WO1997030153A1 - Sonde zur früherkennung von epithelialen dysplasien des mehrschichtigen plattenepithels sowie zur tumordiagnostik und tumortherapie - Google Patents

Sonde zur früherkennung von epithelialen dysplasien des mehrschichtigen plattenepithels sowie zur tumordiagnostik und tumortherapie Download PDF

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pax9
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Heiko Peters
Rudolf Balling
Heinz HÖFLER
Thomas Richter
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GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH
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    • Y10S435/81—Packaged device or kit

Definitions

  • the present invention relates to a new therapeutic or diagnostic agent with at least one nucleic acid as active ingredient, which is particularly suitable for the early detection of dysplasia of the multilayered squamous epithelium and the cartilage, as well as for tumor diagnosis and tumor therapy.
  • Squamous cell carcinoma is the most common tumor in the esophagus.
  • this form of tumors is divided into four different categories (Gl, G2, G3 and G4) based on histological criteria, the histopathological abnormalities being lowest in Gl tumors and being greatest in G4 tumors .
  • dysplasias of the multilayer squamous epithelium are considered to be precancerous lesions and thus potential early stages of tumor development.
  • the causes of dysplasia include to look in the degeneracy of the transcription control of differentiation-specific genes. This control is normally ensured by an orderly interaction of transcription factors which jointly regulate the activity of these target genes. If it is possible to prove that the expression, subcellular localization or activity of these transcription factors have already been changed, such findings can be used as diagnostic markers for the early detection of dysplasia.
  • a favorable marker should also have a change in expression in the malignant tissue.
  • Pax genes represent a multi-gene family which contain a conserved DNA sequence, the "paired" box.
  • 9 different Pax genes (Paxl-Pax9) have been isolated from the human and mouse genome (review in Walther et al., 1991; Stapleton et al., 1993; Wallin et al., 1993).
  • the "paired" box has also been found in representatives of lower animal classes, for example in nematodes, Drosophila, zebrafish, turtles and chicken (overview in Noll, 1993).
  • the "paired" box codes for the DNA-binding "paired”domain; the Proteins of the Pax genes could thus be classified in the group of transcription factors (Treisman et al., 1991, Chalepakis et al., 1991, Xu et al., 1995).
  • Pax genes are critically involved in the development of embryonic structures. During the embryonic development of the mouse, the Pax genes are expressed both spatially and temporally in specific and partially overlapping patterns (Gruss & Walther, 1992). The strong, instructive effects of the Pax genes during embryonic development could include demonstrated by the genetically engineered, ectopic expression of Pax6 in imaginal discs of the wings or legs of Drosophila (the Pax6 gene is normally expressed in the appendix of the eye). The ectopic expression of Pax6 in imaginal discs of the wings or legs has the consequence that an almost complete eye develops in the wrong place (Halder et al., 1995).
  • Paxl undulated
  • Pax3 splotch and Waardenburg syndrome
  • Pax6 Small eye and Aniridia
  • Pax genes are not limited to embryonic development.
  • the Pax-5 protein activates the CD19 gene (CD19 coding for a B-lymphocyte-specific protein) (Kozmik et al., 1992) and thus also takes on a function in the adult organism.
  • Pax8 is expressed in the thyroid of the adult organism and is involved in the activation of the genes for thyroglobulin and thyroperoxidase (Zannini et al., 1992).
  • Pax genes and tumor development are not limited to embryonic development.
  • the Pax-5 protein activates the CD19 gene (CD19 coding for a B-lymphocyte-specific protein) (Kozmik et al., 1992) and thus also takes on a function in the adult organism.
  • Pax8 is expressed in the thyroid of the adult organism and is involved in the activation of the genes for thyroglobulin and thyroperoxidase (Zannini et al., 1992).
  • Paxl Some members of the Pax gene family (Paxl, Pax2, Pax3, Pax6, Pax8) have been identified as proto-oncogenes due to their tumorigenic properties. The identification is based on transformation tests in which the above-mentioned Pax genes are overexpressed in NIH3T3 or 208 cells under the control of the cytomegalovirus promoter. Injections of the transformed 208 cells in nude mice lead to the appearance of sarcomas in almost all cases (Maulbecker & Gruss, 1993).
  • Pax2 The expression of Pax2 was detected in Wilm's kidney tumors (Dressler & Douglass, 1992). Pax2 is necessary for the development of the kidney - however, the expression is downregulated during embryonic development and is not detectable in the healthy, adult kidney (Dressler et al., 1990).
  • DE-A-42 25 569 discloses a therapeutic or diagnostic agent which contains at least one nucleic acid as the active substance which hybridizes with a Pax gene.
  • Paxl to Pax ⁇ are mentioned as Pax genes.
  • the use of such an agent is also described as a molecular probe in tumor diagnostics and as an antisense nucleic acid for inhibiting gene expression.
  • a nucleic acid which codes for the amino acids under 30 to 337 according to SEQ ID NO: 1 and which hybridizes with a Pax9 gene or a gene derived therefrom, in the diagnosis and therapy of dysplasia, metaplasia and tumors of epithelial cells and cartilage cells can be used.
  • Such a nucleic acid is particularly well suited for the diagnosis of squamous cell carcinoma.
  • Such a diagnostic agent can be used for the early detection of epithelial dysplasia, metaplasia and tumors of the multilayer plate epithels can be used excellently. This enables, for example, early detection of macroscopic and microscopic (!) No pathological changes in the cells, early detection of dysplasias, that is to say possible precursors of metaplasias and tumors thereof Tissue to perform.
  • the therapeutic or diagnostic agent according to the invention contains as active ingredient at least one nucleic acid which (a) a nucleic acid sequence coding for the Pax9 protein, (b) a part thereof, (c) one with a nucleic acid sequence from (a) and / or (b) nucleic acid sequence hybridizing under stringent conditions or (d) a nucleic acid sequence complementary to a nucleic acid from (a), (b) and / or (c).
  • nucleic acid which (a) a nucleic acid sequence coding for the Pax9 protein, (b) a part thereof, (c) one with a nucleic acid sequence from (a) and / or (b) nucleic acid sequence hybridizing under stringent conditions or (d) a nucleic acid sequence complementary to a nucleic acid from (a), (b) and / or (c).
  • the nucleic acid comprises the sequence coding for amino acids 1-208 and the sequence coding for amino acids 209-341 (see SEQ ID No: 1; Fig. Lb).
  • sequence protocol begins with the nucleotide 5 actually sequenced (denoted by 1).
  • the nucleic acid can be a DNA or RNA, which is optionally modified.
  • the nucleic acid according to the invention preferably hybridizes to the Pax9 gene under stringent conditions.
  • Stringent conditions are defined according to the invention in such a way that they enable selective and detectable specific binding of the nucleic acid to a Pax9 gene or a derivative thereof or a Pax9 transcript or a derivative thereof.
  • Such a hybridization under Stringent conditions are preferably defined in that after hybridization at 42 ° C. in 50% formamide and subsequent washing of the filter at 65 ° C. in an aqueous solution, the probe is still bound to the Pax9 gene or the Pax9 RNA or However, when using shorter nucleic acids as probes it may be necessary to use less drastic hybridization and / or washing conditions .
  • Highly stringent conditions are: washing the filter in 0.1x SSC, 0.1% SDS at 68 ° C.
  • a nucleic acid sequence from the non-conserved area of the gene is to be used, ie preferably from the area not coding for the paired domain. The same applies to the inhibition of the Pax9 gene.
  • the agent according to the invention can be used in an effective amount as a molecular probe in diganostics or therapy of dysplasia, metaplasia and tumors. Furthermore, it can be used as an antisense nucleic acid for the specific inhibition of the gene expression of the Pax9 gene.
  • a method for tumor diagnosis and a method for inhibiting the expression of the Pax9 gene are furthermore provided which use the agent according to the invention in an effective amount.
  • Another therapeutic or diagnostic agent provided according to the invention contains at least one active ingredient in an effective amount, which comprises at least one Pax9 protein, analogs, parts, conjugates, oligomers and / or mixtures thereof.
  • Such an agent is used in an effective amount in the diagnosis and / or therapy of dysplasia, metaplasia and tumors of epithelial cells.
  • a therapeutic or diagnostic agent contains at least one active ingredient which comprises at least one antibody against a Pax9 protein, analogs, parts, conjugates, oligomers and / or mixtures thereof.
  • the therapeutic and diagnostic agent provided according to the invention with part of the Pax9 protein, analogs, conjugates, oligomers and / or mixtures thereof preferably has amino acids 132-341 and in a further preferred embodiment amino acids 251-341, each of which Fig. IB, (this counting method includes the amino acids not covered by the sequencing technique used; if these are not taken into account in the counting, the amino acids 130 - 337 or 249-337 are obtained), or the amino acids 130 - 337 or 249 - 337 according to SEQ ID No: 1.
  • the therapeutic or diagnostic agent provided according to the invention has at least one active ingredient which contains at least one antibody, preferably a monoclonal antibody, against a Pax9 protein, analogs, parts, conjugates, oligomers and / or Mixtures thereof are included, and in specific embodiments of the invention these antibodies can be directed against epitopes which are in the regions 132-341 or 251-341 of the amino acid sequence of FIGS. IB or 130-337 or 249-337 according to SEQ ID No: 1 are localized.
  • at least one antibody preferably a monoclonal antibody, against a Pax9 protein, analogs, parts, conjugates, oligomers and / or Mixtures thereof are included, and in specific embodiments of the invention these antibodies can be directed against epitopes which are in the regions 132-341 or 251-341 of the amino acid sequence of FIGS. IB or 130-337 or 249-337 according to SEQ ID No: 1 are localized.
  • the Pax9 protein with the amino acid sequence of SEQ ID No: 1, analogs, parts, conjugates, oligomers and / or mixtures thereof are also provided.
  • nucleotide sequence 1-627 and the amino acid sequence 1-208 (SEQ ID No: 1) have already been described in Stapleton (1993) and are not included in a special embodiment of the invention.
  • the present invention also relates to DNA which is intended for the encoded standing Pax9 protein, and RNA, which is derived from this DNA.
  • the antibodies according to the invention are preferably monoclonal antibodies, which are known in a known manner by the Köhler-Milstein method by immunizing a test animal, preferably a mouse, with the Pax9 protein and / or a mixture of Pax9 proteins, obtaining antibody-producing B- Cells or spleen cells from the immunized experimental animal and subsequent fusion of the antibody-producing cells with a suitable leukemia cell to generate hybridomas are available.
  • the antibodies according to the invention can preferably be used in vitro and / or in vivo as agents in tumor diagnosis and / or tumor therapy.
  • the antibodies can also be used as fragments (e.g. Fab or F (ab) 2 fragments) and optionally coupled to a detectable group (enzyme, fluorescent label, radioactive label, nuclear magnetic resonance label etc.) or to a toxin (e.g. ricin, diphtheria toxin etc.) become.
  • Antibody derivatives of this type are produced in a manner known to those skilled in the field of immunology (for example by covalent coupling via a bi-functional linker).
  • the invention also includes antibodies, in particular monoclonal antibodies, which are directed against a Pax9 protein, analogs, parts, conjugates, oligomers and / or mixtures thereof. These antibodies can be used in the methods provided according to the invention and in the claimed uses.
  • the therapeutic or diagnostic agents provided according to the invention are used for the diagnosis or therapy of dysplasia, metaplasia and tumors of epithelial cells, preferably of the multilayered squamous epithelium and of cartilage cells.
  • the diagnosis and therapy of changes in the esophagus, the skin, e.g. psoriasis, the oral mucus Skin, the tongue, the cornea, vagina, the cervix, the endometrium, the anus, the sebaceous glands of the skin and the cartilage are preferred areas of application.
  • the early detection of dysplasia of epithelial cells is a possible area of use of the present invention.
  • a metaplasia in the present case the conversion of an epithelium into a multilayer squamous epithelium, can theoretically occur anywhere in the body where "non-squamous epithelia" are present.
  • the single layer epithelium of the trachea is often converted into a multi-layer squamous epithelium in smokers.
  • Another important example is the conversion of the endometrial epithelium (normally one layer) into a multilayer squamous epithelium.
  • the agent provided according to the invention which contains at least one active substance with at least one nucleic acid that hybridizes with a Pax9 gene or a derivative thereof.
  • the Pax9 protein is localized in larger amounts in dysplasias of epithelial cells than in normal cells in the cytoplasm.
  • recombinant vectors with a sequence coding for a Pax9 protein, an analog, parts, conjugates, oligomers and mixtures thereof, which in a preferred embodiment are in functional connection with one or more signal sequences for the directed transport of the Pax9 protein into the cell nucleus is used.
  • This vector can be derived, for example, from a plasmid or from a viral vector.
  • Usual, known in the field of gene therapy or still to be developed Vectors can be used according to the invention. This is preferably an expression vector which can be expressible both in pro- and in eukaryotic cells.
