EP1173225A2 - Mittel zur gentherapie und zur prävention von metastasen bzw. zur gentherapie von tumoren - Google Patents

Mittel zur gentherapie und zur prävention von metastasen bzw. zur gentherapie von tumoren

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EP1173225A2
EP1173225A2 EP00943552A EP00943552A EP1173225A2 EP 1173225 A2 EP1173225 A2 EP 1173225A2 EP 00943552 A EP00943552 A EP 00943552A EP 00943552 A EP00943552 A EP 00943552A EP 1173225 A2 EP1173225 A2 EP 1173225A2
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EP
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promoter
timp
transgene
agent
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Withdrawn
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EP00943552A
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Karsten Brand
Andrew Baker
Michael Strauss
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Individual
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    • A61K38/50—Hydrolases (3) acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5), e.g. asparaginase
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
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    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • liver metastases of colorectal origin are the leading cause of death for patients with colorectal cancer. Since they are often the only manifestation of the disease over a long period of time after surgical removal of the primary tumor, they are a possible target for curative therapeutic approaches (Dreben, JA and Niederhuber, JE. (1993) Cancer of the lower gastrointestinal tract - colon cancer. In : Niederhuber, JE ed. Current Therapy in Oncology. St. Louis, MO: Decker, 426-431). The potentially curative surgical removal of liver metastases is only possible for a small percentage of the patients and temporary remissions are shown for chemotherapy but no life extension. There is therefore an urgent need for alternative forms of therapy.
  • SPARE BLADE (RULE 26) harbors the problem of inadequate reaching of the tumor, which presents itself with increased intratumoral pressure and limited blood supply and is insufficiently met even with the direct intratumoral injection of gene therapy transfer vehicles which is usually carried out.
  • the systemic or regional administration of the vectors then required makes it much easier to infect the surrounding normal tissue than the tumor cells.
  • the invention aims to improve the prophylaxis and therapy of tumor metastases and primary tumors.
  • the invention is implemented according to the claims.
  • the strategy developed according to the invention circumvents the problem of the difficult accessibility of the tumor tissue by declaring the easily accessible normal tissue to be the primary gene therapy target.
  • the method is characterized in that the normal organ tissue is equipped with defense functions directly at the site of a potential or existing metastasis, which prevent the establishment or further growth of the metastases. The further spread of an inoperable primary tumor can also be prevented.
  • This strategy of impregnating healthy tissue differs fundamentally from all gene therapy and non-gene therapy approaches carried out to date. Compared to systemic or intraperitoneal application e.g. Synthetic protease inhibitors (Nelson, NJ (1998) Inhibitors of Angiogenesis enter phase III testing, J Natl.
  • the advantage of the gene therapy approach is to achieve very high concentrations of active substance locally in the target organ with the Advantage of the reduction of side effects and the possibility of simultaneous application of several inhibitors (see below).
  • permanent gene expression after a single vector application is less expensive and has fewer side effects than repeated administration of synthetic substances over a longer period of time.
  • Embodiment 1 Gene therapy of colorectal liver metastases by adenoviral transfer of metalloproteinase inhibitors (TIMPs) into the liver parenchyma
  • TIMPs metalloproteinase inhibitors
  • MMPs various metalloproteinases
  • ECM extracellular matrix
  • the basic therapeutic idea developed according to the invention is to have metalloproteinases secrete through the liver parenchyma in order to inhibit metastatic tumor cells from their extravasion, to prevent further infiltration of already established metastases and to prevent the supply of the tumors with vessels by inhibiting vascular development .
  • tissue inhibitor of metalloproteinase 2 (TIMP-2) was selected.
  • REPLACEMENT3L ⁇ T (RULE 26) This inhibitor, like several related substances, physiologically limits MMP activity in remodeling processes. By binding to MMP-2, TIMP-2 can inhibit their activity.
  • adenoviruses which are among the most established gene transfer systems, were used as vectors for gene transfer (Brand, K. and Strauss, M (1998) Molecular basis of gene transfer and application for gene therapy. In: Ruckpaul, D. and Ganten, D. (ed .) Handbook of Molecular Medicine, Vol. 2 Tumor Diseases, Springer, Berlin, Heidelberg, New York). These vectors, which cannot replicate due to the lack of the adenoviral E1 gene, infect epithelial cells with high efficiency and can be generated in the necessary large amounts.
  • Ad-TIMP-2 hepatocyte cell line from p53 knockout mice
  • MOIs multiplicities of infection
  • Ad-TIMP-2 The construction of Ad-TIMP-2 has been described (Baker, AH, Wilkinson, GW, Hembry, RM, Murphy, G., and Newby, AC (1996) Development of recombinant adenoviruses that drive high level expression of the human metalloproteinase- 9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 and -2 genes: characterization of their infection into rabbit smooth muscle cells and human MCF-7 adenocarcinoma cells. Matrix Biol.
  • the virus contains the human TIMP-2 cDNA under the control of the CMV promoter.
  • the cell culture supernatant (ZKÜ) was obtained 24 hours or 48 hours later. 10 ⁇ l were applied to a 10% polyacrylamide gel and, after electrophoretic separation, transferred to a nitrocellulose membrane.
  • a monoclonal antibody (T2-101, Ab-1 from Dianova, Hamburg, Germany) was used for the immunological detection.
  • the Western blot showed a strong TIMP-2 band in the supernatant from Ad-TIMP-2 infected cells and no bands in uninfected and control virus-infected supernatants.
  • TIMP-2 The functionality of TIMP-2 was determined using reverse zymography (according to Baker, AH, Wilkinson, GW, Hembry, RM, Murphy, G., and Newby, AC (1996) Development of recombinant adenoviruses that drive high level expression of the human metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 and -2 genes: characterization of their infection into rabbit smooth muscle cells and human MCF-7 adenocarcinoma cells. Matrix Biol. 15: 383-395). Cells were infected as described in (a). The ZKÜ was concentrated using an Amicon concentrator (Lexington, MA, USA).
  • the gel was incubated overnight in 50 mM Tris HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl, 10 mM CaCl 2 , 0.05% Brij-35, and 0.02% NaN 3 at 37 ° C.
  • the gel was stained with 0.5% Coomassie Brilliant Blue (SIGMA R250, Deisenhofen, Germany) and bands of gelatinase inhibitory activity representing TIMP-2 then appear dark against the digested background.
  • Reverse zymography showed gelatinase inhibitory activity only in the supernatants of Ad-TIMP-2 infected cells and not in the supernatants of uninfected or control virus infected cells.
  • adenoviruses were injected into the tail vein of nude mice. After three days, the animals were sacrificed and the livers frozen in liquid nitrogen. A monoclonal mouse antibody against human TIMP-2 (1:10, T2-101, Ab-1, Dianova, Hamburg, Germany) was used for the immunohistochemical detection of TIMP-2. A FITC conjugated sheep anti-mouse antibody was used as the secondary antibody. The result of the staining resulted in expression of TIMP-2 by 40% of the hepatocytes at a dose of 3x10 10 pfu and> 80% at a dose of 6x10 10 pfu. A similar gene transfer efficiency was documented after the application of Ad-ßgal and subsequent X-gal staining.
