DE10159128A1

DE10159128A1 - Genregulatorische Elemente zur Gentherapie, zur Prävention und Diagnose von Metastasen bzw. zur Gentherapie von Tumoren

Info

Publication number: DE10159128A1
Application number: DE10159128A
Authority: DE
Inventors: Karsten Brand
Original assignee: Individual
Current assignee: Custos Biotechnologie 13125 Berlin De GmbH
Priority date: 2001-07-13
Filing date: 2001-12-01
Publication date: 2003-01-23

Abstract

Die Erfindung betrifft Transkriptions-regulatorische Genelemente (Promotoren/Enhancer), die im Rahmen der Ausbreitung maligner Zellen in das umgebende Normalgewebe im Normalgewebe aktiviert werden. Bei den Ausbreitungsprozessen kann es sich um eine metastatische oder vom Primärtumor ausgehende Invasion handeln. Diese Transkriptions-regulatorischen Genelemente werden zur Regulation von antitumorösen Transgenen im Rahmen der Gentherapie von Tumoren oder zur Regulation von Reportergenen zur Diagnose von Metastasen eingesetzt.

Description

Die bei weitem häufigste Todesursache maligner Tumorerkrankungen ist die Organmetastasierung. Während der Primärtumor zumindest in frühen und mittleren Stadien chirurgisch reseziert werden kann, ist dies im Fall der Metastasierung selten möglich. Von wenigen Ausnahmen abgesehen, können die konventionellen Methoden der Chemotherapie und Bestrahlung, wenn überhaupt, dann nur vorübergehende Besserungen des klinischen Bildes metastasierter Tumoren erreichen.
Zu den häufigsten Tumoren gehören kolorektale Karzinome. Lebermetastasen kolorektalen Ursprungs sind die häufigste Todesursache für Patienten mit kolorektalen Karzinomen. Da sie nach chirurgischer Entfernung des Primärtumors häufig über einen längeren Zeitraum die einzige Manifestation der Erkrankung darstellen, sind sie ein mögliches Ziel für kurative Therapieansätze (Dreben, JA and Niederhuber, JE. (1993) Cancer of the lower gastrointestinal tract - Colon cancer. In: Niederhuber, JE ed. Current Therapy in Oncology. St. Louis, MO: Decker, 426-431). Die potentiell kurative chirurgische Entfernung von Lebermetastasen ist aber nur für einen kleinen Prozentsatz der Patienten möglich und für die Chemotherapie sind zwar vorübergehende Remissionen aber keine Lebensverlängerung gezeigt. Daher besteht dringender Bedarf nach alternativen Therapieformen.
Die seit etwa 10 Jahren in der Entwicklung befindlichen gentherapeutischen Ansätze besitzen aufgrund ihrer Komplexität ein gegenüber konventionellen Therapieformen ein dramatisch erhöhtes Maß an Regulierbarkeit. Diese kann im Bereich der Krebsgentherapie unter anderem zum tumorspezifischen Targeting der Vektoren oder der Beschränkung der Genexpression auf Tumorgewebe und zur spezifischen Adaptation der transferierten Transgene an Angriffspunkte des jeweiligen Tumortyps genutzt werden.
Abgesehen von immunologischen Herangehensweisen, haben die bisher verfolgten gentherapeutischen Ansätze, wie schon die konventionellen Methoden, fast ausschließlich das infiltrierende Tumorgewebe zum primären Angriffspunkt. Dies birgt die Problematik unzureichenden Erreichens des Tumors, welcher sich mit erhöhtem intratumoralem Druck und eingeschränkter Blutversorgung präsentiert und selbst bei der üblicherweise durchgeführten direkten intratumoralen Injektion gentherapeutischer Transfervehikel nur ungenügend getroffen wird. Im Falle multipler Metastasierung hat sich gezeigt, daß sich bei der dann erforderlichen systemischen oder regionalen Gabe der Vektoren das umgebende Normalgewebe sogar wesentlich besser infizieren läßt als die Tumorzellen. Diese Tatsache kann man ausnutzen, indem man die Problematik der schwierigen Erreichbarkeit des Tumorgewebes umgeht, indem das gut zu erreichende Normalgewebe zum primären gentherapeutischen Ziel erklärt wird. Das Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß das normale Organgewebe direkt am Ort einer potentiellen oder stattgehabten Metastasierung mit Abwehrfunktionen ausgestattet wird, die eine Etablierung bzw. ein weiteres Wachstum der Metastasen verhindern. Ebenso kann die weitere Ausbreitung eines inoperablen Primärtumors