JP2001526032A

JP2001526032A - 血管内皮増殖因子のペプチドアンタゴニスト

Info

Publication number: JP2001526032A
Application number: JP2000524433A
Authority: JP
Inventors: マイケルクラグスブラン，; シァイソーカー，
Original assignee: Childrens Medical Center Corp
Current assignee: Childrens Medical Center Corp
Priority date: 1997-12-09
Filing date: 1998-12-09
Publication date: 2001-12-18
Anticipated expiration: 2018-12-09
Also published as: JP2009148293A; AU1810899A; WO1999030157A2; AU1906099A; WO1999029861A1; CA2313390A1; WO1999030157A9; WO1999030157A3; JP4312955B2; EP1037994A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＶＥＧＦアンタゴニスト活性を有する単離されたポリペプチド、薬学的組成物および処置の方法を提供する。本発明のポリペプチドとしては、ＶＥＧＦアンタゴニスト活性を有する配列番号１の一部分を含むポリペプチド、ＶＥＧＦアンタゴニスト活性を有する配列番号２またはそれらの一部分を含むポリペプチド、および上記の式（Ｉ）の構造を有するポリペプチドが挙げられる。本発明はさらに、ＶＥＧＦアンタゴニスト活性を有するこれらのポリペプチドのアナログおよび誘導体を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（連邦政府委託研究に関する声明）本明細書において記載する本発明は、一部には、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨｅａｌｔｈ助成金ＣＡ３７３９２およびＣＡ４５５４８により後援されている。米国政府は、本発明に対して特定の権利を有する。

【０００２】（発明の分野）本発明は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に関する。より詳細には、本発明は
、ＶＥＧＦに関連する障害の処置におけるＶＥＧＦのアンタゴニストおよびそれ
らのアンタゴニストの使用に関する。

【０００３】（発明の背景）血管は、酸素および栄養が生体組織に供給され、そして廃棄物が生体組織から
除去される手段である。血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）とは、新しい血
管が形成される工程をいう。例えば、ＦｏｌｋｍａｎおよびＳｈｉｎｇの総説、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１０９３１〜１０９３４（１９９２）、Ｄｖ
ｏｒａｋらＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７４，１２７５〜１２７８（１９９１）を
参照のこと。従って、適切な場合、血管形成とは重要な生物学的工程である。こ
れは生殖、発生および創傷修復において重要である。しかし、不適切な血管形成
は、重篤な負の結果を有し得る。例えば、腫瘍が迅速に増殖および転移すること
を可能にする酸素および栄養の十分な供給を有するのは、血管形成の結果として
、多くの固体腫瘍が血管新生する後のみである。適切な平衡で血管形成の速度を
維持することは、機能の範囲に非常に重要なので、健康を維持するためにはこれ
を注意深く調節するべきである。この血管形成工程は、血管内皮増殖因子（ＶＥ
ＧＦ）および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）のような分裂促進因子によ
り活性化される内皮細胞（ＥＣ）から分泌されたプロテアーゼによる基底膜の分
解から開始すると考えられる。この細胞は、遊走および増殖し、間質性間隙への
固体内皮細胞出芽の形成を誘導し、次いで、血管ループが形成され、そして毛細
血管が発生し、新しい基底膜の緊密な結合および沈着の形成を伴う。

【０００４】成人では、内皮細胞の増殖速度は、代表的には体内の他の細胞型と比べて遅い
。これらの細胞の回転時間は１０００日を超え得る。血管形成が迅速な増殖を生
じる生理学的な例外は、代表的には、雌性の生殖系および創傷治癒過程で見られ
るような緻密な調節下で生じる。

【０００５】血管形成の速度は、微小血管の増殖の正の調節因子と負の調節因子との間の局
所平衡における変化に関与する。血管形成増殖因子の治療的意図は、２０年以上
前にＦｏｌｋｍａｎおよび共同研究者らによって最初に記載された（Ｆｏｌｋｍ
ａｎ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２８５：１１８２〜１１８６（１９７１）
）。身体が血管形成の制御の少なくともいくつかを消失した場合、異常な血管形
成が生じ、これは過度の血管増殖または不充分な血管増殖のいずれかを生じる。
例えば、潰瘍、脳卒中、および心臓発作のような状態は、自然な治癒に通常必要
とされる血管形成の欠如に起因し得る。対照的に、過度の血管増殖は、腫瘍増殖
、腫瘍伝播、失明、乾癬および慢性関節リウマチを生じ得る。

【０００６】従って、血管形成のより大きい程度が所望される場合がある（血液循環増加、
創傷治癒、および潰瘍治癒）。例えば、現在の研究者らは、線維芽細胞増殖因子
（ＦＧＦ）ファミリー（Ｙａｎａｇｉｓａｗａ−Ｍｉｗａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、
２５７：１４０１〜１４０３（１９９２）およびＢａｆｆｏｕｒら、ＪＶａｓ
ｃＳｕｒｇ，１６；１８１〜１９１（１９９２））、内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ）（Ｐｕら、ＪＳｕｒｇＲｅｓ，５４：５７５〜５８３（１９９３））
、ならびにより最近では、心筋および後肢虚血の動物モデルにおいて側副動脈発
生を促進および／または増強する血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（Ｔａｋｅｓｈ
ｉｔａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９０：２２８〜２３４（１９９４）および
Ｔａｋｅｓｈｉｔａら、Ｊ．ＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ，９３：６６２〜６７０（１９９４））のような組換えの血管形成増殖因子の使用の可能性を証明している
。

【０００７】逆に、血管形成の阻害が所望される場合がある。例えば、多くの疾患が永続的
な調節されない血管形成（これはときに、「新血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａ
ｒｉｚａｔｉｏｎ）」といわれる）により進行される。関節炎において、新しい
毛細血管は、関節を侵襲し、そして軟骨を破壊する。糖尿病では、新しい毛細血
管は、ガラス質を侵襲し、出血し、そして失明を生じる。眼球の新血管新生は、
失明の最も普通の原因である。腫瘍増殖および転移は、血管形成依存性である。
腫瘍は、腫瘍自体を増殖させるために新しい毛細血管の増殖を持続的に刺激する
はずである。

【０００８】ＶＥＧＦは、血管形成の主な調節因子であり得るという証拠が高まっている（
Ｆｅｒｒａｒａら、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．，１３，１８〜３２（１９９２）；
Ｋｌａｇｓｂｒｕｎら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，３，６９９〜７０２（１９９３
）；Ｋｌａｇｓｂｒｕｎら、Ｆｅｒｒａｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６１，８５１〜８５８（１９８９）に概説され
た）。ＶＥＧＦは、最初に、小胞星状（ｆｏｌｌｉｃｕｌｏｓｔｅｌｌａｔｅ）
細胞の馴化培地から（Ｆｅｒｒａｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｓｙ．Ｒｅ
ｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６１，８５１〜８５８（１９８９）、および種々の腫瘍
細胞株から（Ｍｙｏｋｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
，８８：５８１９〜５８２３（１９９１）；Ｐｌｏｕｅｔら、ＥＭＢＯ．Ｊ．８
：３８０１〜３８０６（１９９１））精製された。ＶＥＧＦは、血管透過性因子
、つまり同時にＵ９３７細胞の馴化培地から精製された血透過性の調節因子、と
同一であることが見出された（Ｋｅｃｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１３０９
〜１３１２（１９８９））。ＶＥＧＦは、インビトロにおいて内皮細胞（ＥＣ）
の特異的分裂促進因子であり、そしてインビボにおいて強力な血管形成因子であ
る。ＶＥＧＦの発現は、胚形成および雌性の生殖周期中の血管新生下の組織にお
いて上方制御される（Ｂｒｉｅｒら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１１４：５２１
〜５３２（１９９２）；Ｓｈｗｅｉｋｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９
１：２２３５〜２２４３（１９９３））。高レベルのＶＥＧＦは、腫瘍誘発性の
低酸素に応答して、種々のタイプの腫瘍において発現されるが、正常な組織では
発現されない（Ｓｈｗｅｉｋｉら，Ｎａｔｕｒｅ３５９：８４３〜８４６（１
９９２）；Ｄｖｏｒａｋら．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７４：１２７５〜１２
７８（１９９１）；Ｐｌａｔｅら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５３：５８２２〜
５８２７；Ｉｋｅａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：１９７６１〜１９
７６６（１９８６））。ＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体を用いる腫瘍の処
置は、腫瘍血管形成の抑制に起因して腫瘍量の劇的な減少を生じた（Ｋｉｍら，
Ｎａｔｕｒｅ，３８２：８４１〜８４４（１９９３））。ＶＥＧＦは、新血管新
生に関連する多くの病理的状態およびプロセスにおいて主要な役割を果たすよう
である。従って、罹患した組織におけるＶＥＧＦ発現の調節は、ＶＥＧＦに誘導
される新血管新生／血管形成の処置または予防に重要となり得る。

【０００９】ＶＥＧＦは、４０〜４５Ｋの分泌型ホモダイマーである（ＴｉｓｃｈｅｒＥ
ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１１９４７〜１１９５４（１９９１）。
これは、胎盤由来増殖因子（ＰＩＧＦ）、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧ
Ｆ−ＤおよびＶＥＧＦ−Ｅを含む拡大ファミリーのメンバーである（Ｏｌｏｆｓ
ｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：２５７６〜
２５８１（１９９６）、Ｊｏｕｋｏｖら，ＥＭＢＯＪ．１５：２９０〜２９８
（１９９６），Ａｃｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９５：５４８〜５５３（１９９８）、Ｏｇａｗａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２７３：３１２７３〜３１２８２（１９９８））。ＶＥＧＦは、８つのエキソ
ンを含む単独の遺伝子からの選択的スプライシングにより産生される多数の異な
るアイソフォームで存在する（Ｆｅｒｒａｒａら、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１３
：１８〜３２（１９９２）；Ｔｉｓｃｈｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，８
０６：１１９４７〜１１９５４（１９９１）；Ｆｅｒｒａｒａら、Ｔｒｅｎｄｓ
ＣａｒｄｉｏＭｅｄ．，３：２４４〜２５０（１９９３）；Ｐｏｌｔｅｒａ
ｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：７１５１〜７１５８（１９９７））。
ヒトＶＥＧＦアイソフォームは、それぞれ活性なホモダイマーを作製し得る、１
２１、１４５、１６５、１８９、および２０６アミノ酸のモノマーからなる（Ｐ
ｏｌｔｅｒａｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７２：７１５１〜７１５８（１
９９７）；Ｈｏｕｃｋら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，８：１８０６〜１
８１４（１９９１））。このＶＥＧＦ₁₂₁およびＶＥＧＦ₁₆₅アイソフォームが、
最も大量である。ＶＥＧＦ₁₂₁は、ヘパリンに結合しない唯一のＶＥＧＦアイソフォームであり、そしてすべて培養培地に分泌される。ＶＥＧＦ₁₆₅は、それがヘパリンおよび細胞表面の硫酸ヘパリンプロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に結合す
るという点でＶＥＧＦ₁₂₁と機能的に異なり、そして培養培地にほんの部分的に放出される（Ｈｏｕｃｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４７：２８０３１〜２
８０３７（１９９２）；Ｐａｒｋら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４：１３
１７〜１３２６（１９９３））。残りのアイソフォームは、完全に細胞表面およ
び細胞外マトリックスＨＳＰＧに会合している（Ｈｏｕｃｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２４７：２８０３１〜２８０３７（１９９２）；Ｐａｒｋら，Ｍｏｌ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４：１３１７〜１３２６（１９９３））。

