DE19605105A1 - Neue Sonde zur Früherkennung von epithelialen Dysplasien des mehrschichtigen Plattenepithels sowie zur Tumordiagnostik und Tumortherapie von Plattenepithelkarzinomen - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues therapeutisches oder diagnostisches Mittel mit mindestens einer Nukleinsäure als Wirk­ stoff, das sich insbesondere zur Früherkennung von Dysplasien des mehrschichtigen Plattenepithels und des Knorpels sowie zur Tumordiagnostik und Tumortherapie eignet.

Plattenepithelkarzinome, Präkanzerosen und Dysplasien

Das Plattenepithelkarzinom ist der am häufigsten auftretende Tumor des Oesophagus. Diese Form von Tumoren wird in der Tumordi­ agnostik auf Grund histologischer Kriterien in vier verschiedene Kategorien (G1, G2, G3 und G4) unterteilt, wobei die histopa­ thologischen Abnormalitäten in G1-Tumoren am geringsten, die in G4-Tumoren am größten sind.

Die Entwicklung geeigneter Verfahren in der Tumortherapie sind Gegenstand intensiver medizinischer Forschung. Grundlage dieser Forschung ist sowohl eine umfassende morphologische, histologi­ sche und molekulare Tumordiagnostik als auch die Erforschung der Tumorentstehung. Die molekulare Ätiologie der Tumorentstehung ist nicht einheitlich - häufig können jedoch Mutationen (Deletionen, Gen-Amplifikationen, Translokationen chromosomaler Abschnitte etc.) im betroffenen Gewebe nachgewiesen werden, die sich schrittweise in fehlgeleiteter Differenzierung und letztlich in unkontrollierter Zellteilung manifestieren. In Plattenepithelkar­ zinomen des Oesophagus sind eine Vielzahl von Mutationen in Onkogenen, Tumor-Suppressorgenen und Genen für Wachstumsfaktoren beschrieben (Übersicht in Stemmermann et al., 1994). Inter­ essanterweise konnten derartige Mutationen auch in den dem Tumor benachbarten, histologisch normal erscheinenden Geweben nach­ gewiesen werden. Man geht davon aus, daß für die Entstehung eines Tumors die Gesamtheit intrazellulärer Schäden einen kritischen Schwellenwert überschreiten muß. Eine erfolgreiche Tumortherapie wird daher auch von der Diagnostizierung früher Stadien der Tumorentstehung abhängig sein.

Aus histopathologischer Sicht gelten Dysplasien des mehrschichti­ gen Plattenepithels als präkanzerogene Läsionen und somit als potentielle Frühstadien der Tumorentstehung. Die Ursachen der Dysplasien sind u. a. in der Entartung der Transkriptionskontrolle differenzierungsspezifischer Gene zu suchen. Diese Kontrolle wird normalerweise von einem geordneten Zusammenwirken von Trans­ kriptionsfaktoren, die die Aktivität dieser Zielgene gemeinsam regulieren, gewährleistet. Gelingt der Nachweis, daß bereits die Expression, subzelluläre Lokalisation bzw. Aktivität dieser Transkriptionsfaktoren verändert sind, können derartige Befunde als diagnostische Marker zur frühen Erkennung von Dysplasien Verwendung finden. Hinsichtlich der Tumoren des Plattenepithels sollte ein günstiger Marker auch im malignen Gewebe eine Ver­ änderung der Expression aufweisen.

Pax-Gene

Pax-Gene repräsentieren eine Multigenfamilie, die eine kon­ servierte DNA-Sequenz, die "paired"-Box, enthalten. Aus dem Genom des Menschen und der Maus sind bisher jeweils 9 verschiedene Pax-Gene (Pax1-Pax9) isoliert worden (Übersicht in Walther et al., 1991; Stapleton et al., 1993; Wallin et al., 1993). Die "paired"-Box ist darüber hinaus auch in Vertretern niedrigerer Tier­ klassen, z. B. in Nematoden, Drosophila, Zebrafisch, Schildkröte und Huhn, nachgewiesen worden (Übersicht in Noll, 1993). Die "paired"-Box kodiert für die DNA-bindende "paired"-Domäne; die Proteine der Pax-Gene konnten somit in die Gruppe der Trans­ kriptionsfaktoren eingeordnet werden (Treisman et al., 1991, Chalepakis et al., 1991, Xu et al., 1995).

Pax-Gene sind entscheidend an der Entwicklung embryonaler Strukturen beteiligt. Während der Embryonalentwicklung der Maus werden die Pax-Gene sowohl räumlich als auch zeitlich in spezifi­ schen und teilweise einander überlappenden Mustern exprimiert (Gruss & Walther, 1992). Die starke, instruktive Wirkung der Pax-Gene während der Embryonalentwicklung konnte u. a. durch die gentechnisch erzeugte, ektopische Expression von Pax6 in Imagi­ nalscheiben der Flügel bzw. der Beine von Drosophila demonstriert werden (das Pax6-Gen wird normalerweise in der Anlage des Auges exprimiert). Die ektopische Expression von Pax6 in Imaginal­ scheiben der Flügel bzw. der Beine hat zur Folge, daß sich hier an falscher Stelle ein nahezu vollständiges Auge entwickelt (Halder et al., 1995).

Mit der Entdeckung, daß Mutationen in Pax-Genen für kongenitale Fehlbildungen bei Mäusen, aber auch beim Menschen (Pax1: undula­ ted, Pax3: splotch und Waardenburg-Syndrom, Pax6: Small eye und Aniridia) verantwortlich sind, gewannen die Untersuchungen dieser Gengruppe weiter an Bedeutung (Balling et al., 1988; Epstein et al., 1991; Tassabehji et al., 1992; Hill et al., 1991; Ton et al., 1991).

Die Funktion der Pax-Gene ist nicht auf die Embryonalentwicklung beschränkt. Es konnte z. B. gezeigt werden, daß das Pax-5 Protein das Gen CD19 (CD19 kodiert für ein B-Lymphocyten-spezifisches Protein) aktiviert (Kozmik et al., 1992) und somit auch im adulten Organismus eine Funktion übernimmt. Pax8 wird in der Schilddrüse des adulten Organismus exprimiert und ist an der Aktivierung der Gene für Thyroglobulin und Thyroperoxidase beteiligt (Zannini et al., 1992).

Pax-Gene und Tumorentstehung

Einige Mitglieder der Pax-Genfamilie (Pax1, Pax2, Pax3, Pax6, Pax8) sind auf Grund ihrer tumorigenen Eigenschaften als Proto- Onkogene identifiziert worden. Die Identifizierung basiert auf Transformationstests, bei denen die oben genannten Pax-Gene unter der Kontrolle des Cytomegalovirus-Promotors in NIH3T3- bzw. 208-Zellen überexprimiert werden. Injektionen der transformierten 208-Zellen in Nacktmäusen führen in nahezu allen Fällen zum Auftreten von Sarkomen (Maulbecker & Gruss, 1993).

