JPH10505335A - 酵素プロドラッグ療法におけるカルボキシペプチダーゼｇ２の細胞内発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、腫瘍の処置に有用である遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法のための２成分システムを提供し、該システムは、(a)細胞内で発現されるカルボキシペプチダーゼをコードするベクター；および(b)該カルボキシペプチダーゼによって活性な薬剤に変換され得るプロドラッグを含む。

Description

【発明の詳細な説明】 酵素プロドラッグ療法における カルボキシペプチダーゼＧ２の細胞内発現 本発明は、遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法（gene directed enzyme prodr ug therapy; GDEPT）および腫瘍を含む疾患の処置におけるその使用に関する。 「ウイルス指向性酵素プロドラッグ療法（virus-directed enzyme prodrug th erapy; VDEPT）」と呼ばれる治療的アプローチが、プロドラッグを使用し患者の 腫瘍細胞を処置する方法として提案されている。腫瘍細胞は、プロドラッグを活 性化し得る酵素をコードする遺伝子を含む(carrying)ウイルスベクターで標的化 される。その遺伝子は、組織特異的なプロモーターまたはエンハンサー配列によ り転写的に調節され得る。ウイルスベクターは、腫瘍細胞に入り、その酵素を発 現して、プロドラッグは腫瘍細胞内で活性な薬剤に変換される（ヒューバー(Hub er)ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA(1991)、88、8039）。或いは、遺伝子を運 搬(delivery)するための非ウィルス的方法が使用されている。そのような方法は 、リン酸カルシウム共沈法、マイクロインジェクション、リポソーム、直接的DN A取込み、およびレセプター仲介DNA輸送を含む。これらは、モーガンおよびフレ ンチ・ア ンダーソン(Morgan & French Anderson)、Annu．Rev．Biochem.、1993、62; 191 に概説されている。用語「GDEPT」(gene-directed enzyme prodrug therapy：遺 伝子指向性酵素プロドラッグ療法)は、ウイルスおよび非ウィルス運搬システム の両方を含むものとして使用される。 多くの種々の酵素が、GDEPT療法で使用するのに好適であるとして提案されて いる。一般に、酵素は、治療される腫瘍タイプに対して有効であることが知られ ているプロドラッグと適合性であるように選択される。薬剤が細胞に入り得るこ とがまた、GDEPTの成功に重要である。 酵素カルボキシペプチダーゼG2(CPG2)は、ナイトロジエンマスタード・プロド ラッグを含む多くのタイプのプロドラッグと組合せて、抗体指向性酵素プロドラ ッグ療法(ADEPT:Antibody-Directed Enzyme Prodrug Therapy)システムで使用す ることが提案されている。ADEPTでは、プロドラッグは細胞外または細胞表面で 活性化されるので、プロドラッグは細胞に入る重要な能力を有しないと考えられ ていた。さらに、そのプロドラッグは、親水性グルタミン酸を含む。現在、驚く べきことに、そのようなプロドラッグは、細胞に入るのみでなく、CPG2によって 細胞内で活性化し得ることが見い出されている。さらに、細胞内での活性化に続 いて、その薬剤は、周辺細胞 も活性化薬剤によって殺滅される有効なバイスタンダー効果(bystander effect) を発揮する。発明の開示 従って、これらの問題を解消するために、本発明は、遺伝子指向性酵素プロド ラッグ療法のための２成分システムを提供し、該システムは：(a)細胞内で発現 されるカルボキシペプチダーゼをコードするベクター；および(b)該カルボキシ ペプチダーゼによって活性な薬剤に変換され得るプロドラッグを含む。酵素は、 好ましくは、細菌カルボキシペプチダーゼ、特にカルボキシペプチダーゼCPG2（ 配列番号１）またはシュードモナスγ-グルタミルヒドロラーゼ EC3.4.22.12（ レヴィ シーシー(Levy CC)およびゴールドマン ピー(Goldman P)J．Biol．Che m.、242；p2933(1967)である。 ベクターは、RNAまたはDNAベクターであり得る。それは、当分野で入手可能な 、腫瘍細胞を標的化するのに好適な任意のベクターを含むウイルスベクターに由 来し得る。 本発明はまた、患者の処置方法において使用するための本発明のシステム、お よび処置を必要としている患者の腫瘍を処置する方法を提供し、該方法は、カル ボキシペプチダーゼをコードするベクターおよび該酵素によっ て活性な薬剤に変換され得るプロドラッグの有効量を該患者に投与することを包 含する。図面の簡単な説明 図１．NIH3T3細胞でのCPG2^★の発現 (A)イムノブロット分析。NIH3T3細胞を、M LVβpリンク（レーン１）またはMLVCPG2^★（レーン２）でトランスフェクトした 。細胞を緩衝液Ａ中に抽出し、サンプルのそれぞれを10%w/vポリアクリルアミド ゲルで電気泳動し、ニトロセルロースに移し、CPG2特異的ポリクローナル抗体で プローブした。CPG2^★の移動の位置が示され、標準的分子量マーカーの移動の位 置が図の左に（kDaで）示されている。(B)CPG2酵素活性アッセイ。(A)部分から の細胞抽出物を、CPG2酵素活性アッセイで分析した。サンプル番号は、(A)部分 からのレーン番号と対応する。酵素活性は、緩衝液コントロールに対して、任意 の単位で表現する。図２．細胞障害性アッセイ NIH3T3細胞を、MLVβpリンク（サンプル１、３）ま たはMLVCPG2^★（レーン２、４）でトランスフェクトした。トランスフェクショ ンから42時間後、細胞をコントロールとしてのCMDAプロドラッグ・ビヒクル（レ ーン１、２）またはCMDAプロドラッグ（レーン３、４）で、24時間処理した。回 収時間の後、細胞を新鮮な組織培養皿に継代し、３日後、細胞の生存度を [メチル−³H]チミジン取込みを測定することにより測定した。取込まれたチミジ ンの量を、各サンプルごとにdpmで示す。図３Ａ は、NIH3T3細胞でのCPG2^★の構成性発現を示す。図３Ｂおよび３Ｃ は、NIH3T3細胞系#3（白抜き棒）および#9（黒塗り棒）で発現 した、β−ガラクトシダーゼ(A)およびCPG2(B)に関する酵素活性を任意の単位で 示す。発明の詳細な説明 Ａ．ベクターシステム Molonyマウス白血病ウイルスに基づくベクターを含む好適なベクターシステム の例は、公知である（ラム、ゼット(Ram，Z)ら、Cancer Research（1993）53: 8 3-88；ダルトンおよびトレイスマン(Dalton & Treisman)、Cell（1992）68: 597 -612）。これらのベクターは、β-グロビン最小プロモーターの上流にクローニ ングされたマウス白血病ウイルス(MLV)エンハンサーを含む。クローニングされ たタンパク質の充分な翻訳を指示するように、開始ATGまでのβ-グロビン5'非翻 訳領域が補充されている。イニシエーターATGは、NcoI制限部位にまたがり、よ って、ベクターにタンパク質コーディング配列をクローニングするのに使用でき る。このベクターはさらに、クローニングを促進するためのポリリンカー、その 後にβ-グロビ ン3'-非翻訳領域およびポリアデニル化部位を含む。MLVエンハンサーは、強いエ ンハンサーであり、殆どのマウスおよびヒト細胞系で活性であるので、特に使用 される。 好適なウイルスベクターはさらに、レトロウイルスに基づくものを含む。その ようなベクターは、当分野で広く入手可能である。ヒューバーら（上記）は、肝 癌、乳房、結腸または皮膚細胞の形質転換のための両種性レトロウイルスの使用 を報告している。カルバー(Culver)らも、GDEPTでのレトロウイルスベクターの 使用を記載している（Science（1992）256；1550-1552）。そのようなベクター 又はそのようなベクターに由来するベクターも、使用し得る。他のレトロウイル スも、本発明での使用に好適なベクターを作製するのに使用し得る。そのような レトロウイルスは、ラウス肉腫ウイルス(RSV)を含む。