【００１０】ＶＥＧＦレセプターチロシンキナーゼであるＫＤＲ／Ｆｌｋ−１および／また
はＦｌｔ−１は、ほとんどＥＣによって発現される（Ｔｅｒｍａｎら、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１８７：１５７９〜１５８
６（１９９２）；Ｓｈｉｂｕｙａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，５：５１９〜５２４（
１９９０）；ＤｅＶｒｉｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５：９８９〜９９１（１９９２）；Ｇｉｔａｙ−Ｇｏｒａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ.、２８７：６００３〜６０９６（１９９２）；Ｊａｋｅｍａｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅ
ｓｔ．，８９：２４４〜２５３（１９９２））。たとえ両方のレセプターがＶＥ
ＧＦの結合の際にリン酸化を起こしても、ＶＥＧＦ活性（例えば、分裂促進性、
走化性、および形態学的変化の誘導）は、Ｆｌｔ−１でなく、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−
１により媒介されるようである（Ｍｉｌｌａｕｅｒら、Ｃｅｌｌ，７２：８３５
〜８４６（１９９３）；Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．，２６９：２６９８８〜２６９９５（１９９４）；Ｓｅｅｔｈａｒａｍら、Ｏ
ｎｃｏｇｅｎｅ、１０：１３５〜１４７（１９９５）；Ｙｏｓｈｉｄａら，Ｇｒ
ｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ、７：１３１〜１３８（１９９６））。最近、Ｓｏｋ
ｅｒらは、ＥＣおよび種々の腫瘍由来細胞株（例えば、乳癌由来ＭＤＡ−ＭＢ−
２３１（２３１）細胞）上で発現される新しいＶＥＧＦレセプターを同定した（
Ｓｏｋｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：５７６１〜５７６７（１９
９６）。このレセプターは、第７エキソンにコードされる部分を含むためにＶＥ
ＧＦアイソフォームを必要とする。例えば、ＶＥＧＦ₁₂₁およびＶＥＧＦ₁₆₅Ｒの
両方は、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１およびＦｌｔ−１に結合するが、ＶＥＧＦ₁₆₅のみが新しいレセプターに結合する。従って、これはアイソフォーム特異的レセプタ
ーであり、そしてＶＥＧＦ₁₆₅レセプター（ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ）と名付けられた。こ
れはまた、１８９アイソフォームおよび２０６アイソフォームと結合する。構造
機能分析において、ＶＥＧＦ₁₆₅がＶＥＧＦ₁₂₁には存在しない第７エキソンコー
ドドメインを介してＶＥＧＦ₁₆₅Ｒに結合することが直接示された（Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：５７６１〜５７６７（１９９６））。
しかし、このレセプターの機能は明確ではなかった。

【００１１】血管形成的な疾患の現在の処置は十分でない。持続的血管形成を予防する薬剤
（例えば、薬物（ＴＮＰ−４７０）、モノクローナル抗体、アンチセンス核酸お
よびタンパク質（アンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）およびエンドス
タチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ））は、現在、試験中である。Ｂａｔｔｅｇａｙ
，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７３，３３３〜３４６（１９９５）；Ｈａｎａｈａｎら
、Ｃｅｌｌ、８６．３５３〜３６４（１９９６）；Ｆｏｌｋｍａｎ、Ｎ．Ｅｎｇ
ｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３３、１７５７〜１７６３（１９９５）を参照のこと。抗
血管形成性タンパク質を用いた以前の結果は有望であるが、それらのサイズは比
較的大きく、従って使用および作製するのに困難である。さらに、タンパク質は
、酵素的分解に供される。従って、血管形成を阻害する新しい薬剤が必要である
。サイズ、作製の容易さ、安定性および／または力価において改善を示す新しい
血管形成性のタンパク質またはペプチドが、所望される。

【００１２】（発明の要旨）本発明者らは、ＶＥＧＦ₁₆₅の第７エキソンの一部分がすべてのＶＥＧＦアイソフォームに対してアンタゴニストとして作用することを発見した。すべてのＶ
ＥＧＦの形態が第７エキソンを有しているわけではないので、これは驚くべきこ
とである。例えば、本発明者らは、第７エキソンにコードされる４４アミノ酸に
対応するペプチドを含むグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タ
ンパク質、および第８エキソンでコードされるペプチド（ＶＥＧＦ₁₆₅のアミノ酸１１６〜１６０（配列番号１））の第一システインを調製した。この融合タン
パク質は、ヒト臍帯静脈由来ＥＣ（ＨＵＶＥＣ）および２３１細胞上のレセプタ
ーへの¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅の結合を阻害した。この阻害活性は、第７エキソンコ
ードドメイン（アミノ酸２２〜４４）のＣ末端部分に局在化していた。さらに、
この融合タンパク質は、ＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ誘導化増殖を阻害した。この融合
タンパク質はまた、ＶＥＧＦ₁₂₁誘導化分裂促進性を阻害し、これはＶＥＧＦ₁₂₁ が第７エキソンを含まないことを考慮すると、予期せぬ結果であった。従って、
本発明のポリペプチドは、ＶＥＧＦの主要なアイソフォームに対するアンタゴニ
ストであり、そしてＶＥＧＦ誘発性の新血管新生または血管形成に関連する疾患
および状態の処置に用いられ得る。

【００１３】さらに、理論によって拘束されることを望まないが、ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ₁₆ ₅ Ｒ／ＮＰ−１を発現する多くの癌と直接関連しており（Ｓｏｋｅｒら、Ｃｅｌｌ９２，７３５〜７４５（１９９８））、そしてこのレセプターに対するＶＥＧ
Ｆ結合の阻害がこのような癌の処置に用いられ得ると考えられる。

【００１４】本発明は、例えば、以下の実施例に記載するようにＶＥＧＦ₁₆₅を用いるヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）増殖アッセイによって、決定されたように、Ｖ
ＥＧＦアンタゴニスト活性を有する配列番号１の一部分を有するポリペプチドを
提供する。好ましくは、この一部分は、ＨＵＶＥＣ増殖の少なくとも２５％の減
少、より好ましくは５０％の減少、さらにより好ましくは７５％の減少、最も好
ましくは９５％の減少を有する。好ましくは、この一部分は、多くのシステイン
残基さえ有する。

【００１５】ＶＥＧＦアンタゴニスト活性はまた、Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２７１、５７６１〜５７６７（１９９６）に開示され、そして以下の実施例に
示されるように、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒに対する標識されたＶＥＧＦ₁₆₅の結合の阻害に
よって決定され得る。好ましくは、この一部分は、結合を少なくとも２５％、よ
り好ましくは５０％、最も好ましくは７５％阻害する。

【００１６】本発明はさらに、例えば、以下の実施例に記載するようにＶＥＧＦ₁₆₅を用いるヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）増殖アッセイにより決定されるように、
ＶＥＧＦアンタゴニスト活性を有する配列番号２（ＣＳＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡＲ
ＱＬＥＬＮＥＲＴＣＲＣ）を含むポリペプチド、またはその一部分を提供する。
好ましくは、この一部分は、ＨＵＶＥＣ増殖において、少なくとも２５％減少、
より好ましくは５０％減少、さらにより好ましくは７５％減少、最も好ましくは
９５％の減少を有する。好ましくは、この一部分は、多くのシステイン残基さえ
有する。

【００１７】本発明の１つの好ましいポリペプチドは、以下の式（Ｉ）の構造を有する：（Ｘ₁−（ＣＳＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱＬＥＬＮＥＲＴ（配列番号３））−Ｘ₂ ）Ｉ：ここで、Ｘ₁は、Ｈまたは配列番号１のアミノ酸２〜２１の任意の部分である。例えば、配列番号１のアミノ酸３〜２１、４〜２１、５〜２１、６〜２１など。
そしてＸ₂は、ＨまたはＣ、ＣＲ、ＲＣまたはＣＲＣである。式（Ｉ）のポリペプチドは、例えば、以下の実施例に記載するようにＶＥＧＦ₁₆₅を用いるヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）増殖アッセイによって、決定されるように、ＶＥ
ＧＦアンタゴニスト活性を有する。好ましくは、このポリペプチドは、ＨＵＶＥ
Ｃ増殖において、少なくとも２５％減少、より好ましくは５０％減少、さらによ
り好ましくは７５％減少、最も好ましくは９５％の減少を有する。好ましくは、
このポリペプチドは、多数のシステイン残基さえ有する。式（Ｉ）のポリペプチ
ドはアナログを含む。

【００１８】「アナログ」とは、本発明のペプチドのうちの１つの配列と異なるポリペプチ
ドであるが、以下の実施例に記載するようにＶＥＧＦ₁₆₅を用いるヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）増殖アッセイにおいて、配列番号２のポリペプチドの少
なくとも５０％のＶＥＧＦアンタゴニスト活性をなお示すポリペプチドをいう。
好ましくは、このアナログは、配列番号２のポリペプチドのＶＥＧＦアンタゴニ
スト活性の７５％、最も好ましくは９５％を示す。差異は好ましくは保存的アミ
ノ酸置換であり、ここでアミノ酸は、同様の特徴の別の天然に存在するアミノ酸
と置きかえられる。例えば、以下の置換が「保存的」であると考えられる：Ｇｌ
ｙ←→Ａｌａ；Ｖａｌ←→Ｉｌｅ；Ａｓｐ←→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ←→Ａｒｇ；Ａｓ
ｎ←→Ｇｌｎ；およびＰｈｅ←→Ｔｒｐ←→Ｔｙｒ。非保存的変化は、一般に異
なる群からのアミノ酸での上記のアミノ酸の１つの置換（例えば、ＧｌｕをＡｓ
ｎで置換）または、上記アミノ酸のいずれかをＣｙｓ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓもしくは
Ｐｒｏで置換することである。

【００１９】好ましい形態では、本発明のポリペプチドは、融合タンパク質の一部であるか
、あるいは精製度をあげるため、安定性を増すため、および／または生物学的活
性を提供する部分に結合している。

【００２０】別の実施態様では、本発明のポリペプチド（単独でも融合タンパク質の一部と
してのいずれでも）は、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１を発現する標的細胞に用いられる。この標的化は、診断のためにおよび治療的適用のために用いられ得る。例
えば、診断目的で、このポリペプチドは放射線標識され、そしてＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１を発現する細胞を検出するために用いられる。本発明者らは、このレ
セプターの発現が前立腺癌および乳癌、特に転移性癌のような多くの癌において
疾患状態に高い相関を有していることを発見した。従って、さらなる実施態様に
おいて、このポリペプチドは、特定の癌について予知的な様式で用いられ得る。

【００２１】治療的適用のために、このポリペプチドは、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１を発現する細胞に薬剤を送達するために用いられ得る。例えば、このポリペプチドは、
細胞へ所望の化学的または細胞傷害性部分を送達するためにキャリアとして用い
られ得る。この細胞傷害性部分は、細菌、真菌もしくは植物起源の細胞傷害性薬
物または酵素的に活性な毒素、あるいはこのような毒素の酵素的に活性なポリペ
プチド鎖またはフラグメント（「Ａ鎖」）であり得る。酵素的に活性な毒素およ
びそれらのフラグメントが好ましく、そしてジフテリア毒素Ａフラグメント、ジ
フテリア毒素の非結合性活性フラグメント、外毒素Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、Ａリッチ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、アルファサルシン（ａｌｐｈａｓａｒｃｉｎ）、特定のＡｌ
ｅｕｒｉｔｅｓｆｏｒｄｉｉタンパク質、特定のＤｉａｎｔｈｉｎタンパク質
、Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａｃｈａｒａｔｉａインヒビター、カルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、Ｓａｐｏｎａｒｉａｏ
ｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン
（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、
フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、およびエノマイシン（ｅｎｏｍｙｃ
ｉｎ）により例示される。ＲｉｃｉｎＡ鎖、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素ＡおよびＰＡＰが好ましい。

【００２２】本発明は、ＶＥＧＦ誘導性の新血管新生または血管形成に関連する疾患または
障害／状態を処置する方法をさらに提供する。本明細書において用いられる、用
語「新血管新生」は、血管および毛細血管の増殖をいう。ＶＥＧＦ誘導性の新血
管新生または血管形成に関連する疾患、障害または状態としては、網膜の新血管
新生、血管腫（ｈｅｍａｇｉｏｍａ）、固体癌増殖、白血病、転移、乾癬、血管
新生緑内障、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、変形性関節症、子宮内膜症、
筋変性、および未熟児網膜症（ＲＯＰ）が挙げられるがこれらに限定されない。

【００２３】本発明の方法において、本発明のポリペプチドの治療量は、ＶＥＧＦに関連す
る疾患もしくは状態を有するか、またはＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１を発現する腫瘍を有する宿主（例えば、ヒトまたは他の哺乳動物）に投与される。ＶＥＧＦ₁₆ ₅ Ｒ／ＮＰ−１の発現を検出するための方法は、Ｓｏｋｅｒら、Ｃｅｌｌ９２：７３５〜７４５（１９９８）に記載されている。

【００２４】本発明はまた、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせた本発明のポリペプ
チドの有効量を含む組成物を提供する。