  • Ad-TIMP-2 The effectiveness of intravenous administration of Ad-TIMP-2 against LS 174 derived liver metastases was tested with the following experiments. Adenoviruses were administered 1 day before or 10 days after metastasis induction. The metastasis was induced by applying 2x10 6 LS174 cells in the spleen of the animals. The animals were sacrificed 5 weeks after metastasis induction and the tumor weights were determined. In the preventive test approach, Ad-TIMP-2 or Ad-ßgal control virus was administered via the tail vein in a dose of 3x10 10 pfu on day 0, which leads to approximately 40% liver cell infection. After 3 days, the metastasis was induced by the spleen injection of tumor cells described above.
  • Ad-TIMP-2 Ad-ßgal or untreated, Figure 2
  • points correspond to individual animals
  • bars correspond to the mean values.
  • the histopathological examination only showed isolated micrometastases in the macroscopically tumor-free animals of the Ad-TIMP-2 group. It can thus be established that the gene therapy mediated secretion of TIMP-2 by hepatocytes limits both the number and the size of colorectal metastases in the nude mouse model in a highly significant manner. This finding was surprising in its uniqueness and speaks for a central, irreplaceable function of the MMP-2.
  • livers of the animals of both experimental approaches were processed histologically in order to examine them for the standard tumor parameters apoptosis and proliferation as well as the extent of angiogenesis.
  • paraffin sections of the liver were prepared and stained with the following antibodies: A CD31 antibody (Daco, Hamburg, Germany) was used to detect the angiogenesis, and an MIB-1 (Ki- 67) Antibodies (dia 505, Dianova). The detection was carried out using a biotinylated second antibody and a horse-radish-conjugated avidin (Dako). An ApopTag fluorescein in situ apoptosis kit (Intergen, Oxford, UK, TUNEL method) was used to detect apoptosis. Deparaffinized sections were pretreated with Proteinase K.
  • Terminal deoxynucleotidyl transferase was used for primary staining and anti-digoxigenin conjugated to fluorescein was used as the reporter molecule.
  • Propidium iodide was used as a counterstain. Mitoses were counted on hematoxylin / eosin stained sections. 10 microscopic fields per animal were measured at a magnification of x400 (MIB, mitoses, CD31) or with an oil immersion objective (x1000, TUNEL) using a Zeiss (axioscope) fluorescence microscope (Carl Zeiss, Jena,
  • REPLACEMENT BUTT (RULE 26) Germany) were counted and the mean values were calculated. The mean values of all data from tumor-bearing animals in the individual treatment groups were calculated and Student's t-test was used for statistical analysis. There was a significantly to highly significantly reduced proliferation rate and number of blood vessels and an increased apoptosis rate in animals treated with Ad-TIMP-2 compared to untreated or control virus-treated animals.
  • inventions relate to vectors, promoters / enhancers, transgenes, transmembrane anchors and target organs
  • a promising approach to reducing immunogenicity is the outsourcing of all coding adenoviral genome sections from the therapeutic vector (Chen, HH et al. (1997) Persistence in muscle of an adenoviral vector that lacks all viral genes, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94, 1645-1650).
  • the transport capacity of such viruses is increased considerably, so that several transgenes have space on one vector, which enables an attack at different points in the metastasis cascade.
  • TIMP-2-bearing, so-called helper dependent (HD), gutless, or minimal adenoviruses can presumably offer long-term protection against organ metastasis.
  • Retroviruses and adeno-associated viruses are further vectors that allow longer foreign gene expression. Both viruses are not immunogenic and necessarily integrate (retroviruses) or potentially (AAVs) into the genome of the host cell. While with retroviruses the need for replication of the target cells and the difficulty of the generation of high-titer virus suspensions still exist If problems arise, modern AAV vectors could already be used in the medium term for the gene transfer of protease inhibitors.
  • Promising vectors are also lentiviruses, hybrid constructs and herpes simplex viruses, which have a high affinity for neuronal tissue and are therefore particularly suitable for the treatment of brain metastases and glioblastomas.
  • a preferred embodiment of the invention is the modifications in the surface structure of viruses, which enables retargeting of the vectors. This is achieved by expressing a suitable ligand on viral spikes, which enables a specific transduction of certain normal tissues. For example, by incorporating a heparin domain, heparan-expressing cells can be specifically transduced adenovirally.
  • Enhancers / promoters can be used which are active in the normal tissue to be protected. In most cases, this includes the organ parenchyma. In individual cases, expression of antitumor transgenes by underrepresented cells of the organ can also be useful, e.g. secretion of collagen e.g. through fibroblasts.
  • promoters that are only activated after the addition of a foreign substance.
  • promoters such as. B. tetracycline-dependent promoter elements or steroid responsive elements, you have the option to impregnate only sporadically or to select the most dangerous times for metastasis.
  • TIMP-2 is the appropriate protein for the treatment of LS174 cell derived metastases.
  • MMP-2 which is inhibited by TIMP-2, is one of the most relevant proteases for tumor cell invasion.
  • other cell lines also produce other MMPs, and this is also reflected in the protease pattern of human tumors.
  • the extracellular matrix of the target organs is also different
  • SPARE BLADE constructed which places different demands on the tumor cell proteases.
  • a general approach must therefore include protease inhibitors other than TIMP-2, such as TIMP-1, PAI-1 or PAI-2. Modifications in the structure of the naturally occurring inhibitors lead to an increase in effectiveness or a reduction in any side effects. Such modifications consist of shortening the molecule or changing the sequence by exchanging individual bases of the DNA. For example, by removing a terminal (C-terminal) part of the TIMP-2 molecule, it is possible to remove its unwanted protease-activating function.
  • ECM extracellular matrix
  • Naturally occurring components of the extracellular matrix can be overexpressed here. This includes the genes for the various collagens, fibronectin, laminin and genes whose products are responsible for the synthesis of non-protein components of the ECM.
  • components of the ECM which are usually not expressed in the organ in question, can be expressed in a non-local manner and thus the organ specificity of metastases can be changed.
  • non-degradable or poorly degradable substances that are an insurmountable obstacle for metastatic cells can be expressed.
  • Vector construction The two polypeptide chains that generate the triple helix of the collagen fibril are cloned into a minimal adenovirus shuttle vector.
  • a tet activator-responsive and doxycycline-dependent promoter is used as the promoter in order to keep the extent of transgene expression controllable.
  • the tet activator is also brought onto the shuttle plasmid.
  • Another way to block tumor cell invasion and motility is to strengthen cell-cell and cell-matrix adhesions.
  • E-cadherin is responsible for the interaction of epithelial cells and a loss of E-cadherin by cells in the primary tumor
  • Cadherin gene under the control of the RSV promoter carries: Ad-RSV-E-Cad.
  • A2 cells are transduced with Ad-RSV-E-Cad for functional testing.
  • An increase in adhesion is determined by determining the amount of time it takes for trypsin to separate the cells.
  • Ad-RSV-E-Cad is administered in
  • suicide genes are used to impregnate normal tissue. To do this, they must be equipped with a membrane anchor sequence in order to be extracellularly effective and to be able to also toxically apply an applied prodrug extracellularly.
  • the gene for the suicide gene cytosine deaminase under the control of the
  • HNFAIbumin promoter is provided with a membrane anchor sequence so that it is expressed in the membrane after transfection.