  • the present invention also includes eukaryotic cells and prokaryotic cells which have been transformed with a vector which contains the Pax9 gene according to the invention.
  • the vectors provided according to the invention with the Pax9 gene can be used for somatic gene therapy in humans. For example, they can be used for the terminal differentiation of tumor cells and tumor precursor cells.
  • the invention also includes analysis kits for analyzing Pax9 expression in cartilage cells and epithelial cells, in particular of squamous epithelium, for dysplasia, metaplasia and tumors.
  • Fig. IA the amino acid sequence of the human Pax9 protein with 341 amino acids.
  • Fig. IB a comparison of the amino acid sequence of the Pax9 gene in humans (HUPax9) and the mouse (MPax9).
  • Fig. 2 shows a Northern blot analysis
  • Fig. 3 the detection of the Pax9 protein in protein extracts from the esophagus of the mouse and man (Western blot analysis).
  • Fig. 4 the localization of the Pax9 protein in the healthy esophageal epithelium of the mouse (A-D) and humans (E-H).
  • Fig. 8 the localization of the Pax9 protein in differentiating cartilage cells in the growing tubular bone of a 16.5-day-old mouse embryo.
  • the length of the length standards shown in the figures is 100 ⁇ m.
  • the existence of the Pax9 gene is proven in the genomes of the mouse (Wallin et al., 1993), humans (Stapleton et al., 1993) and the chicken (Peters et al., 1995).
  • the amino acid sequence of the DNA-binding "paired" domain is identical in these organisms.
  • the amino acid sequences of the Pax9 proteins of humans are combined from Stapleton et al., 1994 and Peters et al., Unpublished) and of the mouse (Neubüser et al., 1995) are shown in Fig. 1.
  • the "paired" domain and another conserved sequence motif of 8 amino acids, the octapeptide, are framed in this figure.
  • Pax9 is expressed in the epithelium of the undifferentiated pharynx during mouse and chicken embryonic development (Neubüser et al., 1995, Peters et al., 1995).
  • the epithelium of the pharynx is involved in organogenesis of the esophagus in the further course of embryonic development (among others).
  • the initially single-layer epithelium is converted into a multi-layer squamous epithelium that lines the entire esophagus in the adult organism.
  • Pax9 is expressed in the multilayer squamous epithelium of the chicken esophagus (Peters et al., 1995), mouse and human (Peters et al., Unpublished). Multi-layered squamous epithelia also occur in the human organism in the skin, the oral mucosa, the tongue, the cornea, the vagina and in the anus. The sebaceous glands of the skin show a similar structure from epithelial cells. With the exception of the cornea, the expression of Pax9 could be detected in all of the organs mentioned above in the adult mouse. In the late phase of mouse embryonic development, Pax9 is also expressed in a specific phase of cartilage differentiation (Peters and Balling, unpublished).
  • the cells expressing Pax9 mark the transition phase between the proliferating columnar cartilage and the layer of the differentiating bladder cartilage, which is ossified in the further course of development.
  • it is not the proliferating but the differentiating cells that express Pax9 in cartilage cells.
  • the present invention which resulted from the experiments described below, can thus be applied to these organs.
  • the basis for the present invention is the analysis of the gene and protein expression of Pax9 in the multilayered squamous epithelium, in particular the healthy esophageal epithelium of humans and mice, and in cartilage cells of the growing tubular bone during the embryonic development of the mouse.
  • the nucleotide sequence of the exon containing the "paired" box is known from the human Pax9 gene (Stapleton et al., 1993).
  • the total RNA of the esophagus was transformed into the human coding Pax9 cDNA isolated.
  • the isolation of total RNA was carried out using the "RNeasy Total RNA” kit (Qiagen, Hilden). Fresh section material from the Institute for Pathology at thesole der Isar Clinic, Kunststoff, was made available for this purpose, l ⁇ g of the total RNA was used for reverse transcription.
  • the starting point for the reverse transcriptase was the synthetic DNA oligonucleotide 5 1 - CCCAAGCTTTGGACGCTCCCATCAGAGTGC-3 '(restriction site for Hindlll is underlined). This sequence was derived from the mouse Pax9 cDNA (Neubüser et al., 1995) and spans the stop codon and the last two carboxy-terminal amino acids of the murine Pax9 protein. The amplification of the human Pax9 cDNA was then carried out using the polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • the oligonucleotide 5 '-CCCAAGCTTAGCCAGCCTTC GGGGAGGTG-3' was also used, which is derived from the 5 'region of the "paired" box of the human Pax9 gene (Stapleton et al., 1993) has been.
  • the following conditions were observed for 25 amplification cycles: 1 min denaturation at 94 ° C; 1 min hybridization of the oligonucleotides at 60 ° C; 1 min DNA polymerization at 72 ° C.
  • the DNA fragment obtained was digested with HindII and cloned into the restriction site HindIII of the plasmid pKS (Stratagene, Heidelberg). Sequencing was carried out using the Sequenase kit according to the manufacturer's instructions (USB, Cleveland, USA). The sequence of the derived amino acids and the comparison with the Pax9 protein of the mouse are shown in Fig. 1A and IB.
  • Pax9 is expressed in the esophagus of the mouse, but no transcripts are detectable in the glandular stomach, small intestine and large intestine. Pax9 transcripts are also detectable in human esophagus (Fig. 2B).
  • a comparison with the internal length standards of the ribosomal 28S-RNA (6333 bases) or 18S-RNA (2366 bases) showed that the transcript lengths of the human Pax9 gene are approx. 5.3 kilobases (upper band), 3.5 kilobases ( medium band) and 2.1 kilobases (lower band).
  • Pax9 transcripts are translated and can be detected as Pax9 proteins in protein extracts of the esophagus.
  • polyclonal antibodies directed against the Pax9 protein have been raised in rabbits.
  • the cDNA sequence coding for amino acids 252-342 of the mouse Pax9 protein was cloned into the vector pMAL TM -c2 (New England Biolabs).
  • the resulting plasmid, pMALP9 codes for a fusion protein consisting of a 42.7 kd maltose-binding protein from Escherichia coli (Guan et al., 1987) and the carboxy-terminal region of the Pax9 protein.
  • the expression and the purification of the fusion protein were carried out according to the manufacturer's instructions (New England Biolabs).
  • Two rabbits were immunized subcutaneously with 400 ⁇ g of the fusion protein in Freund's adjuvant. At intervals of four weeks, immunization was again carried out with 100 ⁇ g of the fusion protein.
  • a second immune serum designated 105-IV, which recognizes the paired domain of the Pax9 protein (Peters et al., 1995), was used to confirm the specificity of the 281-IV immune serum.
  • protein extracts from human or mouse esophagus were prepared according to known protocols (Peters et al., 1995), each 50 ⁇ g of a protein extract was separated on 12% polyacrylamide gels (Laemmli, 1970) and then by Transfer semi-dry electrical transfer to fluorotrans membranes (Pall, Dreieich).
  • a protein size marker (Sigma, Kunststoff) was additionally applied to estimate protein sizes.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the immune serum was then added in a dilution of 1: 200 and incubated at 21 ° C. for one hour.
  • the membrane was then washed in 0.1% Tween20 in PBS for 20 min and then incubated at a dilution of 1: 2000 with a conjugate of anti-rabbit IgG and alkaline phosphatase (Boehringer, Mannheim).
  • Fig. 3 shows the result of this Western blot analysis.
  • Immune serum 281-IV detects a protein with an estimated molecular weight of approx. 39 kd in the protein extract from the esophagus of the mouse (Fig. 3, lane 1). This size corresponds to the molecular weight of the Pax9 protein to be derived from the amino acid sequence (39 kd, see Fig. 1). This result is ensured by using the second immune serum (105-IV), which recognizes the paired domain of Pax9 and detects a band at the same level (Fig. 3, lane 2). The immune serum 105-IV cross-reacts with the human Pax9 protein and also detects a protein with a molecular weight of approx. 39 kd in the protein extract from the human esophagus (Fig.
  • Lanes 4 (protein extract from the mouse esophagus) and 5 (protein extract from the human esophagus) in Fig. 3 show the result of the control incubation with normal rabbit serum and demonstrate the specificity of the immune sera 281-IV and 105-IV. 3. Localization of the Pax9 protein in the healthy mouse and human esophageal epithelium
  • the subcellular localization of the Pax9 proteins in the healthy esophageal epithelium of the mouse, humans and in the cartilage of the mouse embryo was determined using immunohistochemical methods.
  • the same polyclonal antibodies as described in point 2 were used for these experiments.
  • 5-7 ⁇ m thick paraffin sections from formalin-fixed tissue were dewaxed twice for 10 min in xylene, 5 min in isopropanol, 2 min each in 100% / 96% / 90% / 70% and 50% ethanol and then for 5 min equilibrated in PBS.
  • the sections were pretreated for 10 min in 10 mM citric acid (pH 6.0) and boiled in the microwave.
  • Sections were then carried out for 90 min at 37 ° C. in the antibody dilutions of the immune serum 281-IV or the pre-immune serum (1: 200 in PBS, 3% BSA) or 105-IV (1: 200 in PBS , 3% BSA, 15% normal sheep serum).
  • Sections from mouse tissues were treated as follows: After washing for 5 min in PBS, a conjugate (1: 200 in PBS, 3% BSA diluted) of anti-rabbit IgG and alkaline phosphatase (Boehringer, Mannheim ) incubated.
  • the sections were capped in glycerol gelatin (Merck, Darmstadt) for microscopy. Documentation was done on Kodak Ektachrome slide films using a Leitz Axioplan microscope and Normarski optics. To display the histology, sections from areas analogous to those above were dewaxed and stained with hematoxylin / eosin.
  • the multilayered squamous epithelium of the human esophagus (Fig. 4 E) consists of a mitotically active, basal cell layer (Bz), which contains the stem cells, and the suprabasal cell layers (Sz) resulting from this layer, whose specific differentiations are the multilayered, hornless Build up squamous epithelium.
  • Bz basal cell layer
  • Sz suprabasal cell layers
  • the esophagus of three mice was prepared, fixed and examined immunohistochemically by the method described above over a period of 24 hours at three hour intervals.
  • Pax9 protein could be detected in the basal cell layer (without picture).
  • the expression pattern corresponds in all cases to that shown in FIGS. 4B and 4C.
  • the Pax9 protein is also located in the cell nuclei of the suprabasal cell layers (Fig. 4F and 4G).
  • the control incubation with normal rabbit serum shows no specific staining (Fig. 4H).
  • the Pax9 protein is located in the cell nuclei of the suprabasal layers. This local sation correlates with the terminal differentiation of these cells.
  • Leukoplakia which are characterized by whitish, focal thickening of the mucosal epithelium, are considered to be precancerous. However, the polarity and differentiation of the epithelium is largely preserved (Fig. 5A) and comparable to that of the normal esophageal epithelium (see Fig. 4E).
  • Figure 5B shows the location of the Pax9 protein in leukoplakia. As in the healthy esophageal epithelium, the Pax9 protein is localized in the cell nuclei of the suprabasal layers.
  • Figure 5C shows the protein distribution of Pax9 from another area of the same tissue sample.
  • squamous cell carcinomas of type G2 Fig. 6C, E, G
  • G3 Fig. 7A, C, E
  • the Pax9 protein is examined in all Cases predominantly localized in the cytoplasm.
  • the results are shown as examples of squamous cell carcinomas of type G2 (Fig. 6D, F, H) or type G3 (Fig. 7B, D, F).
  • the present invention provides a new diagnostic or therapeutic agent which contains at least one nucleic acid of the Pax9 gene as active substance and is particularly suitable for the early detection of dysplasia and metaplasia of the multilayered squamous epithelium as well as for tumor diagnosis and tumor therapy of squamous cell carcinoma. It is of particular importance that changes in Pax9 expression can already indicate precancerous lesions that only manifest themselves as tumors in the further course of the disease.
  • osteoarthritis differentiation processes are initiated in this layer, which do not normally occur. Secondary cell division and subsequent chondrocyte hypertrophy can be found in the hyaline articular cartilage (Hoyland et al., 1991, van der Mark et al., 1992).
  • Pax9 a transcription factor
  • the immunohistochemical experiments carried out on the humerus of a 16.5-day-old mouse embryo in this study showed that Pax9 exactly marks the zone of maturation, which is between the phases of cell division and hypertrophy, at the molecular level (Fig. 8B).
  • a comparable expression pattern was also observed in other skeletal elements (shoulder blade, vertebral body, fingers).
  • the Pax9 protein is - in analogy to the findings in healthy esophageal epithelium - localized in the cell nuclei.
  • DNA encoding a polypeptide described above which DNA can be optionally modified.
  • RNA derived from this DNA the RNA being optionally modified.
  • Monoclonal or polyclonal antibodies directed against an epitope of the polypeptides described above are provided.
  • a recombinant vector with a DNA sequence according to the invention optionally in functional connection with one or more signal sequences for the directed transport of the polypeptide into the cell nucleus.