【００２５】本発明の他の局面は、以下に開示される。

【００２６】（発明の詳細な説明）本発明は、ＶＥＧＦアンタゴニスト活性を有する単離されたポリペプチド、ペ
プチドをコードする核酸、このポリペプチドおよび核酸を含む薬学的組成物、な
らびにＶＥＧＦに関連する疾患および障害（例えば、血管形成を誘導するＶＥＧ
Ｆ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１およびＶＥＧＦを発現する腫瘍）を処置するための方法を提供する。本発明のポリペプチドは、上記の、ＶＥＧＦアンタゴニスト活性を有す
る配列番号１の一部を含有するポリペプチド、ＶＥＧＦアンタゴニスト活性を有
する配列番号２（ＣＳＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣＲＣ）または
その一部を含有するポリペプチド、および式（Ｉ）の構造を有するポリペプチド
を含む。本発明はさらに、ＶＥＧＦアンタゴニスト活性を有するこれらのポリペ
プチドのアナログおよび誘導体を含む。エキソン７およびエキソン８をコードす
るＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号１７および１８として配列リストに記載され
る。

【００２７】ＶＥＧＦアンタゴニスト活性は、当該分野で公知の技術を使用して決定され得
る。例えば、ＶＥＧＦアンタゴニスト活性は、アンタゴニストポリペプチドが使
用される場合、野生型のＶＥＧＦ活性を調べ、そしてこのような活性の阻害また
は減少を比較することによって決定され得る。配列番号２のポリペプチドは、基
準として使用され得る。任意のＶＥＧＦ活性を使用し得る。例えば、以下の実施
例に記載されるように、ＶＥＧＦ₁₆₅を使用するヒト臍帯血静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）増殖アッセイを使用し得る。好ましくは、この一部は、ＨＵＶＥＣ
増殖において少なくとも２５％の減少、より好ましくは５０％の減少、さらによ
り好ましくは７５％の減少、最も好ましくは９５％の減少を有する。好ましくは
、この一部は、偶数個のシステイン残基を有する。

【００２８】ＶＥＧＦアンタゴニスト活性はまた、Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２７１、５７６１〜５７６７（１９９６）において開示され、そして以下の
実施例に記載されるように、標識されたＶＥＧＦ₁₆₅のＶＥＧＦ₁₆₅Ｒに対する結
合の阻害によって決定され得る。好ましくは、この一部は少なくとも２５％、よ
り好ましくは５０％、最も好ましくは７５％まで結合を阻害する。

【００２９】血管形成に影響を与えるためのＶＥＧＦアンタゴニストポリペプチドの能力は
また、多くの公知のインビボおよびインビトロアッセイを使用して決定され得る
。このようアッセイは、Ｊａｉｎら、ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ３、１
２０３〜１２０８（１９９７）に開示され、この開示は本明細書中で参考として
援用される。例えば、インビボで血管形成を阻害する能力に対するアッセイは、
ニワトリ絨毛尿膜アッセイおよびマウス、ラットまたはウサギ角膜嚢（ｃｏｒｎ
ｅａｌｐｏｃｋｅｔ）アッセイを含む。Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉら、１９９１、Ｍ
ｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ. １９８：４４０〜４５０を参照のこと。角膜嚢アッセイに従って、選択される腫瘍は、角膜嚢の形で試験動物の角膜内に移植
される。可能性のある血管形成インヒビターは、角膜嚢に適用され、そして角膜
嚢は慣用的に新血管新生について検査される。

【００３０】本明細書中で使用されるように、ＶＥＧＦアンタゴニストポリペプチドの「誘
導体」は、１以上の物理的、化学的、または生物学的な特性が変化しているポリ
ペプチドである。このような改変は、以下：アミノ酸置換、修飾、付加または欠
失；脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、グリコシル化またはリン酸化のパターン
における変化；他の有機分子および非有機分子と、ポリペプチド中に存在するア
ミノ酸残基の遊離のアミノ側鎖、カルボキシル側鎖、またはヒドロキシル側鎖と
の反応；および他の修飾（これらのいずれかは、一次構造、二次構造、または三
次構造の変化を生じ得る）を含むがこれらに限定されない。さらにこのような誘
導体は、上述のＶＥＧＦアンタゴニスト活性の少なくとも一つを示す。

【００３１】本発明のポリペプチドは、好ましくは組換え方法によって産生される。以下の
実施例１に開示される手順を参照のこと。広範な多様な分子学的および生化学的
方法が、本発明のポリペプチドを生成し、そして発現するために利用可能である
。例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔ
ｉｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏ
ｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｆｕｂｅｌ、Ｂｒ
ｅｎｔ、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、Ｍｏｒｅ、Ｆｅｉｄｍａｎ、ＳｍｉｔｈおよびＳｔ
ｕｈｌ編、ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｓｔｅｒ
ｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ、Ｎ．Ｙ．１９９２）に開示される手順またはそうでなく
ても当該分野で公知な他の手順を参照のこと。例えば、本発明のポリペプチドは
、化学合成、Ｅ．Ｃｏｌｉのような細菌および酵母のような真核生物における発
現、バキュロウイルスまたは哺乳動物細胞に基づく発現系などによって得られ得
、ポリペプチドの大きさ、性質および量に依存する。

【００３２】用語「単離された」は、ポリペプチドがその元の環境（例えば、天然ＶＥＧＦ
分子）から取り除かれることを意味する。例えば、天然に存在するポリヌクレオ
チドまたはポリペプチドは、単離されていない生きている動物中に存在するが、
天然の系において、いくつかのまたは全ての共存する物質から分離されている同
一のポリヌクレオチドまたはＤＮＡまたはポリペプチドは、単離されている。こ
のようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得、および／またはこのよ
うなポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは、組成物の一部であり得、そして
さらにこのようなベクターまたは組成物がその天然の環境の一部ではないように
単離される。

【００３３】本発明のポリペプチドを発現することが所望される場合、任意の適切な系が使
用され得る。適切なベクターの一般的な性質、発現ベクターおよびそれに対する
構築物は、当業者に明らかである。

【００３４】適切な発現ベクターは、ファージまたはプラスミドに基づき得、これらはしば
しば他の宿主に設計され得るが、これらの両方は一般に宿主特異的である。他の
適切なベクターは、コスミドおよびレトロウイルス、ならびに任意の他のウイル
スを含み、これらは所定の系に対して特異的であり得るか、または特異的であり
得ない。コントロール配列（例えば、認識配列、プロモータ配列、オペレータ配
列、インデューサ配列、ターミネータ配列および発現の調節に必須な、および／
または有用な他の配列）は、当業者に容易に明らかである。

【００３５】ヌクレオチド配列の適切な調製は、例えば、Ｓａｎｇｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：５４６３〜７（１９７７））の方法に
よって確認され得る。

【００３６】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメント、レセプターまたはそ
のフラグメントは、適切なベクター中に容易に挿入され得る。理想的に、受容ベ
クターは、リーディングフレームおよび挿入の位置にわたって不確実性を誘導し
得るが、挿入の容易さのために適切な制限部位を有し、例えば、用いられ得る平
滑末端ライゲーションを有さない。このような例において、発現について形質転
換株を試験することは当然のことであり、この６中の１は、適切なリーディング
フレームを有するべきである。適切なベクターは、所望の発現系に従って、当業
者によって選択され得ることは当然のことである。

【００３７】適切な生物または好ましくは、アンピシリンを有する形質転換株を選択し、得
られるプラスミドを有する真核細胞株（例えば、ＨｅＬａ）を形質転換すること
によって、または必要であれば他の適切な手段、および必要であればトリプトフ
ァンまたは他の適切なプロモータインデューサ（例えば、インドールアクリル酸
）を添加することによって、所望のポリペプチドまたはタンパク質が発現され得
る。発現の程度は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
（Ｌｅｍｅｌｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８０〜６８５（１９７０））によ
って分析し得る。

【００３８】増殖および形質転換する培養物などについて適切な方法は、通常、例えば、Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ＡＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙＮｏｔｅｂｏｏｋ、Ｍａｎｉａｔｉｓら（編）、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））に例証される。

【００３９】ポリペプチドまたはタンパク質の産生のための有用な培養物は、適切には任意
の生細胞の培養物であり得、そして原核生物発現系から真核生物発現系まで変化
し得る。一つの好ましい原核生物系は、その操作の容易さのためにＥ．Ｃｏｌｉ
の系である。しかし、真核タンパク質の発現のために、哺乳動物細胞株のような
より高度の系を使用することもまた可能である。一過性の発現のための現在好ま
しい細胞株には、ＨｅＬａ細胞株およびＣｏｓ細胞株である。他の発現系として
は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株およびバキュロウイルス系が
挙げられる。

【００４０】使用され得る他の発現系には、例えば、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ、およ
び酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｓｐｐ．特にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）が挙げられる。任意の系は、所望されるように使用され得、一般にオペ
レータによって要求されるものに依存する。適切な系をまた使用しても、遺伝的
物質を増幅し得るが、一般にＤＮＡの増殖のみが要求される場合、この目的のた
めにＥ．ｃｏｌｉを使用することが都合よい。

【００４１】これらのポリペプチドおよびタンパク質は、発酵または細胞培養物から単離さ
れ得、以下を含む任意の種々の従来の方法を使用して精製され得る：ＨＰＬＣ、
ＦＰＬＣなどを使用する液体クロマトグラフィー(例えば、順相または逆相）；アフィニティークロマトグラフィー（例えば、無機リガンドまたはモノクローナ
ル抗体を用いて)；サイズ排除クロマトグラフィー；固定化金属キレートクロマトグラフィー；ゲル電気泳動；など。当業者は、本発明の範囲から逸脱すること
なしに、最も適切な単離および精製技術を選択し得る。

【００４２】これらのポリペプチドはまた、任意のいくつかの化学的技術によって生成され
得る。例えば、これらは、本来Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、「Ｓｏｌｉｄ
ＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉ．ＴｈｅＳｙｎｔｈｅ
ｓｉｓＯｆＡＴｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ
．、８３、２１４９〜５４頁（１９６３）によって記載された固相合成技術を使
用して調製され得、またはこれらは溶液中の合成によって調製され得る。ペプチ
ド合成技術の概要は、Ｅ．ＧｒｏｓｓおよびＨ．Ｊ．Ｍｅｉｎｈｏｆｅｒ、４
ＴｈｅＰｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ；ＭｏｄｅｒｎＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓＯｆＰｅｐｔｉｄｅＡｎｄ
ＡｍｉｎｏＡｃｉｄＡｎａｌｙｓｉｓ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙおよびＳｏ
ｎｓ、（１９８１）ならびにＭ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ＯｆＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ
（１９８４）において見出され得る。

【００４３】上記で議論されるように、処置の一つの方法は、ペプチドに対する適切な毒素
の吸着に次いで、腫瘍の範囲を標的することを包含する。このような毒素は、当
該分野で周知であり、そして有毒な放射性同位体、重金属、酵素および補体活性
化剤ならびに１細胞あたり１または２分子のみのレベルで作用し得るリシンのよ
うな天然毒素を含み得る。このような技術を、例えば癌を処置するために使用さ
れ得る適切な薬学的に活性な化合物の局在された用量を送達するために使用する
ことはまた、可能であり得る。

【００４４】本発明が、例えば、患者に対するペプチドの投与のために提供される場合、次
いでこれは任意の適切な経路によってなされ得る。腫瘍がさらに局在される（ま
たは診断される）と考えられる場合、次いで投与の適切な方法は、その部位に直
接注射することによってなされ得る。投与はまた、皮下の、筋内の、静脈内の、
および皮内の注射を含む注射によってなされ得る。

【００４５】処方物は、投与の経路に適切である任意のものであり得、そして当業者に明白
である。この処方物は、適切なキャリア（例えば生理食塩水）を含み得、そして
またバルク剤、他の医学的製剤、アジュバントおよび任意の他の適切な薬学的材
料を含み得る。カテーテルは、投与の別の好ましい様式である。

【００４６】用語「有効量」とは、検出可能な治療的効果を示すために十分なＶＥＧＦアン
タゴニストポリペプチドまたはこのポリペプチドをコードする核酸の量をいう。
この治療的効果は、例えば、所望されない組織または悪性細胞の増殖を阻害する
こと、不適切な血管形成（新血管新生)を阻害すること、慢性の炎症によって生じる組織の損傷を制限すること、腫瘍細胞の増殖の阻害などを、限定されること
なく含み得る。被験体に対する正確な有効量は、被験体の大きさおよび健康、処
置されるための条件の性質および重篤度などに依存する。従って、あらかじめ正
確な有効量を特定することは不可能である。しかし、与えられた状態における有
効量は、本明細書中で提供される情報に基づく慣習的な実験によって決定され得
る。

