ES2274549T3 - Compuestos para la inhibicion de la angiogenesis por terapia de genes . - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A PROCEDIMIENTOS DE TERAPIA GENETICA PARA INHIBIR LA ANGIOGENESIS ASOCIADA CON EL CRECIMIENTO DE TUMORES SOLIDOS, LA METASTASIS TUMORAL, LA INFLAMACION, LA PSORIASIS, LA ARTRITIS REUMATOIDE, LOS HEMANGIOMAS, LA RETINOPATIA DIABETICA, LOS ANGIOFIBROMAS, Y LA DEGENERACION MACULAR. SE PRESENTA UNA METODOLOGIA DE TERAPIA GENETICA PARA INHIBIR EL CRECIMIENTO TUMORAL PRIMARIO Y LA METASTASIS MEDIANTE TRANSFERENCIA GENETICA DE UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDO QUE CODIFICA UNA FORMA SOLUBLE DEL RECEPTOR DE LA QUINASA DE LA TIROSINA VEGF A UN ANFITRION MAMIFERO. LA SECUENCIA DE NUCLEOTIDO TRANSFERIDA TRANSCRIBE UN ARNM Y UNA PROTEINA RECEPTORA SOLUBLE QUE SE UNE CON UN VEGF EN REGIONES EXTRACELULARES ADYACENTES AL TUMOR PRIMARIO Y A LAS CELULAS ENDOTELIALES MUSCULARES. LA FORMACION DE UN COMPLEJO SVEGFR/VEGF EVITARA LA UNION DEL VEGF CON LOS RECEPTORES DE LA QUINASA DE TIROSINA KDR Y FLT-1, ANTAGONIZANDO LA TRANSDUCCION DE LAS SEÑALES INTRACELULARES NORMALES ASOCIADAS CON LA ANGIOGENESIS TUMORAL INDUCIDA POR LAS CELULAS ENDOTELIALES VASCULARES. ADEMAS, LA EXPRESION DE UNA QUINASA DE TIROSINA DE RECEPTOR SOLUBLE TAMBIEN PUEDE IMPARTIR UN EFECTO TERAPEUTICO UNIENDOSE BIEN CON O BEN SIN VEGFS PARA FORMAR HETERODIMEROS NO FUNCIONALES CON LOS RECEPTORES DE LA QUINASA DE TIROSINA DE LONGITUD COMPLETA ESPECIFICOS PARA EL VEGF Y, POR CONSIGUIENTE, INHIBIRA LAS ACTIVIDADES MITOGENICAS Y ANGIOGENICAS DEL VEGF.
Description
Compuestos para la inhibición de la angiogénesis
por terapia de genes.
La presente invención se refiere a compuestos
útiles en la fabricación de un medicamento para uso en terapia de
genes para la inhibición de la angiogénesis asociada con el
crecimiento de tumores, inflamación, psoriasis, artritis reumatoide,
hemangiomas, retinopatía diabética, angiofibromas, y degeneración
macular.
Igualmente, esta invención se refiere a modelos
animales útiles en la investigación de la inhibición de la
angiogénesis mediada por terapia de genes. Además, la invención se
refiere a vectores recombinantes que son útiles en los
procedimientos de terapia de genes descritos.
Las células endotelilaes vasculares forman una
monocapa no trombogénica luminal a lo largo del sistema vascular.
Los mitógenos promueven el desarrollo, crecimiento, reparación y
angiogénesis vascular embriónica en estas células. La angiogénesis
implica la degradación proteolítica de la membrana basal sobre la
cual residen las células endoteliales, seguido de la subsiguiente
migración quimiotáctica y mitosis de estas células para soportar el
crecimiento sostenido de un nuevo brote capilar. Una clase de
mitógenos selectivos para células endoteliales vasculares incluyen
el factor de crecimiento endoletial vascular (denominado como VEGF o
VEGF-A) y los homólogos del factor de crecimiento de
la placenta (PIGF), VEGF-B y
VEGF-C.
El VEGF humano existe en forma de un homodímero
glucosilado en una de las cinco formas procesadas maduras que
contienen 206, 189, 165, 145 y 121 aminoácidos, siendo la más
prevalente la forma de 165 aminoácidos.
La Patente de EE.UU. No. 5.240.848, describe el
nucleótido y la secuencia aminoácida que codifica la forma de 189
aminoácidos del VEGF humano.
La Patente de EE.UU. No. 5.332.671, describe el
nucleótido y la secuencia aminoácida que codifica la forma de 165
aminoácidos del VEGF humano.
Charnock-Jones, y otros,
(Biol. Reproduction, vol. 48, págs.
1120-1128, (1993)), describe el mRNA variante de
corte y empalme del VEGF145.
La Patente de EE.UU. No. 5.194.596, describe el
nucleótido y la secuencia aminoácida que codifica la forma de 121
aminoácidos del VEGF humano.
Las formas de 206 aminoácidos y de 189
aminoácidos del VEGF humano contienen, cada una de ellas, un inserto
de 24 aminoácidos altamente básico que promueve la estrecha unión a
heparina, y presumiblemente, a proteoglucanos de heparina sobre
superficies celulares y dentro de matrices extracelulares (Ferrara,
y otros, J. Cell. Biochem., vol. 47, págs.
211-218, (1991)). La forma VEGF165 se une a la
heparina en un menor grado, en tanto que la VEGF122 no se une a la
heparina.
Igualmente, el PlGF es un homodímero glucosilado
que comparte un 46% de homología con el VEGF a nivel de proteína. El
corte y empalme diferencial del mRNA del PlGF humano conduce o bien
a un precusor de 170 aminoácidos o bien a uno de 149 aminoácidos,
los cuales son proteolíticamente procesados a formas maduras de 152
ó 131 aminoácidos de longitud, respectivamente (Maglione, y otros,
Oncogene, vol. 8, págs. 925-931, (1993);
Hauser y Weich, Growth Factors, vol. 9, págs.
259-268, (1993)).
El VEGF-B ha sido recientemente
aislado y caracterizado (Olofsson, y otros, Proc. Natl. Acad.
Sci., vol. 93, págs. 2576-2581, (1996);
Grimmond, y otros, Genome Research, vol. 6, págs.
124-131, (1996)). Los cDNAs humanos de longitud
total codifican precursores de 188 y 207 aminoácidos, en los que las
porciones terminales NH_{2} son proteolíticamente procesadas a
formas maduras de 167 y 186 aminoácidos de longitud. La expresión
del VEGF-B humano se ha encontrado predominantemente
en el corazón y músculo esquelético en forma de un homodímero ligado
a un disulfuro. Sin embargo, el VEGF-B humano
puede, igualmente, formar un heterodímero con el VEGF (id. @
2580).
El VEGF-C ha sido, igualmente,
recientemente aislado y caracterizado (Joukov, y otros, EMBO
J., vol. 15, págs. 290-298, (1996)). Se obtuvo
un cDNA que codifica el VEGF-C a partir de una línea
de células de adenocarcinoma prostático humano. Se procesó
proteolíticamente una proteína precursora de 32 kDa para generar la
forma de 23 kDa madura, la cual se une al receptor tirosina quinasa,
Flt-4.
El VEGF-D se identificó en una
biblioteca EST, se clonó la región que codifica la longitud total y
se reconoció como que era la más homóloga al VEGF-C
entre las secuencias aminoácidas de la familia VEGF (Yamada, y
otros, Genomics, vol. 42, págs. 483-488,
(1997)). Se ha mostrado que el mRNA del VEGF-D
humano está expresado en el pulmón y músculo.
El VEGF y sus homólogos imparten actividad
mediante unión a receptores tirosina quinasa de ligamiento a la
membrana de plasma de célula endotelial vascular, los cuales, a
continuación, activan la transducción de la señal y las señales
celulares. La familia del receptor Flt es un receptor tirosina
quinasa principal que se une al VEGF con alta afinidad. Actualmente,
la familia del receptor flt incluye el flt-1
(Shibuya, y otros, Oncogene, vol. 5, págs.
519-524, (1990)), KDR/flk-1 (Terman,
y otros, Oncogene, vol. 6, págs. 1677-1683,
(1991); Terman, y otros, Biochem. Biophys. Res. Commun.,
vol. 187, págs. 1579-1586, (1992)), y
flt-4 (Pajusola, y otros, Cancer Res., vol.
52, págs. 5738-5843, (1992)).
La implicación del VEGF en la promoción de la
angiogénesis del tumor ha producido estudios de investigación de
posibles antagonistas del proceso. Tanto anticuerpos policlonales
(Kondo, y otros, Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 194,
págs. 1234-1241, (1993)) como monoclonales (Kim, y
otros, Growth Factors, vol. 7, págs. 53-64,
(1992); Kim, y otros, Nature, vol. 362, págs.
841-844, (1993)) generados contra el VEGF se ha
mostrado que que suprimen la actividad del VEGF in vivo. Las
estrategias de anticuerpos anti-VEGF para impedir la
angiogénesis y su tumor acompañante han sido igualmente tratadas
por Kim y otros (Nature, vol. 362, págs.