  • the vector is preferably a plasmid or a viral vector, furthermore preferably an expression vector, preferably expressable in eukaryotic cells.
  • a nucleic acid with (a) one for the sequence of amino acids No. 130-337 according to SEQ ID No. : 1, coding nucleic acid sequence or a part thereof, (b) a nucleic acid sequence hybridizing with a nucleic acid sequence from (a) under stringent conditions or (c) a nucleic acid sequence complementary to a nucleic acid from (a) and / or (b) or a polypeptide with an amino acid sequence No. 130- 337 according to SEQ ID No. : 1 or a part thereof or a polyclonal or monoclonal antibody against this sequence for the diagnosis or therapy of dysplasias, metaplasias and tumors of epithelial cells and cartilage cells.
  • the sequence preferably comprises the amino acids No. 209-337 or 249-337 or 130-193 or 202-337 or a part thereof with the corresponding function according to SEQ ID No. : 1.
  • the use is used for the diagnosis and therapy of changes in the epithelial cells of the esophagus, the skin, oral mucosa, tongue, cornea, vagina, the cervix, the endometrium, the anus and the sebaceous glands of the skin and the cartilage, for example for the diagnosis and therapy of Dysplasia of the multilayer squamous epithelium.
  • the nucleic acid according to the invention can be used as an antisense nucleic acid to inhibit gene expression.
  • the vector according to the invention can be used for somatic gene therapy.
  • a method for the detection of tumors, metaplasias and dysplasias of epithelial and cartilage cells in vitro wherein a nucleic acid with (a) one for the sequence of amino acids No. 130-337 according to SEQ ID No. : 1, coding nucleic acid sequence or a part thereof, (b) a nucleic acid sequence hybridizing with a nucleic acid sequence from (a) under stringent conditions or (c) a nucleic acid sequence complementary to a nucleic acid from (a) and / or (b) or a against a polypeptide with the amino acid sequence 130-337 according to SEQ ID No. : 1 directed polyclonal or monoclonal antibody is brought into contact with a tissue sample containing the epithelial cells or cartilage cells to be analyzed in order to analyze the amount and / or the location of the expression of human Pax9 protein.
  • the sequence preferably comprises amino acids No. 209-337 or 249-337 or 130-193 or 202-337 according to SEQ ID No.:l.
  • the vector according to the invention can be used for the terminal differentiation of tumor cells or tumor precursor cells.
  • polypeptide according to the invention or the nucleic acid according to the invention can be used in an analysis kit for analyzing Pax9 expression in epithelial cells and cartilage cells for dysplasias, metaplasias and tumors.
  • a eukaryotic or prokaryotic cell transformed with a vector according to the invention is a eukaryotic or prokaryotic cell transformed with a vector according to the invention.
  • a diagnostic or therapeutic agent at least containing a nucleic acid according to the invention or a polypeptide.
  • a diagnostic agent that is designed as an analysis kit for analyzing Pax9 expression in epithelial cells and cartilage cells for dysplasias, metaplasias and tumors.
  • a monoclonal antibody which is directed against an epitope of a polypeptide with the amino acids 130-193, 202-337, 202-248 or 249-337 (according to SEQ ID No: 1).
  • nucleic acid sequences DNA or RNA sequences
  • amino acid sequences and the monoclonal and polyclonal antibodies directed against them originate from the non-conserved regions of the Pax9 gene, i.e. from those areas which lie outside the restricted areas in the attached figure IB, preferably from the areas with the amino acids 130-193, 202-337, 202-248 and 249-337, and also partial areas of these sequences, for the use provided according to the invention and the method according to the invention can be used.
  • Cartilage matrix protein is a marker for cartilage differentiation.
  • Pax-2 is a DNA-binding protein expressed in embryonic kidney and Wilms tumor. Proc.Natl.Acad.Sei.USA 89, 1179-1183
  • the promoter of the CD19 gene is a target for the B-cell-specific transcription factor BSAP. Mol.Cell.Biol. 12, 2662-2672
  • Tassabehji M., Read, AP, Newton, VE, Harris, R., Balling, R., Gruss, P. & Strachan, T. (1992): Waardenburg's syndrome patients have mutations in the human homologue of the Pax-3 paired box gene. Nature 355, 635-638
  • the paired box encodes a second DNA-binding domain in the paired homeo domain protein.

Abstract

Erfindungsgemäss wird ein therapeutisches oder diagnostisches Mittel bereitgestellt, das mindestens einen Wirkstoff mit mindestens einer Nukleinsäure enthält, die mit einem Pax9-Gen oder einem Derivat hiervon hybridisiert. Die erfindungsgemässen Mittel werden bevorzugt zur Diagnostik und Therapie von Dysplasien, Metaplasien und Tumoren von Epithelzellen, bevorzugt von mehrschichtigen Plattenepithelien, eingesetzt.

Description

SONDE ZUR FRUHERKENNUNG VON EPITHELIALEN DYSPLASIEN DES MEHRSCHICHTIGEN PLATTENEPITHELS SOWIE ZUR TUMORDIAGNOSTIK UND TUMORTHERAPIE
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues therapeutisches oder diagnostisches Mittel mit mindestens einer Nukleinsäure als Wirk¬ stoff, das sich insbesondere zur Früherkennung von Dysplasien des mehrschichtigen Plattenepithels und des Knorpels sowie zur Tumordiagnostik und Tumortherapie eignet.
Plattenepithelkarzinome. Präkanzerosen und Dysplasien
Das Plattenepithelkarzinom ist der am häufigsten auftretende Tumor des Oesophagus. Diese Form von Tumoren wird in der Tumordi¬ agnostik auf Grund histologischer Kriterien in vier verschiedene Kategorien (Gl, G2, G3 und G4) unterteilt, wobei die histopa- thologischen Abnormalitäten in Gl-Tumoren am geringsten, die in G4-Tumoren am größten sind.
Die Entwicklung geeigneter Verfahren in der Tumortherapie sind Gegenstand intensiver medizinischer Forschung. Grundlage dieser Forschung ist sowohl eine umfassende morphologische, histologi- sche und molekulare Tumordiagnostik als auch die Erforschung der Tumorentstehung. Die molekulare Ätiologie der Tumorentstehung ist nicht einheitlich - häufig können jedoch Mutationen (Deletionen, Gen-Amplifikationen, Translokationen chromosomaler Abschnitte etc. ) im betroffenen Gewebe nachgewiesen werden, die sich schrittweise in fehlgeleiteter Differenzierung und letztlich in unkontrollierter Zellteilungmanifestieren. InPlattenepithelkar- zinomen des Oesophagus sind eine Vielzahl von Mutationen in Onkogenen, Tumor-Suppressorgenen und Genen für Wachstumsfaktoren beschrieben (Übersicht in Stemmermann et al., 1994). Inter¬ essanterweise konnten derartige Mutationen auch in den dem Tumor benachbarten, histologisch normal erscheinenden Geweben nach¬ gewiesen werden. Man geht davon aus, daß für die Entstehung eines Tumors die Gesamtheit intrazellulärer Schäden einen kritischen Schwellenwert überschreiten muß. Eine erfolgreiche Tumortherapie wird daher auch von der Diagnostizierung früher Stadien der Tumorentstehung abhängig sein.
Aus histopathologischer Sicht gelten Dysplasien des mehrschichti¬ gen Plattenepithels als präkanzerogene Läsionen und somit als potentielle Frühstadien der Tumorentstehung. Die Ursachen der Dysplasien sind u.a. in der Entartung der Transkriptionskontrolle differenzierungsspezifischer Gene zu suchen. Diese Kontrolle wird normalerweise von einem geordneten Zusammenwirken von Trans¬ kriptionsfaktoren, die die Aktivität dieser Zielgene gemeinsam regulieren, gewährleistet. Gelingt der Nachweis, daß bereits die Expression, subzelluläre Lokalisation bzw. Aktivität dieser Transkriptionsfaktoren verändert sind, können derartige Befunde als diagnostische Marker zur frühen Erkennung von Dysplasien Verwendung finden. Hinsichtlich der Tumoren des Plattenepithels sollte ein günstiger Marker auch im malignen Gewebe eine Ver¬ änderung der Expression aufweisen.
Pax-Gene
Pax-Gene repräsentieren eine Multigenfamilie, die eine kon¬ servierte DNA-Sequenz, die "paired"-Box, enthalten. Aus dem Genom des Menschen und der Maus sind bisher jeweils 9 verschiedene Pax- Gene (Paxl-Pax9) isoliert worden ( Übersicht in Walther et al., 1991; Stapleton et al. , 1993; Wallin et al., 1993). Die "paired"- Box ist darüber hinaus auch in Vertretern niedrigerer Tier¬ klassen, z.B. in Nematoden, Drosophila, Zebrafisch, Schildkröte und Huhn, nachgewiesen worden (Übersicht in Noll, 1993). Die "paired"-Box kodiert für die DNA-bindende "paired"-Domäne; die Proteine der Pax-Gene konnten somit in die Gruppe der Trans¬ kriptionsfaktoren eingeordnet werden (Treisman et al. , 1991, Chalepakis et al., 1991, Xu et al., 1995).
Pax-Gene sind entscheidend an der Entwicklung embryonaler Strukturen beteiligt. Während der Embryonalentwicklung der Maus werden die Pax-Gene sowohl räumlich als auch zeitlich in spezifi¬ schen und teilweise einander überlappenden Mustern exprimiert (Gruss & Walther, 1992). Die starke, instruktive Wirkung der Pax- Gene während der Embryonalentwicklung konnte u.a. durch die gentechnisch erzeugte, ektopische Expression von Pax6 in Imagi- nalscheiben der Flügel bzw. der Beine von Drosophila demonstriert werden (das Pax6-Gen wird normalerweise in der Anlage des Auges exprimiert). Die ektopische Expression von Pax6 in Imaginal- scheiben der Flügel bzw. der Beine hat zur Folge, daß sich hier an falscher Stelle ein nahezu vollständiges Auge entwickelt (Halder et al., 1995).
Mit der Entdeckung, daß Mutationen in Pax-Genen für kongenitale Fehlbildungen bei Mäusen, aber auch beim Menschen (Paxl: undula- ted, Pax3: splotch und Waardenburg-Syndrom, Pax6: Small eye und Aniridia) verantwortlich sind, gewannen die Untersuchungen dieser Gengruppe weiter an Bedeutung (Balling et al., 1988; Epstein et al., 1991; Tassabehji et al., 1992; Hill et al., 1991; Ton et al., 1991).
Die Funktion der Pax-Gene ist nicht auf die Embryonalentwicklung beschränkt. Es konnte z.B. gezeigt werden, daß das Pax-5 Protein das Gen CD19 (CD19 kodiert für ein B-Lymphocyten-spezifisches Protein) aktiviert (Kozmik et al., 1992) und somit auch im adulten Organismus eine Funktion übernimmt. Pax8 wird in der Schilddrüse des adulten Organismus exprimiert und ist an der Aktivierung der Gene für Thyroglobulin und Thyroperoxidase beteiligt (Zannini et al., 1992). Pax-Gene und Tumorentstehunq
Einige Mitglieder der Pax-Genfamilie (Paxl, Pax2, Pax3, Pax6, Pax8) sind auf Grund ihrer tumorigenen Eigenschaften als Proto- Onkogene identifiziert worden. Die Identifizierung basiert auf Transformationstests, bei denen die oben genannten Pax-Gene unter der Kontrolle des Cytomegalovirus-Promotors in NIH3T3- bzw. 208- Zellen überexprimiert werden. Injektionen der transformierten 208-Zellen in Nacktmäusen führen in nahezu allen Fällen zum Auftreten von Sarkomen (Maulbecker & Gruss, 1993).
Die molekularen Zusammenhänge der Tumorentstehung durch Aktivie¬ rung von Pax-Genen sind nicht bekannt. Für eine Reihe von Rhabdomyosarkomen konnte gezeigt werden, daß Pax3 oder Pax7 in Folge von chromosomalen Translokationen mit dem Gen für FKHR, einem Transkriptionsfaktor aus der Familie der forkhead-Gene, fusioniert ist. Es konnte gezeigt werden, daß Chimäre Transkripte aus Pax3-FKHR bzw. Pax7-FKHR in Rhabdomyosarkomen exprimiert werden (Shapiro et al., 1993; Davis et al., 1994).
In Wilm's Tumoren der Niere konnte die Expression von Pax2 nachgewiesen werden (Dressler & Douglass, 1992). Pax2 ist für die Entwicklung der Niere notwendig - die Expression wird jedoch bereits während der Embryonalentwicklung herabreguliert und ist in der gesunden, adulten Niere nicht nachweisbar (Dressler et al., 1990).
Aus der DE-A-42 25 569 ist ein therapeutisches oder diagnosti¬ sches Mittel bekannt, das als Wirksubstanz mindestens eine Nukleinsäure enthält, die mit einem Pax-Gen hybridisiert. Als Pax-Gene werden Paxl bis Paxδ genannt. Weiterhin beschrieben werden die Verwendung eines derartigen Mittels als molekulare Sonde in der Tumordiagnostik und als Antisense-Nukleinsäure zur Hemmung der Genexpression.