【００４７】用語「薬学的に受容される」とは、過度の毒性なしに哺乳動物に投与され得る
化合物および組成物をいう。例示的な薬学的に受容される塩には、塩酸塩、臭化
水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などのような無機酸塩；および酢酸塩、プロピオン
酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などのような有機酸塩が挙げられる。

【００４８】ＶＥＧＦアンタゴニストポリペプチドは、経口的、局所的、または皮下注射お
よび筋内注射、持続性の放出貯蔵物の移植、静脈注射、鼻腔内投与などを含む非
経口的な手段によって投与される。従って、ＶＥＧＦアンタゴニストは、薬学的
に受容されるキャリアと組み合わせて、ＶＥＧＦアンタゴニストを含む薬学的組
成物として投与され得る。このような組成物は、水溶液、エマルジョン、クリー
ム、軟膏、懸濁液、ゲル、リポソーム懸濁液などであり得る。適切なキャリア（
賦形剤）には、水、生理食塩水、Ｒｉｎｇｅｒ溶液、ブドウ糖溶液、およびエタ
ノール、グルコース、スクロース、デキストラン、マンノース、マンニトール、
ソルビトール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リン酸塩、酢酸塩、ゼラチ
ン、コラーゲン、ＣａｒｂｏｐｏｌＲｅｇｉｓｔｅｒｅｄＴＭ、植物性油脂
などの溶液が挙げられ得る。さらに、適切な保存薬、安定薬、抗酸化薬、抗菌剤
、および緩衝剤（例えば、ＢＨＡ、ＢＨＴ、クエン酸、アスコルビン酸、テトラ
サイクリン）などが挙げられ得る。処方物に有用なクリームまたは軟膏基剤には
、ラノリン、ＳｉｌｖａｄｅｎｅＲｅｇｉｓｔｅｒｅｄＴＭ（Ｍａｒｉｏｎ
）、ＡｑｕａｐｈｏｒＲｅｇｉｓｔｅｒｅｄＴＭ（ＤｕｋｅＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）などが挙げられる。他の代表的な処方物には、エーロゾル、包帯
、および他の創傷包帯剤が挙げられる。あるいは、ＶＥＧＦアンタゴニストを、
適切なポリマーマトリックスまたは膜に組み込むかまたは被包し得、従って局所
的に処置させるために部位の近傍に移植するのに適切な持続性の放出送達デバイ
スを提供する。他のデバイスには、留置カテーテルおよびＡｌｚｅｔＲｅｇｉ
ｓｔｅｒｅｄＴＭミニポンプのようなデバイスが挙げられる。目の製剤は、Ｓ
ｏｒｂｉ−ｃａｒｅＲｅｇｉｓｔｅｒｅｄＴＭ（Ａｌｌｅｒｇａｎ）、Ｎｅ
ｏｄｅｃａｄｒｏｎＲｅｇｉｓｔｅｒｅｄＴＭ（Ｍｅｒｃｋ、Ｓｈａｒｐ＆
Ｄｏｈｍｅ）、ＬａｃｒｉｌｕｂｅＲｅｇｉｓｔｅｒｅｄＴＭなどのような
市販のビヒクルを使用して処方され得、または米国特許番号第５，１２４，１５
５号（これは、本明細書中で参考として援用される）に記載されるような代表的
な製剤を使用し得る。さらに、ＶＥＧＦアンタゴニストを固形、特に凍結乾燥粉
末として提供し得る。凍結乾燥された処方物には、代表的に、安定化剤またはバ
ルク剤、例えば、ヒト血清アルブミン、スクロース、マンニトールなどが挙げら
れる。薬学的に受容される賦形剤の詳細な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（ＭａｒｋＰｕｂ．Ｃｏ．）
において入手可能である。

【００４９】本発明のアンタゴニストポリペプチドは、局所的または血管内に使用され得る
。局所的な適用について、この処方物は、約１０ｎｇ／ｃｍ²／日から約１ｍｇ／ｃｍ²／日の割合で直接的に適用される。血管内の適用について、このインヒビターは、体重に対して、約１ｍｇ／ｋｇ／日から約１０ｍｇ／ｋｇ／日の割合
で使用される。体内の使用について、この処方物は、移植される緩徐放出（ｓｌ
ｏｗｒｅｌｅａｓｅ）の重合体物質から、または緩徐放出のポンプもしくは反
復注射からのいずれかで処置される領域に直接放出され得る。各々の場合におけ
る放出速度は、約１００ｎｇ／日／ｃｍ³から約１００ｍｇ／日／ｃｍ³である。

【００５０】本発明のＶＥＧＦアンタゴニストポリペプチドは、治療的な有効量の他の分子
と組み合わせられ得、この分子は消極的に血管形成を調節し、この分子はＴＮＰ
−４７０、血小板第４因子、トロンボスポンジン−１、メタロプロテアーゼの組
織インヒビター（ＴＩＭＰ１およびＴＩＭＰ２）、プロラクチン（１６−Ｋｄフ
ラグメント）、アンジオスタチン（プラスミノゲンの３８−Ｋｄフラグメント）
、エンドスタチン、ｂＦＧＦ可溶性レセプター、トランスホーミング増殖因子β
、インターフェロンα、可溶性ＫＤＲおよびＦＬＴ−１レセプターならびに胎盤
の増殖関連タンパク質であり得るがこれらに限定されない。

【００５１】本発明のＶＥＧＦアンタゴニストポリペプチドはまた、化学療法剤と組み合わ
せられ得る。

【００５２】異常な血管形成または新血管新生に関連し、そして本発明の治療的化合物で処
置され得る疾患、障害、または状態には、網膜の新血管新生、腫瘍の増殖、血管
腫（ｈｅｍａｇｉｏｍａ）、固体の腫瘍、白血病、転移、乾癬、血管新生緑内障
、糖尿病性網膜症、関節炎、子宮内膜症、および未熟児網膜症（ＲＯＰ）が挙げ
られるが、これらに限定されない。

【００５３】本発明のＶＥＧＦアンタゴニストポリペプチドをコードする核酸（例えば、Ｄ
ＮＡ）は、当業者に公知な任意の方法によって宿主へ送達されて、ＶＥＧＦに関
連する障害を処置し得る。本発明の好ましい実施態様は、固体の腫瘍の血管形成
を阻害して、さらなる腫瘍の増殖および結果として生じる転移を予防する方法に
関する。この目的のために、遺伝子トランスファーしやすい任意の固体の腫瘍ま
たは腫瘍の周囲の領域が、開示された治療的適用の標的となり得る。本発明のＶ
ＥＧＦアンタゴニストポリペプチドまたはその誘導体もしくはそのアナログをコ
ードする、組換えウイルスまたは非ウイルスに基づく遺伝子トランスファー系内
に格納されるＤＮＡは、当該分野で公知のいくつかの手順によって腫瘍の近傍内
の標的細胞に配向され得る。これらの手順には、（ａ）有効量のＤＮＡを腫瘍中
の部位またはその周囲に対して投与することと組み合わせた外科的手順（可能で
あれば、腫瘍の一部または全体の最初の除去を含む）；（ｂ）腫瘍部位内または
近傍に対する直接的な遺伝子転移ビヒクルの注射；および（ｃ）当該分野で公知
の技術を使用する、遺伝子転移系ベクターおよび／または遺伝子産物の局所的ま
たは全身的送達が挙げられるがこれらに限定されない。

【００５４】従って、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１もしくはＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／Ｎ
Ｐ−２発現細胞を含む任意の固体の腫瘍は、処置について可能性のある標的であ
る。遺伝子治療の適用に対して特に攻撃されやすい固体の腫瘍の例には、以下が
挙げられるが決して限定として列挙するものではない（ａ）中枢神経系の新生物
（例えば、神経膠芽細胞腫、星状細胞腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脳室上衣細胞
腫、しかしここでも限定される必要はない）；（ｂ）ホルモン依存性である癌（
インサイチュ癌、上皮内癌、髄様癌、管状腺癌、浸潤（ｉｎｖａｓｉｖｅ）（浸
潤（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ）癌および粘液性癌腫を含むがこれらに限定され
ない前立腺、精巣、子宮、頸、卵巣、乳癌のような組織）；（ｃ）黒色腫（癌お
よび眼の黒色腫を含むがこれらに限定されない）；（ｄ）少なくとも扁平上皮細
胞癌腫、紡錘体癌（ｓｐｉｎｄｌｅｃａｒｃｉｎｏｍａ）、小細胞癌、腺癌お
よび大細胞癌を含む肺の癌；ならびに（ｅ）胃腸系（例えば、少なくとも大腸の
腺癌を含む食道、胃、小腸、結腸、結腸直腸、直腸および肛門領域）の癌。

【００５５】発現ベクターは、本明細書中で、適切な宿主において遺伝子のクローン化され
たコピーの転写およびこれらのｍＲＮＡの翻訳について要求されるＤＮＡ配列と
して規定される。このようなベクターを使用して、種々の宿主（例えば、細菌、
藍藻、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞）において真核
生物の遺伝子を発現し得る。

【００５６】特異的に設計されたベクターは、宿主間（例えば、細菌−酵母細胞または細菌
−動物細胞または細菌−昆虫細胞）のＤＮＡのシャトルを可能にする。適切に構
築された発現ベクターには、以下：宿主細胞において自律増殖に対する複製起点
、選択マーカー、限定数の有用な制限酵素部位、高いコピー数に対する可能性、
および活性なプロモーター、を含むべきである。プロモーターは、ＤＮＡに結合
し、そしてＲＮＡ合成を開始するためのＲＮＡポリメラーゼに配向するＤＮＡ配
列として定義される。強力なプロモーターは、高頻度で開始されるｍＲＮＡを生
じるものである。

【００５７】発現ベクターには、クローニングベクター、改変されたクローニングベクター
、特異的に設計されたプラスミドまたはウイルスが挙げられ得るがこれらに限定
されない。

【００５８】種々の哺乳動物の発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞における組換えＶＥ
ＧＦアンタゴニストを発現し得る。市販されている哺乳動物の発現ベクターは、
組換え発現について適切であり得、以下：ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ）、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＬＩＴＭＵＳ
２８、ｐＬＩＴＭＵＳ２９、ｐＬＩＴＭＵＳ３８およびｐＬＩＴＭＵＳ３９（Ｎ
ｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡｌａｍｐ
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１
ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ
５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３
）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅ
ｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１
９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣ
Ｃ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）、ならびに？ＬＺＤ３５
（ＡＴＣＣ３７５６５）を含むがこれらに限定されない。

【００５９】本発明のＶＥＧＦアンタゴニストをコードするＤＮＡはまた、組換え宿主細胞
中の発現に対する発現ベクター内でクローン化され得る。組換え宿主細胞は、原
核生物または真核生物（細菌、酵母、哺乳動物細胞（ヒト、ウシ、ブタ、サルお
よび齧歯類起源の細胞株を含むがこれらに限定されない）、ならびに昆虫細胞（
細胞株由来のショウジョウバエ（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ガ、カおよびヨトウ
ムシ（の幼虫：ａｒｍｙｗｏｒｍ）を含むがこれらに限定されない））を含み得
るがこれらに限定されない。この発現ベクターは、多くの技術の任意の一つ（形
質転換、トランスフェクション、Ａｄ／ポリリジンＤＮＡ複合体、プロトプラス
ト融合、およびエレクトロポレーションを含むがこれらに限定されない)によって宿主細胞内に導入され得る。哺乳動物種由来の細胞株（これは適切であり得、
そして市販されている）には、以下の細胞、ＣＶ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ７０）
、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣＣＲＬ１
６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＣＬ
９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ２）、Ｃ１２７１（ＡＴＣＣＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣ
ＣＣＣＬ２６）およびＭＲＣ−５（ＡＴＣＣＣＣＬ１７１）ならびにＨＥＫ
２９３細胞が挙げられるがこれらに限定されない。昆虫細胞株（これは適切であ
り得、そして市販されている）には、３Ｍ−Ｓ（ＡＴＣＣＣＲＬ８８５１）、
ガ（ＡＴＣＣＣＣＬ８０）、カ（ＡＴＣＣＣＣＬ１９４および１９５；ＡＴ
ＣＣＣＲＬ１６６０および１５９１）ならびにヨトウムシ（Ｓｆ９、ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１７１１）が挙げられるがこれらに限定されない。

