistas 1 e 2 são para as linhas celulares #3 e #16, respectivamente. (B) ensaio da actividade enzimática de β-galactosidase. (C) ensaio da actividade enzimática de CPG2. Em (B) e (C) os extractos celulares de (A) foram analisados. Os resultados para a linha celular #3 de NIH3T3 são dados na barra a branco e para a linha celular #16 na barra a cheio. A actividade está expressa em valores arbitrários, relativos aos controlos de tampão.
Figura 7 Sensibilidade das linhas celulares de NIH3T3 que expressam 84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 5
constitutivamente CPG2(superfície)LNLL ou β-galactosidase à prodroga CMDA.
Fiaura 8 Efeito de proximidade observado com células NIH3T3 que expressam constitutivamente CPG2(superfície)LNLL e com a prodroga CMDA.
Fiaura 9 (A) análise de imunomarcação: expressão transiente de CPG2(superfície) e CPG2(superfície)QQQ em células NIH3T3. A posição de migração de CPG2(superfície) e de CPG2(superfície)QQQ está indicada, bem como a posição de migração dos marcadores de peso molecular padrão (em kDa), à esquerda da figura. (B) ensaio da actividade enzimática de CPG2. Os extractos celulares de (A) foram analisados. Os números das amostras correspondem aos números das pistas de (A). A actividade está expressa em valores arbitrários, relativos aos controlos de tampão.
Fiaura 10 (A) análise de imunomarcação: expressão constitutiva de CPG2(superfície)QQQ em células MDA MB361. A posição de migração de CPG2(superfície)QQQ está indicada, bem como a posição de migração dos marcadores de peso molecular padrão (em kDa), à esquerda da figura. (B) actividade enzimática de β-galactosidase expressa nas linhas celulares M2 e M36 de MDA MB 361. Os extractos celulares de (A) foram analisados. Os números das amostras correspondem aos números das pistas de (A). A actividade está expressa em valores arbitrários, relativos aos controlos de tampão.
Fiaura 11 (A) Sensibilidade das células MDA MB 361 que expressam constitutivamente CPG2(superfície)QQQ ou β-galactosidase à prodroga CMDA. (B) Sensibilidade das células MDA MB 361 que expressam constitutivamente CPG2(superfície)QQQ ou β-galactosidase à prodroga 2.
Fiaura 12 Sensibilidade das células MDA MB 361 que expressam constitutivamente CPG2, à prodroga 2 - ensaio de sulfo-rodamina.
Fiaura 13 Efeito de proximidade observado nas linhas celulares de MDA MB 361 que expressam constitutivamente CPG2(superfície)QQQ com prodroga 2.
84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 6
Descricão detalhada do invento. A. Sistemas de vectores.
Exemplos de sistemas de vectores adequados incluem vectores baseados no vírus Molony da leucemia de murídeo (Ram, Z et aL, Câncer Research (1993) 53: 83-89; Dalton & Treisman, Cell (1992) 68; 597-612). Estes vectores contêm o estimulador do vírus da Leucemia de Murídeo (MLV) clonado a montante num promotor mínimo da β-globina. A região 5' não traduzida da β-globina até ao ATG de iniciação é fornecida para dirigir a tradução eficiente da proteína clonada. O iniciador ATG abre um local de restrição Ncol e assim pode ser utilizado para clonar uma sequência codificadora de uma proteína no vector. Este vector contém ainda um poli-ligante para facilitar a clonagem, seguido pela região 3' não traduzida da β-globina e por locais de poli-adenilação. O estimulador de MLV é de especial interesse uma vez que é um forte estimulador e que é activo na maioria das linhas celulares de murídeo e humanas.
Vectores virais adequados incluem ainda os que são baseados em retrovírus. Tais vectores estão amplamente disponíveis na arte. Huber et al., (ibid) relatam a utilização de retrovírus anfotrópicos para a transformação de células de hepatomas, da mama, do cólon ou da pele. Culver et al. (Science (1992) 256; 1550-1552) descrevem também a utilização de vectores retrovirais em GDEPT. Tais vectores ou vectores derivados de tais vectores também podem ser utilizados. Outros retrovírus também podem ser utilizados para obter vectores adequados para utilização no presente invento. Tais retrovírus incluem o vírus do sarcoma de Rous (RSV). Os promotores de tais vírus podem ser utilizados em vectores de um modo análogo ao acima descrito para MLV.
Englehardt et a! (Nature Genetics (1993) 4; 27-34) descrevem a utilização de vectores baseados em adenovírus na entrega do produto de condutância transmembranar da fibrose quística (CFTR) às células e vectores deste tipo baseados em adenovírus também podem ser utilizados. Os vectores que utilizam o promotor e outras sequências de controlo do adenovírus podem ser úteis na entrega de um sistema de acordo com o invento a células no pulmão e por isso úteis no tratamento de tumores pulmonares. 84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 7
Em geral, ο vector pode ser um qualquer vector de ADN ou ARN utilizado em terapias VDEPT ou GDEPT. B. Enzimas. A enzima pode ser uma enzima qualquer que não seja normalmente expressa na superfície de uma célula, nem libertada para a circulação, em particular de uma célula de mamífero (especialmente humana) e que seja capaz de converter uma prodroga numa droga activa. A enzima pode ser uma enzima de mamífero que não ocorra naturalmente num humano ou uma enzima humana que não esteja normalmente acessível à prodroga. Isto inclui enzimas de outras espécies bem como enzimas de mamíferos que estejam alteradas de modo a que sejam selectivas para a prodroga. Por outras palavras, a alteração significa que a conversão da prodroga numa droga activa pela enzima natural ocorrerá a uma taxa de uma ou mais ordens de grandeza abaixo da taxa a que a enzima alterada opera. As enzimas alteradas podem ser obtidas por técnicas Standard de ADN recombinante, p. ex. clonando a enzima, determinando a sua sequência génica e alterando a sequência génica através de métodos tais como mutagénese dirigida ao local. A enzima converterá normalmente a prodroga numa droga activa removendo um grupo protector da prodroga. Na maioria dos casos, o grupo protector será clivado da prodroga como um todo. No entanto, também é possível que a enzima clive ou simplesmente altere parte do grupo protector, o que resulta num grupo protector parcialmente clivado ou alterado que é instável, resultando na remoção espontânea do resto do grupo. Tais prodrogas são de particular interesse em associação com a enzima nitro-reductase descrita abaixo.
De preferência, a enzima é uma enzima que não de mamífero. Enzimas que não de mamífero adequadas incluem enzimas bacterianas. As enzimas bacterianas incluem carboxipeptidases, tais como a carboxipeptidase G2 (CPG2), tal como divulgado em W088/07378, a γ-glutamil-hidrolase EC3.4.22.12 de Pseudomonas (Levy CC & Goldstein P J. Biol. Chem. 242; p2933 (1967)) e nitro-reductases, tais como uma nitro-reductase de E. coli tal como divulgado em W093/08288. Exemplos de outras enzimas adequadas 84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 8
incluem timidina-quinases (tk), especialmente tk virais tais como a tk de VZV ou de HSV; e a β-lactamase e a β-glucoronidase. Outras enzimas incluem a penicilina V amidase, a penicilina G amidase e a citosina-desaminase.
As enzimas expressas num sistema de vectores do presente invento sofrerão normalmente processamento através do aparelho de Golgi e do retículo endoplasmático até alcançarem a superfície das células. A glicosilação ligada a N ocorre no aparelho de Golgi e no retículo endoplasmático num motivo cuja sequência de aminoácidos primitiva é Asn-Xaa-Ser/Thr (onde Xaa é um aminoácido qualquer); a glicosilação ocorre no resíduo Asn. Nalguns casos, isto pode conduzir a uma redução na actividade da enzima em comparação com a sua forma nativa não glicosilada. É por isso desejável que os vectores do presente invento estejam alterados para a modificarem através de substituição, deleção ou inserção num ou mais locais de glicosilação.
Por exemplo, dentro da sequência de aminoácidos primitiva da CPG2, existem três desses motivos de consenso, localizados nos resíduos Asn 222, Asn 264 e Asn 272. A alteração de um ou mais destes locais é preferida quando a CPG2 é utilizada no presente invento. Desejavelmente, a alteração é uma substituição para leucina ou glutamina.
Em geral, são particularmente preferidas as alterações de enzimas que são substituições de aminoácidos de pelo menos 1 a todos os locais de glicosilação, embora deleções ou inserções de por exemplo 1, 2, 3, 4, 5 ou mais aminoácidos também sejam possíveis. Em qualquer caso, a alteração será tal que a enzima mantenha a sua capacidade para converter uma prodroga numa droga activa substancialmente à mesma taxa que a enzima inalterada, não glicosilada. Neste contexto, "substancialmente inalterada" estará dentro de 1 ordem de grandeza e de preferência de cerca de 2 vezes menos a 2, 5 ou 10 vezes mais.
Para além de alterações específicas a enzima pode de outro modo ser alterada através de truncamento, substituição, deleção ou inserção desde que a actividade da enzima esteja substancialmente inalterada tal como acima definido. Por exemplo, podem ocorrer pequenos truncamentos na sequência do terminal N e/ou C como resultado das manipulações necessárias para produzir 84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 9
'L um vector no qual uma sequência de ácido nucleico codificando a enzima está ligado às várias outras sequências de sinal aqui descritas. A actividade da enzima alterada pode ser medida em sistemas modelo tais como os descritos nos exemplos.
Um exemplo de uma enzima truncada é CPG2' que contém os aminoácidos de 23 a 41 5 de SEQ ID No: 1.
Num outro aspecto do presente invento, é proporcionado um vector compreendendo uma carboxipeptidase bacteriana que foi alterada por substituição, deleção ou inserção num ou mais locais de glicosilação. A carboxipeptidase é desejavelmente CPG2 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 1 excepto quanto às referidas substituições, delecções ou inserções. Variantes de tais carboxipeptidases contendo substituições, delecções ou inserções adicionais mas que mantêm substancialmente inalterada a actividade de carboxipeptidase são uma outra parte deste aspecto do invento. Tais variantes podem por exemplo incluir enzimas truncadas tal como acima discutido. O invento proporciona também um ácido nucleico que pode ser ARN ou ADN codificando tais carboxipeptidases e vectores, incluindo vectores que compreendam um tal ácido nucleico. O ácido nucleico é de preferência o da SEQ ID No: 1 (excepto onde está alterado para eliminar um ou mais locais de glicosilação), ou um fragmento deste codificando as variantes supracitadas da carboxipeptidase. O vector pode ser um vector de expressão, no qual o referido ácido nucleico está operativamente ligado a um promotor compatível com uma célula hospedeira. O invento proporciona assim também uma célula hospedeira que contém um vector de expressão do invento. A célula hospedeira pode ser bacteriana (p. ex. E. coli), de insecto, de levedura ou de mamífero (p. ex. de hamster ou humana).
As células hospedeiras do invento podem ser utilizadas num método de obtenção de uma enzima carboxipeptidase ou de um fragmento desta tal como acima definido que compreende a cultura da célula hospedeira sob condições nas quais a referida enzima ou fragmento desta são expressos e a recuperação da enzima ou do fragmento desta numa forma substancialmente isolada. A
84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 10 enzima ou fragmento desta podem portanto ser expressos como proteínas de fusão. C. Outros componentes do vector·
No sistema de acordo com o invento a enzima pode ser ligada a uma sequência de sinal que dirija a enzima para a superfície de uma célula de mamífero. Esta será normalmente uma sequência de sinal de mamífero ou uma derivada desta que mantenha a capacidade de dirigir a enzima para a superfície da célula. Isto será necessário a menos que a enzima tenha uma sequência de sinal endógena que o faça. Mesmo que uma enzima possua uma tal sequência de sinal, esta pode ser substituída por outra sequência de sinal quando isto for desejável ou apropriado. As sequências de sinal adequadas incluem as encontradas nos receptores transmembranares de tirosina-quinases tais como a sequência de sinal de c-erbB2 (HER2/neu) ou variantes desta que mantenham a capacidade de dirigir a expressão da enzima à superfície da célula. A sequência de sinal de c-erbB2 pode ser obtida por referência a Coussens et a! (1985) Science 230; 1132-1139.
As experiências aqui descritas nos Exemplos podem ser utilizadas para determinar quanto à capacidade de variantes desta, ou de outras sequências de sinal, de expressarem a enzima à superfície da célula. As variantes podem ser produzidas utilizando técnicas Standard conhecidas em biologia molecular, p. ex., mutagénese dirigida ao local de um vector contendo a sequência de sinal.
Outras sequências de sinal adequadas incluem as que podem ser encontradas na revisão de von Heijne (1985) J. Mol. Biol. 184; 99-105. A enzima do sistema de acordo com o invento será expressa à superfície de uma célula. Isto significa que será expressa de forma a obter-se a enzima exposta ao exterior da célula para que possa interagir com a prodroga, mas que estará ainda ligada à membrana plasmática em virtude de uma âncora adequada da membrana plasmática. Uma âncora adequada será uma âncora polipeptídica que seja expressa pelo vector. Por exemplo, a enzima que está ligada a uma sequência que é uma região transmembranar que ancora a enzima na membrana 11 84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ da célula. Uma tal região transmembranar pode ser derivada de quinases de receptores transmembranares, tais como c-erbB2, receptores EGF e receptores CSF-1. A região transmembranar de c-erbB2 é descrita no exemplo abaixo. Também podem ser utilizadas variantes de tais regiões transmembranares desde que mantenham a capacidade de ancorar a enzima na membrana de uma célula, de forma que a porção activa da enzima esteja fora da célula e que à sua superfície outras âncoras p. ex. âncoras de peptidoglicanos sejam âncoras de lípidos e possam também ser possivelmente utilizadas. A âncora tal como a de uma região transmembranar é ligada à estrutura de leitura aberta do gene da enzima através de técnicas de biologia molecular adequadas. Quando a proteína é expressa esta terá a âncora ligada à medida que se produz a proteína de fusão enzima/âncora. A âncora será então firmada na membrana e segurará aí a enzima.