  • A2 cells are transduced with AAV-HNFAIb-CD-Tm. 24 hours after
  • the Prodrug 5-FC is added to the cell culture supernatant (ZKÜ). 5-FC is now transferred to the cytotoxic 5-FU through the membrane-bound CD.
  • the supernatant is collected after 24 h and applied to the cell line LS174 and to resting primary hepatocytes. After a further 72 hours, cell counts are made and the extent of apoptosis is determined.
  • the method according to the invention was developed using the disease model described above.
  • the model can also be applied to other tumor diseases.
  • the most common clinical pictures include liver, lung, bone and brain metastases in breast cancer with latency periods of up to 10 years after removal of the primary tumor, a period that has so far elapsed, brain metastases in bronchial cancer and bone metastases in prostate cancer.
  • the protection of the surrounding normal tissue according to the above-mentioned principle is conceivable.
  • FIG. 1 Prevention of liver metastasis by systemic application of Ad-TIMP-2.
  • Ad-TIMP-2 On day 0, 3x10 10 pfu Ad-TIMP-2 or Ad-ßgal were applied to the tail vein of nude mice. 3 days later, the animals received an intrasplenic injection of LS174 colon carcinoma cells to induce liver metastases. Representative in situ photographs of untreated (left), Ad-ßgal-treated (middle) and Ad-TIMP-2 treated (right) animals after 5 weeks.
  • Figure 2 Methodology as in Figure 1. After 5 weeks, the animals were sacrificed and the tumor masses were determined. Points correspond to individual animals, bars correspond to the mean values.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Prophylaxe und Therapie von Primärtumoren und Metastasen. Die essentiellen Komponenten der Erfindung betreffen einen gentherapeutischen Vektor und eine DNA-Sequenz mit Enhancer/Promotor-Komponente und Transgen. Die einzelnen Komponenten des Mittels sind so ausgewählt, dass sie eine Imprägnierung des Normalgewebes potentiell oder bereits betroffener Organe gegenüber invasiven Tumorzellen gewährleisten, was die Entstehung metastatischer Herde verhindert, die Rückbildung bestehender Herde induziert oder die Invasion von Primärtumoren begrenzt.

Description

Mittel zur Gentherapie und zur Prävention von Metastasen bzw. zur Gentherapie von Tumoren
Beschreibung
Die bei weitem häufigste Todesursache maligner Tumorerkrankungen ist die Organmetastasierung. Während der Primärtumor zumindest in frühen und mittleren Stadien chirurgisch reseziert werden kann, ist dies im Fall der Metastasierung selten möglich. Von wenigen Ausnahmen abgesehen, können die konventionellen Methoden der Chemotherapie und Bestrahlung, wenn überhaupt, dann nur vorübergehende Besserungen des klinischen Bildes metastasierter Tumoren erreichen.
Zu den häufigsten Tumoren gehören kolorektale Karzinome. Lebermetastasen kolorektalen Ursprungs sind die häufigste Todesursache für Patienten mit kolorektalen Karzinomen. Da sie nach chirurgischer Entfernung des Primärtumors häufig über einen längeren Zeitraum die einzige Manifestation der Erkrankung darstellen, sind sie ein mögliches Ziel für kurative Therapieansätze (Dreben, JA and Niederhuber, JE. (1993) Cancer of the lower gastrointestinal tract - Colon cancer. In: Niederhuber, JE ed. Current Therapy in Oncology. St. Louis, MO: Decker, 426-431 ). Die potentiell kurative chirurgische Entfernung von Lebermetastasen ist aber nur für einen kleinen Prozentsatz der Patienten möglich und für die Chemotherapie sind zwar vorübergehende Remissionen aber keine Lebensverlängerung gezeigt. Daher besteht dringender Bedarf nach alternativen Therapieformen. Die seit etwa 10 Jahren in der Entwicklung befindlichen gentherapeutischen Ansätze besitzen aufgrund ihrer Komplexität ein gegenüber konventionellen Therapieformen dramatisch erhöhtes Maß an Regulierbarkeit. Diese kann im Bereich der Krebsgentherapie unter anderem zum tumorspezifischen Targeting der Vektoren oder der Beschränkung der Genexpression auf Tumorgewebe und zur spezifischen Adaptation der transferierten Transgene an Angriffspunkte des jeweiligen Tumortyps genutzt werden.
Abgesehen von immunologischen Herangehensweisen, haben die bisher verfolgten gentherapeutischen Ansätze, wie schon die konventionellen Methoden, fast ausschließlich das infiltrierende Tumorgewebe zum primären Angriffspunkt. Dies
ERSATZBLÄTT (REGEL 26) birgt die Problematik unzureichenden Erreichens des Tumors, welcher sich mit erhöhtem intratumoralem Druck und eingeschränkter Blutversorgung präsentiert und selbst bei der üblicherweise durchgeführten direkten intratumoralen Injektion gentherapeutischer Transfervehikel nur ungenügend getroffen wird. Im Falle multipler Metastasierung hat sich gezeigt, daß sich bei der dann erforderlichen systemischen oder regionalen Gabe der Vektoren das umgebende Normalgewebe sogar wesentlich besser infizieren läßt als die Tumorzellen.
Die Erfindung hat das Ziel, die Prophylaxe und die Therapie von Tumormetastasen und Primärtumoren zu verbessern.
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert. Die gemäß der Erfindung entwickelte Strategie umgeht die Problematik der schwierigen Erreichbarkeit des Tumorgewebes, indem das gut zu erreichende Normalgewebe zum primären gentherapeutischen Ziel erklärt wird. Das Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß das normale Organgewebe direkt am Ort einer potentiellen oder stattgehabten Metastasierung mit Abwehrfunktionen ausgestattet wird, die eine Etablierung bzw. ein weiteres Wachstum der Metastasen verhindern. Ebenso kann die weitere Ausbreitung eines inoperablen Primärtumors verhindert werden. Diese Strategie der Imprägnierung des gesunden Gewebes unterscheidet sich grundlegend von allen bisher durchgeführten gentherapeutischen und nicht-gentherapeutischen Ansätzen. Gegenüber der systemischen oder intraperitonealen Applikation z.B. synthetischer Proteaseinhibitoren (Nelson, N.J. (1998) Inhibitors of Angiogenesis enter phase III testing, J Natl. Cancer Inst., 90, 960-963) besteht der Vorteil des gentherapeutischen Ansatzes darin, lokal im Zielorgan sehr hohe Konzentrationen an Wirkstoff zu erreichen mit dem Vorteil der Verringerung von Nebenwirkungen und der Möglichkeit der gleichzeitigen Applikation mehrerer Inhibitoren (s.u.). Außerdem ist eine dauerhafte Genexpression nach einmaliger Vektorapplikation kostengünstiger und nebenwirkungsärmer als die wiederholte Gabe synthetischer Substanzen über einen längeren Zeitraum.
In folgende klinischen Szenarien läßt sich der oben beschriebene Ansatz einfügen: 1. Die präoperative oder intraoperative Vektorapplikation in Zielorgane, um die Extravasion etwaiger bei Operation des Primärtumors losgelöster metastatischer Tumorzellen zu unterbinden.
