ES2204935T3 - Nuevas enzimas y profarmacos para adept. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A MEJORAS EN UNA TERAPIA CON PROFARMACOS DE ENZIMAS OBJETIVO INCLUIDA UNA TERAPIA CON PROFARMACOS DE ENZIMAS DIRIGIDOS A ANTICUERPOS (ADEPT), Y EN PARTICULAR SE REFIERE A NUEVAS ENZIMAS Y PROFARMACOS A UTILIZAR EN UNA ADEPT.
Description
Nuevas enzimas y profármacos para ADEPT.
La presente invención se refiere a mejoras en la
terapia de enzimas-profármacos dirigidos, incluyendo
la terapia de enzimas-profármacos dirigidos por
anticuerpos (ADEPT), y particularmente se refiere a nuevas enzimas
y profármacos para uso en ADEPT.
En la terapia de ciertas afecciones, es
preferible suministrar el fármaco sólo a una subpoblación
particular de células. Por ejemplo, el uso de fármacos en el
tratamiento de cánceres está limitado por la incapacidad del fármaco
citotóxico de diferenciar entre las células que presentan una
división celular normal y las que presentan una división
neoplásica. Por lo tanto, la terapia no está dirigida en un grado
clínicamente aceptable y las células sanas se exponen a la
citotoxina. La conjugación de un fármaco con un anticuerpo,
preferiblemente un anticuerpo monoclonal (mAb), permite dirigir el
fármaco a una subpoblación celular particular que expresa el
determinante antigénico al que se une el anticuerpo de dirección.
Sin embargo, ciertos factores tales como la incapacidad del
conjugado de penetrar en el tejido relevante, la deficiente
liberación del fármaco desde el conjugado unido al antígeno y la
limitación puesta sobre la cantidad de fármaco que puede
suministrarse por el número de sitios de unión a anticuerpos
disponibles, han limitado la eficacia de esta estrategia.
La intención de evitar tales limitaciones condujo
al concepto de dirección de conjugados de anticuerpos y enzimas
capaces de convertir "profármacos" relativamente no
citotóxicos en citotoxinas de bajo peso molecular en el sitio de
unión al anticuerpo. Este concepto general se describió por Rose en
la solicitud de Patente Europea 84302218.7. Bagshawe y
colaboradores se han denominado el concepto ADEPT, Terapia de
Enzima-Profármaco Dirigido por Anticuerpo (Bagshawe
K.D. et al., Br. J. Cancer [1987] 56;
531-532, Bagshawe K.D. et al., Br. J. Cancer
[1988] 50, 700-703 y documento WO 90/10140).
De esta forma, un conjugado podría generar una cantidad
proporcionalmente mayor de fármaco en el sitio diana por medio de
vueltas repetidas de catálisis enzimática de activación del
profármaco.
El documento EP 382 411 describe una ADEPT donde
un profármaco puede convertirse en un agente citotóxico por enzimas
que incluyen beta-lactamasas aisladas a partir de
diversos microorganismos, L-piroglutamato
aminopeptidasa, beta-galactosidasa,
D-aminoácido peptidasa, isoenzimas de fosfatasa
alcalina y diversas carboxipeptidasas.
El documento WO 91/11201 describe una ADEPT donde
un profármaco puede escindirse enzimáticamente para generar cianuro
por \beta-glicosidasas o
\beta-glucosidasas, generalmente de origen
vegetal.
El documento EP 302 473 describe una ADEPT donde
la enzima fosfatasa alcalina puede usarse para escindir nuevos
profármacos de mitomicina, la penicilina V amidasa puede usarse
para escindir nuevos profármacos de adriamicina, o la citosina
desaminasa puede usarse con el profármaco
5-fluorocitosina.
El documento EP 484 870 describe una ADEPT donde
puede usarse \beta-lactamasa para activar un
profármaco de cefalosporina para producir una mostaza nitrogenada
citotóxica.
El documento WO 88/07378 describe una ADEPT donde
glutamidas de mostaza nitrogenada de ácido benzoico pueden
convertirse en la mostaza nitrogenada bajo la acción de
carboxipeptidasas.
Vitols, K.S. et al., Pteridines 3
[1992], 125-126, describe varios profármacos de
MTX-aminoácido que pueden activarse por conjugados
de carboxipeptidasa-mAb como parte de una
ADEPT.
El documento WO 91/09134 describe mAb híbridos
biespecíficos para uso en una ADEPT, teniendo el mAb
especificidades tanto contra antígenos de células cancerosas
humanas como contra la enzima activadora del profármaco.
Otros documentos a considerar son
EP-A-0423818 y
EP-A-0633029 (este último sólo es
relevante de acuerdo con el Art. 54(3) EPC).
Todos los métodos descritos previamente de ADEPT
pueden dividirse en dos categorías: los que emplean enzimas humanas
y los que emplean enzimas no humanas (por ejemplo bacterianas) para
activar el profármaco relevante. Las dos estrategias retienen
problemas intrínsecos que limitan su potencial para proporcionar
una terapia eficaz. El uso de una enzima humana ocasiona la
inestabilidad del profármaco asociado in vivo, ya que puede
activarse en sitios lejanos del sitio diana donde puede producirse
de forma natural la actividad enzimática humana endógena.
Claramente, esto también tendrá el efecto muy indeseable de generar
compuestos potencialmente citotóxicos en áreas no dirigidas del
cuerpo con consecuencias posiblemente letales. El uso de una enzima
no humana permite que el profármaco asociado, que sólo se activa
por la actividad enzimática no humana, evite la activación por
enzimas endógenas y de esta forma permanezca estable in vivo
hasta que se convierta en el fármaco en el sitio diana. Sin
embargo, tal enzima no humana puede inducir una respuesta inmune
cuando se introduce in vivo y los anticuerpos generados
contra la enzima limitarán o destruirán su capacidad de activar el
profármaco.
El documento WO 90/07929 identifica la aspiración
de una actividad catalítica no endógena que se proporcione por una
enzima no inmunogénica, pero sólo enseña que esto puede conseguirse
por medio del uso de enzimas "conservadas genéticamente" o las
de una "especie genéticamente similar". Sin embargo, no se
enseña cómo puede lograrse.
Ahora se ha descubierto que el conflicto aparente
que surge de la necesidad de proporcionar un profármaco que sea
estable in vivo y que se active por una enzima no
inmunogénica puede resolverse por la generación de una enzima
mutante de mamífero que retenga la actividad catalítica pero que
posea una nueva especificidad de sustrato. El profármaco asociado
puede activarse por la actividad catalítica de la enzima mutante,
pero como la especificidad de sustrato de la enzima mutante no es
una que se produzca de forma natural, el profármaco sigue siendo
estable in vivo hasta que se convierta en el fármaco en el
sitio diana. La capacidad de usar una enzima no inmunogénica de
acuerdo con la presente invención proporciona la ventaja adicional
de que pueden administrarse ciclos repetidos de terapia. Esto se
diferencia de los procesos conocidos para ADEPT, en los que la
introducción inicial de la enzima en el sistema induce una
respuesta inmune que impide eficazmente un tratamiento adicional
con la misma enzima, ya que ésta se eliminará del cuerpo por una
reacción inmune "cebada" durante el primer ciclo de
terapia.
Un aspecto de la presente invención se refiere a
la dirección de un agente quimioterapéutico a un tipo celular
específico de un mamífero de (i) una cantidad eficaz de un
conjugado de una molécula de dirección específica para un tipo
celular con una enzima mutante de mamífero capaz de catalizar un
precursor funcionalmente inactivo de un agente quimioterapéutico a
su forma activa y (ii) una cantidad eficaz del precursor
funcionalmente inactivo del agente quimioterapéutico que sea
resistente a la catálisis endógena para dar el agente
quimioterapéutico.
La catálisis endógena implica la conversión de un
precursor funcionalmente inactivo de un agente quimioterapéutico en
el agente quimioterapéutico por enzimas presentes naturalmente
in vivo. Claramente, la conversión que se produce en el
sitio diana, catalizada por la enzima mutante de mamífero dirigida,
no se considera catálisis endógena.
Otro aspecto de la presente invención
proporciona, para un mamífero que requiere terapia para cualquiera
de las afecciones descritas más adelante, para la preparación de un
medicamento para uso en la administración al mamífero, una cantidad
eficaz de una molécula de dirección específica para un tipo celular
conjugada con una enzima mutante de mamífero que es capaz de
catalizar la conversión de un precursor funcionalmente inactivo de
un fármaco en su forma activa, en combinación con una cantidad
eficaz de un precursor funcionalmente inactivo del fármaco que es
resistente a la catálisis endógena.
Una enzima humana mutante como se usa en este
documento se considerará cualquier enzima humana con una secuencia
diferente en al menos un aminoácido de la secuencia o secuencias de
aminoácidos de esa enzima en el paciente al que se aplica la
terapia.
Como se usa en este documento, la expresión
"tipo celular" significa cualquier población localizada o
dispersa de células que poseen un determinante común esencialmente
selectivo para un estado patológico, por ejemplo, células
cancerosas que expresan el antígeno carcinoembriónico,
Tag-72, mucina, o los antígenos reconocidos por los
anticuerpos Ing-1, 17-1A, 323/A3,
NR-LU-10, c174, PR.1A3, MOV18,
G250, U36, E48, NR-CO-02 o
cualquiera de los otros antígenos mostrados en la tabla 3.
La molécula de dirección específica de tipo
celular puede ser cualquier molécula capaz de unirse de forma
covalente o no covalente o conjugarse con la enzima mutante y que
puede demostrar una selectividad en su afinidad de unión por
marcadores de la superficie celular. Tales moléculas incluyen
anticuerpos policlonales y monoclonales, incluyendo anticuerpos
biespecíficos en los que un brazo del anticuerpo se une de forma no
covalente a la enzima mutante y el otro se dirige específicamente
al tipo celular (U. Sahin et al., Cancer Research 50, 6944,
1990).
Otras moléculas de dirección alternativas que
pueden unirse a enzimas mutantes de mamífero para formar conjugados
incluyen hormonas, ligandos, citoquinas, antígenos,
oligonucleótidos y peptidomiméticos.
La elección de la molécula de dirección
dependerá de la naturaleza de las células diana, pero lo más
probable es que sea un anticuerpo y preferiblemente un anticuerpo
monoclonal tal como mAb, que produce la mayor selectividad.
Un "agente quimioterapéutico", que también
puede denominarse en este documento "fármaco", incluye
cualquier molécula que tenga actividad en terapia humana. Tales
agentes quimioterapéuticos incluyen, pero sin limitación,
compuestos citostáticos o citotóxicos usados en la terapia de
cánceres o de infecciones virales. Un "precursor funcionalmente
inactivo", que también puede denominarse en este documento un
"profármaco", incluye cualquier compuesto que pueda
convertirse en un agente quimioterapéutico bajo la acción de una
enzima. Tales precursores funcionalmente inactivos pueden
convertirse típicamente en un agente quimioterapéutico por la
escisión enzimática del precursor funcionalmente inactivo para
producir un agente quimioterapéutico y un "resto de
profármaco". Tal conversión de un precursor funcionalmente
inactivo en un agente quimioterapéutico también puede realizarse
por isomerización mediada enzimáticamente.
Un precursor funcionalmente inactivo generalmente
no presentará niveles clínicamente significativos de la actividad
terapéutica que posee el agente quimioterapéutico en el que puede
convertirse enzimáticamente, habiéndose modificado químicamente
para reducir su actividad farmacológica normal. El precursor
funcionalmente inactivo de un agente quimioterapéutico citotóxico no
presentará por sí mismo una citotoxicidad clínicamente
significativa y será suficientemente estable in vivo de tal
forma que durante la terapia, sólo se genere un nivel clínicamente
significativo de citotoxicidad en el sitio de conversión del
precursor funcionalmente inactivo en el agente quimioterapéutico, es
decir, en el sitio al que se ha dirigido la enzima mutante.
La enzima mutante de mamífero preferiblemente es
una enzima de mamífero de tipo silvestre con una o más mutaciones
que generan nuevas especificidades de sustrato sin producir una
respuesta inmunológica significativa cuando se administra durante
una terapia humana. Puede considerarse una respuesta inmunológica
significativa una respuesta que impida el uso clínico de tal enzima
en terapia humana.
La característica esencial de una enzima mutante
de mamífero de la presente invención es la presencia de un sitio
mutante de unión a un sustrato independientemente de las secuencias
de aminoácidos que flanquean este sitio mutante de unión al
sustrato. Por lo tanto, dentro de las definiciones de una enzima
mutante de mamífero de la presente invención se incluye una enzima
quimérica que comprende un sitio mutante de unión al sustrato y
secuencias flanqueantes derivadas de una o más enzimas diferentes.
Tal enzima quimérica puede generarse por la tecnología de ADN
recombinante y/o ingeniería genética de proteínas.
Las enzimas adecuadas para la mutagénesis
dirigida incluyen cualquier enzima que posea una actividad
catalítica capaz de convertir un profármaco en un fármaco. Tales
actividades catalíticas incluyen transferasa, hidrolasa,
óxido-reductasa, isomerasa, liasa o ligasa. La
mutagénesis dirigida generará una nueva especificidad de sustrato,
pero conservará la clase de actividad catalítica implicada. Por
ejemplo, una isomerasa mutante de la presente invención poseerá una
nueva actividad isomerasa suficientemente diferente de la isomerasa
a partir de la que se obtuvo para asegurar que los profármacos
susceptibles de activación por la isomerasa mutante siguen siendo
sustancialmente estables en presencia de la isomerasa a partir de la
cual se obtuvo la enzima mutante. Como se mostrará, este cambio
dramático en la actividad puede conseguirse por la alteración de
tan sólo un resto en el sitio catalítico. La alteración del número
mínimo de restos necesarios para obtener el cambio requerido de
actividad asegura la continuidad de la estructura de la enzima y,
por lo tanto, evita efectos inmunológicos negativos cuando la enzima
mutante se introduce en el cuerpo.
Una enzima mutante preferida de la presente
invención es la carboxipeptidasa A (CPA) mutante de mamífero. Esta
enzima tiene la actividad general de escindir restos aminoacídicos
aromáticos y alifáticos carboxi-terminales y se ha
caracterizado en una diversidad de especies y variantes específicas
de tejidos. Las carboxipeptidasas mutantes particularmente
preferidas incluyen mutantes derivados de la carboxipeptidasa A1
pancreática humana (Catasus L. et al., Biochem. J.
287, 299-303, 1992), la carboxipeptidasa A
de mastocitos humanos (Reynolds D.S. et al., J. Clin. Invest.
89 273-282, 1992) y la carboxipeptidasa A2
pancreática humana (Fig. 9, presentada más adelante). Se apreciará
que la característica común de estas carboxipeptidasas es la
presencia de una cavidad de unión al sustrato parecida a la de la
CPA y una actividad enzimática asociada independientemente de la
secuencia o estructura global de la enzima y que cualquier enzima
que posea esta cavidad de unión al sustrato de tipo CPA es
susceptible de experimentar mutación para dar una carboxipeptidasa
mutante de la presente invención.
En una realización particularmente preferida de
la presente invención, la enzima mutante es la carboxipeptidasa A1
o A2 (CPA1 o CPA2) pancreática humana mutante y, aún más
preferiblemente, CPA1 o CPA2 donde se han generado sustituciones de
aminoácidos en uno o más de los restos 203, 210, 242, 244, 250,
253, 255, 267, 268, 269 y 305, de las secuencias de aminoácidos
mostradas en la Tabla 4, que representan las secuencias de tipo
silvestre (w.t.) de CPA1 y CPA2 respectivamente. Las combinaciones
particularmente preferidas de sustituciones de restos incluyen Gly
en los restos 250 y 268 cuando los restos 253 y 255 son w.t.; Gly
en 253 y 268 cuando 250 y 255 son w.t.; Gly en 250 e His en 268
cuando 253 y 255 son w.t.; Gly en 250 cuando 253, 255 y 268 son
w.t.; Ala en 255 e His en 268 cuando 250 y 253 son w.t. e His en
268 cuando 250, 253 y 255 son w.t.. Los mutantes más preferidos son
mutantes de carboxipeptidasa A1 o A2 que comprenden una sola
sustitución; Gly en 268.
El conjugado más preferido de la presente
invención comprende todo o parte de los mAb
CAMPATH-1H®, 323/A3 o ING-1 y al
menos el dominio de unión al sustrato de las enzimas mutantes de
mamífero CPA1 o CPA2 que tienen glicina en la posición de
aminoácido 268 como se describe en la Tabla 5.
La carboxipeptidasa A pancreática humana se
expresa como una preproenzima (Fig. 2) que se procesa hasta un
proenzima y posteriormente hasta la enzima madura. Las
carboxipeptidasas mutantes de la presente invención pueden ser
mutantes de la preproenzima, la proenzima o de la enzima madura,
pero preferiblemente son mutantes de la enzima madura. Estos
mutantes pueden obtenerse a partir de la preproenzima, la proenzima
o la enzima madura, pero preferiblemente se obtienen a partir de la
proenzima. La proenzima mutada (o preproenzima) después puede
convertirse en la correspondiente enzima madura mutante por métodos
convencionales tales como tripsinización.
Una enzima mutante de la presente invención puede
generarse a partir de la fuente de ADN o ARN de cualquier enzima que
posea las actividades descritas previamente por métodos bien
conocidos en la técnica de biológica molecular y, más
particularmente, por los métodos descritos más adelante en los
Ejemplos.
La selección de la actividad enzimática y la
secuencia primaria de una enzima mutante de la presente invención
dependerá claramente de la naturaleza del profármaco relevante y,
si es un profármaco del tipo que se activa por la eliminación de un
resto de profármaco, de la naturaleza precisa de ese resto.
El sitio de unión al sustrato o sitio activo de
la enzima mutante, a diferencia del de la enzima no mutante
correspondiente, debe ser capaz de interaccionar con el profármaco
de tal forma que se facilite la catálisis enzimática. La capacidad
de la enzima mutante de realizar esta actividad dependerá de
sutiles alteraciones en la estructura tridimensional del sitio
activo, que a su vez depende de la secuencia de aminoácidos primaria
de esta región de la proteína. Las alteraciones de la secuencia
primaria de una enzima por técnicas convencionales de ingeniería
genética de proteínas permitirá la generación de una enzima mutante
apropiada para uso de acuerdo con la invención con un profármaco
correspondiente.
Los nuevos profármacos comprenden aquellos de
fórmula (II)
en la
que,
X representa NH u O y
R^{2} representa CO_{2}H, SO_{3}H,
SO_{2}H, OSO_{3}H, PO_{3}H_{2}, OPO_{3}H_{2}, CO_{2}H
esterificado con alquilo C_{1-6}, PO_{3}H_{2}
esterificado con alquilo C_{1-6}, alquilo
C_{4-12}, alquenilo C_{4-12},
alquinilo C_{4-12}, alquilo
C_{4-12} ramificado, alquilo
C_{1-8} o alquilo C_{3-8}
ramificado; sustituidos con CO_{2}H, SO_{3}H, SO_{2}H,
OSO_{3}H, PO_{3}H_{2}, OPO_{3}H_{2}, CO_{2}H
esterificado con alquilo C_{1-6}, PO_{3}H_{2}
esterificado con alquilo C_{1-6}, hidroxilo,
alcoxi, halo, haloalquilo, ciano o carboxamida; cicoalquilo
C_{3-8}, arilo o heteroarilo opcionalmente
sustituido con alquilo C_{1-8}, alquilo
C_{3-8} ramificado, cicloalquilo
C_{3-8}, alquenilo C_{3-6},
alquinilo C_{2-6}, cicloalquenilo
C_{4-6}, sililo trisustituido, es decir,
(R^{13})(R^{14})(R^{15})Si, donde R^{13}, R^{14} y
R^{15} son alquilo C_{1-6}, alquilo
C_{3-6} ramificado, cicloalquilo
C_{3-6}, alquenilo C_{3-6},
alquinilo C_{2-6}, cicloalquenilo
C_{4-6}, arilo o heteroarilo, y donde cada uno de
R^{13}, R^{14} y R^{15} son el mismo grupo o grupos
diferentes (por ejemplo, trimetilsililo,
terc-butildimetilsililo, ciclohexildimetilsililo o
fenildimetilsililo), arilo, CO_{2}H, SO_{3}H, SO_{2}H,
OSO_{3}H, PO_{3}H_{2}, OPO_{3}H_{2}, CO_{2}H
esterificado con alquilo C_{1-6}, PO_{3}H_{2}
esterificado con alquilo C_{1-6}, carboxamida,
hidroxilo, alcoxi C_{1-6}, alquiltio
C_{1-6}, mercapto, halo, haloalquilo, nitro o
ciano, R^{2a} y R^{2b} representan H, hidroxi, mercapto,
alcoxi, alquiltio, halo, ciano, CO_{2}H, SO_{3}H, SO_{2}H,
OSO_{3}H, PO_{3}H_{2}, OPO_{3}H_{2}, CO_{2}H
esterificado con alquilo C_{1-6}, carboxamida,
PO_{3}H_{2} esterificado con alquilo C_{1-6},
C_{2-6} cíclico [es decir, R^{2a} y R^{2b}
conjuntamente representan
(CH_{2})_{2-6}], sililo trisustituido, es
decir (R^{13})(R^{14})(R^{15})Si, donde R^{13},
R^{14} y R^{15} son alquilo C_{1-6}, alquilo
C_{3-6} ramificado, cicloalquilo
C_{3-6}, alquenilo C_{3-6},
alquinilo C_{2-6}, cicloalquenilo
C_{4-6}, arilo o heteroarilo y donde R^{13},
R^{14} y R^{15} pueden ser el mismo grupo o grupos diferentes,
por ejemplo, trimetilsililo,
terc-butildimetilsililo, ciclohexildimetilsililo o
fenildimetilsililo; o alquilo C_{1-6} o alquilo
C_{1-6} ramificado o cicloalquilo
C_{1-6} o arilo o heteroarilo opcionalmente
sustituidos con hidroxi, mercapto, alcoxi C_{1-6},
alquiltio C_{1-6}, halo, ciano, CO_{2}H,
SO_{3}H, SO_{2}H, OSO_{3}H, nitro, PO_{3}H_{2},
OPO_{3}H_{2}, CO_{2}H esterificado con alquilo
C_{1-6}, carboxamida, PO_{3}H_{2}
esterificado con alquilo C_{1-6}, alquilo
C_{1-6}, alquilo C_{1-6}
ramificado, cicloalquilo C_{1-6}, sililo
trisustituido, es decir, (R^{13})(R^{14})(R^{15})Si,
donde R^{13}, R^{14} y R^{15} son alquilo
C_{1-6}, alquilo C_{3-6}
ramificado, cicloalquilo C_{3-6}, arilo o
heteroarilo, y donde R^{13}, R^{14} y R^{15} pueden ser el
mismo grupo o grupos diferentes, por ejemplo, trimetilsililo,
tercbutildimetilsililo o fenildimetilsililo; con la condición de
que R^{2a} y R^{2b} no sean ambos hidroxi o mercapto.
F comprende un resto de fórmula (IV)
en la que R^{1} representa un grupo que
corresponde a la cadena lateral de cualquier
\alpha-aminoácido, por ejemplo, H, alquilo
C_{1-6}, alquenilo C_{1-6},
alquinilo C_{1-6} opcionalmente sustituido con
CO_{2}H, CO_{2}H esterificado con alquilo
C_{1-6}, OPO_{3}, PO_{3}H_{2},
PO_{3}H_{2} esterificado con alquilo C_{1-6},
halo, hidroxi, carboxamida, amino opcionalmente sustituido con
alquilo C_{1-6}, ciano o
nitro.
\newpage
E representa
cada uno de los cuales puede estar opcionalmente
sustituido con uno o más de hidroxi, uno o más de alcoxilo, halo o
alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido con uno
o más de hidroxi, alcoxi C_{1-6} o
halo.
D representa
-CH_{2}-CH(R^{3})-,
-CH_{2}-NR^{3}-,
-NR^{3}-CH_{2}-, -CH_{2}S- o -CH_{2}O-,
donde R^{3} es H, alquilo C_{1-6}, alilo o
propargilo, opcionalmente sustituidos con uno o más de alcoxi
C_{1-6}, halo, hidroxi o ciano; y
B representa
donde,
R^{4} representa H, alquilo
C_{3-6} ramificado, cicloalquilo
C_{3-6}, o alquilo C_{1-6};
R^{5} representa alquilo
C_{1-6}, alquilo C_{3-6}
ramificado, cicloalquilo C_{3-6}, amino
(opcionalmente sustituido con alquilo C_{1-6},
alcanoílo C_{1-6} o bencilo);
R^{6} representa H, alquilo
C_{1-6}, alquilo C_{3-6}
ramificado, cicloalquilo C_{3-6}, amino
(opcionalmente sustituido con alquilo C_{1-6},
alcanoílo C_{1-6} o bencilo), alcoxilo
C_{1-6} o alquiltio C_{1-6};
y
R^{7} representa H, alquilo
C_{1-6}, alquilo C_{3-6}
ramificado, cicloalquilo C_{3-6}, haloalquilo
C_{1-6} o halo;
y sales, N-óxidos, solvatos y derivados
fisiológicamente funcionales de los mismos;
con la condición de que los siguientes compuestos
no estén incluidos dentro de la definición de los nuevos
profármacos, ya que el uso de estos compuestos en terapia no forma
una realización de la presente invención:
ácido
N-(N-(4-(((2-amino-3,4-dihidro-4-oxo-6-quinazolinil)metil(2-propinil)amino)-benzoil)-L-glutam-1-il)-L-
glutámico,
glutámico,
ácido
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-L-glutámico,
ácido
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-L-aspártico,
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-L-fenilalanina,
4-bis(2-cloroetil)amino)-fenilalanilfenilalanina
y
4-bis(2-cloroetil)amino)-fenilalanil-3,5-dimetil-4-metoxifenilalanina
En una realización preferida de profármacos de
acuerdo con la presente invención,
X es NH;
R^{2} es cicloaquilo C_{3-8}
o arilo sustituido con alquilo C_{1-8},
cicloalquilo C_{3-8}, alquilo
C_{3-9} ramificado o sililo trisustituido, es
decir, (R^{13})(R^{14})(R^{15})Si, donde R^{13},
R^{14} y R^{15} son alquilo C_{1-6}, alquilo
C_{3-6} ramificado, cicloalquilo
C_{3-6}, arilo o heteroarilo, y donde cada uno de
R^{13}, R^{14} y R^{15} es el mismo grupo o grupos diferentes
(por ejemplo, trimetilsililo, tercbutildimetilsililo,
ciclohexildimetilsililo, o fenildimetilsililo);
R^{2a} y R^{2b} son ambos H;
R^{1} es H, alquilo C_{1-6},
CH_{2}CO_{2}H, CH_{2}CH_{2}CO_{2}H o
CH_{2}CH_{2}CH_{2}NH_{2},
E es
D es -CH_{2}NH-, -CH_{2}N(CH_{3})-,
-CH_{2}N(CH_{2}C\equivCH)-, -CH_{2}CH_{2}- o
-CH_{2}-CH(C_{2}H_{5})-
y B es
y sales, N-óxidos, solvatos y derivados
fisiológicamente funcionales de los
mismos.
En la realización más preferida de profármacos de
acuerdo con la presente invención,
X es NH;
R^{2} es fenilo o
para-hidroxifenilo sustituido con ciclopentilo,
ciclobutilo o terc-butilo. Los grupos ciclopentilo,
ciclobutilo y terc-butilo pueden estar en posición
orto o meta, pero preferiblemente están en posición meta, R^{2a} y
R^{2b} son H,
R^{1} es CH_{2}CH_{2}CO_{2}H
E es
D es
y B
es
y sales, N-óxidos, solvatos y derivados
fisiológicamente funcionales de los
mismos.
\newpage
Cuando están presentes centros quirales de los
profármacos como se han definido anteriormente pueden estar,
independientemente, en la configuración S o R o pueden ser una
mezcla de la configuración S y R. Preferiblemente están en la
configuración S para "F" y el átomo de carbono quiral de
fórmula (II) adyacente a X.
Un profármaco preferible de acuerdo con la
presente invención es un profármaco del agente citotóxico melfalan
(documento UK 750.155), que está disponible en el mercado bajo el
nombre comercial Alkeran (T.M. The Wellcome Foundation Limited) y
tiene el nombre químico
4-[bis(2-cloroetil)amino]-1-fenilalanina.
Los profármacos de melfalan de acuerdo con la presente invención
tienen la fórmula general
en la que R^{2}, R^{2a}, R^{2b} y X son
como se han definido anteriormente en este
documento.
Los siguientes son nuevos profármacos
particularmente preferidos de acuerdo con la presente
invención:
N-((S)-4-carboxi-2-(5-(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(F)quinazolin-9-il)metil)amino)-1-oxo-2-isoindolinil)butanoil)-L-fenilalanina,
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-2-ciclopentil-L-fenilalanina,
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-fenilalanina,
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclobutil-L-fenilalanina,
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-trimetilsilil-L-fenilalanina,
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-terc-butil-L-fenilalanina,
N-(4-((3-(2,4-diamino-1,6-dihidro-6-oxo-5-pirimidinil)propil)amino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-fenilalanina,
N-(4-(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(F)quinazolin-9-il)metil)amino)-2-fluorobenzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclo-
pentil-L-fenilalanina,
pentil-L-fenilalanina,
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil-metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-tirosina,
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3,5-diyodo-L-tirosina,
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-2-ciclopentil-L-tirosina,
ácido
(S)-3-(3-ciclopentil-4-hidroxifenil)-2-((N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)-metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il)oxi)propiónico,
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-terc-butil-L-tirosina
y sales, N-óxidos, solvatos y derivados
fisiológicamente funcionales de los mismos.
El profármaco más preferido de acuerdo con la
presente invención es:
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-tirosina.
Cualquier centro quiral de cualquiera de las
estructuras químicas de los compuestos descritos en es documento
pueden estar en configuración R y S. Aunque estos centros quirales
de las estructuras químicas mostradas más adelante se representan en
la configuración preferida S, se entiende que las estructuras
químicas correspondientes que tienen los centros quirales en la
configuración R, así como las mezclas enantioméricas y
diastereoméricas de estos compuestos, también se consideran como
parte de la invención.
Un profármaco de fórmula (V), en la que B, D y E
son como se han definido en la fórmula (III) y X, R^{1} y R^{2}
son como se han definido en las fórmulas (IV) y (II),
pueden prepararse por hidrólisis de un éster de
fórmula (VI); en la que R^{8} es alquilo, alquilo ramificado o un
grupo cicloalquilo tal como metilo, etilo,
terc-butilo o ciclohexilo; o un grupo arilo tal como
fenilo, 2,6-dimetilfenilo; bencilo (opcionalmente
sustituido con halo, alcoxi o grupos alquilo tales como metilo o
tercbutilo); o 9-fluorenilmetilo (Fm); normalmente
en presencia de una base, tal como NaOH, LiOH; o, en el caso en el
que R^{8} es Fm, dietilamina o piperidina; o en presencia de un
ácido tal como HCl o ácido trifluoroacético; en un disolvente o
mezcla de disolventes tal como THF, nitrometano o THF:H_{2}O; a
una temperatura de por ejemplo 0ºC a la temperatura de reflujo,
convenientemente a temperatura ambiente; o en presencia de un
ácido, tal como HCl o ácido
trifluoroacético;
en un disolvente tal como THF o nitrometano; a
una temperatura de por ejemplo 0ºC a la temperatura de reflujo,
convenientemente a la temperatura ambiente; o por hidrogenolisis
cuando R^{8} es 9-fluorenilmetilo (Fm) o bencilo
opcionalmente sustituido con grupos alquilo tales como metilo o
tercbutilo, usando hidrógeno a presión ambiental o elevada, por
ejemplo entre 1,75 kgcm^{-2} y 7,0 kgcm^{-2}, convenientemente a
3,5 kgcm^{-2}, en presencia de un catalizador tal como paladio
sobre carbono, en un disolvente polar, por ejemplo metanol o
etanol, o una mezcla de metanol y diclorometano, a temperatura
ambiente, o por métodos que son conocidos por cualquier especialista
en la técnica, tales como los métodos descritos en Rylander, P.N.,
Catalytic Hidrogenation in Organic Syntheses, Academic Press:
New York, 1979, o en Rylander, P.N., Hidrogenation Methods,
Academic Press: London, 1985, o en Bodanszky, M., et. al.,
The Practice of Peptide Synthesis,
Springer-Verlag: Berlin, 1984, que se incorporan en
este documento como referencia; o por oxidación cuando R^{8} es
fenilo o bencilo sustituido con alcoxi (preferiblemente en la
posición 2, 4 ó 6 del anillo de fenilo) opcionalmente sustituido
con grupos alquilo adecuados tales como metilo o
terc-butilo, en presencia de un agente de oxidación
adecuado tal como nitrato cérico amónico o diclorodicianoquinona
(DDQ) en un disolvente adecuado tal como metanol, agua,
diclorometano o combinaciones de los mismos, por métodos que son
conocidos por cualquier especialista en la técnica, tales como los
métodos descritos en Heathcock, C.H., et. al.,
Tetrahedron, 1981, 37, 4087; o los métodos descritos
en Greene, T.W., et. al., Protective Groups in Organic
Synthesis, second edition, John Wiley & Sons: New York,
1991, que se incorporan en este documento como referencia; o cuando
R^{8} es 2-(trimetilsilil)etilo, por reacción con una
fuente de un nucleófilo adecuado tal como fluoruro potásico o
fluoruro de tetrabutilamonio, para lo que se conocen métodos por
cualquier especialista en la técnica, tales como los descritos en
Greene, T.W. et. al., Protective Groups in Organic
Synthesis, second edition, John Wiley & Sons: New York,
1991, o en Bodanszky, M., et. al., the Practice of Peptide
Synthesis, Springer-Verlag: Berlin, 1984, o en
Jones, J., The Chemical Synthesis of Peptides, Clarendon
Press: Oxford, England, 1991, que se incorporan en este documento
como referencia; o cuando R^{8} es un grupo fotoretirable tal
como ortonitrofenilo, por métodos catalíticos que son conocidos por
cualquier especialista en la técnica, tales como los descritos en
Cama, L.D., et. al., J. Am. Chem. Soc., 1978, 100,
8006, o en Pillai, V.N.R, Synthesis, 1980, 1, o en Pillai,
V.N.R., Org. Photochem., 1987, 9, 225, que se
incorporan en este documento como referencia. Los ésteres presentes
en las cadenas laterales R^{1} o R^{2} pueden o pueden no
hidrolizarse en la misma mezcla de reacción utilizada para
hidrolizar R^{8}, dependiendo de la elección del grupo éster y las
condiciones de
reacción.