Nicht genannt werden in der DE-A-42 25 569 therapeutische oder diagnostische Mittel unter Verwendung einer Nukleinsäure, die mit einem Pax9-Gen hybridisiert, und Verwendungen eines derartigen Mittels. Dies ist dadurch zu erklären, daß zum Zeitpunkt der Hinterlegung der DE-A-4225569 (3.8.1992) die Existenz des Pax9- Genes noch unbekannt war. Weiterhin offenbart diese deutsche Offenlegungsschrift ausschließlich in allgemeiner Form die Verwendung derartiger Sonden zur Tumordiagnostik oder Tumor¬ therapie. In welchen speziellen Bereichen der Tumordiagnostik oder Tumortherapie dieses Mittel überhaupt einsetzbar sein soll, wird nicht offenbart, was jedoch bei der Vielzahl und Heterogen!- tät von Tumoren bedeutsam ist. Insbesondere wird in dieser Offenlegungsschrift kein Mittel offenbart, das sich auch zur Früherkennung von präkanzerogenen Läsionen, insbesondere von Dysplasien des mehrschichtigen Plattenepithels, eignet.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine neue, mindestens eine Nukleinsäure als Wirkstoff umfassende Sonde bereitzustellen, die zur Tumordiagnostik und Tumortherapie von Dysplasien, Metaplasien und Tumoren von Epithelzellen und Knorpelzellen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das im Anspruch 1 näher gekennzeichnete therapeutische oder diagnostische Mittel gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen und den nebengeordneten Ansprüchen.
Überraschenderweise wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß eine Nukleinsäure, die für die Aminosäuren unter 30 bis 337 gemäß SEQ ID Nr. : 1 codiert und die mit einem Pax9-Gen oder einem hiervon abgeleiteten Gen hybridisiert, in der Diagnostik und in der Therapie von Dysplasien, Metaplasien und Tumoren von Epithelzel¬ len und Knorpelzellen einsetzbar ist. Insbesondere eignet sich eine derartige Nukleinsäure für die Diagnostik von Plattene- pithelkarzinomen in hervorragender Weise. Ein derartiges diagnostisches Mittel kann zur Früherkennung epithelialer Dysplasien, Metaplasien und Tumoren des mehrschichtigen Platten- epithels hervorragend eingesetzt werden. Hierdurch wird bei¬ spielsweise ermöglicht, bereits zu einem sehr frühen Zeitpunkt, zu makroskopisch und auch mikroskopisch ( ! ) noch keine pathologi¬ schen Veränderungen der Zellen feststellbar sind, eine Früh¬ erkennung von Dysplasien, also möglichen Vorstufen von Metapla¬ sien und Tumoren dieser Gewebe, durchzuführen.
Das erfindungsgemäße therapeutische oder diagnostische Mittel enthält als Wirkstoff mindestens eine Nukleinsäure, die (a) eine für das Pax9-Protein kodierende Nukleinsäuresequenz, (b) einen Teil hiervon, (c) einen mit einer Nukleinsäuresequenz aus (a) und/oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleinsäuresequenz oder (d) eine zu einer Nukleinsäure aus (a), (b) und/oder (c) komplementäre Nukleinsäuresequenz umfaßt.
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung umfaßt die Nuklein¬ säure die für die Aminosäuren 1-208 kodierende Sequenz und die für die Aminosäuren 209-341 kodierende Sequenz (siehe SEQ ID No:l; Abb. lb).
Aufgrund der verwendeten Klonierungstechnik war es nicht möglich, die Nukleotide 1-4 und 1018-1023 bzw. die hiervon abgeleiteten Aminosäuren 1 und 2 und die Aminosäuren 340 und 341 zu bestimmen. In der beiliegenden Abbildung IB sind diese Aminosäuren mit "*" bezeichnet. Das Sequenzprotokoll dagegen beginnt mit dem tatsäch¬ lich sequenzierten Nukleotid 5 (mit 1 bezeichnet).
Die Nukleinsäure kann eine DNA oder RNA sein, die gegebenenfalls modifiziert ist.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäure hybridisiert bevorzugt unter stringenten Bedingungen an das Pax9-Gen. Stringente Bedingungen sind erfindungsgemäß so definiert, daß sie eine selektive und nachweisbare spezifische Bindung der Nukleinsäure an ein Pax9-Gen oder ein Derivat hiervon oder ein Pax9-Transkript oder ein Derivat hiervon ermöglichen. Eine derartige Hybridisierung unter stringenten Bedingungen ist vorzugsweise dadurch definiert, daß nach einer Hybridisierung bei 42 "C in 50% Formamid und anschlie¬ ßendem Waschen des Filters bei 65°C in einer wäßrigen Lösung noch eine Bindung der Sonde an das Pax9-Gen oder die Pax9-RNA oder Derivate hiervon nachweisbar ist. Bei Verwendung von kürzeren Nukleinsäuren als Sonden kann es jedoch erforderlich sein, weniger drastische Hybridisierungs- und/oder Waschbedingungen anzuwenden. Hoch-stringente Bedingungen sind: Waschen des Filters in 0,lx SSC, 0,1% SDS bei 68°C.
Zum spezifischen Nachweis des Pax9-Gens ist eine Nukleinsäurese¬ quenz aus dem nicht konservierten Bereich des Gens zu verwenden, also bevorzugt aus dem nicht für die Paired-Domäne kodierenden Bereich. Das gleiche gilt für die Hemmung des Pax9-Gens.
Das erfindungsgemäße Mittel kann in einer wirksamen Menge als molekulare Sonde in der Diganostik oder Therapie von Dysplasien, Metaplasien und Tumoren eingesetzt werden. Weiterhin ist es als Antisense-Nukleinsäure zur spezifischen Hemmung der Genexpression des Pax9-Gens einsetzbar.
Erfindungsgemäß wird weiterhin ein Verfahren zur Tumordiagnostik und ein Verfahren zur Hemmung der Expression des Pax9-Gens bereitgestellt, das das erfindungsgemäße Mittel in einer wirk¬ samen Menge einsetzt.
Ein weiteres, erfindungsgemäß bereitgestelltes therapeutisches oder diagnostisches Mittel enthält mindestens einen Wirkstoff in einer wirksamen Menge, der mindestens ein Pax9-Protein, Analoga, Teile, Konjugate, Oligomere und/oder Mischungen hiervon umfaßt. Ein derartiges Mittel wird in einer wirksamen Menge in der Diagnostik und/oder Therapie von Dysplasien, Metaplasien und Tumoren von Epithelzellen eingesetzt.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein thera¬ peutisches oder diagnostisches Mittel bereitgestellt, das mindestens einen Wirkstoff enthält, der mindestens einen Antikör¬ per gegen ein Pax9-Protein, Analoga, Teile, Konjugate, Oligomere und/oder Mischungen hiervon umfaßt.
Das erfindungsgemäß bereitgestellte therapeutische und diagnosti¬ sche Mittel mit einem Teil des Pax9-Proteins, Analoga, Kon- jugaten, Oligomeren und/oder Mischungen hiervon weist bevorzugt die Aminosäuren 132-341 und in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform die Aminosäuren 251-341, je der Abb. IB, (bei dieser Zählweise sind die durch die verwendete Sequenzierungs¬ technik nicht erfaßten Aminosäuren mit eingeschlossen; läßt man diese bei der Zählung unberücksichtigt, ergeben sich die Aminosäuren 130 - 337 bzw. 249-337), bzw. die Aminosäuren 130 - 337 oder 249 - 337 gemäß SEQ ID No: 1, auf.
Das erfindungsgemäß bereitgestellte therapeutische oder diagno¬ stische Mittel weist in einer weiteren bevorzugten Ausführungs- form der Erfindung mindestens einen Wirkstoff auf, der mindestens einen Antikörper, bevorzugt einen monoklonalen Antikörper, gegen ein Pax9-Protein, Analoga, Teile, Konjugate, Oligomere und/oder Mischungen hiervon umfaßt, wobei diese Antikörper in speziellen Ausführungsformen der Erfindung gegen Epitope gerichtet sein können, die in den Bereichen 132-341 bzw. 251-341 der Aminosäure¬ sequenz der Abb. IB bzw. 130-337 oder 249-337 gemäß SEQ ID No: 1 lokalisiert sind.
Erfindungsgemäß werden weiterhin das Pax9-Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID No: 1, Analoga, Teile, Konjugate, Oligomere und/oder Mischungen hiervon bereitgestellt.
Die Nukleotidsequenz 1-627 und die Aminosäuresequenz 1-208 (SEQ ID No: 1) sind bereits in Stapleton (1993) beschrieben und werden in einer speziellen Ausführungsform von der Erfindung nicht mitumfaßt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch DNA, die für das vor- stehend genannte Pax9-Protein kodiert, und RNA, die von dieser DNA abgeleitet ist.
Die erfindungsgemäßen Antikörper sind vorzugsweise monoklonale Antikörper, die auf bekannte Weise nach der Köhler-Milstein- Methode durch Immunisierung eines Versuchstieres, vorzugsweise einer Maus, mit dem Pax9-Protein oder/und einem Gemisch von Pax9- Proteinen, Gewinnung von Antikörper-produzierenden B-Zellen oder Milzzellen aus dem immunisierten Versuchstier und anschließender Fusionierung der Antikörper-produzierenden Zellen mit einer geeigneten Leukämiezelle zur Erzeugung von Hybridomen erhältlich sind.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können vorzugsweise in vitro und/oder in vivo als Mittel in der Tumordiagnostik und/oder Tumortherapie verwendet werden. Dabei können die Antikörper auch als Fragmente (z.B. Fab oder F(ab)2 Fragmente) und gegebenenfalls gekoppelt an eine nachweisbare Gruppe (Enzym, Fluoreszenzmarker, radioaktiver Marker, Kernresonanzmarker etc. ) oder an ein Toxin (z.B. Rizin, Diphterietoxin etc.) verwendet werden. Die Her¬ stellung derartiger Antikörper-Derivate erfolgt auf eine dem Fachmann auf dem Gebiet der Immunologie bekannte Weise (z.B. durch kovalente Kopplung über einen bi-funktionellen Linker). Erfindungsgemäß mit umfaßt werden Antikörper, insbesondere monoklonale Antikörper, die gegen ein Pax9-Protein, Analoga, Teile, Konjugate, Oligomere und/oder Mischungen hiervon gerichtet sind. Diese Antikörper können in den erfindungsgemäß bereitge¬ stellten Verfahren und in den beanspruchten Verwendungen einge¬ setzt werden.
Die erfindungsgemäß bereitgestellten therapeutischen oder diagnostischen Mittel werden zur Diagnostik oder Therapie von Dysplasien, Metaplasien und Tumoren von Epithelzellen, bevorzugt des mehrschichtigen Plattenepithels sowie von Knorpelzellen, eingesetzt. Die Diagnostik und Therapie von Veränderungen des Oesophagus, der Haut, beispielsweise Psoriasis, der Mundschleim- haut, der Zunge, der Cornea, Vagina, der Cervix, des Endometri- ums, des Anus, der Talgdrüsen der Haut und des Knorpels stellen bevorzugte Einsatzgebiete dar. Insbesondere die Früherkennung von Dysplasien epithelialer Zellen ist ein mögliches Einsatzgebiet der vorliegenden Erfindung.
Die Diagnostik, insbesondere die Früherkennung, und die Therapie bei Metaplasien ist ein wichtiger Anwendungsbereich der vor¬ liegenden Erfindung. Eine Metaplasie, also im vorliegenden Fall die Umwandlung eines Epithels in ein mehrschichtiges Plattenepi¬ thel, kann im Körper theorethisch überall dort auftreten, wo "Nicht-Plattenepithelien" vorhanden sind. Es ist beispielsweise bekannt, daß das einschichtige Epithel der Luftröhren bei Rauchern häufig in ein mehrschichtiges Plattenepithel umgewandelt wird. Ein weiteres wichtiges Beispiel ist die Umwandlung des Endometriumepithels (normalerweise einschichtig) in ein mehr¬ schichtiges Plattenepithel. An diesen Stellen besteht eindeutig ein erhöhtes Risiko, ein Plattenepithelkarzinom zu entwickeln. Diese mehrschichtigen Plattenepithelien sind durch das erfin¬ dungsgemäß bereitgestellte Mittel, das mindestens einen Wirkstoff mit mindestens einer Nukleinsäure enthält, die mit einem Pax9-Gen oder einem Derivat hiervon hybridisiert, diagnostizierbar oder therapierbar.