verhindert werden. Diese Strategie der Imprägnierung des gesunden Gewebes unterscheidet sich grundlegend von allen bisher durchgeführten gentherapeutischen und nicht-gentherapeutischen Ansätzen. Ein Problem dieses Ansatzes besteht aber darin, daß bei Verwendung ubiquitär aktiver oder Organ-spezifischer Gen-regulatorischer Elemente eine konstitutive Expression antitumoröser Transgene erfolgt, die vom Ausmaß des tatsächlichen invasiven Geschehens unabhängig ist und potentiell zu erheblichen Nebenwirkungen führen kann. Es ist daher notwendig die Aktivierung antitumoröser Transgenprodukte auf das Normalgewebe in der Umgebung tatsächlich betroffener Tumorareale zu beschränken.
Die Invasion von Tumorzellen in das Normalgewebe ist ein sehr komplexer, fein abgestimmter Prozess. Am Beispiel der Lebermetastasierung läßt sich erkennen, daß die Zellen des Normalgewebes auf unterschiedlichste Art und Weise auf die Invasion reagieren. Die Hepatozyten zum Beispiel reagieren unter anderem mit Vakuolenbildung, Fetteinlagerung oder massiver Verformung der Zellgestalt. Solche, als Abwehrreaktionen oder zumindest Reaktionen auf den Invasionsprozess zu deutenden Veränderungen, hängen von der Transkription der entsprechenden, an diesen Prozessen beteiligten Gene (Invasions-induzierte Gene) ab. Neben den Reaktionen des Normalgewebes, welches dem Tumor direkt anliegt, reagiert auch Gene in entfernter liegendem Normalgewebe auf Tumoraktivität (Ausbreitungs-induzierbare Gene).
Die Erfindung hat das Ziel durch Verwendung Ausbreitungs-oder Invasionsaktivierbarer Gen-regulatorischer Elemente die Gentherapie von Metastasen und Primärtumoren effektiver und sicherer zu machen bzw. eine frühzeitige Diagnose aktivierter Mikrometastasen zu ermöglichen.
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert.
Wesentlicher Punkt der Erfindung sind die verwendeten Enhancer/Promotoren. Diese Gen-regulatorischen Elemente Ausbreitungs- und Invasions-induzierter Gene werden verwendet, um unter ihre Kontrolle antitumoröse Gene, wie Tumor-Suppressorgene, Suizidgene, angiostatische und antiproteolytische Gene zu stellen. Dies erlaubt dann, die Aktivierung dieser Gene im Normalgewebe genau zum gewünschten Zeitpunkt der aktiven Tumorinvasion. Neben einer Vielzahl solcher Enhancr/Promotoren noch unbekannter Gene sind bereits schon mehrere Stressgene bekannt, die insbesondere bei metabolischen und bei thermischen Stressituationen aktiviert werden. Dazu gehören auch die Hitzeschock-Proteine (HSPs) mit den Vertretern HSP 27 und HSP 70 oder die Gewebstransglutaminase (TG).
Die betreffenden Promotoren/Enhancer können auch diagnostisch genutzt werden. In diesem Falle werden Reportergene als Transgene verwendet, deren Genprodukte ins Blut sezerniert werden, wenn z. B. Mikrometastasen aktiv werden und die Promotoren/Enhancer im umgebenden Normalgewebe aktivieren. Auf diese Art kann man aktive Mikrometastasen erkennen, die zumindest mit bildgebenden Verfahren noch nicht zu erkennen wären und entsprechend therapeutisch reagieren.
Weiterhin werden Kombinationen von diagnostischen Genen unter der Kontrolle Ausbreitungs-oder Invasions-aktivierter Enhancer/Promotoren und antitumorösen Genen unter der Kontrolle extern regulierter Enhancer/Promotoren verwendet. Dies bietet die Möglichkeit nach Feststellung einer Metastasenaktivierung extern steuerbar therapeutisch einzugreifen.
Als Gentransfervehikel werden virale, liposomale und andere nicht virale Vektoren verwendet.
In folgende klinischen Szenarien läßt sich der erfindungsgemäße Ansatz einfügen:

1. Die präoperative oder intraoperative Vektorapplikation in Zielorgane, um die Extravasion etwaiger bei Operation des Primärtumors losgelöster metastatischer Tumorzellen zu unterbinden.
2. Die Verhinderung des Auswachsens bzw. das Abtöten okkulter Mikrometastasen vor allem bei Hochrisikogruppen wie dem operierten Mammakarzinom mit Lymphknotenbefall oder kolorektalen Tumoren.
3. Die Begrenzung des Wachstums bereits etablierter Metastasen oder inoperabler Primärtumoren.
4. Die frühzeitige Diagnosestellung aktiver Mikrometastasen.

