JP2009148293A - 血管内皮増殖因子のペプチドアンタゴニスト - Google Patents
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Abstract
【解決手段】VEGFアンタゴニスト活性を有する、VEGFペプチドの一部分を有する単離された45アミノ酸残基からなるポリペプチド。VEGFアンタゴニスト活性を有する、VEGFペプチドの特定の配列を有する24アミノ酸残基またはそれらの一部分を含む、単離されたポリペプチド。式(I):(X1−(CSCKNTDSRCKARQLELNERT)−X2)Iの構造を有するペプチドを含む単離されたポリペプチドであって、ここで、X1は、Hまたは前記45アミノ酸残基からなるポリペプチドのアミノ酸2〜21の任意の部分であり、そしてX2は、HまたはC、CR、RCまたはCRC、およびそれらのアナログである、ポリペプチドからなる。
【選択図】なし
Description
本明細書において記載する本発明は、一部には、National Institute of Health 助成金 CA37392およびCA45548により後援されている。米国政府は、本発明に対して特定の権利を有する。
本発明は、血管内皮増殖因子(VEGF)に関する。より詳細には、本発明は、VEGFに関連する障害の処置におけるVEGFのアンタゴニストおよびそれらのアンタゴニストの使用に関する。
血管は、酸素および栄養が生体組織に供給され、そして廃棄物が生体組織から除去される手段である。血管形成(angiogenesis)とは、新しい血管が形成される工程をいう。例えば、FolkmanおよびShingの総説、J.Biol.Chem.267,10931〜10934(1992)、DvorakらJ.Exp.Med.,174,1275〜1278(1991)を参照のこと。従って、適切な場合、血管形成とは重要な生物学的工程である。これは生殖、発生および創傷修復において重要である。しかし、不適切な血管形成は、重篤な負の結果を有し得る。例えば、腫瘍が迅速に増殖および転移することを可能にする酸素および栄養の十分な供給を有するのは、血管形成の結果として、多くの固形腫瘍が血管新生する後のみである。適切な平衡で血管形成の速度を維持することは、機能の範囲に非常に重要なので、健康を維持するためにはこれを注意深く調節するべきである。この血管形成工程は、血管内皮増殖因子(VEGF)および塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)のような分裂促進因子により活性化される内皮細胞(EC)から分泌されたプロテアーゼによる基底膜の分解から開始すると考えられる。この細胞は、遊走および増殖し、間質性間隙への固形内皮細胞出芽の形成を誘導し、次いで、血管ループが形成され、そして毛細血管が発生し、新しい基底膜の緊密な結合および沈着の形成を伴う。
本発明者らは、VEGF165の第7エキソンの一部分がすべてのVEGFアイソフォームに対してアンタゴニストとして作用することを発見した。すべてのVEGFの形態が第7エキソンを有しているわけではないので、これは驚くべきことである。例えば、本発明者らは、第7エキソンにコードされる44アミノ酸に対応するペプチドを含むグルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質、および第8エキソンでコードされるペプチド(VEGF165のアミノ酸116〜160(配列番号1))の第一システインを調製した。この融合タンパク質は、ヒト臍帯静脈由来EC(HUVEC)および231細胞上のレセプターへの125I−VEGF165の結合を阻害した。この阻害活性は、第7エキソンコードドメインのC末端部分(アミノ酸22〜44)に局在化していた。さらに、この融合タンパク質は、HUVECのVEGF誘導化増殖を阻害した。この融合タンパク質はまた、VEGF121誘導化分裂促進性を阻害し、これはVEGF121が第7エキソンを含まないことを考慮すると、予期せぬ結果であった。従って、本発明のポリペプチドは、VEGFの主要なアイソフォームに対するアンタゴニストであり、そしてVEGF誘発性の新血管新生または血管形成に関連する疾患および状態の処置に用いられ得る。
(X1−(CSCKNTDSRCKARQLELNERT(配列番号3))−X2)I:
ここで、X1は、Hまたは配列番号1のアミノ酸2〜21の任意の部分である。例えば、配列番号1のアミノ酸3〜21、4〜21、5〜21、6〜21など。そしてX2は、HまたはC、CR、RCまたはCRCである。式(I)のポリペプチドは、例えば、以下の実施例に記載するようにVEGF165を用いるヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)増殖アッセイによって、決定されるように、VEGFアンタゴニスト活性を有する。好ましくは、このポリペプチドは、HUVEC増殖において、少なくとも25%減少、より好ましくは50%減少、さらにより好ましくは75%減少、最も好ましくは95%の減少を有する。好ましくは、このポリペプチドは、多数のシステイン残基さえ有する。式(I)のポリペプチドはアナログを含む。
・(項目1) VEGFアンタゴニスト活性を有する、配列番号1の一部分を有する単離されたポリペプチド。
・(項目2) VEGFアンタゴニスト活性を有する、配列番号2またはその一部分を含む単離されたポリペプチド。
・(項目3) 以下の式(I):
(X 1 −(CSCKNTDSRCKARQLELNERT(配列番号3))−X 2 )I
の構造を有するペプチドを含む単離されたポリペプチドおよびそれらのアナログであって、
X 1 は、Hであるかまたは配列番号1のアミノ酸2〜21の任意の部分であり、そしてX 2 は、HまたはC、CR、RCまたはCRCである、
ポリペプチド。
・(項目4) 項目1、2または3に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
・(項目5) 前記キャリアが皮膚に対する局所適用に受容可能である、項目4に記載の薬学的組成物。
・(項目6) 前記キャリアが眼に対する適用に受容可能である、項目4に記載の薬学的組成物。
・(項目7) VEGFに関連する疾患または障害を有する被験体を処置するための方法であって、
項目4に記載の薬学的組成物を当該被験体に投与する工程
を包含する、方法。
・(項目8) 前記VEGFに関連する疾患または障害が、転移、不適切な血管形成、および慢性炎症からなる群から選択される、項目7に記載の方法。
・(項目9) 前記VEGFに関連する前記疾患または障害が、カポージ肉腫、変形性関節症、糖尿病性網膜症、および関節リウマチからなる群から選択される、項目7に記載の方法。
・(項目10) 前記疾患または障害が固形腫瘍である、項目7に記載の方法。
・(項目11) VEGF 165 R/NP−1レセプターを発現する腫瘍を処置するための方法であって、
項目4に記載の薬学的組成物を宿主に投与する工程
を包含する、方法。
・(項目12) 項目1〜3に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸。
・(項目13) VEGFに関連する疾患または障害を処置するための医薬の調製における、項目12に記載の単離された核酸の使用。
・(項目14) VEGFに関連する疾患または障害を処置するための医薬の調製における、項目1〜3に記載のポリペプチドの使用。
本発明の他の局面は、以下に開示される。
本発明は、VEGFアンタゴニスト活性を有する単離されたポリペプチド、ペプチドをコードする核酸、このポリペプチドおよび核酸を含む薬学的組成物、ならびにVEGFに関連する疾患および障害(例えば、血管形成を誘導するVEGF165R/NP−1およびVEGFを発現する腫瘍)を処置するための方法を提供する。本発明のポリペプチドは、上記の、VEGFアンタゴニスト活性を有する配列番号1の一部を含有するポリペプチド、VEGFアンタゴニスト活性を有する配列番号2(CSCKNTDSRCKARQLELNERTCRC)またはその一部を含有するポリペプチド、および式(I)の構造を有するポリペプチドを含む。本発明はさらに、VEGFアンタゴニスト活性を有するこれらのポリペプチドのアナログおよび誘導体を含む。エキソン7およびエキソン8をコードするDNA配列は、それぞれ配列番号17および18として配列リストに記載される。
(実験手順)
(材料)