そのようなウイルス由来 のプロモーターは、MLVに関して先に述べたと類似の様式で、ベクター中で使用 し得る。 エングルハルト(Englehardt)らは、嚢胞性線維症のトランスメンブラン・コン ダクタンス・プロダクト(CFTR)の細胞内への運搬におけるアデノウイルスに基づ くベクターの使用を記載しており（Nature Genetics（1993）4；27-34）、その ようなアデノウイルスに基づくベクターも使用し得る。アデノウイルスのプロモ ーターおよび他 の制御配列を活用するベクターは、肺の細胞に本発明のシステムを運搬するのに 使用し得、それ故に、肺腫瘍の処置に有効である。 カルボキシペプチダーゼをコードするベクターは、当分野でそれ自身公知の組 換えDNA技術を用いて作製し得る。酵素をコードする配列は、合成または組換え 核酸配列をスプライシングし、或いは既存の配列を部位指定突然変異誘発のよう な技術によって改変することにより構築し得る。標準的組換えDNA技術の考察に は、サムブルック(Sambrook)らの"Molecular Cloning"（1989、Cold Spring Har bor）が参照し得る。一般に、ベクターは、VDEPTまたはGDEPT療法で使用される 任意のDNAまたはRNAベクターであり得る。Ｂ．カルボキシペプチダーゼ カルボキシペプチダーゼは通常、プロドラッグから保護基を除去することによ り、プロドラッグを活性な薬剤に変換する。殆どの場合、保護基は、全体として プロドラッグから開裂される。しかしながら、酵素が、保護基の一部を開裂また は単に変化させることも可能であり、この結果、部分的に開裂されるか変化させ られた不安定な保護基になり、基の残りの部分は自然に除去される。 カルボキシペプチダーゼG2（CPG2）は、WO88/07378に 開示されており、その配列も下記に配列番号１として記載されている。配列番号 １のアミノ酸配列を有するCPG2が好ましいけれども、アミノ酸を置換、欠失また は挿入（例えば、それぞれの場合、約1、2、3、4、5、10または20残基を）する 配列の変化も可能である。いずれにしても、その変化は、酵素が、天然の酵素と 実質的に同じ速度でプロドラッグを活性な薬剤に変換するその能力を維持するよ うに為される。このコンテクストでは、「実質的に同じ速度」は、望ましくは、 大きさが１オーダー以内、好ましくは約50倍、例えば、約2倍小さいものから2、 5または10倍大きいものである。 特異的変化に加えて、酵素の活性が実質的に上記と変化しない限り、酵素は、 末端切除(truncation)、置換、欠失または挿入により変化され得る。例えば、酵 素をコードする核酸配列が好適なプロモーターに連結しているベクターを産生す るのに必要とされる操作の結果、N-および／またはC-末端配列の小さな末端切除 が起こり得る。変化した酵素の活性は、実施例に記載されるようなモデル系で測 定し得る。 末端切除された酵素の例はCPG2^★であり、該CPG2^★は配列番号１のアミノ酸23 〜415を含む。Ｃ．プロモーター カルボキシペプチダーゼは、ベクターが標的化される細胞で発現され得るプロ モーターを用いて、ベクターで発現される。プロモーターは、酵素およびその関 連配列をコードする配列に作動可能に連結される。例えば、c-erbB2プロト−オ ンコジーンは、乳部組織で低レベルで、組織に限定される様式で発現される。し かしながら、幾つかの腫瘍の状態では、このタンパク質の発現は、転写活性の強 化により増加する。この顕著な例は、乳部組織（腫瘍の約30%）、卵巣（約20%） および膵臓の腫瘍（約50〜75%）である。強化された転写または翻訳によりc-erb B2の発現が増大するような腫瘍では、c-erbB2プロモーターは、タンパク質の発 現を細胞特異的様式で指示するように使用し得る。 そのような腫瘍を標的化するためにc-erbB2プロモーターを活用する本発明のG DEPTシステムでは、c-erbB2プロモーターを有するベクターによる正常細胞のト ランスフェクションは酵素を非常に限られた量しか提供しないか皆無であり、そ れ故にプロドラッグの活性化が限定されるので、GDEPTの特異性は増大する。 c-erbB-2プロモーターは、-1500まで配列決定されており、ハドソン(Hudson) ら（（1990）J．Biol．Chem．265; 4389-4393）を参照すれば得られ得る。転写 の主要な開 始部位は、イシイ(Ishii)ら（（1987）Proc．Natl．Acad. Sci．84; 4374-4378 ）およびタル(Tal)ら（（1987）Mol. Cell Biol．7; 2597-2601）によって決定 されている。この開始部位は、+1として示され、この番号付けを本明細書中で引 用する。c-erbB-2の翻訳は、+178で開始する。プロモーターは、-75にCAATボッ クスを有し、-25にTATAボックスを有する。 ハリウッド(Hollywood)およびハースト(Hurst)（（1993）EMBO J．12; 2369-2 375）は、哺乳動物細胞内では、転写調節のために、-100および-213のプロモー ター領域が重要であると報告している。（サーカー(Sarkar)ら、（1994）J．Bio l．Chem．269; 12285-12289)も参照のこと。） c-erbB-2プロモーターを活用するベクターから発現を得るために、CAATボック スから、好ましくはTATAボックスからのc-erbB-2プロモーター領域を使用し、ハ リウッドおよびハースト（上記）によって哺乳動物細胞に関して見い出されたも ののような、特定の組織での発現特異性に関連する配列エレメントを上流に含ま せることが望ましい。従って、プロモーターは望ましくは、CAATボックスの上流 (5')から、約250番目、例えば300番目、400番目、500番目、600番目、700番目、 800番目、900番目、或いはさらに、ヌクレオチド5'から転写開始に少なくとも 全てのヌクレオチドを含む。TATAボックスを含むことも好ましい。必要に応じて 、TATAボックスの下流から+178の翻訳開始までに、c-erbB-2配列を使用しても良 い。 ヒトc-erbB-2プロモーター配列が好ましいが、ヒト配列に選択的にハイブリダ イズし得る改変されたプロモーター配列も使用し得る。ヒトプロモーター配列に 選択的にハイブリダイズし得るプロモーター配列は一般に、少なくとも20、好ま しくは少なくとも30、例えば、40、60または100個以上の連続的ヌクレオチドか らなる領域にわたって、プロモーター領域またはそのフラグメントに少なくとも 70％、好ましくは少なくとも80または90％以上、より好ましくは少なくとも95％ 相同である。 一般に、当業者は、-213にあるようなプロモーターの幾つかの領域は、ベクタ ー由来の発現の腫瘍特異性を確実にするために維持される必要があるが、プロモ ーターの他の領域は、特異性を有意に失うことなしに改変または欠失され得る。 従って、ヒトc-erbB-2と実質的に同程度に転写的に調節される改変されたプロモ ーターが好ましい。そのような候補となるプロモーターの調節の程度は、例えば 、ハリウッドおよびハースト（上記）に記載されるように、CATアッセイを用い て、当業者によってテストされ評価され得る。 「作動可能に連結される」とは、プロモーターと酵素をコードする配列が、プ ロモーターの制御下にコーディング配列を発現させる関係である並置を指す。従 って、プロモーターとコーディング配列との間に、プロモーターにもコーディン グ配列にも天然にはない5'非コーディング配列のようなエレメントがあって良い 。プロモーターによるコーディング配列の正確な制御を損なわないならば、その ような配列は、ベクター内に含むことができる。 他の好適なプロモーターは、哺乳動物レトロウイルスまたはDNAウイルスのプ ロモーターのようなウイルスプロモーターを含む。好適なプロモーターは、前記 ベクターで使用されるもの、例えば、MLV、CMV、RSVおよびアデノウイルスのプ ロモーターを含む。好ましいアデノウイルスプロモーターは、アデノウイルス初 期遺伝子プロモーターである。強力な哺乳動物のプロモーターも好適であり得る 。そのようなプロモーターの例は、ミズシマ(Mizushima)およびナガタ(Nagata) （(1990)、Nucl．Acids Res．18; 5322）を参照すれば得られ得るEF-1αプロモ ーターである。実質的に類似の転写活性を保持する、そのようなプロモーターの 変種(variants)も使用し得る。 