841-844, (1993)) y Asano y otros (Cancer
Research, vol. 55, págs. 5296-5301, (1995)).
Kendall y Thomas (Proc. Natl. Acad. Sci.,
vol. 90, págs. 10705-10709, (1993)), han aislado y
caracterizado un cDNA que codifica una forma soluble secretada de
flt-1 a partir de células endoteliales de vena
umbilical humana cultivada (HUVEC). La versión recombinante de esta
proteína se purificó mediante unión a heparina inmovilizada. Se
mostró que el flt-1 soluble aislado inhibía la
actividad del VEGF in vitro. No se describe ninguna
sugerencia con respecto a protocolos de transferencia de genes.
Millauer y otros (Nature, vol. 367, págs.
576-579, (1994)), describe la inhibición in
vivo de la angiogénesis de tumor mediante la expresión de un
mutante flk-1 generado artificialmente, en el cual
se ha eliminado el dominio quinasa intracelular pero no el anclaje
de ligamiento de la membrana. Los autores no adelantan ninguna
doctrina ni sugerencia de que un forma soluble de un receptor
tirosina quinasa del VEGF sería útil en aplicaciones de terapia de
genes.
La neovascularización de tumores malignos es un
proceso integral que contribuye al crecimiento de tumor sólido y la
progresión neoplástica (Kondo y otros, Biochemical &
Biophysical Research Communications, vol. 194, págs.
1234-1241, (1993); Carrau y otros, Invasion &
Metastasis, vol. 15, págs. 197-202, (1995)). En
este contexto, diversos estudios han demostrado una correlación
positiva entre neovascularización en tumores malignos y pobres
resultados clínicos (Volm y otros, Anticancer Research, vol.
16, págs. 213-217, (1996); Toi y otros, Japanese
Journal of Cancer Research, vol. 85, págs.
1045-1049, (1994); Shpitzer y otros, Archives of
Otolaryngology - Head & Neck Surgery, vol. 122, págs.
865-868, (1996); Staibano y otros, Human Pathology,
vol. 27, págs. 695-700, (1996); Giatromanolaki y
otros, J. of Pathology, vol. 179, págs.
80-88, (1996)). Aunque el proceso angiogénico tiene
diversos mediadores, parece que el factor de crecimiento endotelial
vascular (VEGF) puede ser un factor de crecimiento crítico con
respecto a la iniciación de la cascada de episodios que estimulan la
nueva formación de vasos sanguíneos en diversos tipos de tumores
(Toi y otros, Cancer, vol. 77, págs.
1101-1106, (1996); Maeda y otros, Cancer,
vol. 77, págs. 858-863, (1996); Anan y otros,
Surgery, vol. 119, págs. 333-339,
(1996)).
Aiello y otros (Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, vol. 92, págs. 10457-10461, (1995)),
describe receptores del VEGF extracelulares quiméricos manipulados
genéticamente para bloquear la angiogénesis en células no
malignas.
A pesar de los recientes avances en la
identificación de genes que codifican ligandos y receptores
implicados en la angiogénesis, no se ha adelantado ninguna
aplicación de terapia de genes que obvie el efecto perjudicial que
este proceso tiene en la promoción del crecimiento de tumores
primarios y la subsiguiente metástasis. La presente invención está
destinada y satisface esta necesidad.
La presente invención se refiere a
procedimientos de terapia de genes para la inhibición de la
angiogénesis inducida por el VEFG asociada con el crecimiento de
tumor sólido, o metástasis de tumor. Estos trastornos están
relacionados dado que el VEGF actúa como un mitógeno para estimular
la angiogénesis local a partir de células endoteliales vasculares,
lo cual, a su vez, exacerba la afección. Específicamente, se
proporciona el uso de un DNA vector tal como se define en la
Reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para la
inhibición de la angiogénesis de un tumor sólido o metastático en un
huésped mamífero.
La presente invención se refiere a la
transferencia de gen de un DNA vector y concomitantemente la
expresión in vivo de una forma soluble de un receptor
tirosina quinasa (sVEGF-R) dentro del huésped
mamífero, el cual une el VEGF un VEGF homólogo en y alrededor del
sitio localizado del trastorno. La formación de un complejo
sVEGF-R/VEGF inhibiría la unión del VEGF a los
receptores tirosina quinasa FLT-1 y KDR mediante
ligamiento de la membrana de célula endotelial vascular,
previniendo, de esta forma, la iniciación de la transducción de la
señal que estimula la angiogénesis. Además, la expresión de
sVEGF-R puede igualmente impartir un efecto
terapéutico mediante la unión a VEGF-Rs asociados a
la membrana. Se estima que los VEGF-Rs se dimerizan
mediante la unión del ligando VEGF dimérico, lo cual, a su vez,
permite a los dominios tirosina quinasa intracelulares del receptor
transfosforilarse entre sí, generando restos tirosina fosforilados
que facilitan la subsiguiente unión y activación de las proteínas de
transducción de la señal más abajo. Los sVEGF-Rs
pueden formar heterodímeros con VEGF-Rs de longitud
total, lo cual, dado que los sVEGF-Rs están exentos
de una región tirosina quinasa intracelular, previene la
transfosforilación del dominio tirosina quinasa del receptor, la
iniciación de la transducción de la señal y, de esta forma, la
mitogénesis y angiogénesis inducida por VEGF en una manera negativa
dominante.
Una aplicación preferida de la presente
invención se refiere a compuestos para promover la inhibición de la
angigénesis y metástasis de tumores sólidos mediante el uso de la
metodología de terapia de genes descrita. En particular, se
describen compuestos para la inhibición del crecimiento y metástasis
de tumores primarios mediante la transferencia de genes de una
secuencia nucleótida que codifica un sVEGF-R a un
huésped mamífero. La secuencia nucleótida transferida transcribe el
mRNA y expresa el sVEGF-R, de manera tal, que el
sVEGF-R se une al VEGF en regiones extracelulares
adyacentes al tumor primario y las células endoteliales vasculares.
La formación de un complejo sVEGF-R/VEGF prevendrá
la unión del VEGF a los receptores tirosina quinasa KDR y
FLT-1, antagonizando la transducción de las señales
intracelulares normales asociadas con la angiogénesis del tumor
inducida por células endoteliales vasculares. Además, la expresión
de sFLT-1 puede impartir, igualmente, un efecto
terapéutico mediante la unión o bien con o bien sin VEGFs para
formar heterodímeros no funcionales con VEGF-Rs de
longitud total y, de esta forma, la inhibición de las actividades
mitógenas y angiogénicas de los VEGFs.
En la presente invención, se usa en protocolos
de terapia de genes una versión truncada de una forma transmembrana
o soluble de FLT-1 (Shibuya, y otros,
Oncogene, vol. 5, págs. 519-524, (1990)).
Estará dentro del alcance del técnico experto el generar el
constructo que exprese la proteína FLT-1 truncada
que se una al VEGF, un VEGF homólogo y/o se dimerice con un
VEGF-R de longitud total inhibiendo su activación
sobre la membrana de plasma de superficie de células endoteliales
vasculares (Figura 1). Un constructo de este tipo puede generarse
mediante técnicas de DNA recombinantes conocidas en la técnica,
usando un fragmento de DNA que codifica una secuencia aminoácida de
un receptor FLT. Usando técnidas de DNA recombinantes, se
construyeron moléculas de DNA que codifican al menos una porción del
receptor de VEGF capaces de unirse al VEGF sin estimular o bien la
mitogénesis o bien la angiogénesis. Se usaron técnicas de DNA
recombinantes estándar tales como las descritas por Maniatis y otros
(Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor
University, Cold Spring Harbor, New York, (1982)).
En la presente invención, un DNA cortado y
empalmado alternativamente expresado de manera natural que codifica
una forma soluble de FLT-1 (Kendall y Thomas,
Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 90, págs.
10705-10709, (1993)) descrito aquí como
sVEGF-RI o sFLT-1 y listado como SEC
ID NO: 1 (secuencia nucleótida) y SEC ID NO: 2 (secuencia
aminoácida) es el molde para la construcción de un vector de terapia
de genes, en el que el sFLT-1 expresado se une al
VEGF e inhibe la formación, dimerización y activación de los
complejos de VEGF-Rs de longitud total y, en
consecuencia, la angiogénesis patológica.
La presente invención se refiere tanto a
vectores recombinantes víricos como no víricos para suministro a
huéspedes diana. A tal fin, un plásmido recombinante no vírico
preferido descrito aquí es el pcDNA3/sflt-1. Un
plásmido recombinante especialmente preferido de la presente
invención es el pcDNAIAsFLT-1, tal como se describe
en la Sección Ejemplo 5.
Para suministro y expresión prolongada dentro de
células diana próximas a un tumor sólido, se prefiere un sistema
adenovirus (Ad) recombinante. Un sistema adnovirus particularmente
útil usado en la presente invención, es el descrito en el Ejemplo
4.