Os vectores que codificam a enzima, juntamente com, quando necessário, uma sequência de sinal e/ou uma região transmembranar podem ser produzidos utilizando técnicas de ADN recombinante conhecidas per se na arte. As sequências que codificam a enzima, a sequência de sinal e as regiões transmembranares podem ser construídas unindo sequências de ácidos nucleicos sintéticos ou recombinantes, ou modificando sequências existentes através de técnicas tais como a mutagénese dirigida ao local. Pode ser feita referência a "Molecular Cloning" de Sambrook et aL (1989, Cold Spring Harbor) para discussão de técnicas Standard de ADN recombinante. D. Promotores A enzima será expressa no vector utilizando um promotor capaz de ser expresso na célula para o qual o vector é dirigido. O promotor estará operativamente ligado às sequências que codificam a enzima e às sequências que lhe estão associadas. Por exemplo, o proto-oncogene c-erbB2 é expresso em tecidos da mama a níveis reduzidos e de um modo restrito ao tecido. Nalguns estados tumorais no entanto a expressão desta proteína é aumentada, devido ao aumento da actividade de transcrição. Exemplos notáveis disto são os tumores de tecidos da mama (cerca de 30% dos tumores), dos ovários (cerca de 20%) e pancreáticos (cerca de 50-75%). Em tais tumores onde a expressão 84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 12
de c-erbB2 é aumentada devido a aumento da transcrição ou da tradução, o promotor de c-erbB2 pode ser utilizado para dirigir a expressão de proteínas de um modo específico para as células.
Com o sistema GDEPT do presente invento utilizando promotores de c-erbB2 para atingir tais tumores, a especificidade de GDEPT é aumentada uma vez que a transfecção de células normais por um vector com um promotor de c-erbB2 proporcionará apenas uma quantidade limitada de níveis de enzima e assim uma activação limitada da prodroga. O promotor de c-erbB-2 foi sequenciado para -1500 e pode ser obtido por referência a Hudson et a!., (1990) J. Biol. Chem. 265: 4389-4393. O principal local de início da transcrição foi determinado por Ishii et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84; 4374-4378 e Tal et al., (1987) Mol. Cell Biol. 7; 2597-2601. Este local de início é referido como + 1 e esta numeração é aqui referida. A tradução de c-erbB-2 inicia-se a + 178. 0 promotor possui uma caixa CAAT a -75 e uma caixa TATA a -25.
Hollywood e Hurst (1993) EMBO J. 12: 2369-2375 relatam que em células de mamífero, as regiões do promotor a -100 e -213 são importantes para a regulação da transcrição. (Ver também Sarker et a!., (1994) J. Biol. Chem. 269; 12285-12289).
Para se obter expressão de um vector utilizando o promotor de c-erbB-2, é desejável utilizar a região do promotor de c-erbB-2 da caixa CAAT e de preferência da caixa TATA a montante, para incluir elementos da sequência responsáveis pela especificidade da expressão em determinados tecidos, tais como os encontrados para as células mamárias por Hollywood e Hurst (ibid). O promotor incluirá assim, desejavelmente, pelo menos todos os nucleótidos a montante (5') da caixa CAAT até cerca do 250°, p. ex., 300°, 400°, 500°, 600°, 700°, 800°, 900° ou um nucleótido mais para 5' do início da transcrição. É também preferível incluir a caixa TATA. Opcionalmente, também podem ser utilizadas as sequências de c-erbB2-2 a jusante da caixa TATA até ao início da tradução a + 1 78.
Embora seja preferida a sequência do promotor de c-erbB2-2 humano, 13 84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ também podem ser utilizadas sequências modificadas do promotor que sejam capazes de hibridar selectivamente com a sequência humana. Uma sequência de um promotor capaz de hibridar selectivamente com a sequência do promotor humano será geralmente pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80 ou 90% e sendo ainda mais preferível pelo menos 95% homóloga à região do promotor ou um fragmento deste, ao longo de uma região de pelo menos 20, de preferência pelo menos 30, por exemplo 40, 60 ou 100 ou mais nucleótidos contíguos.
Em geral, os de vulgar perícia na arte notarão que será necessário manter algumas regiões do promotor tais como as a -213 para assegurar a especificidade tumoral da expressão do vector enquanto que outras regiões do promotor podem ser modificadas ou suprimidas sem perda significativa de especificidade. Assim, são preferidos os promotores modificados que são regulados por transcrição substancialmente no mesmo grau que c-erbB2-2 humano. O grau de regulação de tais promotores candidatos pode ser testado e avaliado pelos peritos na arte utilizando por exemplo ensaios CAT de acordo com os descritos por Hollywood e Hurst (ibid). "Ligado operativamente" refere-se a uma justaposição na qual o promotor e a sequência de codificação da enzima estão numa relação que permite à sequência de codificação ser expressa sob o controlo do promotor. Assim, podem existir elementos tais como a sequência não codificadora 5' entre o promotor e a sequência de codificação que não é nativa nem no promotor nem na sequência de codificação. Tais sequências podem ser incluídas no vector se não prejudiquem o controlo correcto da sequência de codificação pelo promotor.
Outros promotores adequados incluem promotores virais tais como promotores de retrovírus ou de vírus de ADN de mamíferos. Os promotores adequados incluem os utilizados nos vectores acima descritos, p. ex., promotores de MLV, CMV, RSV e de adenovírus. Os promotores de adenovírus preferidos são os promotores dos genes precoces de adenovírus. Podem também ser adequados promotores fortes de mamíferos. Um exemplo de um tal promotor é o promotor de EF-1a que pode ser obtido por referência a Mizushima e Nagata ((1990), Nucl. Acids Res. 18; 5322). Também podem ser utilizadas variantes de tais promotores que retenham actividades de transcrição 84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 14
substancialmente semelhantes.
Os vectores que compreendem o promotor de c-erbB2-2 constituem um aspecto novo adicional do presente invento e podem ser utilizados em sistemas nos quais o vector expressa um gene capaz de converter uma prodroga numa droga activa dentro de uma célula alvo. Assim o invento proporciona um vector virai compreendendo um promotor de c-erbB2-2 ligado operativamente a um gene que codifica uma enzima, sendo a enzima capaz de converter uma prodroga numa droga activa. O invento proporciona também um estojo que compreende um vector tal como acima definido juntamente com uma prodroga que é capaz de ser convertida numa droga activa pela enzima codificada pelo vector. Noutro aspecto, o invento proporciona um vector tal como acima definido ou um estojo tal como acima definido para utilização num método de tratamento do corpo humano ou de um animal e em particular um método de tratamento de tumores nos quais o proto-oncogene c-erbB2-2 é superexpresso. Num outro aspecto, o invento proporciona um método de tratamento de tumores e em particular um método de tratamento de tumores nos quais o proto-oncogene c-erbB2-2 é superexpresso, método que compreende a administração a um indivíduo com um tumor (i) de uma quantidade eficaz de um vector tal como acima definido e (ii) de uma quantidade eficaz de uma prodroga capaz de ser convertida numa droga activa pela enzima codificada pelo vector. E. Prodroqas. A prodroga para utilização no sistema será seleccionada de modo a ser compatível com a enzima, i.e. de forma que a enzima seja capaz de converter a prodroga numa droga activa. Desejavelmente, a toxicidade da prodroga para o doente a ser tratado será pelo menos uma ordem de grandeza inferior do que a droga activa. De preferência, a droga activa será várias ordens de grandeza mais tóxica, p. ex. 2, 3, 4 ou mais ordens de grandeza. As prodrogas adequadas incluem prodrogas mostardas de azoto e outros compostos tais como os descritos em W088/07378, W089/10140, W090/02729, W091/03460, EP-A-540263, W094/02450, W095/02420 ou W095/03830 que são aqui incorporados por referência.
84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 15 E(i) - Prodroaas mostardas de azoto.
As prodrogas mostardas de azoto incluem compostos com a fórmula:
M-Ar-CONH-R onde Ar representa um sistema de anel com o anel aromático opcionalmente substituído, R-NH é o resíduo de um α-aminoácido R-NH2 ou um oligopéptido R-NH2 e contém pelo menos um grupo ácido carboxílico e M representa um grupo mostarda de azoto. O resíduo de aminoácido R-NH2 é de preferência o resíduo do ácido glutâmico. Está divulgado em W088/07378 que a enzima carboxipeptidase G2 é capaz de remover a porção ácido glutâmico dos compostos do tipo acima apresentado e a remoção da porção ácido glutâmico resulta na produção de uma droga mostarda de azoto activa.
Assim as prodrogas mostardas de azoto úteis no invento incluem as prodrogas de fórmula geral I de W094/02450 e sais destas, e em particular os de fórmula (I):
na qual R1 e R2 representa cada um, independentemente, cloro, bromo, iodo, 0S02Me, OS02fenilo (em que fenilo é opcionalmente substituído com 1, 2, 3, 4 ou 5 substituintes independentemente seleccionados de C^alquilo, halogéneo, -CN ou N02); R1a e R2a representam cada um, independentemente, hidrogénio, C^alquilo ou C14haloalquilo; 16 84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ R3 e R4 representam cada um, independentemente, hidrogénio, C^alquilo ou C^haloalquilo; n é um número inteiro de 0 a 4; cada R5 representa independentemente hidrogénio, C14alquilo contendo opcionalmente uma ligação dupla ou uma ligação tripla, C^alcoxi, halogéneo, ciano, -NH2, -CONR7R8 (em que R7 e R8 são independentemente hidrogénio, C^alquilo ou C36cicloalquilo) ou dois grupos R5 adjacentes, juntos, representam a) C4 alquileno possuindo opcionalmente uma ligação dupla; b) C3 alquileno; ou c) -CH = CH-CH = CH-, -CH-CH = CH2- ou -CH2-CH = CH- cada um opcionalmente substituído com 1, 2, 3 ou 4 substituintes, sendo cada um dos referidos substituintes seleccionado independentemente a partir do grupo que consiste em C1.4alquilo, C^alcoxi, halogéneo, ciano e nitro; X é um grupo -C(0>-, -O-C(O)-, -NH-C(O)- ou -CH2-C(0); e Z é um grupo -CH2-T-C(0)-0R6 onde T é CH2, -0-, -S-, -(SO)- ou -(S02)- e R6 é hidrogénio, C.,.6alquilo, C3.6cicloalquilamino, mono-di-C^galquilamino ou mono- ou di-C3.6cicloalquilamino, desde que quando R6 é hidrogénio T seja -CH2-; e derivados fisiologicamente aceitáveis, incluindo sais, dos compostos de fórmula (I). 0 halogéneo inclui flúor, cloro, bromo e iodo. Os valores preferidos para os grupos R1a e R2a são metilo e hidrogénio, especialmente hidrogénio. Os valores preferidos para os grupos R3 e R4 são hidrogénio, metilo e trifluorometilo, especialmente hidrogénio. Os valores preferidos para os grupos R1 e R2 são I, Br, Cl, 0S02Me e OS02fenilo em que fenilo é substituído com um ou mais substituintes nas posições 2 e/ou 4. I, Cl e 0S02Me são especialmente preferidos.
Os valores preferidos para R5 quando n é um número inteiro de 1 a 4 são
84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 17 flúor, cloro, metil-CONH2 e ciano. De preferência, n é 0, 1 ou 2. Quando n é 1 ou 2 é preferível que R5 seja flúor nas posições 3 e/ou 5 do anel. O grupo X é de preferência -C(O)-, -O-C(O)- ou -NH-C(O)-. Z é de preferência um grupo -CH2CH2-COOH.
Os compostos específicos preferidos incluem: ácido N-4-[(2-cloroetil)(2-mesiloxietil)amino]benzoil-L-glutâmico (referido abaixo como "CMDA") e seus sais; ácido N-(4-[bis(2-cloroetil)amino]-3-fluorofenilcarbamoil)-L-glutâmico e seus sais; ácido N-(4-[bis(2-cloroetil)amino]fenilcarbamoil)-L-glutâmico e seus sais; ácido N-(4-[bis(2-cloroetil)amino]fenoxicarbonil)-L-glutâmico e seus sais; e ácido N-(4-[bis(2-iodoetil)amino]fenoxicarbonil)-L-glutâmico (referido abaixo como "prodroga 2") e seus sais.
Podem ser obtidos sub-grupos específicos de interesse dos compostos do presente invento tomando qualquer uma das definições particulares ou genéricas acima mencionadas para R^R4, R5, X ou W, quer individualmente quer em combinação com qualquer outra definição particular ou genérica para R’-R4, R5, X ou W.
Outras prodrogas incluem os compostos de fórmula (II):
Rl R2
N na qual
(II) R1, R2, R5, n e Z são tal como definido para os compostos da fórmula (I) acima; m é um número inteiro de 0 a 4, Z1 e Z2 são cada um, independentemente, -O- ou -NH-; e 18 ^ 18 ^
84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ R9 é hidrogénio, t-butilo ou alilo; e derivados fisiologicamente aceitáveis do composto de fórmula (I). Os valores preferidos de R1, R2, R5, n e Z são tal como acima definido para os compostos de fórmula (I). Os valores preferidos de m são 0, 1 ou 2 tal como acima definido para n. R9 é de preferência hidrogénio, mas pode ser protegido, especialmente durante a síntese, por grupos tais como alilo ou t-butilo.
Estas prodrogas podem ser activadas no local de um tumor por uma enzima carboxipeptidase, por exemplo, a CPG2 tal como divulgado em WO88/07378 ou W094/02450.
As prodrogas mostardas de azoto com a fórmula (III):
O (III) na qual R1, R2, R5, Z1, n e m são tal como definido para os compostos da fórmula (II) e derivados fisiologicamente aceitáveis destes, também podem ser utilizados no presente invento.
Estas prodrogas podem ser activadas no local de um tumor por uma enzima nitro-reductase, por exemplo, tal como divulgado em W093/08288.
Normalmente, para assegurar a actividade da enzima, será necessário um cofactor tal como um ribósido ou um ribótido de ácido nicotínico ou de uma nicotinamida e este pode ser administrado com a prodroga.