Weiter unten wird näher ausgeführt, daß erfindungsgemäß gezeigt werden konnte, daß das Pax9-Protein in Dysplasien epithelialer Zellen in größeren Mengen als in Normalzellen im Zytoplasma lokalisiert ist. Erfindungsgemäß können deshalb rekombinante Vektoren mit einer für ein Pax9-Protein, einem Analogon, Teilen, Konjugaten, Oligomeren und Mischungen hiervon kodierenden Sequenz, die in einer bevorzugten Ausführungsform in funktionel¬ ler Verbindung mit einer oder mehreren SignalSequenzen zum gerichteten Transport des Pax9-Proteins in den Zellkern steht, verwendet werden. Dieser Vektor kann beispielsweise von einem Plasmid oder von einem viralen Vektor abgeleitet sein. Übliche, auf dem Gebiet der Gentherapie bekannte oder noch zu entwickelnde Vektoren sind erfindungsgemäß einsetzbar. Bevorzugt handelt es sich hierbei um einen Expressionsvektor, der sowohl in Pro- als auch in Eukaryontenzellen exprimierbar sein kann.
Von der vorliegenden Erfindung mit umfaßt werden auch Eukaryon¬ tenzellen und Prokaryontenzellen, die mit einem Vektor trans¬ formiert sind, der das erfindungsgemäße Pax9-Gen enthält.
Die erfindungsgemäß bereitgestellten Vektoren mit dem Pax9-Gen sind zur somatischen Gentherapie beim Menschen einsetzbar. Beispielsweise können sie zur terminalen Differenzierung von Tumorzellen und Tumorvorläuferzellen eingesetzt werden.
Von der Erfindung werden mit umfaßt Analysekits zur Analyse von Pax9-Expression in Knorpelzellen und Epithelzellen, insbesondere des Plattenepi-thels, auf Dysplasien, Metaplasien und Tumoren.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand der beiliegenden Abbildun¬ gen näher erläutert. Die Abbildungen zeigen:
Abb. IA die Aminosäuresequenz des humanen Pax9-Proteins mit 341 Aminosäuren.
Abb. IB einen Vergleich der Aminosäuresequenz des Pax9-Gens des Menschen (HUPax9) und der Maus (MPax9).
Abb. 2 eine Northern-Blot-Analyse.
Abb. 3 den Nachweis des Pax9-Proteins in Protein-Extrakten aus dem Oesophagus der Maus und des Menschen (Western-Blot-Analyse).
Abb. 4 die Lokalisation des Pax9-Proteins im gesunden Oesophagus- Epithel der Maus (A-D) und der Menschen (E-H).
Abb. 5, 6 und 7 die Lokalisation des Pax9-Proteins in patholo¬ gisch veränderten, mehrschichtigen Plattenepithelien und in Plattenepithelkarzinomen des Menschen.
Abb. 8 die Lokalisation des Pax9-Proteins in differenzierenden Knorpelzellen im wachsenden Röhrenknochen eines 16,5 Tage alten Mausembryos.
Die Länge der in den Abbildungen gezeigten Längenstandards beträgt jeweils 100 μm.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es ist davon auszugehen, daß die Erfindung nicht auf die genannten speziellen Ausführungsbeispiele beschränkt ist, sondern daß der Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie in bekannter Weise auch weitere Ausführungsformen entwickeln kann.
Das Pax9-Gen
Die Existenz des Pax9-Genes ist in den Genomen der Maus (Wallin et al., 1993), des Menschen (Stapleton et al., 1993) und des Huhnes (Peters et al., 1995) nachgewiesen. Die Aminosäuresequenz der DNA-bindenden "paired"-Domäne ist in diesen Organismen identisch. Die Aminosäuresequenzen der Pax9-Proteine des Menschen (kombiniert aus Stapleton et al., 1994 und Peters et al., unveröffentlicht) und der Maus (Neubüser et al., 1995) sind in Abb.l dargestellt. Die "paired"-Domäne und ein weiteres kon¬ serviertes Sequenzmotiv aus 8 Aminosäuren, das Oktapeptid, sind in dieser Abbildung eingerahmt.
Neben anderen Expressionsdomänen wird Pax9 während der Embryonal- entwicklung der Maus und des Huhnes im Epithel des undifferen- zierten Pharynx exprimiert (Neubüser et al., 1995, Peters et al., 1995). Das Epithel des Pharynx ist im weiteren Verlauf der Embryonalentwicklung (u.a. ) an der Organogenese des Oesophagus beteiligt. Dabei wird das zunächst einschichtige Epithel zum mehrschichtigen Plattenepithel umgewandelt, das den gesamten Oesophagus im adulten Organismus auskleidet. Es ist bekannt, daß Pax9 im mehrschichtigen Plattenepithel des Oesophagus des Huhnes (Peters et al., 1995), der Maus und des Menschen (Peters et al., unveröffentlicht) exprimiert wird. Mehrschichtige Plattenepi¬ thelien kommen im menschlichen Organismus außerdem in der Haut, der Mundschleimhaut, der Zunge, der Cornea, der Vagina und im Anus vor. Die Talgdrüsen der Haut zeigen einen ähnlichen Aufbau aus epithelialen Zellen. Mit Ausnahme der Cornea konnte erfin¬ dungsgemäß in der adulten Maus in allen oben genannten Organen die Expression von Pax9 nachgewiesen werden. In der späten Phase der embryonalen Entwicklung der Maus wird Pax9 auch in einer spezifischen Phase der Knorpeldifferenzierung exprimiert (Peters und Balling, unveröffentlicht). Die Pax9 exprimierenden Zellen markieren dabei die Übergangsphase zwischen dem proliferierenden Säulenknorpel und der Schicht des differenzierenden Blasen¬ knorpels, der im weiteren Verlauf der Entwicklung enchondral ossifiziert. In Analogie zur Expression in mehrschichtigen Plattenepithelien exprimieren auch in Knorpelzellen nicht die proliferierenden, sondern die sich differenzierenden Zellen Pax9. Die vorliegende Erfindung, die sich aus den nachfolgend be¬ schriebenen Experimenten ergab, ist somit auf diese Organe übertragbar.
Ergebnisse
Basis für die vorliegende Erfindung ist die Analyse der Gen- und Proteinexpression von Pax9 im mehrschichtigen Plattenepithel, insbesondere des gesunden Oesophagusepithels des Menschen und der Maus, sowie in Knorpelzellen des wachsenden Röhrenknochens während der embryonalen Entwicklung der Maus.
1. Genexpression von Pax9
Vom menschlichen Pax9-Gen ist bislang die Nukleotidsequenz des "paired"-Box enthaltenden Exons bekannt (Stapleton et al., 1993). Im Rahmen dieser Studie wurde aus Gesamt-RNA des Oesophagus die kodierende Pax9-cDNA des Menschen isoliert. Die Isolierung von Gesamt-RNA wurde mit Hilfe des "RNeasy Total RNA"-Kits (Qiagen, Hilden) durchgeführt. Hierfür wurde frisches Sektionsmaterial aus dem Institut für Pathologie des Klinikums Rechts der Isar, München, zur Verfügung gestellt, lμg der Gesamt-RNA wurde für eine reverse Transkription eingesetzt. Als Startpunkt für die Reverse Transkriptase (Superscript von Gibco-BRL, Karlsruhe) diente das synthetische DNA-Oligonukleotid 51- CCCAAGCTTTGGACGCTCCCATCAGAGTGC-3' (Restriktionsschnittstelle für Hindlll ist unterstrichen). Diese Sequenz wurde von der Pax9-cDNA der Maus (Neubüser et al., 1995) abgeleitet und überspannt das Stop-Codon und die letzten beiden carboxyterminalen Aminosäuren des murinen Pax9-Proteins. Die Amplifizierung der menschlichen Pax9-cDNA wurde anschließend mit Hilfe der Polymerase-Kettenreak- tion (PCR) durchgeführt. Neben dem oben angeführten DNA-Oligonu¬ kleotid wurde außerdem das Oligonukleotid 5' -CCCAAGCTTAGCCAGCCTTC GGGGAGGTG-3' verwendet, das aus dem 5' -Bereich der "paired"-Box des menschlichen Pax9-Gens (Stapleton et al., 1993) abgeleitet wurde. Folgende Bedingungen wurden für 25 Amplifizierungszyklen eingehalten: 1 min Denaturierung bei 94°C; 1 min Hybridisierung der Oligonukleotide bei 60°C; 1 min DNA-Polymerisierung bei 72°C. Das erhaltene DNA-Fragment wurde mit HindiII gespalten und in die Restriktionschnittstelle Hindlll des Plasmids pKS (Stratagene, Heidelberg) kloniert. Die Sequenzierung erfolgte mit Hilfe des Sequenase-Kits nach der Anleitung des Herstellers (USB, Cleve- land, USA). Die Sequenz der abgeleiteten Aminosäuren und der Vergleich mit dem Pax9-Protein der Maus sind in Abb.lA bzw. IB dargestellt.
Der kodierende Bereich der Pax9-cDNAs der Maus (Neubüser et al., 1995) und des Menschen (Peters et al., unveröffentlicht) wurde jeweils radioaktiv markiert (Feinberg 6 Vogelstein, 1984) und gegen membrangebundene Gesamt-RNA des Oesophagus hybridisiert (Northern-Blot-Analyse) . Die Membranen (HybondN, Amersham, Braunschweig) wurden nach der Hybridisierung unter hoch-stringen¬ ten Bedingungen (0,1 X SSC, 0,1% SDS, 68°C), die eine Kreuzhybri- disierung mit anderen Pax-Genen ausschließen, gewaschen. In Abb.2 sind die Ergebnisse der Northern-Blot-Analyse dargestellt. Die Abb. 2A zeigt, daß Pax9 im Oesophagus der Maus exprimiert wird, dagegen keine Transkripte im Drüsenmagen, Dünndarm und Dickdarm nachweisbar sind. Pax9-Transkripte sind auch im Oesophagus des Menschen nachweisbar (Abb. 2B). Ein Vergleich mit den internen Längenstandards der ribosomalen 28S-RNA (6333 Basen) bzw. 18S-RNA (2366 Basen) ergab, daß die Transkriptlängen des menschlichen Pax9-Gens ca. 5,3 Kilobasen (obere Bande), 3,5 Kilobasen (mitt¬ lere Bande) und 2,1 Kilobasen (untere Bande) betragen.
2. Nachweis der Pax9-Proteine
Es wurde geprüft, ob die Pax9-Transkripte translatiert werden und als Pax9-Proteine in Proteinextrakten des Oesophagus nachzuweisen sind. Zu diesem Zweck wurden polyklonale Antikörper, die gegen das Pax9-Protein gerichtet sind, in Kaninchen erzeugt. Dazu wurde die cDNA-Sequenz, die für die Aminosäuren 252-342 des Pax9- Proteins der Maus (Neubüser et al., 1995) kodiert, in den Vektor pMAL™-c2 (New England Biolabs) kloniert. Das resultierende Plasmid, pMALP9, kodiert für ein Fusionsprotein, bestehend aus einem 42.7 kd großen, Maltose-bindenden Protein aus Escherichia coli (Guan et al., 1987) und dem carboxyterminalen Bereich des Pax9-Proteins. Die Expression und die Reinigung des Fusions¬ proteins wurden nach den Angaben des Herstellers (New England Biolabs) durchgeführt. Zwei Kaninchen wurden subcutan mit je 400μg des Fusionsproteins in Freund'schem Adjuvans immunisiert. In Intervallen von vier Wochen wurde jeweils mit lOOμg des Fusionsproteins erneut immunisiert. Für alle Untersuchungen wurde das nach der dritten bzw. vierten Immunisierung gewonnene Immunserum eines Kaninchens, bezeichnet als 281-IV, benutzt. Ein zweites Immunserum, bezeichnet als 105-IV, das die "paired"- Domäne des Pax9-Proteins erkennt (Peters et al., 1995), wurde zur Bestätigung der Spezifität des Immunserums 281-IV benutzt. Zum Nachweis des Pax9-Proteins wurden Proteinextrakte aus dem Oesophagus des Menschen bzw. der Maus nach bekannten Protokollen hergestellt (Peters et al., 1995), je 50μg eines Proteinextraktes auf 12%igen Polyacrylamid-Gelen (Laemmli, 1970) aufgetrennt und anschließend durch halbtrockenen elektrischen Transfer auf Fluorotrans-Membranen (Pall, Dreieich) übertragen. Zur Abschät¬ zung von Proteingrößen wurde zusätzlich ein Protein-Größenmarker (Sigma, München) aufgetragen. Die Membranen wurden über Nacht in phosphatgepufferter Salzlösung (=PBS), die 3% Rinderserum- Albumin, 5% normales Schafserum und 5% Magermilchpulver enthielt, blockiert. Anschließend wurde das Immunserum in einer Verdünnung von 1:200 hinzugegeben und für eine Stunde bei 21°C inkubiert. Nachfolgend wurde die Membran in 0,1% Tween20 in PBS für 20 min gewaschen und danach in einer Verdünnung von 1:2000 mit einem Konjugat aus Anti-Kaninchen-IgG und alkalischer Phosphatase (Boehringer, Mannheim) inkubiert. Der Nachweis der Proteinbanden erfolgte mit den Farbsubstraten 4-Nitroblau-Tetrazolium-HCl (NBT) und 5-Brom-4-chloro-3-indolylphosphat (X-Phosphat) nach den Angaben des Herstellers (Boehringer, Mannheim). Abb. 3 zeigt das Ergebnis dieser Western-Blot-Analyse.