El constructo puede suministrarse al huésped
mamífero usando un vector u otro vehículo de suministro. Los
vehículos de suministro de DNA pueden incluir vectores víricos tales
como adenovirus, virus adeno-asociados, y vectores
retrovíricos. Véanse, por ejemplo, Chu y otros, Gene Teraphy,
vol. 1, págs. 292-299, (1994); Couture y otros,
Hum. Gene Teraphy, vol. 5, págs. 667-677,
(1994); y Eiverhand y otros, Gene Teraphy, vol. 2, págs.
336-343, (1995)). Los vectores no víricos, que son
igualmente adecuados, incluyen DNA desprotegidos (véanse Secciones
de Ejemplos 1, 2, 3 y 5), complejos DNA-lípidos, por
ejemplo conjugados de ligando o mediado por
liposoma/poli-L-lisina, tal como
sistemas de suministro mediados por asialoglucoproteína. Véanse, por
ejemplo, Felgner y otros, J. Biol. Chem., vol. 269, págs.
2550-2561, (1994); Derossi y otros, Restor.
Neurol. Neuros., vol. 8, págs. 7-10, (1995); y
Abcallah y otros, Biol. Chem., vol. 85, págs.
1-7, 1995)). Se prefiere que células locales tales
como células de tejido adiposo o células de músculo liso, así como
células del tumor, sean dianas para suministro y concomitantemente
expresión in vivo de la proteína sVEGF-R
respectiva, con el fin de promover la inhibición de la angiogénesis
del tumor.
Un Ad/sVEGF-RI recombinante es
un virus preferido para células diana próximas a un tumor
sólido.
Un virus Ad/sVEGF-RI
recombinante especialmente preferido es el
AdHCMVsFLT-1.
Otro virus Ad/sVEGF-RI
recombinante especialmente preferido es el AdHCMVI1sFLT.
El constructo puede ser dirigido
fundamentalmente a células endoteliales vasculares próximas al
crecimiento del tumor. Los vehículos de suministro de DNA descritos
anteriormente pueden ser usados para identificar el constructo de
transferencia de genes a células endoteliales vasculares del huésped
mamífero.
Tal como se usa aquí, "VEGF" o
"VEGF-A" se refiere al factor de crecimiento
endotelial vascular.
\newpage
Tal como se usa aquí, "homólogo de VEGF" se
refiere a homodímeros de VEGF-B,
VEGF-C, VEGF-D y PlGF y a cualquier
heterodímero funcional formado entre VEGF-A,
VEGF-B, VEGF-C,
VEGF-D y PlGF, incluyendo pero sin limitarse a él,
un heterodímero VEGF-A/PlGF.
Tal como se usa aquí,
"VEGF-B" se refiere al factor B de crecimiento
endotelial vascular.
Tal como se usa aquí,
"VEGF-C" se refiere al factor C de crecimiento
endotelial vascular.
Tal como se usa aquí,
"VEGF-D" se refiere al factor D de crecimiento
endotelial vascular.
Tal como se usa aquí, "KDR" o
"FLK-1" se refiere al receptor que contiene el
dominio del inserto quinasa o quinasa de hígado fetal.
Tal como se usa aquí,
"FLT-1" se refiere a receptor de tirosina
quinasa tipo fms.
Tal como se usa aquí, "Ad" se refiere a
adenovirus.
Tal como se usa aquí, "HUVEC" se refiere a
célula(s) endotelial de vena umbilical humana.
Tal como se usa aquí, el término "huésped
mamífero" se refiere a cualquier mamífero, incluyendo un ser
humano.
Tal como se usa aquí,
"sVEGF-R" se refiere genéricamente a una forma
soluble de un receptor de tirosina quinasa que se une a su factor de
crecimiento endotelial vascular respectivo tal como VEGF,
VEGF-B, VEGF-C,
VEGF-D y PlGF sin estimulación de la activación,
mitogénesis de células endoteliales vasculares o angiogénesis del
receptor.
Tal como se usa aquí,
"sVEGF-RI" o "sFLT-1" se
refiere a la forma soluble humana nativa de sFLT y presentada aquí
en forma de cDNA (comprendiendo la SEC ID NO: 1) y la forma proteína
(SEC ID NO: 2).
Tal como se usa aquí,
"VEGF-Rs" se refiere a un receptor de tirosina
quinasa específico del homólogo del VEGF/VEGF de tipo salvaje
humano, tal como FLT-1 y KDR.
Tal como se usa aquí,
"mVEGF-R" se refiere genéricamente a un
receptor de tirosina quinasa específico del homólogo del VEGF/VEGF
de tipo salvaje humano, tal que está unido a la membrana, incluyendo
pero silimitarse a FLT-1, VEGF-RTMI,
KDR, y VEGF-RTMII, tal como se muestra en la Figura
1.
Un objeto de la presente invención es el
proporcionar compuestos para inhibir la angiogénesis y el
crecimiento de tumores sólidos.
Igualmente, un objeto de la presente invención
es usar sVEGF-RI en la fabricación de un medicamento
para uso en procedimientos de terapia de genes, para inhibir la
angiogénesis y el crecimiento de tumores sólidos.
Un objeto de la presente invención es describir
modelos animales para la determinación de la eficacia de
construcciones basadas en FLT-1 para el suministro
de células y expresión in vivo en el huésped mamífero.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar vectores de DNA recombinantes que contienen constructos
sVEGF-RI para uso en terapia de genes con el fin de
inhibir localmente la angiogénesis en un huésped mamífero.
La Figura 1 muestra un diagrama esquemático de
VEGF-Rs (FLT-1 y KDR) de longitud
total, los receptores de VEGF solubles (sVEGF-RI y
sVEGF-RII) y los receptores solubles que contienen
la región transmembrana C-terminal
(sVEGF-RTMI y sVEGF-RTMII), con los
dominios proteína de cada uno.
La Figura 2 muestra la secuencia nucleótida que
codifica el sFLT-1 humano [sVEGF-RI]
(SEC ID NO: 1).
La Figura 3A y la Figura 3B muestran la
secuencia aminoácida de sFLT-1 humano
[sVEGF-RI] (SEC ID NO: 2).
La Figura 4 muestra la inhibición del
crecimiento de nódulos de tumor en ratones desnudos para células de
ratón HT-1080 transfectadas transitoriamente con
pcDNA3/sflt-1 (o) o pcDNA3 (\medbullet). El día 0 se
inyectaron 3 x 10 células.
La Figura 5 muestra la inhibición del
crecimiento de nódulos de tumor en ratones desnudos para células de
ratón HT-1080 transfectadas de manera estable con
pcDNA3/sflt-1 (\medbullet) o pcDNA3 (o).
La Figura 6 muestra la representación de
supervivencia de ratones scid inyectados con (a) células de
glioblastoma humano D-54MG transfectadas de manera
estable con pcDNA3 (\blacksquare); (b) células de glioblastoma
humano D-54MG transfectadas de manera estable con
pcDNA-sflt-1 (\boxempty); y (c) células de glioblastoma
humano D-54MG no transfectadas (\medbullet).
La Figura 7 muestra puntos de datos adicionales
procedentes del experimento detallado en la Figura 6,
fundamentalmente el que usó un modelo de glioma humano de ratón scid
CB-17 para confirmar el efecto de la expresión
estable de sflt-1 sobre el crecimiento del tumor y
la supervivencia. (a) células de glioblastoma humano
D-54MG transfectadas de manera estable con pcDNA3
(\blacksquare); (b) células de glioblastoma humano
D-54MG transfectadas de manera estable con
pcDNA-sflt-1 (\ding{115}); células de glioblastoma humano
D-54MG no transfectadas (o).
La Figura 8 muestra que el crecimiento del tumor
en ratones, medido mediante el volúmen y masa promedio (\pmSD),
fue significativamente inhibido por la expresión del gen
sflt-1 (ensayo T de Student de 1 medida, p<0,0001
para comparación de masas) subclonado dentro de pCDNA1A3, dando como
resultado pcDNAIAsFLT-1.
La Figura 9 muestra que las masas del tumor en
ratones de células que expresan sFLt-1 fueron
significativamente menores que, o bien las células de control
tratadas con adenovirus (p = 0,035), o bien las células de control
no tratadas con virus (p = 0,007) usando el ensayo T de Student de 1
medida apropiado.
Tal como se describe más adelante, el suministro
in vivo de un constructo de DNA que codifica el
sVEGF-R está dirigido a células y tejidos que
circundan el tumor, incluyendo pero sin limitarse a ellas, células
endoteliales vasculares, células de músculos, células adiposas, así
como células de tumores y tejidos que circundan dicho tejido de
músculo y tejido adiposo.
La presente invención se refiere, igualmente, a
compuestos para el tratamiento terapéutico de la extensión
metastática de tumores, la causa principal de mortalidad por cáncer.