Die molekularen Zusammenhänge der Tumorentstehung durch Aktivie­ rung von Pax-Genen sind nicht bekannt. Für eine Reihe von Rhabdomyosarkomen konnte gezeigt werden, daß Pax3 oder Pax7 in Folge von chromosomalen Translokationen mit dem Gen für FKHR, einem Transkriptionsfaktor aus der Familie der forkhead-Gene, fusioniert ist. Es konnte gezeigt werden, daß chimäre Transkripte aus Pax3-FKHR bzw. Pax7-FKHR in Rhabdomyosarkomen exprimiert werden (Shapiro et al., 1993; Davis et al., 1994).

In Wilm′s Tumoren der Niere konnte die Expression von Pax2 nachgewiesen werden (Dressler & Douglass, 1992). Pax2 ist für die Entwicklung der Niere notwendig - die Expression wird jedoch bereits während der Embryonalentwicklung herabreguliert und ist in der gesunden, adulten Niere nicht nachweisbar (Dressler et al., 1990).

Aus der DE-A-42 25 569 ist ein therapeutisches oder diagnosti­ sches Mittel bekannt, das als Wirksubstanz mindestens eine Nukleinsäure enthält, die mit einem Pax-Gen hybridisiert. Als Pax-Gene werden Pax1 bis Pax8 genannt. Weiterhin beschrieben werden die Verwendung eines derartigen Mittels als molekulare Sonde in der Tumordiagnostik und als Antisense-Nukleinsäure zur Hemmung der Genexpression.

Nicht genannt werden in der DE-A-42 25 569 therapeutische oder diagnostische Mittel unter Verwendung einer Nukleinsäure, die mit einem Pax9-Gen hybridisiert, und Verwendungen eines derartigen Mittels. Dies ist dadurch zu erklären, daß zum Zeitpunkt der Hinterlegung der DE-A-42 25 569 (3.8.1992) die Existenz des Pax9-Genes noch unbekannt war. Weiterhin offenbart diese deutsche Offenlegungsschrift ausschließlich in allgemeiner Form die Verwendung derartiger Sonden zur Tumordiagnostik oder Tumor­ therapie. In welchen speziellen Bereichen der Tumordiagnostik oder Tumortherapie dieses Mittel überhaupt einsetzbar sein soll, wird nicht offenbart, was jedoch bei der Vielzahl und Heterogeni­ tät von Tumoren bedeutsam ist. Insbesondere wird in dieser Offenlegungsschrift kein Mittel offenbart, das sich auch zur Früherkennung von präkanzerogenen Läsionen, insbesondere von Dysplasien des mehrschichtigen Plattenepithels, eignet.

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine neue, mindestens eine Nukleinsäure als Wirkstoff umfassende Sonde bereitzustellen, die zur Tumordiagnostik und Tumortherapie von Plattenepithelkarzinomen und Chondrosarkomen und zur Früherken­ nung präkanzerogener Läsionen, insbesondere von epithelialen Dysplasien des mehrschichtigen Plattenepithels und des Knorpels, einsetzbar ist.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Bereitstellung eines therapeutischen oder diagnostischen Mittels gelöst, das minde­ stens einen Wirkstoff mit mindestens einer Nukleinsäure enthält, die mit einem Pax9-Gen oder einem Derivat hiervon hybridisiert. Erfindungsgemäß ist unter "Pax9" in den Patentansprüchen immer das "humane Pax9" zu verstehen.

Überraschenderweise wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß eine Nukleinsäure, die mit einem Pax9-Gen oder einem Derivat hiervon hybridisiert, in der Diagnostik von Plattenepithelkarzinomen her­ vorragend einsetzbar ist. Unerwarteterweise konnte weiterhin ge­ zeigt werden, daß sich ein derartiges diagnostisches Mittel auch zur Früherkennung epithelialer Dysplasien, Metaplasien und Tumoren des mehrschichtigen Plattenepithels hervorragend eignet. Hierdurch wird beispielsweise ermöglicht, daß zu einem sehr frühen Zeitpunkt, zu dem makroskopisch und mikroskopisch noch keine pathologischen Veränderungen der Zellen feststellbar sind, eine Früherkennung von Dysplasien also möglichen Vorstufen von Metaplasien und Tumoren dieser Gewebe, ermöglicht wird.

Das erfindungsgemäße therapeutische oder diagnostische Mittel enthält als Wirkstoff mindestens eine Nukleinsäure, die (a) eine für das Pax9-Protein kodierende Nukleinsäuresequenz, (b) einen Teil hiervon, (c) einen mit einer Nukleinsäuresequenz aus (a) und/oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleinsäuresequenz oder (d) eine zu einer Nukleinsäure aus (a), (b) und/oder (c) komplementäre Nukleinsäuresequenz umfaßt.

In weiteren Ausführungsformen der Erfindung umfaßt die Nuklein­ säure die für die Aminosäuren 1-208 kodierende Sequenz und die für die Aminosäuren 209-341 kodierende Sequenz (siehe SEQ ID No: 1).

Aufgrund der verwendeten Klonierungstechnik war es nicht möglich, die Nukleotide 1-4 und 1018-1023 bzw. die hiervon abgeleiteten Aminosäuren 1 und 2 und die Aminosäuren 340 und 341 zu bestimmen. In der beiliegenden Abb. 1B sind diese Aminosäuren mit "*" bezeichnet. Das Sequenzprotokoll dagegen beginnt mit dem tatsäch­ lich sequenzierten Nukleotid 5 (mit 1 bezeichnet).

Die Nukleinsäure kann eine DNA oder RNA sein, die gegebenenfalls modifiziert ist.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäure hybridisiert bevorzugt unter stringenten Bedingungen an das Pax9-Gen. Stringente Bedingungen sind erfindungsgemäß so definiert, daß sie eine selektive und nachweisbare spezifische Bindung der Nukleinsäure an ein Pax9-Gen oder ein Derivat hiervon oder ein Pax9-Transkript oder ein Derivat hiervon ermöglichen. Eine derartige Hybridisierung unter stringenten Bedingungen ist vorzugsweise dadurch definiert, daß nach einer Hybridisierung bei 42°C in 50% Formamid und anschlie­ ßendem Waschen des Filters bei 65°C in einer wäßrigen Lösung noch eine Bindung der Sonde an das Pax9-Gen oder die Pax9-RNA oder Derivate hiervon nachweisbar ist. Bei Verwendung von kürzeren Nukleinsäuren als Sonden kann es jedoch erforderlich sein, weniger drastische Hybridisierungs- und/oder Waschbedingungen anzuwenden. Hoch-stringente Bedingungen sind: Waschen des Filters in 0,1x SSC, 0,1% SDS bei 68°C.

Zum spezifischen Nachweis des Pax9-Gens ist eine Nukleinsäurese­ quenz aus dem nicht konservierten Bereich des Gens zu verwenden, also bevorzugt aus dem nicht für die Paired-Domäne kodierenden Bereich. Das gleiche gilt für die Hemmung des Pax9-Gens.