Os compostos de fórmulas (II) e (III) podem ser produzidos utilizando reacções e métodos conhecidos per si na arte da química. Os seguintes métodos são de especial utilidade: » 84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 19
A: Compostos de fórmula (II) em que Z1 é -Q-:
Os compostos de fórmula (I) em que Z1 é -O- podem ser produzidos fazendo reagir uma mostarda de azoto de fórmula (IV)
(IV) na qual R\ R2 e R5 e n são tal como acima definido e Z4 é -O-, com um agentel de ligação de fórmula (V)
no qual R5, m, Z2, R9 e Z3 são tal como acima definidos e Q é hidrogénio ou um grupo que se despede. Esta reacção pode ser efectuada em solventes apróticos na presença de uma base, por exemplo DMF e trietilamina. Os grupos que se despedem Q preferidos incluem um grupo succinimidilo, um grupo 4-nitrofenilcarbonato, um pentafluorofenilocarbonato e um grupo tetracloroetilo, CH(CI)CCI3. (ii) Os compostos da fórmula (IV) podem ser produzidos a partir de 4-nitrofenol opcionalmente substituído com o(s) grupo(s) R5ln) (tal como acima definido). 0 grupo fenólico é protegido como derivado de adamantaniloxicarbonilo (fazendo reagir os materiais de partida com fluoroformato de adamantanilo e trietilamina em THF à t.a.). O 4-nitrofenilcarbonato protegido é reduzido na amina correspondente por transferência de hidrogénio em etanol utilizando formato de amónio e Pd/C a 84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 20
10% como catalisador à temperatura ambiente. A amina é então hidroxietilada com óxido de etileno em AcOH a 20°C e depois é feita reagir com a mostarda de azoto desejada. Pode ser feita referência a EP-A-433360 ou a EP-A-490970 para as condições adequadas. Os compostos podem ser purificados através de cromatografia de coluna. A desprotecção para remoção do grupo adamantilo pode ser efectuada em ácido trifluoacético. (iii) Alternativamente, a mostarda de azoto de fórmula (IV) pode ser activada como cloroformato através de tratamento com fosgénio ou trifosgénio num solvente aprótico e trietilamina seguido de acoplamento a um composto de fórmula (VI): ΠΙ4 RS(m
(VI) O OR9 na qual R5, m, Z2, R9 e Z1 são tal como acima definidos. Isto pode ser efectuado em THF ou outro solvente aprótico na presença de uma base (por exemplo trietilamina ou piridina). (iv) Uma via alternativa adicional de síntese dos compostos de fórmula (II) em que Z1 é -O- envolve o acoplamento directo de 4-nitrofenol opcionalmente substituído com o(s) grupo(s) R5(n) (tal como acima definido) com o composto de fórmula (V) ou através da reacção do cloroformato do referido composto 4-nitrofenol opcionalmente substituído com o composto de fórmula (V), seguido em cada caso pela reacção acima descrita para converter o grupo nitro, através de uma amina, num grupo mostarda. B: Compostos de fórmula (II) onde Z1 é -NH-: (i) Os compostos de fórmula (II) nos quais Z1 é -NH- podem ser obtidos através da reacção de um composto de fórmula (IV) em que Z4 é -NH- com um agente de ligação de fórmula (V) em solventes apróticos e na presença de uma 84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 21
base. Os compostos da fórmula (IV) em que Z4 é -NH- podem ser produzidos a partir de um composto 1 -halo-4-nitrobenzilo, opcionalmente substituído com o(s) grupo(s) R5(n) (tal como acima definido). Este é convertido no composto 1-bis-hidroxietilamino-4-nitrobenzilo correspondente através da reacção com dietanolamina com calor e o produto resultante purificado através de cromatografia em coluna. A mostarda de azoto 4-nitro correspondente pode ser produzida através de por exemplo mesilação utilizando cloreto de mesilo em piridina e subsequente reacção noutras halo-mostardas, p. ex.( mostardas de bromo ou de iodo se necessário. O grupo 4-nitro pode ser reduzido através de transferência de hidrogénio em etanol utilizando formato de amónio e um catalisador de Pd/C a 10% a 20° C. (ii) Alternativamente o composto 1 -bis-hidroxietilamino-4-nitrobenzilo acima mencionado pode ser reduzido utilizando formato de amónio e Pd/C a 10% como catalisador em etanol a 20° C para proporcionar o derivado fenilenodiamino correspondente. Este derivado pode ser convertido na mostarda de azoto 4-amino correspondente tal como descrito no parágrafo acima, p. ex. inicialmente pela reacção com cloreto de mesilo. C: Compostos de fórmula (III): (i) Os composto de fórmula (III) podem ser obtidos através do acoplamento dos compostos fenólicos da mostarda de azoto descritos na secção A(i) acima com 4-nitrobenzilocloroformato opcionalmente substituído com o(s) grupo(s) R5lml (tal como acima definido) na presença ou ausência de trietilamina a 20° C. (ii) Alternativamente podem ser utilizadas as mostardas de anilina de azoto tal como descrito na secção B(ii) acima com o cloroformato tal como descrito na secção C(i) acima. D: Compostos de fórmula (V) em aue Z2 é -NH-: (i) Os compostos de fórmula (IV) em que Z2 é -NH- podem ser produzidos a partir de um álcool 4-nitrobenzílico opcionalmente substituído com o(s) grupo(s) R5(n) (tal como acima definido). A função hidroxilo é protegida como um 84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 22
éter piranílico ou t-butil-dimetilsilílico (TBDMSi) através de tratamento a 20°C com 3,4-2H-di-hidropirano e p-toluenossulfonato de piridínio (PPTS) num solvente aprótico ou com cloreto de TBDMSi e imidazolo em dimetilformamida (DMAC), respectivamente. O intermediário assim obtido é reduzido na correspondente amina por transferência de hidrogénio em etanol utilizando formato de amónio e Pd/C a 10% como catalisador a 20°C. Esta amina é convertida num éster de glutamilo intermediário de fórmula (VII): O.
O OR9 (VII) onde R5, m, R9 e Z1 são tal como acima definido, Z2 é -NH- e Pr é o grupo protector éter piranílico ou t-butildimetilsilílico (TBDMSi). Isto pode ser efectuado tratando a amina com trifosgénio e trietilamina em tolueno a 60°C para proporcionar o isocianto correspondente, que é tratado com um derivado de glutamato de fórmula R9-C(0)-CH(NH2)-Z1 onde R9 e Z são tal como acima definido. Alternativamente pode-se fazer reagir o isocianato de glutamilo correspondente obtido a partir do glutamato correspondente através de tratamento com trifosgénio e trietilamina em tolueno a -78° C com a amina num procedimento de vazo único. (ii) 0 composto de fórmula (VII) é desprotegido para remover os grupos TBDMSi ou piranilo através de tratamento com meios moderadamente ácidos (AcOH, THF e H20 ou PPTS, EtOH, 55° C). Isto produz um composto de fórmula (VII) em que Pr é hidrogénio. Os compostos de fórmula (V) em que Q é um grupo que se despede podem ser preparados utilizando reacções padrão conhecidas na arte. (iii) Por exemplo quando Q é um grupo succinimidilo o composto de fórmula (VII) onde Pr é hidrogénio pode ser tratado com carbonato de di-succinimidilo e trietilamina em acetonitrilo. Quando se deseja um grupo 84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 23
4-nitrofenilcarbonato pode ser utilizado tratamento com 4-nitrofenilcloroformato e trietilamina em THF. Pode ser adicionado um carbonato de pentafluorofenilo através de fosgenização in situ de pentafluorofenol seguida de acoplamento ao agente de ligação de fórmula (VII) em que Pr é hidrogénio. E: Compostos de fórmula (V) em aue Z2 é -0-: (i) Os materiais de partida para os agentes de ligação possuindo uma ligação carbâmica são álcoois 4-hidroxibenzílicos não substituídos ou substituídos (com o(s) grupo(s) R5(n) (tal como acima definido)). Este tipo de agentes de ligação pode necessitar de um grupo de remoção de electrões extra no núcleo aromático para sofrer eliminação-1,4. O grupo 4-hidroxi é protegido especificamente como acetato tratando o material de partida com acetil-v-triazolo-[4,5-b]piridina, NaOH 1N em THF a 20° C. A função álcool do acetato é ainda protegida como éter piranílico ou éter TBDMSi através dos procedimentos descritos na secção D acima. A função acetato é então desprotegida para repor o grupo 4-hidroxi em NaHC03 aq. MeOH a 20° C. Os compostos fenólicos resultantes são feitos reagir num procedimento de vaso único com um isocianato de glutamilo protegido tal como descrito na secção D(i) acima. Isto produz um composto de fórmula (VII) tal como acima mostrado em que Z2 é -O- e Pr é o grupo protector éter piranílico ou t-butil-dimetilsilílico (TBDMSi). (ii) A desprotecção deste composto produz um composto de fórmula (VII) em que Pr é hidrogénio. Este pode ser convertido em compostos de fórmula (V) através de métodos análogos aos descritos nas secções D (ii) e (iii) acima. F: Síntese alternativa de compostos de fórmula (IV):
Os compostos de fórmula (IV) em que Q é hidrogénio, flúor, cloro, bromo ou -O-(N-succinimida) também podem ser obtidos por referência a W095/02420 ou W095/03830.
Efii): Outras prodroaas
Outros compostos que podem ser utilizados como prodrogas incluem 84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 24
derivados p-nitrobenziloxicarbonilo de compostos citotóxicos. Tais compostos podem ser utilizados em conjunção com uma enzima nitro-reductase. Crê-se que a enzima nitro-reductase converte o grupo nitro da prodroga num grupo hidroxilamino ou amino do que resulta que a porção nitrobenziloxicarbonilo se torna activada e depois auto-imolante. Isto liberta a prodroga activo. Estes compostos incluem um composto de fórmula:
ou Ο N02
A enzima nitro-reductase de W093/08288 necessita de um cofactor tal como NADH ou NADPH e este pode ser opcionalmente fornecido como componente adicional no sistema do invento.
Exemplos de outros compostos descritos nas referência de cima incluem prodrogas de actinomicina D, doxo-rubicina, daunomicina e mitomicina C. As prodrogas das referências anteriores são convertidas em drogas activas tanto pela nitro-reductase como pela CPG2, embora possam ser modificadas para compreenderem grupos protectores cliváveis por outras enzimas, p. ex. β-lactamase ou glucoronidase.
Outras prodrogas adequadas para utilização no invento incluem as de fórmula geral: FTLi-(PRT)m. ou sais destas onde FTLi é um inibidor ras tal como um composto inibidor de farnesiltransferase e PRT representa m' grupos protectores capazes de serem clivados do inibidor ras pela acção de uma enzima, onde m' é um número inteiro de 1 a 5. Tais compostos são divulgados em W095/03830.
Os FLTi adequados incluem os de fórmula (VIII) ou (IX) 84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 25
(VIII)
(IX) onde R3a e R4a são as cadeias laterais de aminoácidos de ocorrência natural (por exemplo -CH3, -CH3(CH3)2, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2CH3, -CH2OH, -CH2CH2SCH3, -CH(OH)CH3), incluindo as suas formas oxidadas (por exemplo, sulfóxido de metionina ou sulfona de metionina), ou são grupos alifáticos, aromáticos ou heteroaromáticos substituídos ou não substituídos, de preferência ciclohexilo, fenilo, piridilo, imidazolilo ou cadeias saturadas ou insaturadas, ramificadas ou lineares, de 2 a 8 átomos de carbono opcionalmente substituídas com um anel aromático ou heteroaromático; X1a é CH2CH2, CH = CH trans ou CH2NH; e X2a é (CH2)n em que n é 0, 1 ou 2. De preferência R3a e R4a representam ambos CH(CH3)CH2CH3.
Os compostos FLTi adequados incluindo os de fórmulas (VIII) e (IX) podem ser obtidos por referência a W095/03830.
Outras prodrogas adequadas para utilização no sistema do invento incluem as que são derivadas com um derivado de açúcar ou β-lactama. Por exemplo, os agentes de ligação adequados que podem ser ligados a drogas activas do tipo acima descrito são:
84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 26
onde R' é hidrogénio ou acetilo e Y' é arilo tal como fenilo, benzilo ou tolulilo e estes podem ser obtidos de um modo análogo ao de outras prodrogas acima descritas.
Um outro grupo de prodrogas são os compostos de tirfostina de fórmula geral: PTKi-PRTm, onde PTKi é um composto com actividade inibidora de PTK (proteína-tirosina-quinase (PTC)), PRT é um grupo protector capaz de ser clivado do inibidor de PTK pela acção de uma enzima e m' é um número inteiro de 1 a 5.
As PTK adequadas incluem as tirfostinas. As tirfostinas são inibidores de proteína-tirosina-quinase contendo esterilo de baixo peso molecular (p. ex. menos de 2000) que são capazes de se ligarem ao sub-local dos domínios da proteína-tirosina-quinase. As tirfostinas adequadas incluem as descritas por Gazit et a! (Gazit et at., J. Med. Chem. (1989) 32, 2344) e Gazit et aL (J. Med. Chem. (1991) 43; 1896-1907) e especialmente tirfostinas com a fórmula geral:
onde X1 representa carbono, um azoto ou um grupo N O; n é um inteiro de 1 a 3; cada um dos grupos R10, que podem ser iguais ou diferentes, é hidrogénio, hidroxi, mercapto, carboxi, formilo, C^alquilo, C24alcenilo, C^alcoxi, C14alquiltio, carboxiC,.4alquilo, carboxiC2.4alcenilo, C^alquilsulfoxi, halogéneo (i.e. fluoro, cloro, bromo ou iodo), nitro, amino, C14alquilamino ou C^di-alquilamino ou, quando n é 2 ou 3, dois grupos R10 podem formar em conjunto um grupo metilenodioxi ou etilenodioxi; R11 é hidrogénio, hidroxi, 84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ
27 C^alquilo ou, juntamente com a posição 2 do anel ao qual o(s) grupo(s) R10 se liga(m), forma um anel alifático ou heterocíclico de 5 ou 6 membros, contendo o referido anel de 5 ou 6 membros opcionalmente um grupo cetona; e R12é ciano, carboxi, carbamoilo, tricarbamoilo, um grupo C(0)HNCH2CN, um grupo C(NH2) = C(CN)2, um grupo alfa-ceto C(0)R13 onde R13 é 3,4-di-hidroxifenilo ou 2-tiofenilo ou um grupo alfa-amido C(0)NHR14 onde R14 é benzilo, fenilo ou 2,4-dimetoxifenilo; desde que pelo menos um destes grupos R10 e R11 seja mercapto, hidroxi ou amino.