2. Die adiuvante über Jahre dauernde kontinuierliche Expression von Inhibitoren im Zielgewebe zur Verhinderung des Auswachsens bzw. zum Abtöten okkulter Mikrometastasen vor allem bei Hochrisikogruppen wie dem operierten Mammakarzinom mit Lymphknotenbefall.
3. Die Begrenzung des Wachstums bereits etablierter Metastasen oder inoperabler Primärtumoren.
Ausführungsbeispiel 1 : Gentherapie kolorektaler Lebermetastasen durch adenoviralen Transfer von Metalloproteinaseinhibitoren (TIMPs) in das Leberparenchym
Metastasen kolorektaler Karzinome produzieren verschiedene Proteasen, die sie zur Intravasion und Extravasion sowie zur Invasion im Zielgewebe benötigen. Darunter sind verschiedene Metalloproteinasen (MMPs) und hier insbesondere die MMP-2 und MMP-9, die für die Degradation von Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) verantwortlich sind (Duffy, M.J. and McCarthy, K. (1998) Matrix metalloproteinases in cancer: Prognostic markers and targets for therapy (review), Int. J. Oncol., 12, 1343- 48). Von den MMPs-2 und -9 wird vorzugsweise Kollagen IV als Hauptkomponente der Basalmembranen abgebaut. Im Zuge dieser Erkenntnisse wurden synthetische Proteaseinhibitoren entwickelt, die klinisch bereits eingesetzt werden und in einigen Fällen bereits die Phase III der klinischen Testung erreicht haben (Nelson, N.J. (1998) Inhibitors of Angiogenesis enter phase III testing, J Natl. Cancer Inst., 90, 960-963).
Die gemäß der Erfindung entwickelte therapeutische Grundidee besteht darin, Hemmstoffe von Metalloproteinasen durch das Leberparenchym sezemieren zu lassen, um metastatische Tumorzellen an ihrer Extravasion zu hemmen, die weitere Infiltration bereits etablierter Metastasen zu unterbinden und die Versorgung der Tumors mit Gefäßen durch Hemmung von Gefäßentwicklung zu unterbinden. Zunächst wurde der Gewebsinhibitor der Metalloproteinase 2 (TIMP-2) ausgewählt.
ERSATZ3LÄΪT (REGEL 26) Dieser Inhibitor, wie auch mehrere verwandte Stoffe, sorgt physiologischerweise für eine Begrenzung der MMP-Aktivität bei Umbauprozessen. Durch Bindung an MMP-2 kann TIMP-2 deren Aktivität hemmen.
Als Vektor zum Gentransfer wurden Erstgenerations-Adenoviren, die zu den etabliertesten Gentransfersystemen gehören (Brand, K. und Strauss, M (1998) Molekulare Grundlagen des Gentransfers und Anwendung für die Gentherapie. In: Ruckpaul, D. und Ganten, D. (Hrsg.) Handbuch der Molekularen Medizin, Bd 2 Tumorerkrankungen, Springer, Berlin, Heidelberg, New York) verwendet. Diese Vektoren, die aufgrund des Fehlens des adenoviralen E1-Gens nicht replizieren können, infizieren mit hoher Effizienz epitheliale Zellen und können in den notwendigen großen Mengen generiert werden.
a) Zum Nachweis der Sekretion von TIMP-2 durch Hepatozyten in vitro, wurden A2 Zellen (Hepatozytenzellinie aus p53 k.o Mäusen) mit unterschiedlichen multiplicities of infection (MOIs) Ad-TIMP-2 infiziert. Die Konstruktion von Ad-TIMP-2 ist beschrieben worden (Baker, A.H., Wilkinson, G.W., Hembry, R.M., Murphy, G., and Newby, A.C. (1996) Development of recombinant adenoviruses that drive high level expression of the human metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 and -2 genes: characterization of their infection into rabbit smooth muscle cells and human MCF-7 adenocarcinoma cells. Matrix Biol. 15: 383- 395). Das Virus beinhaltet die humane TIMP-2 cDNA unter der Kontrolle des CMV Promotors. 24h oder 48h später wurde der Zellkulturüberstand (ZKÜ) gewonnen. 10 μl wurden auf ein 10% Polyacrylamidgel aufgetragen und nach elektrophoretischer Auftrennung auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Für den immunologischen Nachweis wurde ein monoklonaler Antikörper (T2-101 , Ab-1 vonDianova, Hamburg, Deutschland) verwendet.
Der Western Blot zeigte eine starke TIMP-2 Bande im Überstand von Ad-TIMP-2 infizierten Zellen und keine Banden in nicht infizierten und Kontrollvirus-infizierten Überständen.
b) Die Funktionsfähigkeit von TIMP-2 wurde mittels reverser Zymographie (nach Baker, A.H., Wilkinson, G.W., Hembry, R.M., Murphy, G., and Newby, A.C. (1996) Development of recombinant adenoviruses that drive high level expression of the human metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 and -2 genes: characterization of their infection into rabbit smooth muscle cells and human MCF-7 adenocarcinoma cells. Matrix Biol. 15: 383-395) überprüft. Zellen wurden infiziert, wie unter (a) beschrieben. Der ZKÜ wurde mittels eines Amicon Konzentrators (Lexington, MA, USA) konzentriert. NaN3, Brij and CaCI2 wurden zugegeben um eine Endkonzentration von of 0.1 %, 0.05% bzw. 5 mM zu erhalten. Die Proben wurden mit nicht reduzierendem Puffer gemischt und auf ein 10% Polyacrylamid/SDS Gel geladen, welches 1 mg/ml Gelatine (porcine skin type I, bloom 300, SIGMA G2500) und 107 ng/ml aktives MMP-2 Protein (Oncogene, Cambridge, MA, USA) enthält. Nach der Elektrophorese, wurde das SDS durch Inkubation für 2 h in 2.5 % Triton X 100 aus dem Gel entfernt . Das Gel wurde über Nacht in 50 mM Tris HCI, pH 8.0, 50 mM NaCI, 10 mM CaCI2, 0.05% Brij-35, und 0.02% NaN3 bei 37°C inkubiert. Das Gel wurde mit 0.5% Coomassie Brilliantblau (SIGMA R250, Deisenhofen, Deutschland) gefärbt, und Banden Gelatinase-nhibitorischer Aktivität, die TIMP-2 representieren erscheinen dann dunkel gegen den verdauten Hintergrund. Die reverse Zymographie zeigte Gelatinase-inhibitorische Aktivität nur in den Überständen Ad-TIMP-2 infizierter Zellen und nicht in Überständen von nicht infizierten oder Kontrollvirus infizierten Zellen.
c) Die Produktion von MMP-2 durch Tumorzellen wurde durch Gelatin Zymographie nachgewiesen. Der ZKÜ verschiedener Zellinien wurde gesammelt und konditioniert, wie unter (b) beschrieben. Die Zymographie wurde durchgeführt wie unter (b) beschrieben, nur MMP-2 wurde nicht zugeben. Banden der Lyse, die gelatinolytische Aktivität anzeigen, waren gegen den dunklen Hintergrund sichtbar. Unter mehreren Zellinien zeigten LS 174 Kolontumorzellen die stärkste MMP-2 Aktivität.