本発明は、カルボキシペプチダーゼ酵素をコードする 遺伝子に作動可能に連結されているc-erbB-2プロモーターを含むウイルスベクタ ーを提供し、該酵素は、プロドラッグを活性な薬剤に変換し得る。本発明はまた 、ベクターにコードされている酵素によって活性な薬剤に変換され得るプロドラ ッグと共に上記ベクターを含むキットも提供する。他の局面では、本発明は、ヒ トまたは動物の身体の処置方法、特にc-erbB-2プロトオンコジーンが過剰発現さ れる腫瘍の処置方法で使用するための、上記ベクターまたは上記キットを提供す る。さらなる局面では、本発明は、腫瘍の処置方法、特にc-erbB-2プロトオンコ ジーンが過剰発現される腫瘍の処置方法を提供し、該方法は、(i)上記ベクター の有効量、および(ii)ベクターにコードされている酵素によって活性な薬剤に変 換され得るプロドラッグの有効量を、腫瘍を有する個体に投与することを包含す る。Ｄ．プロドラッグ 該システムで使用するプロドラッグは、酵素と適合性であるように、即ち、酵 素がプロドラッグを活性な薬剤に変換し得るように選択される。望ましくは、処 置される患者に対するプロドラッグの毒性は、患者に対して、活性な薬剤よりも 少なくとも１オーダー毒性の強さが低いものである。好ましくは、活性な薬剤は 、数オーダー、 例えば、２、３または４以上のオーダーで毒性がより高い。好適なプロドラッグ は、ナイトロジェンマスタード・プロドラッグおよび、例えば、WO88/07378、WO 89/10140、WO90/02729、WO91/03460、EP-A-540 263、WO94/02450、WO95/02420ま たはWO95/03830に記載されるような他の化合物を含み、それらは本明細書中に参 考として援用されている。Ｅ(i)−ナイトロジェンマスタード・プロドラッグ ナイトロジェンマスタード・プロドラッグは、下記一般式： M-Ar-CONH-R ［式中、Arは、必要に応じて置換された環の芳香環システムを示し、R-NHは、α -アミノ酸R-NH₂の残基またはオリゴペプチドR-NH₂の残基であり、少なくとも１ つのカルボン酸基を含み、Mは、ナイトロジェンマスタード基を示す］で示され る化合物を含む。 アミノ酸の残基R-NHは、好ましくは、グルタミン酸の残基である。WO88/07378 には、酵素カルボキシペプチダーゼG2が、上記タイプの化合物からグルタミン酸 部分を除去し得、グルタミン酸部分の除去によって活性なナイトロジェンマスタ ード薬剤の産生がもたらされることが開示されている。 従って、本発明で使用するナイトロジェンマスタード・プロドラッグは、WO94 /02450の一般式Ｉで示されるプロドラッグおよびその塩、特に式(I)： ［式中、R¹およびR²は、それぞれ独立して、塩素、臭素、ヨウ素、OSO₂Me、OSO₂ フェニル（ここで、フェニルは必要に応じて、C_1-4アルキル、ハロゲン、-CNま たはNO₂から独立して選択される１、２、３、４または５個の置換基で置換され ている）を示し； R^1aおよびR^2aは、それぞれ独立して、水素、C_1-4アルキルまたはC_1-4ハロアルキ ルを示し； R³およびR⁴は、それぞれ独立して、水素、C_1-4アルキルまたはC_1-4ハロアルキル を示し； nは、０〜４の整数であり； R⁵は、それぞれ独立して、水素、必要に応じて１つの二重結合または１つの三重 結合を含むC_1-4アルキル、C_1-4アルコキシ、ハロゲン、シアノ、-NH₂、-CONR⁷R⁸ （ここで、R⁷およびR⁸は独立して、水素、C_1-6アルキルまたは C_3-6シクロアルキルである）を示す、或いは２つの隣接するR⁵基は共に、以下を 示す： a)必要に応じて１つの二重結合を含むC4アルキレン； b)C3アルキレン；または c)それぞれ必要に応じて１、２、３または４個の置換基で置換されており、該置 換基はそれぞれ独立してC_1-4アルキル、C_1-4アルコキシ、ハロゲン、シアノおよ びニトロからなる群から選ばれる、-CH=CH-CH=CH-、-CH-CH-CH2-または-CH2-CH= CH-； Xは、基-C(O)-、-O-C(O)-、-NH-C(O)-または-CH₂-C(O)-であり；および Zは、基-CH₂-T-C(O)-OR⁶（ここで、Tは、CH₂、-O-、-S-、-(SO)-または-(SO₂)- であり、R⁶は、水素、C_1-6アルキル、C_3-6シクロアルキルアミノ、モノ‐ジ-C_{1- 6} アルキルアミノ或いはモノまたはジC_3-6シクロアルキルアミノである、但し、R⁶ が水素であるときTが-CH₂-である）］で示されるもの；および式(I)で示される 化合物の、塩を含む、生理学的に許容される誘導体を含む。 ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を含む。基R^1aおよびR^2aに関す る好ましい意味(values)は、メチルおよび水素、特に水素である。R³およびR⁴に 関する好ましい意味は、水素、メチルおよびトリフルオロメチル、 特に水素である。基R¹およびR²に関する好ましい意味は、I、Br、Cl、OSO₂Meお よびOSO₂フェニル（ここで、フェニルは２位および／または４位で１個または２ 個の置換基で置換されている）である。I、ClおよびOSO₂Meが、特に好ましい。 nが１〜４の整数であるとき、R⁵に関する好ましい意味は、フッ素、塩素、メ チル-CONH₂およびシアノである。好ましくは、nは０、１または２である。nが１ または２であるとき、R⁵は環の３位および／または５位のフッ素であることが好 ましい。基Xは、好ましくは、-C(O)-、-O-C(O)-または-NH-C(O)-である。Zは、 好ましくは、基-CH₂CH₂-COOHである。 好ましい具体的な化合物は、以下を含む： N-4-[(2-クロロエチル)(2-メシルオキシエチル)アミノ］ベンゾイル-L-グルタミ ン酸（下記で「CMDA」と称する）およびその塩； N-(4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]-3-フルオロフェニルカルバモイル)-L-グル タミン酸およびその塩； N-(4-[ビス（2-クロロエチル)アミノ]フェニルカルバモイル)-L-グルタミン酸お よびその塩； N-(4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]フェノキシカルボニル)-L-グルタミン酸お よびその塩； N-(4-[ビス(2-ヨードエチル)アミノ]フェノキシカルボニル)-L-グルタミン酸お よびその塩。 本発明の関心のある化合物の特別なサブグループは、単独で、或いはR¹-R⁴、R⁵ 、XまたはWに関する任意の他の特定の定義又は一般的定義と組合せて、R¹-R⁴、 R⁵、XまたはWに関する上記の特定の定義又は一般的定義を有するものの任意の１ つを得ることにより、得られ得る。 WO88/07378に開示されているもののような従来技術の化合物よりも親油性であ るプロドラッグは、本発明のシステムで使用されるものであり、一般式(II)： ［式中、R¹、R²、R⁵、nおよびZは、上記一般式(I)で示される化合物のように定 義され； mは、０〜４の整数であり、 Z¹およびZ²は、それぞれ独立して、-O-または-NH-であり；および R⁹は、水素、t-ブチルまたはアリルである］で示される化合物；および一般式(I )で示される化合物の生理学的に許容される誘導体を含む。R¹、R²、R⁵、nおよび Zの好ましい意味は、一般式(I)で示される化合物のように定義される。mの好ま しい値は、上記nに関して定義されるように０、１または２である。R⁹は、好ま しくは水素であるが、特に合成の間に、アリルまたはt-ブチルのような基で保護 され得る。 これらのプロドラッグは、カルボキシペプチダーゼ酵素、例えば、WO88/07378 またはWO94/02450に開示されているCPG2によって、腫瘍の部位で活性化され得る 。 一般式(II)で示される化合物は、それ自身化学の分野で公知の反応を用いて作 製し得る。下記の方法は、特定の使用である：Ａ：Z¹が-O-である一般式(II)で示される化合物： Z¹が-O-である一般式(I)で示される化合物は、一般式(III)で示されるナイト ロジェンマスタード ［式中、R¹、R²、およびR⁵およびnは、上記のように定義され、Z⁴は-O-である］ を、一般式(IV)で示されるリンカー ［式中、R⁵、m、Z²、R⁹およびZ³は、上記のように定義され、Qは、水素または脱 離基である］と反応させることによって作製し得る。