【００６０】ＶＥＧＦアンタゴニストポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントは、ウ
イルスまたは非ウイルスに基づく方法により、全身的にか、または哺乳動物宿主
の固形腫瘍の近傍にある標的細胞のいずれかに送達され得る。本発明において利
用され得るウイルスベクター系は、（ａ）アデノウイルスベクター；（ｂ）レト
ロウイルスベクター；（ｃ）アデノ関連ウイルスベクター；（ｄ）単純ヘルペス
ウイルスベクター；（ｅ）ＳＶ４０ベクター；（ｆ）ポリオーマウイルスベクタ
ー；（ｇ）パピローマウイルスベクター；（ｈ）ピコルナウイルス（ｐｉｃａｒ
ｎｏｖｉｒｕｓ）ベクター；および（ｉ）ワクシニアウイルスベクターを含むが
、これらに限定されない。

【００６１】本発明のＶＥＧＦアンタゴニストをコードするＤＮＡを含む組換えウイルスま
たは組換えベクターは、固形腫瘍および／または固形腫瘍に近接する静態組織（
例えば、脂肪組織または筋肉組織）内への直接注射により、宿主に好ましくは投
与される。腫瘍細胞を標的化された脂肪細胞および筋肉細胞の領域中にトランス
フェクトすることは、もちろん有用である。これらの周辺細胞におけるＶＥＧＦ
アンタゴニストの一過性の発現は、これらのペプチドの局所的な細胞外増加を生
じ、そしてＶＥＧＦレセプターとの結合を促進し、従ってそのレセプターへのＶ
ＥＧＦの結合を阻害する。

【００６２】また適切である非ウイルスベクターは、ＤＮＡ−脂質複合体、例えば、アシア
ログリコプロテイン媒介送達系のようなリポソーム−媒介結合体またはリガンド
／ポリ−Ｌ−リシン結合体を含む（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９９４、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０−２５６１；Ｄｅｒｏｓｓｉら、１９９
５、Ｒｅｓｔｏｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓ．８：７−１０；およびＡｂｃ
ａｌｌａｈら、１９９５、Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ８５：１−７を参照のこと）。

【００６３】本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分で満たされた１つ以上
の容器を含む、薬学的パックまたはキットを提供する。必要に応じて薬学的もし
くは生物学的製品の製造、使用または販売の行政機関規制により規定される形態
での注意書きが、そのような容器に付随し得、その注意書きは、ヒト投与物に対
する製造、使用または販売についての行政機関による認可を反映した注意書きで
ある。

【００６４】本願を通して引用された参考文献は、本明細書中で参考として援用される。

【００６５】本発明は、以下の実施例によりさらに例示される。これらの実施例は、本発明
の理解を補助するために提供され、そしてその制限としては解釈されない。

【００６６】（実施例１）（実験手順）（材料）ヒト組換えＶＥＧＦ₁₆₅およびＶＥＧＦ₁₂₁を、以前に記載されたように（Ｓｏ
ｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、５７６１−５７６７（１９９６
）、Ｃｏｈｅｎら、ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ、７、１３１−１３８（１９
９２））、ヒトＶＥＧＦ₁₆₅またはＶＥＧＦ₁₂₁をコードする組換えバキュロウイ
ルスで感染させたＳｆ−２１昆虫細胞において産生した。ＶＥＧＦ₁₆₅を、感染されたＳｆ−２１細胞の馴化培地からヘパリンアフィニティークロマトグラフィ
ーにより精製し、そしてＶＥＧＦ₁₂₁を陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。塩基性ＦＧＦは、ＪｕｄｉｔｈＡｂｒａｈａｍ博士（Ｓｃｉｏｓ、
Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）の御厚意により提供された。細胞培養培地をＬｉｆ
ｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．より購入した。¹²⁵Ｉ−ナトリウムをＮＥＮＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅＰｒｏｄｕｃｔｓより購入した。ジスクシ
ニミジルスベリン酸塩（Ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｓｕｂｅｒａｔｅ）お
よびＩＯＤＯ−ＢＥＡＤＳをＰｉｅｒｃｅより購入した。Ｇ−グルタチオンアガ
ロース、ＮＡＰ−５カラム、およびｐＧＥＸ−２ＴＫプラスミドをＰｈａｒｍａ
ｃｉａＢｉｏｔｅｃｈＩｎｃ．より購入した。ＴＳＫ−ヘパリンカラムをＴ
ｏｓｏＨａｓｓ（Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）より購入した。分子量マーカーをＡ
ｍｅｒｓｈａｍＣｏｒｐ．（ＩＬ）より購入した。ブタ腸粘膜由来ヘパリンを
Ｓｉｇｍａより購入した。

【００６７】（細胞培養）ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌ
ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（ＲｏｃｋｖｉｌｌｅＭＤ）よ
り入手し、そしてゼラチン被覆ディッシュ上で、２０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）
ならびにグルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシンの混合物（ＧＰＳ
）を含有するＭ−１９９培地中で増殖させた。塩基性ＦＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）を
一日おきに培養培地に添加した。親の、およびＫＤＲ／Ｆｌｋ−１（ＰＡＥ−Ｋ
ＤＲ）を発現するようトランスフェクトされたブタ内皮細胞（ＰＡＥ）は、Ｌｅ
ｍａＣｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈ博士の御厚意により提供され、そしてこれ
を記載されたように１０％ＦＣＳおよびＧＰＳを含有するＦ１２培地において増
殖させた（Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９、
２６９８８−２６９９５（１９９４））。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（２３１）細胞
をＡＴＣＣより入手し、そして１０％のＦＣＳおよびＧＰＳを含有するダルベッ
コ（Ｂｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ）変法イーグル培地で増殖した。

【００６８】（内皮細胞増殖アッセイ）ＨＵＶＥＣを、ゼラチン被覆９６ウェルディッシュにおいて、４，０００細胞
／２００Ｕｌ／ウェルの濃度で５％ＦＣＳおよびＧＰＳを含有するＭ−１９９中
に播種した。２４時間後、ＶＥＧＦアイソフォームおよびＶＥＧＦエキソン７−
ＧＳＴ融合タンパク質を同時にウェルに添加した。この細胞を７２時間インキュ
ベートし、そして［３Ｈ］チミジン（１μＣ／ｍｌ）を１０〜１２時間添加した
。培地を吸引し、そしてこの細胞をトリプシン処理し、そして自動セルハーベス
ター（ｃｅｌｌｈａｒｖｅｓｔｅｒ）（ＴＯＭＴＥＣ）により採集し、そして
フィルターマット（Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｓ）（Ｗａｌｌａｃ）にのせた。フィル
ターマットをスキャンし、そしてカウント毎分（ｃｐｍ）をＭｉｃｒｏＢｅｔａ
計数器（Ｗａｌｌａｃ）により測定した。結果は、３連でアッセイされたサンプ
ルの平均を表し、そして標準偏差（ｓｔａｎｄａｒｄｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ）
を決定した。全ての実験は少なくとも３回繰り返され、そして同様の結果が得ら
れた。

【００６９】（ＶＥＧＦの放射性ヨウ素結合）ＶＥＧＦ₁₆₅およびＶＥＧＦ１２１の放射性ヨウ素結合を、ＩＯＤＯ−ＢＥＡＤＳを使用し、製造業者の指示に従って実施した。簡潔には、１つのＩＯＤＯ−
ＢＥＡＤを１００μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）でリンスし、
乾燥させ、そして１００μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）中で¹² ⁵ Ｉ−ナトリウム（０．２ｍＣｉ／μｇタンパク質）と共に５分間室温でインキュベートした。ＶＥＧＦ（１〜３μｇ）を反応混合物に添加し、そして５分後に
、ビーズを除去することによりその反応を停止した。¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦを含有する溶液を２ｍｇ／ｍｌゼラチンに調整し、そして２ｍｇ／ｍｌゼラチンを含有す
るＰＢＳで予め平衡したＮＡＰ−５カラムを使用するサイズ排除クロマトグラフ
ィーにより精製した。ヨウ素化タンパク質のアリコートをドライアイスで凍結し
、そして−８０℃に保存した。その比活性は４０，０００〜１００，０００ｃｐ
ｍ／ｎｇタンパク質の範囲であった。

【００７０】（¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦの結合および架橋） ¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅および¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₂₁を使用する結合ならびに架橋実
験を以前に記載されたように実施した（Ｇｉｔａｙ−Ｇｏｒｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．、２８７、６００３−６０９６（１９９２）、Ｓｏｋｅｒら、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、５７６１−５７６７（１９９６））。ＶＥＧ
Ｆ結合を、ｙ−計数器（Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｇａｍｍａ５５００）における細胞
に付随する放射能を測定することにより定量した。この計数は３つのウェルの平
均を表す。全ての実験は少なくとも３回繰り返され、そして同様の結果が得られ
た。¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ架橋複合体を６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そしてこのゲルをリン光体スクリーンに曝露し、そして２４時間後にＰｈｏｓｐｈｏｒ
Ｉｍａｇｅｒ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）により走査した。引き
続いて、このゲルをＸ線フィルムに曝露した。

【００７１】（ＧＳＴ−ＶＥＧＦエキソン７および８融合タンパク質の調製）ＶＥＧＦのエキソン７および８の異なるセグメントを、以下のプライマーを使
用するヒトＶＥＧＦｃＤＮＡからのポリメラーゼ連鎖反応により増幅した：

【００７２】

【表１】増幅産物をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、そしてプラスミド
ｐ２ＴＫ−エキソン７＋８およびその誘導体を産生するように、ＧＳＴ（Ｓｍｉ
ｔｈら、Ｇｅｎｅ（Ａｍｓｔ．）、８７、３１−４０（１９８８）をコードする
ｐＧＥＫ−２ＴＫベクター（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈＩｎｃ．）
中にクローン化した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（ＤＨ４ａ）をｐ２Ｔ
Ｋ−エキソン７＋８および誘導体で形質転換し、ＧＳＴ融合タンパク質を産生し
た（配列については、図５Ｂを参照のこと）。引き続き、細菌溶解物をグルタチ
オン−アガロースアフィニティ−クロマトグラフィーにより分離した（Ｓｍｉｔ
ｈら、Ｇｅｎｅ（Ａｍｓｔ．）、８７、３１−４０（１９８８））。グルタチオ
ン−アガロースから溶出されたサンプルを、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染
色により分析した。ＧＳＴ融合タンパク質をさらに、記載されるようにＴＳＫ−
ヘパリンカラムに載せた。

【００７３】（結果）（ＨＵＶＥＣに対する、ＶＥＧＦ₁₆₅およびＶＥＧＦ₁₂₁の示差的レセプター
結合および分裂促進活性）ＶＥＧＦ₁₆₅およびＶＥＧＦ₁₂₁は、ＨＵＶＥＣ上で発現されるＶＥＧＦレセプ
ターと相互作用するそれら能力において異なる（Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．、２７１、５７６１−５７６７（１９９６）、Ｇｉｔａｙ−Ｇｏｒｅ
ｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、５５１９−５５２３（１９９６））。
ＶＥＧＦ₁₂₁はＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に結合して２４０−ｋＤａの標識複合体を形成し（図１、レーン２）、一方ＶＥＧＦ₁₆₅はこのサイズの複合体を形成するのに加えて、₁₆₅−１７５ｋＤａのより低分子量の複合体をまた形成する（図１、レーン１）。このアイソフォーム特異的レセプターをＶＥＧＦ₁₆₅レセプター（ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ）と命名した。これらの示差的レセプター結合特性は、ＶＥＧＦ₁ ₆₅ およびＶＥＧＦ₁₂₁が、示差的な分裂促進活性もまた有し得ることを示唆する。従って、ＨＵＶＥＣ増殖を刺激するこの２つのＶＥＧＦアイソフォームの能力
を試験した。ＶＥＧＦ₁₆₅はＶＥＧＦ₁₂₁よりもＨＵＶＥＣに対してより強力な分
裂促進剤であった（図２）。ＶＥＧＦ₁₆₅は１ｎｇ／ｍｌで最大ＤＮＡ合成の半分を刺激し、そして４ｎｇ／ｍｌでの最大刺激は対照に対して８倍の増加を生じ
た。他方、２ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ₁₂₁が最大刺激の半分に必要とされ、そして最大刺激のための２０ｎｇ／ｍｌはＨＵＶＥＣ増殖において、対照に対して４倍
の増加を生じた。従って、ＶＥＧＦ₁₆₅と比較してちょうど２倍のＶＥＧＦ₁₂₁が
、最大刺激の半分を達成するために必要とされ、そしてＶＥＧＦ₁₂₁に誘導される増殖はＶＥＧＦ₁₆₅に誘導されるレベルの約半分で飽和に達する。総合すると、これらの結果は、ＶＥＧＦ₁₂₁と、比較されたＥＣに対するＶＥＧＦ₁₆₅の増強
された分裂促進活性と、ＨＵＶＥＣ上のさらなるレセプター（ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ）に結合するＶＥＧＦ₁₆₅の能力との間に相関が存在し得ることを示唆する。