Las células de tumores pueden metastatizarse mediante entrada dentro
del sistema circulatorio, transporte a sitios distantes,
re-implantación dentro de los tejidos circundantes y
crecimiento. La inhibición de cualquier etapa en este proceso sería
de esperar que inhibiera el establecimiento final y crecimiento de
focos metastáticos. A tal fin, un aspecto adicional de la presente
invención se refiere al uso de los constructos para terapia de genes
de la presente invención, para inhibir la extensión metastática de
tumores. La significativa inhibición del establecimiento de focos de
pulmón metastático HT1080 mediante la expresión de sflt tal como se
muestra en el Ejemplo 2, muestra que el sflt es eficaz en la
inhibición de este proceso. El experimento de inyección en la vena
de la cola de células HT1080 transfectadas con
sflt-1, monitorizó la implantación y/o crecimiento
de células de tumores circulantes, dos de las etapas cruciales en la
extensión metastática. Se considera que el sflt puede disminuir la
eficacia de la extravasación de células de tumores fuera de la
sangre y dentro del tejido circundante, posiblemente por la
inhibición de la permeabilidad vascular inducida por VEGF, lo cual
podría facilitar la migración de la célula a través de las paredes
de los vasos. Adicionalmente, la expresión de sFlt se espera que
interrumpa el desarrollo neovascular dentro de focos metastáticos,
disminuyendo, de esta forma, su crecimiento y/o viabilidad.
El molde para la puesta en práctica de la
presente invención es el cDNA que codifica una forma soluble de
FLT-1 (sVEGF-RI), descrito por
Kendall y Thomas (Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 90, págs.
10705-10709, (1993)). En resumen, se aisló un clon
de cDNA que codifica el sVEGF-RI en una vía de dos
etapas usando tecnología basada en la reacción de cadena de
polimerasa (PCR) y rastreo de la biblioteca de cDNA. En la primera
etapa, se usaron oligonucleótidos de DNA derivados a partir de la
información de la secuencia del dominio extracelular procedente de
FLT, KDR u otro receptor de VEGF de longitud total conocida, para
diseñar cebadores oligonucleótidos para la amplificación de
fragmentos de DNA específicos de sVEGF-R. En la
segunda etapa, estos fragmentos se clonaron con el fin de servir
como sondas para el aislamiento del cDNA de sVEGF-R
completo procedente de una biblioteca de cDNA de lambda gt10
comercialmente disponible (Clontech) derivada a partir de HUVECs
(ATCC CRL 1730). Este cDNA de sVEGF-RI expresa
alternativamente una forma cortada y empalmada del mRNA del
precursor FLT-1 que incluye 31 restos aminoácidos
únicos en el C-terminal que no se encuentran en
FLT-1 (véase Figura 2 y SEC ID NO: 1 para la
secuencia nucleótida y Figura 3 y SEC ID NO: 2 para la secuencia
aminoácida). Estos 31 restos únicos están codificados por un intrón
que no es eliminado en esta versión alternativamente cortada y
empalmada. El mRNA alternativamente cortado y empalmado se tradujo
dentro de esta región intrón hasta que se encontró el primer codón
de parada. Este molde (sflt-1 o
sVEGF-RI) para un vector para terapia de genes
expresará el sVEGF-RI in vivo y se unirá al
VEFG y/o se heterodimerizará con VEGF-Rs de longitud
total (p. ej., VEGF-RI/FLT-1 y
VEGF-RII/KDR), inhibiendo, de esta forma, la
angiogénesis del tumor.
El cDNA de sVEGF-RI clonado
obtenido a través de los procedimientos descritos anteriormente,
puede expresarse de manera recombinante mediante clonación molecular
dentro de un vector de expresión que contiene un promotor adecuado y
otros elementos reguladores de transcripción apropiados, y ser
transferido dentro de células huéspedes procarióticas o
eucarióticas, para producir sVEGF-RI recombinante.
Las técnicas para dichas manipulaciones están completamente
descritas por Maniatis y otros (véase cita anterior), y son bien
conocidas en la técnica.
Tal como se ha indicado anteriormente, una
realización preferida de la presente invención se refiere a
compuestos útiles en la fabricación de un medicamento para uso en
procedimientos de inhibición de la angiogénesis de tumores sólidos
con el fin de prevenir un adicional crecimiento del tumor y una
eventual metástasis. A tal fin, cualquier tumor sólido o la región
que circunda al tumor accesible a la transferencia de genes será una
diana para las aplicaciones terapéuticas descritas. Un gen
sVEGF-RI alojado dentro de un sistema de
transferencia de genes con base vírica o no vírica recombinante,
puede ser dirigido a células diana situadas en la proximidad del
tumor mediante cualquiera de entre un cierto número de
procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo pero sin
limitarse a ellos, (a) procedimientos quirúrgicos asociados con la
administración de una cantidad eficaz del DNA en el sitio en y
alrededor del tumor (lo que implica la eliminación inicial de una
porción o del tumor completo, si es posible); (b) inyección del
vehículo de transferencia de genes directamente dentro o adyacente
al sitio del tumor; y, (c) suministro localizado o sistémico del
vector de transferencia de genes y/o del producto de genes usando
técnicas conocidas en la técnica; tal como se enumeran más
adelante.
De acuerdo con ello, cualquier tumor sólido que
contenga células que expresen el VEGF serán una diana potencial para
el tratamiento. Los ejemplos, pero sin entender su enumeración como
una limitación, de tumores sólidos que serán particularmente
vulnerables a las aplicaciones de terapia de genes de
sVEGF-RI, son: (a) neoplasmas del sistema nervioso
central tal como, pero nuevamente no necesariamente limitados a
ellos, glioblastomas, astrocitomas, neuroblastomas, meningiomas,
ependimomas; (b) cánceres de tejidos dependientes de hormonas tales
como próstata, testiculares, útero, cervix, ovarios, carcinomas
mamarios incluyendo pero no limitado a ellos, carcinoma in
situ, carcinoma medular, carcinoma tubular, carcinomas invasivos
(infiltrantes) y carcinomas mucinosos; (c) melanomas, incluyendo
pero sin limitarse a ellos, cutáneos y melanomas oculares; (d)
cánceres del pulmón que incluyen al menos carcinoma de célula
escamosa, carcinoma fusiforme, carcinoma de célula pequeña,
adenocarcinoma y carcinoma de célula grande; y (e) cánceres del
sistema gastrointestinal tal como esófago, estómago, intestino
delgado, colon, colorectal, rectal y región anal, lo cual incluye al
menos adenocarcinomas del intestino grueso.
Los vectores de expresión se definen aquí como
secuencias de DNA que se requieren para la transcripción de copias
clonadas de genes y la traducción de sus mRNAs en un huésped
apropiado. Dichos vectores pueden usarse para expresar genes
eucarióticos en una diversidad de huéspedes tales como bacterias,
algas azulverdosas, células de hongos, células de levaduras, células
de plantas, células de insectos y células de animales.
Los vectores diseñados específicamente permiten
el cambio de DNA entre huéspedes tales como células de
bacteria-levadura o bacteria-animal
o bacteria-insecto. Un vector de expresión
construido de manera apropiada debería contener: un origen de
replicación para replicación autónoma en células huéspedes,
marcadores seleccionables, un número limitado de sitios de enzima de
restricción útiles, un potencial para alto número de copias, y
promotores activos. Un promotor se define como una secuencia de DNA
que dirige la RNA polimerasa para unirse al DNA e iniciar la
síntesis de RNA. Un promotor fuerte es aquel que da lugar a que se
inicien mRNAs con alta frecuencia. Los vectores de expresión pueden
incluir, pero sin limitarse a ellos, vectores de clonación, vectores
de clonación modificados, virus o plásmidos diseñados
específicamente.
Para expresar sVEGF-RI
recombinante en células de mamíferos, pueden usarse una diversidad
de vectores de expresión de mamíferos. Los vectores de expresión de
mamíferos comercialmente disponibles que pueden usarse de manera
adecuada para la expresión de sVEGF-RI recombinante
incluyen, pero sin limitarse a ellos, pcDNA3.1 (Invitrogen),
pBlueBacHis2 (Invitrogen), pLITMUS28, pLITMUS29, pLITMUS38 y
pLITMUS39 (New England Biolabs), pcDNAI, pcDNAIamp (Invitrogen),
pcDNA3 (Invitrogen), pMC1neo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5
(Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC
37593), pBPV-1(8-2) (ATCC
37110), pdBPV-MMTneo(342-12)
(ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198),
pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460), y
\lambdaZD35 (ATCC 37565).
El DNA que codifica un sVEGF-RI
puede clonarse, igualmente, dentro de un vector de expresión para
expresión en una célula huésped recombinante. Las células huéspedes
recombinantes pueden ser procarióticas o eucarióticas, incluyendo
pero sin limitarse a ellas, células de bacterias, levaduras,
mamíferos incluyendo, pero sin limitarse a ellas, líneas de células
de origen humano, bovino, porcino, mono y roedor, y líneas de
insectos, incluyendo pero sin limitarse a ellas, líneas de células
derivadas de drosofila, polilla, mosquito y larva de polilla. El
vector de expresión puede introducirse dentro de las células
huéspedes a través de uno cualquiera de entre un cierto número de
técnicas, incluyendo pero sin limitarse a ellos, transformación,
transfección, complejos de DNA de Ad/polilisina, fusión del
protoplasto, y electroporación. Las líneas de células derivadas a
partir de especies de mamíferos que pueden usarse de manera adecuada
y las cuales se encuentran comercialmente disponibles, incluyen pero
limitarse a ellas, CV-1 (ATCC CCL 70),
COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) y MRC-5 (ATCC CRL 171) y células HEK 293. Las líneas de células de insectos que pueden usarse de manera adecuada y las cuales se encuentran comercialmente disponibles, incluyen pero limitarse a ellas, 3M-S (ATCC CRL 8851), polilla (ATCC CCL 80), mosquito (ATCC CCL 194 y 195; ATCC CRL 1660 y 1591) y larva de polilla (Sf9, ATCC CRL 1711).
COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) y MRC-5 (ATCC CRL 171) y células HEK 293. Las líneas de células de insectos que pueden usarse de manera adecuada y las cuales se encuentran comercialmente disponibles, incluyen pero limitarse a ellas, 3M-S (ATCC CRL 8851), polilla (ATCC CCL 80), mosquito (ATCC CCL 194 y 195; ATCC CRL 1660 y 1591) y larva de polilla (Sf9, ATCC CRL 1711).
Un fragmento que codifica un
sVEGF-RI puede suministrarse bien sistémicamente o
bien a células diana en la proximidad de un tumor sólido del huésped
mamífero mediante procedimientos a base de virus o de no virus. Los
sistemas de vectores víricos que pueden usarse en la presente
invención incluyen, pero sin limitarse a ellos, (a) vectores de
adenovirus; (b) vectores de retrovirus; (c) vectores de virus
adeno-asociados; (d) vectores del virus herpes
simplex; (e) vectores SV 40; (f) vectores de virus polioma; (g)
vectores de virus papiloma; (h) vectores de picarnovirus; e (i)
vectores de virus vaccinia. Los procedimientos no víricos de
suministro incluyen, pero sin estar necesariamente limitados a
ellos, inyección directa de DNA desprotegido, tal como un vector de
expresión de DNA plasmido recombinante descrito aquí, que comprende
un fragmento de DNA que codifica al sVEGF-RI.
De acuerdo con ello, la presente invención se
refiere a vectores recombinantes no víricos para suministro a los
huéspedes diana. A tal fin, un plásmido recombinante preferido
descrito aquí es el pcDNA3/sflt-1. Un plásmido
recombinante especialmente preferido de la presente invención es el
pcDNAIAsFLT-1, tal como se describe en la Sección
Ejemplo 5.
Para suministro y expresión prolongada dentro de
células diana próximas a un tumor sólido, se prefiere un sistema de
adenovirus (Ad) recombinante. En el Ejemplo 4 se describe un sistema
de adenovirus particularmente útil usado en la presente
invención.
Un Ad/sVEGF-RI recombinante es
un virus preferido para la identificación de células próximas a un
tumor sólido.
Un virus Ad/sVEGF-RI
recombinante especialmente preferido es el
AdHCMVsFLT-1.
Otro virus Ad/sVEGF-RI
recombinante especialmente preferido es el AdHCMVI1sFLT.
Los virus Ad/sVEGF-RI
recombinantes de la presente invención, que incluyen
AdHCMVsFLT-1 y AdHCMVI1sFLT, son administrados
preferiblemente al huésped mediante inyección directa dentro de un
tumor sólido y/o tejido quiescente próximo al tumor sólido, tal como
tejido adiposo o de músculo. Por supuesto, será útil transfectar
células de tumor en la región de tejido adiposo y de músculo
identificado. La expresión transitoria de un
sVEGF-RI en estas células circundantes dará como
resultado un incremento extracelular local en estas proteínas y
promoverá la unión con VEGF y VEGF-Rs de longitud
total, inhibiendo, de esta manera, la formación de dímeros
VEGF-R de longitud total activados.
Los virus Ad/VEGF-RI
recombinantes de la presente invención, que incluyen
AdHCMVsFLT-1 y AdHCMVI1sFLT, pueden suministrarse
igualmente mediante inyección i.v. Un adenovirus recombinante
suministrado mediante inyección i.v. infectará, preferencialmente,
hepatocitos cuando se administra intravenosamente, en los cuales la
expresión persiste durante aproximadamente 3-4
semanas posteriores a la infección inicial. La cantidad adecuada
dependerá de un cierto número de factores, tales como el vector
particular escogido, el huésped, potencia del promotor usado y la
severidad de la enfermedad a ser tratada.
El técnico experto puede alterar la cantidad del
virus administrado al paciente, dependiendo del procedimiento de
suministro, tamaño del tumor y eficacia de expresión a partir del
virus recombinante. Una dosis dentro del intervalo de
10^{9}-10^{11} pfu de adnovirus es la preferida
para tratar la mayoría de los tumores primarios. El técnico experto
comprenderá igualmente que, el número de partículas víricas que
codifican el transgen, sean o no competentes de la replicación en
una célula huésped complementadora, son una unidad de dosificación
relevante. En la mayoría de los constructos de adenovirus, existen
de 50 a 100 veces más partículas que contienen DNA que pfus.
Los véctores no víricos que son igualmente
adecuados, incluyen complejos de DNA-lípido, por
ejemplo conjugados de ligando o mediado por
liposoma/poli-L-lisina, tal como
sistemas de suministro mediados por asiloglucoproteína (véanse, p.
ej., Felgner y otros, J. Biol. Chem., vol. 269, págs.
2550-2561, (1994); Derossi y otros, Restor.
Neurol. Neoros., vol. 8, págs. 7-10, (1995); y
Abcallah y otros, Biol. Cell., vol. 85, págs.
1-7, (1995)).
Existen muchas realizaciones de la presente
invención las cuales los expertos en la técnica pueden apreciar a
partir de la memoria descriptiva. A tal fin, pueden usarse con éxito
diferentes promotores de transcripción, terminadores, véctores
vehículo o secuencias de genes específicas.
La presente invención proporciona compuestos
útiles en la fabricación de un medicamento para uso en
procedimientos de terapia de genes, los cuales inhiben la
angiogénesis del tumor en un huésped mamífero. Resultará fácilmente
obvio para el técnico experto que, en principio, pueden usarse
diversas formas de la secuencia nucleótida que codifica el
sVEGF-RI para alterar la secuencia aminoácida de la
proteína expresada. La proteína expresada alterada puede tener una
secuencia aminoácida alterada, que se une aún al VEGF y, a su vez,
inhibe la cascada molecular requerida para estimular la angiogénesis
del tumor. Por ejemplo, se consideran diversas formas truncadas
COOH-terminales del sVEGF-RI. Será
fácil para el técnico experto generar dichas formas alteradas
revisando esta memoria descriptiva. Cualquiera de dichas versiones
truncadas de FLT que sea soluble y que se una a VEGF, un homólogo de
VEGF y/o FLT-1 o KDR, se considera un equivalente
funcional a la vista de las directrices de esta memoria
descriptiva.
Con el fin de ilustrar la presente invención, se
proporcionan los ejemplos siguientes, sin ser estos, sin embargo,
limitativos de la misma.
Se usaron productos derivados mediante PCR como
sondas de hibridación para rastreo de una biblioteca de cDNA de
lambda gt10 derivada a partir de HUVECs (Clontech). La siembra y
toma de placas de la biblioteca se realizaron mediante
procedimientos estándar (Maniatis y otros, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual; Cold Spring Harbor laboratory, Cold Sring
Harbor, New York, (1982)). Las sondas marcadas cebadas
aleatoriamente con ^{32}P-dCTP a una alta
actividad específica y con cada sonda se llevó a cabo un rastreo
separado de la biblioteca (1 x 10^{6} placas por tamíz). Las
sondas se agregaron a tampón de hibridación (formamida al 50%, 5 x
Denhardts, 6 x SSC (1 x SCC = NaCl 0,15 M,
Na_{3}citrato\cdot2H_{2}O 0,015 M, pH 7,0), SDS al 0,1%, 100
mg/ml de DNA de esperma de salmón) a 1x10^{6} cpm/ml.
Se detectaron cuatro fagos hibridizantes de
manera positiva usando la sonda específica de flt-1. Estos
fagos hibridizantes de manera positiva se observaron que eran
menores que el flt-1 de longitud total.
Dentro de vectores pGEM se subclonaron dos
clones de cDNA de flt-1 de aproximadamente 2,0 kb y 2,7 kb de
longitud (Promega) y se secuenciaron bidireccionalmente en su
totalidad mediante el procedimiento de terminación de cadena (Sanger
y otros, Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 74, págs.
5463-5467, (1977)), mostrándose que contenían un
marco de lectura abierto único de aproximadamente 569 aminoácidos.
El análisis de secuencias demostró que se había perdido una porción
de la región de codificación de flt-1 5' procedente
de estos clones. El remanente del extremo 5' se clonó usando PCR y
se combinó con el DNA de los clones que carecían del extremo 5',
proporcionando un marco de lectura abierto único que codifica
aproximadamente 687 aminoácidos.