この反応は、塩基の存在下 に非プロトン性溶媒、例えばDMFおよびトリエチルアミン中で為され得る。 好ましい脱離基Qは、スクシンイミジル基、4-ニトロフェニルカーボネート基 、ペンタフルオロフェニルカーボネートおよびテトラクロロエチル基CH(Cl)CCl₃ を含む。 (ii)一般式(III)で示される化合物は、必要に応じて基（単数または複数）R⁵ _{( n)} （上記のように定義される）で置換された4-ニトロフェノールから出発して作 製し得る。フェノール基は、｛出発物質をTHF中、アダマンタニル−フルオロホ ルメート(adamantanyl-fluoroformate)およびトリエチルアミンと室温で反応さ せることにより｝アダマンタニルオキシカルボニル−誘導体(adamantanyloxycar bonyl-derivative)として保護される。保護された4-ニトロフェニルカーボネー トは、室温で、ギ酸アンモニウムおよび触媒としてPd/C 10%を用い、エタノール 中で水素移動により、対応するアミンに還元される。続いて、アミンは、AcOH中 で20℃にて、エチレンオキシドによってヒドロキシエチル化され、その後、反応 して所望のナイトロジェンマスタードになる。好適な条件に関しては、EP-A-433 360またはEP-A-490970を参照し得る。化合物は、カラムクロマトグラフィーで 精製し得る。アダマンチル基(adamantyl group)を除去する脱保護は、トリフル オロ酢酸の中で為され得る。 (iii)或いは、一般式(III)で示されるナイトロジェン マスタードは、非プロトン性溶媒およびトリエチルアミン中ホスゲンまたはトリ ホスゲンで処理して、クロロホルメートとして活性化され得、その後、一般式(V )で示される化合物： ［式中、R⁵、m、Z²、R⁹およびZ¹は、上記のように定義される］とカップリング させる。これは、塩基（例えば、トリエチルアミンまたはピリジン）の存在下に 、THFまたは他の非プロトン性溶媒中で為され得る。 (iv)Z¹が-O-である一般式(II)で示される化合物の合成の更に他のルートは、 必要に応じて基（単数または複数）R⁵ _(n)（上記のように定義される）で置換さ れた4-ニトロフェノールを一般式(IV)で示される化合物と直接的にカップリング させるか、または、該必要に応じて置換された4-ニトロフェノール化合物クロロ ホルメートを一般式 (IV)で示される化合物と反応させ、いずれの場合もアミンを介してニトロ基をマ スタード基に変換する上記の反応を行なう。Ｂ：Z¹が-NH-である一般式(II)で示される化合物： Z¹が-NH-である一般式(II)で示される化合物は、塩基の存在下に非プロトン性 溶媒中で、Z⁴が-NH-である一般式(III)で示される化合物と一般式(IV)で示され るリンカーとの反応により作製し得る。Z⁴が-NH-である一般式(III)で示される 化合物は、必要に応じて基（単数または複数）R⁵ _(n)（上記のように定義される ）で置換された1-ハロ-4-ニトロベンジル化合物から作製し得る。これは、加熱 しながらジエタノールアミンと反応させることにより、対応する1-ビス-ヒドロ キシエチルアミノ-4-ニトロベンジル化合物に変換し、得られた産物をカラムク ロマトグラフィーで精製する。対応する4-ニトロナイトロジェンマスタードは、 例えば、ピリジン中塩化メシルを用いるメシル化によって作製し得、その後の反 応により、所望ならば、他のハロ・マスタード類、例えば、ブロモ・マスタード またはヨード・マスタードにする。4-ニトロ基は、ギ酸アンモニウムおよびPd/C 10%触媒を用いて20℃にて、エタノール中で水素移動により還元し得る。 (ii)或いは、上記の1-ビス-ヒドロキシエチルアミノ- 4-ニトロベンジル化合物は、ギ酸アンモニウムおよび触媒としてPd/C 10%を用い て、エタノール中20℃にて還元し得、対応するフェニレン−ジアミノ誘導体を得 る。この誘導体は、前記パラグラフで述べたように、例えば、最初に塩化メシル と反応させることにより、対応する4-アミノナイトロジェンマスタードに変換し 得る。Ｃ：Z²が-NH-である一般式(IV)で示される化合物： (i)Z²が-NH-である一般式(IV)で示される化合物は、必要に応じて基（単数ま たは複数）R⁵ _(n)（上記のように定義される）で置換された4-ニトロベンジルア ルコールから作製し得る。ヒドロキシル基は、非プロトン性溶媒中3,4-2H-ジヒ ドロピランおよびピリジニウム-p-トルエンスルホネート(PPTS)と、或いは、ジ メチルホルムアミド(DMAC)中TBDMSiクロリドおよびイミダゾールと、それぞれ20 ℃にて処理することにより、ピラニル-またはt-ブチル-ジメチルシリル(TBDMSi) -エーテルとして保護される。このようにして得られる中間体は、ギ酸アンモニ ウムおよび触媒としてPd/C 10%を用いて20℃にて、エタノール中での水素移動に より対応するアミンに還元される。このアミンは、一般式(VI)で示されるグルタ ミルエステル中間体： ［式中、R⁵、m、R⁹およびZ¹は、上記のように定義され、Z²は、-NH-であり、Pr は、ピラニル-またはt-ブチル-ジメチルシリル(TBDMSi)-エーテル保護基である ］に変換される。これは、アミンをトルエン中トリホスゲンおよびトリエチルア ミンで60℃にて処理して、対応するイソシアネートを得ることにより為され得、 イソシアネートは、式R⁹-C(O)-CH(NH₂)-Z¹（ここで、R⁹およびZは、上記のよう に定義される）で示されるグルタメート誘導体で処理する。或いは、トルエン中 トリホスゲンおよびトリエチルアミンとの-78℃での処理により、対応するグル タメートから得られる対応するグルタミル−イソシアネートは、ワンポット操作 (one pot procedure)でアミンと反応され得る。 (ii)一般式(VI)で示される化合物は、緩やかな酸性媒 体（AcOH、THFおよびH2OまたはPPTS、EtOH、55℃）で処理して脱保護し、TBDMSi またはピラニル基を除去する。これにより、Prが水素である一般式(VI)で示され る化合物が得られる。Qが脱離基である一般式(IV)で示される化合物は、当分野 で公知の標準的反応を使用して調製し得る。 (iii)例えば、Qがスクシンイミジル基である場合、Prが水素である一般式(VI) で示される化合物は、アセトニトリル中ジスクシンイミジル−カーボネートおよ びトリエチルアミンで処理し得る。4-ニトロフェニルカーボネート基が望ましい 場合、THF中4-ニトロフェニルクロロホルメートおよびトリエチルアミンとの処 理が使用し得る。ペンタフルオロフェニルカーボネートが、ペンタフルオロフェ ノールのin situホスゲン化、その後、Prが水素である一般式(VI)で示されるリ ンカーにカップリングすることにより付加され得る。Ｄ：Z²が-O-である一般式(IV)で示される化合物： (i)カルバミン結合(carbamic bond)を有するリンカーに関する出発物質は、非 置換または｛（基（単数または複数）R⁵ _(n)（上記のように定義される）で｝置 換された4-ヒドロキシ-ベンジルアルコールである。これらのタイプのリンカー は、1,4-除去を行うために、芳香核上に余 分な電子取出基を必要とする。4-ヒドロキシ基は、出発物質をTHF中の1N NaOH、 アセチル-v-トリアゾロ-[4,5-b]ピリジンと、20℃にて処理することにより、ア セテートとして特異的に保護され得る。アセテートのアルコール基は、上記Ｃ項 で述べた手順により、ピラニル-またはTBDMSi-エーテルとしてさらに保護される 。アセテート基は、続いて、NaHCO3水性MeOH中20℃にて脱保護され、4-ヒドロキ シ基を回復する。得られるフェノール化合物は、上記Ｃ(i)項に記載のように、 保護されたグルタミル−イソシアネートとワンポット操作で反応される。これに より、Z²が-O-であり、Prがピラニル-またはt-ブチル-ジメチルシリル(TBDMSi)- エーテル保護基である一般式(VII)で示される化合物が生じる。 (ii)この化合物の脱保護により、Prが水素である一般式(VI)で示される化合物 を生じる。これは、上記Ｃ(ii)および(iii)項に記載されるものと類似の方法に より、一般式(IV)で示される化合物に変換し得る。