Das Immunserum 281-IV detektiert im Proteinextrakt vom Oesophagus der Maus ein Protein mit einem geschätzten Molekulargewicht von ca. 39 kd (Abb.3, Spur 1). Diese Größe entspricht dem von der Aminosäure-Sequenz abzuleitenden Molekulargewicht des Pax9- Proteins (39 kd, vergl. Abb.l). Dieses Ergebnis wird durch die Verwendung des zweiten Immunserums (105-IV), das die paired- Domäne von Pax9 erkennt und eine Bande auf der gleichen Höhe nachweist, abgesichert (Abb. 3, Spur 2). Das Immunserum 105-IV kreuzreagiert mit dem menschlichen Pax9-Protein und detektiert im Proteinextrakt aus dem Oesophagus des Menschen ebenfalls ein Protein mit einem Molekulargewicht von ca. 39 kd (Abb.3, Spur 3). Die Spuren 4 (Proteinextrakt aus dem Oesophagus der Maus) und 5 (Proteinextrakt aus dem Oesophagus des Menschen) in Abb.3 zeigen das Ergebnis der Kontroll-Inkubation mit normalem Kaninchenserum und belegen die Spezifität der Immunseren 281-IV und 105-IV. 3. Lokalisation des Pax9-Proteins im gesunden Oesophagusepithel der Maus und des Menschen
Mit Hilfe immunhistochemischer Verfahren wurde die subzelluläre Lokalisation der Pax9-Proteine im gesunden Oesophagusepithel der Maus, des Menschen und im Knorpel des Mausembryos ermittelt. Für diese Experimente wurden die gleichen polyklonalen Antikörper verwendet wie in Punkt 2. beschrieben. 5-7μm dicke Paraffin- Schnitte aus Formalin-fixiertem Gewebe wurden zweimal für 10 min in Xylol, 5 min in Isopropanol, je 2 min in 100%/96%/90%/70% und 50% Ethanol entparaffinisiert und anschließend für 5 min in PBS äquilibriert. Bei Inkubationen mit dem Antikörper 105-IV wurden die Schnitte für 10 min in lOmM Zitronensäure (pH 6,0) und Kochen in der Mikrowelle vorbehandelt. Anschließend wurden die Schnitte für 90 min bei 37°C in den Antikörper-Verdünnungen des Immunse¬ rums 281-IV oder des Pre-Immunserums (1:200 in PBS, 3% BSA) bzw. 105-IV (1:200 in PBS, 3% BSA, 15% normales Schafserum) inkubiert. ( 1 ) Schnitte aus Geweben der Maus wurden wie folgt weiterbehan¬ delt: Nach 5 min Waschen in PBS wurde mit einem Konjugat (1:200 in PBS, 3% BSA verdünnt) aus Anti-Kaninchen-igG und alkalischer Phosphatase (Boehringer, Mannheim) inkubiert. Die Farbreaktion erfolgte nach den Angaben des Herstellers (Boehringer, Mannheim) mit den Substraten 4-Nitroblau-Tetrazolium-HCl (NBT) und 5-Brom- 4-Chloro-3-Indolylphosphat (X-Phosphat), die ein blau-violettes Präzipitat bilden. Endogene alkalische Phosphataseaktivität wurde durch Zugabe von Levamisol (Sigma, München; Endkonzentration 5 mM) in der Färbelösung blockiert. (2) Schnitte aus menschlichem Gewebe wurden wie folgt weiterbehandelt: Nach 5 min Waschen in PBS wurden die Schnitte mit Maus-Anti-Kaninchen-lgG (Dianova, Hamburg), 1:200 verdünnt in PBS (mit 20% humanem Serum), für 30 min bei 21°C inkubiert. Nach erneutem Waschen in PBS wurden die Schnitte mit Kaninchen-Anti-Maus-IgG (Dakopatts, Dänemark), 1:50 verdünnt in PBS (mit 20% humanem Serum), für 30 min bei 21°C inkubiert. Es wurde erneut in PBS gewaschen und anschließend mit einem APAAP-Komplex (Dakopatts, Dänemark), 1:50 verdünnt in PBS, für 30 min bei 21°C inkubiert. Die Farbreaktion erfolgte mit den Substraten Naphtol-AS-MX-Phosphat (Sigma, München) und Fast Red (Serva, Heidelberg), die ein rotes Präzipitat bilden. Endogene alkalische Phosphataseaktivität wurde durch Zugabe von Levamisol (5 mM) in der Färbelösung blockiert. Schnitte von menschlichen Gewebeproben wurden nach der immunhistochemischen Färbung für 10 sek mit Hämalaun gefärbt, wodurch die Zellkerne schwach bläulich dargestellt werden.
Für die Mikroskopie wurden die Schnitte in Glycerin-Gelatine (Merck, Darmstadt) eingedeckelt. Die Dokumentation erfolgte auf Kodak-Ektachrome-Diafilmen unterVerwendung eines Leitz-Axioplan- Mikroskopes und Normarski-Optik. Zur Darstellung der Histologie wurden Schnitte analoger Bereiche wie oben entparaffinisiert und mit Hämatoxylin/Eosin gefärbt.
Das mehrschichtige Plattenepithel des menschlichen Oesophagus (Abb. 4 E) besteht aus einer mitotisch aktiven, basalen Zell¬ schicht (Bz), die die Stammzellen enthalten, und den aus dieser Schicht hervorgehenden suprabasalen Zellschichten (Sz), deren spezifische Differenzierungen das mehrschichtige, unverhornte Plattenepithel aufbauen. Bei der Maus ist der Aufbau des Platten¬ epithels ähnlich, es ist jedoch - im Gegensatz zu dem des Menschen - verhornt (Abb. 4 A) .
Eine eingehende Studie zur Genexpression von Pax9 wurde zunächst im Tiermodell für das Plattenepithel des Oesophagus der Maus durchgeführt. Es wurden adulte Mäuse des Stammes CD1 verwendet, die im institutsinternen Tierstall der GSF gezüchtet werden. Das Ergebnis dieser Untersuchung besteht darin, daß Pax9 in den suprabasalen Zellschichten, nicht jedoch in der mitotisch aktiven Basalschicht, exprimiert wird. Die Abb.4B (Inkubation mit 281-IV) und 4C (Inkubation mit 105-IV) zeigen exemplarisch das Ergebnis immunhistochemischer Experimente. Beide Immunseren weisen das Pax9-Protein in den Zellen der suprabasalen Zellschichten, in denen die Epithelzellen differenzieren, nach. In Übereinstimmung mit den Eigenschaften als Transkriptionsfaktor ist das Pax9- Protein in den Zellkernen lokalisiert. Das Ergebnis der Kon¬ trollinkubation mit normalem Kaninchenserum (Abb. 4D) zeigt unspezifische Hintergrundfärbung vor allem in der Keratinschicht (K). Aus diesem Befund ist zu folgern, da Pax9 im gesunden Organismus an der Differenzierung, nicht jedoch unmittelbar an der Proliferation des Oesophagusepithels, die in der basalen Zellschicht stattfindet, beteiligt sein kann. Es ist allerdings bekannt, daß die mitotische Aktivität der Stammzellen einer circadianen Rhythmik folgt und bei Mäusen in der Nacht am höchsten ist (Scheving et al., 1979). Es wurde daher untersucht, ob eine von der Tageszeit abhängige Expression von Pax9 in den mitotisch aktiven Zellen der Basalschicht nachzuweisen ist. Dazu wurden adulte Mäuse unter konstanten Licht-Bedingungen ( 12h Licht/12h Dunkelheit) gehalten. Über 24h wurde in dreistündigen Abständen der Oesophagus von jeweils drei Mäusen präpariert, fixiert und nach der oben beschriebenen Methode immunhistoche- misch untersucht. In keiner der insgesamt 24 unabhängigen Gewebe¬ proben konnte Pax9-Protein in der basalen Zellschicht nach¬ gewiesen werden (ohne Abbildung). Das Expressionsmuster ent¬ spricht in allen Fällen dem, das in Abbildung 4B bzw. 4C gezeigt ist.
Für die immunhistochemischen Untersuchungen am Oesophagusepithel des Menschen wurden Paraffinschnitte aus der Sammlung des Instituts für Pathologie (Klinikum Rechts der Isar, München) angefertigt. Die Tabelle 1 gibt eine Übersicht über die ver¬ wendeten Gewebeproben mit der zugehörigen histopathologischen Diagnose.
Im gesunden menschlichen Oesophagusepithel ist das Pax9-Protein ebenfalls in den Zellkernen der suprabasalen Zellschichten lokalisiert (Abb. 4F und 4G). Die Kontrollinkubation mit normalem Kaninchenserum zeigt keine spezifische Färbung (Abb. 4H) .
Im gesundem Oesophagusepithel ist das Pax9-Protein in den Zellkernen der suprabasalen Schichten lokalisiert. Diese Lokali- sation korreliert mit der terminalen Differenzierung dieser Zellen.
4. Lokalisation des Pax9-Proteins in pathologisch veränderten mehrschichtigen Plattenepithelien und in Plattenepithelkar- zinomen des Menschen
Leukoplakien, die sich durch weißliche, herdartige Verdickungen des Schleimhautepithels auszeichnen, gelten als präkanzerogen. Die Polarität und die Differenzierung des Epithels ist jedoch weitgehend erhalten (Abb. 5A) und mit der des normalen Oesopha- gusepithels vergleichbar (vergl. Abb. 4E). In Abbildung 5B ist die Lokalisation des Pax9-Proteins einer Leukoplakie gezeigt. Wie im gesunden Oesophagusepithel ist das Pax9-Protein in den Zellkernen der suprabasalen Schichten lokalisiert. In Abbildung 5C ist die Proteinverteilung von Pax9 aus einem anderen Bereich der gleichen Gewebeprobe dargestellt. Obwohl auch hier die Lokalisation in den Zellkernen dominiert, ist zusätzlich im Cytoplasma eine deutliche Rotfärbung erkennbar. Dagegen ist in Dysplasien des Schleimhautepithels die Verteilung der Pax9- Proteine in der Zelle drastisch verändert. Überraschenderweise ist das Pax9-Protein bereits in leichten Dysplasien des Schleim¬ hautepithels (Abb. 5D) nicht in den Zellkernen der suprabasalen Schichten nachweisbar (Abb. 5E). In dieser Gewebeprobe wie auch in dem Beispiel einer schweren Dysplasie (Abb. 5F) ist das Pax9- Protein überwiegend im Cytoplasma lokalisiert (Abb. 5G). In den Abbildungen 5H und 6A ist jeweils die histologische Färbung eines Karzinoma in situ gezeigt. Diese Tumoren entwickeln sich in- traepithelial und zeigen kein invasives Wachstum in das darunter¬ liegende Mesenchym. Die Entartung des Epithels korreliert hier - wie auch in den gezeigten Dysplasien - mit der fehlenden Lokali¬ sation von Pax9-Protein in den Zellkernen (Abb. 51).
In dieser Studie wurden auch verschiedene, invasiv wachsende Plattenepithelkarzinome des Typs G2 (Abb. 6C,E,G) und G3 (Abb. 7A,C,E) untersucht. Das Pax9-Protein ist in allen untersuchten Fällen vorwiegend im Cytoplasma lokalisiert. Die Ergebnisse sind exemplarisch von Plattenepithelkarzinomen des Typs G2 (Abb. 6D,F,H) bzw. des Typs G3 (Abb. 7B,D,F) gezeigt.
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues diagnostisches oder therapeutisches Mittel bereit, das als Wirksubstanz mindestens eine Nukleinsäure des Pax9-Gens enthält und insbesondere zur Früherkennung von Dysplasien und Metaplasien des mehrschichtigen Plattenepithels sowie zur Tumordiagnostik und Tumortherapie von Plattenepithelkarzinomen geeignet ist. Dabei ist von besonderer Bedeutung, daß Veränderungen der Pax9-Expression bereits präkan¬ zerogene Läsionen anzeigen können, die sich erst im weiteren Krankheitsverlauf als Tumore manifestieren.