Numa concretização preferida, X1 é C; n é um número inteiro de 1 a 3; cada um dos grupos R10, que podem ser iguais ou diferentes, é hidrogénio, hidroxi, carboxi, formilo, C^alquilo, C2_4alcenilo, C14alcoxi, carboxiC^alquilo, carboxiC24alcenilo, halogéneo (i.e. fluoro, cloro, bromo ou iodo), nitro, amino, C^alquilamino ou C^di-alquilamino, ou quando n é 2 ou 3, dois grupos R10 podem em conjunto formar um grupo metilenodioxi ou etilenodioxi; R11 é hidrogénio, hidroxi ou C^alquilo; e R12 é ciano, carboxi, carbamoilo, tricarbamoilo, um grupo C(0)HNCH2CN, ou um grupo C(NH2) = C(CN)2. De maior preferência, X10 representa carbono, n é um inteiro de 1 a 3; cada um dos grupos R10, que podem ser iguais ou diferentes, é hidrogénio, hidroxi ou amino; R11 é hidrogénio ou hidroxi; e R12 é ciano, um grupo C(0)HNCH2CN, um grupo C(NH2) = C(CN)z um grupo alfa-ceto C(0)R13 onde R13 é 3,4-di-hidroxifenilo ou um grupo alfa-amido C(0)NHR14 onde R14 é benzilo; desde que pelo menos um dos grupos R10, R11 e R12 seja hidroxi ou amino. De preferência, R10é hidroxi ou amino. Quando R11 forma um anel de 5 ou 6 membros com R10 os anéis preferidos incluem anéis heterocíclicos em que o anel contém um átomo de azoto e 4 ou 5 átomos de carbono. O número total de átomos inclui os 2 átomos de carbono do anel aos quais o(s) grupo(s) R10 se liga(m).
As tirfostinas adequadas tais como as de cima podem ser obtidas através dos métodos divulgados em W095/02420, Gazit et al. 1989 e 1991, ibid, que são aqui incorporadas por referência, ou métodos análogos.
As tirfostinas podem ser ligadas a qualquer grupo protector adequado que seja removível por uma enzima. Os grupos protectores adequados PRT podem ser encontrados por referência a W095/03830 ou W095/02420 e podem ter a estrutura:
84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 28 -(Z1-C0.0-CH2-Ph-N02)m. -(Z1-CO.O-CH2-Ph-Z-NH-glu)m. onde Ζ1 é tal como acima definido ou S, m' é um inteiro de 1 a 5, Ph é um anel fenileno opcionalmente substituído com de 1 a 4 grupos R5 (que podem ser iguais ou diferentes) tal como acima definido e glu é um grupo -CHZ-C(0)-0R9 onde Z e R9 são tal como acima definido. O grupo nitro pode estar na posição 2 embora seja desejável na posição 4 do anel relativamente ao anel Ph. E(iii). Derivados.
Os derivados fisiologicamente aceitáveis das prodrogas incluem sais, amidas, ésteres e sais de ésteres. Os ésteres incluem ésteres de ácidos carboxílicos nos quais a porção não carbonilo do agrupamento éster é seleccionada a partir de C^alquilo de cadeia linear ou ramificada (metilo, n-propilo, n-butilo ou t-butilo); ou de C3.6alquilo cíclico (p. ex., ciclo-hexilo). Os sais incluem sais de bases fisiologicamente aceitáveis, p. ex. derivados de uma base apropriada, tais como metais alcalinos (p. ex. sódio), sais de metais alcalino-terrosos (p. ex. magnésio), sais de amónio e de NR4.. (em que R é C^alquilo). Outros sais incluem sais de adição de ácido, incluindo os sais cloridrato e acetato. As amidas incluem derivados não substituídos e monossubstituídos e dissubstituídos. F. Aolicacões do invento O sistema do invento pode ser utilizado num método de tratamento do corpo humano ou de um animal. Tal tratamento inclui um método para tratar o crescimento de células neoplásicas que compreende a administração do sistema do invento a um doente a necessitar de tratamento. É também possível que o invento possa ser utilizado para tratar células que estejam doentes devido a infecção do corpo humano ou do animal por bactérias, vírus ou parasitas. Os promotores virais tardios dependem frequentemente de proteínas virais que são produzidas precocemente na infecção. As proteínas de revestimento virai que são expressas à superfície de uma célula infectada podem ser utilizadas como 84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 29
alvo para introduzir ο gene na célula. Se um promotor virai tardio for então utilizado para dirigir a expressão da enzima do GDEPT, qualquer célula infectada expressará a proteína, e especificamente, as células que estiveram infectadas, durante algum tempo. Isto pode ser suficiente para matar as células infectadas. Para parasitas, pode ser utilizado um promotor do parasita e proteínas de superfície do parasita para dirigir a expressão e infectar respectivamente o parasita.
Para uma bactéria, todos os sistemas de distribuição necessitarão provavelmente de ser alterados para utilizarem vírus bacterianos, embora devesse ser mais fácil definir um promotor específico.
Para a utilização dos vectores em terapia, os vectores serão normalmente empacotados em partículas virais e as partículas entregues no local do tumor, tal como descrito por exemplo em Ram et al. (ibid), As partículas virais podem ser modificadas para incluírem um anticorpo, um fragmento deste (incluindo uma única cadeia) ou um ligando dirigido ao tumor para melhorar o direccionamento ao tumor. Alternativamente os vectores podem ser empacotados em lipossomas. Os lipossomas podem ser dirigidos a um tumor específico. Isto pode ser alcançado ligando um anticorpo dirigido ao tumor ao lipossoma. As partículas virais podem também ser incorporadas em lipossomas. As partículas podem ser entregues no tumor através de qualquer meio adequado à disposição do médico. De preferência, as partículas virais serão capazes de infectar selectivamente as células tumorais. "Infectar selectivamente" significa que as partículas virais infectarão principalmente as células tumorais e que a proporção de células não tumorais infectadas é tal que os danos em células não tumorais pela administração de uma prodroga serão aceitavelmente reduzidos, dada a natureza da doença a ser tratada. Finalmente, isto será determinado pelo médico.
Uma via de administração adequada é através de injecção das partículas numa solução estéril. Embora seja possível administrar as prodrogas sozinhas é preferível apresentá-las como formulações farmacêuticas. As formulações compreendem uma prodroga, juntamente com um ou mais transportadores aceitáveis e opcionalmente outros ingredientes terapêuticos. O transportador ou transportadores têm de ser "aceitáveis" no sentido de serem compatíveis com 30 84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ outros ingredientes da formulação e não deletérios para os seus receptores, por exemplo, lipossomas. Os lipossomas adequados incluem, por exemplo, os que compreendem o lípido N-[1 -(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trietilamónio (DOTMA) carregado positivamente, os que compreendem dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) e os que compreendem 3p[N-(N',N'-dimetilaminoetano)carbamoil]-colesterol (DC-Chol).
Os vírus, por exemplo isolados de linhas celulares de empacotamento também podem ser administrados através de perfusão regional ou de direcção intra-tumoral directa, ou de injecção directa numa cavidade corporal (administração intracaviterial), por exemplo através de injecção intraperitoneal. É também conhecido que as células musculares podem tomar ADN nú e assim os sarcomas podem ser tratados utilizando um sistema vector do invento no qual é injectado directamente no sarcoma ADN nú.
As formulações adequadas para administração parentérica ou intramuscular incluem soluções injectáveis aquosas e não aquosas estéreis que podem conter antioxidantes, tampões, antibióticos bacteriostáticos e bactericidas e solutos que tornem a formulação isotónica com o sangue do receptor pretendido; e suspensões aquosas e não aquosas estéreis que podem incluir agentes de suspensão e agentes de espessamento e lipossomas ou outros sistemas microparticulados que sejam concebidos para direccionar o composto aos componentes do sangue ou a um ou mais órgãos. As formulações podem ser apresentadas em recipientes de dose única ou de doses múltiplas, por exemplo ampolas e frascos selados, e podem ser armazenadas no estado criodessecado (liofilizadas) necessitando apenas da adição de um transportador líquido estéril, por exemplo água para injecções, imediatamente antes da sua utilização. As soluções e suspensões para injecção podem ser preparadas extemporaneamente a partir de pós, grânulos e comprimidos estéreis do tipo previamente descrito.
Deve ser compreendido que adicionalmente aos ingredientes especificamente mencionados acima as formulações podem incluir outros agentes convencionais na arte tendo em conta o tipo de formulação em questão. Das possíveis formulações, as soluções estéreis aquosas e não
84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ aquosas estéreis, isentas de pirogénios, são as preferidas.
As doses podem ser administradas sequencialmente, p. ex. em intervalos diários, semanais ou mensais, ou em resposta a uma necessidade específica do doente. As vias de administração preferidas são a administração oral e a injecção, tipicamente a injecção parentérica ou intramuscular ou a injecção intratumoral.
Ao utilizar o sistema do presente invento a prodroga será tipicamente administrada após a administração do vector que codifica uma enzima. Tipicamente, o vector será administrado ao doente e depois a captação do vector por células transfectadas ou infectadas (no caso de vectores virais) será monitorizada, por exemplo através da recuperação e análise de uma amostra de biópsia do tecido alvo. O regime de dosagem exacto precisa, obviamente, de ser determinado por cada médico para cada doente e isto, por sua vez, será controlado pela natureza exacta da prodroga e do agente citotóxico a ser libertado da prodroga mas pode ser dada alguma orientação geral. A quimioterapia deste tipo envolverá normalmente a administração parentérica da prodroga e do vírus modificado e frequentemente verifica-se que a administração através da via intravenosa é a mais prática. Para o glioblastoma a via é frequentemente intratumoral. Uma gama típica de dosagem de prodroga estará geralmente na gama de cerca de 1 a 150 mg por kg por doente por dia, a qual pode ser administrada em doses únicas ou múltiplas. De preferência a gama de doses estará na gama de cerca de 10 a 75, p. ex. de cerca de 10 a 40 mg por kg por doente por dia. Podem ser utilizadas outras doses de acordo com a condição do doente e de outros factores à descrição do médico.
Os tumores que podem ser tratados utilizando o sistema do presente invento incluem quaisquer tumores susceptíveis de serem tratados, ou a serem tratados, com um sistema GDEPT ou VDEPT e assim não estão limitados a uma qualquer classe específica de tumores. Os tipos de tumores particularmente adequados incluem tumores da mama, colo-rectais e dos ovários, bem como tumores pancreáticos, melanomas, glioblastomas, hepatomas, das células pequenas do pulmão, das células não pequenas do pulmão, dos músculos e da
84 599 32 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ próstata. Ο sistema do invento também pode ser utilizado para tratar doenças infecciosas, por exemplo, e qualquer outra condição que necessite de erradicação de uma população de células.
Compreender-se-á que no que diz respeito ao tratamento de tumores, o tratamento inclui qualquer medida tomada pelo médico para aliviar o efeito do tumor num doente. Assim, embora a remissão completa do tumor seja um objectivo desejável, o tratamento eficaz incluirá também quaisquer medidas capazes de alcançar uma remissão parcial do tumor bem como um abrandamento na taxa de crescimento de um tumor incluindo metástases. Tais medidas podem ser eficazes no prolongamento e/ou aumento da qualidade de vida e alívio dos sintomas da doença.
Os seguintes Exemplos ilustram o invento. EXEMPLO PREPARATIVO 1
Para que fosse expresso CPG2 à superfície de células de mamífero, foi construída uma fusão entre CPG2 e porções de c-erbB2. As porções de c-erbB2 utilizadas foram: 1. A região de codificação do péptido sinal (codões 1-27): 5'> ATG GAG CTG GCG GCC TTG TCC CGC TGG GGG CTC CTC CTC GCC CTC TTG CCC CCC GGA GCC GCG AGC ACC CAA GTG TGC ACC<3'
Esta é idêntica à sequência publicada por Coussens et a/. (1985) Science 230. 1132-1139, à parte de uma mutação silenciosa natural de CGC para CGT que ocorre no codão 8, mas que não altera o aminoácido nesta posição.
2. A região transmembranar (codões 636-686): 5' > GAC CTG GAT GAC AAG GGC TGC CCC GCC GAG CAG AGA GCC AGC CCT CTG ACG TCC ATC GTC TCT GCG GTG GTT GGC ATT CTC
84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ CTG GTC GTG GTC TTG GGG GTG GTC ΤΤΤ GGG ATG CTC ATC AAG CGA CGG CAG CAG AAG ATC CGG AAG TAC ACG < 3'
Esta é idêntica à sequência publicada por Coussens et al. (1985) Science 230. 1132-1139, à parte de uma mutação natural no codão 655, que causa uma substituição conservada de Vai (GTC) para lie (ATC).
Para facilitar a união do péptido de sinal de c-erbB2 a CPG2, foi gerado um fragmento de PCR que continha os codões 1-27 de c-erbB2, com os codões 28 e 29 mutados para os converter num local de restrição pela endonuclease BamH1 (GGATCC). Isto foi conseguido utilizando o iniciador #4478: 5'>GCT TAC AAT TGC TTC TGA CAC<3' em conjunção com o iniciador #4479: 5' > CGC GGA TCC GGT GCA CAC TTG GGT GCT < 3' O fragmento contendo o péptido de sinal foi libertado do fragmento de PCR através de digestão com BamH1 e Ncol (existe um local em c-erbB2 que abre o códão de início ATG - i.e. CCATGG).
Através de uma abordagem semelhante, os codões 21 e 22 de CPG2 foram convertidos num local BamH1. Ao mesmo tempo, foi criado um local EcoRI no codão 416 (o codão natural de terminação) de CPG2. Isto foi realizado utilizando o iniciador de PCR #4476: 5' > CGC GGA TCC GCC CTG GCC CAG AAG CGC <3' em conjunção com o iniciador #4477: 5'>CGC GAA TTC CTT GCC GGC GCC CAG ATC <3'
De modo semelhante, os codões 634 e 635 de c-erbB2 foram convertidos num local EcoRI e os codões 687 e 688 num local Clal. Isto foi conseguido utilizando o iniciador #4480:
84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 5'>CGC GAA TTC GAC CTG GAT GAC AAG GGC<3' em conjunção com o iniciador #4481: 5' > CGC ATC GAT CGT GTA CTT CCG GAT CCT<3' A região transmembranar de c-erbB2 (codões 636-686) foi libertada como fragmento de PCR digerido com EcoR1 e Ciai.