Ｅ：一般式(III)で示される化合物の別の合成： Qが水素、フルオロ、クロロ、ブロモまたは-O-(N-スクシンイミド)である一般 式(III)で示される化合物は、WO95/02420またはWO95/03830を参照しても得られ 得る。Ｅ(ii)．他のプロドラッグ 本発明で使用するのに好適な更なるプロドラッグは、一般式FTLi-(PRT)m［式 中、FTLiは、ファーネシルトランスフェラーゼ・インヒビター化合物のようなra sインヒビターであり、PRTは、酵素の作用によりrasインヒビターから開裂され 得るm'個の保護基を示し、ここで、m'は、１〜５の整数である］で示されるもの 又はその塩を含む。そのような化合物は、WO95/03830に開示されている。 好適なFLTiは、下記一般式 ［式中、R_3aおよびR_4aは、天然に生じるアミノ酸の側鎖（例えば、-CH₃、-CH(CH₃ )₂、-CH₂CH(CH₃)₂、-CH(CH₃)CH₂CH₃、-CH₂OH、-CH₂CH₂SCH₃、-CH(OH)CH₃）であ り、それらの酸化形態（例えば、メチオニンスルホキシドまた はメチオニンスルホンを含む）であり、或いは、置換または非置換の脂肪族、芳 香族またはヘテロ芳香族基、好ましくは、シクロヘキシル、フェニル、ピリジル 、イミダゾリル或いは必要に応じて芳香族またはヘテロ芳香族環で置換された飽 和または不飽和の分岐状または直鎖状の２〜８炭素原子であり； X_1aは、CH₂CH₂、トランスCH=CHまたはCH₂NHであり；および X_2aは、(CH₂)_n（ここで、ｎは、０、１または２である）である］で示されるも のを含む。好ましくは、R_3aおよびR_4aは共に、CH(CH₃)CH₂CH₃を示す。 上記式で示されるものを含む好適なFLTi化合物は、WO95/03830を参照して得ら れる。 プロドラッグの更なる群は、一般式：PTKi-PRT_m［式中、PTKiは、PTK（タンパ ク質チロシンキナーゼ）阻害活性を有する化合物であり、PRTは、酵素の作用に よりPTKインヒビターから開裂され得る保護基であり、m'は、１〜５の整数であ る］で示されるチルホスチン(tyrphostin)化合物である。 好適なPTKsは、チルホスチンを含む。チルホスチンは、タンパク質チロシンキ ナーゼ・ドメインのサブサイトに結合し得るタンパク質チロシンキナーゼのイン ヒビター を含む、低分子量（例えば、2,000未満）のスチリルである。好適なチルホスチ ン類は、ガジット(Gazit)ら（J．Med．Chem．（1989）32，2344）およびガジッ トら（J．Med．Chem．（1991）43; 1896-1907）に記載されているもの、並びに 特に下記一般式で示されるチルホスチン： ［式中、X¹は、炭素、窒素または基N→Oを示し；nは、１〜３の整数であり；基R¹⁰ のそれぞれは、同一または異なっていても良く、水素、ヒドロキシ、メルカプ ト、カルボキシ、ホルミル、C_1-4アルキル、C_2-4アルケニル、C_1-4アルコキシ、 C_1-4アルキルチオ、カルボキシC_1-4アルキル、カルボキシC_2-4アルケニル、C_1-4 アルキルスルホキシ、ハロ（即ち、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード）、 ニトロ、アミノ、C_1-4アルキルアミノ、またはC_1-4ジアルキルアミノであり、或 いはnが２または３であるとき、２つのR¹⁰基は共にメチレンジオキシまたはエチ レンジオキシ基を形成しても良い；R¹¹は、水素、ヒドロ キシ、C_1-4アルキルであるか又は基（単数または複数）R¹⁰が結合する環の２位 と共に５または６員の脂肪族環または複素環を形成し、該５または６員環は、必 要に応じてケトン基を含み；R¹²は、シアノ、カルボキシ、カルバモイル、チオ カルバモイル、基C(O)HNCH₂CN、基C(NH₂)=C(CN)₂、アルファケト基C(O)R¹³（こ こで、R¹³は、3,4-ジヒドロキシフェニルまたは2-チオフェニルである）或いは アルファアミド基C(O)NHR¹⁴（ここで、R¹⁴は、ベンジル、フェニルまたは2,4-ジ メトキシフェニルである）である；但し、基R¹⁰およびR¹¹の少なくとも１つが、 メルカプト、ヒドロキシまたはアミノである］を含む。 好ましい実施態様では、X¹はCであり：nは１〜３の整数であり；基R¹⁰のそれ ぞれは、同一または異なっていても良く、水素、ヒドロキシ、カルボキシ、ホル ミル、C_1-4アルキル、C_2-4アルケニル、C_1-4アルコキシ、カルボキシC_1-4アルキ ル、カルボキシC_2-4アルケニル、ハロ（即ち、フルオロ、クロロ、ブロモまたは ヨード）、ニトロ、アミノ、C_1-4アルキルアミノ、またはC_1-4ジアルキルアミノ であり、或いはnが２または３であるとき、２つのR¹⁰基は共にメチレンジオキシ またはエチレンジオキシ基を形成しても良い；R¹¹は、水素、ヒドロキシまたはC_1-4 アルキルであり；およびR¹²は、シアノ、カルボキシ、 カルバモイル、チオカルバモイル、基C(O)HNCH₂CNもしくは基C(NH₂)=C(CN)₂であ る。最も好ましくは、基X¹⁰は、炭素を示し、nは、１〜３の整数であり；R¹⁰の それぞれは、同一または異なっていても良く、水素、ヒドロキシまたはアミノで あり；R¹¹は、水素またはヒドロキシであり；R¹²は、シアノ、基C(O)HNCH₂CN、 基C(NH₂)=C(CN)₂、アルファケト基C(O)R¹³（ここで、R¹³は、3,4-ジヒドロキシ フェニルである）、或いはアルファアミド基C(O)NHR¹⁴（ここで、R¹⁴は、ベンジ ルである）である；但し、基R¹⁰、R¹¹、およびR¹²の少なくとも１つが、ヒドロ キシまたはアミノである］である。好ましくは、基R¹⁰は、ヒドロキシまたはア ミノである。R¹¹が、R¹⁰と共に５または６員環を形成するとき、好ましい環は、 複素環（ここで、環は、１個の窒素原子および４または５個の炭素原子を含む） を含む。原子の総数は、基（単数または複数）R¹⁰が結合している環の２個の炭 素原子を含む。 上記のような好適なチルホスチンは、WO95/02420、ガジットら（1989および19 91、上記）に開示されている方法、またはそれと類似の方法により得られ得、そ れらは、本明細書中に参考として援用されている。 チルホスチンは、酵素によって除去し得る任意の好適な保護基と結合していて も良い。好適な保護基PRTは、W O95/03830またはWO95/02420を参照して見い出され得、下記構造： -(Z¹-CO.0.CH₂-Ph-Z-NH-glu)_m' ［式中、Z¹は、上記のように定義されるか又はSであり、m'は、１〜５の整数で あり、Phは、上記のように定義される１〜４個の基R⁵（同一または異なっていて も良い）で必要に応じて置換されたフェニル環であり、gluは、-CHZ-C(O)-OR⁹（ ここで、ZおよびR⁹は、上記のように定義される）である］を有するものであり 得る。Ｅ(iii)．誘導体 前記プロドラッグの生理学的に許容される誘導体は、塩、アミド、エステルお よびエステルの塩を含む。エステルは、エステル基の非カルボニル部分が直鎖状 または分岐鎖状のC_1-6アルキル（メチル、n-プロピル、n-ブチルまたはt-ブチル ）；またはC_3-6環状アルキル（例えば、シクロヘキシル）から選択されるカルボ ン酸エステルを含む。塩は、例えば、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）、ア ルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）塩、アンモニウムおよびNR_4''（ここ で、R''は、C_1-4アルキルである）塩のような好適な塩基から誘導される生理学 的に許容される塩基塩である。他の塩は、塩酸および酢酸塩を含む酸付加塩を含 む。アミドは、非置換およびモ ノ−およびジ−置換された誘導体を含む。Ｆ．本発明の用途 本発明のシステムは、ヒトまたは動物の身体の処置方法の中で使用し得る。そ のような処置は、処置を必要とする患者に本発明のシステムを投与することを包 含する、新生物細胞の増殖を処置する方法を含む。本発明は、細菌、ウイルスま たは寄生虫によるヒトまたは動物の身体の感染を介して、疾患化した細胞を処置 するのに使用し得る。ウイルス後期プロモーターは、感染の初期に産生されるウ イルスタンパク質にしばしば依拠する。感染された細胞の表面に発現されるウイ ルス・コートタンパク質は、遺伝子を細胞内に入り込ませるための標的物として 使用し得る。