El éster (VI) puede prepararse por reacción de
una amina de fórmula (VII) en la que R^{1} es como se ha definido
en la fórmula (IV), R^{2} y X son como se han definido en la
fórmula (II) y R^{8} es como se ha definido en la fórmula (VI);
un ácido carboxílico de fórmula (VIII),
en la que B y D son como se definen más adelante
y G representa un grupo
(IX),
donde n = 3-7, o
1,4-ciclohexilo (X) donde los sustituyentes 1 y 4
pueden estar en configuración cis o trans o mezclas de las dos
configuraciones, o un grupo aromático elegido entre los
siguientes:
La reacción de las aminas de fórmula (VII) con
ácidos carboxílicos de fórmula (VIII) se realiza en presencia de un
agente de acoplamiento; incluyendo, pero sin limitación,
cianofosfonato de dietilo (XI),
1-etil-3-(dimetilaminopropil)carbodiimida
(XII) o diciclohexilcarbodiimida (XIIa), opcionalmente en presencia
de un grupo de activación tal como
1-hidroxibenzotriazol (HOBT), en un disolvente
aprótico polar, convenientemente
N,N-dimetilformamida (DMF) o
N,N-dimetilpropilenourea (DMPU) a una temperatura
de, por ejemplo, 0ºC a 80ºC,
convenientemente a la temperatura ambiente. Como
alternativa, un éster de fórmula (VI) puede prepararse por
tratamiento de una mezcla de ácido carboxílico (VIII) y una base de
amina terciaria; tal como trietilamina, diisopropiletilamina o
N-metilmorfolina; en un disolvente aprótico tal como
DMF o DMPU; a una temperatura comprendida entre 0ºC y 25ºC; con un
agente de acilación tal como cloroformiato de isobutilo o
cloroformiato de etilo; seguido de la adición de una amina
(VII).
Varios de los ácidos carboxílicos preferidos
(VIII) pueden adquirirse a partir de proveedores comerciales, por
ejemplo (XIII) puede adquirirse en Chemical Aldrich Co; o puede
prepararse mediante procedimientos descritos en la bibliografía,
por ejemplo (XIV): De Graw, J I, et. al, J. Med Chem,
1982, 25, 1227; Ibid, 1986, 29, 1056 (XV):
Jones, T R, et. al., J. Med Chem, 1986, 29,
1114; Nair, M. G., et al: Ibid, 1986, 29,
1754; Ghazola, M, et. al: Ibid, 1986, 29, 1263;
Acharya S.P. et. al., J. Heterocyclic Chem, 1975, 12,
1283. (XVI): Barnett, C J, et. al, Tetrahedron Lett,
1989, 30, 6291. (XVII): Styles, V. L., et al.: J.
Med Chem, 1990, 33, 561 Taylor, E.C., et al. J.
Med Chem 1992, 32 1517: (XVIIa) y Bisset, G.M.F. et
al., J. Med. Chem. 1992 35 859;
Los ácidos carboxílicos de fórmula (VIII) pueden
prepararse por hidrólisis de ésteres de fórmula (XVIII), donde B y
D son como se han definido en la fórmula (III), G es como se ha
definido en la fórmula (VIII) y R^{9} es un grupo adecuado tal
como metilo, etilo o terc-butilo; normalmente en
presencia de una base adecuada, tal como NaOH o LiOH; o un ácido
adecuado tal como HCl o ácido trifluoroacético; en un disolvente o
mezcla de disolventes adecuados, tal como THF, nitrometano o
THF:H_{2}O; a una temperatura de, por ejemplo, 0ºC a la
temperatura de reflujo, convenientemente a temperatura ambiente.
\newpage
(XVIII)B-D-G-CO_{2}-R^{9}
Para los profármacos en los que D en la fórmula
(III) o en la fórmula (XVIII) representa
-CH_{2}-NR^{3}-, los ésteres de fórmula (XVIII)
pueden prepararse por:
- (a)
- reacción de un compuesto de fórmula (XIX)
(XIX)R^{10}-G-CO_{2}R^{9}
- en la que G es como se ha definido en la fórmula (VIII), R^{9} es como se ha definido en la fórmula (XVIII) y R^{10} representa NHR^{3}, donde R^{3} es como se ha definido en la fórmula (III); y un compuesto de fórmula (XX)
(XX)K-R^{11}
- donde R^{11} es un grupo aldehído o un grupo ciano y K es un grupo heterocíclico tal como los definidos como B en la fórmula (III) o un grupo tal como (XXI) donde Z = O, o un grupo tal como el definido como B en la fórmula (III) o un grupo tal como (XXI) donde Z = O sustituido con un grupo protector adecuado, para proporcionar un reactivo más adecuado, incluyendo los grupos adecuados, pero sin limitación, N-pivaloílo, N-benzoílo, N-carbobenciloxi (N-cbz) o N-terc-butoxicarbonilo (N-t-BOC). Tales grupos protectores pueden retirarse en una fase posterior de la síntesis, según sea apropiado, usando métodos convencionales conocidos por cualquier especialista en la técnica, tales como los métodos descritos en Green, T.W., et. al., Protective Groups in Organic Synthesis second edition, John Wiley & Sons: New York, 1991, que se incorporan en este documente como referencia.
- Los ésteres de fórmula (XVIII) se preparan por reacción de (XVI) y (XX) en un disolvente tal como THF, DMPU, DMF, etanol o ácido acético a una temperatura comprendida entre 25ºC y 100ºC, opcionalmente con la retirada de agua durante el transcurso de la reacción, seguido de reducción con cianoborohidruro sódico o gas hidrógeno en presencia de un catalizador adecuado, tal como níquel Raney, usando condiciones de reacción convencionales conocidas por cualquier especialista en la técnica.
- (b)
- reacción de un compuesto de fórmula (XIX), como se ha definido en (a), con un compuesto de fórmula (XX), en la que K es como se ha definido en (a) pero R^{11} se define como CH_{2}Y, donde Y se define como a un grupo saliente tal como cloro, bromo, yodo, mesilo o tosilo, en un disolvente adecuado tal como THF, en presencia de una base tal como NaHCO_{3}, NA_{2}CO_{3}, K_{2}CO_{3}, trietilamina o diisopropiletilamina, a una temperatura elevada, por ejemplo de 50ºC a 150ºC y convenientemente de 80ºC a 120ºC.
Para los profármacos en los que D en la fórmula
(III) y la fórmula (XVIII) representa
-NR^{3}-CH_{2}-, los ésteres de fórmula (XVIII)
pueden prepararse por reacción de un compuesto de fórmula (XIX) en
la que R^{10} representa un grupo aldehído y G es como se ha
definido en la fórmula (VIII), y un compuesto de fórmula (XX), en
la que K es como se ha definido en la fórmula (XX) y R^{11} se
define como HNR^{3}, donde R^{3} es como se ha definido en la
fórmula (III), en un disolvente tal como THF, DMF, DMPU o ácido
acético a una temperatura comprendida entre 25ºC y 100ºC,
opcionalmente con la retirada de agua durante el transcurso en la
reacción, seguido de reducción con cianoborohidruro sódico o gas
hidrógeno en presencia de un catalizador adecuado, tal como níquel
Raney.
Para los profármacos en los que D en la fórmula
(III) y la fórmula (XVIII) representa -CH_{2}O- o -CH_{2}S-,
los ésteres de fórmula (XVIII) se preparan por reacción de un
compuesto de fórmula (XIX), en la que R^{9} es como se ha
definido en la fórmula (XVIII), G es como se ha definido en la
fórmula (VIII) y R^{10} es OH o SH; con un compuesto de fórmula
(XX), en la que k es como se ha definido en la fórmula (XX) y
R^{11} es CH_{2}Y, donde Y se define como un grupo saliente tal
como cloro, bromo, yodo, mesilo o tosilo; en un disolvente adecuado
tal como DMF, DMPU o acetona; en presencia de una base tal como
trietilamina, diisopropiletilamina, carbonato de cesio, bicarbonato
de cesio, carbonato sódico o bicarbonato sódico, a una temperatura
de 25ºC a 80ºC.
Para los profármacos en los que D en la fórmula
(III) y la fórmula (XVIII) representa -CH_{2}CH_{2}-, los
ésteres de fórmula (XVIII) se preparan por:
\newpage
- (a)
- reacción de un compuesto de fórmula (XX) en la que K es como se ha definido en la fórmula (XX) y en la que R^{11} es CH_{2}Br, con trifenilfosfina en un disolvente polar, por ejemplo un alcanol C_{1-4} o glicol, convenientemente metanol o etanol, normalmente en presencia de una base, por ejemplo un alcóxido metálico formado convenientemente a partir del metal y el disolvente, es decir, metóxido sódico o etóxido sódico a una temperatura de 0ºC a la temperatura de reflujo; seguido de la adición de un compuesto de fórmula (XIX), en la que R^{9} es como se ha definido en la fórmula (XVIII), G es como se ha definido en la fórmula (VIII), y R^{10} es un grupo aldehído; seguido de reducción con hidrógeno a una presión elevada, por ejemplo entre 1,75 kgcm^{-2} y 7,0 kgcm^{-2}, convenientemente a 3,5 kgcm^{-2}, en presencia de un catalizador adecuado tal como paladio sobre carbono, en un disolvente polar, por ejemplo metanol o etanol o una mezcla de metanol y diclorometano, a temperatura ambiente.
- (b)
- reacción de un compuesto de fórmula (XIX) en la que R^{9} es como se ha definido en la fórmula (XVIII) y G es como se ha definido en la fórmula (VIII), y R^{10} es CH_{2}Br, con trifenilfosfina en un disolvente polar, por ejemplo un alcanol C_{1-4} o glicol, convenientemente metanol o etanol, normalmente en presencia de una base, por ejemplo un alcóxido metálico formado convenientemente a partir del metal y el disolvente, es decir, metóxido sódico o etóxido sódico a una temperatura de 0ºC a la temperatura de reflujo; seguido de la adición de un compuesto de fórmula (XX), donde K es como se ha definido en la fórmula (XX), y R^{11} es un grupo aldehído; seguido de reducción con hidrógeno a una presión elevada, por ejemplo entre 1,75 kgcm^{-2} y 7,0 kgcm^{-2}, convenientemente a 3,5 kgcm^{-2}, en presencia de un catalizador adecuado tal como paladio sobre carbono, en un disolvente polar, por ejemplo metanol o etanol o una mezcla de metanol y diclorometano, a temperatura ambiente.
- (c)
- reacción de un compuesto de fórmula (XX), en la que K es como se ha definido en la fórmula (XX) y R^{11} es cloro, bromo o yodo; con un compuesto de fórmula (XIX), en la que R^{9} es como se ha definido en la fórmula (XVIII), G es como se ha definido en la fórmula (VIII) y R^{10} es un grupo acetileno C\equivCH.
La reacción se realiza en presencia de un
catalizador de Pd(0), convenientemente
tetraquis(trifenilfosfina)paladio; y una base tal como
trietilamina o diisopropiletilamina; en un disolvente aprótico
polar tal como DMF o DMPU; a una temperatura de 25ºC a 50ºC;
seguido de reducción con hidrógeno a presión elevada, por ejemplo
entre 1,75 kgcm^{-2} y 7,0 kgcm^{-2}, convenientemente a 3,5
kgcm^{-2} en presencia de un catalizador adecuado tal como
paladio sobre carbono, en un disolvente polar, por ejemplo metanol o
etanol o una mezcla de metanol y diclorometano, a temperatura
ambiente.
Para los profármacos en los que D en la fórmula
(III) y en la fórmula (XVIII) representa
-CH_{2}-CH(R^{3})-, R^{3} es como se ha
definido en la fórmula (III), los ésteres de fórmula (XVIII) se
preparan por reacción de un compuesto de fórmula (XX) en la que K
es como se ha definido en la fórmula (XX) y en la que R^{11} es
CH_{2}Br, con tributilfosfina o trifenilfosfina en un disolvente
polar, por ejemplo un alcanol C_{1-4} o glicol,
convenientemente metanol o etanol, normalmente en presencia de una
base, por ejemplo un alcóxido metálico convenientemente formado a
partir del metal y el disolvente, es decir, metóxido sódico o
etóxido sódico, o en una solución de dimetil sulfóxido y una base
tal como hidruro sódico a una de 25ºC a 80ºC; seguido de la adición
de un compuesto de fórmula (XIX), en la que R^{9} es como se ha
definido en la fórmula (XVIII) G es como se ha definido en la
fórmula (VIII) y R^{10} es un grupo ceto
-(CO)-R^{3}, donde R^{3} es como se ha definido
en la fórmula (III); agitando posteriormente la mezcla de reacción
a una temperatura de 25ºC a la temperatura de reflujo durante un
período de tiempo de 4 a 96 horas, convenientemente de 24 a 48
horas; seguido de reducción con hidrógeno a presión elevada, por
ejemplo entre 1,75 kgcm^{-2} y 7,0 kgcm^{-2}, convenientemente
a 3,5 kgcm^{-2} en presencia de un catalizador adecuado tal como
paladio sobre carbono u óxido de platino, en un disolvente polar,
por ejemplo metanol, etanol o ácido acético.
Los compuestos de fórmula (XX) en la que K es
como se ha definido anteriormente y R^{11} es CH_{2}Br pueden
prepararse usando una metodología disponible para los especialistas
en la técnica. (Piper, JR et al, J. Org Chem, 1977,
42, 208; Piper, JR et al, J. Med Chem, 1986,
29, 1080; Oakes, V, et al, J. Chem Soc, 1956,
4433; Acharya, S P, et al, J. Heterocyclic Chem,
1975, 12, 1283; Bird, O D, et al en Pteridine
Chemistry, Pfleiderer W & Taylor E C, Eds, Pergamon Press,
Oxford, 1964, p. 417; Piper, J R, et al, J.
Heterocyclic Chem 1974, 279).
Los compuestos de fórmula (XX) en la que K es
como se ha definido anteriormente y R^{11} es un grupo aldehído
pueden prepararse usando una metodología disponible para los
especialistas en la técnica. (Taylor, E C, et al, J. Org
Chem, 1983, 48, 4852; Arnold, A, et al, Collect
Czech Chem Commum, 1960, 25, 1318; Beardsley, G P, et
al, Proc Am Assoc Cancer Res, 1986, 1027).
Los compuestos de fórmula (XX) en la que K es
como se ha definido anteriormente y R^{11} es un grupo ciano
pueden prepararse usando una metodología disponible para los
especialistas en la técnica. (Elsager, E F et al, Lect
Heterocyclic Chem, 1974, 2, S-97; Davoll,
J, et al, J Chem Soc (C), 1970, 997; Jones, T.R,
Eur. J. Cancer, 1981, 17, 11; Kondo, T, et al,
Chem. Lett, 1980, 559).
Los compuestos de fórmula (XX) en la que K es
como se ha definido anteriormente y R^{11} es un grupo amino
pueden prepararse usando una metodología disponible para los
especialistas en la técnica. (Hynes, J B, et al, J. Med
Chem, 1975, 18, 632, 1191; Davoll, J, et al, J.
Med Chem, 1972, 15, 837; Bernetti, R, et al, J
Org Chem, 1962, 27, 2863).
Los compuestos de fórmula (XX) en la que K es
como se ha definido anteriormente y R^{11} es un grupo bromo,
cloro o yodo pueden prepararse usando una metodología disponible
para los especialistas en la técnica. (Taylor, E C et al,
J. Med Chem, 1992, 35, 4450; Taylor, E C, et
al, J Org Chem, 1989, 54, 3618; Jones, J H, et
al, J Med Chem, 1968, 11, 322).
Los ácidos carboxílicos de fórmula (VIII) en la
que A es un grupo de fórmula (XXI), donde Z = S, pueden prepararse
a partir de ácidos carboxílicos de fórmula (VIII) en la que C es un
grupo de fórmula (XXI), donde Z = O, por reacción con un agente de
sulfuración tal como P_{2}S_{5} en un disolvente tal como
piridina a una temperatura comprendida entre 25ºC y la temperatura
de reflujo.
Los compuestos de fórmula (XIX) en la que G es
como se ha definido en la fórmula (VIII), R^{9} es como se ha
definido en la fórmula (XVIII) y R^{10} es NHR^{3}, donde
R^{3} es como se ha definido en la fórmula (III), pueden
prepararse a partir de compuestos de fórmula (XIX) en la que G y
R^{9} son como se han definido anteriormente y R^{10} es
NH_{2}, por reacción con un compuesto R^{3}-Y,
donde Y se define como un grupo saliente tal como cloro, bromo,
yodo, mesilo o tosilo; en presencia de una base adecuada tal como
2,6-lutidina, en un disolvente aprótico polar tal
como DMF o dimetilacetamida a una temperatura elevada comprendida
entre 50ºC y 100ºC.
Los compuestos de fórmula (XIX) en la que G es un
grupo fenilo o furilo, R^{10} es NH_{2} y R^{9} es como se ha
definido en la fórmula (XVIII), pueden obtenerse a partir de
proveedores comerciales, o pueden prepararse fácilmente a partir de
compuestos que están disponibles a partir de proveedores
comerciales, usando procedimientos conocidos por cualquier
especialista en la técnica. Uno de tales compuestos preferidos de
fórmula (XXII)
puede prepararse por los métodos descritos por N
Soundararajan y M S Platz. (Soundararajan N et al., J. Org
Chem, 1990, 55, 2034. Uno de tales compuestos preferidos
es de fórmula (XXIIa) y puede prepararse por los métodos descritos
en Mackay, D., Can J Chem, 1966, 44, 2881; o en Paul.,
et al, Arch. Pharm, 1978, 52,
538.
Los compuestos de fórmula (XIX) en la que G es un
grupo ciclohexilo, R^{10} es NH_{2} y R^{9} es como se ha
definido en la fórmula (XVIII) pueden obtenerse a partir de
proveedores comerciales, o pueden prepararse fácilmente usando
métodos convencionales disponibles para cualquier especialista en
la técnica. (Banfi, A, et al, Synth Commum, 1989,
19, 1787; Krieg, R, et al, J Prakt Chem, 1987,
329, 1123; Johnston, T P, et al, J Med Chem,
1977, 20, 279).
Los compuestos de fórmula (XIX) en la que G es un
grupo tienilo, R^{10} es NH_{2} y R^{9} es como se ha
definido en la fórmula (XVIII) pueden prepararse por una
metodología disponible para cualquier especialista en la técnica.
(Goddard, C J, J Heterocyclic Chem, 1991, 28, 17;
Decroix, B, et al, J Chem Res (S), 1978, 134; Paul,
H, et al, Arch Pharm, 1978, 311, 679; Mackay,
D, Can J Chem, 1996, 44, 2881).
Los compuestos de fórmula (XIX) en la que G es un
grupo tiazol, R^{10} es NH_{2} y R^{9} es como se ha definido
en la fórmula (XVIII) pueden prepararse a partir de ácido
5-nitrotiazol-2-carboxílico
(Strehlke, P, Chem Ber, 1973, 106, 721) usando métodos
de esterificación y reducción conocidos por cualquier especialista
en la técnica.
Los compuestos de fórmula (XIX) en la que G es un
grupo piridilo, R^{10} es NH_{2} y R^{9} es como se ha
definido en la fórmula (XVIII) pueden prepararse usando metodología
disponible para cualquier especialista en la técnica (Dawson, M I,
et al, J Med Chem, 1983, 26, 1282; Finch, N,
et al, J Med Chem, 1978, 21, 1269; Cooper, G H,
et al, J Chem Soc(C), 1971, 3257; Deady, L W,
et al, Aust J Chem, 1971, 24, 385).
Los compuestos de fórmula (XIX) en la que G es un
grupo pirimidilo, R^{10} es NH_{2} y R^{9} es como se ha
definido en la fórmula (XVIII) pueden prepararse usando métodos
análogos a los descritos por P R Marsham, et al., (Marsham,
P.R., et al, J Med Chem, 1991, 34, 1594).
Los métodos generales para la síntesis de los
compuestos de fórmula (VIII) se describen en dos artículos
recientes (Palmer, D C, et al, Prog Med Chem, 1988,
25, 85; Rosowsky, A, Prog Med Chem, 1989, 26,
1).
Los ésteres de fórmula (VI) en la que E se define
como
pueden prepararse por reacción de un compuesto de
fórmula (XX) en la que R^{11} es CH_{2}Br; y un compuesto de
formula
(XXIII)
en la que R^{1} se define como en la fórmula
(IV), R^{2} y X se definen como en la fórmula (II), y R^{8} se
define como en la fórmula (VI); en un disolvente polar tal como DMF
o DMPU; en presencia de una base, tal como bicarbonato sódico,
carbonato de cesio, carbonato sódico o carbonato de cesio; a una
temperatura elevada, por ejemplo de 50ºC a 100ºC, convenientemente a
100ºC. Los compuestos de fórmula (XXIII) pueden prepararse a partir
de compuestos de fórmula (VII) y un compuesto de fórmula
(XXIV)
por métodos análogos a los descritos por W
Pendergast, et al. (Pendergast, W, et al, J Med
Chem, [1994], 37, p 838) o en la solicitud de patente WO
01/19700, que se incorporan en este documento como referencia en su
totalidad.
Los compuestos de fórmula (VII) pueden prepararse
a partir de compuestos de fórmula (XXV), en la que R^{1} es como
se ha definido en la fórmula (IV), R^{2} y X son como se han
definido en la fórmula (II), R^{8} es como se ha definido en la
fórmula (VI) y R^{12} representa un grupo protector adecuado tal
como N-terc-butoxicarbonilo
(N-t-Boc), o
N-carbobenciloxi (N-Cbz), para lo
que se conocen métodos por cualquier especialista en la técnica,
tales como los métodos descritos en Greene, T.W., et al.,
Protective Groups in Organic Synthesis, second edidition,
John Wiley & Sons: New York, 1991, que se incorporan en este
documento como referencia.
Los compuestos de fórmula (XXV)
pueden prepararse por una reacción de un ácido
carboxílico de fórmula (XXVI) y un compuesto de fórmula (XXVII), en
la que X es como se ha definido en la fórmula (II); para los
compuestos en los que X es NH, los compuestos de fórmula (XXV)
pueden prepararse por reacción de un ácido carboxílico de fórmula
(XXVI) y una amina de fórmula (XXVII), en la que X es NH, en
presencia de un agente de acoplamiento adecuado tal como
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
o diciclohexilcarbodiimida, en presencia de una base adecuada tal
como N-metilmorfolina, en un disolvente aprótico tal
como diclorometano o DMF, a una temperatura de 0ºC a 50ºC, o por
métodos que son conocidos por cualquier especialista en la técnica,
tales como los métodos descritos en Bodanszky, M., et al.,
The Practice of Peptide Synthesis,
Springer-Verlag: Berlin, 1984, o en Jones, J.,
The Chemical Synthesis of Peptides, Clarendon Press: Oxford,
England, 1991, que se incorporan en este documento como
referencia.
en diclorometano o DMF a una temperatura de 0ºC a
50ºC, para lo que se conocen métodos por cualquier especialista en
la técnica, tales como los métodos descritos en Greene, T.W., et
al., Protective Groups in Organic Synthesis second
edition, John Willey & Sons: New York, 1991, que se
incorporan en este documento como
referencia.
Para los compuestos de fórmula (XXV) en la que X
es O, los compuestos de fórmula (XXV) pueden prepararse por reacción
de un ácido carboxílico de fórmula (XXVI) con un agente de
activación adecuado tal como cloruro de
para-toluenosulfonilo o cloruro de bencenosulfonilo,
en un disolvente adecuado tal como piridina o lutidina, a una
temperatura comprendida entre 0ºC y 25ºC; seguido de la adición de
un alcohol de fórmula (XXVII) en la que X es O.
Los ésteres de fórmula (XXVII), en la que X se
define como en la fórmula (II), pueden prepararse a partir de
ácidos carboxílicos de fórmula (XXVIII) usando métodos
convencionales conocidos por cualquier especialista en la técnica,
tales como los métodos descritos en Greene, T.W., et al.,
Protective Groups in Organic Synthesis second edition, John
Willey & Sons: New York, 1991, que se incorporan en este
documento como referencia.
Los ácidos carboxílicos de fórmula (XXVIII) en la
que X es O, pueden obtenerse a partir de ácidos carboxílicos de
formula (XXVIII) en la que X es NH, por métodos análogos a los
descritos por C Morin, et al. (Morin, C, et al,
Synthesis, 1987, 479) y K Mori, et al (Mori, K, et
al, Tetrahedron, 1982, 38, 3705).
Los ácidos carboxílicos de fórmula (XXVIII) en la
que X es NH, pueden prepararse a partir de compuestos de fórmula
(XXIX); donde W es un grupo saliente tal como cloro, bromo, yodo,
mesilo o tosilo y R^{2} se define como en la fórmula (II); por
métodos análogos a los descritos por R M Williams (Williams, R M,
Aldrichimica Acta, 1992, 25, 11 y las referencias
citadas en ese documento) o por M J O'Donnell, et al.
(O'Donnell, M J et al, J Am Chem Soc, 1989,
111, 2353).
(XXIX)WCH_{2}R^{2}
Los compuestos de fórmula (XXIX), en la que W es
un grupo saliente tal como cloro, bromo, yodo, mesilo o tosilo,
pueden prepararse a partir de compuestos de fórmula (XXIX) en la
que W es un grupo hidroxilo, para lo que se conocen métodos por
cualquier especialista en la técnica, tales como los métodos
descritos en March, J., Advanced Organic Chemistry, fourth
edition, John Wiley & Sons: New York, 1992, que se
incorporan en este documento como referencia.
Algunos de los compuestos preferidos de fórmula
(XXIX) en la que R^{2} es un grupo fenilo sustituido con alquilo
C_{1-8}, alquilo C_{3-8}
ramificado o cicloalquilo C_{3-8} pueden
prepararse por reacción de un compuesto (XXIX) donde W es un grupo
hidroxilo o un grupo hidroxilo con un grupo protector adecuado que
puede unirse y retirarse posteriormente cuando sea apropiado en la
síntesis, por métodos convencionales conocidos por cualquier
especialista en la técnica, y R^{2} es un grupo fenilo sustituido
con un grupo yodo o un grupo bromo; la reacción puede realizarse por
la adición de un compuesto olefínico adecuado en presencia de un
catalizador de Pd por métodos análogos a los descritos por H A
Dieck, et al, (Dieck, H A, et al, J Am Chem
Soc, 1974, 96, 1133), seguido de reducción con gas
hidrógeno en presencia de un catalizador adecuado usando
condiciones convencionales conocidas por cualquier especialista en
la técnica, para lo que se conocen métodos por los especialistas en
la técnica, tales como los métodos descritos en Rylander, P. N.,
Catalytic Hidrogenation in Organic Synthesis, Academic
Press: New York, 1979, o en Rylander, P.N., Hidrogenation
Methods, Academic Press: London, 1985, que se incorporan en
este documento como referencia; o la reacción puede realizarse por
reacción con un reactivo de alquillitio adecuado tal como reactivo
de n-butillitio, en un disolvente etéreo tal como
THF, a una temperatura reducida, por ejemplo de -100ºC a -20ºC,
convenientemente a -78ºC, seguido de la adición del grupo de
alcohol bencilónico resultante por métodos análogos a los descritos
por C T West, et al, (West, et al. J. Org Chem,
1973, 38, 2675).
Algunos de los compuestos preferidos de fórmula
(XXIX) en la que R^{2} es un grupo fenilo sustituido con un grupo
carboxilo o carboxilo esterificado, pueden prepararse por reacción
de un compuesto de fórmula (XXIX) en la que W es un grupo hidroxilo
y R^{2} es un grupo fenilo sustituido con un grupo bromo o yodo,
con monóxido de carbono en un disolvente de alcanol adecuado por
métodos análogos a los descritos por A Schoenber, et al,
(Schoenber, A, et al, J Org Chem, 1974, 39,
3318), seguido de hidrólisis del éster resultante, si se desea, para
lo que se conocen métodos por cualquier especialista en la
técnica, tales como los métodos descritos en Greene, T.W., et
al., Protective Groups in Organic Synthesis, second
edition, John Willey & Sons: New York, 1991, que se
incorporan en este documento como referencia.
Algunos ácidos carboxílicos preferidos de fórmula
(XXVIII) en la que X es NH y R^{2} es un grupo
para-hidroxifenilo sustituido con alquilo
C_{1-8}, alquilo C_{3-8}
ramificado o cicloalquilo C_{3-8}, pueden
prepararse por reacción de tirosina sustituida sobre el anillo de
fenilo con un grupo bromo o yodo; donde los grupos amino y/o
carboxilo pueden estar opcionalmente sustituidos con un grupo
protector adecuado que puede unirse y posteriormente retirarse
cuando sea apropiado en la síntesis, para lo que se conocen métodos
por cualquier especialista en la técnica, tales como los métodos
descritos en Greene, T.W., et al., Protective Groups in
Organic Synthesis, second edition, John Willey & Sons: New
York, 1991, que se incorporan en este documento como referencia,
con un compuesto olefínico adecuado en presencia de un catalizador
de Pd, por métodos análogos a los descritos por H A Dieck, et
al, (Dieck, H A, et al, J Am Chem Soc, 1974,
96, 1133), seguido de reducción con gas hidrógeno en
presencia de un catalizador adecuado usando condiciones
convencionales conocidas por cualquier especialista en la
técnica.
Algunos de los ácidos carboxílicos preferidos de
fórmula (XXVIII) en la que X es NH y R^{2} es un grupo
para-hidroxifenilo sustituido con carboxilo o
carboxilo esterificado, pueden prepararse por reacción de tirosina
sustituida sobre el anillo de fenilo con un grupo bromo o yodo;
donde los grupos amino y/o carboxilo pueden estar opcionalmente
sustituidos con un grupo protector adecuado que puede unirse y
posteriormente retirarse cuando sea apropiado en la síntesis, para
lo que se conocen métodos por cualquier especialista en la técnica,
tales como los métodos descritos en Greene, T.W., et al.,
Protective Groups in Organic Synthesis, second edition, John
Willey & Sons: New York, 1991, que se incorporan en este
documento como referencia; con monóxido de carbono en un disolvente
de alcanol adecuado por métodos análogos a los descritos por
(Schoenberg, A, et al, J Org Chem, 1974, 39,
3318), seguido por hidrólisis del éster resultante, si se desea,
usando métodos convencionales conocidos por cualquier especialista
en la técnica.
Un método alternativo para la síntesis de
compuestos de fórmula (VI) implica la reacción del compuesto de
fórmula (XX) en la que K es como se ha definido en la fórmula (XX)
y R^{11} es un grupo aldehído, un grupo ciano, NHR^{3}, donde
R^{3} es como se ha definido en la fórmula (III), o un grupo
CH_{2}Y, donde Y se define como un grupo saliente tal como cloro,
bromo, yodo, mesilo o tosilo; con un compuesto de fórmula (XXX)
en la que R^{1} es como se ha definido en la
fórmula (IV), R^{2} y X son como se han definido en la fórmula
(II), R^{8} es como se ha definido en la fórmula (VI), G es como
se ha definido en la fórmula (VIII), y R^{10} se define como OH,
NHR^{3}, donde R^{3} es como se ha definido en la fórmula
(III), un grupo aldehído, un grupo
ceto-(CO)-R^{3}, donde R^{3} es como se ha
definido en la fórmula (III), o un grupo CH_{2}Y, donde Y es un
grupo saliente tal como cloro, bromo, yodo, mesilo o toxilo; por
métodos análogos a los descritos para la preparación de los
compuestos de fórmula (XVIII) por reacción de compuestos de fórmula
(XX) con compuestos de fórmula
(XIX).
Los compuestos de fórmula (XXX) en la que R^{1}
es como se ha definido en la fórmula (IV), R^{2} y X son como se
han definido en la fórmula (II), R^{8} es como se ha definido en
la fórmula (VI), G es como se ha definido en la fórmula (VIII) y
R^{10} es CH_{2}Y, donde Y es un grupo saliente tal como cloro,
bromo, yodo, mesilo o tosilo, pueden prepararse a partir de
compuestos de fórmula (XXX) en la que R^{1}, R^{2}, R^{8}, X
y G son como se han definido anteriormente, y donde R^{10} es
CH_{2}OH, para lo que se conocen métodos por cualquier
especialista en la técnica, tales como los métodos descritos en
March, J., Advanced Organic Chemistry, fourth edition, John
Wiley & Sons: New York, 1992, que se incorporan en este
documento como referencia.
Los compuestos de fórmula (XXX) en la que R^{1}
es como se ha definido en la fórmula (IV), R^{2} y X son como se
han definido en la fórmula (II), R^{8} es como se ha definido en
la fórmula (VI), G es como se ha definido en la fórmula (VIII) y
R^{10} se define como OH, SH, CH_{2}OH, NHR^{3}, donde
R^{3} es como se ha definido en la fórmula (III), un grupo
aldehído, o un grupo ceto -(CO)-R^{3}, pueden
prepararse a partir de compuestos de fórmula (VII) en la que
R^{1}, R^{2}, R^{8} y X son como se han definido
anteriormente, con un compuesto de fórmula (XIX) en la que R^{9}
es hidrógeno y R^{10} es como se ha definido anteriormente, por
métodos análogos a los descritos para la preparación de compuestos
de fórmula (VI), por reacción de compuestos de fórmula (VII) con
compuestos de fórmula (VIII). En los casos en los que R^{10} es
OH, SH, CH_{2}OH, NHR^{3}, puede ser preferible añadir un grupo
protector a R^{10} antes de la reacción con un compuesto de
fórmula (VII). Tales grupos protectores pueden añadirse y pueden
retirarse en una fase posterior en la síntesis, para lo que se
conocen métodos por cualquier especialista en la técnica, tales
como los métodos descritos en Greene, T.W., et al.,
Protective Groups in Organic Synthesis, second edition, John
Willey & Sons: New York, 1991, que se incorporan en este
documento como referencia.