Das erfindungsgemäße Mittel kann in einer wirksamen Menge als molekulare Sonde in der Diagnostik oder Therapie von Dysplasien, Metaplasien und Tumoren eingesetzt werden. Weiterhin ist es als Antisense-Nukleinsäure zur spezifischen Hemmung der Genexpression des Pax9-Gens einsetzbar.

Erfindungsgemäß wird weiterhin ein Verfahren zur Tumordiagnostik und ein Verfahren zur Hemmung der Expression des Pax9-Gens bereitgestellt, das das erfindungsgemäße Mittel in einer wirk­ samen Menge einsetzt.

Ein weiteres, erfindungsgemäß bereitgestelltes therapeutisches oder diagnostisches Mittel enthält mindestens einen Wirkstoff in einer wirksamen Menge, der mindestens ein Pax9-Protein, Analoga, Teile, Konjugate, Oligomere und/oder Mischungen hiervon umfaßt. Ein derartiges Mittel wird in einer wirksamen Menge in der Diagnostik und/oder Therapie von Dysplasien, Metaplasien und Tumoren von Epithelzellen eingesetzt.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein thera­ peutisches oder diagnostisches Mittel bereitgestellt, das mindestens einen Wirkstoff enthält, der mindestens einen Antikör­ per gegen ein Pax9-Protein, Analoga, Teile, Konjugate, Oligomere und/oder Mischungen hiervon umfaßt.

Das erfindungsgemäß bereitgestellte therapeutische und diagnosti­ sche Mittel mit einem Teil des Pax9-Proteins, Analoga, Kon­ jugaten, Oligomeren und/oder Mischungen hiervon weist bevorzugt die Aminosäuren 132-341 und in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform die Aminosäuren 251-341, je der Abb. 1B, bzw. die Aminosäuren 130-337 oder 249-337 gemäß SEQ ID No: 1, auf.

Das erfindungsgemäß bereitgestellte therapeutische oder diagno­ stische Mittel weist in einer weiteren bevorzugten Ausführungs­ form der Erfindung mindestens einen Wirkstoff auf, der mindestens einen Antikörper, bevorzugt einen monoklonalen Antikörper, gegen ein Pax9-Protein, Analoga, Teile, Konjugate, Oligomere und/oder Mischungen hiervon umfaßt, wobei diese Antikörper in speziellen Ausführungsformen der Erfindung gegen Epitope gerichtet sein können, die in den Bereichen 132-341 bzw. 251-341 der Aminosäure­ sequenz der Abb. 1B bzw. 130-337 oder 249-337 gemäß SEQ ID No: 1 lokalisiert sind.

Erfindungsgemäß werden weiterhin das Pax9-Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID No: 1, Analoga, Teile, Konjugate, Oligomere und/oder Mischungen hiervon bereitgestellt.

Die Nukleotidsequenz 1-627 und die Aminosäuresequenz 1-208 (SEQ ID No: 1) sind bereits in Stapleton (1993) beschrieben und werden in einer speziellen Ausführungsform von der Erfindung nicht mitumfaßt.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch DNA, die für das vor­ stehend genannte Pax9-Protein kodiert, und RNA, die von dieser DNA abgeleitet ist.

Die erfindungsgemäßen Antikörper sind vorzugsweise monoklonale Antikörper, die auf bekannte Weise nach der Köhler-Milstein-Metho­ de durch Immunisierung eines Versuchstieres, vorzugsweise einer Maus, mit dem Pax9-Protein oder/und einem Gemisch von Pax9-Proteinen, Gewinnung von Antikörper-produzierenden B-Zellen oder Milzzellen aus dem immunisierten Versuchstier und anschließender Fusionierung der Antikörper-produzierenden Zellen mit einer geeigneten Leukämiezelle zur Erzeugung von Hybridomen erhältlich sind.

Die erfindungsgemäßen Antikörper können vorzugsweise in vitro und/oder in vivo als Mittel in der Tumordiagnostik und/oder Tumortherapie verwendet werden. Dabei können die Antikörper auch als Fragmente (z. B. Fab oder F(ab)₂ Fragmente) und gegebenenfalls gekoppelt an eine nachweisbare Gruppe (Enzym, Fluoreszenzmarker, radioaktiver Marker, Kernresonanzmarker etc.) oder an ein Toxin (z. B. Rizin, Diphterietoxin etc.) verwendet werden. Die Her­ stellung derartiger Antikörper-Derivate erfolgt auf eine dem Fachmann auf dem Gebiet der Immunologie bekannte Weise (z. B. durch kovalente Kopplung über einen bi-funktionellen Linker). Erfindungsgemäß mit umfaßt werden Antikörper, insbesondere monoklonale Antikörper, die gegen ein Pax9-Protein, Analoga, Teile, Konjugate, Oligomere und/oder Mischungen hiervon gerichtet sind. Diese Antikörper können in den erfindungsgemäß bereitge­ stellten Verfahren und in den beanspruchten Verwendungen einge­ setzt werden.

Die erfindungsgemäß bereitgestellten therapeutischen oder diagnostischen Mittel werden zur Diagnostik oder Therapie von Dysplasien, Metaplasien und Tumoren von Epithelzellen, bevorzugt des mehrschichtigen Plattenepithels sowie von Knorpelzellen, eingesetzt. Die Diagnostik und Therapie von Veränderungen des Oesophagus, der Haut, der Mundschleimhaut, der Zunge, der Cornea, Vagina, der Cervix, des Endometriums, des Anus, der Talgdrüsen der Haut und des Knorpels stellen bevorzugte Einsatzgebiete dar. Insbesondere die Früherkennung von Dysplasien epithelialer Zellen ist ein mögliches Einsatzgebiet der vorliegenden Erfindung.

Die Diagnostik, insbesondere die Früherkennung, und die Therapie bei Metaplasien ist ein wichtiger Anwendungsbereich der vor­ liegenden Erfindung. Eine Metaplasie, also im vorliegenden Fall die Umwandlung eines Epithels in ein mehrschichtiges Plattenepi­ thel, kann im Körper theoretisch überall dort auftreten, wo "Nicht-Plattenepithelien" vorhanden sind. Es ist beispielsweise bekannt, daß das einschichtige Epithel der Luftröhren bei Rauchern häufig in ein mehrschichtiges Plattenepithel umgewandelt wird. Ein weiteres wichtiges Beispiel ist die Umwandlung des Endometriumepithels (normalerweise einschichtig) in ein mehr­ schichtiges Plattenepithel. An diesen Stellen besteht eindeutig ein erhöhtes Risiko, ein Plattenepithelkarzinom zu entwickeln. Diese mehrschichtigen Plattenepithelien sind durch das erfin­ dungsgemäß bereitgestellte Mittel, das mindestens einen Wirkstoff mit mindestens einer Nukleinsäure enthält, die mit einem Pax9-Gen oder einem Derivat hiervon hybridisiert, diagnostizierbar oder therapierbar.