d) Zum Nachweis rekombinanten humanen TIMP-2 im Blut von Nacktmäusen wurden verschieden Dosen Ad-TIMP-2 intravenös in die Schwanzvene von Nacktmäusen injiziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurde Blut abgenommen und Serum gewonnen. Die Proben wurden mittels eines TIMP-2 ELISAs (RPN 2618, Amersham Buchler, Braunschweig, Germany) auf TIMP-2 Gehalt überprüft. Die Ergebnisse zeigen eine Abhängigkeit der TIMP-2 Expression von der applizierten Virusmenge mit einer TIMP-2-Konzentration von 45 μg/ml bei einer Dosis von 3x1010 pfus (plaque forming units). Die Serumkonzentration an TIMP-2 war über 2 Wochen stabil. Diese Ergebnisse zeigen, daß TIMP-2 nach intravenöser Injektion in das Blut sezemiert wird.
e) Um das Ausmaß des Gentransfers in die Leber zu prüfen, wurden Adenoviren in die Schwanzvene von Nacktmäusen injiziert. Nach drei Tagen wurden die Tiere getötet und die Lebern in Flüssigstickstoff eingefroren. Zur immunohistochemischen Detektion von TIMP-2 wurde ein monoklonaler Mausantikörper gegen humanes TIMP-2 (1 :10, T2-101 , Ab-1 , Dianova, Hamburg, Germany) verwendet. Ein FITC konjugierter Schaf anti-Mausantikörper wurde als sekundärer Antikörper verwendet. Das Ergebnis der Färbung ergab eine Expression vonTIMP-2 durch 40% der Hepatozyten bei einer Dosis von 3x1010 pfu und von >80% bei einer Dosis von 6x1010 pfu. Eine ähnliche Gentransfereffizienz wurde nach Applikation von Ad-ßgal und nachfolgendes X-gal staining dokumentiert.
f) Die Wirksamkeit intravenöser Applikation von Ad-TIMP-2 gegenüber LS 174 abgeleiteten Lebermetastasen wurde mit folgenden Experimenten geprüft. Adenoviren wurden 1 Tag vor oder 10 Tage nach Metastaseninduktion appliziert. Die Metastaseninduktion erfolgte durch Applikation von 2x106 LS174 Zellen in die Milz der Tiere. 5 Wochen nach Metastaseninduktion wurden die Tiere getötet und die Tumorgewichte bestimmt. Im präventiven Versuchsansatz wurden an Tag 0 Ad- TIMP-2 oder Ad-ßgal Kontollvirus in einer Dosis von 3x1010 pfu, die zu etwa 40% Leberzellinfektion führt, über die Schwanzvene gegeben. Nach 3 Tagen erfolgte die Metastaseninduktion über die oben beschriebene Milzinjektion von Tumorzellen. Nach 4 Wochen wurde das Experiment beendet und die Volumina der Lebertumoren bestimmt. Es zeigte sich, daß sowohl in der unbehandelten Kontrollgruppe, wie auch in der mit Kontrollvirus behandelten Gruppe die Mehrzahl der Tiere eine, die Leber fast vollständig aufbrauchende, Metastasierung aufwiesen, während die mit Ad- TIMP-2 behandelten Tiere in der Mehrzahl makroskopisch tumorfrei waren (Abbildung 1 : Unbehandeltes, Ad-ßgal behandeltes (Mitte) und Ad-TIMP-2 behandeltes Tier (rechts)).
Die quantitative Auswertung ergab ein Verhältnis des Mittelwertes der Tumorgewichte in den Versuchsgruppen von 1 :20 (Ad-TIMP-2: Ad-ßgal oder unbehandelt, Abbildung 2, Punkte entsprechen einzelnen Tieren, Balken entsprechen den Mittelwerten). Die histopathologische Untersuchung ergab nur vereinzelte Mikrometastasen in den makroskopisch tumorfreien Tieren der Ad-TIMP- 2 Gruppe. Damit läßt sich feststellen, daß die gentherapeutisch mediierte Sekretion von TIMP-2 durch Hepatozyten sowohl die Zahl als auch die Größe kolorektaler Metastasen im Nacktmausmodell hochsignifikant einschränkt. Dieser Befund war in seiner Eindeutigkeit überraschend und spricht für eine zentrale, nicht ersetzbare Funktion der MMP-2. Da im beschriebenen Ansatz nur etwa 40% der Hepatozyten transduziert waren liegt hier offensichtlich eine hochwirksame Therapie vor, die vermutlich durch lokale hohe Konzentrationen des Wirkstoffs mit antimetastatischer Wirkung auf mehreren Ebenen (Extravasion, Infiltration und Angiogenese) bedingt ist.
In einem zweiten Versuch erfolgte die Applikation der therapeutischen Vektoren eine Woche nach Metastaseninduktion. In diesem Falle war die Therapieeffizienz geringer als bei präventiver Gabe der Vektoren. Die Unterschiede zwischen Behandlungsgruppe (TIMP-2) und Kontrollgruppen (Ad-ßgal oder unbehandelt) waren aber hochsignifikant.
g) Die Lebern der Tiere beider experimenteller Ansätze wurden histologisch aufgearbeitet, um sie auf die Standard-Tumorparamenter Apoptose und Proliferation sowie das Ausmaß an Angiogenese zu untersuchen.
Zur Bestimmung der Angiogenese, Proliferation und Apoptose wurden Paraffinschitte der Lebern angefertigt und mit den folgenden Antikörpern gefärbt: Zum Nachweis der Angiogenese wurde ein CD31 Antikörper (Daco, Hamburg, Germany) verwendet, zur Bestimmung der Prozentzahl proliferierender Zellen ein MIB-1 (Ki-67) Antikörper (dia 505, Dianova). Der Nachweis erfolgte mittels eines biotinylierten zweiten Antikörpers und eines horse-radish-konjugiertem Avidin (Dako). Zum Nachweis von Apoptose wurde ein ApopTag fluorescein in situ apoptose Kit (Intergen, Oxford, UK, TUNEL- Methode) verwendet. Deparaffinisierte Schnitte wurden mit Proteinase K vorbehandelt. Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) wurde zur primären Färbung verwendet und anti-Digoxigenin, konjugiert an Fluorescein, wurde als Reporter Molekül verwendet. Propidiumiodid wurde als Gegenfärbung eingesetzt. Mitosen wurden auf Hematoxylin/Eosin gefärbten Schnitten gezählt. 10 mikroskopische Felder pro Tier wurden bei einer Vergrößerung von x400 (MIB, mitoses, CD31 ) oder mit einem Ölimmersionsobjektiv (x1000, TUNEL) unter Verwendung eines Zeiss (Axioskop) Fluoreszenzmikroskops (Carl Zeiss, Jena,
ERSATZBUTT (REGEL 26) Germany) gezählt, und die Mittelwerte wurden errechnet. Die Mittelwerte aller Daten tumortragender Tiere in den einzelnen Behandlungsgruppen wurden errechnet, und zur statistischen Analyse wurde Student's T-Test angewendet. Es zeigte sich eine signifikant bis hochsignifikant erniedrigte Proliferationsrate und Anzahl an Blutgefäßen und erhöhte Apoptoserate bei Ad-TIMP-2 behandelten Tieren im Vergleich zu unbehandelten oder Kontrollvirus behandelten Tieren.