Los compuestos de fórmula (XIX) en la que R^{9}
es hidrógeno y R^{10} se define como OH, SH, CH_{2}OH,
NHR^{3}, donde R^{3} es como se ha definido en la fórmula
(III), un grupo aldehído, o un grupo ceto
-(CO)-R^{3} citado anteriormente, pueden
prepararse a partir de compuestos de fórmula (XIX), en la que
R^{9} es como se ha definido en la fórmula (XVIII) y R^{10} es
como se ha definido anteriormente, para lo que se conocen métodos
por cualquier especialista en la técnica, tales como los métodos
descritos en Greene, T.W., et al., Protective Groups in
Organic Synthesis second edition, John Willey & Sons: New
York, 1991, que se incorporan en este documento como
referencia.
Los profármacos de estructura general (XXXI)
donde X y R^{2} son como se han definido en la fórmula (II),
pueden prepararse a partir de compuestos de la fórmula (XXXII)
en la que R^{12} es como se ha definido en la
fórmula (XXV), R^{2} es como se ha definido en la fórmula (II) y
R^{8} es como se ha definido en la fórmula (VI), para lo que se
conocen métodos por cualquier especialista en la técnica, tales
como los métodos descritos en Greene, T.W., et al.,
Protective Groups in Organic Synthesis, second edition, John
Willey & Sons: New York, 1991, que se incorporan en este
documento como
referencia.
Los compuestos de fórmula (XXXII) pueden
prepararse por reacción de compuestos de fórmula (XXXIII) en la que
R^{12} es como se ha definido en la fórmula (XXV);
con compuestos de fórmula (XXVII) en la que X es
NH u O, R^{2} es como se ha definido en la fórmula (II), y
R^{8} es como se ha definido en la fórmula (VI); usando métodos
análogos a los descritos para la preparación de compuestos de
fórmula (XXV) a partir de compuestos de fórmulas (XXVI) y
(XXVII).
Los compuestos de fórmula (XXXIII), en la que
R^{12} es un grupo protector adecuado como se ha definido en la
fórmula (XXV), pueden prepararse a partir de melfalan (documento UK
750.155) que está disponible en el mercado bajo el nombre comercial
Alkeran (T.M. The Wellcome Foundation Limited) y tiene el nombre
químico
4-[bis(2-cloroetil)amino]-1-fenilalanina;
para lo que se conocen métodos por cualquier especialista en la
técnica, tales como los métodos descritos en Greene, T.W., et
al., Protective Groups in Organic Synthesis, second
edition, John Willey & Sons: New York, 1991, que se
incorporan en este documento como referencia.
La expresión ingeniería genética de proteínas
viene a significar la modificación dirigida estructuralmente de una
proteína para obtener una nueva serie específica y deseada de
propiedades de la proteína o, en este contexto, una actividad
enzimática precisa. Pueden usarse dos estrategias para la
modificación de la especificidad y la reactividad de las proteínas.
Las diferencias en estas estrategias dependen de la información
química y estructural disponible para una enzima específica. Si no
se dispone de ninguna información química estructural acerca de una
proteína, pueden introducirse mutaciones aleatorias individualmente
o en grupos para determinar la importancia de restos aminoacídicos
específicos usando técnicas bien conocidas en la técnica de la
biología molecular. Sin embargo, puede realizarse una estrategia
más dirigida usando mutagénesis de localización dirigida, si se
dispone de información química y estructural detallada de una
proteína. Esto implica sólo cambios específicos en restos
aminoacídicos que, según sugieren los datos químicos y
estructurales, son los restos críticos para la determinación de la
actividad enzimática deseada. Si se dispone de datos estructurales
tridimensionales, la metodología también puede realizarse para
proporcionar modelos moleculares de mutaciones propuestas. Estos
modelos pueden proporcionar estimaciones de la estabilidad relativa
o reactividad de una mutación dirigida a un sitio específico.
Típicamente, en la estrategia de modificación de
proteínas por ingeniería genética asistida por ordenador, se usan
modelos de ordenador basados en estructuras cristalográficas de
rayos X o modelos construidos, por construcción de modelos de
homología, a partir de estructuras de rayos X de proteínas
homologas. En muchos casos, las estructuras cristalográficas de
partida puede obtenerse a partir de la Brookhaven Protein Database
disponible públicamente.
Ciertos estudios extensos de la estructura de
proteínas y de la función de aminoácidos individuales han permitido
la clasificación de los restos en relación con su importancia en la
estructura, estabilidad, reactividad o catálisis. Muchos restos
aminoacídicos del sitio activo de proteínas muestran una
reactividad química poco habitual, caracterizando estas
reactividades químicas las propiedades catalíticas de las
proteínas. Esta reactividad química sirve de ayuda en la
identificación del sitio activo y los restos asociados no reactivos
del sitio activo. Ciertos estudios cristalográficos junto con la
información de reactividad química pueden indicar claramente las
localizaciones del sitio activo. Además, algunas proteínas
cristalizarán con sustratos o inhibidores en el sitio activo. Todas
estas piezas de información estructural pueden combinarse para
mejorar el enfoque de los esfuerzos de diseño hacia restos
específicos como candidatos de mutagénesis de localización
dirigida.
El cambio deseado específico en la reactividad de
la proteína puede obtenerse por cambios específicos en el
aminoácido de un sitio dado de interés. Pueden insertarse restos
aminoacídicos, separando de esta manera grupos funcionales, o
pueden delecionarse restos existentes, acercando grupos funcionales
entre sí.
Además, pueden realizarse cambios en la
estructura de la proteína cambiando los ángulos de torsión de
cadenas laterales o de la cadena principal y los grupos funcionales
presentes en los restos aminoacídicos. Estos ángulos de torsión
pueden cambiarse por intercambio, deleción o inserción de restos
aminoacídicos. Si se dispone de datos estructurales, todos estos
cambios pueden modelarse usando técnicas de modelado molecular
asistidas por ordenador. Las fuerzas que interaccionan sobre las
estructuras proteicas pueden modelarse en el ordenador usando
campos de fuerza de dinámica molecular o mecánica molecular.
El espacio disponible dentro de una proteína para
la unión al ligando puede modificarse por cambios en el volumen de
las cadenas laterales de aminoácidos. La mutación de restos
voluminosos, tales como isoleucina o leucina, a alanina o glicina,
puede proporcionar cavidades dentro de un sitio de unión al ligando
sin cambiar apreciablemente la hidrofobia del sitio. La mutación
opuesta puede excluir la unión de sustratos voluminosos a una
proteína específica.
Las mutaciones que implican cambios en los grupos
funcionales de los aminoácidos que constituyen un sitio activo
pueden proporcionar cambios más drásticos que la tolerancia al
volumen o los cambios estéricos. Se dispone de ejemplos de muchos
de estos tipos de cambios en la bibliografía (véase, por ejemplo,
Recktenwald, A, et al, J. Biotech 1993, 28,
1-23 y las referencia citadas en este documento; y
Lesk, A, et al, "Antibody Engineering: A Practical
Guide", Ed. C. A.K. Borrebaeck et al, 1991,
1-75). En sistemas con datos estructurales de alta
calidad, pueden insertarse grupos de unión a hidrógeno específicos
para mejorar la interacción de sustratos polares. El reemplazo de
restos no cargados por arginina, lisina o histidina inserta grupos
que podrían interaccionar con sustratos cargados negativamente. El
reemplazo de restos por ácido glutámico o ácido aspártico puede
proporcionar interacciones con sustratos cargados positivamente y,
de esta forma, cambiar la especificidad de una interacción
enzima-sustrato.
En otro aspecto de la presente invención, se
proporciona un conjugado recombinante que comprende un anticuerpo de
dirección como se ha descrito anteriormente y una enzima mutante de
la presente invención; habiéndose expresado dicho conjugado
recombinante a partir de una sola construcción de ADN o habiéndose
traducido a partir de un solo transcrito de ARN. Dentro del alcance
de la presente invención también se incluyen las moléculas de ADN y
ARN correspondientes que codifican tal conjugado. Las realizaciones
preferidas de tal conjugado reflejan una combinación de las
realizaciones preferidas para las actividades de sus dos
componentes como se ha expresado anteriormente en este
documento.
Tales conjugados recombinantes pueden producirse
por expresión de construcciones de fusión, generadas por la unión,
in vitro, de fragmentos de ADN que codifican por separado la
enzima y todo o parte de un mAb que confiere especificidad de
antígeno (Pastan, I. et al, (1986) Cell, 47,
641-648). Tales fusiones pueden construirse por
técnicas convencionales de biología molecular recombinante de
manera que el sitio de unión al sustrato o sitio activo del
polipéptido se sitúe en el extremo amino o el extremo carboxi y
preferiblemente en el extremo amino. La porción mAb de la
construcción puede diseñarse de forma que una especie monocatenaria
del anticuerpo se conecte a la porción enzimática, estando el
dominio ligero variable o el dominio pesado variable en el extremo
5'. En cualquier caso, las regiones del gen ligero variable y
pesado variable se conectarán con un fragmento de ADN sintético que
codifica un enlazador peptídico que consigue la disposición espacial
correcta de las regiones variables del anticuerpo. También puede
ser deseable tal región de ADN sintética que conecta la porción del
anticuerpo de la construcción de fusión con la porción de la
enzima. En otras formas, el gen que codifica la enzima puede
fusionarse al extremo 5' de la región variable del gen de la cadena
pesada o ligera que se extiende para formar una especie Fab o
F(ab')_{2}. Pueden usarse otras variaciones del gen de
cadena pesada para formar el conjugado recombinante de
enzima/anticuerpo. Tales variaciones pueden incluir isotipos de
cadena pesada naturales, genes de cadena pesada de longitud completa
modificados de todos los isotipos de anticuerpo, y cadenas pesadas
con diversas deleciones, específicamente la deleción del dominio
CH_{2} puede conferir propiedades farmacocinéticas deseables.
Como alternativa, la fusión puede producir un conjugado de
anticuerpo:enzima biespecífico covalente donde un brazo del
anticuerpo se reemplaza por la enzima de una forma similar, pero sin
limitación, a la descrita en De Sutter, K y Fiers, W. Mol Immunol
31 261 (1994). El término "conjugado", como se usa en
este documento, incluye tales conjugados recombinantes.
Los anticuerpos diseñados para tener
especificidades celulares particulares pueden generarse de
cualquier forma bien conocida en la técnica. También pueden usarse
como moléculas de dirección fragmentos de anticuerpos generados por
tecnología de ADN recombinante.
Aunque los anticuerpos preferidos para uso serán
los expresadas a partir de líneas de células humanas naturales o
recombinantes, también es posible explotar anticuerpos de otras
líneas celulares de mamífero productoras de anticuerpo siempre que
tales anticuerpos no sean inmunogénicos en una medida que pueda
interferir significativamente con la terapia o que los anticuerpos
se hayan "humanizado" de tal forma que ya no inducen una
reacción inmune in vivo. Tal anticuerpo humanizado puede ser
un anticuerpo quimérico (Morrison et al, P.N.A.S. (1984),
81, 6851-6855; Boulianne et al.,
Nature, 1985, 314, 268-270 y Neuberger et
al, Nature, 1985, 314, 268-70), o un
anticuerpo con CDR injertadas (James et al, Nature, 1986,
321, 522-525; Riechmann et al, Nature,
1988, 332, 323-327).
Un anticuerpo para uso de acuerdo con la presente
invención preferiblemente es un anticuerpo monoclonal o un
fragmento del mismo. Por lo tanto, el anticuerpo puede comprender
un anticuerpo completo, un fragmento F(ab')_{2}, un
fragmento Fab', un fragmento Fab, un dímero de cadena ligera o un
dímero de cadena pesada, o una especie monocatenaria que comprende
las regiones variables de las cadenas pesada y ligera. El
anticuerpo puede ser una IgG tal como IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4; o
IgM, IgA, IgE o IgD. El dominio constante de la cadena pesada de
anticuerpo puede seleccionarse de acuerdo con esto. El dominio
constante de la cadena ligera puede ser un dominio constante kappa o
lambda.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico
del tipo descrito en el documento WO 86/01533. Un anticuerpo
quimérico de acuerdo con el documento WO 86/01533 comprende una
región de unión al antígeno y una región que no es de
inmunoglobulina. La región de unión al antígeno es un dominio
variable de cadena ligera de anticuerpo y/o un dominio variable de
cadena pesada. Típicamente, el anticuerpo quimérico comprende
dominios variables tanto de cadena ligera como de cadena pesada. La
región que no es de inmunoglobulina se fusiona al extremo C de la
región de unión al antígeno. La región que no es de inmunoglobulina
típicamente es una proteína no inmunoglobulina y preferiblemente es
una región enzimática. Las dos regiones del anticuerpo quimérico
pueden conectarse a través de una secuencia enlazadora
escindible.
Pueden inducirse anticuerpos de cualquiera de las
clases mencionadas anteriormente contra cualquier antígeno
característico de una diana particular limitándose esencialmente a
dicha diana. Tales dianas se incluyen todos los tipos de patógenos
humanos, células que expresan antígenos como consecuencia de una
transformación o infección viral, células que expresan antígenos de
histocompatibilidad particulares, células implicadas en respuestas
inflamatorias, coágulos sanguíneos a los que se pueden dirigir
anticuerpos contra fibrina, etc.
En la fig. 8 se detallan anticuerpos preferidos
para uso de acuerdo con la invención, los antígenos a los que se
dirigen y la indicación asociada.
Los anticuerpos particularmente preferidos para
uso de acuerdo con la invención incluyen CAMPATH 1H®,
ING-1, c174, PR1.A3, 323/A3, G250, MOV18,
17-1A, NR-LU-10,
U36, NR-CO-02 así como anticuerpos
que se dirigen a mucinas o a antígenos carcinoembriónicos.
Para el tratamiento de seres humanos cuando el
resto de dirección es un anticuerpo, se prefiere usar un anticuerpo
que no lleve asociado el riesgo del desarrollo de una reacción
inmune contra el propio anticuerpo. Por consiguiente, aunque es
posible usar anticuerpos monoclonales de ratón o rata, se prefieren
usar anticuerpos que se hayan producido por tecnología de ARN
recombinante y que se hayan modificado por ingeniería genética para
reducir el riesgo de producir una reacción inmune. De esta manera,
es posible usar un anticuerpo quimérico en el que los dominios
constantes de un anticuerpo de ratón o rata se hayan reemplazado
por los dominios constantes de un anticuerpo humano. Sin embargo,
para el tratamiento de seres humanos se prefiere usar un anticuerpo
humanizado o con injertos de CDR, es decir, un anticuerpo en el que
las regiones determinantes de complementariedad de un anticuerpo de
ratón o rata se combinan con regiones flanqueantes y dominios
constantes de uno o más anticuerpos humanos.
En una realización preferida, el uso de acuerdo
con la invención se realiza usando el anticuerpo con injertos de
CDR CAMPATH-1H (véase Riechmman et al,
Nature, 322, 323-327 (1988)). Como se
ha indicado anteriormente, el anticuerpo CAMPATH-1H
puede producirse en células de mieloma de rata como se ha descrito
originalmente o puede producirse en cualquier otro sistema de
expresión, particularmente un sistema de expresión adecuado para la
producción de un proteína de mamífero glicosilada y plegada
correctamente. Se han obtenido altos rendimientos de
CAMPATH-1H por expresión en una línea de células
CHO manipuladas genéticamente (Page y Sydenham,
Biotechnology, 9, 64-68 (1991)).
La conjugación de la molécula de dirección con la
enzima puede realizarse de cualquier forma apropiada que no
interfiera con la especificidad de unión ni con la capacidad de la
molécula de dirección ni inhiba la actividad catalítica de la
enzima. En el caso de moléculas de dirección proteicas, la
conjugación puede realizarse por una unión covalente directa
después de la generación de grupos reactivos por tratamiento con
agentes modificadores de proteínas o por medio de uso de moléculas
de entrecruzamiento homo o heterobifuncionales.
Pueden hacerse reaccionar enlazadores disponibles
en el mercado que tienen grupos amino o hidrazida con aldehídos
generados por oxidación de los restos de azúcar de glicoproteínas y
carbohidratos para formar una base del Schiff (Sela M. et
al, Conjugates of Antibodies with Cytotoxic Drugs.
Immunoconjugates. Antibody Conjugates in Radioimaging and Therapy
of Cancer (C.-W. Vogel, ed.) 189-216, (1987)). Como
alternativa, pueden hacerse reaccionar enlazadores con grupos
amino, carboxilo o sulfhidrilo del anticuerpo o la enzima
(Wawrzynczak P.E. et al, Methods for Preparing Immunotoxins:
Effect of the Linkage on Activity & Stability In:
Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimaging and Therapy
of Cancer (C.- W. Vogel, ed.) 78-85, (1987)).
La unión covalente puede obtenerse por la
generación de grupos sulfhidrilo y, particularmente en el caso de
anticuerpos, por reducción de enlaces disulfuro. Tales grupos
sulfhidrilo libres pueden hacerse reaccionar con grupos
haloalquilo, grupos p-mercuribenzoato y grupos
capaces de experimentar reacciones de adición de tipo Michael,
tales como maleimidas o grupos similares (Mitra et al, J
Amer Chem Soc, 101, 3097-3110, 1979).
Otro método para unir la enzima al anticuerpo
comprende utilizar los grupos amino épsilon de la lisina. Pueden
usarse ésteres de succinimida, tioésteres cíclicos o anhídridos
reactivos para introducir funciones carbonilo que puedan reaccionar
con el grupo amino de la lisina o para introducir un grupo tiol
reactivo tal como los descritos en este documento. Como alternativa,
pueden activarse funciones carbonilo con carbodiimidas para formar
enlaces carboxamida o el grupo amino de la lisina puede hacerse
reaccionar con ésteres de metil amidato para formar un enlace
amidinio.
Una utilidad particular de la presente invención
es su aplicación a la diagnosis in vitro o in vivo.
Por ejemplo, la detección in vitro de un antígeno particular
puede conseguirse exponiendo una muestra de diagnóstico a un
conjugado de la presente invención que comprende un resto de
dirección tal como un anticuerpo capaz de unirse al antígeno y
posteriormente exponiéndola a un profármaco, tal como un profármaco
de metotrexato de la presente invención, que puede catalizarse a
metotrexato por la enzima del conjugado si está presente el
antígeno y el conjugado está unido al antígeno. El profármaco debe
añadirse después de haber retirado el conjugado no unido. El
profármaco catalizado, tal como MTX, puede detectarse por análisis
de HPLC convencional, o por el ensayo espectrofotométrico acoplado
descrito en este documento.
Las aplicaciones de diagnóstico in vivo de
la presente invención incluyen su capacidad de usarse en la
formación de imágenes de tumores. Los conjugados particularmente
preferidos para uso en esta aplicación incluyen los que comprenden
un anticuerpo contra un antígeno asociado a un tumor y una enzima
mutante capaz de realizar una catálisis para producir metotrexato, y
un profármaco de MTX marcado en el anillo de benceno con ^{131}I.
Tal profármaco debe ser uno que por lo demás sea resistente a la
catálisis endógena. El conjugado y el profármaco pueden
administrarse de una manera análoga para la aplicación terapéutica
de la invención y la detección de la localización del profármaco
catalizado, es decir, ^{131}I MTX puede conseguirse usando un
equipo convencional para la detección de la desintegración de
radioisótopos.
Las sales de profármacos de la presente invención
incluyen sales de bases farmacéuticamente aceptables, obtenidas a
partir de una base apropiada, tal como un metal alcalino (por
ejemplo, sodio), sales de metales alcalinotérreos (por ejemplo,
magnesio), sales de amonio y sales de NX+4 (donde X es alquilo
C_{1-4}). Las sales farmacéuticamente aceptables
adecuadas también incluyen, pero sin limitación, las preparadas a
partir de los siguientes ácidos: clorhídrico, bromhídrico,
sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, salicílico,
p-tolueno-sulfónico, tartárico,
cítrico, acético, trifluoroacético, metanosulfónico, fórmico,
succínico, naftaleno-2-sulfónico,
isetiónico, lactobiónico y bencenosulfónico. Las sales de
profármacos farmacéuticamente aceptables pueden prepararse de una
manera convencional, por ejemplo, por tratamiento con la base o el
ácido apropiado.
En el uso de acuerdo con la presente invención,
los medios de administración del conjugado y del profármaco
dependerán de la enfermedad y su gravedad, y estarán a la
discreción del médico a cargo del caso. Tanto el conjugado como el
profármaco pueden administrarse por los métodos convencionales bien
conocidos para los especialistas en la técnica, incluyendo la vía
intravenosa, intraperitoneal, intralinfática, subcutánea,
intradérmica, intramuscular, oral o, en el caso de un tumor, por
inyección directa en el tumor. Tanto el profármaco como el conjugado
preferiblemente se administrarán por vía intravenosa como una
inyección en embolada o por infusión continua. Preferiblemente, la
dosis de conjugado administrada está en el intervalo de 0,1 a 100
mg por kg de peso corporal por día, y más preferiblemente entre 1,0
y 40 mg por kg de peso corporal por día. La dosis preferida de
profármaco administrada está en el intervalo de 0,01 a 100 mg por
kg de peso corporal por día y preferiblemente entre 1,0 y 50 mg por
kg de peso corporal por día.
Se prefiere que el conjugado de la molécula de
dirección y la enzima mutante se administre al paciente antes de la
administración del profármaco. El periodo entre la administración
del conjugado y el profármaco debe ser suficiente para permitir la
dirección del conjugado a las células diana y la eliminación eficaz
del sistema del exceso de conjugado que no se haya unido a las
células diana. El conjugado no unido debe retirarse eficazmente para
evitar la activación del profármaco administrado posteriormente por
el conjugado no unido presente en sitios alejados de las células
diana. El periodo entre la administración del conjugado y el
profármaco preferiblemente está comprendido entre 0,5 días y 7
días, pero puede reducirse por medio del uso de cualquier técnica
conocida para acelerar la eliminación de tales conjugados del
sistema; particularmente mediante el suministro de una cantidad
eficaz de un anticuerpo anti-enzima, que se une a
la enzima mutante y a su vez acelera la eliminación, o mediante
circulación extracorpórea (Nilsson, I M, et al, Plasma
Ther. Transfus Technol, 1984, 5, 127; Wallmark, A, et
al, Artificial Organs, 1984, 8, 72) que implica
la eliminación del conjugado no unido por métodos tales como el
paso a través de una columna de una matriz de afinidad apropiada.
También puede ser deseable acoplar restos galactosilo al conjugado
para facilitar la eliminación del conjugado no unido por medio de
lectinas de hepatocitos.
Las afecciones susceptibles de terapia claramente
incluirán aquellas para las que existe un agente quimioterapéutico
conocido y un profármaco correspondiente del mismo como se ha
definido anteriormente, y que presentan un característica
patológica específica que permite la unión de un conjugado de la
presente invención. Tales afecciones incluyen transformaciones
celulares neoplásicas y no neoplásicas, enfermedades autoinmunes,
enfermedades inflamatorias e infecciones virales, bacterianas,
fúngicas, por micoplasmas o parasitarias.
La presente invención puede comprender además la
coadministración de varios agentes capaces de aumentar la eficacia
de la terapia. Por ejemplo, se sabe que los interferones aumentan
el nivel de expresión de ciertos antígenos diana de ADEPT
potenciales y, por lo tanto, la administración de un interferón
apropiado antes de la administración del conjugado puede aumentar el
nivel de unión del conjugado a las células diana.
También se prefiere administrar una combinación
de un profármaco de un inhibidor de la síntesis de purinas, tal como
un inhibidor de la glicinaamida ribonucleótido transformilasa (GAR
TFasa), o un profármaco de un inhibidor de la síntesis de
pirimidinas, tal como un inhibidor de la timidina sintasa (TS), en
combinación con un profármaco de un inhibidor de dihidrofolato
(DHFR) como parte de tal terapia (Galivan, J. et al, J. Biol. Chem.
264, 10685, 1989, Ferguson, K. et al, Cancer Chemother.
Pharmacol. 23, 173, 1989). También se prefiere administrar
una combinación de un profármaco de un inhibidor de la síntesis de
purinas, tal como un inhibidor de GAR TFasa, o un profármaco de un
inhibidor de la síntesis de pirimidinas, tal como un inhibidor de
TS, en combinación con un inhibidor de DHFR, o administrar una
combinación de un inhibidor de la síntesis de purinas, tal como un
inhibidor de GAR TFasa, o un inhibidor de la síntesis de
pirimidinas, tal como un inhibidor de TS, en combinación con un
profármaco de un inhibidor de DHFR como parte de tal terapia.
Otro aspecto de la presente invención comprende
la potenciación de cualquier compuesto antiviral, cuya eficacia
puede aumentarse por medio de la elevación de la actividad quinasa
intracelular.
De acuerdo con la presente invención, un
conjugado de la presente invención que comprende un molécula de
dirección capaz de dirigir el conjugado a una célula infectada por
un virus y un profármaco de un antagonista de folato que puede ser
uno o más de los siguientes: un inhibidor de la timidilato sintasa
(TS), un inhibidor de la dihidrofolato reductasa (DFHR) o un
inhibidor de la GAR transformilasa, debe usarse para suministrar
altas dosis de antagonista de folato directamente a las células
infectadas por el virus de un paciente que se está sometiendo a la
terapia. Como la infección viral está asociada con un aumento de los
niveles de síntesis de ADN, se propone que la liberación de un
inhibidor de la síntesis de ADN en combinación con tal agente
antiviral puede resultar terapéutica, ya que la inhibición de la
síntesis de ADN aumentará el nivel de quinasas intracelulares
disponibles para fosforilar el compuesto antiviral.
En una realización preferida de este aspecto
adicional de la invención, el agente antiviral es un compuesto
contra el herpes seleccionado entre aciclovir (documento GB
1523865), valaciclovir (documento EP308065), famciclovir (documento
EP182024), penciclovir (documento EP141927), ganciclovir (documento
EP0072027), foscarnet (documento GB 1585615), yododesoxiuridina,
5-bromovinil-2'-desoxiuridina
(documento GB 1601020),
arabino-furanosil-5-bromovinil-2'-desoxiuridina
(documento EP0031128), nucleósidos de bencimidazol,
1-(\beta-D-arabinofuranosil)-5-(1-propinil)uracilo
(documento EP272065) y
2'-desoxi-5-etil-\beta-4'-tiouridina
(documento EP409575), o es un compuesto contra VIH seleccionado
entre 2',3'-didesoxiinosina (documento EP206497),
2',3'-didesoxicitidina (J. Org. Chem. 32(3)
817-818 (1967)),
(2R,5S)-5-fluoro-1-(2-hidroximetil)-1,3-oxatiolan-5-il)citosina
(documento US5210085),
(2R,5S)-1-(2-hidroximetil)-1,3-oxatiolan-5-il)citosina
(documento EP0382526),
5-cloro-2',3'-didesoxi-3'-fluorouridina
(documento EP03055117) y
(1S,4R)-4-(2-amino-6-(ciclopropilamino)-9H-purin-9-il)-2-ciclopentano-1-metanol
(documento EP0434450) o es el compuesto contra la influenza
9-(2-desoxi-2-fluoro-\beta-D-ribofuranosil)guanina)
(documento EP0417999).
En la realización más preferida de este aspecto
adicional de la invención, el compuesto antiviral es un compuesto
contra VIH tal como zidovudina (documento EP196185), (Retrovir:
marca comercial registrada de The Wellcome Foundation Limited), el
conjugado comprende un anticuerpo contra un antígeno asociado con
VIH tal como GP120 y el profármaco es un profármaco de un inhibidor
de TS.
La presente invención proporciona el uso de un
nuevo profármaco de la presente invención como se ha definido
anteriormente en este documento, o una sal farmacéuticamente
aceptable, solvato, N-óxido o derivado fisiológicamente funcional
del mismo, en la preparación de un medicamento para uso en el
tratamiento de cualquiera de las afecciones descritas anteriormente
en este documento.
También se proporciona el uso de una enzima
mutante de la presente invención, o un conjugado de la misma como
se ha descrito anteriormente en este documento, en la preparación
de un medicamento para uso en el tratamiento de cualquiera de las
afecciones descritas anteriormente en este documento.
Las formulaciones farmacéuticas para la enzima
mutante, el anticuerpo y el profármaco pueden incluir, pero sin
limitación, soluciones, suspensiones, comprimidos, polvos y otras
formulaciones conocidas para los especialistas en la técnica. Las
formulaciones pueden contener estabilizadores y vehículos
farmacéuticamente aceptables, incluyendo albúmina de suero humano u
otras proteínas, agentes tamponantes del pH, y sales fisiológicas u
otras sales no tóxicas, así como solubilizantes no tóxicos
conocidos para los especialistas en la técnica. Preferiblemente,
una formulación farmacéutica de una enzima mutante y un anticuerpo
comprenderá el conjugado en una solución estéril. Una formulación
farmacéutica de profármaco preferiblemente comprenderá una solución
estéril o un sólido.
Otro aspecto de la presente invención comprende
un kit que comprende una formulación farmacéutica de conjugado y una
formulación farmacéutica de profármaco que puede convertirse en
fármaco por ese conjugado.
Otro aspecto adicional de la presente invención
comprende la combinación de un profármaco y un conjugado de la
presente invención como se ha definido anteriormente en este
documento.
Otro aspecto adicional de la presente invención
comprende el uso de un nuevo profármaco como se ha definido
anteriormente en este documento pero excluyendo la condición
indicada previamente, para uso en la preparación de un medicamento
para uso en el tratamiento de cualquiera de las afecciones descritas
anteriormente en este documento.
Otro aspecto de la presente invención comprende
el uso de un profármaco en la preparación de un medicamento para
uso en el tratamiento de un paciente al que previamente se le ha
administrado un conjugado de la presente invención como se ha
definido anteriormente en este documento.
Otro aspecto de la invención comprende la versión
clonada de la carboxipeptidasa A2 humana descrita en este documento
así como el ADN que codifica la carboxipeptidasa A2.
Otro aspecto de la invención comprende cualquier
secuencia de ADN que codifique una enzima mutante para uso de
acuerdo con la presente invención y plásmidos, vectores de expresión
y líneas celulares que contienen tal ADN. Preferiblemente, tal ADN
codifica mutantes de carboxipeptidasa A1 o A2 como se han descrito
en este documento y, aún más preferiblemente, mutantes de
carboxipeptidasa A1 o A2 donde la posición 268 es glicina.
Otro aspecto de la invención comprende una
secuencia de ADN que codifica un conjugado de acuerdo con la
presente invención y plásmidos, vectores de expresión y líneas
celulares que contienen tal ADN.
Otro aspecto adicional convenido de la invención
es un método para convertir un profármaco en un fármaco que sea
citotóxico para las células.
Todas las referencias a alternativas en este
documento, tales como modelos alternativos de sustituciones
químicas, se considerarán inclusivas y no exclusivas.
Como se usa en este documento, el término
"halo" significa flúor, cloro, bromo o yodo.
El término "arilo" significa fenilo, naftilo
o antracenilo opcionalmente sustituido con uno o más halo, hidroxi,
nitro, ciano, trifluorometilo, alquilo C_{1-6},
alcoxi C_{1-6} o amino opcionalmente sustituido
con alquilo C_{1-6}.
El término "heteroarilo" significa un
sistema de anillo aromático condensado monocíclico o bicíclico que
comprende de 5 a 10 átomos de carbono, donde uno o más átomos del
anillo se seleccionan independientemente entre nitrógeno, oxígeno o
azufre.
Los grupos "carboxamida" pueden estar no
sustituidos o sustituidos con alquilo
C_{1-6}.
Una enzima mutante de mamífero, como se usa en
este documento, se considerará cualquier enzima con una secuencia
que difiere al menos en un aminoácido de la secuencia o secuencias
de aminoácidos de esa enzima en el mamífero al que se le aplica la
terapia. Preferiblemente, el mamífero al que se le aplica la
terapia es un paciente humano y preferiblemente la secuencia de
aminoácidos de la enzima mutante de mamífero no difiere en más de
15% de la secuencia o secuencias de aminoácidos de esa enzima en el
mamífero al que se le aplica la terapia.
Todas las referencias indicadas anteriormente y
en la reivindicaciones presentadas más adelante a números de restos
de aminoácidos se refieren a los números de restos indicados en las
Tablas contenidas en este documento y no a los números de restos
proporcionados en la lista de secuencias, que sigue una convención
de numeración diferente.
Todos los disolventes fueron de calidad reactiva
y se usaron sin purificación adicional. Los disolventes anhidros se
distribuyeron desde frascos Aldrich Sure Seal usando una jeringa
seca. Los agentes químicos son de calidad reactiva y se usaron sin
purificación. El nombre completo y la dirección de los proveedores
de los reactivos se proporcionan cuando se citan por primera vez.
Posteriormente, se usa un nombre abreviado.