Finalmente, foram utilizados dois adaptadores oligonucleotídicos para criar um local de reconhecimento pelo anticorpo monoclonal 9E10 (ver Evan et al. (1985) Mol Cell Biol 5, 3610-3616) na extremidade 5' da região transmembranar de c-erbB2. Isto foi conseguido utilizando o oligonucleótido #4513: 5>CGA TGA GCA GAA GCT GAT ATC CGA GGA GGA CCT GAA < 3' e o oligonucleótido #4514: 5'>CTA GTT CAG GTC CTC CTC GGA TAT CAG CTT CTG CTC AT <3' juntamente com técnicas Standard de clonagem de ligantes. Os vários fragmentos foram unidos uns aos outros ao longo dos locais de restrição por endonucleases construídos para criar uma quimera que produz uma proteína com a estrutura: c-erbB2 (aminoácidos 1-27): GlySer: CPG2 (aminoácidos 23-415): GluPhe: c-erbB2 (aminoácidos 636-686): IleAsp: epitopo de 9E10 (GluGInLysLeulIeSerGIuGluAspLeu): Asn\
Os aminoácidos extra entre cada porção da fusão são uma consequência dos locais de restrição enzimática construídos. Este gene de fusão é referido como "CPG2(superfície)". Foi criada uma variação deste gene na qual foi introduzida uma mutação de desvio de estrutura de leitura entre o péptido de sinal de c-erbB2 e a porção de CPG2. Isto foi conseguido através da digestão da
84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 35 quimera com BamHI, reparação das extremidades soltas e nova ligação do plasmídeo. Isto produz uma mutação fora da estrutura de leitura, que resulta num gene que não pode expressar CPG2(superfície) e que é referido como "CPG2(superfícieF/S)". CPG2(superfície) e CPG2(superfícieF/S) foram clonados no vector de expressão de mamífero MLVPpIink, que utiliza um vírus LTR de leucemia de murídeo Moloney para dirigir a expressão dos genes em linhas celulares de murídeo (Dalton e Treisman, (1982), Cell 68, 597-612). Estes plasmídeos são referidos como MLVCPG2(superfície) e MLVCPG2(superfícieF/S) respectivamente. EXEMPLO COMPARATIVO 1
Para avaliar a expressão de CPG2(superfície) em células de mamífero, foi transfectada uma placa de células NIH3T3 com MLVCPG2(superfície) e como controlo negativo, uma placa de células com MLVPpIink. As transfecções foram efectuadas com o reagente lipídico de transfecção lipofectAMINE (GibcoBRL). Para a transfecção, foram plaqueadas 1χ105 células em placas de cultura de tecidos de 35 mm e foram incubadas a 37° C de um dia para o outro. No dia seguinte, os complexos lipofectAMINE:ADN foram preparados combinando 0,4 pg de plasmídeo com 6 μΙ de reagente lipofectAMINE num total de 32 μΙ de PBSA; os complexos foram incubados à temperatura ambiente durante 15 minutos. As células foram lavadas duas vezes com 2 ml de meio DMEM isento de soro e colocadas em 0,8 ml de DMEM isento de soro. Os complexos lipofectAMINE:ADN foram diluídos para 0,2 ml de meio isento de soro e adicionados às células. As células foram incubadas com os complexos lipofectAMINE:ADN durante 6 horas a 37° C, lavadas duas vezes com 2 ml de meio DMEM contendo 10% de soro fetal de vitelo (FCS) e colocadas em 2,5 ml de FCS a 10%/DMEM. Após mais um período de incubação de 42 horas, as células foram lavadas duas vezes com 5 ml de PBSA e efectuou-se a extracção nas placas de cultura de tecidos para 50 μΙ de tampão A (Tris.HCI 250 mM, glicerol a 10% v/v, Triton X-100 a 1% v/v, pH 7,5). O extracto foi transferido para tubos de 1,5 ml, centrifugado a 13000 rpm numa microcentrífuga. Os sobrenadantes foram recolhidos e a concentração de proteína foi determinada com o estojo de ensaio de proteínas Bio-Rad, com BSA como padrão.
Para análise de imunomarcação de proteínas, foram combinados 10 μΙ de
( 84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 36 cada extracto com 10 μΙ de tampão de amostra SDS e as proteínas foram separadas num gel de SDS a 10%-poliacrilamida (Laemmli U.K. (1970) Nature 227: 680-685). As proteínas no gel foram transferidas para nitrocelulose através de electroeluição e os extractos celulares foram analisados através de imunomarcação de proteínas (Gershoni J.M. e Palade G.E. (1983) Anal. Biochemistry 131: 1-15), utilizando um anticorpo policlonal de coelho específico para CPG2 que foi criado para CPG2 expressa em células Sf9 de insecto. O anticorpo foi utilizado numa diluição de 1:1000 e os complexos imunitários foram detectados utilizando o estojo de imunomarcação ECL, de acordo com as instruções do fabricante (Amersham).
Estes resultados mostram que nos extractos das células transfectadas com pMLVCPG2(superfície) existe uma proteína reconhecida pelo anticorpo que corre como uma mancha com uma Mr de -50000-60000 (Figura 1, pista 2). Esta proteína não está presente na células transfectadas com MLVppIink (pista 1) e portanto demonstrou-se que CPG2(superfície) é expressa a níveis elevados nestas células.
Os extractos foram testados quanto à actividade enzimática de CPG2 medindo a sua capacidade para clivar a prodroga CMDA em droga (Springer et aL Eur J Câncer (1991) 27; 1361-1366), a qual pode ser detectada medindo a absorvância luminosa a 305 nm. Para o ensaio, foram incubados 5 pg de proteína, extraída de NIH3T3 em tampão A, em 1 ml de tampão de ensaio (Tris.HCI 20 mM, MgCI2 1 mM, ZnCI2 60 μΜ, pH 7,4) contendo 50 μΜ de prodroga CMDA, a 37° C durante 15 min. Após a incubação, foi adicionado EDTA até uma concentração final de 10 mM e a alteração resultante na absorvância a 305 nm foi comparada com a da solução inicial. Uma redução na absorvância indica conversão da prodroga na droga e portanto por inferência demonstra a presença de CPG2. Sob estas condições, não pode ser detectada actividade de CPG2 nos extractos das células transfectadas com MLVppIink ou com MLVCPG2(superfície) indicando que a proteína expressa estava inactiva. EXEMPLO COMPARATIVO 2
Uma vez que é provável que CPG2(superfície) seja processada ao longo do aparelho de Golgi e do retículo endoplasmático para alcançar a superfície das
84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ células (a via tomada por c-erbB2) foi considerado que podia ser potencialmente glicosilada e que isto podia contribuir para a ausência de actividade enzimática. A glicosilação ligada a N ocorre no aparelho de Golgi e no retículo endoplasmático num motivo cuja sequência de aminoácidos primitiva é Asn-Xaa-Ser/Thr (onde Xaa é um aminoácido qualquer); a glicosilação ocorre no resíduo Asn. Dentro da sequência de aminoácidos primitiva de CPG2, existem três destes motivos de consenso, localizados nos resíduos Asn 222, Asn 264 e Asn 272. Para estabelecer se CPG2(superfície) era glicosilada, foram preparados dois conjuntos de células transfectadas. Cada conjunto continha uma placa de células transfectadas com MLVCPG2(superfície) e uma placa transfectada com MLVCPG2(superfície/FS) como controlo negativo. Após a transfecção, o conjunto 1 foi incubado em FCS a 10%/DMEM durante 42 horas. O conjunto 2 foi também incubado em FCS a 10%/DMEM durante 42 horas, mas foi incluída tunicamicina no meio (concentração final de 0,1 mg/ml) durante as últimas 24 horas de incubação. A tunicamicina é um antibiótico nucleosídico que inibe a glicosilação ligada a N. As células foram colhidas em tampão A e sujeitas a análise de imunomarcação de proteínas e a ensaio da actividade enzimática de CPG2 tal como descrito acima.
Os dados de imunomarcação mostram que quando a CPG2(superfície) é produzida em células de mamífero que sejam incubadas na presença de tunicamicina, a sua mobilidade em geles de SDS-poliacrilamida aumenta em comparação com a de células incubadas na ausência de tunicamicina (Figura 2, comparar pistas 2 e 4). Para além disso, a proteína sofre uma gradação, sugestiva da ocorrência de um bloqueio na glicosilação. Parte da proteína parece escapar ao bloqueio, mas é provável que isto represente proteínas que foram sintetizadas antes da tunicamicina ter sido aplicada. As pistas de controlo mostram que a CPG2(superfície) não é produzida nas células transfectadas com MLVCPG2(superfícieF/S) (Figura 2, pistas 1, 3).
Estes extractos proteicos foram analisados quanto à actividade enzimática de CPG2 tal como acima descrito. Os extractos de células transfectadas com MLVCPG2(superfície/FS) não continham qualquer actividade enzimática significativa em células que foram tratadas ou não com tunicamicina (Figura 2B, amostras 1, 3). Os extractos de células transfectadas com MLVCPG2(superfície) e não tratadas com tunicamicina também não continham
84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 38 qualquer actividade de CPG2 (Figura 2B, amostra 2). No entanto o extracto das células transfectadas com MLVCPG2(superfície) e tratadas com tunicamicina continha um nível elevado de actividade de CPG2 que pode ser detectado neste ensaio (Figura 2B, amostra 4).
Estes dados mostram que a CPG2(superfície) expressa em células NIH3T3 é glicosilada e que esta glicosilação inibe a sua actividade enzimática. No entanto, quando a glicosilação é bloqueada, então a enzima é activa. EXEMPLO 1
Para evitar a glicosilação de CPG2(superfície), foi construída uma série de genes mutantes contendo substituições específicas de codões que foram concebidas para desfazer os motivos de glicosilação. Na primeira série, foram criadas mutações individuais que converteram os aminoácidos Asn222, Asn264 ou Asn272 em resíduos de leucina. Estas foram geradas através de PCR, utilizando os iniciadores expostos abaixo. 1) Para Asn222. Iniciador #538: 5'>CCG GCA TGC GAG GCC TTG CCG GTG ATG AGG ACC TGC AC <3'
Este foi utilizado em conjunção com o iniciador #4732: 5' > CGA AGG CCC CGT TCC GCG<3' 2) Para Asn264. Iniciador #539: 5' > CTG CGC TTC CTC TGG ACC ATC<3'
Iniciador #540: 5' > GAT GGT CCA GAG GAA GCG CAG<3'
Estes foram utilizados em conjunção com o iniciador #4733:
84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 39 5 >TGC AGG TCA ACA TCA CCG<3' e iniciador #557: 5'>TTC TTG CCG CCT TCG CCG GC<3' 3) Para Asn272. Iniciador #541: 5'> AAG GCC GGC CTC GTC TCG AAC<3'
Iniciador #542: 5' > GTT CGA GAC GAG GCC GGC CTT<3'
Estes foram utilizados em conjunção com os iniciadores #4733 e 557.
Para Asn222, foi produzido um fragmento de PCR contendo o resíduo mutado num fragmento Smal/Sphl que foi utilizado para substituir as sequências de tipo selvagem. Para os resíduos Asn264 e Asn272, os fragmentos de PCR relevantes foram gerados como fragmentos Sphl/Notl e estes foram utilizados para substituir as sequências de tipo selvagem no gene de CPG2. Todos os três mutantes foram clonados no contexto de MLVCPG2(superfície) e são referidos por MLVCPG2(superfície)LNN para o mutante Asn222Leu; MLVCPG2(superfície)NLN para o mutante Asn264Leu e MLVCPG2(superfície)NNL para o mutante Asn272Leu.
Para testar se os potenciais locais eram glicosilados, foram preparados dois conjuntos de células NIH3T3. Cada conjunto continha uma placa de células transfectadas com MLVCPG2(superfície), uma placa de células transfectadas com MLVCPG2(superfície)LNN, uma placa de células transfectadas com MLVCPG2(superfície)NLN e uma placa de células transfectadas com MLVCPG2(superfície)NNL. O Conjunto 1 foi incubado na ausência de tunicamicina e o Conjunto 2 na presença de tunicamicina tal como acima descrito. Os extractos celulares foram preparados em tampão A e foram efectuadas análise de imunomarcação de proteínas e ensaios de aptividade enzimática de CPG2.
84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 40
Os dados de imunomarcação mostram que cada uma das mutações individuais resulta num aumento na mobilidade de CPG2(superfície) em geles de SDS-poliacrilamida (Figura 3A, pistas 1-4). Na presença de tunicamicina, a mobilidade das proteínas mutantes não glicosiladas é idêntica à de CPG2(superfície) (Figura 3A, pistas 5-8). Estes dados indicam que o aumento de mobilidade observado na ausência de tunicamicina não é devido ao efeito das mutações na mobilidade de CPG2(superfície) em geles de SDS-poliacrilamida e indicam que cada um dos três potenciais locais é glicosilado em células NIH3T3.
Os extractos foram sujeitos a ensaio da actividade enzimática de CPG2 tal como acima descrito. Verificou-se que todas as três proteínas mutantes eram inactivas quando produzidas em células NIH3T3 não tratadas com tunicamicina tal como observado com a proteína não mutada (Figura 3B, pistas 1-4). No entanto, quando produzidas em células NIH3T3 tratadas com tunicamicina, verificou-se que CPG2(superfície), CPG2(superfície)LNN e CPG2(superfície)NNL eram todas activas, enquanto que se verificou que CPG2(superfície)NLN era inactiva (Figura 3B, pistas 5-8).
Tomados em conjunto, estes dados indicam que cada um dos potenciais motivos de glicosilação identificados é glicosilado em células NIH3T3 e que as mutações que desfazem os motivos evitam a glicosilação. A mutação individual dos resíduos Asn222 e Asn272 não tem efeito na actividade enzimática, mas a mutação de Asn264 bloqueia a actividade enzimática.
Foi portanto produzida uma variação da mutação no motivo de glicosilação em Asn264. É possível bloquear a glicosilação através de mutação de Ser/Thr na terceira posição no motivo. Portanto, Thr266 foi mutada numa leucina utilizando o iniciador #766: 5'>TCC AAC TGG GTC ATC GCC AAG<3' e o iniciador #767: 5'>CTT GGC GAT GAC CCA GTT GAA<3' 41 84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ em conjunção com os iniciadores #4733 e #577 e seguindo a mesma estratégia que para as mutações nos resíduos 264 e 272. A mutação Thr266Leu foi clonada no contexto das mutações Asn222Leu e Asn272Leu para produzir um gene triplamente mutado referido como CPG2(superfície)LNLL. Este foi clonado em MLVppIink e é referido como MLVCPG2(superfície)LNLL.