ヒト組換えVEGF165およびVEGF121を、以前に記載されたように(Sokerら、J.Biol.Chem.、271、5761−5767(1996)、Cohenら、Growth Factors、7、131−138(1992))、ヒトVEGF165またはVEGF121をコードする組換えバキュロウイルスで感染させたSf−21昆虫細胞において産生した。VEGF165を、感染されたSf−21細胞の馴化培地からヘパリンアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、そしてVEGF121を陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。塩基性FGFは、Judith Abraham博士(Scios、Sunnyvale、CA)の御厚意により提供された。細胞培養培地をLife Technologies,Inc.より購入した。125I−ナトリウムをNEN Life Science Productsより購入した。ジスクシニミジルスベリン酸塩(Disuccinimidyl suberate)およびIODO−BEADSをPierceより購入した。G−グルタチオンアガロース、NAP−5カラム、およびpGEX−2TKプラスミドをPharmacia Biotech Inc.より購入した。TSK−ヘパリンカラムをTosoHass(Tokyo、Japan)より購入した。分子量マーカーをAmersham Corp.(IL)より購入した。ブタ腸粘膜由来ヘパリンをSigmaより購入した。
ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を、American Type Culture Collection(ATCC)(Rockville MD)より入手し、そしてゼラチン被覆ディッシュ上で、20%ウシ胎仔血清(FCS)ならびにグルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシンの混合物(GPS)を含有するM−199培地中で増殖させた。塩基性FGF(1ng/ml)を一日おきに培養培地に添加した。親の、およびKDR/Flk−1(PAE−KDR)を発現するようトランスフェクトされたブタ内皮細胞(PAE)は、Lema Claesson−Welsh博士の御厚意により提供され、そしてこれを記載されたように10%FCSおよびGPSを含有するF12培地において増殖させた(Waltenbergerら、J.Biol.Chem.、269、26988−26995(1994))。MDA−MB−231(231)細胞をATCCより入手し、そして10%のFCSおよびGPSを含有するダルベッコ(Bulbecco’s)変法イーグル培地で増殖した。
HUVECを、ゼラチン被覆96ウェルディッシュにおいて、4,000細胞/200Ul/ウェルの濃度で5%FCSおよびGPSを含有するM−199中に播種した。24時間後、VEGFアイソフォームおよびVEGFエキソン7−GST融合タンパク質を同時にウェルに添加した。この細胞を72時間インキュベートし、そして[3H]チミジン(1μC/ml)を10〜12時間添加した。培地を吸引し、そしてこの細胞をトリプシン処理し、そして自動セルハーベスター(cell harvester)(TOMTEC)により採集し、そしてフィルターマット(Filtermats)(Wallac)にのせた。フィルターマットをスキャンし、そしてカウント毎分(cpm)をMicroBeta計数器(Wallac)により測定した。結果は、3連でアッセイされたサンプルの平均を表し、そして標準偏差(standard derivation)を決定した。全ての実験は少なくとも3回繰り返され、そして同様の結果が得られた。
VEGF165およびVEGF121の放射性ヨウ素結合を、IODO−BEADSを使用し、製造業者の指示に従って実施した。簡潔には、1つのIODO−BEADを100μlの0.1Mリン酸ナトリウム(pH7.2)でリンスし、乾燥させ、そして100μlの0.1Mリン酸ナトリウム(pH7.2)中で125I−ナトリウム(0.2mCi/μgタンパク質)と共に5分間室温でインキュベートした。VEGF(1〜3μg)を反応混合物に添加し、そして5分後に、ビーズを除去することによりその反応を停止した。125I−VEGFを含有する溶液を2mg/mlゼラチンに調整し、そして2mg/mlゼラチンを含有するPBSで予め平衡したNAP−5カラムを使用するサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。ヨウ素化タンパク質のアリコートをドライアイスで凍結し、そして−80℃に保存した。その比活性は40,000〜100,000cpm/ngタンパク質の範囲であった。