Los espectros de ^{1}H-RMN se
obtuvieron usando espectrómetros Varian XL-200 o
XL-300 a 200 y 300 MHz respectivamente. Los
desplazamientos químicos se expresan en ppm campo abajo de
tetrametilsilano. Los datos espectrales se tabulan en orden:
multiplicidad (s, singlete; d, doblete, t, triplete; q,
cuadruplete; m, multiplete; a, ancho), número de hidrógenos,
constante(s) de acoplamiento en hercios, descriptor. Los
espectros de masas de ionización química (CI) se realizaron por
Oneida Research Services, Inc., Whitesboro, NY 13492. Los espectros
de masas de ionización química a presión atmosférica (APCI) se
obtuvieron usando un espectrómetro de masas Fisons Platform. Los
espectros de masas de bombardeo de átomos rápidos (FAB) se
obtuvieron usando un espectrómetro VG Analytical 70SQ. Los
espectros de masas de nebulización iónica se obtuvieron usando un
espectrómetro Sciex API III. Los análisis elementales se realizaron
por Atlantic Microlabs, Inc., Atlanta, GA 30366. Las HPLC analíticas
de fase inversa se realizaron en columnas analíticas C18 usando un
sistema de HPLC Waters que constaba de un Controlador del Sistema
600E, un procesador de muestras 715 UltraWisp, y un Detector de
Serie de Fotodiodos 991. Las HPLC semipreparativas se realizaron en
una columna Regis (C18,
Prep-100-60-ODS-FEC,
relleno 10 mm, 25 cm x 21,1 mm de d.i.) usando un sistema similar
equipado con un inyector manual.
Las abreviaturas usadas son: gramos (g),
mililitros (ml), litros (l), horas (h), minutos (min), temperatura
ambiente (TA), calculado (calc.), descomposición (desc.), peso
molecular (pm), tetrahidrofurano (THF), dimetil formamida (DMF),
dimetil sulfóxido (DMSO),
1,3-dimetil-3,4,5,6-tetrahidro-2(1H)-pirimidinona
(DMPU), clorhidrato de
1-etil-3-(dimetilaminopropil)carbodiimida
(EDC), diciclohexilcarbodiimida (DCC), cianofosfonato de dietilo
(DECP), (benciloxi)carbonilo (Cbz) y ácido trifluoroacético
(TFA).
Algunos ejemplos preparados fueron muy afines al
agua y/o a otros disolventes hidroxílicos (por ejemplo DMF), y/o se
obtuvieron como sales totales o parciales de ácidos orgánicos o
inorgánicos (por ejemplo ácido trifluoroacético, ácido
clorhídrico). Tales adenda se indican en los datos analíticos para
los ejemplos apropiados; aunque estos adenda pueden no estar
indicados como parte del nombre del compuesto, su presencia en los
productos aislados se aprecia por la inclusión de la sal y los
datos de hidratación en las fórmulas moleculares y en los datos
analíticos en los ejemplos apropiados.
Un matraz de 3 l, de 3 bocas, equipado con un
agitador magnético, se cargó con 25,00 g de
2-fluoro-4-nitrotolueno
(Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, 53233), 1,65 l de NaOH 1 N y
25,00 g de KMnO_{4}. La mezcla resultante se calentó a 95ºC con
agitación. Se añadieron porciones adicionales de 25,00 g de
KMnO_{4} después de 1 h y 2 h. Después de agitar a 95ºC durante
una hora más, la mezcla de reacción se enfrió a TA y se filtró a
través de celite para retirar el MnO_{2}. El filtrado se
concentró al vacío para dar hasta 500 ml y se acidificó a pH 2 por
la adición de H_{2}SO_{4} concentrado. Se formó un precipitado
amarillo-naranja que se recogió por filtración al
vacío. El sólido bruto se disolvió en 300 ml de NaOH acuoso 1 N, se
acidificó a pH 2 y la mezcla se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (4 x
150 ml). Los extractos de CH_{2}Cl_{2} se lavaron con HCl
acuoso 0,1 N (2 x 100 ml), se secaron sobre Na_{2}SO_{4}
anhidro y se concentraron al vacío para producir 12,44 g (42%) de
ácido
2-fluoro-4-nitrobenzoico
en forma de un sólido amarillo cristalino, p.f.
165-167ºC.
\newpage
A un matraz de 100 ml de 3 bocas seco, equipado
con un agitador magnético y una entrada de nitrógeno, se le
añadieron 3,00 g del ácido
2-fluoro-4-nitrobenzoico,
3,00 g de NaHCO_{3}, y 20 ml de dimetilacetamida anhidra. La
suspensión se trató con 3,50 ml de yoduro de etilo y se agitó a TA
en una atmósfera de N_{2} durante 18 h. La mezcla de reacción se
filtró para retirar los sólidos y el filtrado se concentró al vacío
para dar un residuo naranja que se disolvió en 100 ml de
CH_{2}Cl_{2}. La solución se lavó con NaHCO_{3} acuoso
saturado (3 x 50 ml) y agua (1 x 60 ml) y se secó sobre
Na_{2}SO_{4} anhidro. La retirada del agente de secado por
filtración y el paso a través de un lecho corto de gel de sílice (3
x 5 cm) dio una solución de color amarillo claro que se concentró
al vacío para producir 3,10 g (90%) de
2-fluoro-4-nitrobenzoato
de etilo en forma de un sólido cristalino amarillo claro, p.f.
70-73ºC.
A un matraz de fondo redondo de 250 ml equipado
con un agitador magnético se le añadieron 3,00 g de
2-fluoro-4-nitro-benzoato
de etilo y 100 ml de MeOH. La solución desoxigenó burbujeando
nitrógeno a su través durante 10 min y después se trató con 2,00 g
de níquel Raney (Raney 3200, Davison Chemical, Chattanooga, TN
37406) que se había lavado con agua y EtOH. La solución se sometió
a hidrogenación a una atmósfera con agitación durante 40 min. El
matraz se purgó con nitrógeno y el catalizador se retiró por
filtración. El filtrado se concentró al vacío para producir 2,40 g
(93%) de
4-amino-2-fluorobenzoato
de etilo en forma de un sólido cristalino castaño, p.f.
110-112ºC.
A un matraz de 3 l de 3 bocas, equipado con un
agitador magnético, una entrada de nitrógeno y un condensador de
reflujo, se le añadieron 1,4 l de 1,2-dicloroetano.
El disolvente se calentó a reflujo y se añadieron lentamente 10,00
g de
3,9-dimetilbenzo(f)-quinazolin-1(2H)-ona
(preparada de acuerdo con el método descrito en la Solicitud de
Patente Internacional WO 91/19700). Esto se continuó por la adición
de 8,73 g de N-bromosuccinimida (Aldrich) y 1,00 g de
peróxido de benzoílo (Aldrich). Después del calentamiento a reflujo
durante 2 h, la mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente
y se concentró al vacío. El residuo se suspendió con 60 ml de EtOH
y el sólido se recogió por filtración al vacío. El producto se lavó
con 50 ml de EtOH y se secó al vacío para producir 12,39 g de un
sólido castaño claro, p.f. >200ºC. El análisis por ^{1}H RMN
indicó una mezcla que constaba de un 80% de
9-bromometil-3-metilbenzo(f)quinazolin-1(2H)-ona
y un 20% de material de partida. El material se llevó a la
siguiente etapa sin purificación adicional.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 9,86 (s, 1H, CH aromático),
8,28 (d, 1H, J = 9,0, CH aromático), 8,06 (d, 1H, J = 8,4, CH
aromático), 7,72 (d, 1H, J = 8,2, CH aromático), 7,65 (d, 1H, J =
8,8, CH aromático), 4,94 (s, 2H, ArCH_{2}Br), 2,49 (s, 3H,
CH_{3}).
A un matraz de 500 ml de 3 bocas equipado con un
agitador magnético, una entrada de nitrógeno y un condensador de
reflujo, se le añadieron 5,00 g de
9-bromometil-3-metilbenzo(f)quinazolin-1-(2H)-ona,
3,02 g de
4-amino-2-fluorobenzoato
de etilo, 4,17 g de NaHCO_{3} y 42 ml de DMH anhidra. La mezcla
de reacción se calentó a 100ºC con agitación en un atmósfera de
nitrógeno durante 1,5 h. Después de enfriar a TA, la mezcla se
filtró para retirar los sólidos y el producto bruto se depositó
sobre 30 g de gel de sílice, concentrando el filtrado al vacío en
presencia de gel de sílice. La mezcla del producto/gel de sílice se
aplicó a una columna (360 g de SiO_{2}) y se purificó por
cromatografía ultrarrápida usando elución en gradiente de
MeOH-EtOAc (EtOAc \rightarrow MeOH al 2%-EtOAc).
Esto produjo 3,50 g (65%) de
4-(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(f)quinazolin-9-il)metil)amino)-2-fluorobenzoato
de etilo en forma de un polvo blanco, p.f. >200ºC.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 12,54 (s, 1H, NH), 9,85 (s,
1H, CH aromático), 8,23 (d, 1H, J = 8,7, CH aromático), 8,01 (d, 1H,
J = 8,2, CH aromático), 7,69-7,50 (m, 3H, CH
aromático), 6,52 (dd; 1H; J = 1,8, 8,9; CH aromático), 6,40 (dd;
1H; J = 1,7, 14,7; CH aromático), 4,58 (d, 2H, J = 5,6,
ArCH_{2}N), 4,19 (q, 2H, J = 7,0, etil CH_{2}), 2,44 (s, 3H,
CH_{3}), 1,24 (t, 3H, J = 7,0, etil CH_{3}).
Un matraz de 100 ml de 3 bocas, equipado con un
agitador magnético, se cargó con 0,200 g de
4-(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(f)quinazolin-9-il)metil)amino)-2-fluorobenzoato
de etilo, 18 ml de NaOH 1 N y 20 ml de EtOH. Después de agitar
durante una noche a TA, la solución se concentró hasta 20 ml al
vacío y se acidificó a pH 2,5 por la adición de HCl concentrado. El
precipitado resultante se recogió por filtración al vacío, se lavó
con 15 ml de agua y se secó al vacío para producir 0,15 g (77%) del
ácido
4-(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(f)quinazolin-9-il)metil)amino)-2-fluorobenzoico
en forma de un polvo blanco, p.f. >250ºC.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,20-12,30
(s a, 1H, COOH), 9,83 (s, 1H, CH aromático), 8,24 (d, 1H, J = 8,6,
CH aromático), 8,06 (d, 1H, J = 8,4, CH aromático),
7,80-7,40 (m, 4H, CH aromático), 6,51 (d, 1H, J =
7,9, CH aromático), 6,37 (d, 1H, J = 14,2, CH aromático), 4,60 (s,
2H, ArCH_{2}N), 2,48 (s, 3H, CH_{3}).
Un matraz de 2 l, de 3 bocas, equipado con un
agitador magnético y un termómetro, se cargó con 25,0 g de
\gamma-etil éster del ácido glutámico (Sigma
Chemical, Co., St. Louis, MO, 63178) y 1 l de agua destilada. La
solución se calentó a 60ºC con agitación y se trató con 30 g de
NaHCO_{3} seguido de 25 ml de cloroformiato de bencilo (Aldrich).
El matraz se dejó enfriar a TA y se continuo agitando durante 2 h.
La mezcla se extrajo con éter etílico (5 x 100 ml) y los extractos
de éter se desecharon. La fase acuosa se acidificó hasta un criterio
de valoración de rojo congo por la adición de HCl acuoso
concentrado y la emulsión resultante se extrajo con CH_{2}Cl_{2}
(5 x 100 ml). Los extractos de CH_{2}Cl_{2} combinados se
lavaron con HCl acuoso 0,05 N (2 x 100 ml), se secaron sobre
NaSO_{4} anhidro y se concentraron al vacío hasta un volumen de
50 ml. La solución se enfrió en un baño de agua enfriada con hielo
y se trituró con la adición de 200 ml de pentano. El sólido
resultante se recogió por filtración al vacío y se secó al vacío
para producir 37,0 g (83%) del ácido
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-etil-L-glutámico
en forma de un polvo blanco, p.f. 82-84ºC.
A un matraz de 250 ml de 3 bocas, equipado con un
agitador magnético y un condensador de reflujo, se le añadieron 3,00
g de
3-(1'-naftil)-L-alanina
(Schweizerhall, Inc., Piscataway, NJ, 08854) y 75 ml de EtOH
absoluto. La suspensión se acidificó burbujeando gas HCl a su
través hasta que se obtuvo una solución transparente y la solución
se calentó a reflujo con agitación durante 5 h. La solución se
enfrió a TA y se concentró al vacío para dar un sólido blanco, que
se suspendió en 100 ml de NaHCO_{3} acuoso al 5% y se extrajo con
EtOAc (3 x 60 ml). Los extractos de EtOAc combinados se lavaron con
NaHCO_{3} acuoso al 5% (3 x 50 ml), agua (1 x 50 ml) y se secaron
sobre Na_{2}SO_{4} anhidro. El agente de secado se retiró por
filtración y el filtrado se concentró al vacío para dar un aceite
que se disolvió en 40 ml de éter etílico. La solución de éter se
trató con 13,9 ml de HCl etéreo 1 N, el precipitado resultante se
recogió por filtración al vacío y se secó al vacío para producir
3,70 g (95%) de
3-(1-naftil)-L-alaninato
de etilo\cdotHCl en forma de un polvo blanco, p.f.
182-184ºC.
Un matraz de 250 ml de 3 bocas, equipado con un
agitador magnético y una entrada de nitrógeno se cargó con 3,70 g
de
3-(1-naftil)-L-alaninato
de etilo\cdotHCl, 4,09 g del ácido
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-etil-L-glutámico,
60 ml de CH_{2}Cl_{2} y 1,45 ml de N-metilmorfolina. La
mezcla se enfrió a 0ºC en una baño de hielo, se trató con 2,66 g de
EDC (Aldrich) y se agitó en un atmósfera de nitrógeno. Después de 1
h a 0ºC, la solución se dejó calentar a TA y se continuo agitando
durante 3 h más. La solución se concentró al vacío y el residuo se
disolvió en 100 ml de EtOAc. La solución de EtOAc se lavó con ácido
cítrico acuoso al 10% (3 x 50 ml) seguido de NaHCO_{3} acuoso al
5% (3 x 50 ml). La solución se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro,
se concentró al vacío hasta 20 ml y se trituró con la adición de 50
ml de pentano. El sólido resultante se recogió por filtración al
vacío y se secó al vacío para producir 5,80 g (82%) de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-etil-L-glutam-1-il-3-(1-naftil)-L-alaninato
de etilo en forma de un polvo blanco, p.f.
124-126ºC.
Un recipiente Parr de 500 ml se cargó con 0,19 g
de Pd(C) al 10% y 60 ml de EtOH absoluto en un atmósfera de
nitrógeno. La mezcla de catalizador-disolvente se
desoxigenó burbujeando nitrógeno a su través durante 5 minutos y
después se trató con 0,14 ml de cloruro de acetilo seguido de 1,02 g
de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-etil-L-glutam-1-il-3-(1-naftil)-L-alaninato
de etilo. La mezcla se hidrógeno a 45 psi (310,26 kPa) durante 18
h. El recipiente se purgó con nitrógeno y el catalizador se retiró
por filtración a través de celite. El filtrado se concentró al
vacío para producir 0,81 g (97%) de
5-O-etil-L-glutam-1-il-3-(1-naftil)-L-alaninato
de etilo\cdotHCl en forma de una espuma de color amarillo claro,
p.f. 85-90ºC (desc.).
Un matraz de 100 ml y de 3 bocas equipado con una
entrada de nitrógeno y un agitador magnético, se cargó con 0,50 g
del ácido
4-(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(f)quinazolin-9-il)metil)amino)-2-fluorobenzoico
y 10 ml de DMPU (Aldrich). La mezcla se calentó y sonicó de forma
alterna para disolver el sólido y la solución resultante se agitó en
una atmósfera de nitrógeno en presencia de 0,50 g de tamices
moleculares de 3 \ring{A}; durante 18 h. La mezcla se enfrió a
0ºC en un baño de hielo y se trató con 0,15 ml de
N-metilmorfolina seguido de 0,17 ml de cloroformiato
de isobutilo. Después de agitar a 0ºC durante 15 min, la mezcla de
reacción se trató con una solución de 0,69 g de
5-O-etil-L-glutam-1-il-3-(1-naftil)-L-alaninato
de etilo\cdotHCl y 0,17 ml de N-metilmorfolina en 4 ml de
DMH anhidra. La reacción se mantuvo a 0ºC durante 1 h y después se
dejo calentar a TA y se agitó durante 4 horas más. La mezcla se
filtró para retirar los sólidos y el filtrado se mezcló con 150 ml
de agua. El sólido bruto resultante se recogió por filtración, se
secó al vacío y se sometió a cromatografía ultrarrápida sobre 200 g
de gel de sílice (MeOH al 1%/EtOAc \rightarrow MeOH al 5%/EtOAc)
para producir 0,40 g (40%) de
N-(N-(4-(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(f)quinazolin-9-il)metil)amino)-2-fluorobenzoil)-5-O-etil-L-glutam-1-il)-3-(1-naftil)-L-alaninato
de etilo en forma de un polvo blanco, p.f. 225ºC (desc.).
^{1}H RMN: (200 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 12,55 (s, 1H,
benzaquinazolina NH), 9,87 (s, 1H, CH aromático), 8,63 (d, 1H, J =
7,5, amida NH), 8,24 (d, 1H, J = 8,3, CH aromático), 8,09 (d, 1H, J
= 7,7, CH aromático), 8,03 (d, 1H, J = 8,0, CH aromático), 7,92 (d,
1H, J = 7,1, CH aromático), 7,79 (t, 1H, J = 5,6,
4-aminobenzoil NH), 7,68-7,30 (m,
9H, CH aromático, amida NH), 6,56 (d, 1H, J = 7,9, CH aromático),
6,42 (d, 1H, J = 14,4, CH aromático), 4,68-4,43 (m,
4H, benzoquinazolina-9-CH_{2}- glu
metina, naftilala metina), 4,10-3,92 (m, 4H, etil
CH_{2}), 3,63-3,30 (m, 2H,
naftil-CH_{2}), 2,45 (benzoquinazolina CH_{3}),
2,29 (m, 2H, glu 4-CH_{2}),
2,07-1,74 (m, 2H, glu 3-CH_{2}),
1,14 (t, 3H, J = 7,1, etil CH_{3}), 1,03 (t, 3H, J = 7,1, etil
CH_{3}).
A un matraz de 50 ml de 3 bocas equipado con un
agitador magnético y una entrada de nitrógeno, se le añadieron 0,15
g de
N-(N-(4-(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(f)quinazolin-9-il)metil)amino)-3-fluorobenzoil)-5-O-etil-L-glutam-1-il)-3-(1-naftil)-L-alaninato
de etilo, 8 ml de 1:1 de THF:H_{2}O y 20 mg de
LiOH\cdotH_{2}O. La mezcla se agitó a TA en una atmósfera de
nitrógeno. Después de 1 h, el análisis de la solución por tlc
(SiO_{3}, MeOH al 3%/CH_{2}Cl_{2}) mostró que no quedaba
material de partida y un nuevo componente a R_{f} = 0,0. La
solución se acidificó a pH 5 por la adición de HCl acuoso 1 N y la
suspensión blanca resultante se concentró al vacío a sequedad. El
análisis del residuo por HPLC de fase inversa (C18, 65:35:0,1 de
H_{2}O: MeCN:TFA) indicó un componente mayoritario (95%) a k' =
3,17 y un componente minoritario (5%) a k' = 4,90. El producto
bruto se purificó por HPLC de fase inversa semipreparativa usando
una elución en gradiente (C18,70: 30: 0,1 \AE 65:35:0,1 de
H_{2}O:MeCN:TFA durante 10 min). Las fracciones puras (según se
determinó por la HPLC analítica) se combinaron, se concentraron
hasta 20 ml al vacío y se liofilizaron para producir 76 mg (50%) de
N-(N-(4-(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(f)-quinazolin-9-
il)metil)amino)-2-fluorobenzoil)-L-glutam-1-il)-3-(1-naftil)-L-alanina
en forma de un polvo blanquecino, p.f. 180ºC (desc.).
HPLC: un pico sobre C18, k' = 3,53,
65:35:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA, caudal = 1 ml/min.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,30-12,20
(m a, COOH), 9,82 (s, 1H, CH aromático), 8,44 (d, 1H, J = 8,1,
amida NH), 8,26 (d, 1H, J = 8,9, CH aromático), 8,11 (d, 1H, J =
8,3, CH aromático), 8,03 (d, 1H, J = 8,3, CH aromático), 7,84 (d,
1H, J = 8,2, CH aromático), 7,73 (d, 1H, J = 7,8, CH aromático),
7,67-7,27 (m, 9H, CH aromático, amida NH), 6,53 (d,
1H, J = 8,5, CH aromático), 6,38 (d, 1H, J = 14,7, CH aromático),
4,63-4,38 (m, 4H,
benzoquinazolina-9-CH_{2}, glu
metina, naftilala metina), 3,55 (m, 1H,
naftil-CH_{2}), 3,27 (m, 1H,
naftil-CH_{2}), 2,43 (s, 3H, benzoquinazolina
CH_{3}), 2,18 (m, 2H, glu 4-CH_{2}),
2,00-1,70 (m, 2H, glu
3-CH_{2}).
Análisis Elemental: Calc. para
C_{39}H_{34}N_{5}O_{7}F\cdot1,5 H_{2}O\cdot0,5 TFA
(PM 787,76), C, 60,99; H, 4,80; N, 8,89. Encontrado: C, 60,96; H,
4,82; N, 8,98.
Espectro de Masas: (FAB) 704 (M +
H)^{+}, 613, 489, 371, 309.
Espectro UV: (Tampón pH 7) \lambda_{max}
(\varepsilon) 223,4 (82600), 266,4 (53100), 348,6 (5500).
\lambda_{min} (\varepsilon) 243,2 (23500),
340,2 (3430).
\newpage
A una solución de 0,24 ml de DECP (Aldrich) y
0,22 ml de Et_{3}N en 20 ml de DMF anhidra en una matraz de 100
ml de 3 bocas se le añadieron 0,20 g de hemiclorhidrato del ácido
4-(N-(2,4-diamino-6-pteridinilmetil)-N-metilamino)benzoico
dihidrato (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI 53233) y 0,04 ml de
Et_{3}N disueltos en 3 ml de DMPU. La solución se agitó a TA en
una atmósfera de nitrógeno durante 3 h y se trató con una solución
de 0,23 g de
5-O-etil-L-glutam-1-il-3-(1-naftil)-L-alaninato
de etilo\cdotHCl y 0,15 ml de Et_{3}N en 2 ml de DMF anhidra.
Después de agitar durante 70 h, la mezcla de reacción se concentró
al vacío a 3 ml y se trató con 60 ml de éter etílico para
precipitar el producto bruto en forma de un sólido naranja
pegajoso. El éter se decantó y el producto se disolvió en 60 ml de
CHCl_{3}. La solución se extrajo con NH_{4}OH acuoso al 1%, se
secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y se concentró al vacío a
sequedad. El residuo amarillo-naranja se purificó
por cromatografía ultrarrápida sobre 150 g de gel de sílice (7:7:1
de CH_{2}Cl_{2}:acetona:MeOH) para producir 0,26 g (70%) de
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-etil-L-glutam-1-il-3-(1-naftil)-L-alaninato
de etilo en forma de un polvo amarillo, p.f. 135ºC (desc.).
^{1}H RMN: (200 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,59 (s, 1H,
pteridinil-7-CH), 8,45 (d, 1H, J =
7,2, amida NH), 8,10 (d, 1H, J = 8,0, CH aromático), 8,04 (d, 1H, J
= 8,2, CH aromático), 7,92 (d, 1H, J = 6,8, CH aromático),
7,83-7,45 (m, 6H, CH, NH_{2}),
7,41-7,23 (m, 2H, CH aromático), 6,84 (d, 2H, J =
8,8, CH aromático), 6,65 (s a, 2H, NH_{2}), 4,81 (s, 2H,
pteridinil-CH_{2}), 4,63-4,39 (m,
2H, glu metina, naftilala metina), 4,13-3,91 (m, 4H,
etil CH_{2}, 3,63-3,32 (m, 2H,
naftil-CH_{2}), 3,24 (s, 3H,
N-CH_{3}), 2,34 (t, 2H, J = 7,6,
glu-4-CH_{2}),
2,10-1,80 (m, 2H,
glu-3-CH_{2}), 1,17 (t, 3H, J =
7,1, etil-CH_{3}), 1,03 (t, 3H, J = 7,1,
etil-CH_{3}).
A una matraz de 50 ml de 3 bocas, equipado con un
agitador magnético y una entrada de nitrógeno, se le añadieron 0,13
g de
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-etil-L-glutam-1-il-3-(1-naftil)-L-alaninato
de etilo, 10 ml de EtOH y 15 ml de NaOH 0,2 N. La solución
resultante se agitó a TA en un atmósfera de N_{2} durante 2,5 h,
se acidificó a pH 5 por la adición de HCl acuoso 1 N y se concentró
al vacío a sequedad. El análisis del sólido amarillo por HPLC de
fase inversa (C18, 70:30:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA) indicó un
componente mayoritario (93%) a k' = 4,3 y cuatro componentes
minoritarios a k' = 6,8, 3,5, 2,9 y 1,9. Se purificó una porción de
70 mg del producto bruto por HPLC de fase inversa semipreparativa
(C18, 70:30:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA). Las fracciones puras (como
se determinó por la HPLC analítica) se combinaron, se concentraron
al vacío hasta 20 ml y se liofilizaron para producir 36 mg (53%) de
N-(4-(((2,4-diamino-6-
pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-(1-naftil)-L-alanina
en forma de un polvo amarillo, p.f. 175ºC (desc.).
HPLC: un pico sobre C18, k' = 3,23,
70:30:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA, caudal = 1 ml/min.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,00-11,95
(m a, 2H, COOH), 8,65 (s, 1H,
pteridinil-7-CH), 8,45 (s, 1H,
NH_{2}), 8,36-8,18 (s, 1H, NH_{2}), 8,25 (d,
1H, J = 7,5, amida NH), 8,10 (d, 1H, J = 8,6, CH aromático), 7,96
(d, 1H, J = 7,8, CH aromático), 7,90 (d, 1H, J = 7,7, CH aromático),
7,70 (m, 3H, CH aromático), 7,60-7,45 (m, 3H, CH
aromático, NH_{2}), 7,39-7,15 (m, 3H, CH
aromático, amida NH, NH_{2}), 6,81 (d, 2H, J = 8,6, CH aromático),
4,84 (s, 2H, pteridinil-CH_{2}), 4,51 (m, 1H,
naftilala metina), 4,42 (m, 1H, glu metina), 3,57 (m, 1H,
naftilala-CH_{2}), 3,28 (m, pico de H_{2}O
solapante, naftilala CH_{2}), 3,25 (s, 3H,
N-CH_{3}), 2,23 (t, 2H, J = 7,5,
glu-4-CH_{2}),
2,02-1,72 (m, 2H,
glu-3-CH_{2}).
Análisis Elemental: Calc. para
C_{33}H_{33}N_{9}O_{6}\cdot1,5 H_{2}O\cdot0,5 TFA (PM
735,72): C, 55,51; H, 5,00; N, 17,13. Encontrado: C, 55,65; H,
5,09; N, 16,92.
Espectro de Masas: (FAB) 652 (M +
H)^{+}, 581, 461, 371, 309.
Espectro de UV: (Tampón pH 7)
\lambda_{max} (\varepsilon) 224,3 (74700), 260,3 (24900), 295,9
(24100), 372,5 (7150).
\lambda_{min} (\varepsilon) 242,3 (15200),
271,0 (20500), 345,2 (5550).
A un matraz de 1 l de tres bocas, equipado con un
termómetro y un agitador magnético, se le añadieron 4,90 g de
\gamma-metil éster del ácido
L-glutámico (Sigma) y 200 ml de agua. La solución
se calentó a 60ºC, se trató con 6,40 g de NaHCO_{3} seguido de
5,20 ml de cloroformiato de bencilo (Aldrich) y se dejó enfriar a
TA con agitación vigorosa. Después de 4 h, la mezcla de reacción se
extrajo con éter etílico (4 x 100 ml) y los extractos de éter se
desecharon. La solución acuosa se acidificó hasta un criterio de
valoración de rojo congo por la adición de HCl concentrado. Esto
dio como resultado una emulsión oleosa que se extrajo con
CH_{2}Cl_{2} (4 x 60 ml). Los extractos orgánicos combinados se
lavaron con HCl acuoso 0,05 N (2 x 60 ml), se secaron sobre
Na_{2}SO_{4} anhidro y se concentraron al vacío para producir
8,23 g (92%) del ácido
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-metil-L-glutámico
en forma de un sólido blanco cristalino, p.f.
61-63ºC.
Un matraz de 500 ml de 3 bocas, equipado con
agitador magnético y una entrada de nitrógeno, se cargó con 10,00 g
de éster terc-butílico de glicina\cdotHCl (Sigma) y 200 ml
de CH_{2}Cl_{2} anhidro. La solución se trató con 10,80 g de
benzofenona imina (Aldrich) y se agitó a TA en una atmósfera de
nitrógeno durante 24 h. Durante la reacción se formó un precipitado
blanco fino de NH_{4}Cl. La mezcla se concentró al vacío a
sequedad para dar un sólido blanco que se suspendió en 250 ml de
éter etílico y se lavó con agua (3 x 200 ml) para retirar el
NH_{4}Cl. La solución etérea se secó sobre MgSO_{4} anhidro y
se concentró al vacío para producir un sólido blanco. El material
se disolvió en 30 ml de CH_{2}Cl_{2} y se trituró con la adición
de 150 ml de pentano. Se produjo un sólido blanco cristalino que se
recogió por filtración, se secó al vacío y se identificó como éster
terc-butílico de glicina-benzofenona imina
por ^{1}H-RMN. Rendimiento = 15,0 g (85%), p.f.
110-112ºC.
A un matraz de 100 ml de 3 bocas seco, equipado
con una entrada de nitrógeno y un agitador magnético, se le
añadieron 5,00 g de alcohol 2-yodobencílico
(Aldrich) y 20 ml de CH_{2}Cl_{2} anhidro. La suspensión
resultante se enfrió a 0ºC y se trató con 0,71 ml de PBr_{3}
(Aldrich) por la adición gota a gota durante un periodo de 2
minutos. El sólido se disolvió lentamente, dando una solución de
color amarillo claro que se agitó en una atmósfera de nitrógeno a
0ºC durante 2 h y después se dejó calentar a TA con agitación
continua durante 18 h. La solución se concentró al vacío a sequedad
y el residuo se disolvió en 60 ml de éter etílico. La solución
etérea se lavó con NaHCO_{3} acuoso al 5% enfriado con hielo (3 x
50 ml), se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y se concentró al
vacío para producir 5,65 g (89%) de bromuro de
2-yodobencilo en forma de un sólido blanco
cristalino, p.f. 52-54ºC.
Una matraz de 500 ml de 3 bocas, equipado con una
entrada de nitrógeno y un agitador magnético, se cargó con 20,00 g
de éster terc-butílico de glicina-benzofenona
imina, 24,13 g de bromuro de 2-yodobencilo, 2,85 g
de cloruro de N-bencilcinconidinio (Fluka Chemical Corp.,
Ronkonkoma, NY, 11779) y 105 ml de CH_{2}Cl_{2}. La solución
resultante se trató con 110 ml de NaOH acuoso al 50% (p/p) y la
mezcla se agitó vigorosamente a TA en una atmósfera de nitrógeno.
Después de 24 h, la tlc (gel de sílice, 7:1 de hexanos:EtOAc)
indicó un nuevo componente mayoritario a R_{f} = 0,65, material
de partida sin reaccionar a R_{f} = 0,85 y tres componentes
minoritarios a R_{f} = 0,20-0,45. La fase de
CH_{2}Cl_{2} se separó, se lavó con agua, (3 x 70 ml), se secó
sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y se concentró al vacío para
producir un aceite rosa viscoso. El producto bruto se sometió a
cromatografía ultrarrápida sobre 550 g de gel de sílice eluyendo
con 7:1 de hexano: EtOAc (la columna se pretrató pasándola a través
de dos volúmenes de columna de Et_{3}N al 0,5% en 7:1 de
hexano:EtOAc) para dar 26,4 g (76%) de la mezcla enantiomérica
deseada según se identificó por ^{1}H-RMN. Se
determinó que el producto era una mezcla de los dos enantiómeros
por HPLC quiral (fenilglicina de Pirkle, 99:1 de
hexano:isopropanol, caudal = 1 ml/min): k' = 3,66 (76%), k' = 3,28
(24%). La mezcla se disolvió en 160 ml de hexano y se dejó
cristalizar a 4ºC durante 2 días. El sólido se separó por
filtración y se secó al vacío para producir 10,72 g (31%) de
material racémico. El filtrado se concentró al vacío para dar 15,72
g (45%) de material enriquecido enantioméricamente (éster
terc-butílico de
2-yodo-L-fenilalanina-benzofenona
imina, ee = 86%) en forma de un aceite viscoso transparente. El
producto se usó en las siguientes etapas sin purificación
adicional.
^{1}H RMN: (200 MHz, CDCl_{3})
\delta 7,72 (d, 1H, 7,8, CH aromático), 7,60 (m, 2H, CH
aromático), 7,41-7,21 (m, 6H, CH aromático), 7,19
(m, 2H, CH aromático), 6,86 (m, 1H, CH aromático), 6,55 (d, 2H, J
= 6,6, CH aromático), 4,34 (dd; 1H; J = 3,9, 9,6; metina),
3,48-3,21 (m, 2H, Ar-CH_{2}), 1,47
(s, 9H, t-Bu).
Espectro de Masas: (Cl, CH_{4}) 512 (M +
H)^{+}, 484, 456, 410, 384, 217.
Un matraz de fondo redondo de 500 ml, equipado
con un condensador de reflujo y un agitador magnético, se cargó con
15,72 g de éster terc-butílico de
2-yodo-L-fenilalanina-benzofenona
imina (ee del 86%) y 165 ml de HCl acuoso 6 N. La mezcla se calentó
a reflujo con agitación durante 4 h y se enfrió a TA para producir
una mezcla de un sólido blanco cristalino y una fase orgánica
inmiscible (benzofenona). La mezcla se repartió entre agua (100 ml)
y éter etílico (70 ml). La fase acuosa se separó, se lavó con
cuatro porciones más de 70 ml de éter y se concentró al vacío a
sequedad para dar 9,5 g (94%) de
2-yodo-L-fenilalanina\cdotHCl
en forma de un sólido blanco esponjoso, p.f. 240ºC (desc.).