Weiter unten wird näher ausgeführt, daß erfindungsgemäß gezeigt werden konnte, daß das Pax9-Protein in Dysplasien epithelialer Zellen in größeren Mengen als in Normalzellen im Zytoplasma lokalisiert ist. Erfindungsgemäß können deshalb rekombinante Vektoren mit einer für ein Pax9-Protein, einem Analogon, Teilen, Konjugaten, Oligomeren und Mischungen hiervon kodierenden Sequenz, die in einer bevorzugten Ausführungsform in funktionel­ ler Verbindung mit einer oder mehreren Signalsequenzen zum gerichteten Transport des Pax9-Proteins in den Zellkern steht, verwendet werden. Dieser Vektor kann beispielsweise von einem Plasmid oder von einem viralen Vektor abgeleitet sein. Übliche, auf dem Gebiet der Gentherapie bekannte oder noch zu entwickelnde Vektoren sind erfindungsgemäß einsetzbar. Bevorzugt handelt es sich hierbei um einen Expressionsvektor, der sowohl in Pro- als auch in Eukaryontenzellen exprimierbar sein kann.

Von der vorliegenden Erfindung mit umfaßt werden auch Eukaryon­ tenzellen und Prokaryontenzellen, die mit einem Vektor trans­ formiert sind, der das erfindungsgemäße Pax9-Gen enthält.

Die erfindungsgemäß bereitgestellten Vektoren mit dem Pax9-Gen sind zur somatischen Gentherapie beim Menschen einsetzbar. Beispielsweise können sie zur terminalen Differenzierung von Tumorzellen und Tumorvorläuferzellen eingesetzt werden.

Von der Erfindung werden mit umfaßt Analysekits zur Analyse von Pax9-Expression in Knorpelzellen und Epithelzellen, insbesondere des Plattenepithels, auf Dysplasien, Metaplasien und Tumoren.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand der beiliegenden Abbildun­ gen näher erläutert. Die Abbildungen zeigen:

Abb. 1A die Aminosäuresequenz des humanen Pax9-Proteins mit 341 Aminosäuren.

Abb. 1B einen Vergleich der Aminosäuresequenz des Pax9-Gens des Menschen (HUPax9) und der Maus (MPax9).

Abb. 2 eine Northern-Blot-Analyse.

Abb. 3 den Nachweis des Pax9-Proteins in Protein-Extrakten aus dem Oesophagus der Maus und des Menschen (Western-Blot-Analyse).

Abb. 4 die Lokalisation des Pax9-Proteins im gesunden Oesophagus- Epithel der Maus (A-D) und der Menschen (E-H).

Abb. 5, 6 und 7 die Lokalisation des Pax9-Proteins in patholo­ gisch veränderten, mehrschichtigen Plattenepithelien und in Plattenepithelkarzinomen des Menschen.

Abb. 8 die Lokalisation des Pax9-Proteins in differenzierenden Knorpelzellen im wachsenden Röhrenknochen eines 16,5 Tage alten Mausembryos.

Die Länge der in den Abbildungen gezeigten Längenstandards beträgt jeweils 100 µm.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es ist davon auszugehen, daß die Erfindung nicht auf die genannten speziellen Ausführungsbeispiele beschränkt ist, sondern daß der Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie in bekannter Weise auch weitere Ausführungsformen entwickeln kann.

Das Pax9-Gen

Die Existenz des Pax9-Genes ist in den Genomen der Maus (Wallin et al., 1993), des Menschen (Stapleton et al., 1993) und des Huhnes (Peters et al., 1995) nachgewiesen. Die Aminosäuresequenz der DNA-bindenden "paired"-Domäne ist in diesen Organismen identisch. Die Aminosäuresequenzen der Pax9-Proteine des Menschen (kombiniert aus Stapleton et al., 1994 und Peters et al., unveröffentlicht) und der Maus (Neubüser et al., 1995) sind in Abb. 1 dargestellt. Die "paired"-Domäne und ein weiteres kon­ serviertes Sequenzmotiv aus 8 Aminosäuren, das Oktapeptid, sind in dieser Abbildung eingerahmt.

Neben anderen Expressionsdomänen wird Pax9 während der Embryonal­ entwicklung der Maus und des Huhnes im Epithel des undifferen­ zierten Pharynx exprimiert (Neubüser et al., 1995, Peters et al., 1995). Das Epithel des Pharynx ist im weiteren Verlauf der Embryonalentwicklung (u. a.) an der Organogenese des Oesophagus beteiligt. Dabei wird das zunächst einschichtige Epithel zum mehrschichtigen Plattenepithel umgewandelt, das den gesamten Oesophagus im adulten Organismus auskleidet. Es ist bekannt, daß Pax9 im mehrschichtigen Plattenepithel des Oesophagus des Huhnes (Peters et al., 1995), der Maus und des Menschen (Peters et al., unveröffentlicht) exprimiert wird. Mehrschichtige Plattenepi­ thelien kommen im menschlichen Organismus außerdem in der Haut, der Mundschleimhaut, der Zunge, der Cornea, der Vagina und im Anus vor. Die Talgdrüsen der Haut zeigen einen ähnlichen Aufbau aus epithelialen Zellen. Mit Ausnahme der Cornea konnte erfin­ dungsgemäß in der adulten Maus in allen oben genannten Organen die Expression von Pax9 nachgewiesen werden. In der späten Phase der embryonalen Entwicklung der Maus wird Pax9 auch in einer spezifischen Phase der Knorpeldifferenzierung exprimiert (Peters und Balling, unveröffentlicht). Die Pax9 exprimierenden Zellen markieren dabei die Übergangsphase zwischen dem proliferierenden Säulenknorpel und der Schicht des differenzierenden Blasen­ knorpels, der im weiteren Verlauf der Entwicklung enchondral ossifiziert. In Analogie zur Expression in mehrschichtigen Plattenepithelien exprimieren auch in Knorpelzellen nicht die proliferierenden, sondern die sich differenzierenden Zellen Pax9. Die vorliegende Erfindung, die sich aus den nachfolgend be­ schriebenen Experimenten ergab, ist somit auf diese Organe übertragbar.

Ergebnisse

Basis für die vorliegende Erfindung ist die Analyse der Gen- und Proteinexpression von Pax9 im mehrschichtigen Plattenepithel, insbesondere des gesunden Oesophagusepithels des Menschen und der Maus, sowie in Knorpelzellen des wachsenden Röhrenknochens während der embryonalen Entwicklung der Maus.