La secuencia nucleótida del cDNA de
sVEGF-RI (sflt-1) derivada de
flt-1 y la secuencia aminoácida deducida se muestran en la
Figura 2 (secuencia nucleótida: SEC ID NO: 1) y la Figura 3
(secuencia aminoácida: SEC ID NO: 2). La inspección de la secuencia
aminoácida deducida revela la presencia de un único marco de lectura
ambierto grande de 687 aminoácidos. Por comparación con la secuencia
aminoácida del receptor del VEGF FLT-1 de longitud
total, 31 aminoácidos están codificados en el extremo
C-terminal del cDNA de sVEGF-FI, que
son diferentes de los de FLT-1.
El cDNA de sVEGF-RI descrito en
el Ejemplo 1, clonado en pGEM3z y denominado como
psflt-1, se digerió con BamHI, se purificó y se ligó
dentro de pcDNA3 digerido con BamHI. El plásmido resultante,
pcDNA3/sflt-1 (alternativamente denominado como
SFLT-1), se verificó mediante mapaje de restricción
así como secuenciación del DNA del inserto BamHI de 500 bp 5' y 3'.
El plásmido se transformó dentro de E. coli Top10F' y se
purificó usando Quiagen mega prep y el kit de eliminación Qiagen
Endotoxin.
El plásmido de expresión
pcDNA3/sflt-1, se mezcló con
adenovirus-polilisina (AdPl) y se transfectó dentro
de células de ratón HT-1080 (ATCC CRL 1730). Las
transfecciones de control se realizaron de una forma idéntica usando
pcDNA3 no modificado. Las células HT-1080 se
transfectaron al alcanzar una confluencia del 80% y se recolectaron
a las16-24 horas para posterior estudio.
El recuento de células sobre cavidades por
triplicado se realizó para 3 puntos de tiempo dentro de los 7 días
de la transfección usando exclusión por azul tripano, no revelándose
diferencias en las curvas de crecimiento entre los dos grupos.
Las células recolectadas se inyectaron o bien
subcutáneamente o bien a través de la vena de la cola en ratones
desnudos, midiéndose los nódulos en días seleccionados para los
núdulos subcutáneos. Para las inyecciones a través de la vena de la
cola, se realizaron dos conjuntos de experimentos. En el primer
experimento, los animales se sacrificaron antes del desarrollo de
nódulos pero hubo diferencias detectables en los pesos de los
pulmones, aunque los pesos no fueron significativamente diferentes.
En el segundo experimento, hubo diferencias definitivas en el
número de nódulos por secciones, teniendo el grupo
sflt-1 menos nódulos/sección de tejido.
La transfección transitoria con
pcDNA3/sflt-1 (n = 7), comparada con un control de
pcDNA (n = 6), dió como resultado un crecimiento más lento de los
nódulos del tumor en todos los días examinados (p<0,01). Estas
células tenían velocidades de crecimiento idénticas in vitro
a lo largo de un período de 96 horas. Los volúmenes de nódulo
promedio para células transfectadas con sflt-1
fueron de 50 mm^{3}, 75 mm^{3} y 190 mm^{3} los días 7, 12 y
17, respectivamente. Por el contrario, usando células transfectadas
con pcDNA3 de control, los nódulos fueron de 151 mm^{3}, 261
mm^{3} y 474 mm^{3} los días 7, 12 y 17. De manera similar, los
pesos de pulmón medios fueron menores en animales que recibieron
células transfectadas con pcDNA3/sflt-1 (171 mg, n
= 3) mediante inyección en vena de cola, en comparación con los
controles de pcDNA3 (205 mg, n = 3). La Figura 4 muestra una
disminución marcada en el volúmen del tumor en ratones desnudos
inyectados con células HT-1080 que expresan
transitoriamente sVEGF-RI en la forma de
pcDNA3/sflt-1.
Un segundo estudio diseñado para investigar la
capacidad de la terapia de genes basada en sFLT, para ser aplicada
al tratamiento de la metástasis de tumores, proporcionó resultados
similares. Las células HT-1080 se transfectaron
transitoriamente con pcDNA3 o pcDNA3/sflt-1. Se
inyectaron 4 x 10^{6} células el día 0 a través de la vena de
cola de cada ratón. Los animales se sacrificaron después de un mes y
se extrajeron los pulmones, se pesaron y se examinaron
histológicamente para determinar el tamaño del tumor. La histología
pulmonar realizada sobre animales que recibieron tumores inyectados
intravenosamente reveló una diferencia notable entre los dos grupos.
Las células transfectadas con pcDNA3 se asociaron con una extensión
del tumor intramural pulmonar, edema parenquimal masivo e infiltrado
mononuclear 20 días después de la inyección intravenosa de células
tumorales. Por el contrario, las células transfectadas con
pcDNA3/sflt-1 se asociaron con focos de tumor raros,
la ausencia de edema e histología del parénquima del pulmón casi
normal. Ocho de los 9 animales inyectados con células
HT-1080 que expresan transitoriamente
sVEGF-RI estuvieron limpios de crecimiento del
tumor. Inversamente, las células de tumor HT-1080
transfectadas con el plásmido de control pcDNA3 mostraron 2 de 9 sin
crecimiento del tumor, mientras que 7 de 9 formaron nódulos en el
pulmón. Estos datos muestran que las aplicaciones de terapia de
genes basadas en sFLT pueden usarse para tratar metástasis de
tumores.
En tercer lugar, se examinó un modelo singénico.
Se generaron clones agrupados o bien para pcDNA3 o bien
pcDNA3/sflt-1 en células de glioma de ratón GL261.
El recuento de células de las células desarrolladas en el cultivo no
reveló diferencias entre los grupos. Todos los 3 animales con pcDNA3
desarrollaron grandes tumores después de aproximadamente un mes. Dos
de 3 del grupo con sFLT-1 estuvieron libres de
tumor. El tercero había formado un tumor muy pequeño. La
histopatología diferió, pero todos los tumores tenían un aspecto
maligno claro.
El estudio descrito en el Ejemplo 2 se repitió
con células HT-1080 transfectadas de manera estable
o bien con pcDNA3 de control o bien con
pcDNA3/sflt-1. La Figura 5 muestra una inhibición
virtualmente completa del crecimiento del tumor comparada con los
datos adicionales generados con células de tumor transfectadas
transitoriamente.
Para determinar los efectos de
sVEGF-RI sobre la supervivencia de animales, la
línea de células de glioma humano D-54MG se
transfectó de manera estable con pcDNA3/psflt-1 o un
control de pcDNA3. Los clones se agruparon y se inyectaron el mismo
número de células intracrealmente usando un dispositivo
estereotáctico de ratón con suturas del cráneo como marcas de
referencia. Previamente, se había determinado que el modelo tenía
características de supervivencia fiables. Los animales fueron
tratados de manera idéntica post-operativamente. La
Figura 6 muestra que los ratones inyectados con un control no
transfectado murieron el día 26, los ratones inyectados con células
de control transfectadas con pcDNA3 murieron el día 25, en tanto que
todos los ratones que recibieron células transfectadas con
pcDNA3/sVEGF-R estaban vivas el día 41. La Figura 7
muestra puntos de datos ampliados procedentes de este experimento,
los cuales muestran que la superviviencia media para células
D-54MG transfectadas con
pcDNA3/sflt-1 fue de 46,5 días. Tal como se ha
indicado anteriormente en este párrafo, las células de glioma humano
D-54MG fueron transfectadas con
pcDNA3/sflt-1 o pcDNA3 usando transfección con AdpL.
Las células fueron subsiguientemente propagadas en medio completo
conteniendo 400 \mug/ml de antibiótico G418 (Gibco BRL, Grand
Island, NY) durante un mes para seleccionar una población de clones
que contenían el plásmido pcDNA3/sflt-1 o pcDNA3. A
continuación, las células seleccionadas, las cuales representan una
población de clones agrupados, se recolectaron usando solución de
tripsina/EDTA (Gibco) y se contaron usando un hematocitómetro con
exclusión por azul tripano. Las células se resuspendieron hasta una
concentración final de 10^{7} células/100 \mul en DMEM/F12
libre de suero conteniendo metilcelulosa al 5% como un vehículo para
potenciar la viabilidad de la célula. Se realizó una incisión en la
línea media del cuero cabelludo, seguido de un agujero con un buril
de 0,5 mm a 1,5-2,0 mm a la derecha de la línea
media y 0,5-1,0 mm posterior a la sutura coronal.
Las células se cargaron dentro de una microjeringa de 100 \mul y
se inyectaron 5 \mul estereotácticamente. Una aguja de galga 30
montada sobre la microjeringa se insertó verticalmente a través del
agujero del buril hasta una profundidad de 2,5 mm. Cuarenta y cinco
a sesenta segundos después de la inyección, la aguja se extrajo
lentamente y se cerró la incisión con clips para heridas Michel de 9
mm. Los ratones se devolvieron a jaulas de policarbonato
microaislante estéril, se dispusieron sobre un lecho de
calentamiento hasta su recuperación, y se suministró comida de
laboratorio tratada en autoclave y agua estéril sin límitación. Los
animales se comprobaron dos veces al día con el fin de determinar su
supervivencia. Estos resultados demuestran que los animales con
sFLT-1 sobrevivieron más tiempo que los controles
históricos y los controles subsiguientes.