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,90-8,23 (s
a, 3H, -NH_{3}^{+}), 7,88 (d, 1H, J = 8,1, CH aromático), 7,39
(m, 2H, CH aromático), 7,04 (m, 1H, CH aromático), 4,06 (t, 1H, J =
7,4, metina), 3,23 (m, 2H, Ar-CH_{2}).
A un matraz de 500 ml de 3 bocas, equipado con un
agitador magnético y un condensador de reflujo, se le añadieron 5,00
g de
2-yodo-L-fenilalanina\cdotHCl
y 100 ml de MeOH anhidro. La mezcla se agitó y se acidificó
burbujeando gas HCl a su través durante 3 min. Se produjo una
solución transparente que se calentó a reflujo durante 5 h. La
solución se enfrió a TA y se concentró al vacío a sequedad para dar
un sólido blanco. El material se suspendió en 120 ml de
CH_{2}Cl_{2} y se lavó con NaHCO_{3} acuoso al 5% (4 x 80 ml).
La solución de CH_{2}Cl_{2} se concentró hasta un volumen de 20
ml, se diluyó a 60 ml con éter etílico y se trató con 17 ml de HCl
etéreo 1 M. Precipitó un sólido blanco que se recogió por
filtración al vacío y se secó al vacío para producir 4,90 g (94%)
de
2-yodo-L-fenilalaninato
de metilo\cdotHCl, p.f. 194-196ºC.
Un matraz de 500 ml de 3 bocas, equipado con una
entrada de nitrógeno y un agitador magnético, se cargó con 3,00 g de
2-yodo-L-fenilalaninato
de metilo\cdotHCl, 2,59 g de ácido
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-metil-L-glutámico
y 80 ml de CH_{2}Cl_{2}. La mezcla se enfrió a 0ºC en un baño de
agua enfriada con hielo y se trató con 0,97 ml de
N-metilmorfolina seguido de 1,77 g EDC (Aldrich). La
mezcla se reacción se agitó a 0ºC durante 1 h y se dejó calentar a
TA con agitación continua durante 3 h mas. La solución se diluyó
con 100 ml de CH_{2}Cl_{2}, se lavó con ácido cítrico acuoso al
5% (3 x 70 ml) y NaHCO_{3} acuoso al 5% (3 x 70 ml) y se secó
sobre Na_{2}SO_{4} anhidro. La retirada del agente de secado por
filtración, seguido de concentración al vacío del filtrado, produjo
4,30 g (84%) de un sólido blanquecino cristalino, p.f.
110-112ºC. El examen por ^{1}H RMN indicó
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-metil-L-glutam-1-il-2-yodo-L-fenilalanina
de metilo contaminado con aproximadamente un 4% del diastereómero
(S,R). El producto bruto se recristalizó dos veces en 1:1 de
EtOH-H_{2}O para dar 3,47 g (68%) del
diastereómero (S,S) en forma sólido blanco cristalino, p.f.
114-116ºC.
A un matraz de 100 ml de 3 bocas seco, equipado
con un termómetro, agitador magnético y un condensador de reflujo,
se le añadieron 1,50 g de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-metil-L-glutam-1-il-2-yodo-L-fenilalaninato
de metilo, 0,149 g de Pd(Ph_{3}P)_{4} y 35 ml de
1:1 de MeOH:THF en una cantidad abundante de nitrógeno. La solución
se desoxigenó burbujeando nitrógeno a su través durante 10 min y
después se saturó con CO, burbujeando CO a su través durante 10
min. La solución cambió de color de amarillo a naranja brillante
durante este periodo. El recipiente de reacción se puso en una
presión de globo de CO uniendo un globo cargado de CO al condensador
mediante un adaptador de entrada de gas. La mezcla de reacción se
calentó a 60ºC con agitación. Después de 3 h, el análisis por TLC
(SiO_{2}: 1:1 de hexano:EtOAc) indicó que no quedaba material de
partida, un nuevo componente a R_{f} = 0,40, y dos componentes
minoritarios a R_{f} = 0,90-0,95. La solución se
enfrió a TA y se concentró al vacío para dar un sólido amarillo.
Este material se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre 85 g
de gel de sílice (1:1 de hexano:EtOAc) para producir 1,23 g (93%) de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-
metil-L-glutam-1-il-2-(metoxicarbonil)-L-fenilalaninato
de metilo en forma de un sólido blanco cristalino, p.f.
128-130ºC.
De acuerdo con el ejemplo 10, se hidrogenaron
1,10 g de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-metil-L-glutam-1-il-2-(metoxicarbonil)-L-fenilalaninato
de metilo en presencia de 0,214 g de Pd(C) al 10% y 0,18 ml
de cloruro de acetilo, para proporcionar 0,86 g (97%) de
5-O-metil-L-glutam-1-il-2-(metoxicarbonil)-L-fenilalaninato
de metilo\cdotHCl en forma de una espuma de color amarillo claro,
p.f. 77-80ºC.
De acuerdo con el ejemplo 11, se acoplaron 0,50 g
de ácido
4-(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(f)quinazolin-9-il)metil)-amino)-2-fluorobenzoico
con 0,55 g de
5-O-metil-L-glutam-1-il)-2-(metoxicarbonil)-L-fenilalaninato
de metilo\cdotHCl usando 0,17 ml de cloroformiato de isobutilo y
0,14 ml (2x) de N-metilmorfolina. El producto bruto se
purificó por cromatografía ultrarrápida sobre 250 g de gel de sílice
(97:3\rightarrow95:5 de CH_{2}Cl_{2}:MeOH) para producir 0,29
g (30%) de
N-(N-(4-(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(f)quinazolin-9-il)metil)-amino)-2-fluorobenzoil)-5-O-metil-L-glutam-1-il)-2-(metoxicarbonil)-L-fenilalaninato
de metilo en forma de un polvo blanco, p.f. 180ºC (desc).
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 12,52 (s, benzoquinazolina
NH), 9,86 (s, 1H, CH aromático), 8,52 (d, 1H, J = 7,6, amida NH),
8,23 (d, 1H, J = 8,8, CH aromático), 8,03 (d, 1H, J = 8,4, CH
aromático), 7,80 (d, 1H, J = 7,2, CH aromático), 7,59 (m, 2H, CH
aromático, 4-amino-benzoil NH), 7,50
(t, 1H, J = 7,6, CH aromático), 7,44-7,21 (m, 5H,
CH aromático, amida NH), 6,53 (d, 1H, J = 8,0, CH aromático), 6,40
(d, 1H, J = 14,5, CH aromático), 4,58 (m, 3H, benzoquinazolina
9-CH_{2}, metina), 4,45 (m, 1H, metina), 3,82 (s,
3H, ArCO_{2}CH_{3}), 3,57 (s, 3H, CO_{2}CH_{3}), 3,55 (s,
3H, CO_{2}CH_{3}), 3,48 (m, 1H, phe
Ar-CH_{2}), 3,10 (m, 1H, phe
Ar-CH_{2}), 2,45 (s, 3H, CH_{3}), 2,27 (t, 2H,
J = 7,5, glu 4-CH_{2}), 2,01-1,73
(m, 2H, glu 3-CH_{2}).
Un matraz de 50 ml de 3 bocas, equipado con una
entrada de nitrógeno y una agitador magnético, se cargó con 0,11 g
de
N-(N-(4-(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(f)quinazolin-9-il)metil)-amino)-2-fluorobenzoil)-5-O-metil-L-glutam-1-il)-2-(metoxicarbonil)-L-fenilalaninato
de metilo y 15 ml de 1:1 de THF:H_{2}O. La solución se trató con
62 mg de LiOH (Fisher Scientific Co., Fair Lawn, NJ) y se agitó a
TA en una atmósfera de nitrógeno. Después de 18 h, el análisis por
HPLC (C18, 70:30:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA) mostró que no quedaba
material de partida (k' = 4,89), un nuevo componente a k' = 2,29
(92%) y tres componentes minoritarios entre k' = 0,72 y 1,13. La
solución se concentró al vacío hasta 7 ml y se sometió a HPLC
semipreparativa (C18, 80:20:0,1 \AE 70:30:0,1 de
H_{2}O:MeCN:TFA durante 25 min). Las fracciones puras (según se
determinó por la HPLC analítica) se combinaron y se concentraron al
vacío a sequedad. El residuo se disolvió en 20 ml de LiOH acuoso
0,17 M, se filtró y se acidificó a pH = 3,5 por la adición de HCl
acuoso 1 N. Esto produjo un sólido blanco que se separó por
centrifugación y se lavó con cuatro ciclos de suspensión
acuosa-centrifugación-decantación.
El producto se suspendió en 10 ml de agua, se congeló y se
liofilizó para producir 60 mg (56%) de
N-(N-(4-(((1,2-Dihidro-3-metil-1-oxobenzo(f)quinazolin-9-il)metil)amino)-2-fluorobenzoil)-L-glutam-1-il)-2-carboxi-L-fenilalanina
en forma de un sólido blanco esponjoso, p.f. 245ºC (desc).
HPLC: un pico sobre C18, k' = 1,86,
70:30:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA, caudal = 1 ml/min.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,00-11,70
(s a, COOH), 12,54 (s, 1H, benzoquinazolina NH), 9,84 (s, 1H, CH
aromático), 8,35 (d, 1H, J = 7,9, amida NH), 8,22 (d, 1H, J = 9,1,
CH aromático), 8,01 (d, 1H, J = 8,2, CH aromático), 7,78 (d, 1H, J
= 7,8, CH aromático), 7,60 (m, 2H, CH aromático,
4-aminobenzoil NH), 7,50 (t, 1H, J = 7,8, CH
aromático), 7,45-7,18 (m, 5H, CH aromático, amida
NH), 6,53 (d, 1H, J = 8,5, CH aromático), 6,39 (d, 1H, J = 14,7, CH
aromático), 4,67-4,46 (m, 3H, benzoquinazolina
9-CH_{2}, metina), 4,41 (m, 1H, metina), 3,55
(dd, 1H, J = 4,0, 12,3; phe Ar-CH_{2}), 3,06 (dd,
1H, J = 10,2, 12,9; phe Ar-CH_{2}), 2,42 (s, 3H,
CH_{3}), 2,16 (t, 2H, J = 7,3, glu 4-CH_{2}),
1,98-1,64 (m, 2H, glu
3-CH_{2}).
Análisis elemental: Calc. para
C_{36}H_{32}N_{5}O_{9}F\cdotH_{2}O (PM 715,69): C,
60,42; H, 4,79; N, 9,79. Encontrado: C, 60,49; H, 4,83; N,
9,76.
Espectro de masas: (Nebulización iónica)
698 (M+H)^{+}, 489, 361.
Espectro UV: (Tampón pH 7) \lambda_{max}
(\varepsilon) 265,2 (43700), 298,4 (25600), 347,9 (5320).
\lambda_{min} (e) 241,5 (20300), 284,9 (24600),
3440,0 (3140).
De acuerdo con el ejemplo 13, se hicieron
reaccionar 0,29 g de hemiclorhidrato del ácido
4-(N-(2,4-diamino-6-pteridinilmetil)-N-metilamino)benzoico
dihidrato (Aldrich) con 0,32 g de
5-O-metil-L-glutam-1-il-2-(metoxicarbonil)-L-fenilalaninato
de metilo\cdotHCl usando 0,35 ml de DECP (Aldrich) y 0,58 ml de
Et_{3}N. El producto bruto se purificó por cromatografía
ultrarrápida sobre 100 g de gel de sílice (7:7:1 de
CH_{2}Cl_{2}:acetona:MeOH) para producir 0,27 (51%) de
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-metil-L-glutam-1-il-2-(metoxicarbonil)-L-fenilalaninato
de metilo en forma de un polvo amarillo, p.f.
125-130ºC.
A un matraz de 50 ml de 3 bocas, equipado con una
entrada de nitrógeno y una agitador magnético, se le añadieron 0,12
g de
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-metil-L-glutam-1-il-2-(metoxicarbonil)-L-fenilalaninato
de metilo y 10 ml de 1:1 de H_{2}O:THF. La mezcla se trató con 29
mg de LiOH\cdotH_{2}O (J.T. Baker Chemical Co., Phillipsburg,
NJ) y se agitó a TA en una atmósfera de nitrógeno. Después de 48 h,
el análisis por HPLC (C18, 75:25:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA) indicó un
nuevo componente mayoritario a k' = 1,70 (aprox. 90%) y tres
componentes minoritarios a k' = 0,60, 1,03 y 2,58. La solución se
neutralizó por la adición gota a gota de HCl acuoso 1 N y se
concentró al vació a sequedad. El residuo se disolvió en 10 ml de
MeOH, se filtró y se diluyó con 20 ml de agua para precipitar el
producto. El MeOH se retiró por evaporación rotatoria y la
suspensión restante se congeló y se liofilizó para producir 65 mg
(45%) de
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-2-carboxi-L-fenilalanina
en forma de un polvo amarillo, p.f. 160ºC (desc).
HPLC: dos picos sobre C18, k' = 2,49
(98%), k' = 5,65 (2%); 78:22:01 de H_{2}O:MeCN:TFA, caudal = 1
ml/min.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,10-11,90
(s a, COOH), 8,64 (s, 1H, 7-CH pteridinil), 8,62 (s
a, 1H, NH_{2}), 8,18 (d, 1H, J = 8,0, amida NH), 7,92 (d, 1H, J =
8,0, amida NH), 7,80-7,20 (m a, 2H, NH_{2}), 7,77
(d, 1H, J = 7,3, CH aromático), 7,70 (d, 2H, J = 8,9, CH
aromático), 7,25 (m, 3H, CH aromático), 6,81 (d, 2H, J = 9,0, CH
aromático), 4,84 (s, 2H, pteridinil-CH_{2}), 4,49
(m, 1H, metina), 4,39 (m, 1H, metina), 3,51 (m, 1H, phe
Ar-CH_{2}), 3,24 (s, 3H,
N-CH_{3}), 3,08(m, 1H, phe
Ar-CH_{2}), 2,19 (t, 2H, J = 7,6, glu
4-CH_{2}), 1,97-1,72 (m, 2H, glu
3-CH_{2}).
Análisis elemental: Calc. para
C_{30}H_{31}N_{9}O_{8}\cdot2,7H_{2}O\cdot1,2TFA (PM
831,10): C, 46,82; H, 4,56; N, 15,17. Encontrado: C, 46,76; H,
4,48; N, 15,15.
Espectro de masas: (Nebulización iónica)
646 (M+H)^{+}, 410, 185.
Espectro UV: (Tampón pH 7) \lambda_{max}
(\varepsilon) 258,8 (23400), 307,0 (24200), 372,8 (7540).
\lambda_{min} (\varepsilon) 242,0 (16000),
273,2 (16200), 3440,3 (5900).
De acuerdo con el ejemplo 9, se acoplaron 2,01 g
de éster dimetílico del ácido L-aspártico\cdotHCl
(Sigma) con 3,00 g de ácido
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-metil-L-glutámico
usando 2,05 g de EDC (Aldrich) y 1,12 ml de
N-metilmorfolina. Esto dio 3,93 g (88%) de dimetil
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-metil-L-glutam-1-il-L-aspartato
de dimetilo en forma de un sólido blanco cristalino, p.f.
86-88ºC.
De acuerdo con el ejemplo 10, se hidrogenaron
2,00 g de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-metil-L-glutam-1-il-L-aspartato
de dimetilo en presencia de 0,45 g de Pd (C9 al 10%) y 0,39 ml de
cloruro de acetilo para producir 1,56 g (100%) de
5-O-metil-L-glutam-1-il-L-aspartato
de dimetilo\cdotHCl en forma de una espuma de color amarillo
claro.
^{1}H-RMN: (200 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 9,14 (d, 1H, J = 7,4, NH),
8,40 (s a, 3H, NH_{3}^{+}), 4,72 (m, 1H, glu metina), 3,89 (m,
1H, asp metina), 3,66 (s, 3H, CO_{2}CH_{3}), 3,65 (s, 3H,
CO_{2}CH_{3}), 3,65 (s, 3H, CO_{2}CH_{3}), 3,64 (s, 3H,
CO_{2}CH_{3}), 2,85 (d, 2H, J = 6,2, asp CH_{2}), 2,49 (m,
2H, glu 4-CH_{2}), 2,04 (m, 2H, glu
3-CH_{2}).
De acuerdo con el ejemplo 11, se acoplaron 0,50 g
de ácido
4-(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(f)quinazolin-9-il)metil)amino)-2-fluorobenzoico
con 0,45 g de
5-O-metil-L-glutam-1-il-L-aspartato
de dimetilo\cdotHCl usando 0,17 ml de cloroformiato de isobutilo
y 0,14 ml (2x) de N-metil morfolina. El producto bruto se
purificó por cromatografía ultrarrápida sobre 250 g de gel de
sílice (95:5 de CH_{2}Cl_{2}:MeOH) para producir 0,33 g (38%)
de
N-(N-(4-(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxo-benzo(f)quinazolin-9-il)metil)amino)-2-fluorobenzoil)-5-O-metil-L-glutam-1-il)-L-aspartato
de dimetilo en forma de un polvo blanco, p.f.
198-200ºC.
^{1}H-RMN: (200 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 12,54 (s, 1H,
benzoquinazolina NH), 9,85 (s, 1H, CH aromático), 8,55 (d, 1H, J =
7,7, amida NH), 8,23 (d, 1H, J = 8,8, CH aromático), 8,02 (d, 1H, J
= 8,4, CH aromático), 7,70-7,45 (m, 4H, CH
aromático, amida NH), 7,33 (m, 1H,
4-amino-benzoil NH), 6,55 (dd, 1H, J
= 8,8, 1,9, CH aromático), 6,42 (dd, 1H, J = 15,3, 1,7, CH
aromático), 4,72-4,41 (m, 4H, benzoquinazolina
9-CH_{2}, glu y asp metinas), 3,62 (s, 3H,
CO_{2}CH_{3}), 3,60 (s, 3H, CO_{2}CH_{3}), 3,55 (s, 3H,
CO_{2}CH_{3}), 2,91-2,66 (m, 2H, asp CH_{2}),
2,42 (s, 3H, CH_{3}), 2,34 (t, 2H, J = 7,7, glu
4-CH_{2}), 2,13-1,80 (m, 2H, glu
3-CH_{2}).
De acuerdo con el ejemplo 12, se saponificaron
0,12 g de
N-(N-(4-(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxo-benzo(f)quinazolin-9-il)metil)amino)-2-fluorobenzoil)-5-O-metil-L-glutam-1-il)-L-aspartato
de dimetilo en 8 ml de 1:1 de THF-H_{2}O usando
45 mg de LiOH\cdotH_{2}O (Baker). El análisis del producto bruto
por HPLC de fase inversa (C18, 80:20:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA)
indicó un componente mayoritario a k' = 1,73 (90%) y un componente
minoritario a k' = 1,28. EL material se purificó por HPLC
semipreparativa usando una elución en gradiente (C18,
80:20:0,1\rightarrow75:25:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA durante 20
min). Las fracciones puras (según se determinó por la HPLC
analítica) se combinaron y se concentraron al vacío. El residuo se
mezcló con 20 ml de agua y se trató con suficiente
LiOH\cdotH_{2}O para disolver el sólido. La solución se filtró y
se acidificó a pH = 3,0 por la adición de HCl 1 N. Precipitó un
sólido que se separó por centrifugación, se lavó con cuatro ciclos
de suspensión
acuosa-centrifugación-decantación, y
se liofilizó para producir 57 mg (48%) de ácido
N-(N-(4-((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(f)quinazolin-9-il)metil)amino)-2-fluorobenzoil)-L-glutam-1-il-L-aspártico
en forma de un sólido blanquecino, p.f. 185ºC (desc).
HPLC: un pico sobre C18, k' = 1,42
75:25:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA, caudal = 1 ml/min.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 12,85-12,00
(s a, COOH), 12,53 (s, 1H, benzoquinazolina NH), 9,84 (s , 1H, CH
aromático), 8,36 (d, 1H, J = 7,9, amida NH), 8,21 (d, 1H, J = 8,8,
CH aromático), 8,01 (d, 1H, J = 8,3, CH aromático),
7,67-7,46 (m, 4H, CH aromático, amida NH), 7,32 (m,
1H, 4-aminobenzoil NH), 6,53 (d, 1H, J = 8,5, CH
aromático), 6,40 (d, 1H, J = 14,8, CH aromático),
4,64-4,44 (m, 4H, benzoquinazolina
9-CH_{2}, glu metina, asp metina),
2,75-2,53 (m, 2H, asp CH_{2}), 2,42 (s, 3H,
CH_{3}), 2,25 (t, 2H, J = 7,3, glu 4-CH_{2}),
1,98 (m, 1H, glu 3-CH_{2}), 1,83 (m, 1H, glu
3-CH_{2}).
Análisis elemental: Calc. para
C_{30}H_{28}N_{5}O_{9}F\cdot1,8H_{2}O (PM 654,01): C,
55,10; H, 4,87; N, 10,71. Encontrado: C, 55,04; H, 4,82; N,
10,61.
Espectro de masas: (Nebulización iónica)
622 (M+H)^{+}, 316, 213, 156.
Espectro UV: (Tampón pH 7) \lambda_{max}
(\varepsilon) 264,8 (46200), 298,4 (28500), 347,8 (6180).
\lambda_{min} (\varepsilon) 237,9 (19500),
285,7 (27900), 340,0 (3820).
De acuerdo con el ejemplo 13, se acoplaron 0,200
g de hemiclorhidrato del ácido
4-(N-(2,4-diamino-6-pteridinilmetil)-N-metilamino)benzoico
dihidrato (Aldrich) con 0,18 g de
5-O-metil-L-glutam-1-il-L-aspartato
de dimetilo\cdotHCl usando 0,24 ml de DECP (Aldrich) y 0,41 ml de
Et_{3}N. El producto bruto se purificó por cromatografía
ultrarrápida sobre 100 g de gel de sílice (7:7:1 de
CH_{2}Cl_{2}:acetona:MeOH) para producir 0,17 g (53%) de
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-metil-L-glutam-1-il)-L-aspartato
de dimetilo en forma de un polvo amarillo, p.f.
130-135ºC.
Para el procedimiento B para preparar este
compuesto, véase el ejemplo 125.
Un matraz de 50 ml de 3 bocas, equipado con un
agitador magnético y una entrada de nitrógeno, se cargó con 0,16 g
de
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilaminobenzoil)-5-O-metil-L-glutam-1-il)-L-aspartato
de dimetilo y 10 ml de 1:1 de THF:H_{2}O. La solución se trató
con 44 mg de LiOH\cdotH_{2}O (Baker) y se agitó a TA en una
atmósfera de N_{2}. Después de 3h, la tlc (SiO_{2}, 7:7:1 de
CH_{2}Cl_{2}:acetona:MeOH) indicó que no quedaba material de
partida a R_{f} = 0,30 y una sola mancha a R_{f} = 0,0. El
análisis por HPLC de fase inversa (C18, 85:15:0,1 de
H_{2}O:MeCN:TFA) indicó un componente mayoritario a k' = 2,65
(90%) y un componente minoritario a k' = 1,94. La solución se
neutralizó por la adición de HCl 1 N y se concentró al vacío a
sequedad. El producto bruto se purificó por HPLC semipreparativa
(C18, 87:13:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA). Las fracciones puras (según
se determinó por la HPLC analítica) se combinaron y se concentraron
al vacío a sequedad. El residuo se disolvió en 20 ml de H_{2}O y
se liofilizó para producir 65 mg (32%) de ácido
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-L-aspártico
en forma de un polvo amarillo-naranja, p.f.
165-180ºC (desc).
HPLC: un pico sobre C18, k' = 2,45
85:15:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA, caudal = 1 ml/min.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,00-11,85
(s a, COOH), 9,17 (s a, 1H, NH_{2}), 8,96 (s a, 1H, NH_{2}),
8,71 (s, 1H, pteridinil 7-CH),
8,60-8,30 (s a, 1H, NH_{2}), 8,21 (d, 1H, J = 8,0,
amida NH), 8,06 (d, 1H, J = 7,8, amida NH),
7,85-7,43 (s a, 1H, NH_{2}), 7,75 (d, 2H, J = 8,7,
CH aromático), 6,82 (d, 2H, J = 8,8, CH aromático), 4,87 (s, 2H,
pteridinil-CH_{2}), 4,59-4,38 (m,
2H, 2 metinas), 3,25 (s, 3H, N-CH_{3}),
2,75-2,53 (m, 2H, asp CH_{2}), 2,28 (t, 2H, J =
7,5, glu 4-CH_{2}), 2,01 (m, 1H, glu
3-CH_{2}), 1,88 (m, 1H, glu
3-CH_{2}).
Análisis elemental: Calc. para
C_{24}H_{27}N_{9}O_{8}\cdot1,9H_{2}O\cdot1,6TFA (PM
786,20): C, 41,55; H, 4,15; N, 16,03. Encontrado: C, 41,53; H,
4,19; N, 16,00.
Espectro de masas: (Nebulización iónica)
570 (M+H)^{+}, 223.
Espectro UV: (Tampón pH 7) \lambda_{max}
(\varepsilon) 258,7 (24400), 307,3 (26800), 372,9 (8080).
\lambda_{min} (\varepsilon) 240,0 (14800),
272,9 (17000), 345,0 (6420).
De acuerdo con el ejemplo 9, se acoplaron 3,17 g
de éster dietílico del ácido L-glutámico\cdotHCl
(Sigma) con 4,09 g de ácido
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-etil-L-glutámico
usando 2,66 g de EDC (Aldrich) y 1,45 ml de
N-metilmorfolina. Esto dio 4,80 g (74%) de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-etil-L-glutam-1-il-L-glutamato
de dietilo en forma de un sólido blanco cristalino, p.f. 104ºC.
A un recipiente Parr de 500 ml se le añadieron
0,75 de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-etil-L-glutam-1-il-L-glutamato
de dietilo, 0,14 g de Pd(C) al 10% y 60 ml de EtOH en una
cantidad abundante de N_{2}. La mezcla se desoxigenó burbujeando
N_{2} a su través durante 7 minutos, se trató con 1,52 ml de HCl
etéreo 1 M y se hidrogenó a 45 psi (310,26 kPa) durante 18 h. El
recipiente se purgó con N_{2}, el catalizador se retiró por
filtración a través de celite y el filtrado se concentró al vacío a
sequedad para producir 0,60 (99%) de
5-O-etil-L-glutam-1-il-L-glutamato
de dietilo\cdotHCl en forma de una espuma de color amarillo
claro.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 9,11 (d, 1H, J = 7,5, NH),
8,41 (s a, 3H, NH_{3}^{+}), 4,32 (m, 1H, metina), 4,06 (m, 6H,
etil CH_{2}), 3,92 (m, 1H, metina), 2,47 (m, 4H, glu
4-CH_{2}), 2,12-1,79 (m, 4H, glu
3-CH_{2}), 1,19 (t, 9H, J = 7,1, etil
CH_{3}).
De acuerdo con el ejemplo 11, se acoplaron 0,57 g
de ácido
4-(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(f)quinazolin-9-il)metil)amino)-2-fluorobenzoico
con 0,60 g de
5-O-etil-L-glutam-1-il)-L-glutamato
de dietilo\cdotHCl usando 0,20 ml de cloroformiato de isobutilo y
0,17 ml (2x) de N-metilmorfolina. El producto bruto se
purificó por cromatografía ultrarrápida sobre 350 g de gel de
sílice (EtOAc\rightarrow98:2 de EtOAc:MeOH) para producir 0,27 g
(25%) de
N-(N-(4-(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(f)quinazolin-9-il)metil)amino)-2-fluorobenzoil)-5-O-etil-L-glutam-1-il)-L-glutamato
de dietilo en forma de un polvo blanco p.f.
185-187ºC.
Un matraz de 250 ml de 3 bocas, equipado con un
agitador magnético y una entrada de nitrógeno, se cargó con 0,217 g
de
N-(N-(4-(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(f)quinazolin-9-il)metil)amino)-2-fluorobenzoil)-5-O-etil-L-glutam-1-il)-L-glutamato,
40 ml de NaOH acuoso 0,2 N y 15 ml de EtOH. La mezcla se agitó a TA
en una atmósfera de N_{2}. El material de partida sólido se
disolvió lentamente para dar una solución transparente. Después de 2
h, la tlc (SiO_{2}, EtOAc) indicó que no quedaba material de
partida a R_{f} = 0,15 y una nueva mancha a R_{f} = 0,0. La
solución se acidificó a pH = 3,00 por la adición de HCl 1 N.
Precipitó un sólido blanco que se separó por centrifugación, se
lavó con cuatro ciclos de suspensión
acuosa-centrifugación-decantación y
se liofilizó para producir 0,17 g (84%) de ácido
N-(N-(4-(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(f)quinazolin-9-il)metil)amino)-2-fluorobenzoil)-L-glutam-1-il)-L-glutámico
en forma de un polvo blanco, p.f. 180ºC (desc). Mediante la HPLC se
determinó que el producto era puro.
HPLC: un pico sobre C18, k' = 1,66
75:25:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA, caudal = 1 ml/min.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 12,65-11,90
(s a, COOH), 12,53 (s, 1H, benzoquinazolina NH), 9,84 (s, 1H, CH
aromático), 8,29 (d, 1H, J = 7,5 amida NH), 8,22 (d, 1H, J = 8,9,CH
aromático), 8,01 (d, 1H, J = 8,0, CH aromático), 7,60 (m, 3H, CH
aromático, amida NH), 7,51 (t, 1H, J = 9,0, CH aromático), 7,33 (m,
1H, 4-aminobenzoil NH), 6,54 (dd, 1H, J = 8,5, 1,9,
CH aromático), 6,41 (dd, 1H, J = 13,9, 1,4, CH aromático), 4,57 (d,
2H, J = 5,2, benzoquinazolina 9-CH_{2}), 4,49 (m,
1H, metina), 4,22 (m, 1H, metina), 2,43 (s, 3H, CH_{3}), 2,28 (m,
4H, glu 4-CH_{2}), 2,10-1,70 (m,
4H, glu 3-CH_{2}).
Análisis elemental: Calc. para
C_{31}H_{30}N_{5}O_{9}F\cdot2H_{2}O (PM 671,64): C,
55,44; H, 5,10; N, 10,43. Encontrado: C, 55,38; H, 5,12; N,
10,26.
Espectro de masas: (FAB) 636
(M+H)^{+}, 613, 581, 549.
Espectro UV: (Tampón pH 7) \lambda_{max}
(\varepsilon) 264,9 (45100), 296,1 (28000), 331,4 (7280), 348,1
(5990).
\lambda_{min} (\varepsilon) 285,6 (27200),
329,3 (7040), 339,8 (3700).
\lambda_{sh} (\varepsilon) 271,5 (41900).
De acuerdo con el ejemplo 13, se acoplaron 0,142
g de hemiclorhidrato del ácido
4-(N-(2,4-diamino-6-pteridinil-
metil)-N-metilamino)benzoico dihidrato (Aldrich) con 0,15 g de 5-O-etil-L-glutam-1-il-L-glutamato de dietilo\cdotHCl usando 0,18 ml de DECP (Aldrich) y 0,31 ml de Et_{3}N. El producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre 120 g de gel de sílice (7:7:1 CH_{2}Cl_{2}:acetona:MeOH) para producir 0,14 g (56%) de N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-etil-L-glutam-1-il-L-glutamato de dietilo en forma de un polvo amarillo, p.f. 105-109ºC.
metil)-N-metilamino)benzoico dihidrato (Aldrich) con 0,15 g de 5-O-etil-L-glutam-1-il-L-glutamato de dietilo\cdotHCl usando 0,18 ml de DECP (Aldrich) y 0,31 ml de Et_{3}N. El producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre 120 g de gel de sílice (7:7:1 CH_{2}Cl_{2}:acetona:MeOH) para producir 0,14 g (56%) de N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-etil-L-glutam-1-il-L-glutamato de dietilo en forma de un polvo amarillo, p.f. 105-109ºC.
Para el procedimiento B para preparar este
compuesto, véase el ejemplo 129.
De acuerdo con el ejemplo 33, se saponificaron
0,125 g de
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilaminobenzoil)-5-O-metil-L-glutam-1-il)-L-glutamato
en 10 ml de 1:1 de THF:H_{2}O usando 23 mg de LiOH (Fisher).
Después de agitar a TA en una atmósfera de N_{2} durante 18 h, la
solución se acidificó a pH = 2,0 por la adición de HCl 1 N y después
se concentró al vacío a sequedad. EL análisis del residuo por HPLC
(C18, 85:15:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA) indicó un componente
mayoritario a k' = 2,89 (90%) y dos componentes minoritarios a k' =
2,46 y 1,17. El producto bruto se purificó por HPLC semipreparativa
(C18, 87:13:0,5 de H_{2}O:MeCN:TFA) y se liofilizó para producir
37 mg (24%) de ácido
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-L-glutámico
en forma de un polvo amarillo, p.f. 178ºC.
HPLC: un pico sobre C18, k' = 2,90,
85:15:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA, caudal = 1 ml/min.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,20-12,00
(s a, COOH), 9,30 (s a, 1H, NH_{2}), 9,10 (s a, 1H, NH_{2}),
8,74 (s, 1H, pteridinil 7-CH),
8,72-8,42 (s a, 1H, NH_{2}), 8,20 (d, 1H, J = 7,5,
amida NH), 8,07 (d, 1H, J = 7,5, amida NH), 7,76 (d, 2H, J = 8,8,
CH aromático), 7,61-7,40 (s a, 1H, NH_{2}), 6,83
(d, 2H, J = 8,8, CH aromático), 4,90 (s, 2H,
pteridinil-CH_{2}), 4,43 (m, 1H, metina), 4,20 (m,
1H, metina), 3,27 (s, 3H, N-CH_{3}), 2,30 (m, 4H,
glu 4-CH_{2}), 2,08-1,77 (m, 4H,
glu 3-CH_{2}).