Anwendungsbeispiel

1. Vektorkonstruktion

Es werden Gentransfervektoren konstruiert, welche als Promotor/Enhancer den HSP 70 Promotor oder den TG Promotor enthalten, als Transgen das TIMP-2 Gen (hemmt die Tumorausbreitung) oder entweder das Reportergen β-Galactosidase oder α₁-Antitrypsin tragen und als Vektorkomponente ein Erstgenerations-Adenovirus haben.

2. Tumormodell

Als Tumormodell wird eine Injektion von Kolonkarzinomellen (z. B. LS174 T) in den Portalvenenkreislauf der Leber von immundefizienten Nacktmäusen verwendet, um Lebermetastasen zu induzieren, oder die Tumorzellen werden direkt in die Leber injiziert, um einen Lebertumor zu induzieren.

3. Gentransfer

10 Tage nach Tumorinduktion, wenn sich kleine Tumoren gebildet haben, werden über die Schwanzvene der Tiere rekombinante Adenoviren gemäß Punkt 1 verabreicht. In einer Dosis von 3 × 10¹⁰ infektiösen Einheiten werden dabei etwa 50% der Leberzellen infiziert.

4. Detektion der Tumorausbreitung

Ab Tag 3 nach dem Gentransfer wird den Tieren Blut abgenommen, und die Konzentration des ct1-Antitrypsin wird bestimmt. Die Konzentration des Proteins im Serum von Tieren mit Tumorinduktion und Transfer des α₁-Antitrypsin-Adenovirus ist mehrfach höher als im Serum von Tieren, die entweder nur Tumorinduktion oder nur Gentransfer hatten. Die Konzentration wird ansteigen mit zunehmender Größe der Tumorinvasionsfront, also mit zunehmender Ausbreitung des Tumors.
Ähnliche Ergebnisse erhält man, wenn β-Galaktosidase Adenovirus verwendet wird, nur daß hier nicht die Serumkonzentration gemessen wird, sondern die intrazelluläre β-Galaktosidasekonzentration, die über eine histochemische Reaktion (Blaufärbung) sichtbar gemacht wird. Leberzellen in unmittelbarer Nähe sich ausbreitender Tumoren sind stärker blau gefärbt als entferntere Zellen. Keine Blaufärbung ist in Tumortieren ohne Gentransfer zu sehen. Geringe oder fehlende Blaufärbung ist bei Gentransfer ohne Tumorinduktion zu sehen.

5. Effizienz

Die Effizenz des Ansatzes bezüglich der Hemmung der Tumorausbreitung wird mit dem TIMP-2 Gen als Transgen gezeigt. Tumortragende Tiere, die ein TIMP-2 Adenovirus erhielten, werden zu unterschiedlichen Zeitpunkten getötet, die Tumorvolumina werden ermittelt und mit denen von Tieren, die Reportergenviren erhalten hatten verglichen. Die TIMP-2 Tiere weisen erheblich kleinere Tumoren auf. Die entsprechenden Abbildungen werden nachgereicht.

Claims

1. Mittel zur Prophylaxe, Therapie und Diagnose von Tumorerkrankungen umfassend
einen Vektor im Sinne eines Gentransfervehikels
einen Enhancer/Promotor
ein oder mehrere Transgene,
dadurch gekennzeichnet, daß ein Enhancer/Promotor gewählt wird, der bei Ausbreitung des Tumors ins umgebende Normalgewebe im Normalgewebe aktiviert wird.

2. Mittel nach Anspruch 1 in dem der Enhancer/Promotor ein Hitzeschockgen- Enhancer/Promotor ist.

3. Mittel nach Anspruch 1 in dem der Enhancer/Promotor ein Apoptoseinduktorgen- Enhancer/Promotor ist.

4. Mittel nach Anspruch 1 in dem der Enhancer/Promotor der Enhancer/Promotor der Gewebstransglutaminase ist.

5. Mittel nach Anspruch 1 in dem der Enhancer/Promotor durch metabolischen Stress induzierbar ist.

6. Mittel nach Anspruch 1 in dem der Enhancer/Promotor durch Hypoxie induzierbar ist.

7. Mittel nach Anspruch 1 in dem der Enhancer/Promotor in Hepatozyten oder Kupfferschen Sternzellen oder Sinusendothelzellen durch Ausbreitung des Tumors aktivierbar ist.

8. Mittel nach Anspruch 1 in dem der Enhancer/Promotor im Lungengewebe oder Nervengewebe oder Knochengewebe oder Lymphknoten oder Haut durch Ausbreitung des Tumors aktivierbar ist.

9. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend Transgene für Substanzen,
welche das Wachstum des Tumors begrenzen
en Tumor zerstören
das Normalgewebe vor Tumorinvasion schützen.

10. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend Gene von Metalloproteaseinhibitoren

11. Mittel nach Anspruch 1 und 10 enthaltend ein antitumorales Transgen kodierend für:
TIMP-1 oder TIMP-2

12. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend ein Protease-inhibitorisches Transgen kodierend für:
TIMP-3 oder TIMP-4 oder PAI-1 oder PAI-2.

13. Mittel nach Anspruch 11 oder 12 enthaltend ein modifiziertes Transgen, dessen antitumorale Wirkung durch diese Modifikation verstärkt wurde.

14. Mittel nach Anspruch 13 welches als betreffendes Transgen C-terminal trunkiertes TIMP-2 enthält.

15. Mittel nach Anspruch 1, 2 oder 3 enthaltend ein Transgen der Extrazellulären Matrix.

16. Mittel nach Anspruch 15 enthaltend mindestens zwei Polypeptidketten des Kollagen oder Fibronektin oder Laminin oder Gene deren Produkte für die Synthese von nicht proteinischen Komponenten der ECM verantwortlich sind.

17. Mittel nach Anspruch 15 oder 16 enthaltend ein so modifiziertes Transgen der Extrazellulären Matrix, daß es schwer oder nicht abbaubar ist.

18. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend ein Transgen kodierend für ein Adhäsionsmolekül.

19. Mittel nach Anspruch 18 in dem das betreffende Adhäsionsmolekül das Claudin oder Occludin oder ein Cadherin oder ein Integrin oder ein Gen aus der Immunglobulin Superfamilie ein Selectin oder ein Muzin ist.

20. Mittel zur Prophylaxe und Behandlung von Tumorerkrankungen enthaltend ein antitumorales Transgen oder Sequenzen desselben, welches mit einer Membranankersequenz versehen ist.

21. Anwendung eines Gentransfervektors zur Herstellung eines Mittels zur Prophylaxe und Behandlung von Tumorerkrankungen enthaltend ein antitumorales Transgen oder Sequenzen desselben, welches mit einer Membranankersequenz oder Sekretionssequenz versehen ist.

22. Verfahren zur Prophylaxe und Behandlung von Tumorerkrankungen bei dem ein antitumorales Transgen oder Sequenzen desselben, welches mit einer Membranankersequenz oder Sekretionssequenz versehen ist, transferiert wird.

23. Mittel nach Anspruch 20 welches als betreffendes Transgen ein Suizidgen oder ein sonstwie chemotherapeutisch wirksames Gen enthält.

24. Mittel nach Anspruch 23 in dem das betreffende Transgen Cytosin Desaminase oder aktive Teilsequenzen derselben oder Nitroreduktase oder aktive Teilsequenzen derselben sind.

25. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend mindestens 1 Transgen, welches zum Nachweis von Tumoraktivität verwendet werden kann.

26. Mittel nach Anspruch 25 enthaltend mindestens 1 Transgen dessen Genprodukt ins Blut sezerniert wird wie alpha Fetoprotein oder alpha 1 Antitrypsin.

27. Mittel nach Anspruch 25 enthaltend mindestens 1 Transgen, dessen Genprodukt durch lsotopendiagnostik sichtbar gemacht werden kann.

28. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend sowohl ein therapeutisches als auch ein diagnostisches Transgen.

29. Mittel nach Anspruch 28 dadurch gekennzeichnet, daß das therapeutische Gen nicht durch einen Ausbreitungs-induzierbaren Promotor/Enhancer sondern durch einen extern regulierbaren Promotor/Enhancer, wie z. B. den tet-Promotor reguliert wird.

30. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Enhancer/Promotor gewählt wird, der bei Ausbreitung des Tumors ins Normalgewebe im Normalgewebe, welches direkt an die Invasionsfront des Tumors angrenzt, aktiviert wird.

31. Mittel nach Anspruch 1 in dem der Vektor ein Virus ist.

32. Mittel nach Anspruch 31 in dem das Virus ein Erstgenerations-Adenovirus oder ein Adeno-assoziiertes Virus oder ein Minimal-Adenovirus oder ein HSV oder ein Lentivirus ist.

33. Mittel nach Anspruch 31 in dem das Virus ein Lentivirus/Minimal-Adenovirus Hybrid ist.

34. Mittel nach Anspruch 31 in dem der Vektor ein nicht-humanes Mammalier- Adenovirus ist.

35. Mittel nach Anspruch 1 in dem der Vektor kein Virus ist.

36. Mittel nach Anspruch 35 in dem der Vektor eine liposomale Formulation ist oder Trägerproteine verwendet sind.

37. Mittel nach Anspruch 31 und 35, in dem die Oberfläche so modifiziert ist, daß ein spezifischer Gentransfer in das Normalgewebe erreicht wird.