【００７４】（エキソン７−および８−コードドメインを含有する融合タンパク質は、Ｈ
ＵＶＥＣおよび２３１細胞上レセプターへの¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅の結合を阻害す
る）本発明者らの以前の研究は、ＶＥＧＦ₁₆₅のＶＥＧＦ₁₆₅Ｒへの結合がエキソン
７によりコードされる４４のアミノ酸（ＶＥＧＦアミノ酸１１６〜１５８）（こ
れは、ＶＥＧＦ₁₆₅に存在するが、ＶＥＧＦ₁₂₁には存在しない）により媒介され
ることを示した（Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、５７６１
−５７６７（１９９６））。ＶＥＧＦエキソン７またはＶＥＧＦエキソン７およ
び８によりコードされるペプチドを含有するＧＳＴ融合タンパク質が調製された
。エキソン７に対してＣ末端であるエキソン８によりコードされる６つのアミノ
酸が、融合タンパク質の調製を促進するために含まれたが、いずれにしても結果
に影響を与えなかった（データ示さず）。エキソン７融合タンパク質は、直接的
に２３１細胞上のＶＥＧＦ₁₆₅Ｒに結合する（Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、５７６１−５７６７（１９９６））。それはまた、ＨＵＶＥ
Ｃ上のＫＤＲ／ＦＬＫ−１にではなく、ＨＵＶＥＣ上のＶＥＧＦ₁₆₅Ｒに直接的に結合する（図１、レーン３）。ＨＵＶＥＣ（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１およびＶＥＧ
Ｆ₁₆₅Ｒを両方とも発現する）への¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅の結合、ＰＡＥ−ＫＤＲ細胞（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１のみを発現する（Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９、２６９８８−２６９９５（１９９４））への¹² ⁵ Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅の結合、および２３１細胞（ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒのみ発現する（Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、５７６１−５７６７（１９９
６））への¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅の結合と競合するＧＳＴ−ＶＥＧＦ₁₆₅エキソン７−および８−コードペプチド（ＧＳＴ−Ｅｘ７＆８）の能力を試験した（図
３）。ＧＳＴ−Ｅｘ７＋８の濃度の増加は、¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅のＨＵＶＥＣ
への結合を約８５〜９５％（図３Ａ）、および２３１細胞への結合を９７〜９８
％、著しく阻害した（図３Ｂ）。しかし、この融合タンパク質はＰＡＥ−ＫＤＲ
細胞（これはＶＥＧＦ₁₆₅Ｒを全く発現しない）への¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅の結合を阻害しなかった（図３Ｃ）。ＧＳＴタンパク質単独では２０μｇ／ｍｌの濃度
でさえ、¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅の任意の細胞型への結合において有意な効果を有さ
なかった。総合すると、これらの結合研究は、ＧＳＴ−ＥＸ７＋８が¹²⁵Ｉ− ＶＥＧＦ₁₆₅結合に対して、ＫＤＲではなくＶＥＧＦ₁₆₅Ｒと直接的に相互作用す
ることにより競合することを示唆した。

【００７５】これらの結合実験は、架橋による個々のＶＥＧＦレセプター種への¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦの結合におけるＧＳＴ−Ｅｄ７＋８の効果を分析するために拡大された
（図４）。２３１細胞への¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅の架橋はＶＥＧＦ₁₆₅Ｒを有する標識複合体の形成を生じた（図４、レーン３）。これらの複合体の形成は、１５
μｇ／ｍｌのＧＳＴ−Ｅｘ７＋８の存在下で著しく阻害された（図４、レーン
４）。ＨＵＶＥＣへの¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅の架橋は、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を伴う
、より高分子量の標識複合体、およびＶＥＧＦ₁₆₅Ｒを伴う、より低分子量の標識複合体の形成を生じた（図４、レーン１）。ＧＳＴ−Ｅｘ７＋８は、ＶＥＧ
Ｆ₁₆₅Ｒを含有するＶＥＧＦ₁₆₅−１７５−ｋＤａの標識複合体の形成を著しく阻
害した（図４、レーン２）。他方、融合タンパク質は、ＰＡＲ／ＫＤＲ細胞上の
ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１への¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅の架橋を阻害しなかった（示さず）
。総合すると、（ｉ）ＶＥＧＦ₁₆₅はエキソン４（４０）によりコードされるアミノ酸を介してＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に結合し、（ｉｉ）ＶＥＧＦ₁₆₅はエキソン７によりコードされるアミノ酸を介してＶＥＧＦ₁₆₅Ｒに結合し、そして（ｉｉｉ）ＧＳＴ−Ｅｘ７＋８はＫＤＲではなくＶＥＧＦ₁₆₅Ｒに結合するから（図１および図８）、これらの結果は、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒへの¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅の結合と直接的に整合することにより、ＧＳＴ−Ｅｘ７＋８がＫＤＲ／Ｆｌｋ−１
への¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅の結合をまた間接的に阻害することを示唆した。

【００７６】（エキソン７−コードドメインを伴うコア阻害性領域の局在化）ＧＳＴ−Ｅｘ７融合タンパク質は、４４アミノ酸のエキソン７コードドメイ
ン全体を含む。コア阻害性領域が存在するか否かを決定するため、エキソン７の
Ｎ末端およびＣ末端での欠失が作製され、そしてＨＵＶＥＣへの¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅の結合に対する効果が測定された（図５）。これらの実験において、エキソン８の位置でエキソン７コードドメイン＋システイン残基を含有する融合タン
パク質が、融合タンパク質のＶＥＧＦ部分におけるシステイン残基の数を、等し
く維持するために含まれる。ＧＳＴ−Ｅｘ７融合タンパク質は、２μｇ／ｍｌ
融合タンパク質でＨＵＶＥＣへの¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅の結合を８０％阻害した（
図５）。ＨＵＶＥＣおよび２３１細胞への¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅の結合の阻害はＧ
ＳＴ−Ｅｘ７＋８の結合の阻害と比較された（データ示さず）。最初の１０の
Ｎ末端アミノ酸の欠失（ＧＳＴ−Ｅｘ７ｄ−（１−１０））または２１のＮ末
端アミノ酸の欠失（ＧＳＴ−Ｅｘ７ｄ−（１−２１））は、融合タンパク質の
阻害活性を減少しなかった。実際、１μｇ／ｍｌのＧＳＴ−Ｅｘ７ｄ−（１−
２１）は、同じ濃度のＧＳＴ−Ｅｘ７よりも大きな阻害活性を有した。このこ
とは、エキソン７のアミノ酸１〜２１残基内に阻害活性を干渉する領域が存在し
得ることを示唆する。他方、エキソン７における２２位のシステイン残基の欠失
（ＧＳＴ−Ｅｘ７ｄ（１−２２））は、阻害活性の完全な喪失を生じた。１５
のＣ末端アミノ酸の欠失（ＧＳＴ−Ｅｘ７ｄ−（３０−４４））もまた、阻害
活性の完全な喪失を生じた（図５）。これらの結果は、阻害性のコアがエキソン
７のアミノ酸２２−４４内に見出されることを示した。さらに、エキソン７の位
置２２のシステイン残基（ＶＥＧＦ内のＣｙｓ１３７）は、阻害に必要とされる
特異的な構造を維持するために重要であるように思われる。

【００７７】（ＧＳＴ−Ｅｘ７＋８はＶＥＧＦ₁₆₅誘導のＨＵＶＥＣ増殖を阻害する）ＧＳＴ−Ｅｘ７＋８融合タンパク質によるＫＤＲ／Ｆｌｋ−１へのＶＥＧＦ ₁₆₅ の結合の阻害は、図４に示されるように、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１がＶＥＧＦ分裂促進活性を媒介するため、ＧＳＴ−Ｅｘ７＋８融合タンパク質はＶＥＧＦ₁₆ ₅ の分裂促進性のインヒビターでもまたあり得ることを示唆した（Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９、２６９８８−２６９９５
（１９９４））。ＨＵＶＥＣへの１〜５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ₁₆₅の添加は、増殖率における５．５倍増、２．５ｎｇ／ｍｌでのピークを生じた（図６）。１５
μｇ／ｍｌのＧＳＴ−Ｅｘ７＋８をＶＥＧＦ₁₆₅にさらに添加した場合、ＨＵＶＥＣ増殖は約６０％減少した。同様の様式により調製されたＧＳＴタンパク質
は、２５μｇ／ｍｌでさえも、ＨＵＶＥＣ増殖を阻害せず、この阻害効果が単に
融合タンパク質内のエキソン７＋８コードドメインの存在に起因することを示し
た。エキソン７＋８ペプチドに媒介されるＨＵＶＥＣ上のＶＥＧＦレセプターへ
のＶＥＧＦ₁₆₅の結合の阻害は、ＨＵＶＥＣ増殖阻害と相関すると結論付けられた。

【００７８】（ＧＳＴ−Ｅｘ７＋８はＶＥＧＦ₁₂₁誘導のＨＵＶＥＣ増殖を阻害する）ＧＳＴ−Ｅｘ７＋８は、ＶＥＧＦ₁₆₅誘導の分裂促進性のレベルを、約２倍から、ＶＥＧＦ₁₂₁誘導の分裂促進性のおよそのレベルにまで阻害する（図７）。１５μｇ／ｍｌでＧＳＴ−Ｅｘ７＋８はまた、ＶＥＧＦ₁₂₁媒介のＨＵＶＥＣ増殖を約２倍阻害した。ＶＥＧＦ₁₂₁はエキソン７を含まないことを考慮すると、これは予想外の結果であった。ＶＥＧＦ₁₂₁阻害の性質をより理解するために、ＶＥＧＦレセプターへの¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₂₁の結合におけるＧＳＴ−ＥＸ
７＋８の効果を架橋研究により分析した。ＨＵＶＥＣへの¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₂₁の
架橋は、２４０−ｋＤａの標識複合体（図８、レーン１）（これはＶＥＧＦ₁₂₁ およびＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を含むことが示されている）の形成を生じた（Ｓｏｋ
ｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、５７６１−５７６７（１９９６）
、Ｇｉｔａｙ−Ｇｏｒｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、５５１９−
５５２３（１９９６））これらの複合体の形成は、１５μｇ／ｍｌのＧＳＴ−Ｅ
ｘ７＋８により有意に阻害された（図８、レーン２）。ＧＳＴ−Ｅｘ７＋８
は、おそらくそのＫＤＲ／Ｆｌｋ−１への結合を阻害することにより、ＶＥＧＦ ₁₂₁ 誘導の分裂促進性を阻害すると結論付けられた。