Análisis elemental: Calc. para
C_{25}H_{29}N_{9}O_{8}\cdot2,3H_{2}O\cdot1,7 TFA (PM
818,84): C, 41,66; H, 4,35; N, 15,40. Encontrado: C, 41,61; H,
4,25; N, 15,44.
Espectro de masas: (FAB) 584
(M+H)^{+}, 309, 275, 176, 155, 119.
Espectro UV: (Tampón pH 7)
\lambda_{max}x (\varepsilon) 220,9 (20500), 258,5 (21500),
306,7 (23200), 372,5 (7180).
\lambda_{min}(\varepsilon) 240,1
(13400), 272,5 (15100), 344,8 (5730).
Una solución de 5,70 g de
3-amino-L-tirosina
(Aldrich) en 35 ml de HCl acuoso 2,15 N se enfrió a 0ºC y se trató
con una solución de 1,41 g de NaNO_{2} (Aldrich) en 5 ml de agua,
seguido de 2,97 g de Na_{2}CO_{3}. Después de agitar a 0ºC
durante 7 min, la solución se añadió lentamente (mediante un embudo
de adición) a una mezcla agitada de 3,58 g de CuCN (Aldrich), 5,88
g de NaCN (Aldrich) y 5,72 g de Na_{2}CO_{3} en 40 ml de agua
mantenida a 75ºC en un matraz de 250 ml de 3 bocas equipado con un
condensador. Durante la adición, se produjo desprendimiento vigoroso
de gas y la mezcla de reacción cambió de color a rojo
oscuro-naranja. La mezcla de reacción se agitó a
75ºC durante 2 horas, se calentó a 95ºC y se agitó durante 1 h más.
Después de enfriar a TA, la mezcla de reacción se acidificó a pH =
2,0 por la adición de HCl concentrado mediante el embudo de
adición. El gas desprendido se depuró a través de un purgador de
NaOH acuoso al 20% seguido de un purgador de NaOCl al 5% (Clorox).
La mezcla se filtró y el pH del filtrado se ajustó a 6,0 con
NH_{4}OH. La solución parda se mezcló con 300 ml de agua y se
agitó con 300 g de resina de intercambio iónico DOWEX
50WX-8 (forma ácida). La resina se filtró, se lavó
con 1 l de agua, se mezcló con 500 ml de agua y la mezcla se
gasificó a pH 11 por la adición de NH_{4}OH concentrado. La mezcla
se filtró y el filtrado se concentró al vacío a sequedad. El
residuo pardo oscuro se suspendió en 20 ml de agua y se trató con
suficiente NaOH acuoso 1 N para disolver el sólido. El pH después
se ajustó a 6,0 por la adición de HCl acuoso 1 N. Se formó un
precipitado que se recogió por filtración y se secó al vacío para
producir 1,45 g (35%) de
3-ciano-L-tirosina
en forma de un sólido de color pardo chocolate, p.f. >250ºC.
^{1}H-RMN: (200 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 9,60-7,20 (s
a, NH_{2}), 7,39 (s, 1H, CH aromático), 7,30 (m, 1H, CH
aromático), 6,98 (m, 1H, CH aromático), 3,52 (m, 1H, metina), 2,92
(m, 2H, ArCH_{2}).
Un matraz de 250 ml de 3 bocas, equipado con un
condensador de reflujo y un agitador magnético, se cargó con 1,45 g
de
3-ciano-L-tirosina,
50 ml de HCl concentrado y 50 ml de agua. La solución se calentó a
reflujo con agitación. Después de 2 días, el análisis de la mezcla
de reacción por HPLC (C18, 90:10:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA) indicó
un componente mayoritario a k' = 2,23 (75%) y a un componente
minoritario a k' = 1,59 (25%). Después de 4 días, la HPLC indicó
sólo el material de k' = 2,23. La mezcla de reacción se enfrió a
TA, se filtró y el filtrado se concentró al vacío a sequedad para
dar 1,2 g de
3-carboxi-L-tirosina
en forma de un sólido pardo oscuro. El análisis por IR (nujol)
indicó pérdida del fragmento de nitrilo de la
3-ciano-L-tirosina,
a 2223 cm^{-1}. El sólido bruto se añadió a 60 ml de MeOH anhidro
en un matraz de 250 ml de 3 bocas equipado con un condensador y un
agitador magnético. La mezcla se acidificó burbujeando gas HCl a su
través durante 5 min y se calentó a reflujo con agitación. Después
de 6 h, la mezcla de reacción se enfrió a TA y se neutralizó con
NaHCO_{3} sólido. La mezcla se concentró al vacío a sequedad, se
mezcló con 100 ml de agua y se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (4 x 50
ml). Los extractos combinados se lavaron con NaHCO_{3} acuoso al
5% (2 x 50 ml), se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y se concentraron
al vacío hasta 10 ml. La solución se diluyó con 35 ml de éter y se
trató con 5,5 ml de HCl etéreo 1 M. Precipitó un sólido que se
recogió por filtración, se lavó con éter y se secó al vacío para
producir 0,90 (50%) de
3-(metoxicarbonil)-L-tirosinato de
metilo\cdotHCl en forma de un polvo blanquecino, p.f.
211-213ºC.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 10,45 (s, 1H, OH), 8,59 (s a,
3H, NH_{3}^{+}), 7,66 (s, 1H, CH aromático), 7,38 (dd, 1H, J =
7,9, 1,1, CH aromático) 6,97 (d, 1H, J = 7,9, CH aromático), 4,26
(m, 1H, metina), 3,89, (s, 3H, CO_{2}CH_{3}), 3,68 (s, 3H,
CO_{2}CH_{3}), 3,09 (m, 2H, ArCH_{2}).
De acuerdo con el ejemplo 9, se acoplaron 0,80 g
de 3-(metoxicarbonil)-L-tirosinato
de metilo\cdotHCl con 0,82 g de ácido
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-metil-L-glutámico
usando 0,56 de EDC (Aldrich) y 0,30 ml de N-metilmorfolina.
Esto dio 1,24 g (85%) de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-metil-L-glutam-1-il-3-(metoxicarbonil)-L-tirosinato
de metilo en forma de un sólido blanco, p.f.
142-144ºC.
De acuerdo con el ejemplo 10, se hidrogenaron
0,99 g de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-metil-L-glutam-1-il-3-(metoxicarbonil)-L-tirosinato
de metilo usando 0,19 g de Pd(C) al 10% y 0,15 ml de cloruro
de acetilo en 90 ml de 2:1 de EtOH:EtOAc para producir 0,75 g (93%)
de
5-O-metil-L-glutam-1-il-3-(metoxicarbonil)-L-tirosinato
de metilo\cdotHCl en forma de una espuma de color amarillo claro,
p.f. 95-97ºC (desc).
De acuerdo con el ejemplo 11, se acoplaron 0,65 g
de ácido
4-(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(f)quinazolin-9-il)metil)amino)-2-fluorobenzoico
con 0,75 g de
5-O-metil-L-glutam-1-il-3-(metoxicarbonil)-L-tirosinato
de metilo\cdotHCl usando 0,22 ml de cloroformiato de isobutilo y
0,19 ml (2x) de N-metilmorfolina. El producto bruto se
purificó por cromatografía ultrarrápida sobre 300 g de gel de sílice
(99:1\rightarrow94:6 de EtOAc:MeOH) para producir 0,53 g (40%) de
N-(N-(4(((1,2-Dihidro-3-metil-1-oxobenzo(f)quinazolin-9-il)metil)amino)-2-fluorobenzoil)-5-O-metil-L-glutam-1-il)-3-(metoxicarbonil)-L-tirosinato
de metilo en forma de un polvo blanco, p.f.
195-203ºC (desc).
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 12,52 (benzoquinazolina NH)
10,38 (s, 1H, OH), 9,83 (s, 1H, CH aromático), 8,45 (d, 1H, J = 7,5
amida NH), 8,21 (d, 1H, J = 8,9,CH aromático), 8,00 (d, 1H, J =
8,3, CH aromático) 7,60, (m, 3H, CH aromático,
4-aminobenzoil NH), 7,48 (m, 2H, CH aromático), 7,36
(m, 2H, CH aromático, amida NH), 6,86 (d, 1H, J = 8,6, CH
aromático), 6,52 (dd, 1H, J = 8,5, 1,9, CH aromático), 6,39 (dd,
1H, J = 13,9, 1,5, CH aromático), 4,57 (d 2H, J = 5,6,
benzoquinazolina 9-CH_{2}), 4,45 (m, 2H, metinas),
3,84 (s, 3H, CO_{2}CH_{3}), 3,58 (s, 3H, CO_{2}CH_{3}),
3,52 (s, 3H, CO_{2}CH_{3}), 3,05-2,80 (m, 2H,
ArCH_{2}), 2,42 (s, 3H, CH_{3}), 2,25 (t, 2H, J = 7,8, glu
4-CH_{2}), 2,00-1,77 (m, 2H, glu
3-CH_{2}).
Una solución de 0,15 g de
N-(N-(4-(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(f)quinazolin-9-il)metil)amino)2-fluorobenzoil)-5-O-metil-L-glutam-1-il)-3-(metoxicarbonil)-L-tirosinato
de metilo en 20 ml de NaOH acuoso 0,2 N se agitó a TA en una
atmósfera de N_{2} durante 18 horas. El análisis de la solución
por HPLC (C18, 70:30:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA) indicó un componente
mayoritario a k' = 1,0 (90%) y dos componentes minoritarios a k' =
1,0 y 2,6. La solución se acidificó a pH 2,5 por la adición de HCl 1
N. Esto produjo un precipitado blanco que se separó por
centrifugación y se purificó por HPLC semipreparativa (C18,
75:25:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA). Las fracciones puras (según se
determinó por la HPLC analítica) se combinaron y se concentraron al
vacío a sequedad. El residuo se disolvió en 20 ml de NaOH acuoso
0,15 N y la solución se acidificó a pH = 3,0 por la adición de HCl
1 N. El precipitado blanco resultante se separó por centrifugación,
se lavó con cuatro ciclos de suspensión
acuosa-centrifugación-decantación y
se liofilizó para producir 39 mg (26%) de
3-carboxi-N-(N-(4-(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(f)quinazolin-9-il)metil)amino)-2-fluorobenzoil)-L-glutam-1-il)-L-tirosina
en forma de un polvo blanco, p.f. 198-205ºC
(desc).
HPLC: un pico sobre C18, k' = 1,86,
70:30:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA, caudal = 1 ml/min.
^{1}H-RMN: (200 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,00-11,00
(m a, COOH, benzoquinazolina NH), 9,86 (s, 1H, CH aromático), 8,28
(d, 1H, J = 7,5, amida NH), 8,24 (d, 1H, J = 8,9, CH aromático),
8,03 (d, 1H, J = 8,4, CH aromático), 7,70-7,42 (m,
5H, CH aromático, 4-aminobenzoil NH),
7,40-7,24 (m, 2H, CH aromático, amida NH), 6,78 (d,
1H, J = 8,6, CH aromático), 6,55 (dd, 1H, J = 8,5, 1,9, CH
aromático), 6,42 (dd, 1H, J = 13,9, 1,5, CH aromático), 4,58 (d,
2H, J = 5,8, benzoquinazolina 9-CH_{2}),
4,55-4,31 (m, 2H, metinas),
3,06-2,75 (m, 2H, ArCH_{2}), 2,24 (s, 3H,
CH_{3}), 2,21 (t, 2H, J = 7,6, glu 4-CH_{2}),
2,08-1,70 (m, 2H, glu
3-CH_{2}).
Análisis elemental: Calc. para
C_{36}H_{32}N_{5}O_{10}F\cdot2,2H_{2}O (PM 753,31): C,
57,40; H, 4,87; N, 9,30. Encontrado: C, 57,37; H, 4,97; N,
9,28.
Espectro de masas: (FAB) 714
(M+H)^{+}, 613, 549, 461, 360, 309.
Espectro UV: (Tampón pH 7) \lambda_{max}
(\varepsilon) 265,9 (4470000), 300,2 (28200), 348,3 (5270).
\lambda_{min} (\varepsilon) 246,3 (23400),
285,2 (25500), 340,8 (3630).
Un matraz de 250 ml de 3 bocas, equipado con un
agitador magnético y un condensador, se cargó con 4,1 g de
3-ciano-L-tirosina y
100 ml de HCl acuoso 6 N. La mezcla se calentó a reflujo con
agitación. Después de 36 h, la HPLC (C18, 90:10:01 de
H_{2}O:MeCN:TFA) indicó que no quedaba material de partida a k' =
1,33 y un nuevo componente mayoritario a k' = 1,69. La mezcla de
reacción se enfrió a TA, se filtró para retirar los sólidos y se
concentró al vacío a sequedad. El residuo se disolvió en 100 ml de
8:2 de H_{2}O:MeOH y las soluciones se pasaron a través de dos
lechos cortos C18 (3,5 x 4,5 cm, separaciones de EM LiCHroprep
RP-18) lavando con 8:2 de H_{2}O:MeOH. El filtrado
se concentró al vacío a sequedad para producir 4,5 g de
3-carboxitirosina en forma de un sólido pardo. Una
porción de este material (1,30 g) se disolvió en 40 ml de
1,4-dioxano con 2 ml de H_{2}SO_{4} concentrado
y la solución se añadió a 30 ml de isobutileno (condensado a -78ºC)
en un recipiente a presión de 300 ml equipado con un agitador
magnético. El recipiente se tapó, se calentó a TA y se agitó.
Después de 48 h, el recipiente se enfrió a 0ºC en un baño de agua
enfriada con hielo, se abrió, y la mezcla se trató con 20 de
NaHCO_{3}. Después de dejar que se evaporara el isobutileno, la
mezcla se suspendió en 300 ml de agua y se extrajo con
CH_{2}Cl_{2} (4 x 100 ml). Los extractos de CH_{2}Cl_{2}
combinados se lavaron con NaHCO_{3} acuoso al 5% (2 x 50 ml), se
secaron sobre MgSO_{4} anhidro y se concentraron al vacío para
proporcionar un aceite amarillo-pardo. El análisis
por tlc (SiO_{2} 97:3 CH_{2}Cl_{2}:MeOH) indicó un componente
mayoritario a R_{f} = 0,41 y tres componentes minoritarios a
R_{f} = 0,30, 0,25 y 0,0. El material bruto se purificó por
cromatografía ultrarrápida sobre 75 g de gel de sílice (94:6 de
CH_{2}Cl_{2}:MeOH) para dar 1,2 g de un aceite amarillo claro.
El aceite se disolvió en 40 ml de éter y se trató con 3,9 ml de HCl
etéreo 1 M. Se formó un precipitado que se recogió por filtración y
se secó al vacío para producir 1,14 g (53%) de
3-(terc-butoxicarbonil)-L-tirosinato
de terc-butilo\cdotHCl en forma de un sólido blanco
esponjoso. Se preparó una muestra analítica (26 mg) por
recristalización en MeOH-éter, p.f. 205ºC (desc).
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 10,69 (s, 1H, OH), 8,39 (s a,
3H, NH_{3}^{+}), 7,57 (d, 1H, J = 2,2, CH aromático), 7,43 (dd,
1H, J = 8,6, 2,2, CH aromático), 6,96 (d, 1H, J = 8,4, CH
aromático), 4,12 (m, 1H, metina), 3,11 (dd, 1H, J = 14,3, 5,3,
ArCH_{2}), 2,97 (dd, 1H, J = 14,1, 8,1, ArCH_{2}), 1,57 (s, 9H,
t-Bu), 1,36 (s, 9H, t-Bu).
De acuerdo con el ejemplo 9, se acoplaron 0,323 g
de
3-(terc-butoxicarbonil)-L-tirosinato
de terc-butilo\cdotHCl con 0,292 g
\gamma-t-butil éster del ácido
N-benciloxicarbonil-L-glutámico
(Sigma) usando 0,174 g de EDC (Aldrich) y 0,095 ml de
N-metilmorfolina. El producto bruto se purificó por
cromatografía ultrarrápida sobre 85 g de gel de sílice (75:25 de
hexano:EtOAc) para producir 0,49 g (89%) de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-(terc-butoxicarbonil)-L-tirosinato
de terc-butilo en forma de una espuma blanca pegajosa.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 10,67 (s, 1H, OH), 8,21 (d,
1H, J = 7,4 NH), 7,56 (s, 1H, CH aromático),
7,46-7,26 (m, 7H, CH aromático, NH), 6,86 (d, 1H, J
= 8,5, CH aromático), 5, 00 (m, 2H, PhCH_{2}O), 4,31 (m, 1H,
metina), 4,06 (m, 1H, metina), 2,89 (d, 2H, J = 6,9, ArCH_{2}),
2,21 (t, 2H, J = 7,7, glu 4-CH_{2}),
1,92-1,64 (m, 2H, glu 3-CH_{2}),
1,57 (s, 9H, t-Bu), 1,38 (s, 9H,
t-Bu), 1,33 (s, 9H, t-Bu).
A un recipiente Parr de 300 ml se le añadieron
0,076 g de Pd(C) al 10% y 20 ml de MeOH en una cantidad
abundante de nitrógeno. A esto se le añadió una solución de 0,49 g
de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-(terc-butoxicarbonil)-L-tirosinato
de terc-butilo en 50 ml de MeOH. La mezcla se desoxigenó
burbujeando nitrógeno a su través durante 7 minutos y se hidrogenó
a 50 psi (344,73kPa) durante 3 h. El recipiente se purgó con
nitrógeno, se retiró el catalizador por filtración a través de
celite y el filtrado se concentró al vacío para dar un aceite
viscoso.
Este material se purificó por cromatografía
ultrarrápida sobre 70 g de gel de sílice (98:2 de
CH_{2}Cl_{2}:MeOH) para producir 0,31 g (82%) de
5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-(terc-butoxicarbonil)-L-tirosinato
de terc-butilo en forma de un aceite transparente viscoso.
Se preparó una pequeña muestra de la sal HCl correspondiente para
el análisis por ^{1}H-RMN por tratamiento de 5 mg
del producto con un exceso de HCl etéreo 1 N y concentración a
sequedad.
^{1}H-RMN: (200 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 10,68 (s, 1H, OH), 8,99 (d,
1H, J = 7,1 NH), 8,33 (s a, 3H, NH_{3}^{+}), 7,60 (d, 1H, J =
2,0, CH aromático), 7,47 (dd, 1H, J = 8,6, 2,2, CH aromático), 6,92
(d, 1H, J = 8,4, CH aromático), 4,38 (m, 1H, metina), 3,87 (m, 1H,
metina), 2,92 (d, 2H, J = 7,1, ArCH_{2}), 2,34 (m, 2H, glu
4-CH_{2}), 2,00 (m, 2H, glu
3-CH_{2}), 1,59 (5, 9H, t-Bu),
1,41 (s, 9H, t-Bu), 1,35 (s, 9H,
t-Bu).
Un matraz de 100 ml de 3 bocas seco, equipado con
una entrada de nitrógeno y un agitador magnético, se cargó con 25
ml de DMF anhidra, 0,26 ml de DECP (Aldrich) y 0,28 ml de
Et_{3}N. A esta solución se le añadieron 0,217 g de
hemiclorhidrato del ácido
4-(N-(2,4-diamino-6-pteridinilmetil)-N-metilamino)benzoico
dihidrato (Aldrich). El material de partida sólido se disolvió
lentamente para dar una solución de color amarillo claro. Después de
agitar durante 3 h en una atmósfera de N_{2}, la solución se trató
con 0,29 g de
5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-(terc-butoxicarbonil)-L-tirosinato
de terc-butilo en 5 ml de DMF. La solución se agitó durante
18 h a TA y después se concentró al vacío a sequedad. El residuo se
disolvió en 85 ml de CHCl_{3}. La solución resultante se lavó con
NH_{4}OH acuoso al 1% (3x60 ml), se secó sobre MgSO_{4} anhidro
y se concentró para dar un aceite amarillo-naranja
viscoso. Este material se purificó por cromatografía ultrarrápida
sobre 150 g de gel de sílice (7:7:1 CH_{2}Cl_{2}:acetona:MeOH)
para producir 0,245 g (52%) de
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-terc-L-glutam-1-il-3-(terc-butoxicarbonil)-L-tirosinato
de terc-butilo en forma de un polvo amarillo claro, p.f.
140-143ºC.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 10,64 (s, 1H, OH), 8,57 (s,
1H, pteridinil 7-CH), 8,15 (d, 1H, J = 7,4, amida
NH), 7,99 (d, 1H, 7,9, amida NH), 7,71 (d, 2H, J = 8,8, CH
aromático), 7,67 (s a ,1H, NH_{2}), 7,53 (d, 1H, J = 2,0, CH
aromático), 7,43 (s a, 1H, NH_{2}), 7,37 (dd, 1H, J = 8,6, 2,1, CH
aromático), 6,81 (m, 3H, CH aromático), 6,59 (s a, 2H, NH_{2}),
4,79 (s, 2H, pteridinil-CH_{2}, 4,43 (m, 1H,
metina), 4,32 (m, 1H, metina), 3,21 (s, 3H,
N-CH_{3}), 2,90 (d, 2H, J = 7,1, ArCH_{2}), 2,24
(t, 2H, J = 7,9, glu 4-CH_{2}),
2,03-1,78 (m, 2H, glu 3-CH_{2}),
1,54 (5, 9H, t-Bu), 1,36 (s, 9H,
t-Bu), 1,30 (s, 9H, t-Bu).
Un matraz de 100 ml de 3 bocas, equipado con un
agitador magnético y una entrada de nitrógeno, se cargó con 0,20 g
de
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-(terc-butoxicarbonil)-L-tirosinato
de terc-butilo y 20 ml de CH_{3}NO_{2}. La solución
amarilla se agitó a TA y se acidificó burbujeando HCl gaseoso a su
través durante 10 min. Después del tratamiento con HCl, el color
cambió rápidamente de amarillo a naranja y a amarillo claro y
comenzó a precipitar un sólido. La mezcla se agitó a TA en una
atmósfera de N_{2} durante 1,5 h y después se concentró al vacío a
sequedad. El sólido amarillo resultante se suspendió en 15 ml de
agua y se trató con suficiente NaOH acuoso 1 N para dar una
solución completa. La solución se filtró y se neutralizó por la
adición de HCl acuoso 1 N. Se produjo un precipitado amarillo que
se separó por centrifugación, se lavó con cuatro ciclos de
suspensión
acuosa-centrifugación-decantación, y
se liofilizó para producir 140 mg (88%) de
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-carboxi-L-tirosina
en forma de un polvo amarillo-naranja, p.f. 195ºC
(desc).
HPLC: dos picos sobre C18, k' = 3,16
(98%), k' = 6,07 (2%), 80:20:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA, caudal = 1
ml/min.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,15-11,80
(s a, COOH), 8,62 (s, 1H, pteridinil 7-CH), 8,19 (s
a, 1H, NH_{2}), 8,00 (m, 3H, amida NH (2), NH_{2}), 7,72 (d,
2H, J = 8,7, CH aromático), 7,61 (d, 1H, J = 2,1, CH aromático),
7,22 (m, 3H, NH_{2} (2), CH aromático), 6,81 (d, 2H, J = 8,7, CH
aromático), 6,66 (d, 1H, J = 7,8, CH aromático), 4,81 (s, 2H,
pteridinil-CH_{2}), 3,39 (m, 2H, metinas), 3,21
(s, 3H, N-CH_{3}), 2,94 (m, 1H, ArCH_{2}), 2,86
(m, 1H, ArCH_{2}) 2,27 (t, 2H, J = 7,9, glu
4-CH_{2}), 2,05-1,72 (m, 2H, glu
3-CH_{2}).
Análisis elemental: Calc. para
C_{30}H_{31}N_{9}O_{9}\cdot1,8H_{2}O (PM 694,06):
C,51,92; H, 5,02; N, 18,16. Encontrado: C, 51,84; H, 5,0Z; N,
18,19.
Espectro de masas: (Nebulización iónica)
662 (M+H)^{+}, 385, 306, 235, 157.
Espectro UV: (Tampón pH 7) \lambda_{max}
(\varepsilon) 258,6 (19900), 306,3 (23500), 372,6 (5490).
\lambda_{min} (\varepsilon) 245,4 (14800),
272,8 (12600), 347,0 (4040).
Un matraz de 500 ml de 3 bocas seco, equipado con
un agitador magnético y una entrada de nitrógeno, se cargó con 3,0
g de
(2R,3S)-6-oxo-2,3-difenil-4-morfolinocarboxilato
de bencilo (Aldrich) y 180 ml de THF anhidro. Después de calentar
suavemente la mezcla para disolver el material de partida sólido,
la solución se enfrió a -78ºC y se trató con 8,13 ml de
bis(trimetilsilil)amida sódica en THF 1 M (Aldrich)
por adición lenta mediante una jeringa a través de un tabique de
caucho. La solución se agitó a -78ºC en una atmósfera de N_{2}
durante 40 min y después se trató con una solución de 2,41 g de
bromuro de 3-yodobencilo (Lancaster, Windham, NH
03087) en 5 ml de THF anhidro. La mezcla de reacción se agitó a
-78ºC durante 2,5 h, se mezcló con 100 ml de agua y la mezcla
resultante se concentró al vacío a sequedad. El residuo se disolvió
en 100 ml de EtOAc, se lavó con agua (3x100 ml), se secó sobre
Na_{2}SO_{4} anhidro y se concentró al vacío a sequedad para
dar un sólido castaño. El análisis por tlc (SiO_{2}, 8:2 de
hexano:EtOAc) indicó que no quedaba material de partida a R_{f} =
0,35, un nuevo componente mayoritario a R_{f} = 0,50 y algo de
bromuro de 3-yodobencilo sin reaccionar a R_{f} =
0,80. El producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida
sobre 150 g de gel de sílice (8:2 de hexano:EtOAc) para producir
2,8 g (60%) de
3-(3-yodobencil)-2-oxo-2,3-difenil-4-morfolinocarboxilato
de (2R,3S,5S)-bencilo en forma
de un sólido cristalino blanco, p.f. 167-168ºC.
Un matraz de 100 ml de 3 bocas seco, equipado con
un agitador magnético, un condensador de reflujo y un termómetro,
se cargó con 2,56 g de
3-(3-yodobencil)-2-oxo-5,6-difenil-4-morfolinocarboxilato
de (2R,3S,5S)-bencilo y 50 ml
de 1:1 de THF:MeOH. La mezcla se desoxigenó burbujeando N_{2} a su
través durante 10 min y se trató con 1,0 ml de Et_{3}N, seguido
de 0,24 g de Pd(Ph_{3}P)_{4} (Aldrich). La mezcla
se saturó con CO y se calentó a reflujo (65ºC) con agitación. Se
mantuvo una ligera presión positiva de CO mediante la unión de un
adaptador de entrada de gas de CO equipado con un burbujeador de
aceite mineral al condensador. Después de 4 h a reflujo, la tlc
(SiO_{2}, 8:2 de hexano:EtOAc) indicó que no quedaba material de
partida a R_{f} = 0,50 y un nuevo componente a R_{f} = 0,30. La
mezcla de reacción se enfrió a TA, momento en el que precipitó un
sólido blanco voluminoso. La suspensión se mezcló con 100 ml de
CH_{2}Cl_{2} y la solución resultante se filtró a través de un
lecho corto de gel de sílice (2,5x3 cm) y se concentró al vacío
para dar un sólido amarillo claro. Este material se purificó por
cromatografía ultrarrápida sobre 150 g de gel de sílice (8:2 de
hexano:EtOAc) para producir 2,0 g (88%) de
3-(3-metoxicarbonil)-2-oxo-5,6-difenil-4-morfolinocarboxilato
de (2R,3S,5S)-bencilo en forma
de un sólido blanquecino cristalino, p.f.
180-182ºC.
^{1}H-RMN: (200 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,05-7,80 (m,
2H, CH aromático), 7,72-6,97 (m, 14H, CH
aromático), 6,73 (m, 1H, CH aromático), 6,58 (m, 2H, CH aromático),
6,25-6,16 (d, J = 2,2, d, J = 2,6, 1H total, 2
resonancias para morfolina 2-H debido a los
confórmeros de carbamato), 5,36, 5,31 (d, J = 2,6, d, J = 2,6, 1H
total, 2 resonancias para morfolina 3-H debido a
los confórmeros de carbamato), 5,16-4,88 (m, 3H,
morfolina 5-H, PhCH_{2}O), 3,88, 3,85 (5,5, 3H
total, CO_{2}CH_{3}, confórmeros) 3,71-3,40 (m,
2H, ArCH_{2}).
A un recipiente Parr de 500 ml se le añadieron
2,0 g de
3-(3-metoxicarbonil)-2-oxo-5,6-difenil-4-morflinocarboxilato
de (2R,3S,5S)-bencilo, 0,46 g
de PdCl_{2} (Aldrich) y 60 ml de 1:1 de THF:MeOH. La mezcla se
desoxigenó burbujeando N_{2} a su través durante 10 min y después
se hidrogenó a 45 psi (310,26 kPa) durante 18 h. El recipiente se
purgó con N_{2} y la mezcla se filtró para retirar el catalizador.
El filtrado se concentró al vacío hasta 5 ml y se trituró con la
adición de 50 ml de éter. Precipitó un sólido blanco que se recogió
por filtración al vacío, se lavó con 30 ml de éter y se secó al
vacío para producir 0,88 g (91%) de
3-metoxicarbonil-L-fenilalanina\cdotHCl,
p.f. >200ºC.
^{1}H-RMN: (200 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,50 (s a, 3H,
NH_{3}^{+}), 7,89 (m, 2H, CH aromático),
7,67-7,43 (m, 2H, CH aromático), 4,21 (m, 1H,
metina), 3,87 (s, 3H, CO_{2}CH_{3}), 3,22 (d, 2H, J = 6,5,
ArCH_{2}).
Una solución de 0,88 g de
3-metoxicarbonil-L-fenilalanina\cdotHCl
y 1,5 ml de H_{2}SO_{4} conc. en 20 ml de
1,4-dioxano se añadió a 25 ml de isobutileno
líquido (condensado a -78ºC) en un recipiente a presión de 300 ml
equipado con un agitador magnético. El recipiente se cerró
herméticamente y la mezcla se dejó calentar a TA con agitación. La
mezcla inicialmente heterogénea produjo una solución ligeramente
turbia después de agitarla durante 18 h a TA. Después de 48 h, el
recipiente se enfrió en un baño de agua enfriada con hielo, se
abrió y los contenidos se trataron con 13 g de NaHCO_{3} sólido.
El isobutileno se dejó evaporar y la mezcla restante se concentró
al vacío a sequedad. EL residuo se suspendió en 100 ml de agua y se
extrajo con EtOAc (4x40 ml). Los extractos de EtOAc combinados se
lavaron con NaHCO_{3} acuoso al 5% (3x50 ml), se secaron sobre
MgSO_{4} anhidro y se concentraron al vacío para dar un aceite.
Este material se disolvió en 30 ml de éter y la solución se trató
con 3,4 ml de HCl etéreo 1 M. Se formó un precipitado sólido que se
recogió por filtración y se secó al vacío para producir 0,79 g
(74%) de
3-metoxicarbonil-L-fenilalaninato
de terc-butilo\cdotHCl, p.f. 165ºC (desc).
De acuerdo con el ejemplo 9, se acoplaron 0,79 g
de
3-metoxicarbonil-L-fenilalaninato
de terc-butilo\cdotHCl con 0,84 g de
\gamma-terc-butil éster del ácido
N-benciloxicarbonil-L-glutámico
(Sigma) usando 0,50 g de EDC (Aldrich) y 0,27 ml de
N-metilmorfolina. El producto bruto se purificó por
cromatografía ultrarrápida sobre 85 g de gel de sílice (70:30 de
hexano:EtOAc) para producir 1,38 g (93%) de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-terc-L-glutam-1-il-3-metoxicarbonil-L-fenilalaninato
de terc-butilo en forma de un vidrio transparente.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,26 (d, 1H, J = 7,5, NH),
7,80 (m, 2H, NH, CH aromático), 7,43 (d, 1H, J = 7,7, CH aromático),
7,44-7,23 (m, 7H, CH aromático), 4,99 (m, 2H,
PhCH_{2}O), 4,38 (m, 1H, metina), 4,01 (m, 1H, metina), 3,83 (s,
3H, CO_{2}CH_{3}), 3,02 (m, 2H, ArCH_{2}), 2,19 (t, 2H, J =
7,7, glu 4-CH_{2}), 1,90-1,61 (m,
2H, glu 3-CH_{2}), 1,38 (s, 9H,
t-Bu), 1,32 (s, 9H, t-Bu).
De acuerdo con el ejemplo 48, se hidrogenaron
1,38 g de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-terc-L-glutam-1-il-3-metoxicarbonil-L-fenilalaninato
de terc-butilo usando 0,23 g de Pd(C) al 10% en 60 ml
de MeOH. Esto produjo 1,0 g (94%) de
5-O-terc-L-glutam-1-il-3-metoxicarbonil-L-fenilalaninato
de terc-butilo en forma de un aceite transparente viscoso.
El producto se llevó a la siguiente etapa sin purificación
adicional. Se preparó una muestra de la sal HCl correspondiente para
el análisis de ^{1}H-RMN por tratamiento de 7 mg
del producto con un exceso de HCl etéreo 1 M y concentración a
sequedad.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 9,12 (d, 1H, J = 7,6, NH),
8,39 (s a, 3H, NH_{3}^{+}), 7,82 (m, 2H, CH aromático), 7,60 (d,
1H, J = 7,5, CH aromático), 7,46 (t, 1H, J = 6,9, CH aromático),
4,40 (m, 1H, metina), 3,85 (m, 1H, metina), 3,83 (s, 3H,
COCH_{3}), 3,05 (d, 2H, J = 8,4, ArCH_{2}), 2,33 (t, 2H, J =
7,7, glu 4-CH_{2}), 1,97 (m, 2H, glu
3-CH_{2}), 1,37 (s, 9H, t-Bu),
1,31 (s, 9H, t-Bu).