5. Lokalisation des Pax9-Proteins in Knorpelzellen während der enchondralen Ossifikation
Die weitaus größten Anteile des Skeletts werden während der Embryonalentwicklung als knorpelige Anlagen präformiert. Diese Anlagen verknöchern durch enchondrale Ossifikation, einem kon¬ tinuierlich verlaufenden Prozess, bei dem Knorpel abgebaut und durch Knochensubstanz ersetzt wird. Gleichzeitig muß ein rasches Wachstum des embryonalen Knochens gewährleistet sein. In den Röhrenknochen findet das Wachstum im Perichondrium und an den beiden Enden des Knochens, den Epiphysen, statt. Dabei werden in den Epiphysen sich teilende Chondrocyten zum Säulenknorpel angeordnet (Abb. 8A). In dieser Phase werden essentielle, spezifische Moleküle der extrazellulären Matrix wie z.B. Collagen II, Collagen IX, und Aggrecan exprimiert (Argraves et al., 1981, Bogaert et al., 1992, Nakata et al.,1993, ). An die Phase der Zellteilung schließt sich die Reifung der Chondrocyten an, die im weiteren Verlauf der Differenzierung hypertroph werden und den Blasenknorpel bilden. Während der Reifung wird CMP (cartilage matrix protein), ein weiteres, spezifisches Moleküle der extra¬ zellulären Matrix exprimiert (Chen et al., 1995). Veränderungen der Chondrocytendifferenzierung sind bei verschiedenen Krank- heitsbildern bekannt (Überblick in Rimoin, 1975). Exemplarisch sei hier die Osteoarthritis in Gelenken angeführt. Die Gelenke von artikulierenden Knochen werden von einer hyalinen Knorpel- schicht überdeckt. Bei der Osteoarthritis werden in in dieser Schicht Differenzierungsvorgänge eingeleitet, die im Normallfall nicht auftreten. Im hyalinen Gelenkknorpel können sekundäre Zellteilungen und nachfolgende Hypertrophie der Chondrocyten festgestellt werden (Hoyland et al., 1991, van der Mark et al., 1992).
Transkriptionsfaktoren, die spezifisch in der Phase der Chon- drocytenreifung exprimiert werden, sind bislang nicht bekannt. Überraschenderweise konnten wir Pax9, einen Transkriptionsfaktor, in dieser Zone nachweisen. Die in dieser Studie durchgeführten immunhistochemischen Experimente am Humerus eines 16,5 Tage alten Mausembryos haben gezeigt, daß Pax9 exakt die Zone der Reifung, die sich zwischen den Phasen der Zellteilung und Hypertrophie befindet, auf molekularer Ebene markiert (Abb. 8B). Ein ver¬ gleichbares Expressionsmuster wurde auch in anderen skelettalen Elementen (Schulterblatt, Wirbelkörper, Finger) beobachtet. Das Pax9-Protein ist - in Analogie zu den Befunden im gesunden Oesophagusepithel - in den Zellkernen lokalisiert. Darüberhinaus besteht offensichtlich eine weitere Korrelation der Pax9-Expres- sion im reifenden Knorpel einerseits und der Pax9-Expression in mehrschichtigen Plattenepithelien andererseits: In beiden Geweben exprimieren nicht die sich teilenden Zellen, sondern die sich differenzierenden Zellen Pax9. Die Kernlokalisation von Pax9 ist neben den mehrschichtigen Plattenepithelien daher auch als ein Marker für Knorpelzellen, die sich in der terminalen Differenzie¬ rung befinden, geeignet. Zusammenfassend werden nachfolgende bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beschrieben:
Ein Protein mit der Aktivität von menschlichem Pax9 mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID No: 1, Analoga, Teile, Konjugate, Oligomere und Mischungen hiervon, ausgenommen ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz 1 - 208 alleine oder Teile hiervon.
Ein Polypeptid mit der Sequenz der Aminosäuren Nr. 209-337 gemäß SEQ ID No: 1, aus dem humanen Pax9-Gen oder einer Teilsequenz hiervon mit einer dem humanen Pax9-TeiIgen mit den Aminosäuren Nr. 209 - 337 gemäß SEQ ID No: 1 entsprechenden Funktion.
Ein Polypeptid mit der Sequenz der Aminosäuren Nr. 249-337 gemäß SEQ ID No. 1, aus dem humanen Pax9-Gen.
DNA, die für ein oben beschriebenes Polypeptid kodiert, wobei die DNA wahlweise modifiziert sein kann.
RNA, die von dieser DNA abgeleitet ist, wobei die RNA wahlweise modifiziert sein kann.
DNA, die unter stringenten Bedingungen zu dieser DNA hybridisiert und ein davon abgeleitetes Peptid.
Monoklonale oder polyklonale Antikörper, die gegen ein Epitop der oben beschriebenen Polypeptide gerichtet sind.
Ein rekombinanter Vektor mit einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz, wahlweise in funktioneller Verbindung mit einer oder mehreren Signalsequenzen zum gerichteten Transport des Polypeptids in den Zellkern.
Bevorzugt ist der Vektor ein Plasmid oder ein viraler Vektor, weiterhin bevorzugt ein Expressionsvektor, bevorzugt in Eukaryontenzellen exprimierbar. Die Verwendung einer Nukleinsäure mit (a) einer für die Sequenz der Aminosäuren Nr. 130-337 gemäß SEQ ID No. : 1, kodierenden Nu¬ kleinsäuresequenz oder eines Teils hiervon, (b) einer mit einer Nukleinsäuresequenz aus (a) unter stringenten Bedingungen hybridisierenden Nukleinsäuresequenz oder (c) einer zu einer Nukleinsäure aus (a) und/oder (b) komplementären Nukleinsäurese¬ quenz oder eines Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz Nr. 130- 337 gemäß SEQ ID No. : 1 oder eines Teils hiervon oder eines polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers gegen diese Sequenz zur Diagnostik oder Therapie von Dysplasien, Metaplasien und Tu¬ moren von Epithelzellen und Knorpelzellen.
Bevorzugt umfaßt die Sequenz die Aminosäuren Nr. 209-337 oder 249-337 oder 130 - 193 oder 202 - 337 oder eines Teils hiervon mit der entsprechenden Funktion gemäß SEQ ID No. : 1.
Die Verwendung dient zur Diagnostik und Therapie von Veränderun¬ gen der Epithelzellen des Oesophagus, der Haut, Mundschleimhaut, Zunge, Cornea, Vagina, der Cervix, des Endometriums, des Anus und der Talgdrüsen der Haut sowie des Knorpels, beispielsweise zur Diagnostik und Therapie von Dysplasien des mehrschichtigen Plattenepithels.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann als Antisense-Nukleinsäure zur Hemmung der Genexpression eingesetzt werden.
Der erfindungsgemäße Vektor kann zur somatischen Genterapie eingesetzt werden.
Ein Verfahren zum Nachweis von Tumoren, Metaplasien und Dys¬ plasien von Epithel- und Knorpelzellen in vitro, wobei eine Nukleinsäure mit (a) einer für die Sequenz der Aminosäuren Nr. 130-337 gemäß SEQ ID No. : 1, kodierenden Nukleinsäuresequenz oder ein Teil hiervon, (b) einer mit einer Nukleinsäuresequenz aus (a) unter stringenten Bedingungen hybridisierenden Nukleinsäurese¬ quenz oder (c) einer zu einer Nukleinsäure aus (a) und/oder (b) komplementären Nukleinsäuresequenz oder ein gegen ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz 130-337 nach SEQ ID No. : 1 gerichteter polyklonaler oder monoklonaler Antikörper in Kontakt mit einer die zu analysierenden Epithelzellen oder Knorpelzellen enthalten¬ den Gewebeprobe gebracht wird, um die Menge und/oder die Lokalisation der Expression von humanem Pax9-Protein zu analysie¬ ren.
Bevorzugt umfaßt die Sequenz die Aminosäuren Nr. 209 - 337 oder 249 - 337 oder 130 - 193 oder 202 - 337 gemäß SEQ ID No.:l.
Der erfindungsgemäße Vektor kann zur terminalen Differenzierung von Tumorzellen oder Tumorvorläuferzellen eingesetzt werden.
Das erfindungsgemäße Polypeptid oder die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann in einem Analysekit zur Analyse der Pax9- Expression in Epithelzellen und Knorpelzellen auf Dysplasien, Metaplasien und Tumoren eingesetzt werden.
Eine Eukaryonten- oder Prokaryontenzelle, transformiert mit einem erfindungsgemäßen Vektor.
Ein diagnostisches oder therapeutisches Mittel, mindestens enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ein Polypep¬ tid.
Ein diagnostisches Mittel, das als ein Analysekit zur Analyse der Pax9-Expression in Epithelzellen und Knorpelzellen auf Dys¬ plasien, Metaplasien und Tumoren ausgestaltet ist.
cDNA zur erfindungsgemäß bereitgestellten RNA.
Verwendung der erfindungsgemäß bereitgestellten Sequenzen als Marker für Knorpelzellen oder zur Lokalisierung und Quantifizie¬ rung der Expression von Pax9 in einer Eurkaryontenzelle. Ein monoklonaler Antikörper, der gegen ein Epitop eines Poly- peptids mit den Aminosäuren 130 - 193, 202 - 337, 202 - 248 oder 249 - 337 (nach SEQ ID No: 1) gerichtet ist.
Die obengenannten Nukleinsäuresequenzen (DNA- oder RNA-Sequen- zen), Aminosäuresequenzen und die monoklonalen und polyklonalen Antikörper, die hiergegen gerichtet sind, stammen aus den nicht- konservierten Bereichen des Pax9-Gens, d.h. aus denjenigen Bereichen, die in der beiliegenden Abbildung IB außerhalb der eingegrenzten Bereiche liegen, bevorzugt aus den Bereichen mit den Aminosäuren 130 - 193, 202 - 337, 202 - 248 und 249 - 337 sowie solchen Teilbereichen dieser Sequenzen, die für die erfindungsgemäß bereitgestellte Verwendung und das erfindungs¬ gemäße Verfahren einsetzbar sind.
Der Fachmann auf dem Gebiet der Gentechnologie wird anhand der vorliegenden Beschreibung und den Ausführungsbeispielen ohne erfinderisches Zutun in die Lage versetzt, die Erfindung im gesamten beschriebenen und beanspruchten Umfang auszuführen.
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SEQUENZPROTOKOLL
( 1 ) ALLGEMEINE ANGABEN :
( i ) ANMELDER .