Para testar se esta proteína era glicosilada e se era activa foram preparados dois conjuntos de células NIH3T3, cada um contendo uma placa de células transfectadas com MLVCPG2(superfície) e uma placa de células transfectadas com MLVCPG2(superfície)LNLL. O Conjunto 1 foi incubado na ausência de tunicamicina e o Conjunto 2 na presença de tunicamicina tal como descrito. Os extractos celulares foram preparados em tampão A e foram sujeitos a análise de imunomarcação de proteínas e a ensaio da actividade enzimática. A análise de imunomarcação mostra que CPG2(superfície)LNLL migra como uma banda estreita em geles de SDS-poliacrilamida com uma Mr aparente de «47000; esta é consideravelmente menor que a de CPG2(superfície) (Figura 4A, pistas 1,2). Quando CPG2(superfície)LNLL é produzida em células incubadas com tunicamicina, não há alteração na sua massa molecular aparente (pistas 2, 4). Para além disso, CPG2(superfície)LNLL co-migra com a forma migrante mais rápida (e portanto presumivelmente não glicosilada) de CPG2(superfície) produzida em células NIH3T3 tratadas com tunicamicina (Figura 4B, pistas 2, 3). A actividade enzimática destes extractos foi examinada. Ao contrário de CPG2(superfície), verificou-se que a CPG2(superfície)LNLL era activa em extractos tomados a partir de células que não foram tratadas com tunicamicina (Figura 4B, amostras 1, 2). A CPG2 de células que foram tratadas com tunicamicina não afecta esta actividade, em contraste com CPG2(superfície) de células tratadas com tunicamicina (comparar as amostras 1, 3 com 2, 4).
Estes dados indicam que as mutações de todos os três motivos de glicosilação em CPG2(superfície) inibem completamente a sua glicosilação em células NIH3T3. A mutação Asn222Leu bloqueou a glicosilação desse resíduo e foi permissiva quanto à actividade enzimática. A mutação Asn264Leu bloqueou a glicosilação desse resíduo mas também inibiu a actividade enzimática. A mutação Thr266Leu bloqueou a glicosilação no resíduo Asn264 e foi permissiva
84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 42 quanto à actividade. A mutação Asn272Leu bloqueou a glicosilação nesse resíduo e foi permissiva quanto à actividade. O triplo mutante Asn222Leu, Thr266Leu, Asn272Leu não foi glicosilado e era activo. EXEMPLO 2 A capacidade de CPG2(superfície) para matar células NIH3T3 na presença da prodroga CMDA foi examinada. Foram preparados três conjuntos de células NIH3T3, cada contendo uma placa de células transfectadas com MLVppIink, uma placa de células transfectadas com MLVCPG2(superfície) ou uma placa de células transfectadas com MLVCPG2(superfície)LNLL. As células foram incubadas durante 42 horas após a transfecção e depois o conjunto 1 foi incubado na presença do veículo da prodroga (Hepes 5 mM, DMSO a 0,5% v/v, pH 7,0; concentrações finais) durante 24 horas. O conjunto 2 foi incubado na presença da prodroga CMDA (concentração final de 0,5 mM) durante 3 horas. O conjunto 3 foi incubado em CMDA (0,5 mM) durante 24 horas. Após o tratamento com prodroga, as células foram lavadas três vezes com 5 ml de FCS a 10%/DMEM e os conjuntos 1 e 3 foram incubados em meio fresco durante mais 24 horas, o conjunto 2 durante 45 horas. As células foram então passadas para placas de cultura frescas, semeadas a 1x105 células/placa de 35 mm em 2 ml de FCS/DMEM. Após mais 72 h de incubação o crescimento celular foi avaliado através de incorporação de [3H]-timidina.
Para a incorporação de timidina adicionou-se 1 pCi de [metil-3H]timidina a cada poço (2 ml de meio) e incubou-se durante 5 horas a 37° C. As células foram lavadas duas vezes com PBSA (4o C) e fixadas com ácido tricloroacético a 5% p/v (TCA) em água a 4o C durante 20 minutos. O TCA foi removido e as células lavadas duas vezes com 2 ml de metanol e secas ao ar. O ADN foi extraído com 1 ml de NaOH 0,1 M, SDS a 1% à temperatura ambiente durante 5 minutos, adicionaram-se 4 ml de fluído de cintilações e a timidina incorporada foi determinada através de contagem de cintilações.
As células que foram transfectadas quer com MLVCPG2(superfície) quer com MLVCPG2(superfície)LNLL cresceram à mesma taxa que as células transfectadas com MLVppIink, indicando que a expressão de CPG2(superfície) ou de CPG2(superfície)LNLL à superfície de células de mamífero não afecta as
84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 43 taxas de crescimento das células (Figura 5, amostras 1-3). O tratamento com prodroga das células de controlo teve um efeito mínimo na sua taxa de crescimento (Figura 5, amostras 1, 4, 7). Em contraste, o tratamento com prodroga das células que expressavam CPG2(superfície) e CPG2(superfície)LNLL teve um efeito marcado no seu crescimento. As células que expressavam CPG2(superfície) não foram afectadas por um tratamento com prodroga de 3 horas, mas houve uma inibição de -87% do crescimento celular após um tratamento com prodroga de 24 horas (Figura 5, amostras 2, 5, 8). As que expressavam CPG2(superfície)LNLL foram ainda mais sensíveis ao tratamento com prodroga, apresentando uma redução de *20% no crescimento celular após um tratamento com prodroga de 3 horas e morte celular completa após um tratamento com prodroga de 24 horas.
Estes dados mostram que quando as células NIH3T3 que expressam CPG2(superfície) são tratadas com prodroga CMDA, o crescimento celular pode ser evitado. O bloqueio da glicosilação de CPG2(superfície) aumentou a actividade enzimática e resultou num potencial de morte celular grandemente aumentado do sistema enzima-prodroga.
I EXEMPLO PREPARATIVO 2 1. Construção do vector
Foi construído uma cassete de expressão através da fusão do fragmento Hindlll/EcoRI de 1,2 kb do plasmídeo pEF-Bos (Mizishuma e Nasgata (1990) NAR 18, 5322), que contém o promotor EFIa, o primeiro exão, o primeiro intrão e uma porção do segundo exão, com o gene da β-globina na posição -4 relativamente ao início de transcrição do gene da β-globina. O fragmento Nco-1/Hindlll do plasmídeo MLN^Plink, contendo o agente de poli-ligação e a região 3' não traduzida da β-globina foi fundido ao local Nco-1 do gene da β-globina, que se localiza do outro lado do início de tradução da β-globina (posição +50, relativamente ao início da transcrição), para proporcionar um poliligante e uma região 3' não traduzida para o processamento apropriado do ARNm.
Todo esta cassete era para ser clonado no vector pMCINeo Poli A 44 84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ (Stratagene). pMCINeo Poli A foi primeiro modificado para destruir o local Ncol localizado no gene NeoR e para remover os locais BamHi, Hincll e Sall localizados na extremidade 3' do gene NeoR. A cassete de expressão EF1a foi clonado como fragmento Hindlll (reparado nas extremidades) no local Xhol (reparado nas extremidades) no plasmídeo pMCINeo Poli A modificado. Foi escolhido um vector com o promotor EF1a e o promotor de TK (que dirige a expressão do gene NeoR) em sentidos opostos, para a expressão de CPG2(superfície)LNLL; o vector é referido como pMCEF-Plink. CPG2(superfície)LNLL foi clonado a partir de pMLVCPG2(superfície) como fragmento Ncol/Xbal nos locais Nco1/Xba1 de pMCEF-Plink; este plasmídeo é referido como pMCEFCPG2(superfície)LNLL. Como plasmideo .de controlo, o gene lacZ também foi clonado nos locais Ncol/Xbal de pMCEF-Plink como fragmento Ncol/Xba do plasmídeo MLVBIacZ; este é referido como pMCEFIacZ. 2. Preparação de linhas celulares estáveis
Foram preparadas linhas celulares estáveis com células NIH3T3 para expressarem constitutivamente CPG2(superfície)LNLL, ou como controlo o produto do gene lacZ (β-galactosidase). Para realizar isto, foram transfectadas células NIH3T3 com pMCEF-CPG2(superfície)LNLL ou pMCEFIacZ tal como descrito no Exemplo Comparativo 1 acima e dois dias após a transfecção, as células foram plaqueadas a baixa densidade em meio contendo G418 a 1 mg/ml. Podiam-se observar colónias provenientes de células únicas cerca de duas semanas depois e estas foram clonadas e cultivadas individualmente. A expressão de CPG2(superfície) foi determinada através de imunomarcação de proteínas de 30 ml de extracto celular (extraído tal como descrito no Exemplo Comparativo acima) de cada uma das colónias resistentes a G418 com o anti-soro do Exemplo Comparativo 1 acima. A linha celular #16 que expressa níveis elevados de CPG2(superfície)LNLL (Figura 6A) e a linha celular #3, que expressa a β-galactosidase (ver abaixo) foram seleccionadas para porterior investigação. A expressão de CPG2(superfície)LNLL e de β-galactosidase foi verificada nas linhas celulares, através de ensaio enzimático. Para estes ensaios, foram plaqueadas 1x105 células das linhas #3 e #16 em placas de cultura de tecidos de 35 mm e incubadas durante 4 dias. Foram preparados extractos celulares (ver acima) e 5 pg de proteína foram sujeitos a um ensaio de degradação de CMDA e um ensaio da β-galactosidase (o ensaio de CMDA é
84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 45 descrito no Exemplo Comparativo acima). Para o ensaio da actividade da β-galactosidase nas células, foram adicionados 5 pg de proteína extraída a 600 μΙ de tampão de ensaio (Na2P04 40 mM, NaH2P04 26,7 mM, KCI 6,7 mM, MgS04 1 mM, 2-mercaptoetanol 25 mM, Tris.HCI 50 mM, Triton X-100 a 0,06% v/v, o-nitrofenil β-D-galactopiranósido 2,2 mM) e incubou-se a 37°C durante 60 min. Foram adicionados 250 μΙ de Na2C03 1 M à amostra e foi medida a DO420. Os resultados nas Figuras 6B e 6C mostram que os extractos da linha #3 (barras a cheio) continham níveis elevados de actividade de β-galactosidase mas nenhuma actividade de CPG2. O extracto da linha #16 não continha qualquer actividade detectável de β-galactosidase, mas continha níveis detectáveis de actividade de CPG2. EXEMPLO 3
As linhas celulares #3 e #16 obtidas no Exemplo Preparativo 2 foram testadas quanto à citotoxicidade com a prodroga CMDA. Foram plaqueadas 1χ105 células em cada um dos poços de placas de 24 poços, incubadas durante 40 horas e depois tratadas com concentrações crescentes de CMDA a 37° C durante 60 minutos. Após mais uma incubação de 6 horas, 10% das células foram novamente plaqueadas para placas de 24 poços, incubadas durante mais 5 dias e a sobrevivência celular foi determinada através de incorporação de [3H]-timidina. Os resultados na Figura 7 mostram que a linha celular #3 (símbolos a cheio) não é sensível nem aos mais elevados níveis de concentração de CMDA testados, enquanto que #16 (símbolos a branco) é sensível de um modo dependente da dose, mostrando uma Cl50 de - 125 μΜ. EXEMPLO 4 O efeito de proximidade foi determinado misturando as linhas celulares #3 e #16 obtidas no Exemplo Preparativo 2 numa variedade de concentrações tal como indicado e plaqueando um total de 1 χ 105 células por poço em placas de 24 poços. As células foram incubadas e tratadas tal como descrito no Exemplo 3, excepto que foram tratadas com CMDA 250 μΜ ou 1000 μΜ durante 60 minutos tal como indicado. A sobrevivência celular foi determinada tal como no Exemplo 3. Estes resultados na Figura 8 mostram que, com estas condições, existe um efeito marginal de proximidade, uma vez que com apenas
84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 46 40% das células a expressarem CPG2(superfície)LNLL, mais de 80% das células foram mortas na presença da prodroga. EXEMPLO PREPARATIVO 3
Neste exemplo foram preparadas outras mutações dos locais de glicosilação que permitiriam maior actividade de CPG2(superfície). Para este fim, foi testada a viabilidade de fazer mutações conservadas de asparigina para glutamina nos codões 222, 264 e 272, os locais que se mostrou serem glicosilados. lsto: foi conseguido através de mutagénese dirigida por PCR, utilizando os iniciadores de PCR:
Para o codão 222: #1171: 5'>GTG CAG GTC CAA ATC ACC GGA<3' e #1172: 5'>GCC GGT GAT TTG GAC CTG CAC<3\
Para o codão 264: #926: 5' > CTG CGC TTC CAA TGG ACC ATC<3' e #927: 5'>GAT GGT CCA TTG GAA GCG CAG<3'.
Para o codão 272: #1173: 5' > AAG GCC GGC CAA GTC TCG AAC < 3' e #1174: 5'>GTT CGA GAC TTG GCC GGC CTT<3'.
Isto foi realizado utilizando o protocolo experimental descrito no Exemplo 1. A CPG2{superffcie) contendo as mutações nos codões N222/264/272Q é referida como CPG2(superfície)QQQ e foi clonada em MLVpPIink como fragmento Ncol/Xba; este plasmídeo é designado pMLVCPG2(superffcie)QQQ. Para testar a actividade enzimática de CPG2(superfície)QQQ, foram transfectadas células NIH3T3 com pMLVCPG2(superfície) ou pMLVCPG2(superfície)QQQ e foram preparados extractos celulares; estes
84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ extractos foram examinados através de imunomarcação de proteínas e quanto à actividade enzimática de CPG2 tal como descrito no Exemplo Comparativo. As imunomarcações de proteínas mostram que a proteína CPG2(superfície)QQQ (Fig. 9A, pista 2) ao contrário da proteína CPG2(superfície) (Fig 9A, pista 1) migra com uma mobilidade consistente com o facto da proteína não ser glicosilada. Dos dados do ensaio de actividade, pode-se observar que para quantidades de actividade semelhantes, a proteína CPG2(superfície)QQQ (barra a cheio, Fig 9B) contém níveis -50 vezes superiores de actividade de clivagem de CPG2 que a proteína CPG2(superfície) (barra a branco, Fig 9B).