1. Genexpression von Pax9

Vom menschlichen Pax9-Gen ist bislang die Nukleotidsequenz des "paired"-Box enthaltenden Exons bekannt (Stapleton et al., 1993). Im Rahmen dieser Studie wurde aus Gesamt-RNA des Oesophagus die kodierende Pax9-cDNA des Menschen isoliert. Die Isolierung von Gesamt-RNA wurde mit Hilfe des "RNeasy Total RNA"-Kits (Qiagen, Hilden) durchgeführt. Hierfür wurde frisches Sektionsmaterial aus dem Institut für Pathologie des Klinikums Rechts der Isar, München, zur Verfügung gestellt. 1 µg der Gesamt-RNA wurde für eine reverse Transkription eingesetzt. Als Startpunkt für die Reverse Transkriptase (Superscript von Gibco-BRL, Karlsruhe) diente das synthetische DNA-Oligonukleotid 5′-CCCAAGCTTTGGACGCTCCCATCAGAGTGC-3′ (Restriktionsschnittstelle für HindIII ist unterstrichen). Diese Sequenz wurde von der Pax9-cDNA der Maus (Neubüser et al., 1995) abgeleitet und überspannt das Stop-Codon und die letzten beiden carboxyterminalen Aminosäuren des murinen Pax9-Proteins. Die Amplifizierung der menschlichen Pax9-cDNA wurde anschließend mit Hilfe der Polymerase-Kettenreak­ tion (PCR) durchgeführt. Neben dem oben angeführten DNA-Oligonu­ kleotid wurde außerdem das Oligonukleotid 5′-CCCAAGCTTAGCCAGCCTTC GGGGAGGTG-3′ verwendet, das aus dem 5′-Bereich der "paired"-Box des menschlichen Pax9-Gens (Stapleton et al., 1993) abgeleitet wurde. Folgende Bedingungen wurden für 25 Amplifizierungszyklen eingehalten: 1 min Denaturierung bei 94°C; 1 min Hybridisierung der Oligonukleotide bei 60°C; 1 min DNA-Polymerisierung bei 72°C. Das erhaltene DNA-Fragment wurde mit HindIII gespalten und in die Restriktionsschnittstelle HindIII des Plasmids pKS (Stratagene, Heidelberg) kloniert. Die Sequenzierung erfolgte mit Hilfe des Sequenase-Kits nach der Anleitung des Herstellers (USB, Cleve­ land, USA). Die Sequenz der abgeleiteten Aminosäuren und der Vergleich mit dem Pax9-Protein der Maus sind in Abb. 1A bzw. 1B dargestellt.

Der kodierende Bereich der Pax9-cDNAs der Maus (Neubüser et al., 1995) und des Menschen (Peters et al., unveröffentlicht) wurde jeweils radioaktiv markiert (Feinberg & Vogelstein, 1984) und gegen membrangebundene Gesamt-RNA des Oesophagus hybridisiert (Northern-Blot-Analyse). Die Membranen (HybondN, Amersham, Braunschweig) wurden nach der Hybridisierung unter hoch-stringen­ ten Bedingungen (0,1 × SSC, 0,1% SDS, 68°C), die eine Kreuzhybri­ disierung mit anderen Pax-Genen ausschließen, gewaschen. In Abb. 2 sind die Ergebnisse der Northern-Blot-Analyse dargestellt. Die Abb. 2A zeigt, daß Pax9 im Oesophagus der Maus exprimiert wird, dagegen keine Transkripte im Drüsenmagen, Dünndarm und Dickdarm nachweisbar sind. Pax9-Transkripte sind auch im Oesophagus des Menschen nachweisbar (Abb. 2B). Ein Vergleich mit den internen Längenstandards der ribosomalen 28S-RNA (6333 Basen) bzw. 18S-RNA (2366 Basen) ergab, daß die Transkriptlängen des menschlichen Pax9-Gens ca. 5,3 Kilobasen (obere Bande), 3,5 Kilobasen (mitt­ lere Bande) und 2,1 Kilobasen (untere Bande) betragen.

2. Nachweis der Pax9-Proteine

Es wurde geprüft, ob die Pax9-Transkripte translatiert werden und als Pax9-Proteine in Proteinextrakten des Oesophagus nachzuweisen sind. Zu diesem Zweck wurden polyklonale Antikörper, die gegen das Pax9-Protein gerichtet sind, in Kaninchen erzeugt. Dazu wurde die cDNA-Sequenz, die für die Aminosäuren 252-342 des Pax9-Pro­ teins der Maus (Neubüser et al., 1995) kodiert, in den Vektor pMAL^TM-c2 (New England Biolabs) kloniert. Das resultierende Plasmid, pMALP9, kodiert für ein Fusionsprotein, bestehend aus einem 42.7 kd großen, Maltose-bindenden Protein aus Escherichia coli (Guan et al., 1987) und dem carboxyterminalen Bereich des Pax9-Proteins. Die Expression und die Reinigung des Fusions­ proteins wurden nach den Angaben des Herstellers (New England Biolabs) durchgeführt. Zwei Kaninchen wurden subcutan mit je 400 µg des Fusionsproteins in Freund′schem Adjuvans immunisiert. In Intervallen von vier Wochen wurde jeweils mit 100 µg des Fusionsproteins erneut immunisiert. Für alle Untersuchungen wurde das nach der dritten bzw. vierten Immunisierung gewonnene Immunserum eines Kaninchens, bezeichnet als 281-IV, benutzt. Ein zweites Immunserum, bezeichnet als 105-IV, das die "paired"-Domäne des Pax9-Proteins erkennt (Peters et al., 1995), wurde zur Bestätigung der Spezifität des Immunserums 281-IV benutzt.

Zum Nachweis des Pax9-Proteins wurden Proteinextrakte aus dem Oesophagus des Menschen bzw. der Maus nach bekannten Protokollen hergestellt (Peters et al., 1995), je 50 µg eines Proteinextraktes auf 12%igen Polyacrylamid-Gelen (Laemmli, 1970) aufgetrennt und anschließend durch halbtrockenen elektrischen Transfer auf Fluorotrans-Membranen (Pall, Dreieich) übertragen. Zur Abschät­ zung von Proteingrößen wurde zusätzlich ein Protein-Größenmarker (Sigma, München) aufgetragen. Die Membranen wurden über Nacht in phosphatgepufferter Salzlösung (=PBS), die 3% Rinder­ serum-Albumin, 5% normales Schafserum und 5% Magermilchpulver enthielt, blockiert. Anschließend wurde das Immunserum in einer Verdünnung von 1 : 200 hinzugegeben und für eine Stunde bei 21°C inkubiert. Nachfolgend wurde die Membran in 0,1% Tween20 in PBS für 20 min gewaschen und danach in einer Verdünnung von 1 : 2000 mit einem Konjugat aus Anti-Kaninchen-IgG und alkalischer Phosphatase (Boehringer, Mannheim) inkubiert. Der Nachweis der Proteinbanden erfolgte mit den Farbsubstraten 4-Nitroblau-Tetrazolium-HCl (NBT) und 5-Brom-4-Chloro-3-Indolylphosphat (X-Phosphat) nach den Angaben des Herstellers (Boehringer, Mannheim). Abb. 3 zeigt das Ergebnis dieser Western-Blot-Analyse.