Weitere Ausführungsformen der Erfindung betreffen Vektoren, Promotoren/Enhancer, Transgene, Transmembrananker und Zielorgane
Vektoren
Vor allem beim Vorliegen okkulter Metastasen, deren Reaktivierung erst nach jahrelanger Latenz auftreten kann und bei präoperativer Metastasenprävention ist die Langzeitexpression des transferierten Gens essentiell. Bei Verwendung von Erstgenerations-Adenoviren sind die therapeutischen Effekte zeitlich auf einige Wochen begrenzt. Hierfür werden immunologische Abwehrreaktionen des Empfängers verantwortlich gemacht. Diese scheinen durch die Restexpression adenoviraler Gene bedingt zu sein (Yang, Y. et al. (1994) Cellular immunity to viral antigens iimits E1-deleted adenovirus for gene therapy. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91 , 4407-4411.). Ein vielversprechender Ansatz zur Reduktion der Immunogenität ist die Auslagerung aller kodierenden adenoviralen Genomabschnitte aus dem therapeutischen Vektor (Chen, H.H. et al. (1997) Persistence in muscle of an adenoviral vector that lacks all viral genes, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94, 1645- 1650). Gleichzeitig wird die Transportkapazität solcher Viren erheblich erhöht, so daß mehrere Transgene auf einem Vektor Platz haben, was einen Angriff an verschiedenen Stellen der Metastasierungskaskade möglich macht. Solche TIMP-2 tragenden, sogenannten helper dependent (HD), gutless, oder Minimal-Adenoviren können vermutlich einen langandauernden Schutz vor Organmetastasierung bieten. Weitere Vektoren, die eine längerdauernde Fremdgenexpression zulassen, sind Retroviren und adeno-assoziierte Viren (AAVs). Beide Viren sind nicht immunogen und integrieren notwendigerweise (Retroviren) oder potentiell (AAVs) in das Genom der Wirtszelle. Während bei Retroviren die Notwendigkeit der Replikation der Zielzellen und die Schwierigkeit der Generation hochtitriger Virussuspensionen noch Probleme bereiten, könnten moderne AAV-Vektoren bereits mittelfristig zum Gentransfer von Proteaseinhibitoren verwendet werden. Aussichtsreiche Vektoren sind außerdem Lentiviren Hybridkonstrukte sowie Herpes Simplex Viren, die eine hohe Affinität zu neuronalem Gewebe haben und daher insbesondere zue Behandlung von Hirnmetastasen und Glioblastomen geeignet sind. Unter den nicht viralen Vektorsystemen sind Liposomen hervorzuheben. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist die Modifikationen in der Oberflächenstruktur von Viren, die ein Retargeting der Vektoren ermöglicht. Dies wird erreicht in dem ein geeigneter Ligand wird auf viralen spikes exprimiert wird, was eine gezielte Transduktion bestimmter Normalgewebe ermöglicht. So kann man z.B. durch Inkorporation einer Heparindomäne Heparan-exprimierende Zellen gezielt adenoviral transduzieren.
Enhancer/Promotoren
Es können Enhancer/Promotoren verwendet werden, die im jeweiligen zu schützenden Normalgewebe aktiv sind. Hierunter fällt in den meisten Fällen das Organparenchym. In Einzelfällen kann auch eine Expression von Antitumortransgenen durch unterrepräsentierte Zellen des Organs sinnvoll sein, wie z.B. die unten angesprochene Sekretion von Kollagen z.B. durch Fibroblasten.
Eine andere Möglichkeit besteht darin, Promotoren zu verwenden, die erst nach Zugabe einer körperfremden Substanz aktiviert werden. Mit solchen Promotoren, wie z. B. Tetracyclin abhängigen Promotorelementen oder Steroid responsiven Elementen hat man die Möglichkeit, nur sporadisch zu imprägnieren oder die für eine Metastasierung gefährlichsten Zeitpunkte auszuwählen.
Transgene
1. TIMP-2 ist das geeignete Protein zur Behandlung LS174-Zell abgeleiteter Metastasen. MMP-2, welche durch TIMP-2 gehemmt wird, gehört zu den für die Tumorzellinvasion relevantesten Proteasen. Andere Zellinien produzieren jedoch auch andere MMPs, und dies spiegelt sich auch im Proteasemuster humaner Tumoren wieder. Auch die extrazelluläre Matrix der Zielorgane ist unterschiedlich
ERSATZBLÄTT (REGEL 26) aufgebaut was unterschiedliche Anforderungen an die Tumorzellproteasen stellt. Ein allgemeingültiger Ansatz muß daher auch andere Proteasehemmstoffe als TIMP-2, wie z.B. TIMP-1 , PAI-1 oder PAI-2 einbeziehen. Modifikationen in der Struktur der natürlich vorkommenden Inhibitoren führen zu Steigerungen der Wirksamkeit oder zur Verringerung etwaiger Nebenwirkungen. Solche Modifikationen bestehen in Verkürzungen des Moleküls oder in der Veränderung der Sequenz durch Austausch einzelner Basen der DNA. Bespielweise gelingt es durch Entfernung eines endständigen (C-terminalen) Teils des TIMP-2 Moleküls, dessen unerwünschte Protease-aktivierende Funktion zu entfernen.
2. Eine Alternative zur Hemmung der Degradation der extrazellulären Matrix (ECM) ist die Verstärkung oder Modifikation derselben. Es können hier natürlicherweise vorkommende Komponenten der extrazellulären Matrix überexprimiert werden. Hierunter fallen die Gene für die verschiedenen Kollagene, Fibronektin, Laminin und Gene deren Produkte für die Synthese von nicht proteinischen Komponenten der ECM verantwortlich sind. Weiterhin können Komponenten der ECM, die gewöhnlich nicht in dem betreffenden Organ exprimiert werden, ortsfremd exprimiert werden und damit die Organspezifität von Metastasen verändert werden. Weiterhin können nicht abbaubare oder schwer abbaubare Substanzen, die ein unüberwindliches Hindernis für metastatische Zellen darstellen exprimiert werden.
Ausführungsbeispiel 2:
Es ist seit längerem bekannt, daß in zirrhotischen Lebern seltener Metastasen entstehen, als in normalen Lebern. Ursache hierfür ist vermutlich die Hemmung der Ausbreitung metastatischer Zellen in fibrotischem Gewebe. Diesen Zusammenhang kann man therapeutisch nutzen und erweitern indem hepatisches Normalgewebe durch Gentransfer dazu gebracht wird, seine Mikroanatomie so zu ändern, daß eine Art eingeschränkte künstliche Zirrhose/Fibröse zu generiert wird und damit metastatische Zellen an ihrer Expansion gehindert werden. Kollagen IV ist Hauptbestandteil von Basalmembranen. Eine solche existiert zwischen Hepatozyten und Sinusoiden nicht. Nur wenig kollagenes Gewebe liegt im Disseschen Raum. Eine geringgradige Erhöhung des Kollagengehaltes wird die Metastasierungsfähigkeit empfindlich einschränken. Vektorkonstruktion: Die beiden Polypeptidketten, die die Tripelhelix der Kollagenfibrille generieren, werden in einen Minimal-Adenovirus Shuttle Vektor kloniert. Als Promotor wird ein tet-Aktivator-responsiver und Doxycyclin-abhängiger Promotor verwendet, um das Ausmaß der Transgenexpression steuerbar zu halten. Außerdem wird der tet-Aktivator mit auf das Shuttle Plasmid gebracht. Unter Verwendung eines beliebigen Verpackungssystems wird ein Minimal-Adenovirus hergestellt (=HDAD-tetColl)
Vektortestung: In Nacktmäusen werden durch Injektion von LS 174 Zellen Lebermetastasen induziert. Die Verabreichung von HDAd-tetColl erfolgt in Analogie zur Methodik in Ausführungsbeispiel 1. Gleiches gilt für die Auswertung.