Preparação de linhas celulares estáveis de MDA261B
Uma vez que CPG2(superfície)QQQ é mais activa que CPG2(superfície) foram preparadas linhas celulares MDA261B que expressassem constitutivamente CPG2(superfície)QQQ, ou como controlo, β-galactosidase. Foi clonada CPG2(superfície)QQQ em pMCEF-Plink como fragmento Ncol/Xba; este plasmídeo é designado pMCEFCPG2(superfície)QQQ. As células MDA316B foram transfectadas com pMCEFCPG2(superfície)QQQ, ou com pMCEFIacZ de acordo com o protocolo descrito no Exemplo Comparativo e foram tratadas tal como as células NIH3T3 para gerarem colónias G418. As colónias resistentes a G418 foram testadas quanto à expressão de CPG2(superfície)QQQ através de análise de imunomarcação de proteínas, tal como descrito para as células NIH3T3. Desta análise, foram seleccionadas duas linhas celulares, M2 que expressa β-galactosidase e M38, que expressa CPG2(superfície)QQQ para mais testes. A análise de imunomarcação verifica que M38 expressa CPG2(superfície)QQQ (Fig 10A, pista 2), enquanto que M2 não (Fig 10A, pista 1). A expressão de β-galactosidase pela linha M2 foi confirmada através de ensaio enzimático (Fig 10B, a pista 1 contém extracto de M2, a pista 2 contém um extracto de controlo). EXEMPLO 5
Estas linhas celulares foram testadas quanto à sensibilidade à prodroga CMDA e prodroga 2. Foram plaqueadas 1χΊO5 células em cada um dos poços de uma placa de 24 poços. As células foram incubadas durante 48 horas a 37°C. Foram depois incubadas em concentrações crescentes de CMDA ou de
84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ prodroga 2 durante 60 minutos a 37° C, lavadas duas vezes, recolocadas em meio e incubadas por mais 5 dias. A viabilidade das células foi então determinada utilizando incorporação de [3Hj-timidina. Os resultados mostram que a linha celular que expressa CPG2(superfície)QQQ (linha M38, Fig 11A e 11 B, símbolos a branco) foi mais sensível a ambas as prodrogas que a linha que expressa β-galactosidase (linha M2, Fig 11A e 11 B, símbolos a cheio).
Para a prodroga CMDA, não foi possível avaliar quanto mais sensível M38 era em relação a M2 uma vez que e M2 não mostrou qualquer sensibilidade à prodroga, mesmo na maior concentração testada. No entanto, com a prodroga 2, a diferença foi substancial, sendo as células M38 na ordem de 200 vezes mais sensíveis à prodroga que as células M2. EXEMPLO 6 A prodroga 2 foi também ensaiada (Fig 12) nas células MDA MB361 transfectadas obtidas no Exemplo Preparativo 3 utilizando um ensaio de citotoxicidade de sulfo-rodamina B que foi realizado plaqueando 5000 células por poço numa placa de microtítulo de 96 poços. As células foram plaqueadas em 1 60 μΙ de meio DMEM. Após incubação de um dia para o outro a droga ou os controlos apropriados foram adicionados aos poços, em DMEM contendo soro, a 5% de soro num volume de 40 μΙ. As células foram incubadas durante 4 dias sob condições padrão. Após isto o meio foi removido e as células tratadas com TCA (ácido tricloroacético) a 10% arrefecido em gelo sobre gelo durante cerca de 30 minutos. O TCA foi removido a as células enxaguadas para adição de 18 μΙ de sulfo-rodamina B (SRB) a 0,4% que foi deixado durante 10 minutos para corar as células. Após a coloração as células foram enxaguadas em TCA e secas ao ar antes da adição de 18 μΙ de TRIS 10 mM e depois foi lida a viabilidade celular. Foi utilizada Cisplatina (CDDP) como controlo para assegurar que cada linha era igualmente susceptível (i.e. para verificar que a linha celular que expressa CPG2 não se tinha tornado mais sensível a agentes de morte celular). Não se verificou qualquer diferença entre a susceptibilidade a CDDP para a linha que expressava CPG2 em comparação com a linha I2C-Z de controlo (ver Fig 1 2).
84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 49 EXEMPLO 7
Para examinar ο efeito de proximidade com as células MDA MB 361 que expressam constitutivamente CPG2(superfície)QQQ, foi plaqueada a linha celular M38, a linha celular M2, ou uma mistura de 1:10 de células M38:M2 (1χ104 células) nos poços de uma placa de 24 poços e incubou-se durante 48 horas. As células foram então tratadas com concentrações variáveis de prodroga 2 durante 60 min, lavadas duas vezes com meio fresco e incubadas em meio fresco durante 5 dias. A sobrevivência das células foi então determinada através de incorporação de [3H-metil]timidina. Os resultados mostram que a linha celular M38 (Cl50 »1 μΜ) é «200 vezes mais sensível à prodroga que a linha celular M2 (Cl50 «200 μΜ). No entanto, quando estas duas linhas celulares estão misturadas numa razão de 1:10, a Cl50 é reduzida «10 vezes («20 μΜ), apesar do facto de apenas 10% destas células estarem a expressar CPG2(superfície)QQQ, demonstrando um efeito substancial de proximidade.
84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 50
INFORMAÇÃO SOBRE A SEQUÊNCIA SEQ ID No. 1: Sequência do ADN genómico e da proteína CPG2 ATCATQGATC CACGCaCIGA AGGOGOGCQG CMGACGOGC GGQGTGGOGA OGdGlGCAT 60 GQGCGGGGGC GAAGGCACCG CSCTGGCACr CGAAITGCEA TAAGAACCAX GGCIGQQGAC 120 gcocgacaac aggcgiocac crccrrmT cktoocgaca acccgaaoga acaatgcgdv íeo GAGCAGGAGA ΤΓΧ AEG OSC CCA TOC ATC CAC CGC ACA GOC MC GCC GCC 230
Met Arg Pro Ser Ue His Arg Thr Ala Ile Ala Ala 15 10 GIG CTC GOC AOC GOC TTC CTG GCG GGC ACC GCC CXG GOC CSG AAG OGC 278
Vai Leu Ala Thr Ala íhe Vai Ala Gly Thr Ala Leu Ala Gin lys Arg 15 20 25 GAC AAC GTC CTC TTC CAG GCA GCT AOC GAC GAG CAG COG GCC GTC AIC 326
Asp Asn Vai leu lhe Gin Ala Ala Thr Asp Glu Gin Pro Ala Vai He 30 35 40 AAG ACG CTC GAG AAG CTC QIC AAC ATC GAG ACC GGC ACC GGT GAC GOC 374
Lys Thr Leu Glu lys Leu vai Asn Ile Glu Thr Gly Thr Gly Asp Ala 45 50 55 60 GAG GGC ATC GCC GCT GOG GGC AAC TTC CTC GAG GCC GAG CTC AAG AAC 422
Glu Gly Ile Ala Ala Ala Gly Asn Rie Leu Glu Ala Glu Leu lys Asn 65 70 75 CTC GGC TTC AOS GTC AGG OGA AGC AAG TCG GOC GGC CTG GIG GIG GGC 470 leu Gly Fhe Thr Vai Thr Arg Ser Lys Ser Ala Gly Leu Vai Vai Gly 80 85 90 GAC AAC ATC GIG GGC AAG ATC AAG GGC CGC GGC GGC AAG AAC CTC CIG 518
Asp Asn Ile Vai Gly lys Ile lys Gly Arg Gly Gly lys Asn Leu Leu 95 100 105 CIG ATO TCG CAC AIG GAC ACC GTC TRC CTC AAG GGC ATT CTC GOG AAG 566 leu Met ser His Met Asp Thr vai lyr Leu lys Gly Ile Leu Ala lys 110 115 120 GOC COG TTC OGC GTC GAA GGC GAC AAG GCC TAC GGC CCG GGC ATC GOC 614
Ala Pro lhe Azg Vai Glu Gly Asp lys Ala lyr Gly Pro Gly Ile Ala 125 130 135 140 GAC GAC AAG GGC GGC AAC GOG CTC ATC CIG CAC AOG CTC AAG CIG CIG 662
Asp Asp lys Gly Gly Asn Ala Vai He leu His Thr Leu lys Leu Leu 145 150 155 AAG GAA TAC GGC GTG CGC GAC TAC GGC ACC ATC ACC GIG CTG TTC AAC lys Glu Tyr Gly Vai Arg Asp Tyr Gly Thr He Thr Vai Leu lhe Asn 160 165 170 710
84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 51 ACC GAC GAG GAA AAG GGT TCC TTC GGC TOG G3C GAC CIG ATC CAG GAA Thr Asp Glu Glu Lys Gly Ser ftve Gly Ser Arg Asp leu Ue Gin Glu 175 180 185 GAA GCC AAG CIG GOC GAC TAC GIG CIC TCC TTC GAG GGC AOC AGC GCA Glu Ala Lys leu Ala Asp Tyr Vai Leu Ser Phe Glu Fn Thr Ser Ala 190 195 200 GGC GAC GAA AAA CIC 7CG CIG GGC ACC TCG GGC ATC GCC TAC GIG CAG Gly Asp Glu lys Leu Ser leu Gly Thr Ser Gly Ile Ala Tyr Vai Gin 205 210 215 220 GIC AAC ATC ACC GGC AAG GCC TOS CAT GCC GGC GOC GCG CTC GAG CTC Vai Asn Ile Thr Gly lys Ala Ser His Ala Gly Ala Ala Pro Glu Leu 225 230 235 GGC GIG AAC GOS CZG GIC GAG GCT TCC GAC CTC GIG CIG CGC AOS ATO Gly Vai Asn Ala Leu Vai Glu Ala Ser Asp Leu Vai leu Arg Thr Met 240 245 250 AAC ATC GAC GAC AAG GGS AAG AAC CTG CGC TTC AAC TQG ACC ATC GCC Asn ile Asp Asp lys Ala lys Asn Leu Arg Ibe Asn Trp Thr ile Ala 255 260 265 AAG GCC GGC AAC GFC TGG AAC ATC ATC CGC G0C AGC GCC ACG CIG AAC lys Ala Gly Asn Vai Ser Asn He Ile Pro Ala Ser Ala Thr leu Asn 270 275 280 GCC GAC GTG OSC TAC GOS CGC AAC GAG GAC TTC GAC GCC GCC AIG AAG Ala Asp Vai Arg Tyr Ala Arg Asn Glu Asp R» Asp Ala Ala Met lys 285 290 295 300 ACG CIG GAA GAG GGC GGS CAG CAG AAG AAG CIG GCC GAG GCC GAC GIG Thr leu Glu Glu Arg Ala Gin Gin lys lys Leu Pro Glu Ala Asp Vai 305 310 315 AAG GIG ATC GIC ACG CISC GGC OSC CCS GCC TTC AAT GCC GGC GAA GGC lys Vai Ile Vai Thr Arg Gly Arg Pro Ala Pte Asn Ala Gly Glu Gly 320 325 330 GGC AAG AAG CIG CTC GAC AAG GOS GIG GCC TAC TAC AAG GAA GCC GGC Gly lys lys Leu Vai Asp Lys Ala Vai Ala Tyr Tyr lys Glu Ala Gly 335 340 345 GGC ACG CIG GGC GIG GAA GAG OGC AOC GGC GGC GGC ACC GAC GQG GGC Gly Thr Leu Gly Vai Glu Glu Arg Thr Gly Gly Gly Thr Asp Ala Ala 350 355 360 TAC GCC GOG CTC TCA GGC AAG OCA GIG ATC GAG AGC CTG GGC CTG OQG Tyr Ala Ala leu Ser Gly Lys Pro vai Ile Glu Ser Leu Gly Leu Pro 365 370 375 380 GGC TZC GGC TAC CAC AGC GAC AAG GCC GAG TAC GIG GAC ATC AGC GCG Gly Phe Gly Tyr His Ser Asp lys Ala Glu Tyr Vai Asp Ile Ser Ala 385 390 395
758 806 854 902 950 998 1046 1094 1142 1190 1238 1286 1334 1382 52 84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ ΑΓΓ CCG CGC CGC CTC TAC ATC GCT GCG CGC CT3 ATC ATC GAT CIG OGC 1430 lie Ρτο Arg Arg Leu lyr Met Ala Ala Arg Leu He Met Asp Leu Gly 400 405 410 GOC GGC AAG T GAA1GCIG0C OOOOSacm TCACTOSOST TOCIC3ICTA 1480
Ala Gly Lys 415 ACICCAOOOC OOGAGGGGGA GGCGCGGICC GCCITGQQGC QnCCCGGCGG OSACOSOCir 1540 GTCACA1AGA A5GAACIGCC AIGTTCTIGA CfiGCAGAO^ OSAASOCaTC 03CGACGQ3G 1600 TCQGCGACIT CIO3CAASCC GAACTCIGGC CCAACGCasC GftftTOQQSftC CGCSA3CACA 1660 GCmCOCAA GAGCCCAOCA GGOCTO3GC IGGQ3IAQGC ACICIGOCTG OGCGftGGAGC 1720 A1GGCQGCGC Q3GQCTCGAC TACCTCACCT OGCGCIQGIG CIGGMGftGA IHVmXGG 1780 CGAQ3G03GC ACCA3CAOCG CCKDCAGCGT GACCAACIGC OOOSICAAOS CCATCCTCAT 1840 GCGdAOGGC AACGCGCA3C AGAAGAAGCA CTGGCTCMG CGGCIGGQSC AGGGOOGGAX 1900
GdCGGOGGC TTCIGCCXGA CCGAGOOGCA GGCCGGCftGC GATCCATOGiA GCOGOGCAC 1960 CACEGCGCGC AAGGAOGGOG ACGGCTAOGT GATCGACGGC GIGAA3CAGT TCRICACCAG 2020 CGGCAASAAC GGCCAGGIGG CQGGATCC 2048
Lisboa, 28. Klft- 2000
Por CÂNCER RESEARCH CAMPAIGN TECHNOLOGY LIMITED - O AGENTE OFICIAL -

Claims (16)

  1. 84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Sistema de dois componentes para utilização em associação um com o outro compreendendo: (a) um vector capaz de expressar uma enzima à superfície de uma célula; e (b) uma prodroga que pode ser convertida numa droga activa pela referida enzima.
  2. 2. Sistema de acordo com a reivindicação 1, no qual a enzima é uma carboxipeptidase bacteriana.