Das Immunserum 281-IV detektiert im Proteinextrakt vom Oesophagus der Maus ein Protein mit einem geschätzten Molekulargewicht von ca. 39 kd (Abb. 3, Spur 1). Diese Größe entspricht dem von der Aminosäure-Sequenz abzuleitenden Molekulargewicht des Pax9-Pro­ teins (39 kd, vergl. Abb. 1). Dieses Ergebnis wird durch die Verwendung des zweiten Immunserums (105-IV), das die paired-Domäne von Pax9 erkennt und eine Bande auf der gleichen Höhe nachweist, abgesichert (Abb. 3, Spur 2). Das Immunserum 105-IV kreuz reagiert mit dem menschlichen Pax9-Protein und detektiert im Proteinextrakt aus dem Oesophagus des Menschen ebenfalls ein Protein mit einem Molekulargewicht von ca. 39 kd (Abb. 3, Spur 3). Die Spuren 4 (Proteinextrakt aus dem Oesophagus der Maus) und 5 (Proteinextrakt aus dem Oesophagus des Menschen) in Abb. 3 zeigen das Ergebnis der Kontroll-Inkubation mit normalem Kaninchenserum und belegen die Spezifität der Immunseren 281-IV und 105-IV.

3. Lokalisation des Pax9-Proteins im gesunden Oesophagusepithel der Maus und des Menschen

Mit Hilfe immunhistochemischer Verfahren wurde die subzelluläre Lokalisation der Pax9-Proteine im gesunden Oesophagusepithel der Maus, des Menschen und im Knorpel des Mausembryos ermittelt. Für diese Experimente wurden die gleichen polyklonalen Antikörper verwendet wie in Punkt 2. beschrieben. 5-7 µm dicke Paraffin-Schnitte aus Formalin-fixiertem Gewebe wurden zweimal für 10 min in Xylol, 5 min in Isopropanol, je 2 min in 100%/96%/90%/70% und 50% Ethanol entparaffinisiert und anschließend für 5 min in PBS äquilibriert. Bei Inkubationen mit dem Antikörper 105-IV wurden die Schnitte für 10 min in 10 mM Zitronensäure (pH 6,0) und Kochen in der Mikrowelle vorbehandelt. Anschließend wurden die Schnitte für 90 min bei 37°C in den Antikörper-Verdünnungen des Immunserums 281-IV oder des Pre-Immunserums (1 : 200 in PBS, 3% BSA) bzw. 105-IV (1 : 200 in PBS, 3% BSA, 15% normales Schafserum) inkubiert. (1) Schnitte aus Geweben der Maus wurden wie folgt weiterbehandelt: Nach 5 min Waschen in PBS wurde mit einem Konjugat (1 : 200 in PBS, 3% BSA verdünnt) aus Anti-Kaninchen-IgG und alkalischer Phospha­ tase (Boehringer, Mannheim) inkubiert. Die Farbreaktion erfolgte nach den Angaben des Herstellers (Boehringer, Mannheim) mit den Substraten 4-Nitroblau-Tetrazolium-HCl (NBT) und 5-Brom-4-Chloro- 3-Indolylphosphat (X-Phosphat), die ein blau-violettes Präzipitat bilden. Endogene alkalische Phosphataseaktivität wurde durch Zugabe von Levamisol (Sigma, München; Endkonzentration 5 mM) in der Färbelösung blockiert. (2) Schnitte aus menschlichem Gewebe wurden wie folgt weiterbehandelt: Nach 5 min Waschen in PBS wurden die Schnitte mit Maus-Anti-Kaninchen-IgG (Dianova, Hamburg), 1 : 200 verdünnt in PBS (mit 20% humanem Serum), für 30 min bei 21°C inkubiert. Nach erneutem Waschen in PBS wurden die Schnitte mit Kaninchen-Anti-Maus-IgG (Dakopatts, Dänemark), 1 : 50 verdünnt in PBS (mit 20% humanem Serum), für 30 min bei 21°C inkubiert. Es wurde erneut in PBS gewaschen und anschließend mit einem APAAP-Komplex (Dakopatts, Dänemark), 1 : 50 verdünnt in PBS, für 30 min bei 21°C inkubiert. Die Farbreaktion erfolgte mit den Substraten Naphtol-AS-MX-Phosphat (Sigma, München) und Fast Red (Serva, Heidelberg), die ein rotes Präzipitat bilden. Endogene alkalische Phosphataseaktivität wurde durch Zugabe von Levamisol (5 mM) in der Färbelösung blockiert. Schnitte von menschlichen Gewebeproben wurden nach der immunhistochemischen Färbung für 10 sek mit Hämalaun gefärbt, wodurch die Zellkerne schwach bläulich dargestellt werden.

Für die Mikroskopie wurden die Schnitte in Glycerin-Gelatine (Merck, Darmstadt) eingedeckelt. Die Dokumentation erfolgte auf Kodak-Ektachrome-Diafilmen unter Verwendung eines Leitz-Axioplan-Mi­ kroskopes und Normarski-Optik. Zur Darstellung der Histologie wurden Schnitte analoger Bereiche wie oben entparaffinisiert und mit Hämatoxylin/Eosin gefärbt.

Das mehrschichtige Plattenepithel des menschlichen Oesophagus (Abb. 4 E) besteht aus einer mitotisch aktiven, basalen Zell­ schicht (Bz), die die Stammzellen enthalten, und den aus dieser Schicht hervorgehenden suprabasalen Zellschichten (Sz), deren spezifische Differenzierungen das mehrschichtige, unverhornte Plattenepithel aufbauen. Bei der Maus ist der Aufbau des Platten­ epithels ähnlich, es ist jedoch - im Gegensatz zu dem des Menschen - verhornt (Abb. 4A).

Eine eingehende Studie zur Genexpression von Pax9 wurde zunächst im Tiermodell für das Plattenepithel des Oesophagus der Maus durchgeführt. Es wurden adulte Mäuse des Stammes CD1 verwendet, die im institutsinternen Tierstall der GSF gezüchtet werden. Das Ergebnis dieser Untersuchung besteht darin, daß Pax9 in den suprabasalen Zellschichten, nicht jedoch in der mitotisch aktiven Basalschicht, exprimiert wird. Die Abb. 4B (Inkubation mit 281-IV) und 4C (Inkubation mit 105-IV) zeigen exemplarisch das Ergebnis immunhistochemischer Experimente. Beide Immunseren weisen das Pax9-Protein in den Zellen der suprabasalen Zellschichten, in denen die Epithelzellen differenzieren, nach. In Übereinstimmung mit den Eigenschaften als Transkriptionsfaktor ist das Pax9-Pro­ tein in den Zellkernen lokalisiert. Das Ergebnis der Kon­ trollinkubation mit normalem Kaninchenserum (Abb. 4D) zeigt unspezifische Hintergrundfärbung vor allem in der Keratinschicht (K). Aus diesem Befund ist zu folgern, da Pax9 im gesunden Organismus an der Differenzierung, nicht jedoch unmittelbar an der Proliferation des Oesophagusepithels, die in der basalen Zellschicht stattfindet, beteiligt sein kann. Es ist allerdings bekannt, daß die mitotische Aktivität der Stammzellen einer circadianen Rhythmik folgt und bei Mäusen in der Nacht am höchsten ist (Scheving et al., 1979). Es wurde daher untersucht, ob eine von der Tageszeit abhängige Expression von Pax9 in den mitotisch aktiven Zellen der Basalschicht nachzuweisen ist. Dazu wurden adulte Mäuse unter konstanten Licht-Bedingungen (12 h Licht/12 h Dunkelheit) gehalten. Über 24 h wurde in dreistündigen Abständen der Oesophagus von jeweils drei Mäusen präpariert, fixiert und nach der oben beschriebenen Methode immunhistoche­ misch untersucht. In keiner der insgesamt 24 unabhängigen Gewebe­ proben konnte Pax9-Protein in der basalen Zellschicht nach­ gewiesen werden (ohne Abbildung). Das Expressionsmuster ent­ spricht in allen Fällen dem, das in Abb. 4B bzw. 4C gezeigt ist.