3. Ein anderer Weg zur Blockade von Tumorzellinvasion und Motilität ist die Verstärkung der Zeil-Zeil und Zell-Matrix-Adhäsionen. Zu nennen sind die tight junetions mit den Proteinen Claudin und Occludin, die Desmosomen und Adherence junetions mit dem Hauptprotein Cadherin, Integrine, die v.a. mit Komponenten der ECM reagieren, die Immunglobulin Superfamilie, die Selectine und die Muzine.
Ausführungsbeispiel 3:
Es wurde bereits gezeigt, daß E-Cadherin für die Interaktion von Epithelzellen verantwortlich ist und ein Verlust von E-Cadherin durch Zellen im Primärtumor
Metastasierung fördert (Birchmeier, W. (1995) E-cadherin as a tumor (invasion) suppressor gene. Bioessays 17, 97-99). Eine Expression von E-Cadherin durch
Normalzellen führt einerseits zu einer Adhesion mit den Tumorzellen und zu einer
Hemung von deren Motilität und weiterhin zu einer Verstärkung der Adhesion innerhalb der Normalzellen.
Vektorkonstruktion: Ein Erstgenerations-Adenovirus wird konsruiert, welches das E-
Cadherin-Gen unter der Kontrolle des RSV-Promotors trägt: Ad-RSV-E-Cad.
In vitro Testung: Zur Funktionstestung werden A2 Zellen mit Ad-RSV-E-Cad transduziert. Eine Zunahme der Adhesion wird durch Bestimmung der Zeitdauer ermittelt, die Trypsin benötigt, um die Zellen zu vereinzeln.
Vektortestung :ln Nacktmäusen werden durch Injektion von LS 174 Zellen
Lebermetastasen induziert. Die Verabreichung von Ad-RSV-E-Cad erfolgt in
Analogie zur Methodik in Ausführungsbeispiel 1. Gleiches gilt für die Auswertung. Transgene mit Membranankersequenz
Suizidgene werden im Sinne der Erfindung zur Imprägnierung von Normalgewebe verwendet, dazu müssen sie mit einer Membranankersequenz ausgestattet werden, um extrazellulär wirksam zu sein und eine applizierte Prodrug auch extrazellulär toxifizieren zu können.
Ausführungsbeispiel 4:
Das Gen für das Suizidgen Cytosin Desaminase unter der Kontrolle des
HNFAIbumin-Promotors wird mit einer Membranankersequenz versehen, so daß es nach Transfektion membranständig exprimiert wird. Diese Expressionskassette wird in einen AAV-shuttle Plasmid kloniert und ein AAV wird unter Verwendung eines beliebigen Helfersystems hergestellt (=AAV-HNFAIb-CD-Tm).
In vitro Testung: A2 Zellen werden mit AAV-HNFAIb-CD-Tm transduziert. 24 h nach
Transduktion wird die Prodrug 5-FC in den Zellkulturüberstand (ZKÜ) gegeben. 5-FC wird nun durch die membranständige CD in das zytotoxische 5-FU überführt. Der
Überstand wird nach 24 h gesammelt und auf die Zellinie LS174 sowie auf ruhende primäre Hepatozyten gegeben. Nach weiteren 72h werden Zellzählungen vorgenommen, und das Ausmaß der Apoptose wird bestimmt.
In vivo Testung: Vektorappplikation und Ermittlung der Therapieeffizienz verlaufen in
Analogie zum Ausführungsbeispiel 1.
Zielorgane
Auf Grund der hervorragenden Infizierbarkeit der Leber bei systemischer Gabe von Adenoviren und der hohen klinischer Relevanz der Behandlung kolorektaler Metastasen wurde das erfindungsgemäße Verfahren an Hand des oben beschriebenen Krankheitsmodells entwickelt. Das Modell läßt sich auch auf andere Tumorerkrankungen anwenden. Zu den häufigsten Krankheitsbildern gehören Leber- ,Lungen,-Knochen- und Hirnmetastasen bei Mammakarzinom mit Latenzzeiten bis zu 10 Jahren nach Entfernung des Primärtumors, ein Zeitraum, der bisher ungenutzt verstreicht, Hirnmetastasen bei Bronchialkarzinom und Knochenmetastsen bei Prostatakarzinom. Weiterhin gibt es Primärtumoren, die aufgrund des fortgeschrittenen Stadiums primär inoperabel sind, wie häufig Glioblastome und Hepatozelluläre Karzinome. Als lebensverlängernde Maßnahme ist hier der Schutz des umgebenden Normalgewebes nach oben genanntem Prinzip vorstellbar.
Legende zu den Abbildungen:
Abbildung 1 : Verhinderung von Lebermetastasierung durch systemische Applikation von Ad-TIMP-2. An Tag 0 wurden 3x1010 pfu Ad-TIMP-2 oder Ad-ßgal in die Schwanzvene von Nacktmäusen appliziert. 3 Tage später erhielten die Tiere eine intrasplenale Injektion von LS174 Kolonkarzinomzellen zur Induktion von Lebermetastasen. Representative in situ Photographien von unbehandelten (links), Ad-ßgal behandelten (Mitte) und Ad-TIMP-2 behandelten (rechts) Tieren nach 5 Wochen.
Abbildung 2: Methodik wie Abbildung 1. Nach 5 Wochen wurden die Tiere getötet und die Tumormassen wurden bestimmt. Punkte entsprechen einzelnen Tieren, Balken entsprechen den Mittelwerten.

Claims

Patentansprüche
1. Mittel zur gentherapeutischen Prophylaxe und Therapie von Tumorerkrankungen umfassend einen
- Vektor im Sinne eines Gentransfervehikels
- Enhancer/Promotor
- Transgen wobei mindestens einer der aufgeführten Bestandteile auf die Imprägnierung von Normalgewebe ausgerichtet ist.
2. Anwendung des Mittels nach Anspruch 1 zur gentherapeutischen Prophylaxe und Therapie von Tumorerkrankungen umfassend einen
- Vektor im Sinne eines Gentransfervehikels
- Enhancer/Promotor
- Transgen wobei mindestens einer der aufgeführten Bestandteile auf die Imprägnierung von Normalgewebe ausgerichtet ist.
3. Anwendung eines Gentransfervektors umfassend ein Transgen in operativer Verknüpfung mit einem Enhancer/Promotor zur Herstellung eines Mittels für die gentherapeutische Prophylaxe und Therapie von Tumorerkrankungen durch Verabreichung an Normalgewebe.