【００７９】（考察）最も大量にあるＶＥＧＦアイソフォームは、ＶＥＧＦ₁₆₅およびＶＥＧＦ₁₂₁で
ある。ＶＥＧＦ生物学の理解の点からの重要な疑問は、これらのアイソフォーム
が生化学特性および生物学的特性において異なるか否かということである。現在
までに、ＶＥＧＦ₁₂₁ではなくＶＥＧＦ₁₆₅は、細胞表面ＨＳＰＧに結合すること
（Ｈｏｕｃｋら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、８、１８０６−１８１４（
１９９１）、Ｈｏｕｃｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４７、２８０３１−
２８０３７（１９９２）、Ｐａｒｋら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ、４、１３
１７−１３２６（１９９３））およびＶＥＧＦ₁₆₅はＶＥＧＦ₁₂₁よりもより強力
なＥＣ分裂促進剤であること（Ｓｍｉｔｈら、Ｇｅｎｅ（Ａｍｓｔ．）、８７、
３１−４９（１９８８））が証明されている（図２）。さらに、本発明者らは最
近、ＶＥＧＦ₁₂₁ではなくＶＥＧＦ₁₆₅に結合するという点で特異的な、ＨＵＶＥ
Ｃ、および腫瘍細胞の表面上で見出された新規の１３０−ｋＤａのＶＥＧＦレセ
プターを特徴付けた（Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、５７
６１−５７６７（１９９６））。ＶＥＧＦ₁₆₅はこのレセプター（ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ
と呼ばれる）に、エキソン７によりコードされる４４のアミノ酸を介して結合す
る。このエキソンはＶＥＧＦ₁₆₅に存在するがＶＥＧＦ₁₂₁には存在しない。対照
的に、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１およびＦｌｔ−１は、ＶＥＧＦ₁₆₅およびＶＥＧＦ₁₂₁ の両方に結合し、そしてそれぞれＶＥＧＦエキソン４および３を介して結合する
（Ｋｅｙｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、５６３８−５６４６（１９
９６））。本発明の研究における、本発明者らの目標は、エキソン７がＶＥＧＦ ₁₆₅ 活性、特にＨＵＶＥＣについての分裂促進活性を調節するか否か、およびいかなる機構によって調節されるかを決定することであった。そのため、本発明者
らはエキソン７コードドメインを含むＧＳＴ融合タンパク質を使用してＶＥＧＦ ₁₆₅ ＲへのＶＥＧＦ₁₆₅の結合を阻害し、そしてＨＵＶＥＣ増殖において引き続く
効果を調べる戦略を進展させた。架橋実験は、予想通り、エキソン７融合タンパ
ク質がＫＤＲ／Ｆｌｋ−１ではなくＶＥＧＦ₁₆₅Ｒに結合し得ることを立証した。エキソン７融合タンパク質は¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅の、２３１細胞（これは、Ｖ
ＥＧＦ₁₆₅Ｒを単独で発現する）への結合を９８％、およびＨＵＶＥＣ（これは、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１およびＶＥＧＦ₁₆₅Ｒの両方を発現する）への結合を８５〜９５％阻害する強力なインヒビターであることが見出された。しかしエキソン
７融合タンパク質は、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を発現するがＶＥＧＦ₁₆₅Ｒは発現しないＰＡＥ−ＫＤＲ細胞への¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅の全ての結合を阻害はしなかっ
た。ＧＳＴタンパク質単独では、いずれの細胞型への結合も阻害しなかった。こ
のことは、この阻害が単に融合タンパク質のエキソン７部分に起因したことを立
証する。特定の¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅レセプター複合体の形成を立証した架橋分析
は、ＧＳＴ−Ｅｘ７＋８がＨＵＶＥＣおよび２３１細胞上のＶＥＧＦ₁₆₅Ｒへの¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅の結合を著しく阻害したことを確認した。総合すると、こ
れらの結果は、エキソン７融合タンパク質がＶＥＧＦ₁₆₅Ｒと直接的に相互作用し、そしてこのレセプターへの¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅の結合の競合インヒビターと
して作用し得ることを示す。

【００８０】ＧＳＴ−Ｅｘ７＋８融合タンパク質はＶＥＧＦ₁₆₅誘導のＨＵＶＥＣ増殖を約６０％、ＶＥＧＦ₁₂₁により誘導されるのに等価なレベルにまで阻害し、このことは、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１チロシンキナーゼレセプターの活性が、どうやら反
対方向に影響されることを示唆する。確かに、架橋分析は、ＧＳＴ−Ｅｘ７＋
８融合タンパク質は、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒへの¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅の架橋を阻害するのみでなく、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１への架橋もまた阻害することを示した。本発明
者らの架橋研究は、ＶＥＧＦ₁₆₅はそのエキソン４コードドメインを介してＫＤＲ／Ｆｌｋ−１と相互作用するという以前の証明（Ｋｅｙｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．、２７１、５５１９−５５２３（１９９６））に一致して、エキソン
７融合タンパク質が直接的にはＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に結合しないことを示したた
め、この結果は予想外であった。従って、エキソン７コードドメインを介したＶ
ＥＧＦ₁₆₅Ｒへの¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅の結合は、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１と増殖因子の間接的な相互作用を調節するように思われる。ＨＵＶＥＣ増殖におけるＧＳＴ
−Ｅｘ７＋８のこの阻害効果についての可能なメカニズムは、ＫＤＲ／Ｆｌｋ
−１およびＶＥＧＦ₁₆₅Ｒが細胞表面上できわめて近接して同時に局在化するということである。このモデルにおいて、ＶＥＧＦ₁₆₅ダイマーは、エキソン４ドメインを介してＫＤＲ／Ｆｌｋ−１と、およびエキソン７ドメインを介してＶＥ
ＧＦ₁₆₅Ｒと同時に相互作用し、３つの成分の複合体を産生する。ＧＳＴ−Ｅｘ７＋８融合タンパク質はＶＥＧＦ₁₆₅ＲへのＶＥＧＦ₁₆₅の結合と直接的に競合
することにより、シグナリングレセプターＫＤＲ／Ｆｌｋ−１へ結合するＶＥＧ
Ｆ₁₆₅の能力を間接的に損なう。従って、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１へのＶＥＧＦ₁₆₅の
効率的な結合は、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒとの首尾よい相互作用に部分的に依存し得る。他の代替的な可能性は、エキソン７コードドメインがヘパリン結合ドメインを含
むこと（Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、５７６１−５７６
７（１９９６））および過剰なＧＳＴ−Ｅｘ７＋８が、ＶＥＧＦ₁₆₅のそのレセプターへの効率的な結合に必要とされる、ＶＥＧＦ₁₆₅の細胞表面ＨＳＰＧへの結合を阻止すること（Ｇｉｔａｙ−Ｇｏｒｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
、２８７、６００３−６０９６（１９９２））である。

【００８１】驚くべきことに、ＶＥＧＦ₁₂₁はＶＥＧＦ₁₆₅Ｒに結合しないにもかかわらず、
ＧＳＴ−Ｅｘ７＋８はＨＵＶＥＣに対するＶＥＧＦ₁₂₁の分裂促進活性もまた、約５０％阻害した（Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、５７
６１−５７６７（１９９６））。可能な説明は、ＶＥＧＦ₁₆₅ＲおよびＫＤＲ／Ｆｌｋ−１が細胞表面上で近接していること、ならびにＶＥＧＦ₁₆₅Ｒに結合する過剰なＧＳＴ−Ｅｘ７＋８が、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１へのＶＥＧＦ₁₂₁の接近を立体的に阻害することである。架橋分析は、実際、直接的にはＫＤＲ／Ｆｌｋ
−１に結合しないＧＳＴ−Ｅｘ７＋８の存在下で、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１への¹² ⁵ Ｉ−ＶＥＧＦ₁₂₁の減少した結合を示した。これは、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１へのＶ
ＥＧＦ₁₂₁の結合における融合タンパク質の間接的効果を示唆する。

【００８２】ＧＳＴ−Ｅｘ７＋８はまた、２３１乳癌細胞（これは、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１
ではなくＶＥＧＦ₁₆₅Ｒを発現する）へのＶＥＧＦ₁₆₅の結合を阻害する。

【００８３】ＨＵＶＥＣ上のより高親和性のレセプターおよびより低親和性のレセプター（
それぞれ、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１およびＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ）への対等なＶＥＧＦ₁₆₅の
結合（Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、５７６１−５７６７
（１９９６））ならびにこれらの２つのレセプターへのＶＥＧＦ₁₆₅の結合におけるＧＳＴ−Ｅｘ７＋８融合タンパク質の阻害効果は、ＶＥＧＦ₁₆₅活性を媒介する際に作用する両特異性レセプター（ｄｕａｌｒｅｃｅｐｔｏｒ）系が存
在することを示唆する。いくつかの他の増殖因子が、高親和性レセプターおよび
低親和性レセプターに結合することが示されている。形質転換増殖因子−βは３
つのレセプターを有する複合体を産生する；そのうちの２つ（レセプターＩおよ
びＩＩ）はシグナリングレセプターであり、一方、形質転換増殖因子−βレセプ
ターＩＩＩ／βグリカンはより低親和性の付属結合分子（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ
ｂｉｎｄｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌｅ）である（Ｌｏｐｅｚ−Ｃａｓｉｌｌａｓら
、Ｃｅｌｌ、４７、７８５−７９６（１９９１））。神経因子ファミリーについ
ての低親和性レセプター、ｐ７５は、シグナリングＴＲＫレセプターを有する複
合体の一部である（Ｂａｒｂａｃｉｄ，Ｍ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ＣｅｌｌＢ
ｉｏｌ．、７、１４８−１５５（１９９５））。両特異性レセプター認識の異な
るタイプは、細胞表面ＨＳＰＧおよびそのシグナリングレセプターへのｂＦＧＦ
の結合である（Ｙａｙｏｎら、Ｃｅｌｌ、６４，８４１−８４８（１９９１）、
Ｋｌａｇｓｂｒｕｎら、Ｃｅｌｌ、６７、２２９−２３１（１９９１））。その
低親和性レセプター（ＨＳＰＧＳ）へのｂＦＧＦの結合は、ＨＳＰＧ結合ｂＦＧ
Ｆがその高親和性のシグナリングレセプターに効率的に提示され得るように、ｂ
ＦＧＦ内のコンフォメーション変化を誘導し得ることが示唆された（Ｙａｙｏｎ
ら、Ｃｅｌｌ、６４，８４１−８４８（１９９１）、Ｋｌａｇｓｂｒｕｎら、Ｃ
ｅｌｌ、６７、２２９−２３１（１９９１））。従って、ＶＥＧＦ₁₆₅ＲおよびＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の両方へのＶＥＧＦ₁₆₅の結合は、一般的なメカニズム（ここで、２つの異なるタイプのレセプターは増殖因子活性を調節するために使用さ
れる）の一部であるように思われる。

【００８４】レセプター結合研究を、エキソン７によりコードされる４４のアミノ酸内の阻
害性コア（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｒｅ）を同定するために使用した。エキ
ソン７のＮ末端残基およびＣ末端残基の両方において欠失を作製し、そしてその
阻害活性はエキソン７のＣ末端部分の２３アミノ酸（アミノ酸２２−４４）に局
在化された。これらの２３のアミノ酸のうち、５つはシステイン残基である。高
い割合のシステイン残基は、このドメインが、ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒへの効率的な結合のために必要とされる規定された三次元構造を有することを示唆する。エキソン
７ドメインの２２位のシステイン残基は阻害性活性に重要なため、おそらく必要
な三次元構造の維持のために重要である。ＶＥＧＦ₁₆₅における異なる位置のシステイン残基の役割を調べた研究は、システイン１４６（エキソン７のコア阻害
性ドメイン内に存在する（エキソン７中の３１位））のセリン残基による置換が
、ＶＥＧＦ₁₆₅の浸透活性において６０％の減少およびＥＣ分裂促進性の全損失を生じたことを示した（Ｃｌａｆｆｅｙら、Ｂｉｏｃｈｉｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ａｃｔａ．、１２４６、１−９（１９９５））。システイン１４６の変異は、Ｖ
ＥＧＦの二量体化において全く効果を有しなかった（Ｃｌａｆｆｅｙら、Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１２４６、１−９（１９９５））。従
って、このシステイン残基は２つのＶＥＧＦモノマー間の分子間ジスルフィド（
ｉｎｔｅｒｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）結合の形成に関与するのではなく、むしろその
モノマー内の分子内ジスルフィド（ｉｎｔｒａｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）結合に関与
し得るように思われる。これらの結果は、システイン残基により安定化される三
次元構造がエキソン７のＣ末端の半分において存在し、それがＶＥＧＦ₁₆₅Ｒとの相互作用のようなＶＥＧＦ₁₆₅の生物学的活性に寄与するという、本発明者らの仮説を支持する。興味深いことに、エキソン７によりコードされるＮ末端２１
アミノ酸残基の欠失に対応する融合タンパク質は、インタクトなエキソン７コー
ドペプチドよりもより強力なインヒビターであった。このＮ末端部分はＶＥＧＦ ₁₆₅ Ｒへの増強された結合を生じ、そしてＶＥＧＦ₁₆₅のより良好な競合者を産生
することがあり得る。