125I−VEGF165および125I−VEGF121を使用する結合ならびに架橋実験を以前に記載されたように実施した(Gitay−Gorenら、J.Biol.Chem.、287、6003−6096(1992)、Sokerら、J.Biol.Chem.、271、5761−5767(1996))。VEGF結合を、y−計数器(Beckman、Gamma 5500)における細胞に付随する放射能を測定することにより定量した。この計数は3つのウェルの平均を表す。全ての実験は少なくとも3回繰り返され、そして同様の結果が得られた。125I−VEGF架橋複合体を6%SDS−PAGEにより分離し、そしてこのゲルをリン光体スクリーンに曝露し、そして24時間後にPhosphorImager(Molecular Dynamics)により走査した。引き続いて、このゲルをX線フィルムに曝露した。
VEGFのエキソン7および8の異なるセグメントを、以下のプライマーを使用するヒトVEGF cDNAからのポリメラーゼ連鎖反応により増幅した:
(HUVECに対する、VEGF165およびVEGF121の示差的レセプター結合および分裂促進活性)
VEGF165およびVEGF121は、HUVEC上で発現されるVEGFレセプターと相互作用するそれら能力において異なる(Sokerら、J.Biol.Chem.、271、5761−5767(1996)、Gitay−Gorenら、J.Biol.Chem.271、5519−5523(1996))。VEGF121はKDR/Flk−1に結合して240−kDaの標識複合体を形成し(図1、レーン2)、一方VEGF165はこのサイズの複合体を形成するのに加えて、165−175kDaのより低分子量の複合体をまた形成する(図1、レーン1)。このアイソフォーム特異的レセプターをVEGF165レセプター(VEGF165R)と命名した。これらの示差的レセプター結合特性は、VEGF165およびVEGF121が、示差的な分裂促進活性もまた有し得ることを示唆する。従って、HUVEC増殖を刺激するこの2つのVEGFアイソフォームの能力を試験した。VEGF165はVEGF121よりもHUVECに対してより強力な分裂促進剤であった(図2)。VEGF165は1ng/mlで最大DNA合成の半分を刺激し、そして4ng/mlでの最大刺激は対照に対して8倍の増加を生じた。他方、2ng/mlのVEGF121が最大刺激の半分に必要とされ、そして最大刺激のための20ng/mlはHUVEC増殖において、対照に対して4倍の増加を生じた。従って、VEGF165と比較してちょうど2倍のVEGF121が、最大刺激の半分を達成するために必要とされ、そしてVEGF121に誘導される増殖はVEGF165に誘導されるレベルの約半分で飽和に達する。総合すると、これらの結果は、VEGF121と、比較されたECに対するVEGF165の増強された分裂促進活性と、HUVEC上のさらなるレセプター(VEGF165R)に結合するVEGF165の能力との間に相関が存在し得ることを示唆する。
本発明者らの以前の研究は、VEGF165のVEGF165Rへの結合がエキソン7によりコードされる44のアミノ酸(VEGFアミノ酸116〜158)(これは、VEGF165に存在するが、VEGF121には存在しない)により媒介されることを示した(Sokerら、J.Biol.Chem.、271、5761−5767(1996))。VEGFエキソン7またはVEGFエキソン7および8によりコードされるペプチドを含有するGST融合タンパク質が調製された。エキソン7に対してC末端であるエキソン8によりコードされる6つのアミノ酸が、融合タンパク質の調製を促進するために含まれたが、いずれにしても結果に影響を与えなかった(データ示さず)。エキソン7融合タンパク質は、直接的に231細胞上のVEGF165Rに結合する(Sokerら、J.Biol.Chem.、271、5761−5767(1996))。それはまた、HUVEC上のKDR/FLK−1にではなく、HUVEC上のVEGF165Rに直接的に結合する(図1、レーン3)。HUVEC(KDR/Flk−1およびVEGF165Rを両方とも発現する)への125I−VEGF165の結合、PAE−KDR細胞(KDR/Flk−1のみを発現する(Waltenbergerら、J.Biol.Chem.、269、26988−26995(1994))への125I−VEGF165の結合、および231細胞(VEGF165Rのみ発現する(Sokerら、J.Biol.Chem.、271、5761−5767(1996))への125I−VEGF165の結合と競合するGST−VEGF165エキソン7−および8−コードペプチド(GST−Ex 7&8)の能力を試験した(図3)。GST−Ex 7+8の濃度の増加は、125I−VEGF165のHUVECへの結合を約85〜95%(図3A)、および231細胞への結合を97〜98%、著しく阻害した(図3B)。しかし、この融合タンパク質はPAE−KDR細胞(これはVEGF165Rを全く発現しない)への125I−VEGF165の結合を阻害しなかった(図3C)。GSTタンパク質単独では20μg/mlの濃度でさえ、125I−VEGF165の任意の細胞型への結合において有意な効果を有さなかった。総合すると、これらの結合研究は、GST−EX 7+8が125I−VEGF165結合に対して、KDRではなくVEGF165Rと直接的に相互作用することにより競合することを示唆した。