  3. 3. Sistema de acordo com a reivindicação 2, no qual a carboxipeptidase é a CPG2.
  4. 4. Sistema de acordo com a reivindicação 3, no qual a CPG2 foi alterada num ou mais locais de glicosilação da sequência Asn-Xaa-Ser ou Asn-Xaa-Thr, onde Xaa é um aminoácido qualquer.
  5. 5. Sistema de acordo com a reivindicação 4, no qual um ou mais dos resíduos Asn 222, Asn 264 e Asn 272 da CPG2 foram substituídos.
  6. 6. Sistema de acordo com a reivindicação 4 ou 5, no qual os resíduos Asn 222 e 272 foram alterados para glutamina e o resíduo 266 alterado para leucina.
  7. 7. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, no qual a prodroga é uma prodroga mostarda de azoto.
  8. 8. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, no qual o vector compreende uma sequência codificando um péptido de sinal de uma quinase de receptor transmembranar.
  9. 9. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, no qual o vector compreende um promotor capaz de ser expresso de um modo restrito a um tecido. 84 599 ΕΡ Ο 774 005/ΡΤ 2/2
  10. 10. Sistema de acordo com a reivindicação 9, no qual o promotor é um promotor de c-erbB2.
  11. 11. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores para utilização num método de tratamento de terapia do corpo humano ou de um animal.
  12. 12. Método in vitro de conversão de uma prodroga numa droga activa à superfície de uma célula, o qual compreende a introdução na referida célula de um vector capaz de expressar uma enzima à superfície da célula e a exposição da referida célula a uma prodroga que pode ser convertida numa droga activa pela referida enzima à superfície da célula, para assim matar a referida célula ou inibir o seu crescimento.
  13. 13. Método de acordo com a reivindicação 12, no qual a referida enzima é tal como definida em qualquer uma das reivindicações 2 a 6, a referida prodroga é tal como definido na reivindicação 7, ou o referido vector é tal como definido na reivindicação 8, 9 ou 10.
  14. 14. Método de acordo com a reivindicação 12 ou 13, no qual a referida célula é uma célula tumoral.
  15. 15. Estojo compreendendo: (a) um vector capaz de expressar uma enzima à superfície de uma célula; e (b) uma prodroga que pode ser convertida numa droga activa pela referida enzima.
  16. 16. Estojo de acordo com a reivindicação 15, no qual a referida enzima é tal como definida em qualquer umas das reivindicações 2 a 6, a referida prodroga é tal como definido na reivindicação 7, ou o referido vector é tal como definido na reivindicação 8, 9, ou 10. Lisboa, 28. ííAii. 23'jv) Por CÂNCER RESEARCH CAMPAIGN TECHNOLOGY LIMITED - O AGENTE OFICIAL -
    ANTÓNIO JOÃO CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. Ruo das Flores, 74 - 4.‘ 1200 LISBOA
PT95927025T 1994-07-27 1995-07-27 Expressao em superficie de enzimas em terapia com prodrogas dirigida por genes PT774005E (pt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB9415167A GB9415167D0 (en) 1994-07-27 1994-07-27 Improvements relating to cancer therapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PT774005E true PT774005E (pt) 2000-06-30

Family

ID=10758973

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT95927025T PT774005E (pt) 1994-07-27 1995-07-27 Expressao em superficie de enzimas em terapia com prodrogas dirigida por genes

Country Status (15)

Country Link
US (2) US6025340A (pt)
EP (3) EP0772455B1 (pt)
JP (3) JPH10505335A (pt)
AT (3) ATE308999T1 (pt)
AU (2) AU693584B2 (pt)
CA (2) CA2196052A1 (pt)
DE (3) DE69535916D1 (pt)
DK (1) DK0774005T3 (pt)
ES (1) ES2143641T3 (pt)
GB (1) GB9415167D0 (pt)
GR (1) GR3032744T3 (pt)
NZ (2) NZ290449A (pt)
PT (1) PT774005E (pt)
WO (2) WO1996003151A2 (pt)
ZA (2) ZA956264B (pt)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE37736E1 (en) 1992-05-05 2002-06-11 Automotive Technologies International Inc. Vehicle occupant position and velocity sensor
GB9709421D0 (en) 1997-05-10 1997-07-02 Zeneca Ltd Chemical compounds
CA2211293A1 (en) * 1997-07-23 1999-01-23 Immunova Ltee Recombinant lysostaphin analogs
EP1240922B1 (en) * 1997-08-08 2008-11-12 Celmed Oncology (USA), Inc. Methods and compositions for overcoming resistance to biologic and chemotherapy
ATE413881T1 (de) 1997-08-08 2008-11-15 Celmed Oncology Usa Inc Verfahren und zubereitungen um resistenz gegen biologische oder chemische therapien zu überwinden
US7462605B2 (en) 1998-01-23 2008-12-09 Celmed Oncology (Usa), Inc. Phosphoramidate compounds and methods of use
EP1167972B1 (en) * 1998-01-23 2017-03-08 Kiadis Pharma Intellectual Property B.V. Enzyme catalyzed therapeutic agents
US6410328B1 (en) 1998-02-03 2002-06-25 Protiva Biotherapeutics Inc. Sensitizing cells to compounds using lipid-mediated gene and compound delivery
EP1053023B2 (en) 1998-02-03 2011-03-30 Protiva Biotherapeutics Inc. Systemic delivery of serum stable plasmid lipid particles for cancer therapy
AU3266899A (en) * 1998-03-06 1999-09-20 Oxford Biomedica (Uk) Limited Enhanced prodrug activation
GB9907414D0 (en) 1999-03-31 1999-05-26 Cancer Res Campaign Tech Improvements relating to prodrugs
EP1173225A2 (de) * 1999-04-30 2002-01-23 Karsten Brand Mittel zur gentherapie und zur prävention von metastasen bzw. zur gentherapie von tumoren
GB9910077D0 (en) 1999-05-01 1999-06-30 Univ Manchester Chemical compounds
DE19928342A1 (de) * 1999-06-21 2000-12-28 Deutsches Krebsforsch Vektoren zur gentherapeutischen Tumorbehandlung
US6656917B1 (en) * 1999-06-30 2003-12-02 Marker Gene Technologies, Inc. Compositions and methods for targeted enzymatic release of cell regulatory compounds
CN1391486A (zh) * 1999-07-22 2003-01-15 新生物公司 治疗对治疗有抗性的肿瘤的方法
US6683061B1 (en) 1999-07-22 2004-01-27 Newbiotics, Inc. Enzyme catalyzed therapeutic activation
GB0011060D0 (en) * 2000-05-08 2000-06-28 Cancer Res Campaign Tech Improvements relating to gene directed enzyme prodrug therapy
US6656718B2 (en) 2000-07-07 2003-12-02 Cancer Research Technology Limited Modified carboxypeptidase enzymes and their use
CA2441350A1 (en) 2001-01-19 2002-07-25 Newbiotics, Inc. Methods to treat autoimmune and inflammatory conditions
GB0102239D0 (en) 2001-01-29 2001-03-14 Cancer Res Ventures Ltd Methods of chemical synthisis
DK1537146T3 (da) 2002-07-15 2011-04-04 Univ Texas Antistoffer, der binder til anioniske phospholipider og aminophospholipider, og deres anvendelse til behandling af virusinfektioner
GB0220319D0 (en) 2002-09-02 2002-10-09 Cancer Res Campaign Tech Enzyme activated self-immolative nitrogen mustard drugs
US20050107320A1 (en) * 2003-01-30 2005-05-19 Matthew During Methods and compositions for use in interventional pharmacogenomics
GB0517957D0 (en) 2005-09-03 2005-10-12 Morvus Technology Ltd Method of combating infection
GB0526552D0 (en) 2005-12-29 2006-02-08 Morvus Technology Ltd New use
GB2442202A (en) 2006-09-30 2008-04-02 Morvus Technology Ltd Vermin poison
EP2614837A1 (en) 2007-11-09 2013-07-17 Affitech Research AS Anti-VEGF antibody compositions and methods
ES2385251B1 (es) 2009-05-06 2013-05-06 Fundació Privada Institut D'investigació Biomèdica De Bellvitge Adenovirus oncolíticos para el tratamiento del cáncer.
GB201310917D0 (en) * 2013-06-19 2013-07-31 Cancer Res Inst Royal Vaccinia virus for gene-directed enzyme prodrug therapy

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308483D0 (en) * 1983-03-28 1983-05-05 Health Lab Service Board Secretion of gene products
US4935352A (en) * 1985-10-21 1990-06-19 Takeda Chemical Industries, Ltd. Expression vector for animal cell line and use thereof
GB8705477D0 (en) 1987-03-09 1987-04-15 Carlton Med Prod Drug delivery systems
US4975278A (en) * 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
GB8809616D0 (en) 1988-04-22 1988-05-25 Cancer Res Campaign Tech Further improvements relating to drug delivery systems
GB8820850D0 (en) 1988-09-05 1988-10-05 Cancer Res Campaign Tech Improvements relating to pro-drugs
EP0387380A1 (en) 1989-03-17 1990-09-19 BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft Mutants of urinary plasminogen activator, their production and use
US5665543A (en) * 1989-07-18 1997-09-09 Oncogene Science, Inc. Method of discovering chemicals capable of functioning as gene expression modulators
GB8919607D0 (en) * 1989-08-30 1989-10-11 Wellcome Found Novel entities for cancer therapy
GB8920011D0 (en) 1989-09-05 1989-10-18 Mann J New route of synthesis for tertiary butyl esters
US5223408A (en) * 1991-07-11 1993-06-29 Genentech, Inc. Method for making variant secreted proteins with altered properties
EP0638123B1 (en) 1991-10-23 2006-12-27 Cancer Research Technology Limited Bacterial nitroreductase for the reduction of cb 1954 and analogues thereof to a cytotoxic form
GB9314960D0 (en) * 1992-07-23 1993-09-01 Zeneca Ltd Chemical compounds
DE69434969T2 (de) 1993-07-15 2008-01-10 Cancer Research Campaign Technology Ltd. Verbindungen die zur herstellung von protein-tyrosin-kinase-inhibitor-prodrogen verwendet werden können
GB9315494D0 (en) 1993-07-27 1993-09-08 Springer Caroline Improvements relating to prodrugs
GB9423367D0 (en) * 1994-11-18 1995-01-11 Wellcome Found Enzyme prodrug therapy

Also Published As

Publication number Publication date
JP2006042821A (ja) 2006-02-16
US6004550A (en) 1999-12-21
WO1996003151A3 (en) 1996-05-02
WO1996003515A2 (en) 1996-02-08
AU3119195A (en) 1996-02-22
GR3032744T3 (en) 2000-06-30
CA2196051A1 (en) 1996-02-08
ZA956264B (en) 1996-03-15
DE69534599D1 (en) 2005-12-15
DE69535916D1 (de) 2009-04-02
EP0774005B1 (en) 1999-12-29
NZ290448A (en) 1998-01-26
EP0774005A1 (en) 1997-05-21
NZ290449A (en) 1998-08-26
JPH10505335A (ja) 1998-05-26
ATE423208T1 (de) 2009-03-15
GB9415167D0 (en) 1994-09-14
EP0919622A3 (en) 1999-10-06
JPH10503646A (ja) 1998-04-07
DK0774005T3 (da) 2000-05-22
ATE308999T1 (de) 2005-11-15
AU712383B2 (en) 1999-11-04
US6025340A (en) 2000-02-15
ZA956263B (en) 1996-05-22
ES2143641T3 (es) 2000-05-16
DE69514234D1 (de) 2000-02-03
EP0772455A2 (en) 1997-05-14
DE69534599T2 (de) 2006-07-20
WO1996003151A2 (en) 1996-02-08
ATE188256T1 (de) 2000-01-15
CA2196052A1 (en) 1996-02-08
AU3119095A (en) 1996-02-22
JP3747290B2 (ja) 2006-02-22
WO1996003515A3 (en) 1996-03-07
EP0919622A2 (en) 1999-06-02
AU693584B2 (en) 1998-07-02
DE69514234T2 (de) 2000-07-13
EP0919622B1 (en) 2009-02-18
EP0772455B1 (en) 2005-11-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PT774005E (pt) Expressao em superficie de enzimas em terapia com prodrogas dirigida por genes
Gürlevik et al. Administration of gemcitabine after pancreatic tumor resection in mice induces an antitumor immune response mediated by natural killer cells
Marais et al. Gene-directed enzyme prodrug therapy with a mustard prodrug/carboxypeptidase G2 combination
ES2274549T3 (es) Compuestos para la inhibicion de la angiogenesis por terapia de genes .
US20140350087A9 (en) Oncovector Nucleic Acid Molecules and Methods of Use
ES2609685T7 (es) Purina nucleósido fosforilasa como activador enzimático de profármacos de nucleósidos
ES2237754T3 (es) Mejoras relacionadas con la terapia del cancer.
PT1135513E (pt) Terapia génica mediada por adenovírus
EP0876160B1 (en) Ligand directed enzyme prodrug therapy
JP2004500097A (ja) Ｔｃｆ応答性エレメント
JPH09505557A (ja) ヒト腫瘍細胞の遺伝子形質転換によるヒト腫瘍の治療
ES2957688T3 (es) Construcción génica suicida doble e inducible y su uso en terapia génica
ES2741523T3 (es) Dirección del virus del herpes simple a receptores específicos
US6524571B1 (en) Methioninase gene therapy for tumor treatment
ES2288756T3 (es) Expresion de ciclina g1 en tumores.
JP2003507337A (ja) チロシンキナーゼｒａｆおよびｒａｓを用いて脈管形成を調節するために有用な方法および組成物
US6221848B1 (en) Protection of the esophagus from chemotherapeutic or irradiation damage by gene therapy
ES2239475T3 (es) Nuevo uso medico del gen y el vector que codifican para una desoxirribonucleosidasa multisustrato.
NZ522753A (en) Bacterial carboxypeptidase CPG2 variants and their use in gene directed enzyme prodrug therapy
US6887856B1 (en) Protection from ionizing irradiation or chemotherapeutic drug damage by in vivo gene therapy
ES2222577T3 (es) Supresion de la malignidad utilizando la ribonucleotido reductasa r1.
US6852755B1 (en) Nitrogen mustard compounds and prodrugs therefor
Carroll et al. Gene therapy for liver tumors
JP2002515231A (ja) シトシンデアミナーゼ遺伝子