Für die immunhistochemischen Untersuchungen am Oesophagusepithel des Menschen wurden Paraffinschnitte aus der Sammlung des Instituts für Pathologie (Klinikum Rechts der Isar, München) angefertigt. Die Tabelle 1 gibt eine Übersicht über die ver­ wendeten Gewebeproben mit der zugehörigen histopathologischen Diagnose.

Im gesunden menschlichen Oesophagusepithel ist das Pax9-Protein ebenfalls in den Zellkernen der suprabasalen Zellschichten lokalisiert (Abb. 4F und 4G). Die Kontrollinkubation mit normalem Kaninchenserum zeigt keine spezifische Färbung (Abb. 4H).

Im gesundem Oesophagusepithel ist das Pax9-Protein in den Zellkernen der suprabasalen Schichten lokalisiert. Diese Lokali­ sation korreliert mit der terminalen Differenzierung dieser Zellen.

4. Lokalisation des Pax9-Proteins in pathologisch veränderten mehrschichtigen Plattenepithelien und in Plattenepithelkar­ zinomen des Menschen

Leukoplakien, die sich durch weißliche, herdartige Verdickungen des Schleimhautepithels auszeichnen, gelten als präkanzerogen. Die Polarität und die Differenzierung des Epithels ist jedoch weitgehend erhalten (Abb. 5A) und mit der des normalen Oesopha­ gusepithels vergleichbar (vergl. Abb. 4E). In Abb. 5B ist die Lokalisation des Pax9-Proteins einer Leukoplakie gezeigt. Wie im gesunden Oesophagusepithel ist das Pax9-Protein in den Zellkernen der suprabasalen Schichten lokalisiert. In Abb. 5C ist die Proteinverteilung von Pax9 aus einem anderen Bereich der gleichen Gewebeprobe dargestellt. Obwohl auch hier die Lokalisation in den Zellkernen dominiert, ist zusätzlich im Cytoplasma eine deutliche Rotfärbung erkennbar. Dagegen ist in Dysplasien des Schleimhautepithels die Verteilung der Pax9-Pro­ teine in der Zelle drastisch verändert. Überraschenderweise ist das Pax9-Protein bereits in leichten Dysplasien des Schleim­ hautepithels (Abb. 5D) nicht in den Zellkernen der suprabasalen Schichten nachweisbar (Abb. 5E). In dieser Gewebeprobe wie auch in dem Beispiel einer schweren Dysplasie (Abb. 5F) ist das Pax9-Pro­ tein überwiegend im Cytoplasma lokalisiert (Abb. 5G). In den Abb. 5H und 6A ist jeweils die histologische Färbung eines Karzinoma in situ gezeigt. Diese Tumoren entwickeln sich in­ traepithelial und zeigen kein invasives Wachstum in das darunter­ liegende Mesenchym. Die Entartung des Epithels korreliert hier - wie auch in den gezeigten Dysplasien - mit der fehlenden Lokali­ sation von Pax9-Protein in den Zellkernen (Abb. 5I).

In dieser Studie wurden auch verschiedene, invasiv wachsende Plattenepithelkarzinome des Typs G2 (Abb. 6C, E, G) und G3 (Abb. 7A, C, E) untersucht. Das Pax9-Protein ist in allen untersuchten Fällen vorwiegend im Cytoplasma lokalisiert. Die Ergebnisse sind exemplarisch von Plattenepithelkarzinomen des Typs G2 (Abb. 6D, F, H) bzw. des Typs G3 (Abb. 7B, D, F) gezeigt.

Die vorliegende Erfindung stellt ein neues diagnostisches oder therapeutisches Mittel bereit, das als Wirksubstanz mindestens eine Nukleinsäure des Pax9-Gens enthält und insbesondere zur Früherkennung von Dysplasien und Metaplasien des mehrschichtigen Plattenepithels sowie zur Tumordiagnostik und Tumortherapie von Plattenepithelkarzinomen geeignet ist. Dabei ist von besonderer Bedeutung, daß Veränderungen der Pax9-Expression bereits präkan­ zerogene Läsionen anzeigen können, die sich erst im weiteren Krankheitsverlauf als Tumore manifestieren.

5. Lokalisation des Pax9-Proteins in Knorpelzellen während der enchondralen Ossifikation

Die weitaus größten Anteile des Skeletts werden während der Embryonalentwicklung als knorpelige Anlagen präformiert. Diese Anlagen verknöchern durch enchondrale Ossifikation, einem kon­ tinuierlich verlaufenden Prozeß, bei dem Knorpel abgebaut und durch Knochensubstanz ersetzt wird. Gleichzeitig muß ein rasches Wachstum des embryonalen Knochens gewährleistet sein. In den Röhrenknochen findet das Wachstum im Perichondrium und an den beiden Enden des Knochens, den Epiphysen, statt. Dabei werden in den Epiphysen sich teilende Chondrocyten zum Säulenknorpel angeordnet (Abb. 8A). In dieser Phase werden essentielle, spezifische Moleküle der extrazellulären Matrix wie z. B. Collagen II, Collagen IX, und Aggrecan exprimiert (Argraves et al., 1981, Bogaert et al., 1992, Nakata et al., 1993). An die Phase der Zellteilung schließt sich die Reifung der Chondrocyten an, die im weiteren Verlauf der Differenzierung hypertroph werden und den Blasenknorpel bilden. Während der Reifung wird CMP (cartilage matrix protein), ein weiteres, spezifisches Moleküle der extra­ zellulären Matrix exprimiert (Chen et al., 1995). Veränderungen der Chondrocytendifferenzierung sind bei verschiedenen Krank­ heitsbildern bekannt (Überblick in Rimoin, 1975). Exemplarisch sei hier die Osteoarthritis in Gelenken angeführt. Die Gelenke von artikulierenden Knochen werden von einer hyalinen Knorpel­ schicht überdeckt. Bei der Osteoarthritis werden in in dieser Schicht Differenzierungsvorgänge eingeleitet, die im Normallfall nicht auftreten. Im hyalinen Gelenkknorpel können sekundäre Zellteilungen und nachfolgende Hypertrophie der Chondrocyten festgestellt werden (Hoyland et al., 1991, van der Mark et al., 1992).