De acuerdo con el ejemplo 49, se acoplaron 0,200
g de hemiclorhidrato del ácido
4-(N-(2,4-diamino-6-pteridinil-
metil)-N-metilamino)benzoico dihidrato (Aldrich) con 0,245 de 5-O-terc-L-glutam-1-il-3-metoxicarbonil-L-fenilalaninato de terc-butilo usando 0,24 ml de DECP (Aldrich) y 0,26 ml de Et_{3}N en 20 ml de DMF. El producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre 130 g de gel de sílice (12:12:1 de CH_{2}Cl_{2}:acetona:MeOH) para producir 0,297 g (73%) de N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-(metoxicarbonil)-L-fenilalaninato de terc-butilo en forma de un polvo amarillo, p.f. 130ºC (desc).
metil)-N-metilamino)benzoico dihidrato (Aldrich) con 0,245 de 5-O-terc-L-glutam-1-il-3-metoxicarbonil-L-fenilalaninato de terc-butilo usando 0,24 ml de DECP (Aldrich) y 0,26 ml de Et_{3}N en 20 ml de DMF. El producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre 130 g de gel de sílice (12:12:1 de CH_{2}Cl_{2}:acetona:MeOH) para producir 0,297 g (73%) de N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-(metoxicarbonil)-L-fenilalaninato de terc-butilo en forma de un polvo amarillo, p.f. 130ºC (desc).
De acuerdo con el ejemplo 50, se trataron 0,15 de
N-(-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-(metoxicarbonil)-L-fenilalaninato
de terc-butilo con HCl gaseoso en 20 ml de CH_{3}NO_{2}.
Después de agitar la mezcla a TA durante 1 h, la mezcla se
concentró al vacío a sequedad para dar un sólido
amarillo-naranja. El análisis de este material por
^{1}H-RMN indicó la pérdida completa de los grupos
terc-butilo del material de partida. La HPLC (C18, 75:25:0,1
de H_{2}O:MeCN:TFA) indicó un solo componente a k' = 3,50. El
éster metílico intermedio se disolvió en 25 ml de 1:1 de
THF:H_{2}O, se trató con 49 mg de LiOH\cdotH_{2}O (Baker) y
la solución se agitó a TA en una atmósfera de N_{2} durante 18 h.
El análisis por HPLC indicó que no quedaba material de k' = 3,50 y
un único nuevo componente a k' = 1,58. La solución se neutralizó por
la adición de HCl acuoso 1 N. Se produjo una suspensión amarilla
que se concentró al vacío hasta 2 ml y se diluyó con 20 ml de agua.
El precipitado se separó por centrifugación, se lavó con cuatro
ciclos de suspensión
acuosa-centrifugación-decantación, y
se liofilizó para producir 0,109 g (84%) de
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-carboxi-L-fenilalanina
en forma de un polvo amarillo-naranja, p.f. 195ºC
(desc).
HPLC: un pico sobre C18, k' = 1,93
78:22:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA, caudal = 1 ml/min.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,00-12,10
(s a, COOH), 8,58 (s, 1H, pteridinil 7-CH), 8,08
(d, 1H, J = 7,8, amida NH), 7,98 (d, 1H, J = 8,0, amida NH), 7,80
(s, 1H, CH aromático), 7,79-7,60 (m, 4H, NH_{2}
(1), CH aromático), 7,49 (s a, 1H, NH_{2}), 7,44 (d, 1H, J = 7,7,
CH aromático), 7,30 (t, 1H, J = 7,6, CH aromático), 6,81 (d, 2H, J
= 9,0, CH aromático), 6,63 (s a, 2H, NH_{2}), 4,79 (s, 2H,
pteridinil-CH_{2}), 4,41 (m, 2H, metinas), 3,20
(s, 3H, N-CH_{3}), 3,10 (m, 1H, ArCH_{2}), 2,97
(m, 1H, ArCH_{2}), 2,23 (t, 2H, J = 7,8, glu
4-CH_{2}), 2,00-1,73 (m, 2H, glu
3-CH_{2}).
Análisis elemental: Calc. para
C_{30}H_{31}N_{9}O_{8}\cdot1,5H_{2}O (PM 672,65):
C,53,57; H, 5,09; N, 18,74. Encontrado: C, 53,58; H, 5,11; N,
18,72.
Espectro de masas: (Nebulización iónica)
646 (M+H)^{+}, 437, 340, 308, 175.
Espectro UV: (Tampón pH 7) \lambda_{max}
(\varepsilon) 258,7 (24300), 307,5 (25000), 372,7 (7880).
\lambda_{min} (\varepsilon) 244,0 (17900),
272,7 (16900), 346,2 (6440).
Un matraz de 100 ml de 3 bocas equipado con un
agitador magnético y una entrada de nitrógeno, se cargó con 0,150 g
de ácido
4-(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(f)quinazolin-9-il)metil)amino)-2-fluorobenzoico,
0,221 g de
5-O-terc-L-glutam-1-il-3-metoxicarbonil-L-fenilalaninato
de terc-butilo, 65 mg de
3-hidroxi-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-ona
(Aldrich) y 24 ml de DMF anhidra. La solución de color amarillo
claro resultante se trató con 84 mg de EDC (Aldrich) y se agitó a
TA en una atmósfera de N_{2} durante 48 h. La DMF se retiró al
vacío y el residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre
150 g de gel de sílice (98:2\rightarrow96:4 de
CH_{2}Cl_{2}:MeOH) para producir 0,255 g (78%) de
N-(4-(((1,2-Dihidro-3-metil-1-oxobenzo(f)-quinazolin-9-il))metil)amino)-2-fluorobenzoil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-(metoxicarbonil)-L-fenilalaninato
de terc-butilo en forma de un polvo blanco, p.f.
155-157ºC.
De acuerdo con el ejemplo 50, se trataron 0,219 g
de
N-(4-(((1,2-Dihidro-3-metil-1-oxobenzo(f)-quinazolin-9-il))metil)amino)-2-fluorobenzoil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-(metoxicarbonil)-L-fenilalaninato
de terc-butilo con HCl gaseoso en 20 ml de CH_{3}NO_{2}.
Después de la retirada del CH_{3}NO_{2} al vacío, el residuo se
saponificó con 66 mg de LiOH\cdotH_{2}O (Baker) en 20 ml de 1:1
de THF:H_{2}O durante 18 h. La solución se acidificó a pH = 2,5
por la adición de HCl 1 N y el precipitado resultante se aisló y se
liofilizó de la forma convencional para producir 0,162 g (84%) de
N-(4-(((1,2-Dihidro-3-metil-1-oxobenzo(f)-quinazolin-9-il))metil)amino)-2-fluorobenzoil)-L-glutam-1-il-3-carboxi-L-fenilalanina
en forma de un polvo blanco, p.f. 187ºC (desc).
HPLC: un pico sobre C18, k' = 4,29
75:25:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA, caudal = 1 ml/min.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,00-12,25
(m a, COOH, benzoquinazolina NH), 9,83 (s, 1H, CH aromático), 8,32
(d, 1H, J = 7,4, amida NH), 8,22 (d, 1H, J = 9,0, CH aromático),
8,00 (d, 1H, J = 8,5, CH aromático), 7,81 (s, 1H, CH aromático),
7,75 (d, 1H, J = 8,0, CH aromático), 7,60 (m, 2H, CH aromático),
7,49 (m, 3H, CH aromático, 4-aminobenzoil NH), 7,35
(m, 2H CH aromático, amida NH), 6,52 (d, 1H, J = 8,8, CH
aromático), 6,39 (d, 1H, J = 15,2, CH aromático), 4,57 (s a, 2H,
benzoquinazolina 9-CH_{2}), 4,45 (m, 2H, metinas),
3,12 (m, 1H, ArCH_{2}), 2,96 (m, 1H, ArCH_{2}), 2,42 (s, 3H,
CH_{2}), 2,19 (m, 2H, glu 4-CH),
2,01-1,70 (m, glu 3-CH_{2}).
Análisis elemental: Calc. para
C_{36}H_{32}N_{5}O_{9}F\cdot1,7H_{2}O (PM 728,30):
C,59,37; H, 4,90; N, 9,62. Encontrado: C, 59,45; H, 4,93; N,
9,42.
Espectro de masas: (Nebulización iónica)
698 (M+H)^{+}.
Espectro UV: (Tampón pH 7) \lambda_{max}
(\varepsilon) 265,3 (45500), 296,5 (26100), 348,0 (5530).
\lambda_{min} (\varepsilon) 244,4 (22600),
287,0 (25500), 340,1 (3540).
Una bomba Parr de 300 ml se cargó con 10,0 g de
alcohol 2-yodobencílico (Aldrich), 80 ml de tolueno,
30 ml de ciclopenteno (Aldrich), 2,60 g de
tri-orto-tolilfosfina (Aldrich) y
6,6 ml de Et_{3}N. La mezcla se desoxigenó burbujeando N_{2} a
su través durante 10 min y después se trató con 0,96 g de
Pd(OAc)_{2} (Aldrich). La bomba se lavó
abundantemente con N_{2}, se cerró herméticamente y se calentó a
100ºC durante 18 h. El recipiente se enfrió a TA, se purgó con
N_{2} y se abrió. La mezcla de reacción roja oscura se concentró
al vacío para dar un jarabe rojo-pardo. Este
material se disolvió en 200 ml de CH_{2}Cl_{2}, se lavó con
agua (4x100 ml), se secó sobre MgSO_{4} anhidro y se concentró al
vacío para producir un aceite pardo. El análisis por tlc
(SiO_{2}, 8:2 de hexano:EtOAc) indicó dos nuevos componente
mayoritarios a R_{f} = 0,45 y 0,50,
tri-o-tolilfosfina a R_{f} = 0,90
y 4 componentes minoritarios a R_{f} = 0,60, 0,70, 0,85 y 0,0. El
producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida (dos
veces) sobre 200 g de gel de sílice (9:1 de hexano:EtOAc) para
producir 6,1 g (82%) de una mezcla de los materiales de R_{f} =
0,45 y 0,50. Se determinó que este material era una mezcla de
isómeros de doble enlace por ^{1}H-RMN. El
producto (6,0 g) después se hidrogenó a 40 psi (275,79 kPa) en 40
ml de MeOH en presencia de 0,60 g de Pt(C) al 5% (Aldrich)
durante 4 h. El catalizador se retiró por filtración a través de
celite y el filtrado se concentró al vacío para producir 5,47 g (74%
del alcohol 2-yodobencílico) de alcohol
2-ciclopentilbencílico en forma de un líquido
amarillo claro-pardo.
^{1}H-RMN: (200 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 7,40-7,07 (m,
4H, CH aromático), 5,06 (t, 1H, J = 5,4, OH), 4,58 (d, 2H, J = 5,4,
ArCH_{2}O), 3,24 (m, 1H, ciclopentil metina), 1,97 (m, 2H,
ciclopentil CH_{2}), 1,89-1,42 (m, 6H,
ciclopentil CH_{2}).
De acuerdo con el ejemplo 17, se trataron 5,47 g
de alcohol 2-ciclopentilbencílico con 1,03 ml de
PBr_{3} en 25 ml de CH_{2}Cl_{2} anhidro para producir 6,9 g
(93%) de bromuro de 2-ciclopentilbencilo en forma de
un líquido transparente.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 7,40-7,24 (m,
3H, CH aromático), 7,14 (m, 1H, CH aromático), 4,78 (s, 2H,
ArCH_{2}Br), 3,31 (m, 1H, ciclopentil metina), 2,05 (m, 2H,
ciclopentil CH_{2}), 1,88-1,47 (m, 6H,
ciclopentil CH_{2}).
De acuerdo con el ejemplo 51, se alquilaron 1,47
g de
(2R,3S)-6-oxo-2,3-difenil-4-morfolinocarboxilato
de bencilo (Aldrich) con 1,00 g de bromuro de
2-ciclopentilbencilo usando 3,99 ml de
bis(trimetilsilil)amida sódica 1 M en THF (Aldrich).
El producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre
125 g de gel de sílice (8:2 de hexano:EtOAc) para producir 1,07 g
(52%) de
3-(3-ciclopentilbencil)-2-oxo-2,3-
difenil-4-morfolinocarboxilato de
(2R,3S,5S)-bencilo en forma de
un sólido blanco, p.f. 161-163ºC.
De acuerdo con el ejemplo 53, se hidrogenó 1,0 g
de
3-(3-ciclopentilbencil)-2-oxo-2,3-difenil-4-morfolinocarboxilato
de (2R,3S,5S)-bencilo en 40 ml
de 1:1 de THF:MeOH usando 0,23 g de PdCl_{2} para producir 0,373
g (76%) de
2-ciclopentil-L-fenilalanina\cdotHCl
en forma de un polvo blanquecino, p.f. 175ºC (desc).
^{1}H-RMN: (200 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,49 (s a, 3H,
NH_{3}^{+}), 7,38-7,07 (m, 4H, CH aromático),
3,92 (m, 1H, metina), 3,18 (m, 1H, ciclopentil metina, 1,98 (m, 2H,
ciclopentil CH_{2}), 1,90-1,41 (m, 6H,
ciclopentil CH_{2}).
De acuerdo con el ejemplo 54, se trataron 0,23 g
de
2-ciclopentil-L-fenilalanina\cdotHCl
con 25 ml de isobutileno en 20 ml de 1,4-dioxano en
presencia de 0,13 ml de H_{2}SO_{4} conc. El tratamiento produjo
un aceite transparente que se disolvió en 20 ml de éter. La
solución se trató con 1 ml de HCl etéreo 1 M y se concentró al
vacío a sequedad para producir 0,28 g (100%) de
2-ciclopentil-L-fenilalaninato
de terc-butilo\cdotHCl en forma de un vidrio amarillo
claro.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,59 (s a, 3H,
NH_{3}^{+}), 7,28 (m, 2H, CH aromático), 7,10 (m, 2H, CH
aromático), 3,91 (m, 1H, metina), 3,30 (m, 1H, ArCH_{2}), 3,18
(m, 1H, ciclopentil metina), 2,99 (dd, 1H, J = 10,1, 12,4,
ArCH_{2}), 1,98 (m, 2H, ciclopentil CH_{2}),
1,89-1,46 (m, 6H, ciclopentil CH_{2}), 1,19 (s,
9H, t-Bu).
De acuerdo con el ejemplo 9, se acoplaron 0,25 g
de
2-ciclopentil-L-fenilalaninato
de terc-butilo\cdotHCl con 0,26 g de
\gamma-terc-butil éster del ácido
N-benciloxicarbonil-L-glutámico
(Sigma) usando 0,16 g de EDC (Aldrich) y 0,084 ml de
N-metilmorfolina. El producto bruto se purificó por
cromatografía ultrarrápida sobre 85 g de gel de sílice (8:2 de
hexano:EtOAc) para producir 0,355 g (76%) de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-terc-L-glutam-1-il-2-ciclopentil-L-fenilalaninato
de terc-butilo en forma de un sólido blanco, p.f.
95-96ºC.
De acuerdo con el ejemplo 48, se hidrogenaron
0,355 g de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-terc-L-glutam-1-il-2-ciclopentil-L-fenilalaninato
de terc-butilo usando 60 mg de Pd(C) al 10% en 45 ml
de MeOH. Esto produjo 0,236 g (85%) de
5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-2-ciclopentil-L-fenilalaninato
de terc-butilo en forma de un aceite transparente
viscoso.
^{1}H-RMN: (200 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,23 (m, 1H, NH),
7,34-7,00 (m, 4H, CH aromático), 4,37 (m, 1H,
metina), 3,36-2,85 (m, 5H, ArCH_{2}, ciclopentil
metina, NH_{2}), 2,27-1,92 (m, 4H, glu
4-CH_{2}, glu 3-CH_{2}),
1,90-1,46 (m, 8H, ciclopentil CH_{2}), 1,39 (s,
9H, t-Bu), 1,32 (s, 9H, t-Bu).
De acuerdo con el ejemplo 49, se acoplaron 0,189
g de hemiclorhidrato del ácido
4-(N-(2,4-diamino-6-pteridinil-
metil)-N-metilamino)benzoico dihidrato (Aldrich) con 0,236 g de 5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-2-ciclopentil-L-fenilalaninato de terc-butilo usando 0,23 ml de DECP (Aldrich) y 0,24 ml de Et_{3}N en 20 ml de DMF. El producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre 85 g de gel de sílice (12:12:1 de CH_{2}Cl_{2}:acetona:MeOH) para producir 0,195 g (50%) de N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-2-ciclopentil-L-fenilalaninato de terc-butilo en forma de un polvo amarillo, p.f. 130-140ºC.
metil)-N-metilamino)benzoico dihidrato (Aldrich) con 0,236 g de 5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-2-ciclopentil-L-fenilalaninato de terc-butilo usando 0,23 ml de DECP (Aldrich) y 0,24 ml de Et_{3}N en 20 ml de DMF. El producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre 85 g de gel de sílice (12:12:1 de CH_{2}Cl_{2}:acetona:MeOH) para producir 0,195 g (50%) de N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-2-ciclopentil-L-fenilalaninato de terc-butilo en forma de un polvo amarillo, p.f. 130-140ºC.
De acuerdo con el ejemplo 50, se trataron 0,167 g
de
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-2-ciclopentil-L-fenilalaninato
de terc-butilo con HCl gaseoso en 15 ml de CH_{3}NO_{2}
durante 1 h. La mezcla de reacción se concentró al vacío a sequedad
para dar un sólido amarillo. Este material se suspendió en éter, se
recogió por filtración al vacío y se secó al vacío para producir
0,15 g (91%) de
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-2-ciclopentil-L-fenilalanina
en forma de un polvo amarillo claro, p.f. 155ºC (desc).
HPLC: un pico sobre C18, k' = 3,25,
65:35:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA, caudal = 1 ml/min.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,25-12,95
(s a, COOH), 9,31 (s, 1H, NH_{2}), 9,09 (s, 1H, NH_{2}),
8,80-8,58 (s a, 1 N, NH_{2}), 8,72 (s, 1H,
pteridinil 7-CH), 8,24 (d, 1H, J = 8,0, amida NH),
8,01 (d, 1H, J = 8,0, amida NH), 7,74 (m, 3H, NH_{2}(1),
CH aromático), 7,22 (d, 1H, J = 8,1, CH aromático), 7,12 (m, 2H, CH
aromático), 6,93 (t, 1H, J = 7,4, CH aromático), 6,82 (d, 2H, J =
9,0, CH aromático), 4,88 (s, 2H,
pteridinil-CH_{2}), 4,45 (m, 1H, metina), 4,34
(m, 1H, metina), 3,26-3,10 (m, 2H, ArCH_{2},
ciclopentil metina), 2,88 (m, 1H, ArCH_{2}), 2,23 (t, 2H, J =
7,6, glu 4-CH_{2}), 2,06-1,40 (m,
10H, glu 3-CH_{2}, ciclopentil CH_{2}).
Análisis elemental: Calc. para
C_{34}H_{39}N_{9}O_{6}\cdot1,7HCl\cdot2,2H_{2}O (PM
771,36): C, 52,94; H, 5,89; N, 16,34; Cl, 7,81. Encontrado: C,
52,57; H, 5,74; N, 16,13; Cl, 7,52.
Espectro de masas: (Nebulización iónica)
670 (M+H)^{+}, 613, 459, 391, 309, 275.
Espectro UV: (Tampón pH 7) \lambda_{max}
(\varepsilon) 259,5 (24000), 373,0 (7450).
\lambda_{min} (\varepsilon) 241,0 (14400),
274,2 (16200), 346,5 (5840).
De acuerdo con el ejemplo 61, se trataron 10.0 g
de alcohol 3-yodobencílico (Aldrich) con 30 ml de
ciclopenteno usando 0,96 g de Pd(OAc)_{2}, 2,60 g
de tri-orto-tolilfosfina, y 6,6 ml
de Et_{3}N. La mezcla de olefina resultante se hidrogenó durante
2,5 h usando 0,62 g de Pt(C) al 5% en MeOH para producir
5,77 g (76%) de alcohol 3-ciclopentilbencílico en
forma de un líquido amarillo claro.
^{1}H-RMN: (200 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 7,32-7,17 (m,
2H, CH aromático), 7,15 (m, 2H, CH aromático), 5,14 (t, 1H, J =
5,5, OH), 4,48 (d, 2H, J = 5,6, ArCH_{2}O), 2,96 (m, 1H,
ciclopentil metina), 2,01 (m, 2H, ciclopentil CH_{2}),
1,88-1,42 (m, 6H, ciclopentil CH_{2}).
De acuerdo con el ejemplo 17, se trataron 5,77 g
de alcohol 3-ciclopentilbencílico con 1,09 ml de
PBr_{3} en 25 ml de CH_{2}Cl_{2} anhidro para producir 7,85 g
(100%) de bromuro de 3-ciclopentilbencilo en forma
de un líquido amarillo claro.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 7,37-7,14 (m,
4H, CH aromático), 4,68 (s, 2H, ArCH_{2}Br), 2,96 (m, 1H,
ciclopentil metina), 2,00 (m, 2H, ciclopentil CH_{2}),
1,84-1,42 (m, 6H, ciclopentil CH_{2}).
Un matraz de 500 ml de 3 bocas seco, equipado con
una entrada de nitrógeno y un agitador magnético, se cargó con 1,47
g de
(2R,3S)-6-oxo-2,3-difenil-4-morfolinocarboxilato
de bencilo (Aldrich), 1,00 g de bromuro de
3-ciclopentilbencilo y 80 ml de THF anhidro. La
mezcla se calentó suavemente con agitación para disolvente el
material de partida sólido y la solución resultante se enfrió a
-78ºC. La solución se trató con 4,0 ml de
bis(trimetilsilil)amida sódica 1 M en THF (Aldrich)
por adición lenta mediante una jeringa a través de un tabique de
caucho. Después de agitar a -78ºC durante 4 h, la solución se
mezcló con 80 ml de agua se trató de acuerdo con el ejemplo 51. El
producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre 85
g de gel de sílice (85:15 de hexano:EtOAc) para producir 1,44 g
(70%) de
3-(3-ciclopentilbencil)-2-oxo-2,3-difenil-4-morfolinocarboxilato
de (2R,3S,5S)-bencilo en forma
de un polvo blanco, p.f. 82-84ºC.
De acuerdo con el ejemplo 53, se hidrogenaron
1,37 g de
3-(3-ciclopentilbencil)-2-oxo-2,3-difenil-4-morfolinocarboxilato
de (2R,3S,5S)-bencilo en 80 ml
de 1:1 de THF:MeOH usando 0,31 g de PdCl2 para producir 0,63 g
(93%) de
3-ciclopentil-L-fenilalanina\cdotHCl
en forma de un polvo blanco, p.f. >200ºC.
\newpage
^{1}H-RMN: (200 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,39 (s a, 3H,
NH_{3}^{+}), 7,31-7,12 (m, 3H, CH aromático),
7,08 (d, 1H, J = 7,3, CH aromático), 4,17 (m, 1H, metina), 3,11 (d,
2H, J = 6,1, ArCH_{2}), 2,96 (m, 1H, ciclopentil metina), 1,99
(m, 2H, ciclopentil CH_{2}), 1,88-1,45 (m, 6H,
ciclopentil CH_{2}).
De acuerdo con el ejemplo 54, se trataron 0,50 g
de
3-ciclopentil-L-fenilalanina\cdotHCl
con 25 ml de isobutileno en 20 ml de 1,4-dioxano en
presencia de 0,3 ml de H_{2}SO_{4} conc. El tratamiento seguido
de la acidificación de la amida libre con HCl etéreo produjo 0,49 g
(82%) de
3-ciclopentil-L-fenilalaninato
de terc-butilo en forma de un polvo blanco, p.f.
154-156ºC.
De acuerdo con el ejemplo 9, se acoplaron 0,49 g
de
3-ciclopentil-L-fenilalaninato
de terc-butilo\cdotHCl con 0,51 g de
\gamma-terc-butil éster del ácido
N-Cbz-L-glutámico (Sigma)
usando 0,30 g de EDC (Aldrich) y 0,16 ml de N-metilmorfolina.
El producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre
80 g de gel de sílice (8:2 de hexano:EtOAc) para producir 0,75 g
(82%) de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-fenilalaninato
de terc-butilo en forma de un aceite transparente
viscoso.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,22 (d, 1H, J = 7,3, NH),
7,33 (m, 6H, CH aromático), 7,20-6,97 (m, 3H, CH
aromático, NH), 5,01 (m, 2H, PhCH_{2}O), 4,33 (m, 1H, metina),
4,05 (m, 1H, metina), 2,91 (m, 3H, ArCH_{2}, ciclopentil metina),
2,20 (t, 2H, J = 7,7, glu 4-CH_{2}), 1,97 (m, 2H,
glu 3-CH_{2}), 1,88-1,43 (m, 8H,
ciclopentil CH_{2}), 1,38 (s, 9H, t-Bu), 1,31 (s,
9H, t-Bu).
De acuerdo con el ejemplo 48, se hidrogenaron
0,75 g de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-fenilalaninato
de terc-butilo usando 0,12 g de Pd(C) al 10% en 60 ml
de MeOH. Esto produjo 0,58 g (99%) de
5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-fenilalaninato
de terc-butilo en forma de un aceite transparente. Se
preparó una muestra de la sal HCl correspondiente para el análisis
de ^{1}H-RMN tratando 10 mg del producto con un
exceso de HCl etéreo 1 N y concentración al vacío.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,99 (d, 1H, J = 7,0, NH),
8,32 (s a, 3H, NH_{3}^{+}), 7,24-7,01 (m, 4H, CH
aromático), 4,38 (m, 1H, metina), 3.85 (m, 1H, metina), 2,93 (m,
3H, ArCH_{2}, ciclopentil metina), 2,34 (t, 2H, J = 7,7, glu
4-CH_{2}), 1,96 (m, 4H, glu
3-CH_{2}, ciclopentil CH_{2}),
1,82-1,44 (m, 6H, ciclopentil CH_{2}), 1,40 (s,
9H, t-Bu), 1,31 (s, 9H, t-Bu).
De acuerdo con el ejemplo 49, se acoplaron 0,200
g de hemiclorhidrato del ácido
4-(N-(2,4-diamino-6-pteridinil-
metil)-N-metilamino)benzoico dihidrato (Aldrich) con 0,25 g de 5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-fenilalaninato de terc-butilo usando 0,24 ml de DECP (Aldrich) y 0,26 ml de Et_{3}N en 20 ml de DMF. EL producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre 150 g de gel de sílice (7:7:1 de CH_{2}Cl_{2}:acetona:MeOH) para producir 0,195 g (47%) de 5-O-terc-butil-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-fenilalaninato de terc-butilo en forma de un polvo amarillo, p.f. 115-120ºC.
metil)-N-metilamino)benzoico dihidrato (Aldrich) con 0,25 g de 5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-fenilalaninato de terc-butilo usando 0,24 ml de DECP (Aldrich) y 0,26 ml de Et_{3}N en 20 ml de DMF. EL producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre 150 g de gel de sílice (7:7:1 de CH_{2}Cl_{2}:acetona:MeOH) para producir 0,195 g (47%) de 5-O-terc-butil-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-fenilalaninato de terc-butilo en forma de un polvo amarillo, p.f. 115-120ºC.
De acuerdo con el ejemplo 50, se trataron 0,18 g
de
5-O-terc-butil-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-fenilalaninato
de terc-butilo con HCl gaseoso en 20 ml de CH_{3}NO_{2}
durante 1,25 h. El tratamiento y el aislamiento de la forma
convencional produjeron 0,135 g (84%) de
N-(4-(((2,4-Diamino-6-
pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-fenilalanina
en forma de un polvo amarillo-naranja, p.f. 170ºC
(desc).
HPLC: un pico sobre C18, k' = 2,86,
65:35:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA, caudal = 1 ml/min.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 12,90-11,85
(s a, COOH), 8,58 (s, 1H, pteridinil 7-CH), 8,04
(d, 1H, J = 7,7, amida NH), 8,00 (d, 1H, J = 8,1, amida NH), 7,72
(s a, 1H, NH_{2}), 7,71 (d, 2H, J = 8,8, CH aromático), 7,53 (s
a, 1H, N_{2}), 7,08-6,93 (m, 4H, CH aromático),
6,81 (d, 2H, J = 8,9, CH aromático), 6,69 (s a, 2N, NH_{2}), 4,79
(s, 2H, pteridinil-CH_{2}), 4,40 (m, 2H, metinas),
3,22 (s, 3H, N-CH_{3}), 3,01 (m, 1H, ArCH_{2}),
2,94-2,75 (m, 2H, ArCH_{2}, ciclopentil metina),
2,24 (t, 2H, J = 7,7, glu 4-CH_{2}),
2.03-1,76 (m, 4H, glu 3-CH_{2},
ciclopentil CH_{2}), 1,73-1,35 (m, 6H,
ciclopentil CH_{2}).
Análisis elemental: Calc. para
C_{34}H_{39}N_{9}O_{6}\cdot1,6H_{2}O (PM 698,56): C,
58,46; H, 6,09; N, 18,05. Encontrado: C, 58,50; H, 6,08; N,
18,10.
Espectro de masas: (FAB) 670
(M+H)^{+}, 613, 437, 309, 275.
Espectro UV: (Tampón pH 7) \lambda_{max}
(\varepsilon) 259,7 (23300), 308,3 (23500), 371,7 (7030).
\lambda_{min} (\varepsilon) 241,0 (13500),
274,9 (15300), 346,1 (5260).
De acuerdo con el ejemplo 61, se trataron 10,0 g
de alcohol 2-yodobencílico con 25 ml de ciclohexano
(Aldrich) usando 0,96 g de Pd(OAc)_{2}, 2,60 g de
tri-orto-tolilfosfina, y 6,6 ml de
Et_{3}N a 110ºC durante 48 h. La mezcla de olefinas resultante se
hidrogenó durante 6,5 h usando 0,36 g de Pt(C) en MeOH para
producir 3,37 g (42%) de alcohol 2-ciclohexil
bencílico en forma de un líquido amarillo claro.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 7,33 (d, 1H, J = 7,4, CH
aromático), 7,27-7,08 (m, 3H, CH aromático), 5,03
(t, 1H, J = 5,4, OH), 4,34 (d, 2H, J = 5,4, ArCH_{2}O), 2,76 (m,
1H, ciclohexil metina), 1,85-1,61 (m, 5H,
ciclohexil CH_{2}), 1,48-1,22 (m, 5H, ciclohexil
CH_{2}).
De acuerdo con el ejemplo 17, se trataron 3,36 g
de alcohol 2-ciclohexilbencílico con 0,59 ml de
PBr_{3} en 25 ml de CH_{2}Cl_{2} anhidro para producir 3,90 g
de producto bruto (pureza del 90% por ^{1}H-RMN).
Este material se destiló al vacío mediante un recorrido corto (1,0
mmHg, 117-120ºC) para producir 3,54 g (79%) de
bromuro de 2-ciclohexilbencilo en forma de un
líquido transparente.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 7,39 (d, 1H, J = 5,7, CH
aromático), 7,29 (m, 2H, CH aromático), 7,13 (m, 1H, CH aromático),
4,76 (s, 2H, ArCH_{2}Br), 2,86 (m, 1H, ciclohexil metina),
1,83-1,63 (m, 5H, ciclohexil CH_{2}),
1,53-1,20 (m, 5H, ciclohexil CH_{2}).
A un matraz de 250 ml de 3 bocas seco, equipado
con un agitador magnético y una entrada de nitrógeno, se le añadió
una solución de 1,47 g de
(2R,3S)-(-)-6-oxo-2,3-difenil-4-morfolinocarboxilato
de terc-butilo (Aldrich) en 30 ml de THF y una solución de
1,00 g de bromuro de 2-ciclohexilbencilo en 8 ml de
THF. Las dos soluciones se habían secado sobre tamices moleculares
de 3 \ring{A}; durante 24 h. El THF anhidro se usó para aclarar
(30 ml) dando un volumen de solución total de 68 ml. La solución
resultante se enfrió a -78ºC y se trató con 4,15 ml de
bis-(trimetilsilil) amida sódica 1 M en THF (Aldrich) por adición
lenta mediante una jeringa a través de un tabique de caucho.
Después de agitar a -78ºC durante 3,5 h, la mezcla de reacción se
mezcló con 80 ml de agua y se sometió a evaporación rotatoria para
retirar el THF. La mezcla resultante se extrajo con EtOAc (4x50
ml). Los extractos de EtOAc se lavaron con NaCl acuoso saturado
(2x70 ml), se secaron sobre MgSO_{4} anhidro y se concentraron al
vacío para producir un sólido blanco. La purificación de este
material por cromatografía ultrarrápida sobre 200 g de gel de
sílice (8:2 de hexano:EtOAc) produjo 1,2 g (58%) de
3-(2-ciclohexilbencil)-2-oxo-2,3-difenil-4-morfolinocarboxilato
de (2R,3S,5S)-terc-butilo en forma de un
sólido blanco cristalino, p.f. 195-198ºC.
Un matraz de 50 ml de 3 bocas seco, equipado con
una entrada de nitrógeno y un agitador magnético, se cargó con 2,10
g de
3-(2-ciclohexilbencil)-2-oxo-5,6-difenil-4-morfolinocarboxilato
de (2R,3S,5S)-terc-butilo y 33 ml de
CH_{2}Cl_{2} anhidro. La solución se agitó a TA y se trató con
3,3 ml de THF. Después de 3,5 h, la tlc (SiO_{2}, 85:15 de
hexano:EtOAc) indicó que no quedaba material de partida, un nuevo
componente mayoritario a R_{f} = 0,45 y dos componentes
minoritarios a R_{f} = 0,68 y 0,70. La solución se neutralizó por
la adición de 9 ml Et_{3}N y se concentró al vacío para dar un
aceite viscoso. Este material se disolvió en 80 ml de
CH_{2}Cl_{2}, se lavó con agua (3 x 60 ml) seguido de
NaHCO_{3} acuoso al 5% (3 x 60 ml) y se secó sobre MgSO_{4}
anhidro. El agente de secado se retiró por filtración y el filtrado
se concentró al vacío para producir un sólido blanco. La
purificación del producto bruto por cromatografía ultrarrápida
sobre 150 g de gel de sílice (8:2 de hexano:EtOAc) seguido de
recristalización en EtOH-H_{2}O produjo 1,27 g
(75%) de
(2R,3S,5S)-6-Oxo-2,3-difenil-5-(2-ciclohexilbencil)morfolina
en forma de un sólido blanco cristalino, p.f.