【００８５】本明細書を通して引用された参考文献は、本明細書中で参考として援用される
。

【００８６】本発明は、特定の実施態様への参照を伴って記載された。しかし、本願は、添
付される特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく当業者によりな
され得るそれらの変更および置換を包含することが意図される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅、¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₂₁、および¹²⁵Ｉ−ＧＳＴ− ＥＸ７のＨＵＶＥＣに対する架橋を示す。¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅（５ｎｇ／ｍｌ）
（レーン１）または¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₂₁（１０ｎｇ／ｍｌ）（レーン２）または ¹²⁵ Ｉ−ＧＳＴ−ＥＸ７（５０ｎｇ／ｍｌ）（レーン３）を、６−ｃｍディッシュにおいてＨＵＶＥＣのサブコンフルエントな培養物に結合した。この結合は、
１μｇ／ｍｌのヘパリンの存在下で実施した。２時間のインキュベーションの最
後に、各々の¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦアイソフォームを、細胞表面に化学的に架橋した。これらの細胞を溶解し、そしてタンパク質を６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分
離した。このポリアクリルアミドゲルを乾燥し、そしてＸ線フィルムに曝露した
。

【図２】図２は、ＶＥＧＦ₁₆₅およびＶＥＧＦ₁₂₁に対応するＨＵＶＥＣ増殖を示す。Ｈ
ＵＶＥＣを、２４時間、９６−ウェルディッシュ（５，０００細胞／ウェル）に
培養した。ＶＥＧＦ₁₆₅（黒丸）またはＶＥＧＦ₁₂₁（白丸）の増加する量を、培
養物に添加し、そしてこの細胞をさらに３日間インキュベートした。ＨＵＶＥＣ
ＤＮＡ内の[３Ｈ]チミジンの取り込みに基づくＤＮＡ合成を、実施例に記載さ
れるように測定した。これらの結果を３つのウェルにおける平均数で表し、そし
てこの標準偏差を決定した。

【図３Ａ】図３Ａは、ＨＵＶＥＣ細胞に結合する¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅のＧＳＴ−ＥＸ７＋
８による阻害を示す。¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅（５ｎｇ／ｍｌ）を、ＧＳＴ−ＥＸ７＋８（黒
四角）またはコントロールＧＳＴタンパク質（白四角）の増加する量の存在下で
、４８−ウェルディッシュにおいてＨＵＶＥＣ（３Ａ）のサブコンフルエントな
培養物に結合させた。２時間のインキュベーションの最後に、これらの細胞を洗
浄し、そして溶解し、そして細胞に関連する放射能をγ−計数管で決定した。得
られた数をＧＳＴまたは融合タンパク質を付加することなしにＰＢＳの存在下で
得られる数の百分率として表す。

【図３Ｂ】図３Ｂは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に結合する¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅のＧＳＴ
−ＥＸ７＋８による阻害を示す。¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅（５ｎｇ／ｍｌ）を、ＧＳ
Ｔ−ＥＸ７＋８（黒四角）またはコントロールＧＳＴタンパク質（白四角）の増
加する量の存在下で、４８−ウェルディッシュにおいてＭＤＡ−ＭＢ−２３１細
胞（３Ｂ）のサブコンフルエントな培養物に結合させた。２時間のインキュベー
ションの最後に、これらの細胞を洗浄し、そして溶解し、そして細胞に関連する
放射能をγ−計数管で決定した。得られた数をＧＳＴまたは融合タンパク質を付
加することなしにＰＢＳの存在下で得られる数の百分率として表す。

【図３Ｃ】図３Ｃは、ＰＡＥ−ＫＤＲ細胞に結合する¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅のＧＳＴ−ＥＸ
７＋８による阻害を示す。¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅（５ｎｇ／ｍｌ）を、ＧＳＴ−Ｅ
Ｘ７＋８（黒四角）またはコントロールＧＳＴタンパク質（白四角）の増加する
量の存在下で、４８−ウェルディッシュにおいてＰＡＥ−ＫＤＲ細胞（３Ｃ）の
サブコンフルエントな培養物に結合させた。２時間のインキュベーションの最後
に、これらの細胞を洗浄し、そして溶解し、そして細胞に関連する放射能をγ−
計数管で決定した。得られた数をＧＳＴまたは融合タンパク質を付加することな
しにＰＢＳの存在下で得られる数の百分率として表す。

【図４】図４は、ＧＳＴ−ＥＸ７＋８融合タンパク質が、¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅の、ＶＥ
ＧＦ₁₆₅Ｒに対する架橋およびＫＤＲ／Ｆ１Ｋ−１に対する架橋を阻害することを示す。¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅（５ｎｇ／ｍｌ）を、６−ｃｍディッシュにおいて
ＨＵＶＥＣ（レーン１および２）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（レーン３お
よび４）のサブコンフルエントな培養物に結合した。この結合を、１５μｇ／ｍ
ｌＧＳＴ−Ｅｘ７＋８の存在下（レーン２および４）または非存在下（レーン
１および３）で実施した。ヘパリン（１μｇ／ｍｌ）を各々のディッシュに添加
した。２時間のインキュベートの最後に、¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅を細胞表面に化学
的に架橋した。これらの細胞を溶解し、そしてタンパク質を６％ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅによって分離した。このゲルを乾燥し、そしてＸ線フィルムに曝露した。

【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂは、エキソン７内のコア阻害性領域の局在性を示す。Ｎ末端
およびＣ末端で全長エキソン７にコードされるドメインまたは切断を含むＧＳＴ
−Ｅｘ７融合タンパク質を、実施例に記載されるように調製した。¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅（５ｎｇ／ｍｌ）を、図３に記載されるように、ＧＳＴ融合タンパク質の増加する濃度の存在下でサブコンフルエントなＨＵＶＥＣ培養物に結合した。
２時間のインキュベーションの最後に、この細胞を洗浄し、そして溶解し、そし
て細胞に関連する放射能をγ−計数管で決定した。得られた数を融合タンパク質
Ｂ（ＶＥＧＦエキソン７誘導体のアミノ酸配列）なしにＰＢＳの存在下で得られ
る数の百分率として表す。これらの誘導体を、これらのＣ末端においてエキソン
８の第一のシステイン残基を含むように調製し、偶数個のシステイン残基を保持
させた。

【図５Ｂ】図５Ａおよび５Ｂは、エキソン７内のコア阻害性領域の局在性を示す。Ｎ末端
およびＣ末端で全長エキソン７にコードされるドメインまたは切断を含むＧＳＴ
−Ｅｘ７融合タンパク質を、実施例に記載されるように調製した。¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅（５ｎｇ／ｍｌ）を、図３に記載されるように、ＧＳＴ融合タンパク質の増加する濃度の存在下でサブコンフルエントなＨＵＶＥＣ培養物に結合した。
２時間のインキュベーションの最後に、この細胞を洗浄し、そして溶解し、そし
て細胞に関連する放射能をγ−計数管で決定した。得られた数を融合タンパク質
Ｂ（ＶＥＧＦエキソン７誘導体のアミノ酸配列）なしにＰＢＳの存在下で得られ
る数の百分率として表す。これらの誘導体を、これらのＣ末端においてエキソン
８の第一のシステイン残基を含むように調製し、偶数個のシステイン残基を保持
させた。

【図６】図６は、ＧＳＴ−Ｅｘ７＋８融合タンパク質が、ＶＥＧＦ₁₆₅に刺激されるＨＵＶＥＣ増殖を阻害することを示す。ＨＵＶＥＣを、図２に記載されるように９
６−ウェルディッシュ（５，０００細胞／ウェル）において培養した。ＶＥＧＦ ₁₆₅ （白丸）の増加する濃度を、１５μｇ／ｍｌのＧＳＴ−Ｅｘ７＋８（黒丸）または２５μｇ／ｍｌのＧＳＴ（四角）と共に培養物に添加し、そしてこれらの
細胞をさらに４日間インキュベートした。ＤＮＡ合成を、図２に記載されるよう
にＨＵＶＥＣにおいて測定した。これらの結果は３つのウェルにおける平均数を
表し、そしてこの標準偏差を決定した。

【図７】図７は、ＧＳＴ−Ｅｘ７＋８融合タンパク質が、ＶＥＧＦ₁₆₅およびＶＥＧＦ₁ ₂₁ に刺激されるＨＵＶＥＣ増殖を阻害することを示す。ＶＥＧＦ₁₆₅（丸）またはＶＥＧＦ₁₂₁（四角）の増加する濃度を、１５μｇ／ｍｌＧＳＴ−Ｅｘ７＋８とともに（黒）またはＧＳＴ−Ｅｘ７＋８なしで（白）、ＨＵＶＥＣに添加し
、そしてＤＮＡ内への[^*Ｈ]チミジンの取り込みを図２に記載されるように測定した。これらの結果は３つのウェルにおける平均数を表し、そしてこの標準偏差
を決定した。

【図８】図８は、ＧＳＴ−Ｅｘ７＋８融合タンパク質が、ＨＵＶＥＣのＫＤＲ／Ｆ１ｋ
−１に対する¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ１２１の架橋を阻害することを示す。¹²⁵Ｉ−ＶＥ
ＧＦ₁₂₁（２０ｎｇ／ｍｌ）を、６−ｃｍディッシュにおいてＨＵＶＥＣのサブコンフルエントな培養物に結合した。この結合を、１５μｇ／ｍｌＧＳＴ−Ｅ
ｘ７＋８の存在下（レーン２）または非存在下（レーン１）で実施した。ヘパリ
ン（１μｇ／ｍｌ）を各々のディッシュに添加した。２時間のインキュベーショ
ンの最後に、¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦを、細胞表面に化学的に架橋した。これらの細胞を溶解し、そしてタンパク質を、６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。この
ゲルを乾燥し、そしてＸ線フィルムに曝露した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 19/02 Ａ６１Ｐ 29/00 １０１ 29/00 35/00 １０１ 35/04 35/00 43/00 １１１ 35/04 Ｃ０７Ｋ 14/52 43/00 １１１Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ０７Ｋ 14/52 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (71)出願人 300 ＬｏｎｇｗｏｏｄＡｖｅｎｕｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ 02115，Ｕ．Ｓ．Ａ． (72)発明者ソーカー，シァイアメリカ合衆国マサチューセッツ 02446，ブルックリン，ビールズストリート 92 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA04 CA07 DA03 DA06 EA04 GA11 HA01 HA03 4C084 AA02 AA07 AA13 BA01 BA08 BA19 BA23 CA18 CA25 DB57 MA01 MA58 MA63 NA14 ZA331 ZA961 ZB071 ZB111 ZB211 ZB261 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA05 MA58 MA63 NA14 ZA33 ZA96 ZB07 ZB11 ZB21 ZB26 4H045 AA10 BA10 BA41 CA40 DA01 EA20 FA72 FA74 GA26 【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＶＥＧＦアンタゴニスト活性を有する、配列番号１の一部分
を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項２】ＶＥＧＦアンタゴニスト活性を有する、配列番号２またはそ
れらの一部分を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項３】以下の式（Ｉ）の構造を有するペプチドを含む単離されたポ
リペプチドであって：（Ｘ₁−（ＣＳＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱＬＥＬＮＥＲＴ（配列番号３））−Ｘ₂ ）Ｉここで、Ｘ₁は、Ｈまたは配列番号１のアミノ酸２〜２１の任意の部分であり、そしてＸ₂は、ＨまたはＣ、ＣＲ、ＲＣまたはＣＲＣ、およびそれらのアナログである、ポリペプチド。
【請求項４】請求項１、２または３に記載のポリペプチドおよび薬学的に
受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項５】前記キャリアが皮膚に対する局所適用に受容可能である、請
求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項６】前記キャリアが眼に対する適用に受容可能である、請求項４
に記載の薬学的組成物。
【請求項７】ＶＥＧＦに関連する疾患または障害を有する被験体を処置す
るための請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項８】ＶＥＧＦに関連する前記疾患または障害が、転移、不適切な
血管形成、および慢性炎症からなる群から選択される、請求項７に記載の薬学的
組成物。
【請求項９】ＶＥＧＦに関連する前記疾患または障害が、カポージ肉腫、
変形性関節症、糖尿病性網膜症、および慢性関節リウマチからなる群から選択さ
れる、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】前記疾患または障害が固体の腫瘍である、請求項７に記載
の薬学的組成物。
【請求項１１】ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ／ＮＰ−１レセプターを発現する腫瘍を処置するための、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】請求項１〜３に記載のポリペプチドをコードする、単離さ
れた核酸。
【請求項１３】ＶＥＧＦに関連する疾患または障害を処置するための医薬
の調製における請求項１２に記載の単離された核酸の使用。
【請求項１４】ＶＥＧＦに関連する疾患または障害を処置するための医薬
品の調製における請求項１〜３に記載のポリペプチドの使用。