Transkriptionsfaktoren, die spezifisch in der Phase der Chon­ drocytenreifung exprimiert werden, sind bislang nicht bekannt. Überraschenderweise konnten wir Pax9, einen Transkriptionsfaktor, in dieser Zone nachweisen. Die in dieser Studie durchgeführten immunhistochemischen Experimente am Humerus eines 16,5 Tage alten Mausembryos haben gezeigt, daß Pax9 exakt die Zone der Reifung, die sich zwischen den Phasen der Zellteilung und Hypertrophie befindet, auf molekularer Ebene markiert (Abb. 8B). Ein ver­ gleichbares Expressionsmuster wurde auch in anderen skelettalen Elementen (Schulterblatt, Wirbelkörper, Finger) beobachtet. Das Pax9-Protein ist - in Analogie zu den Befunden im gesunden Oesophagusepithel - in den Zellkernen lokalisiert. Darüberhinaus besteht offensichtlich eine weitere Korrelation der Pax9-Expres­ sion im reifenden Knorpel einerseits und der Pax9-Expression in mehrschichtigen Plattenepithelien andererseits: In beiden Geweben exprimieren nicht die sich teilenden Zellen, sondern die sich differenzierenden Zellen Pax9. Die Kernlokalisation von Pax9 ist neben den mehrschichtigen Plattenepithelien daher auch als ein Marker für Knorpelzellen, die sich in der terminalen Differenzie­ rung befinden, geeignet.

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Sequenzprotokoll

Claims (29)

1. Therapeutisches oder diagnostisches Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens einen Wirkstoff mit mindestens einer Nukleinsäure enthält, die mit einem Pax9-Gen oder einem Derivat hiervon hybridisiert.

2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff mindestens eine Nukleinsäure enthält, die (a) eine für das Pax9-Protein kodierende Nuklein­ säuresequenz, (b) einen Teil hiervon, (c) eine mit einer Nukleinsäuresequenz aus (a) und/oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleinsäuresequenz oder (d) eine zu einer Nukleinsäure aus (a), (b) und/oder (c) komplementäre Nukleinsäuresequenz umfaßt.

3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff mindestens eine Nukleinsäure enthält, die (a) eine für die Aminosäuren 130-337 gemäß SEQ ID No: 1 kodierende Nukleinsäuresequenz, (b) einen Teil hiervon, (c) eine mit einer Nukleinsäuresequenz aus (a) und/oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nu­ kleinsäuresequenz oder (d) eine zu einer Nukleinsäure aus (a), (b) und/oder (c) komplementäre Nukleinsäuresequenz umfaßt.

4. Mittel nach einem oder mehreren der vorhergehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eine gegebenenfalls modifizierte DNA oder RNA ist.

5. Verwendung eines Mittels nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche in einer wirksamen Menge als mo­ lekulare Sonde in der Diagnostik oder Therapie von Dys­ plasien, Metaplasien und Tumoren.

6. Verwendung eines Mittels nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche in einer wirksamen Menge als Antisense-Nukleinsäure zur Hemmung der Genexpression.

7. Verfahren zur Tumordiagnostik, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mittel nach einem oder mehreren der vorherge­ henden Ansprüche in einer wirksamen Menge verwendet.

8. Verfahren zur Hemmung der Expression von Genen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mittel nach einem oder mehreren der vorherge­ henden Ansprüche in einer wirksamen Menge verwendet.

9. Therapeutisches oder diagnostisches Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens einen Wirkstoff in einer wirksamen Menge enthält, der mindestens ein Pax9-Protein, Analoga, Teile, Konjugate, Oligomere und/oder Mischungen hiervon umfaßt.

10. Verwendung eines Mittels nach Anspruch 9 in einer wirk­ samen Menge in der Diagnostik und/oder Therapie von Dys­ plasien, Metaplasien und Tumoren.

11. Therapeutisches oder diagnostisches Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens einen Wirkstoff enthält, der mindestens einen Antikörper gegen ein Pax9-Protein, Analoga, Teile, Konjugate, Oligomere und/oder Mischungen hiervon umfaßt.

12. Therapeutisches oder diagnostisches Mittel nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

13. Protein mit der Aktivität von menschlichem Pax9 mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID No: 1, Analoga, Teile, Konjugate, Oligomere und Mischungen hiervon, ausgenommen ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz 1-208 alleine.

14. DNA, die für ein Pax9-Protein nach Anspruch 13 kodiert.

15. RNA, die von der DNA nach Anspruch 14 abgeleitet ist.

16. Monoklonaler oder polyklonaler Antikörper, der gegen ein Pax9-Protein, Analoga, Teile, Konjugate, Oligomere und/oder Mischungen hiervon gerichtet ist.

17. Verwendung eines therapeutischen oder diagnostischen Mit­ tels nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß die Verwendung die Diagnostik oder die Therapie von Dysplasien, Metaplasien und Tumoren von Epithelzellen und Knorpelzellen umfaßt.

18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Diagnostik und Therapie von Veränderungen der Epithelzellen des Oesophagus, der Haut, Mundschleimhaut, Zunge, Cornea, Vagina, der Cervix, des Endometriums, des Anus und der Talgdrüsen der Haut sowie des Knorpels umfaßt wird.

19. Rekombinanter Vektor mit einer für ein Pax9-Protein, einem Analogon, Teilen, Konjugaten, Oligomeren und Mischungen hiervon kodierenden DNA-Sequenz nach SEQ ID No: 1, wahlweise in funktioneller Verbindung mit einer oder mehreren Signalsequenzen zum gerichteten Transport des Pax9-Proteins in den Zellkern.

20. Vektor nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Plasmid ist oder von einem viralen Vektor ab­ geleitet ist.

21. Vektor nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Expressionsvektor ist.

22. Vektor nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß er in Eukaryontenzellen exprimierbar ist.

23. Eukaryontenzelle oder Prokaryontenzelle, transformiert mit einem Vektor nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche.

24. Verwendung eines Vektors nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche zur somatischen Gentherapie.

25. Verwendung eines Vektors nach einem oder mehren der vor­ hergehenden Ansprüche zur terminalen Differenzierung von Tumorzellen oder Tumorvorläuferzellen.

26. Diagnostisches Mittel nach einem oder mehreren der vorher gehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Analysekit zur Analyse von Pax9-Expression in Epithelzellen und Knorpelzellen auf Dysplasien, Metaplasien und Tumoren ist.

27. Antisense-Nukleinsäuren zum Pax9-Gen oder einem Derivat hiervon.

28. Synthetisches menschliches Pax9 mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID No: 1.

29. cDNA mit der DNA-Sequenz der SEQ ID No: 1.