次に、ウイルス後期プロモーターが、GDEPT酵素の発現を指示する ように使用される場合、任意の感染した細胞、特に暫くの間感染していた細胞が 、タンパク質を発現する。これは、感染した細胞を殺滅するのに十分であり得る 。寄生虫については、寄生虫のプロモーターおよび寄生虫の表面タンパク質が、 発現を指示し寄生虫を感染させるために、それぞれ使用し得る。 細菌については、特異的プロモーターがより容易に定められるべきであるが、 細菌ウイルスを使用するためには、恐らく全ての運搬システムが変化させられる 必要が ある。 ベクターを治療の中で使用するために、ベクターは、例えば、ラム(Ram)らに 記載される（上記）ように、通常、ウイルス粒子中にパッケージされ、粒子は、 腫瘍の部位に運搬される。ウイルス粒子は、腫瘍の標的化を増強するために、抗 体、そのフラグメント（シングル・チェーンを含む）または腫瘍指向性リガンド (tumour-directed ligand)を含むように改変し得る。或いは、ベクターは、リポ ソーム中にパッケージされ得る。リポソームは、特定の腫瘍に標的化され得る。 これは、腫瘍指向性抗体（tumour-directed antibody)をリポソームに結合させ ることにより、為され得る。ウイルス粒子も、リポソーム中に組込まれ得る。粒 子は、医師の裁量による任意の好適な手段によって、腫瘍に運搬し得る。好まし くは、ウイルス粒子は、腫瘍細胞を選択的に感染し得る。「選択的に感染する」 とは、ウイルス粒子が主として腫瘍細胞に感染し、感染した非腫瘍細胞の部分は 、疾患の症状が処置された場合に、プロドラッグの投与による非腫瘍細胞に対す る障害が容認できるほど低いことを意味する。究極的には、これは、医師により 決定される。 好適なリポソームは、例えば、正に荷電した脂質(N[1-(2,3-ジオレイルオキシ )プロピル]-N,N,N-トリエチルア ンモニウム(DOTMA)を含むもの、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン( DOPE)を含むもの、および3β[N-(n',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル] コレステロール(DC-Chol)を含むもの、を含む。 好適な投与経路は、粒子の滅菌液の溶液の注射による。プロドラッグは単独で 投与することが可能であるが、薬学的製剤として提供することが好ましい。その 製剤は、プロドラッグを、１種以上の許容されるその担体および必要に応じて他 の治療的成分と共に含む。１又は複数の担体は、製剤の他の成分と適合し得、そ のレシピエントに有害でない意味で「許容可能な」ものでなければならず、例え ば、リポソームである。好適なリポソームは、例えば、正に荷電した脂質(N[1-( 2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリエチルアンモニウム(DOTMA)を含む もの、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)を含むもの、および 3β[N-(n',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル]コレステロール(DC-Chol) を含むもの、を含む。 例えばパッケージング細胞系から単離されたウイルスは、局所的灌流または直 接的腫瘍内誘導、或いは体腔内への直接的注射（腔内投与）、例えば、腹腔内注 射によっても、投与し得る。 筋肉細胞は、裸のDNAを取込めることも公知であり、従って、肉腫は、裸のDNA が肉腫に直接的に注射される本発明のベクターシステムを用いて処置し得る。 非経口的または筋肉内投与に好適な製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、殺菌 性抗生物質および、意図されるレシピエントの血液に製剤を等張化する溶質を含 んでも良い水性および非水性滅菌注射溶液；並びに懸濁剤および濃稠化剤、およ び血液成分または１種以上の器官に化合物を標的化するようデザインされている リポソームまたは他の微粒子システムを含んでも良い水性および非水性滅菌懸濁 液を含む。製剤は、単位投薬用またはマルチ投薬用容器、例えば、密封されたア ンプルおよびバイアルで提供し得、および注射剤として、使用する直前に滅菌性 液状担体、例えば、水に加えることのみを要求する凍結乾燥状態で保存し得る。 注射用溶液および懸濁液は、先に述べた種類の滅菌した粉末、顆粒および錠剤か ら即座に調製し得る。 特に先に述べた成分に加えて、製剤は、問題となるタイプの製剤に配慮して、 当分野で慣用されている他の薬剤を含み得る。可能性のある製剤の中では、滅菌 され、発熱物質を含まない水性および非水性溶液が好ましい。 投薬量は、例えば、毎日、毎週または毎月、間隔をお いて、或いは患者の具体的な必要性に応じて、連続的に、投与し得る。 投与の好ましい経路は、経口的運搬および注射、代表的には非経口的または筋 肉内注射または腫瘍内注射である。 本発明のシステムを使用する際、プロドラッグは、通常、酵素をコードするベ クターの投与後に投与される。代表的には、ベクターは患者に投与され、続いて 、トランスフェクトされた又は感染された（ウイルスベクターの場合）細胞によ るベクターの取込みが、例えば、標的化組織の生検サンプルの回収および分析に よってモニターされる。 正確な投与規則は、無論、個々の患者について個々の臨床医により決定される 必要があり、これは引き続いて、プロドラッグおよびプロドラッグから放出され る細胞障害性物質の正確な性質によりコントロールされるが、幾つかの一般的な 指針が示され得る。このタイプの化学療法は、通常、プロドラッグと改変された ウイルスの両方の非経口的投与を含み、経静脈的経路による投与が最も実際的で あることが頻繁に見い出される。神経膠芽腫に関しては、しばしば腫瘍内経路で 行われる。プロドラッグの代表的投与量範囲は、一般に、患者の体重kgにつき、 毎日約１〜150 mgの範囲であり、これは、単一または複数投薬で投与し得る。好 ましくは、投与量範囲は、患者の体重kgにつき、毎日約10〜75 mg、例えば約10 〜40 mgの範囲である。他の投与量が、患者の状態および医師の裁量で決まる他 の要因に従って、使用し得る。 本発明のシステムを用いて処置し得る腫瘍は、GDEPTまたはVDEPTシステムによ って処理し得るあらゆる腫瘍を含み、従って、いかなる特定のクラスの腫瘍にも 限定されない。特に好適な腫瘍のタイプは、乳房、結腸直腸および卵巣の腫瘍、 並びに膵臓、メラノーマ、神経膠芽腫、肝癌、小細胞肺、非小細胞肺、筋肉およ び前立腺の腫瘍を含む。 本発明のシステムは、例えば、感染症、および細胞集団の根絶を必要とする任 意の他の状態を処置するのにも使用し得る。 腫瘍の処置に関する場合、処置は、患者における腫瘍の影響を軽減するように 医師が採用する任意の手段を含む。従って、腫瘍の完全な緩解が望ましいゴール であるが、有効な処置は、腫瘍の部分的緩解を達成し得、並びに転移を含む腫瘍 の増殖速度を減速し得る任意の手段も含む。そのような手段は、生活の質を延長 および／または強化し、疾患の症状を緩和するのに有効であり得る。 以下の実施例は、本発明を説明する。 調製例１ 天然のCPG2タンパク質は、細菌細胞から細胞外環境へとそれを輸送する働きを するシグナルペプチドを含む。哺乳動物細胞からのCPG2の輸送をシグナルペプチ ドが指示しないことを確実にするために、PCR指向性部位特異的突然変異誘発(PC R directed site specific mutagenesis)を使用して、CPG2遺伝子からシグナル ペプチドを欠失させた。これは、PCRプライマー#4476： 5'＞CGC GGA TCC GCC CTG GCC CAG AAG CGC＜3' をプライマー#4477： 5'＞CGC GAA TTC CTT GCC GGC GCC CAG ATC＜3' と組合せて使用して為された。 プライマー#4476は、CPG2遺伝子のコドン21および22をBamH1制限エンドヌクレ アーゼ部位に変化させるために使用した。プライマー#4477は、コドン416（CPG2 の天然の停止コドン）をEcoR1制限エンドヌクレアーゼ部位に変化させるために 使用した。全CPG2オープンリーディングフレームを含むPCRで生じたフラグメン トが生じ、BamH1およびEcoR1で消化し、プラスミドMLVβpリンク（ダルトン(Dal ton)およびトレイスマン(Treisman)(1992)、Cell 68、597-612）のそれらの部位 にクローニングした。