GST−Ex 7融合タンパク質は、44アミノ酸のエキソン7コードドメイン全体を含む。コア阻害性領域が存在するか否かを決定するため、エキソン7のN末端およびC末端での欠失が作製され、そしてHUVECへの125I−VEGF165の結合に対する効果が測定された(図5)。これらの実験において、エキソン8の位置でエキソン7コードドメイン+システイン残基を含有する融合タンパク質が、融合タンパク質のVEGF部分におけるシステイン残基の数を、等しく維持するために含まれる。GST−Ex 7融合タンパク質は、2μg/ml融合タンパク質でHUVECへの125I−VEGF165の結合を80%阻害した(図5)。HUVECおよび231細胞への125I−VEGF165の結合の阻害はGST−Ex 7+8の結合の阻害と比較された(データ示さず)。最初の10のN末端アミノ酸の欠失(GST−Ex 7d−(1−10))または21のN末端アミノ酸の欠失(GST−Ex 7d−(1−21))は、融合タンパク質の阻害活性を減少しなかった。実際、1μg/mlのGST−Ex 7d−(1−21)は、同じ濃度のGST−Ex 7よりも大きな阻害活性を有した。このことは、エキソン7のアミノ酸1〜21残基内に阻害活性を干渉する領域が存在し得ることを示唆する。他方、エキソン7における22位のシステイン残基の欠失(GST−Ex 7d(1−22))は、阻害活性の完全な喪失を生じた。15のC末端アミノ酸の欠失(GST−Ex 7d−(30−44))もまた、阻害活性の完全な喪失を生じた(図5)。これらの結果は、阻害性のコアがエキソン7のアミノ酸22−44内に見出されることを示した。さらに、エキソン7の位置22のシステイン残基(VEGF内のCys137)は、阻害に必要とされる特異的な構造を維持するために重要であるように思われる。
GST−Ex 7+8融合タンパク質によるKDR/Flk−1へのVEGF165の結合の阻害は、図4に示されるように、KDR/Flk−1がVEGF分裂促進活性を媒介するため、GST−Ex 7+8融合タンパク質はVEGF165の分裂促進性のインヒビターでもまたあり得ることを示唆した(Waltenbergerら、J.Biol.Chem.、269、26988−26995(1994))。HUVECへの1〜5ng/mlのVEGF165の添加は、増殖率における5.5倍増、2.5ng/mlでのピークを生じた(図6)。15μg/mlのGST−Ex 7+8をVEGF165にさらに添加した場合、HUVEC増殖は約60%減少した。同様の様式により調製されたGSTタンパク質は、25μg/mlでさえも、HUVEC増殖を阻害せず、この阻害効果が単に融合タンパク質内のエキソン7+8コードドメインの存在に起因することを示した。エキソン7+8ペプチドに媒介されるHUVEC上のVEGFレセプターへのVEGF165の結合の阻害は、HUVEC増殖阻害と相関すると結論付けられた。
GST−Ex 7+8は、VEGF165誘導の分裂促進性のレベルを、約2倍から、VEGF121誘導の分裂促進性のおよそのレベルにまで阻害する(図7)。15μg/mlでGST−Ex 7+8はまた、VEGF121媒介のHUVEC増殖を約2倍阻害した。VEGF121はエキソン7を含まないことを考慮すると、これは予想外の結果であった。VEGF121阻害の性質をより理解するために、VEGFレセプターへの125I−VEGF121の結合におけるGST−EX 7+8の効果を架橋研究により分析した。HUVECへの125I−VEGF121の架橋は、240−kDaの標識複合体(図8、レーン1)(これはVEGF121およびKDR/Flk−1を含むことが示されている)の形成を生じた(Sokerら、J.Biol.Chem.、271、5761−5767(1996)、Gitay−Gorenら、J.Biol.Chem.、271、5519−5523(1996))これらの複合体の形成は、15μg/mlのGST−Ex 7+8により有意に阻害された(図8、レーン2)。GST−Ex 7+8は、おそらくそのKDR/Flk−1への結合を阻害することにより、VEGF121誘導の分裂促進性を阻害すると結論付けられた。