Para la construcción de vectores de adenovirus
(Ad) independientes del ayudante, se han desarrollado diversos
sistemas y, recientemente, han sido revisados por Graham y Prevec
(Mol. Biotech., vol. 3, págs. 207-220,
(1995)) y Hitt y otros ("Técnicas para la construcción y
caracterización de vector adenovirus humano", en Methods in
Molecular Genetics, Volume 7. Molecular Virology Techniques Part
B, ed. Kenneth W. Adolph, Academic Press, Inc. Orlando,
Florida). Todos estos sistemas implican la clonación del transgen de
interés (región de codificación flanqueada por secuencias
reguladoras apropiadas) dentro de un plásmido lanzadera, en el cual
está flanqueado por secuencias Ad homólogas a la región del genoma
vírico dentro del cual se introducirá el transgen. A continuación,
el DNA procedente del plásmido lanzadera es rescatado dentro del
virus bien por ligamiento directo in vitro seguido de
transfección o bien mediante recombinación de homólogos in
vivo después de transfección dentro de células 293.
Los plásmidos lanzadera E1 han sido
desarrollados para el rescate de insertos dentro de la región E1.
Estos plásmidos contienen el 16% izquierdo del genoma Ad con una
deleción de secuencias E1 y sitios de clonación dentro de los cuales
se introduce el transgen. Si se encuentran disponibles sitios de
restricción convenientes en la estructura principal del vector,
puede realizarse el ligamiento directo del plásmido lanzadera al DNA
vírico purificado in vitro, seguido de transfección dentro de
células 293 para generar virus infecciosos. Este procedimiento,
aunque eficaz, puede requerir un rastreo extensivo si el DNA vírico
no está completamente restringido y, en muchos casos, no es práctico
debido a la ausencia de sitios de restricción únicos correctamente
posicionados. Por estas razones, muchos protocolos están basados en
la recombinación de homólogos in vivo para generar virus
infecciosos. Para construir un virus mediante recombinación de
homólogos, el plásmido lanzadera puede transfectarse dentro de
células 293 con DNA vírico purificado que ha sido restringido en el
extremo izquierdo o con DNA vírico contenido en un segundo plásmido.
Al igual que como con el ligamiento directo, el uso de DNA vírico
purificado requiere, a veces, un rastreo extensivo para obtener el
vector deseado, debido a la regeneración del virus progenitor y,
por esta razón, son más deseables los sistemas plásmidos. Se han
desarrollado un cierto número de sistemas plásmidos para el rescate
de insertos dentro de regiones E1 (McGrory y otros, Virology,
vol. 163, págs. 614-617, (1988)) o E3
(Ghosh-Choudhury y otros, Gene, vol. 50,
págs. 161-171, (1986); Mittal y otros, Virus
Res., vol. 28, págs. 67-90, (1993)) o ambas
(Bett y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 91, págs.
8802-8806, (1994)).
Las etapas implicadas en la construcción de los
vectores Ad independientes del ayudante que expresan
sFLT-1 se describen más adelante. Todas las etapas
implican el uso de protocolos estándar para la generación de
vectores de adenovirus (Hitt y otros, en Methods in Molecular
Genetics, Volume 7. Molecular Virology Techniques Part B, ed.
Kenneth W. Adolph, Academic Press, Inc. Orlando, Florida). Las
secuencias de codificación para sFLT se obtuvieron a partir del
plásmido psflt-1 mediante digestión con BamHI e
inserción dentro del sitio BamHI en la región de policlonación del
plásmido lanzadera E1, p\DeltaE1sp1HCMV-BGHpA,
generando el pHCMVsFLT-1. El
p\DeltaE1sp1HCMV-BGHpA contiene secuencias Ad5
desde la bp 1 hasta 341 y bp 3524 hasta 5790 con un promotor caja
que consiste en el promotor HCMV, una región de policlonación y la
señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovino
insertada en la orientación antiparalela de E1 entre las bp 341 y bp
3524 de Ad5. A continuación, el pHCMVsFLT-1 se
cotransfectó dentro de células 293 con plásmido pJM17 de genoma de
Ad (McGrory y otros, Virology, vol. 163, págs.
614-617, (1988)) y el virus
AdHCMVsFLT-1 se generó mediante recombinación in
vivo entre los plásmidos. El pJM17 contiene esencialmente el
genoma de Ad entero, pero no es infeccioso en transfecciones únicas
de células 293 ya que contiene una inserción de un derivado pBR322
en el bp 1339 en secuencias de Ad, lo cual hace que el genoma vírico
resultante sea demasiado grande para encapsidar. La recombinación
in vivo entre pJM17 y pHCMVsFLT-1 genera un
vector de un tamaño encapsidable que contiene la caja de expresión
sFLT-1 en la región E1.
Igualmente, se describe un virus adenovirus
recombinante adicional. Esencialmente, es el mismo que el vector
descrito anteriormente, pero usa un segmento promotor HCMV
ligeramente diferente que consiste en el promotor HCMV y el primer
intrón (Intrón A). Este constructo incrementa los niveles de
expresión dentro del huésped mamífero. Para construir este vector,
se obtuvieron secuencias de codificación de sFLT-1 a
partir del plásmido pHCMVsFLT-1 (anteriormente
descrito), mediante digestión con KpnI y EcoRI. A continuación, el
fragmento sFLT-1 se insertó dentro de los sitios
KpnI y EcoRI en el plásmido lanzadera E1,
pHCMVI1-BGHpA, generando el
pHCMVI1sFLT-1. El pHCMVI1sFLT-1 se
había cotransfectado dentro de células 293 con plásmido pJM17 de
genoma de Ad. Como alternativa, el pHCMVI1sFLT-1 se
digerió con PacI y se ligó con DNA vírico purificado procedente del
virus AdE1PacIE3, igualmente digerido con PacI. Después de la
transfección de los productos de ligamiento dentro de células 293,
se rastrearon placas víricas para obtener el vector
AdHCMVI1sFLT-1.
Generación de plásmido
sFLT-1 - Se construyó un plásmido adicional
(pcDNAIAsFLT-1) que contenía el Intrón A de HCMV más
arriba del cDNA de sflt-1, con el fin de generar
clones HT-1080 que secreten cantidades incrementadas
de sflt-1. En estudios previos, se ha demostrado que
este intrón potencia la expresión de genes en 10-100
veces sobre plásmidos que contienen únicamente el promotor temprano
HCMV. Para la construcción de pcDNAIAsFLt-1, se
digerió pcDNA3 con NruI y KpnI (para eliminar el promotor HCMV) y se
ligó con el fragmento MscI/KpnI procedente del plásmido
pVIJNS-MCS (que contiene el promotor HCMV e Intrón
A), generando el pcDNAINTA. A continuación, el pcDNAINTA se digerió
con KpnI y EcoRI y se ligó a un fragmento KpnI/EcoRI que contiene
las secuencias que codifican sFLT-1, generando
pCDNAIAsFLT-1.
Selección de clones HT1080 transfectados de
manera estable con pcDNAIAsFLT-1 y que expresan
sFlt-1 - Se transfectaron células de tumor
HT1080 de fibrosarcoma humano (Rasheed y otros, Cancer, vol.
33, págs. 1027-1033, (1974)) con el plásmido
(pcDNAIAsFLT-1) que contiene el gen
sFlt-1 humano bajo el control del promotor HCMV que
contiene el primer intrón HCMV y el gen de resistencia a
medicamentos G418 seleccionable. Las células HT1080 transfectadas
agrupadas de manera estable, se sembraron en discos de 100 cm a una
densidad de 10 y 100 células/placa. Las células se desarrollaron en
medio suplementado DMEM [Medio de Eagle modificado de
Dulbecco/F-12 (DMEM), GIBCOBRL (Cat#
11331-030), suero bovino fetal al 10% (GIBCOBRL Cat#
16000-028) y 1 x
penicilina-estreptomicina (GIBCOBRL Cat#
15070-063)] con 500 \mug/ml de G418 (GIBCOBRL Cat#
10131-035). El medio se reemplazó cada día hasta que
las colonias individuales se desarrollaron hasta diámetros de 2,5
mm, aproximadamente. Las colonias aisladas se trataron con tripsina
(GIBCOBRL Cat# 25200-056), se transfirieron a placas
de 24 cavidades y se desarrollaron hasta confluencia. Se retiró 1
ml de medio y se ensayó para determinar la actividad de unión de
VEGF. El clon estable seleccionado para posteriores estudios tenía
velocidades de crecimiento similares in vitro comparado tanto
con células no transfectadas como con células transfectadas con
pCDNA3, con división celular que se producía aproximadamente cada 48
horas.