これ により、構造：Met-Ala-Gly-Ser-(CPG2コドン23〜415)-Glu-Phe-Leu-Glu-Ile-As pを有するCPG2タンパク質を生じ、従って、シグナルペプチドを欠いている。こ のプラスミドを、"MLVCPG2^★"と称し、それから産生されるタンパク質をCPG2^★ と称する。 CPG2が哺乳動物細胞で産生され得るかどうか決定するために、NIH3T3細胞を、 MLVCPG2^★またはコントロールとしてMLVβpリンクでトランスフェクトした。ト ランスフェクションを、脂質試薬リポフェクトアミン（(LipofectAMINE)、ギブ コビーアールエル(GibcoBRL)）を用いて行った。トランスフェクションのために 、１×10⁵個の細胞を35 mm組織培養皿にプレートし、37℃で終夜インキュベート した。翌日、リポフェクトアミン：DNA複合体を、トータルで32μｌのPBSA中で0 .4μgのプラスミドと6μｌのリポフェクトアミン試薬（ギブコ／ビーアールエル ）とを混合することにより調製し；複合体を、室温で15分間インキュベートした 。血清を含まないDMEM培地２mlで細胞を２回洗浄し、血清を含まないDMEM 0.8 m l中に置いた。リポフェクトアミン：DNA複合体を、血清を含まない培地0.2 mlに 稀釈し、細胞に加えた。細胞を、リポフェクトアミン：DNA複合体と６時間37℃ にてインキュベートし、10% ウシ胎児血清(FCS)を含むDMEM培地２mlで２回洗浄 し、 10% FCS/DMEM 2.5 ml中に置いた。さらに42時間インキュベーションした後、細 胞を５ml PBSAで２回洗浄し、組織培養皿上で50μｌの緩衝液Ａ（250mM Tris.HC l、10%v/vグリセロール、1%v/v Triton X-100、pH 7.5）に抽出した。抽出物を 、1.5 ml管に移し、マイクロフュージ管で13,000 rpmで遠心して上清を集め；BS Aを標準物としてバイオラド(Bio-Rad)タンパク質アッセイキットで、タンパク質 濃度を測定した。 タンパク質−イムノブロット分析のために、10μｌの各抽出物を、10μｌのSD Sサンプル緩衝液と混合し、タンパク質を10% SDS-ポリアクリルアミドゲル上で 分離した（ラエムリ ユー．ケー．(Laemmli U.K.)（1970）Nature 227; 680-68 5）。ゲル中のタンパク質を、電気溶出によりニトロセルロースに移し、Sf9昆虫 細胞で発現されるCPG2に対して生じたCPG2特異的ウサギ・ポリクローナル抗体を 用いて、細胞抽出物をタンパク質イムノブロッティング（ガーショニ ジェイ． エム．(Gershoni J.M.)およびパラデ ジー．イー．(Palade G.E.)（1983）Anal ．Biochemistry 131; 1-15）で分析した。抗体は、1:1000の希釈度で使用し、製 造元（アマーシャム(Amersham)）の指示に従いECLイムノブロッティングキット を使用して、免疫複合体を検出した。 抽出物はまた、CMDAプロドラッグを活性薬剤に開裂するその能力を測定するこ とによって、CPG2酵素活性についてもテストした。活性薬剤は、305 nmでの光学 密度吸光度の変化を測定することにより検出し得る。アッセイのために、緩衝液 A中に抽出された5μgのNIH3T3タンパク質を、50μM CMDAプロドラッグを含むア ッセイ用緩衝液（20 mM Tris.HCl、1mM MgCl2、60μM ZnCl2、pH 7.4）１ml中で 、37℃にて15分間インキュベートした。インキュベーション後、EDTAを最終濃度 10mMまで加え、305 nmでの吸光度の変化をモニターして、出発溶液のものと比較 した。吸光度の低下は、プロドラッグの薬剤への変換を示し、それ故に、推論的 にCPG2の存在を実証している；酵素活性は、任意の単位で表され、抽出緩衝液コ ントロールと比較される。 イムノブロット分析から、MLVCPG2^★でトランスフェクトされた細胞からの抽 出物は〜40,000の見かけ上のMrを有するタンパク質を含んでいた。該タンパク質 は、CPG2抗体によって認識されたが、MLVβpリンクでトランスフェクトされた細 胞には存在しなかった（図1A）。これらの抽出物の酵素活性が調べられたとき、 CPG2活性は、MLVCPG2^★でトランスフェクトされた細胞からの細胞抽出物中に検 出されたが、MLVβpリンクでトランスフェクトされた細 胞からの抽出物には検出されなかった（図1B）。これらのデータは、哺乳動物細 胞内でCPG2^★を、酵素的に活性な形態で発現することが可能であることを示して いる。 実施例１ 内部に発現されたCPG2^★を、プロドラッグで処理したNIH3T3細胞において細胞 死を指示する、その能力についてテストした。それぞれが、MLVβpリンクでトラ ンスフェクトされた１皿の細胞およびMLVCPG2^★でトランスフェクトされた１皿 の細胞を含む、２セットの細胞を調製した。トランスフェクションの後、細胞を 42時間インキュベートし、次に、セット１をプロドラッグ・ビヒクル（5mMHepes 、0.5%v/v DMSO、pH 7.0；最終濃度）の存在下に24時間インキュベートし、セッ ト２をCMDAプロドラッグ（0.5 mM最終濃度）の存在下に24時間インキュベートし た。プロドラッグ処理の後、細胞を新鮮な培地５mlで２回洗浄し、さらに24時間 インキュベートした。次にそれらを、新鮮な培養皿に継代し、２ml 10%FCS／DME M中、１×10⁵個の細胞／35 mm皿で播いた。さらに72時間インキュベーションし た後、細胞増殖をチミジン取込みによって評価した。チミジン取込みのために、 １μCiの[メチル−³H]チミジンを各ウェル（２ml培地）に加え、37℃にて５時間 インキュベートした。細胞を、PBSA（４℃）で ２回洗浄し、水中 5%w/vトリクロロ酢酸(TCA)を用いて、４℃にて20分間固定し た。TCAを除去し、細胞をメタノール２mlで２回洗浄し、空気乾燥した。DNAを、 １ml 0.1M NaOH、1%SDSを用いて室温で５分間抽出し、シンチレーション液４ml に加え、取込まれたチミジンをシンチレーション・カウンティングにより測定し た。 MLVCPG2^★でトランスフェクトされた細胞は、MLVβpリンクでトランスフェク トされた細胞と同じ速度で増殖し、細胞でのCPG2^★の発現がこれら細胞の増殖に 影響しなかったことを示している（図２、サンプル１、２を比較）。 コントロール細胞をCMDAで処理すると、それらの増殖速度に最小の影響しか有し なかった（図２、サンプル１、３を比較）。対照的に、CPG2^★を発現している細 胞をCMDAで処理すると、チミジン取込みの完全な阻害と細胞死が生じた（図２、 サンプル２、４を比較）。従って、これらのデータは、酵素CPG2が、NIH3T3細胞 で、これら細胞の増殖速度に影響するとは見えない活性形態で発現され得ること を示す。CPG2^★を発現する細胞が 0.5mM CMDAで24時間処理される場合、100%の 細胞が殺滅される。 調製例２ １．ベクターの構築 発現カセットを、プラスミドpEF-Bos（ミジシュマ(Mi zishuma)およびナスガタ(Nasgata)（1990）NAR 18，5322）由来の1.2kb HindIII /EcoR1フラグメントを融合することにより構築した。該プラスミドは、EF1aプロ モーター、第１エクソン、第１イントロンおよびβ-グロビン遺伝子の第２エク ソンの部分を、β-グロビン遺伝子の転写開始に対して-4の位置に含んでいる。 ポリリンカーとβ-グロビン3'非翻訳領域を含む、プラスミドMLVβ-Pリンク由来 のNco-1/HindIIIフラグメントを、β-グロビン翻訳開始を横切って位置している （翻訳開始に対して+50の位置）β-グロビン遺伝子のNco-1部位と融合して、適 切なmRNAプロセッシングのためのポリリンカーおよび3'非翻訳領域を提供した。 この全体のカセットを、pMClNeo PolyA（ストラタジーン(Stratagene)）ベク ターにクローニングしようとした。pMClNeo PolyAを先ず改変して、Neo^R遺伝子 中に位置しているNcol部位を破壊し、Neo^R遺伝子の3'末端に位置しているBamHi 、HincIIおよびSaI1部位を除去した。EF1α発現カセットを、改変されたpMC1Neo PolyAプラスミドのXho1（末端修復されていた）部位に、HindIIIフラグメント （末端修復されていた）としてクローニングした。