4. Verfahren zur gentherapeutischen Prophylaxe und Therapie von Tumorerkrankungen dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mittel umfassend einen
- Vektor im Sinne eines Gentransfervehikels
- Enhancer/Promotor
- Transgen wobei mindestens einer der aufgeführten Bestandteile auf die Imprägnierung von Normalgewebe ausgerichtet ist, einem Subjekt, welches einer prophylaktischen oder therapeutischen Tumorbehandlung bedarf, derart verabreicht, daß der Vektor im Wesentlichen von Normalzellen aufgenommen wird.
5. Mittel nach Anspruch 1 , mit einem Promotor und/oder Enhancer, der durch Transkriptionsfaktoren reguliert wird, die in Normalgewebe aktiv sind.
6. Mittel nach Anspruch 5 enthaltend den CMV-Promotor oder den SV 40 Promotor oder den RSV Promotor, oder leberspezifische Promotoren, wie den Albumin Promotor oder lungenspezifische Promotoren oder himgewebsspezifische Promotoren oder knochenspezifische Promotoren oder Promotoren, die in potentiellen metastatischen Zielorganen oder Organen des Entstehens von Primärtumoren aktiv sind.
7. Mittel nach Anspruch 5 enthaltend einen Enhancer/Promotor der durch Zugabe einer applizierbaren Substanz aktiviert wird.
8. Mittel nach Anspruch 5 und 7 bei dem es sich um einen Tetracyclin abhängigen oder einen Steroidhormon abhängigen Promotor handelt.
9. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend Transgene für Substanzen,
- welche das Wachstum des Tumors begrenzen
- den Tumor zerstören
- das Normalgewebe vor Tumorinvasion schützen.
10. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend Gene von Metalloproteaseinhibitoren
11. Mittel nach Anspruch 1 und 10 enthaltend ein antitumorales Transgen kodierend für:
TIMP-1 oder TIMP-2
12. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend ein Protease-inhibitorisches Transgen kodierend für:
TIMP-3 oder TIMP-4 oder PAI-1 oder PAI-2.
13. Mittel nach Anspruch 11 oder 12 enthaltend ein modifiziertes Transgen, dessen antitumorale Wirkung durch diese Modifikation verstärkt wurde.
14. Mittel nach Anspruch 13 welches als betreffendes Transgen C-terminal trunkierte TIMP-2 enthält.
15. Mittel nach Anspruch 1 , 2 oder 3 enthaltend ein Transgen der Extrazellulären Matrix.
16. Mittel nach Anspruch 15 enthaltend mindestens zwei Polypeptidketten des Kollagen oder Fibronektin oder Laminin oder Gene deren Produkte für die Synthese von nicht proteinischen Komponenten der ECM verantwortlich sind.
17. Mittel nach Anspruch 15 oder 16 enthaltend ein so modifiziertes Transgen der Extrazellulären Matrix, daß es schwer oder nicht abbaubar ist.
18. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend ein Transgen kodierend für ein Adhäsionsmolekül.
19. Mittel nach Anspruch 18 in dem das betreffende Adhäsionsmolekül das Claudin oder Occiudin oder ein Cadherin oder ein Integrin oder ein Gen aus der Immunglobulin Superfamilie ein Selectin oder ein Muzin ist.
20. Mittel zur Prophylaxe und Behandlung von Tumorerkrankungen enthaltend ein antitumorales Transgen oder Sequenzen desselben, welches mit einer Membranankersequenz versehen ist.
21. Anwendung eines Gentransfervektors zur Herstellung eines Mittels zur Prophylaxe und Behandlung von Tumorerkrankungen enthaltend ein antitumorales Transgen oder Sequenzen desselben, welches mit einer Membranankersequenz versehen ist.
22. Verfahren zur Prophylaxe und Behandlung von Tumorerkrankungen bei dem ein antitumorales Transgen oder Sequenzen desselben, welches mit einer Membranankersequenz versehen ist transferiert wird.
ERSATZBUTT (REGEL 26)
23. Mittel nach Anspruch 20 welches als betreffendes Transgen ein Suizidgen oder ein sonstwie chemotherapeutisch wirksames Gen enthält
24. Mittel nach Anspruch 23 in dem das betreffende Transgen
Cytosin Desaminase oder aktive Teilsequenzen derselben oder Nitroreduktase oder aktive Teilsequenzen derselben sind.
25. Mittel nach Anspruch 1 in dem der Vektor ein Virus ist.
26. Mittel nach Anspruch 25 in dem das Virus ein Erstgenerations-Adenovirus oder ein Adeno-assoziiertes Virus oder ein Minimal-Adenovirus oder ein HSV oder ein Lentivirus ist.
27. Mittel nach Anspruch 26 in dem das Virus ein Lentivirus/Minimal-Adenovirus Hybrid ist.
28. Mittel nach Anspruch 27 in dem der Vektor ein nicht-humanes Mammalier- Adenovirus ist.
29. Mittel nach Anspruch 1 in dem der Vektor kein Virus ist.
30. Mittel nach Anspruch 29 in dem der Vektor eine liposomale Formulation ist oder Trägerproteine verwendet sind.
31. Mittel nach Anspruch 25 und 29, in dem die Oberfläche so modifiziert ist, daß ein spezifischer Gentransfer in das Normalgewebe erreicht wird.
32. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend ein Minimal-Adenovirus und TIMP-2.
33. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend ein Minimal-Adenovirus und C-terminal trunkiertes TIMP-2.
34. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend ein AAV und TIMP-2
ERSATZBUπ (REGEL 26)
35. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend ein Erstgenerations-Adenovirus und TIMP-2.
36. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend ein Lentivirus/Minimaladenovirus Hybrid und TIMP-2.
37. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend ein AAV und C-terminal trunkiertes TIMP-2.
38. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend ein Minimal-Adenovirus und E-Cadherin.
39. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend ein AAV und E-Cadherin.
40. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend ein Minimal-Adenovirus und mindestens zwei Polypeptidketten des Kollagen.
41. Mittel nach Anspruch 1 zum Gentransfer ins Lebergewebe.
42. Mittel nach Anspruch 1 zur Therapie und Prophylaxe von Lebermetastasen.
43. Mittel nach Anspruch 1 zur Therapie von Hirntumoren.
44. Mittel nach Anspruch 1 zur Therapie von Lungenmetastasen.
45. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend den HNFAIbumin-Enhancer/Promotor, AAV und TIMP-1.
46. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend einen Enhancer/Promotor, der durch eine körperfremde Substanz aktiviert wird und mindestens zwei Polypeptidketten des Kollagen.
47. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend einen leberspezifischen Promotor, ein AAV und einen Metalloprotease-Inhibitor.
48. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend einen leberspezifischen Promotor, ein Minimal-Adenovirus und einen Metalloprotease-Inhibitor.
ERSATZBUTT (REGEL 26)
49. Mittel nach Anspruch 1 und 9 enthaltend einen leberspezifischen Promotor und ein Minimal-Adenovirus.
50. Mittel nach Anspruch 1 und 9 enthaltend einen leberspezifischen Promotor und ein AAV.
51. Mittel nach Anspruch 1 und 9 enthaltend einen leberspezifischen Promotor und ein Lentivirus/Minimal-Adenovirus Hybrid.
ERSATZBUTT (REGEL 26)
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