Protocolo de unión de VEGF - Se lavó
Heparin-Sepharose CL-6B (Pharmacia
Cat# 17-0467-01) 3 veces con
solución salina tamponada con fosfato [PBS] (GIBCOBRL
Cat#20012-027), y se resuspendió en un volúmen igual
de PBS. De cada cavidad se retiró 1 ml de medio acondicionado, se
mezcló con 50 \mul de suspensión de
Heparin-Sepharose CL-6B y se incubó
durante una noche a 4ºC con mezclado constante. Las esférulas de
Heparin-Sepharose se granularon mediante
centrifugación (10.000 xg durante 2 minutos) y se lavaron 3 veces
con PBS. La proteína unida se eluyó con 40 \mul de PBS que
contenía NaCl 1,2 M. Se retiró una parte alícuota de 10 \mul y se
agregó a 10 \mul de DMEM/gelatina al 2%, se agregó 1 \mul de
^{125}I-VEGF (Amarsham Cat# IM 274; 100.000
cpm/\mul) y se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente. A
la reacción se agregaron 2 \mul de suberato de
bis(sulfosuccinimidilo) BS^{3} 10 mM [SB^{3}] (Pierce
Cat# 21579 G) y se incubaron durante un tiempo adicional de 15
minutos a temperatura ambiente. La reacción de reticulación se
interrumpió mediante la adición de 20 \mul de 2X tampón de
muestra Laemmli (BioRad Cat# 161-0637). Las
complejos de reticulación se separaron mediante SDS/PAGE al 7,5% y
se visualizaron mediante autoradiografía.
Preparación de clones seleccionados para el
estudio del crecimiento del tumor - Se sembraron células en
matraces T-75 y se desarrollaron hasta confluencia
en medio suplementado DMEM. Las células se lavaron con PBS y se
tripsinizaron en 20 ml. La tripsinización se interrumpió mediante la
adición de 8 ml de medio suplementado DMEM y las células
desprendidas se retiraron y contaron. Las células se granularon
mediante centrifugación (1000 rpm en una centrífuga de sobremesa
Sorvall 6000B) durante 5 minutos y se resuspendieron en PBS con
calcio y magnesio hasta una concentración final de 1,0 x 10^{7}
células/ml y se inyectaron 0,5 ml de células subcutáneamente dentro
de ratones.
Resultados - Las células
HT-1080 (0,5 x 10^{6} células/0,5 ml)
transfectadas de manera estable bien con plásmido de control o bien
con plásmido que codifica sflt-1
[pcDNAIAsFLT-1] (n = 10/grupo) que se clonaron y
seleccionaron para alta expresión de sflt-1, se
inyectaron subcutáneamente dentro de ratones hembra Balb/c nu/nu
(Charles River Laboratories). La longitud y anchura del tumor se
midieron como una función del tiempo y se usaron para calcular el
volúmen del tumor mediante la ecuación:
Volúmen = 4/3 \cdot p \cdot
(longitud/2)(anchura/2)(longitud +
anchura)/4),
la cual estima el volúmen de la
mitad de un elipsoide achatado, dando por supuesto que la altura es
el promedio de la longitud y la anchura. El día 12 después de la
implantación del tumor, la ulceración fue visible, de manera que los
tumores se extirparon y pesaron; la expresión de
sFlt-1 ocasionó una reducción del 93% en la masa del
tumor. Tal como se muestra en la Figura 8, el crecimiento de tumores
medido mediante el volúmen y masa promedio (\pmSD) estuvieron
significativamente inhibidos por la expresión del gen
sflt-1 (ensayo T de Student de 1 medida, p<0,0001
para comparaciones de
masas).
La generación de constructos adenovíricos
sFlt-1 es tal como se describe en la Sección Ejemplo
4.
Infección adenovírica de células HT1080 in
vitro e implantación in vivo - Se sembraron células en matraces
T-75 y se desarrollaron hasta confluencia en medio
suplementado DMEM. Un matraz de células se tripsinizó (2 ml), las
células se retiraron y se resuspendieron en medio suplementado DMEM
y se contaron para determinar el número de células/placa. Se retiró
el medio de desarrollo de los matraces y las células unidas se
lavaron con PBS que contenía calcio y magnesio. Tanto los adenovirus
de control como los adenovirus que expresan sFlt-1
humano bajo control de HCM/intrón A, se agregaron a matraces a una
multiplicidad de infección de 20 virus pfu (unidades de formación
de placas)/célula en 2 ml de PBS con calcio y magnesio y se
incubaron durante 1 hora a 37ºC. Se retiró el virus y las células se
incubaron en un incubador humidificado con CO_{2} al 5% a 37ºC
durante un tiempo adicional de 24 horas. Las células se lavaron con
PBS y se tripsinizaron con 2 ml de tripsina. La tripsinización se
interrumpió mediante la adición de medio suplementado DMEM y las
células desprendidas se retiraron y contaron. Las células se
granularon mediante centrifugación (1000 rpm en una centrífuga de
sobremesa Sorvall 6000B) durante 5 minutos y se resuspendieron en
PBS con calcio y magnesio hasta una concentración final de 1,0 x
10^{7} células/ml y 0,5 ml de células se inyectaron
subcutáneamente dentro de ratones hembra Balbc nu/nu de
6-8 semanas de edad.
Resultados - Las células del tumor que no
estuvieron expuestas a virus, o lo estuvieron a adenovirus de
control o a adenovirus que expresa sFlt-1 bajo
control del promotor HCMV/intrón A [AdHCMVI1sflt-1]
(n = 5/grupo), se dejaron crecer subcutáneamente en ratones
desnudos. Después de 11 días de crecimiento in vivo, la piel
sobre el tumor comenzó a ulcerarse en los animales de control, de
modo que los tumores se extrajeron de todos los animales y se
pesaron. Los masas de tumor promedio \pmSEMs del grupo se muestran
en la Figura 9.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: MERCK & Co., INC.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: TERAPIA DE GENES PARA INHIBICIÓN DE LA ANGIOGÉNESIS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DIRECCIÓN: J. Mark Hand - MERCK & CO., INC.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 126 EAST LINCOLN AVENUE - P-P- BOX 2000
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: RAHWAY
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: NJ
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: ESTADOS UNIDOS DE AMÉRICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO: 07065-0900
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Diskete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM Compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: FastSEQ Versión 1.5
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: u.s. 60/026.641
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 24 de Septiembre de 1996
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- PROCURADOR/AGENTE DE INFORMACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Hand, J. Mark
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 36.545
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 19810Y
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELEFONO: 908-594-3905
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 908-594-4720
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELEX:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2313 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 687 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (11)
1. El uso, para la fabricación de un medicamento
para la inhibición de la angiogénesis de un tumor sólido o
metastático en un mamífero huésped, de un vector de DNA que expresa
una forma soluble de un receptor de tirosina quinasa que comprende
la secuencia aminoácida establecida en la SEC ID NO: 2, en la que el
receptor de tirosina quinasa forma un dímero con VEGF, un homólogo
de VEGF o una proteína del receptor de tirosina quinasa específica
de VEGF.
2. Uso de acuerdo con la Reivindicación 1, en el
que dicho huésped mamífero es un humano.
3. Uso de acuerdo con la Reivindicación 2, en el
que dicho vector de DNA es un adenovirus recombinante.
4. Uso de acuerdo con la Reivindicación 2, en el
que dicho vector de DNA es un vector plásmido de DNA
recombinante.
5. Uso de acuerdo con la Reivindicación 3, en el
que dicho adenovirus recombinante se suministra mediante infección
dentro de las células de un tumor sólido o las células adyacentes a
dicho tumor sólido.
6. Uso de acuerdo con la Reivindicación 5, en el
que dichas células están seleccionadas entre el grupo que consiste
en células adiposas, células del músculo y células endoteliales
vasculares.
7. Uso de acuerdo con la Reivindicación 6, en el
que dicho adenovirus recombinante es AdHCMVsFLT-1 o
AdHCMVI1sFLT.
8. Uso de acuerdo con la Reivindicación 4, en el
que dicho vector plásmido de DNA recombinante se suministra
mediante inyección dentro de las células de un tumor sólido o las
células adyacentes a dicho tumor sólido.
9. Uso de acuerdo con la Reivindicación 8, en el
que dichas células están seleccionadas entre el grupo que consiste
en células adiposas, células del músculo y células endoteliales
vasculares.
10. Uso de acuerdo con la Reivindicación 9, en
el que dicho vector plásmido de DNA recombinante es
pcDNA3/sflt-1 o pcDNA3IA/sflt-1.
11. Un procedimiento de determinación de la
eficacia de la inhibición de la angiogénesis del tumor, el cual
comprende:
(a) transfección de células del tumor cultivadas
con un vector de DNA que expresa sFLT, el cual comprende la
secuencia aminoácida establecida en la SEC ID NO: 2;
(b) inyección de dichas células del tumor
transfectadas dentro de un ratón;
(c) sacrificio de dicho ratón después de un
intervalo que permite el crecimiento del tumor dentro de dicho
ratón; y,
(d) observación de la formación de nódulos del
tumor en dicho ratón, comparada con un ratón inyectado con células
del tumor transfectadas con el vector solamente o células de tumor
no transfectadas.
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