最も大量にあるVEGFアイソフォームは、VEGF165およびVEGF121である。VEGF生物学の理解の点からの重要な疑問は、これらのアイソフォームが生化学特性および生物学的特性において異なるか否かということである。現在までに、VEGF121ではなくVEGF165は、細胞表面HSPGに結合すること(Houckら、Mol.Endocrinol.、8、1806−1814(1991)、Houckら、J.Biol.Chem.、247、28031−28037(1992)、Parkら、Mol.Biol.Cell、4、1317−1326(1993))およびVEGF165はVEGF121よりもより強力なEC分裂促進剤であること(Smithら、Gene(Amst.)、87、31−49(1988))が証明されている(図2)。さらに、本発明者らは最近、VEGF121ではなくVEGF165に結合するという点で特異的な、HUVEC、および腫瘍細胞の表面上で見出された新規の130−kDaのVEGFレセプターを特徴付けた(Sokerら、J.Biol.Chem.、271、5761−5767(1996))。VEGF165はこのレセプター(VEGF165Rと呼ばれる)に、エキソン7によりコードされる44のアミノ酸を介して結合する。このエキソンはVEGF165に存在するがVEGF121には存在しない。対照的に、KDR/Flk−1およびFlt−1は、VEGF165およびVEGF121の両方に結合し、そしてそれぞれVEGFエキソン4および3を介して結合する(Keytら、J.Biol.Chem.、271、5638−5646(1996))。本発明の研究における、本発明者らの目標は、エキソン7がVEGF165活性、特にHUVECについての分裂促進活性を調節するか否か、およびいかなる機構によって調節されるかを決定することであった。そのため、本発明者らはエキソン7コードドメインを含むGST融合タンパク質を使用してVEGF165RへのVEGF165の結合を阻害し、そしてHUVEC増殖において引き続く効果を調べる戦略を進展させた。架橋実験は、予想通り、エキソン7融合タンパク質がKDR/Flk−1ではなくVEGF165Rに結合し得ることを立証した。エキソン7融合タンパク質は125I−VEGF165の、231細胞(これは、VEGF165Rを単独で発現する)への結合を98%、およびHUVEC(これは、KDR/Flk−1およびVEGF165Rの両方を発現する)への結合を85〜95%阻害する強力なインヒビターであることが見出された。しかしエキソン7融合タンパク質は、KDR/Flk−1を発現するがVEGF165Rは発現しないPAE−KDR細胞への125I−VEGF165の全ての結合を阻害はしなかった。GSTタンパク質単独では、いずれの細胞型への結合も阻害しなかった。このことは、この阻害が単に融合タンパク質のエキソン7部分に起因したことを立証する。特定の125I−VEGF165レセプター複合体の形成を立証した架橋分析は、GST−Ex 7+8がHUVECおよび231細胞上のVEGF165Rへの125I−VEGF165の結合を著しく阻害したことを確認した。総合すると、これらの結果は、エキソン7融合タンパク質がVEGF165Rと直接的に相互作用し、そしてこのレセプターへの125I−VEGF165の結合の競合インヒビターとして作用し得ることを示す。
7+8融合タンパク質はVEGF165RへのVEGF165の結合と直接的に競合することにより、シグナリングレセプターKDR/Flk−1へ結合するVEGF165の能力を間接的に損なう。従って、KDR/Flk−1へのVEGF165の効率的な結合は、VEGF165Rとの首尾よい相互作用に部分的に依存し得る。他の代替的な可能性は、エキソン7コードドメインがヘパリン結合ドメインを含むこと(Sokerら、J.Biol.Chem.、271、5761−5767(1996))および過剰なGST−Ex 7+8が、VEGF165のそのレセプターへの効率的な結合に必要とされる、VEGF165の細胞表面HSPGへの結合を阻止すること(Gitay−Gorenら、J.Biol.Chem.、287、6003−6096(1992))である。
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