EF1αプロモーターとTKプロ モーター（これは、Neo^R遺伝子の発現を駆動する）とを逆向きに有するベクター を、CPG2 ^★ 発現のために選択した；このベクターを、pMCEF-Pリンクと称する。CPG2^★を 、pMLVCPG2^★から、pMCEF-PリンクのNco1/Xba1部位にNco1/Xba1フラグメントと してクローニングした；このプラスミドを、pMCEFCPG2^★と称する。コントロー ルのプラスミドとして、プラスミドMLVBlacZから、pMCEF-PリンクのNco1/Xba1部 位にNco1/Xbaフラグメントとして、lacZ遺伝子もクローニングした；これをpMCE FlacZと称する。２．安定な細胞系の調製 CPG2^★を、またはコントロールとしてlacZ遺伝子産物（β-ガラクトシダーゼ ）を構成的に発現するNIH3T3細胞を用いて、安定な細胞系を調製した。これを行 なうために、NIH3T3細胞を、調製例１に記載されるようにpMCEF-CPG2^★またはpM CEFlacZでトランスフェクトし、トランスフェクションから２日後に、G418を1mg /mlで含む培地に、細胞を低密度でプレートした。単一細胞から生じるコロニー は、約２週間後に観察されることができ、これらは個々にクローン化され、増殖 された。CPG2^★の発現は、G418耐性コロニーのそれぞれからの細胞抽出物（調製 例１に記載されるように抽出された）30μｌを、CPG2特異的ポリクローナル抗体 を用いるイムノプロテインブロッティングにより測定した。高レベルのCPG2^★を 発現する細胞 系#9（図3A）および、β-ガラクトシダーゼを発現する細胞系#3（下記参照）を 、さらなる調査のために選択した。CPG2^★およびβ-ガラクトシダーゼの発現は 、酵素アッセイによって細胞系で実証された。これらのアッセイのために、#3系 および#9系に関する１×10⁵個の細胞を、35 mm組織培養皿にプレートし、４日間 インキュベートした。細胞抽出物を、調製例１に記載されるように調製し、タン パク質５μgをCMDA分解アッセイおよびβ-ガラクトシダーゼ・アッセイにかけた （CMDAアッセイは、調製例１に記載されている）。細胞中のβ-ガラクトシダー ゼ活性のアッセイのために、抽出したタンパク質５μgをアッセイ用緩衝液（40m M Na₂PO₄、26.7mM NaH₂PO₄、6.7mMKCL、1mMMgSO₄、25mM 2-メルカプトエタノー ル、50mM Tris.HCL、0.06%v/v Triton X-100、2.2mM o-ニトロフェニルβ-D-ガ ラクトピラノシド）600μｌに加え、37℃にて60分間インキュベートした。1MNa₂ CO₃ 250μｌをサンプルに加え、OD₄₂₀を測定した。図3Bおよび3Cの結果は、系#3 （白抜き棒）からの抽出物が高レベルのβ-ガラクトシダーゼ活性を含むが、CPG 2活性を含まないことを示す。系#9からの抽出物は、いかなる検出可能なβ-ガラ クトシダーゼ活性も含まないが、検出可能なレベルのCPG2活性は含むことを示す 。 実施例２ 調製例２で得られた細胞系#3および#9を、CMDAプロ−ドラッグを用いて、細胞 障害性についてテストした。１×10⁵個の細胞を、24ウェル皿の各ウェルにプレ ートし、40時間インキュベートし、次にCMDA濃度を増加させながら、37℃にて60 分間処理した。さらに６時間インキュベーションした後、細胞の10%を24ウェル 皿に再プレートし、さらに５日間インキュベートし、細胞生存度を[³H]-チミジ ン取込みにより測定した。図４の結果は、細胞系#3（黒塗りの記号）が、テスト されたCMDAの最高濃度に対してさえ感受性でないが、細胞系＃9（白抜きの記号 ）が、用量依存性に感受性であり、- 125μMのIC50を示すことを示している。 実施例３ 調製例２で得られた細胞系＃3および＃9を表示されている種々の濃度で混合す ることにより、バイスタンダー効果を測定し、トータルで１×10⁵個の細胞を24 ウェル・プレートの各ウェルにプレートし、終夜インキュベートした。細胞を、 表示されているように250μM CMDAで60分間処理し、細胞生存度を実施例２のよ うに測定した。図５の結果は、これらの条件では、全細胞集団の僅か5%がCPG2^★ を発現するとき、細胞の95%以上が殺滅されることを 示しており；従って、このシステムには実質的なバイスタンダー効果があること が明示される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９６年７月１７日 【補正内容】 請求の範囲 １． (a)細胞内で発現されるカルボキシペプチダーゼをコードするベクター； および(b)該カルボキシペプチダーゼによって活性な薬剤に変換され得るナイト ロジェンマスタード・プロドラッグを含み、該ナイトロジェンマスタード・プロ ドラッグがパラ-N-ビス（2-クロロエチル）アミノベンゾイルグルタミン酸以外 のものである、遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法のための２成分システム。 ２． 酵素が細菌カルボキシペプチダーゼである請求項１に記載のシステム。 ３． カルボキシペプチダーゼがカルボキシペプチダーゼCPG2である請求項２に 記載のシステム。 ４． ナイトロジェンマスタード・プロドラッグが4-[(2-クロロエチル)(2-メシ ルオキシエチル)アミノ]ベンゾイル-L-グルタミン酸である請求項１〜３のいず れか１つに記載のシステム。 ５． ベクターが組織に限定される様式で発現され得るプロモーターを含む請求 項１〜４のいずれか１つに記載のシステム。 ６． プロモーターがcerbB2プロモーターである請求項５に記載のシステム。 ７． ヒトまたは動物の身体の処置または治療方法で使 用するための請求項１〜６のいずれか１つに記載のシステム。 ８． 処置を必要としている患者の腫瘍を処置する方法であって、細胞内で発現 され得るカルボキシペプチダーゼ酵素をコードするベクターおよび該酵素によっ て活性な薬剤に変換され得るナイトロジェンマスタード・プロドラッグの有効量 を該患者に投与することを包含し、該ナイトロジェンマスタード・プロドラッグ がパラ-N-ビス(2-クロロエチル)アミノベンゾイルグルタミン酸以外のものであ る方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 31/13 Ｃ１２Ｎ 5/10 35/76 9/48 37/54 ＡＤＵ 15/09 ＺＮＡ 37/64 ＡＧＢ // Ａ６１Ｋ 31/13 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 35/76 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 マライス リチャード イギリス国 エスダブリュ３ ６ジェイビ ー ロンドン フルハム ロード 237 ザ インスティテュート オブ キャンサ ー リサーチ チェスター ビーティ ラ ボラトリーズ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． (a)細胞内で発現されるカルボキシペプチダーゼをコードするベクター； および(b)該カルボキシペプチダーゼによって活性な薬剤に変換され得るプロド ラッグを含む、遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法のための２成分システム。 ２． 酵素が細菌カルボキシペプチダーゼである請求項１に記載のシステム。 ３． カルボキシペプチダーゼがカルボキシペプチダーゼCPG2である請求項２に 記載のシステム。 ４． プロドラッグがナイトロジェンマスタード・プロドラッグである請求項１ 〜３のいずれか１つに記載のシステム。 ５． ベクターが組織に限定される様式で発現され得るプロモーターを含む請求 項１〜４のいずれか１つに記載のシステム。 ６． プロモーターがc-erbB2プロモーターである請求項５に記載のシステム。 ７． ヒトまたは動物の身体の処置または治療方法で使用するための請求項１〜 ６のいずれか１つに記載のシステム。 ８． 処置を必要としている患者の腫瘍を処置する方法 であって、細胞表面に発現され得る酵素をコードするベクターおよび該酵素によ って活性な薬剤に変換され得るプロドラッグの有効量を該患者に投与することを 包含する方法。