(A) NAME: GSF Forschungsinstitut fuer Utnwelt und
Gesundheit GmbH
(B) STRASSE: Ingolstaedter Landstr. 1
(C) ORT: Oberschleissheim
(E) LAND: Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: 85764
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Neue Sonde zur Frueherkennung von epithelialen Dysplasien des mehrschichtigen Plattenepithels sowie zur Tumordiagnostik und Tumortherapie von Plattenepithelkarzinomen
(in) ANZAHL DER SEQUENZEN: 4
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPA)
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(l) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1013 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE. ringförmig
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA zu mRNA
(m) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE NEIN
(v) ART DES FRAGMENTS: C-Termmus
(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Homo sapiens
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE:3..1013
(xi) SEQUENZBΞSCHREIBUNG SEQ ID NO. 1. AG CCA GCC TTC GGG GAG GTG AAC CAG CTG GGA GGA GTG TTC GTG AAC 47
Pro Ala Phe Gly Glu Val Asn Gin Leu Gly Gly Val Phe Val Asn 1 5 10 15
GGG AGG CCG CTG CCC AAC GCC ATC CGG CTT CGC ATC GTG GAA CTG GCC 95 Gly Arg Pro Leu Pro Asn Ala Ile Arg Leu Arg Ile Val Glu Leu Ala 20 25 30
CAA CTG GGC ATC CGA CCG TGT GAC ATC AGC CGC CAG CTA CGG GTC TCG 143 Gin Leu Gly Ile Arg Pro Cys Asp Ile Ser Arg Gin Leu Arg Val Ser 35 40 45
CAC GGC TGC GTC AGC AAG ATC CTG GCG CGA TAC AAC GAG ACG GGC TCG 191 His Gly Cys Val Ser Lys Ile Leu Ala Arg Tyr Asn Glu Thr Gly Ser 50 55 60
ATC TTG CCA GGA GCC ATC GGG GGC AGC AAG CCC CGG GTC ACT ACC CCC 239 Ile Leu Pro Gly Ala Ile Gly Gly Ser Lys Pro Arg Val Thr Thr Pro 65 70 75
ACC GTG GTG AAA CAC ATC CGG ACC TAC AAG CAG AGA GAC CCC GGC ATC 287 Thr Val Val Lys His Ile Arg Thr Tyr Lys Gin Arg Asp Pro Gly Ile 80 85 90 95
TTC GCC TGG GAG ATC CGG GAC CGC CTG CTG GCG GAC GGC GTG TGC GAC 335 Phe Ala Trp Glu Ile Arg Asp Arg Leu Leu Ala Asp Gly Val Cys Asp 100 105 110
AAG TAC AAT GTG CCC TCC GTG AGC TCC ATC AGC CGC ATT CTG CGC AAC 383 Lys Tyr Asn Val Pro Ser Val Ser Ser Ile Ser Arg Ile Leu Arg Asn 115 120 125
AAG ATC GGC AAC TTG GCC CAG CAG GGT CAT TAC GAC TCA TAC AAG CAG 431 Lys Ile Gly Asn Leu Ala Gin Gin Gly His Tyr Asp Ser Tyr Lys Gin 130 135 140
CAC CAG CCG ACG CCG CAG CCA GCG CTG CCC TAC AAC CAC ATC TAC TCG 479 His Gin Pro Thr Pro Gin Pro Ala Leu Pro Tyr Asn His Ile Tyr Ser 145 150 155
TAC CCC AGC CCT ATC ACG GCG GCG GCC GCC AAG GTG CCC ACG CCA CCC 527 Tyr Pro Ser Pro Ile Thr Ala Ala Ala Ala Lys Val Pro Thr Pro Pro 160 165 170 175
GGG GTG CCT GCC ATC CCC GGT TCG GTG GCC ATG CCG CGC ACC TGG CCC 575 Gly Val Pro Ala Ile Pro Gly Ser Val Ala Met Pro Arg Thr Trp Pro 180 185 190
TCC TCG CAC TCC GTC ACC GAC ATC CTG GGC ATC CGC TCC ATC ACC GAC 623 Ser Ser His Ser Val Thr Asp Ile Leu Gly Ile Arg Ser Ile Thr ASD 195 200 205 CAA GTG AGC GAC AGC TCC CCC TAC CAC AGC CCC AAG GTG GAG GAG TGG 671 Gin Val Ser Asp Ser Ser Pro Tyr His Ser Pro Lys Val Glu Glu Trp 210 215 220
•AGC AGC CTG GGC CGC AAC AAC TTC CCC GCC GCC GCC CCG CAT GCG GTG 719 Ser Ser Leu Gly Arg Asn Asn Phe Pro Ala Ala Ala Pro His Ala Val 225 230 235
AAC GGG TTG GAG AAG GGA GCC CTG GAG CAG GAA GCC AAG TAC GGT CAG 767 Asn Gly Leu Glu Lys Gly Ala Leu Glu Gin Glu Ala Lys Tyr Gly Gin 240 245 250 255
GCA CCA AAT GGT CTC CCA GCT GTG GGC AGT TTT GTG TCA GCA TCC AGC 815 Ala Pro Asn Gly Leu Pro Ala Val Gly Ser Phe Val Ser Ala Ser Ser 260 265 270
ATG GCT CCT TAC CCT ACC CCA GCC CAA GTG TCG CCT TAC ATG ACC TAC 863 Met Ala Pro Tyr Pro Thr Pro Ala Gin Val Ser Pro Tyr Met Thr Tyr 275 280 285
•AGT GCT GCT CCT TCT GGT TAT GTT GCT GGA CAT GGG TGG CAA CAT GCT 911 Ser Ala Ala Pro Ser Gly Tyr Val Ala Gly His Gly Trp Gin His Ala 290 295 300
GGG GGC ACC TCA TTG TCT CCC CAC AAC TGT GAC ATT CCG GCA TCG CTG 959 Gly Gly Tnr Ser Leu Ser Pro His Asn Cys Asp Ile Pro Ala Ser Leu 305 310 315
GCG TTC AAG GGA ATG CAG GCA GCC AGA GAA GGT AGT CAT TCT GTC ACG 1007 Ala Phe Lys Gly Met Gin Ala Ala Arg Glu Gly Ser His Ser Val Thr 320 325 330 335
GCT TCC 1013
Ala Ser
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(l) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 337 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
Pro Ala Phe Gly Glu Val Asn Gin Leu Gly Gly Val Phe Val Asn Gly
1 5 10 15
Arg Pro Leu Pro Asn Ala Ile Arg Leu Arg Ile Val Glu Leu Ala Gin 20 25 30 Leu Gly Ile Arg Pro Cys Asp Ile Ser Arg Gin Leu Arg Val Ser His 35 40 45
Gly Cys Val Ser Lys Ile Leu Ala Arg Tyr Asn Glu Thr Gly Ser Ile 50 55 60
Leu Pro Gly Ala Ile Gly Gly Ser Lys Pro Arg Val Thr Thr Pro Thr 65 70 75 80
Val Val Lys His Ile Arg Thr Tyr Lys Gin Arg Asp Pro Gly Ile Phe 85 90 95
Ala Trp Glu Ile Arg Asp Arg Leu Leu Ala Asp Gly Val Cys Asp Lys 100 105 HO
Tyr Asn Val Pro Ser Val Ser Ser Ile Ser Arg Ile Leu Arg Asn Lys 115 120 125
Ile Gly Asn Leu Ala Gin Gin Gly His Tyr Asp Ser Tyr Lys Gin His 130 135 140
Gin Pro Thr Pro Gin Pro Ala Leu Pro Tyr Asn His Ile Tyr Ser Tyr 145 150 155 160
Pro Ser Pro Ile Thr Ala Ala Ala Ala Lys Val Pro Thr Pro Pro Gly 165 170 175
Val Pro Ala Ile Pro Gly Ser Val Ala Met Pro Arg Thr Trp Pro Ser 180 185 190
Ser His Ser Val Thr Asp Ile Leu Gly Ile Arg Ser Ile Thr Asp Gin 195 200 205
Val Ser Asp Ser Ser Pro Tyr His Ser Pro Lys Val Glu Glu Trp Ser 210 215 220
Ser Leu Gly Arg Asn Asn Phe Pro Ala Ala Ala Pro His Ala Val Asn 225 230 235 240
Gly Leu Glu Lys Gly Ala Leu Glu Gin Glu Ala Lys Tyr Gly Gin Ala 245 250 255
Pro Asn Gly Leu Pro Ala Val Gly Ser Phe Val Ser Ala Ser Ser Met 260 265 270
'Ala Pro Tyr Pro Thr Pro Ala Gin Val Ser Pro Tyr Met Thr Tyr Ser 275 280 285
• Ala Ala Pro Ser Gly Tyr Val Ala Gly His Gly Trp Gin His Ala Gly 290 295 300
Gly Thr Ser Leu Ser Pro His Asn Cys Asp Ile Pro Ala Ser Leu Ala 3 05 3 10 3 15 320
Phe Lys Gly Met Gin Ala Ala Arg Glu Gly Ser His Ser Val Thr Ala 325 330 335
Ser
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(l) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) ART: Nucleotld
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nuclemsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "DNA-Oligonukleotid"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
CCCAAGCTTT GGACGCTCCC ATCAGAGTGC 30
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(l) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 29 Basenpaare
(B) ART. Nucleotld
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "DNA-Oligonukleotid"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
CCCAAGCTTA GCCAGCCTTC GGGGAGGTG 29

Claims

P A T E N T A N S P R Ü C H E
1. Protein mit der Aktivität von menschlichem Pax9 mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID No: 1, Analoga, Teile, Kon¬ jugate, Oligomere und Mischungen hiervon, ausgenommen ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz 1 - 208 alleine oder Teile hiervon.
2. Polypeptid mit der Sequenz der Aminosäuren Nr. 209-337 gemäß SEQ ID No: 1, die Bestandteil dieses Anspruchs ist, aus dem humanen Pax9-Gen oder einer Teilsequenz hiervon mit einer dem humanen Pax9-Teilgen mit den Aminosäuren Nr. 209 - 337 gemäß SEQ ID No: 1 entsprechenden Funktion.
3. Polypeptid nach Anspruch 2 mit der Sequenz der Aminosäu¬ ren Nr. 249-337 gemäß SEQ ID No. 1, die Bestandteil die¬ ses Anspruchs ist, aus dem humanen Pax9-Gen.
4. DNA, die für ein Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 oder 3 kodiert, wobei die DNA wahlweise modifiziert sein kann.
5. RNA, die von der DNA nach Anspruch 4 abgeleitet ist, wo¬ bei die RNA wahlweise modifiziert sein kann.
6. DNA, die unter stringenten Bedingungen zur DNA nach An¬ spruch 4 hybridisiert und ein davon abgeleitetes Peptid.
7. Monoklonaler oder polyklonaler Antikörper, der gegen ein Epitop des Polypeptids oder Proteins nach Anspruch 1,2 oder 3 gerichtet ist.
8. Rekombinanter Vektor mit einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 4 oder 6, wahlweise in funktioneller Verbindung mit einer oder mehreren Signalsequenzen zum gerichteten Transport des Polypeptids in den Zellkern.
9. Vektor nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Plasmid ist oder von einem viralen Vektor ab¬ geleitet ist.
10. Vektor nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Expressionsvektor ist.
11. Vektor nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß er ein in Eukaryontenzellen exprimierbarer Vektor ist.
12. Verwendung einer Nukleinsäure mit (a) einer für die Se¬ quenz der Aminosäuren Nr. 130-337 gemäß SEQ ID No. : 1, die Bestandteil dieses Anspruchs ist, kodierenden Nu¬ kleinsäuresequenz oder eines Teils hiervon, (b) einer mit einer Nukleinsäuresequenz aus (a) unter stringenten Be¬ dingungen hybridisierenden Nukleinsäuresequenz oder (c) einer zu einer Nukleinsäure aus (a) und/oder (b) komple¬ mentären Nukleinsäuresequenz oder eines Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz Nr. 130-337 gemäß SEQ ID No.: 1 oder eines Teils hiervon oder eines polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers gegen diese Sequenz zur Diagno¬ stik oder Therapie von Dysplasien, Metaplasien und Tumo¬ ren von Epithelzellen und Knorpelzellen.
13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz die Aminosäuren Nr. 209-337 oder 249-337 oder 130 - 193 oder 202 - 337 oder eines Teils hiervon mit der entsprechenden Funktion gemäß SEQ ID No. : 1, die Bestand¬ teil dieses Anspruchs ist, umfaßt.
14. Verwendung nach Anspruch 12 oder 13 zur Diagnostik und Therapie von Veränderungen der Epithelzellen des Oesopha¬ gus, der Haut, Mundschleimhaut, Zunge, Cornea, Vagina, der Cervix, des Endometriums, des Anus und der Talgdrüsen der Haut sowie des Knorpels.
15. Verwendung nach Anspruch 14 zur Diagnostik und Therapie von Dysplasien des mehrschichtigen Plattenepithels.
16. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche als Antisense-Nukleinsäure zur Hemmung der Genexpression.
17. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 8 - 11 zur somatischen Genterapie.
18. Verfahren zum Nachweis von Tumoren, Metaplasien und Dysplasien von Epithel- und Knorpelzellen in vitro, wobei eine Nukleinsäure mit (a) einer für die Sequenz der Ami¬ nosäuren Nr. 130-337 gemäß SEQ ID No. : 1, die Bestandteil dieses Anspruchs ist, kodierenden Nukleinsäuresequenz oder ein Teil hiervon, (b) einer mit einer Nukleinsäure¬ sequenz aus (a) unter stringenten Bedingungen hybridis¬ ierenden Nukleinsäuresequenz oder (c) einer zu einer Nu¬ kleinsäure aus (a) und/oder (b) komplementären Nuklein¬ säuresequenz oder ein gegen ein Polypeptid mit der Amino¬ säuresequenz 130-337 nach SEQ ID No. : 1 gerichteter poly¬ klonaler oder monoklonaler Antikörper in Kontakt mit ei¬ ner die zu analysierenden Epithelzellen oder Knorpelzel¬ len enthaltenden Gewebeprobe gebracht wird, um die Menge und/oder die Lokalisation der Expression von humanem Pax9-Protein zu analysieren.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz die Aminosäuren Nr. 209 - 337 oder 249 - 337 oder 130 - 193 oder 202 - 337 gemäß SEQ ID No.:l, die Bestandteil dieses Anspruchs ist, umfaßt.
20. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 8 - 11 zur terminalen Differenzierung von Tumorzellen oder Tu¬ morvorläuferzellen.
21. Verwendung eines Polypeptids oder einer Nukleinsäure nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche in einem Analysekit zur Analyse der Pax9-Expression in Epithelzel¬ len und Knorpelzellen auf Dysplasien, Metaplasien und Tu¬ moren.
22. Eukaryonten- oder Prokaryontenzelle, transformiert mit einem Vektor nach einem der Ansprüche 8 - 11.
23. Diagnostisches oder therapeutisches Mittel, mindestens enthaltend eine Nukleinsäure oder ein Polypeptid, wie es in einem der Ansprüche 1 - 6, 12 oder 13 gekennzeichnet ist.
24. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Analysekit zur Analyse der Pax9-Expression in Epithelzellen und Knorpelzellen auf Dysplasien, Metapla¬ sien und Tumoren ist.
25. cDNA zur RNA gemäß Anspruch 5.
26. Verwendung der in Anspruch 12 oder 13 gekennzeichneten Sequenzen als Marker für Knorpelzellen.
27. Verwendung der in Anspruch 12 oder 13 näher gekennzeich- neten Nukleinsäure zur Lokalisierung und Quantifizierung der Expression von Pax9 in einer Eurkaryontenzelle.
28. Monoklonaler Antikörper, der gegen ein Epitop eines Poly¬ peptids mit den Aminosäuren 130 - 193, 202 - 337, 202 - 248 oder 249 - 337 gerichtet ist.
29. Verwendung nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eine DNA oder RNA ist.
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