159-160ºC.
De acuerdo con el ejemplo 53, se hidrogenaron
1,17 g de (2R,3S,
5S)-6-Oxo-2,3-difenil-5-(2-ciclohexilbencil)morfolina
en 60 ml de 1:1 de THF:EtOH usando 0,34 g de PdCl_{2} para
producir 0,83 g de
2-ciclohexil-L-fenilalanina\cdotHCl
en forma de un sólido blanco esponjoso, p.f. 140ºC (desc).
De acuerdo con el ejemplo 54, se trataron 0,73 g
de
2-ciclohexil-L-fenilalanina\cdotHCl
con 25 ml de isobutileno en 25 ml de 1,4-dioxano en
presencia de 0,4 ml de H_{2}SO_{4} conc. El tratamiento seguido
de la acidificación de la amina libre con HCl etéreo produjo 0,70 g
(80%) de
2-ciclohexil-L-fenilalaninato
de terc-butilo en forma de una espuma amarilla.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,53 (s a, 3H,
NH_{3}^{+}), 7,27 (m, 2H, CH aromático), 7,10 (m, 2H, CH
aromático), 3,86 (m, 1H, metina), 3,24 (m, 1H, ArCH_{2}), 2,97
(m, 1H, ArCH_{2}), 2,72 (m, 1H, ciclohexil metina),
1,86-1,60 (m, 5H, ciclohexil CH_{2}),
1,56-1,30 (m, 5H, ciclohexil CH_{2}), 1,19 (s,
9H, t-Bu).
De acuerdo con el ejemplo 9, se acoplaron 0,70 g
de
2-ciclohexil-L-fenilalaninato
de terc-butilo\cdotHCl con 0,70 g de
\gamma-terc-butil éster del ácido
N-Cbz-L-glutámico (Sigma)
usando 0,42 g de EDC (Aldrich) y 0,23 ml de N-metilmorfolina.
El producto crudo se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre
150 g de gel de sílice (8:2 de hexano:EtOAc) para producir 0,97 g
(76%) de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-2-ciclohexil-L-fenilalaninato
de terc-butilo en forma de una espuma blanca.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,32 (d, 1H, J = 7,6, NH),
7,40-6,97 (m, 10 H, CH aromático, NH), 5,00 (m, 2H,
PhCH_{2}O), 4,26 (m, 1H, metina), 4,04 (m, 1H, metina), 3,07 (m,
1H, ArCH_{2}), 2,93-2,70 (m, 2H, ArCH_{2},
ciclohexil metina), 2,19 (t, 2H, J = 7,7, glu
4-CH_{2}), 1,90-1,62 (m, 7H, glu
3-CH_{2}, ciclohexil CH_{2}),
1,56-1,33 (m, 5H, ciclohexil CH_{2}), 1,38 (s,
9H, t-Bu), 1,32 (s, 9H, t-Bu).
Espectro de Masas: (Cl, CH_{4}) 623
(M+H)^{+}, 567, 539, 511, 489, 433, 193.
De acuerdo con el ejemplo 48, se hidrogenaron
0,97 g de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-2-ciclohexil-L-fenilalaninato
de terc-butilo usando 0,16 g de Pd(C) al 10% en 50 ml
de MeOH. Esto produjo 0,76 g (100%) de
5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-2-ciclohexil-L-fenilalaninato
de terc-butilo en forma de un aceite transparente viscoso.
Se preparó una muestra de la sal HCl correspondiente para el
análisis por ^{1}H-RMN por tratamiento de 10 mg
del producto con un exceso de HCl etéreo 1 M y concentración a
sequedad.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 9,05 (d, 1H, J = 7,5, NH),
8,24 (s a, 3H, NH_{3}^{+}), 7,20 (m, 3H, CH aromático), 7,07 (t,
1H, J = 7,1, CH aromático), 4,28 (m, 1H, metina), 3,83 (m, 1H,
metina), 3,08 (m, 1H, ArCH_{2}), 2,91 (m, 1H, ArCH_{2}, 1,78
(m, 1H, ciclohexil metina), 2,34 (m, 2H, glu
4-CH_{2}), 2,00 (m, 2H, glu
3-CH_{2}), 1,89-1,60 (m, 5H,
ciclohexil CH_{2}), 1,57-1,20 (m, 5H, ciclohexil
CH_{2}), 1,40 (s, 9H, t-Bu), 1,33 (s, 9H,
t-Bu).
De acuerdo con el ejemplo 49, se acoplaron 0,247
g de hemiclorhidrato del ácido
4-(N-(2,4-diamino-6-pteridi-
nilmetil)-N-metilamino)benzoico dihidrato (Aldrich) con 0,35 g de 5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-2-ciclohexil-L-fenilalaninato de terc-butilo usando 0,30 ml de DECP (Aldrich) y 0,32 ml de Et_{3}N en 25 ml de DMF. El producto bruto se sometió dos veces a cromatografía ultrarrápida (150 g SiO_{2}, 7:7:1 de CH_{2}Cl_{2}:acetona:MeOH y 150 g SiO_{2}, 95:5 de CH_{2}Cl_{2}:MeOH) para producir 0,297 g (57%) de N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-terc-L-butil-L-glutam-1-il-2-ciclohexil-L-fenilalaninato de terc-butilo en forma de un polvo amarillo, p.f. 135-140ºC.
nilmetil)-N-metilamino)benzoico dihidrato (Aldrich) con 0,35 g de 5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-2-ciclohexil-L-fenilalaninato de terc-butilo usando 0,30 ml de DECP (Aldrich) y 0,32 ml de Et_{3}N en 25 ml de DMF. El producto bruto se sometió dos veces a cromatografía ultrarrápida (150 g SiO_{2}, 7:7:1 de CH_{2}Cl_{2}:acetona:MeOH y 150 g SiO_{2}, 95:5 de CH_{2}Cl_{2}:MeOH) para producir 0,297 g (57%) de N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-terc-L-butil-L-glutam-1-il-2-ciclohexil-L-fenilalaninato de terc-butilo en forma de un polvo amarillo, p.f. 135-140ºC.
De acuerdo con el ejemplo 50, se trataron 0,271 g
de
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-terc-L-butil-L-glutam-1-il-2-ciclohexil-L-fenilalaninato
de terc-butilo con HCl gaseoso en 20 ml de CH_{3}NO_{2}
durante 1,5 h. El tratamiento y el aislamiento de la forma
convencional produjeron 0,191 g (79%) de
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-2-ciclohexil-L-fenilalanina
en forma de un polvo amarillo-naranja, p.f. 175ºC
(desc).
HPLC: un pico sobre C18, k' = 4,05,
65:35:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA, caudal = 1 ml/min.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 12,75-11,90
(s a, COOH), 8,58 (s, 1H, pteridinil 7-CH), 8,20
(d, 1H, J = 7,9, amida NH), 7,98 (d, 1H, J = 8,1, amida NH), 7,79
(s a, 1H, NH_{2}), 7,72 (d, 2H, J = 8,9, CH aromático), 7,59 (s
a, 1H, NH_{2}), 7,19 (m, 1H, CH aromático), 7,08 (m, 2H, CH
aromático), 6,92 (m, 1H, CH aromático), 6,83 (d, 2H, J = 8,9, CH
aromático), 6,75 (s a, 2H, NH_{2}), 4,80 (s, 2H,
pteridinil-CH_{2}), 4,43 (m, 1H, metina), 4,31 (m,
1H, metina), 3,21 (s, 3H, N-CH_{3}), 3,12 (m, 1H,
ArCH_{2}), 3,92-3,70 (m, 2H, ArCH_{2},
ciclohexil metina), 2,23 (t, 2H, J = 7,7, glu
4-CH_{2}), 2,05-1,60 (m, 7H, glu
3-CH_{2}, ciclohexil CH_{2}),
1,50-1,16 (m, 5H, ciclohexil CH_{2}).
Análisis elemental: Calc. para
C_{35}H_{41}N_{9}O_{6}\cdot1,5 H_{2}O (PM 710,79): C,
59,14; H, 6,24; N, 17,74. Encontrado: C, 59,11; H, 6,20; N,
1,73.
Espectro de masas: (FAB) 684
(M+H)^{+}, 613, 510, 385, 309.
Espectro UV: (Tampón pH 7) \lambda_{max}
(\varepsilon) 259,7 (23300), 308,8 (22700), 374,0 (6850).
\lambda_{min} (\varepsilon) 241,7 (12800),
275,2 (14700), 346,3 (5170).
Un matraz de 100 ml de 3 bocas seco, equipado con
una entrada de nitrógeno, un condensador, un termómetro y un
agitador magnético, se cargó con 2,0 g de
3-terc-butiltolueno (Wiley Organics, Coshocton, OH 43812),
2,40 g de N-bromosuccinimida (Aldrich) y 30 ml de CCl_{4}.
La mezcla se trató con 0,16 g de peróxido de benzoílo (Aldrich) y
se calentó a 60ºC en una atmósfera de N_{2}. Es importante el
control minucioso de la temperatura para minimizar la formación de
subproductos. Después de 1 h a 60ºC, la mezcla de reacción se
enfrió a 0ºC, se filtró para retirar la succinimida y el filtrado se
concentró al vacío para producir un líquido amarillo claro. El
análisis de este material por tlc (SiO_{2}, hexano) indicó un
nuevo componente mayoritario a R_{f} = 0,50, un componente
minoritario a R_{f} = 0,55, y una pequeña cantidad de
3-terc-butiltolueno a R_{f} = 0,75. El producto bruto se
purificó por cromatografía ultrarrápida sobre 100 g de gel sílice
(hexano) para producir 1,06 g (35%) de bromuro de
3-terc-butilbencilo en forma de un líquido transparente.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 7,47 (s, 1H, CH aromático),
7,39-7,21 (m, 3H, CH aromático), 4,69 (s, 2H,
ArCH_{2}Br), 1,27 (s, 9H, t-Bu).
De acuerdo con el ejemplo 81, se alquilaron 1,63
g de
(2R,3S)-(-)-6-oxo-2,3-difenil-4-morfolinacarboxilato
de terc-butilo (Aldrich) con 1,0 g de bromuro de
3-terc-butilbencilo en 70 ml de THF anhidro, usando 4,62 ml
de bis(trimetilsilil)amida sódica 1 M en THF
(Aldrich). El producto bruto se purificó por cromatografía
ultrarrápida sobre 150 g de gel de sílice (9:1 hexano:EtOAc) para
producir 1,84 g (80%) de 3-(3-terc-
butilbencil)-2-oxo-2,3-difenil-4-morfolinacarboxilato
de (2R,3S,5S)-terc-butilo en forma de
una espuma blanca, p.f. 65-90ºC.
De acuerdo con el ejemplo 82, se trataron 1,79 g
de
3-(3-terc-butilbencil)-2-oxo-2,3-difenil-4-morfolinacarboxilato
de (2R,3S,5S)-terc-butilo con 3 ml de
TFA en 30 ml de CH_{2}Cl_{2} durante 3,4 h. La neutralización
con 7,7 ml de Et_{3}N y el tratamiento de la forma convencional
de un aceite viscoso. La purificación del material bruto por
cromatografía ultrarrápida sobre 125 g de gel de sílice (75:25 de
hexano:EtOAc) produjo 0,90 g (63%) de
(2R,3S,5S)-6-oxo-2,3-difenil-5-(3-terc-butilbencil)morfolina
en forma de un sólido blanco cristalino, p.f.
136-137ºC.
De acuerdo con el ejemplo 53, se hidrogenaron
0,89 g de
(2R,3S,5S)-6-oxo-2,3-difenil-5-(3-terc-butilbencil)morfolina
en 40 ml de 1:1 de THF:EtOH usando 0,28 g de PdCl_{2} para
producir 0,57 g (99%) de
3-terc-butil-L-fenilalanina\cdotHCl
en forma un polvo blanco, p.f. >250ºC.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,42 (s a, 3H,
NH_{3}^{+}), 7,26 (m, 3H, CH aromático), 7,08 (dd; 1H; J = 7,0,
1,3; CH aromático), 4,12 (m, 1H, metina), 3,12 (d, 2H, J = 6,1,
ArCH_{2}), 1,27 (s, 9H, t-Bu).
De acuerdo con el ejemplo 54, se trataron 0,50 g
de
3-terc-butil-L-fenilalanina\cdotHCl
con 30 ml de isobutileno en 25 ml de 1,4-dioxano en
presencia de 0,4 ml de H_{2}SO_{4} conc. El tratamiento de la
forma convencional seguido de acidificación de la amina libre con
HCl etéreo produjo 0,53 g (87%) de
3-terc-butil-L-fenilalaninato
de terc-butilo\cdotHCl en forma de un espuma amarilla
clara.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,48 (s a, 3H,
NH_{3}^{+}), 7,36-7,20 (m, 3H, CH aromático),
7,08 (d, 1H, J = 7,1, CH aromático), 4,16 (m, 1H, metina), 3,19
(dd; 1H; J = 13,9, 5,7; ArCH_{2}), 2,95 (dd; 1H; J = 13,9, 8,6;
ArCH_{2}), 1,28 (s, 9H, t-Bu), 1,27 (s, 9H,
t-Bu).
De acuerdo con el ejemplo 9, se acoplaron 0,52 g
de
3-terc-butil-L-fenilalaninato
de terc-butilo\cdotHCl con 0,56 g de
\gamma-terc-butil éster del ácido
N-Cbz-L-glutámico (Sigma)
usando 0,33 g de EDC (Aldrich) y 0,18 ml de N-metilmorfolina.
El producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre
110 g de gel de sílice (75:25 de hexano:EtOAc) para producir 0,77 g
(78%) de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-terc-butil-L-fenilalaninato
de terc-butilo en forma de un aceite transparente
viscoso.
^{1}H RMN: (200 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,28 (d, 1H, J = 7,3, NH),
7,42-7,13 (m, 9H, CH aromático, NH), 7,04 (d, 1H, J
= 6,6, CH aromático), 5,02 (s, 2H, PhCH_{2}O), 4,37 (m, 1H,
metina), 4,07 (m, 1H, metina), 2,96 (d, 2H, J = 7,6, ArCH_{2}),
2,21 (t, 2N, J = 7,7, glu 4-CH_{2}),
1,97-1,60 (m, 2H, glu 3-CH_{2}),
1,39 (s, 9H, t-Bu), 1,31 (s, 9H,
t-Bu), 1,27 (s, 9H, t-Bu).
De acuerdo con el ejemplo 48, se hidrogenaron
0,76 g de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-terc-butil-L-fenilalaninato
de terc-butilo usando 0,13 g de Pd(C) al 10% en 60 ml
de MeOH. Esto produjo 0,58 g (99%) de
5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-terc-butil-L-fenilalaninato
de terc-butilo en forma de un aceite transparente viscoso.
Se preparó una muestra de la sal HCl correspondiente para el
análisis por ^{1}H-RMN tratando 10 mg del producto
con un exceso de HCl etéreo 1 N y concentración a sequedad.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,97 (d, 1H, J = 7,0, NH),
8,27 (s a, 3H, NH_{3}^{+}), 7,31-7,15 (m, 3H, CH
aromático), 7,06 (d, 1H, J = 6,8, CH aromático), 4,38 (m, 1H,
metina), 3,82 (m, 1H, metina), 2,96 (d, 2H, J = 7,2, ArCH_{2}),
2,33 (m, 2H, glu 4-CH_{2}), 1,98 (m, 2H, glu
3-CH_{2}), 1,38 (s, 9H, t-Bu),
1,29 (s, 9H, t-Bu), 1,26 (s, 9H,
t-Bu).
De acuerdo con el ejemplo 49, se acoplaron 0,223
g de hemiclorhidrato del ácido
4-(N-(2,4-diamino-6-pteridinil-
metil)-N-metilamino)benzoico dihidrato (Aldrich) con 0,30 g de 5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-terc-butil-L-fenilalaninato de terc-butilo usando 0,27 ml de DECP (Aldrich) y 0,29 ml de Et_{3}N en 25 ml de DMF. El producto bruto se sometió a cromatografía ultrarrápida dos veces (180 g, SiO_{2}, 7:7:1 CH_{2}Cl_{2}:acetona:MeOH; y 185 g de SiO_{2}, 95:5 CH_{2}Cl_{2}:MeOH) para producir 0,323 g (71%) de N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-terc-butil-L-fenilalaninato de terc-butilo en forma de un polvo amarillo, p.f. 128-135ºC.
metil)-N-metilamino)benzoico dihidrato (Aldrich) con 0,30 g de 5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-terc-butil-L-fenilalaninato de terc-butilo usando 0,27 ml de DECP (Aldrich) y 0,29 ml de Et_{3}N en 25 ml de DMF. El producto bruto se sometió a cromatografía ultrarrápida dos veces (180 g, SiO_{2}, 7:7:1 CH_{2}Cl_{2}:acetona:MeOH; y 185 g de SiO_{2}, 95:5 CH_{2}Cl_{2}:MeOH) para producir 0,323 g (71%) de N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-terc-butil-L-fenilalaninato de terc-butilo en forma de un polvo amarillo, p.f. 128-135ºC.
Para el procedimiento B para preparar este
compuesto, véase el ejemplo 130.
De acuerdo con el ejemplo 50, se trataron 0,303 g
de
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-terc-butil-L-fenilalaninato
de terc-butilo con HCl gaseoso en 40 ml de CH_{3}NO_{2}
durante 1,5 h. El tratamiento y el aislamiento de la forma
convencional produjeron 0,215 g (79%) de
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-terc-butil-L-fenilalanina
en forma de un polvo amarillo, p.f. 183ºC
HPLC: un pico sobre C18, k' = 2,54,
70:30:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA, caudal = 1 ml/min.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 12,90-11,80
(s a, COOH), 8,59 (s, 1H, pteridinil 7-CH), 8,08
(d, 1H, J = 7,6, amida NH), 7,98 (d, 1H, J = 8,0 amida NH), 7,89 (s
a, 1H, NH_{2}) 7,70 (d, 2H, J = 8,9, CH aromático), 7,69 (s a,
1H, NH_{2}), 7,21 (s, 1H, CH aromático), 7,16 (d, 1H, J = 7,7, CH
aromático), 7,08 (t, 1H, J = 7,6, CH aromático), 6,99 (d, 1H, J =
7,4, CH aromático), 6,81 (m, 4H, CH aromático, NH_{2}), 4,79 (s,
2H, pteridinil CH_{2}), 4,43 (m, 2H, metinas), 3,21 (s, 3H,
N-CH_{3}), 3,03 (m, 1H, ArCH_{2}), 2,91 (m, 1H,
ArCH_{2}), 2,24 (t, 2H, J = 7,9, glu 4-CH_{2}),
2,04-1,74 (m, 2H, glu 3-CH_{2}),
1,20 (s, 9H, t-Bu).
Análisis Elemental: Calc. para
C_{33}H_{39}N_{9}O_{6}\cdot1,8 H_{2}O (PM 690,16): C,
57,43; H, 6,22; N, 18,27. Encontrado: c, 57,34; H, 6,07; N,
18,26.
Espectro de Masas: (FAB) 658 (M +
H)^{+}, 459, 307.
Espectro de UV: (Tampón pH 7)
\lambda_{max} (\varepsilon) 259,4 (22800), 308,1 (23000), 372,5
(7040).
\lambda_{min} (\varepsilon) 241,0 (13400),
274,6 (15200), 345,2 (5380).
Un matraz de 50 ml de 3 bocas seco, equipado con
un agitador magnético y una entrada de nitrógeno, se cargó con 0,10
g de
4'-(bis(2-cloroetil)amino)-L-fenilalanina\cdotH_{2}O
(Sigma), 14 ml de 1:1 DMF:CH_{3}CN y 0,19 ml de Et_{3}N. La
mezcla se trató con 91 mg de
2-(terc-butoxicarboniloxiimino)-2-fenilacetonitrilo
(BOC-ON, Fluka) y se agitó a TA en una atmósfera de
N_{2}. Después de 18 h, el material de partida sólido se había
disuelto dando una solución de color amarillo claro que se
concentró al vacío a sequedad. El análisis del residuo por tlc
(SiO_{2}, 9:1 CHCl_{3}:MeOH) indicó un nuevo componente
mayoritario a R_{f} = 0,65, componentes derivados de
BOC-ON a R_{f} = 1,0 y 0,71 y dos componentes
minoritarios a R_{f} = 0,60 y 0,35. El producto bruto se purificó
por cromatografía ultrarrápida sobre 60 g de gel de sílice (9:1
CHCl_{3}:MeOH) para producir 0,10 g (80%) de
N-((terc-butoxi)carbonil)-4-(bis(2-cloroetil)amino)-L-fenilalanina
en forma de un vidrio amarillo claro.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 7,04 (d, 2H, J = 8,6, CH
aromático), 6,62 (d, 2H, J = 8,5, CH aromático), 6,46 (s a, 1H, NH),
3,87 (m, 1H, metina), 3,67 (s, 8H, N,
(CH_{2}CH_{2}Cl)_{2}), 2,90 (m, 1H, ArCH_{2}), 2,73
(m, 1H, ArCH_{2}), 1,33 (s, 9H, t-Bu).
Un matraz de fondo redondo de 50 ml equipado con
un agitador magnético, se cargó con 96 mg de
N-((terc-butoxi)carbonil)-4-(bis(2-cloroetil)amino)-L-fenilalanina,
77 mg de
3-ciclopentil-L-fenilalaninato
de terc-butilo\cdotHCl y 10 ml de CH_{2}Cl_{2}. La
solución se enfrió a 0ºC y se trató con 48 mg de EDC (Aldrich)
seguido de 0,026 ml de N-morfolina. La mezcla de reacción se
agitó a 0ºC durante 20 min, se dejó calentar a TA y se agitó
durante 2 h más. El análisis de la solución por tlc (SiO_{2}, 7:3
hexano:EtOAc) indicó un nuevo componente mayoritario a R_{f} =
0,54 y cuatro componentes minoritarios a R_{f} = 0,4, 0,37, 0,16 y
0,0. La solución se concentró al vacío a sequedad y el residuo se
sometió a cromatografía ultrarrápida sobre 50 g de gel de sílice
para producir 73 mg (46%) de
N-((terc-butoxi)carbonil)-4-(bis(2-cloroetil)amino)-L-fenilalanil-(3-ciclopentil)-L-fenilalaninato
de terc-butilo en forma de un semisólido viscoso.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,18 (d, 1H, J = 7,8, NH),
7,19 (m, 1H, CH aromático), 7,13-7,00 (m, 5H, CH
aromático, NH), 6,77 (d, 1H, J = 8,8, CH aromático), 6,63 (d, 2H, J
= 8,9, CH aromático), 4,35 (m, 1H, metina), 4,05 (m, 1H, metina),
3,68 (s, 8H, N (CH_{2}CH_{2}Cl)_{2}), 2,93 (m, 3H,
ArCH_{2}, ciclopentil metina), 2,79 (m, 1H, ArCH_{2}), 2,58 (m,
1H, ArCH_{2}), 1,80-1,43 (m, 8H, ciclopentil
CH_{2}), 1,29 (s, 18H, t-Bu).
Un matraz de 25 ml de 3 bocas, equipado con una
entrada de nitrógeno y un agitador magnético, se cargó con 65 mg de
N-((terc-butoxi)carbonil)-4-(bis(2-cloroetil)amino)-L-fenilalanil-(3-ciclopentil)-L-fenilalaninato
de terc-butilo y 8 ml de CH_{3}NO_{2}. La solución se
acidificó burbujeando gas HCl a su través durante 10 min. Después
de agitar a TA en una atmósfera de N_{2} durante 30 min, la
solución se concentró al vacío a sequedad. El análisis del sólido
resultante por HPLC (C18, 50:50:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA) indicó un
componente mayoritario a k' = 1,14 (96%) y un componente
minoritario a k' = 1,60 (4%). El producto bruto se purificó por HPLC
semipreparativa (C18, 55:45:0,1 \rightarrow 50:50:0,1 de
H_{2}O:MeCN:TFA durante 20 min, caudal = 15 ml/min). Las
fracciones que contenían el producto puro (k' = 1,14 por HPLC
analítica) se combinaron y se concentraron al vacío hasta 20 ml. La
suspensión resultante se congeló y se liofilizó para producir 35 mg
(55%) de
4-(Bis-(2-cloroetil)amino)-L-fenilalanil-3-ciclopentil-L-fenilalanina
en forma de un polvo blanco, p.f. 80-90ºC.
HPLC: un pico sobre C18, k' = 1,05, 50:
50: 0,1:MeCN\cdotH_{2}O:TFA, caudal = 1 ml/min.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,85 (d, 1H, J = 7,8, NH),
8,00 (s a, 3H, NH_{3}^{+}), 7,25-7,00 (m, 6H, CH
aromático), 6,70 (d, 2H, J = 8,5, CH aromático), 4,50 (m, 1H,
metina), 3,89 (m, 1H, metina, 3,69 (s, 8H, N
(CH_{2}CH_{2}Cl)_{2}), 3,12-283 (m, 4H,
ArCH_{2}, ciclopentil metina), 2,77 (m, 1H, ArCH_{2}), 1,97 (m,
2H, ciclopentil CH_{2}), 1,84-1,43 (m, 6H,
ciclopentil CH_{2}).
^{19}F-RMN: (282 MHz,
DMSO-d_{6}): \delta 1,26 (con respecto a un
patrón externo de TFA).
Análisis Elemental: Calc. para
C_{27}H_{35}N_{3}O_{3}Cl_{2}\cdotTFA\cdot1,6 H_{2}O
(PM 663,35): C, 52,51; H, 5,96; N, 6,33. Encontrado: C, 52,16; H,
5,69; N, 6,69.
Espectro de Masas: (FAB) 250 (M +
H)^{+}, 273.
Espectro de UV: (2,5 x
10-3M NaOH) \lambda_{max} (\varepsilon) 261,5
(18700), 303,9 (2090).
\lambda_{min} (\varepsilon) 232,3 (5270),
288,2 (1760).
Un matraz de 100 ml de 3 bocas equipado con un
agitador magnético y una entrada de nitrógeno se cargó con 5,0 g de
alcohol 3-yodobencílico (Aldrich), 3,86 g de
cloruro de terc-butildimetilsililo (Aldrich), 3,20 g de
imidazol (Aldrich) y 30 ml de DMF anhidra. La solución resultante
se agitó en una atmósfera de nitrógeno durante 4 h y se concentró
al vacío para dar un aceite viscoso transparente. Este material se
disolvió en 150 ml de EtOAc y la solución se lavó con NaHCO_{3}
acuoso al 5% (3 x 70 ml), se secó sobre MgSO_{4} anhidro y se
concentró al vacío para dar un líquido transparente. El producto
bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre 200 g de gel
de sílice (hexano) para producir 7,01 g (94%) de
3-yodo-O-(terc-butildimetilsilil)bencil
alcohol en forma de un líquido transparente.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 7,67 (s, 1H, CH aromático),
7,56 (d, 1H, J = 7,3, CH aromático), 7,27 (d, 1H, J = 9,2, CH
aromático), 7,06 (t, 1H, J = 7,6, CH aromático), 4,68 (s, 2H,
ArCH_{2}O), 0,94 (s, 9H, t-Bu), 0,10 (s, 6H,
SiMe_{2}).
A un matraz de 500 ml de 3 bocas seco, equipado
con una entrada de nitrógeno y un agitador magnético, se le
añadieron 7,0 g de
3-yodo-O-(terc-butildimetilsilil)bencil
alcohol y 100 ml de THF anhidro. La solución se enfrió a -78ºC en
un baño de hielo seco-isopropanol y se trató con
9,7 ml de n-butillitio/hexano 2,5 M (Aldrich) por
adición gota a gota mediante una jeringa a través de un tabique de
caucho. Después de agitar a -78ºC durante 20 min, la solución se
trató con 1,80 de ciclobutanona (Aldrich) por adición gota a gota.
La mezcla de reacción se agitó a -78ºC durante 20 min y después se
dejó calentar a TA. Después de 30 min a TA, la solución se mezcló
con 100 ml de agua y se sometió a evaporación rotatoria para
retirar el THF. La emulsión resultante se extrajo con EtOAc (4 x 60
ml). Los extractos de EtOAc combinados se lavaron con salmuera
saturada, se secaron sobre MgSO_{4} anhidro y se concentraron al
vacío para dar un aceite amarillo claro. Este material se purificó
por cromatografía ultrarrápida sobre 160 g de gel de sílice (9:1 de
hexano:EtOAc) para producir 3,98 g (68%) de
3-(1-hidroxiciclobutil)-O-(terc-butiltrimetilsilil)bencil
alcohol en forma de un líquido transparente.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 7,44 (s, 1H, CH aromático),
7,38-7,23 (m, 2H, CH aromático), 7,15 (d, 1H, J =
7,4, CH aromático), 5,45 (s, 1H, OH), 4,72 (s, 2H, ArCH_{2}O),
2,41-2,18 (m, 4H, ciclobutil CH_{2}), 1,88 (m,
1H, ciclobutil CH_{2}), 1,61 (m, 1H, ciclobutil CH_{2}), 0,90
(s, 9H, t-Bu), 0,08 (s, 6H, SiMe_{2}).
Un matraz de 500 ml de 3 bocas seco, equipado con
una entrada de nitrógeno y un agitador magnético se cargó con 3,98
g de
3-(1-hidroxiciclobutil)-O-(-terc-butiltrimetilsilil)bencil
alcohol y 85 ml de CH_{2}Cl_{2}. La solución se enfrió a 0ºC en
una atmósfera de nitrógeno y se trató con 15,7 ml de TFA seguido de
4,78 ml de trietilsilano. Después de agitar a 0ºC durante 1 h, la
solución se dejó calentar a TA. El análisis por tlc (SiO_{2}, 8:2
de hexano:EtOAc) después de 3,5 h a TA, indicó material de partida
sin reaccionar a R_{f} = 0,15 y un nuevo componente a R_{f} =
0,65. La solución se trató con 3 ml más de trietilsilano y se agitó
a TA durante 18 h. La solución se enfrió a 0ºC y se neutralizó por
la adición lenta de 30 ml de Et_{3}N. La mezcla se concentró al
vacío para dar un líquido amarillo claro que se disolvió en 100 ml
de EtOAc. La solución resultante se lavó con salmuera saturada (3 x
80 ml), se secó sobre MgSO_{4} anhidro y se concentró para dar un
líquido transparente. Este material se disolvió en 80 ml de THF
anhidro y se trató con 60 ml de
(n-Bu)_{4}NF 1 M (Aldrich) en un matraz de
500 ml de 3 bocas. Después de agitar a TA durante 18 h, la solución
se concentró al vacío y el residuo se disolvió en 100 ml de EtOAc.
La solución se lavó con salmuera saturada (4 x 80 ml), se secó sobre
MgSO_{4} anhidro y se concentró para dar un aceite transparente.
El producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre
120 g del gel de sílice (8:2 de hexano:EtOAc) para producir 1,29 g
(59%) de alcohol 3-ciclobutilbencílico en forma de
un líquido transparente.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 7,29-7,05 (m,
4H, CH aromático), 5,14 (t, J = 5,7, OH), 4,48 (d, J = 5,8,
ArCH_{2}O), 3,51 (m, 1H, ciclobutil metina), 2,30 (m, 2H,
ciclobutil CH_{2}), 2,17-1,88 (m, 3H, ciclobutil
CH_{2}), 1,82 (m, 1H, ciclobutil CH_{2}).
De acuerdo con el ejemplo 17, se trataron 1,29 g
de alcohol 3-ciclobutilbencílico con 0,26 ml de
PBr_{3} en 15 ml de CH_{2}Cl_{2} anhidro para producir 1,69 g
de producto bruto (pureza del 92% por ^{1}H-RMN).
Este material se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre 65 g
de gel de sílice (hexano) para producir 1,59 g (89%) de bromuro de
3-ciclobutilbencilo en forma de un líquido
transparente.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 7,35-7,13 (m,
4H, CH aromático), 4,70 (s, 2H, ArCH_{2}Br), 3,53 (m, 1H,
ciclobutil metina), 2,39-1,75 (m, 6H, ciclobutil
CH_{2}).
De acuerdo con el ejemplo 81, se alquilaron 2,50
g de
(2R,3S)-(-)-6-oxo-2,3-difenil-4-morfolinacarboxilato
de terc-butilo (Aldrich) con 1,59 g de bromuro de
3-ciclobutilbencilo en 80 ml de THF anhidro usando
7,41 ml de bis(trimetilsilil)amida sódica 1 M en THF
(Aldrich). El producto bruto se sometió a cromatografía
ultrarrápida sobre 120 g de gel de sílice (8:2 de hexano:EtOAc) y
después se recristalizó en EtOH-agua para producir
1,90 g (54%) de
(2R,3S,5S)-6-oxo-2,3-difenil-5-(3-ciclobutilbencil)-4-morfolinacarboxilato
de terc-butilo en forma de un polvo blanco, p.f.
145-147ºC.
De acuerdo con el ejemplo 82, se trataron 1,87 g
de
(2R,3S,5S)-6-oxo-2,3-difenil-5-(3-ciclobutilbencil)-4-morfolinacarboxilato
de terc-butilo con 3,1 ml de TFA en 30 ml de CH_{2}Cl_{2}
durante 4 h. La neutralización con 8 ml de Et_{3}N y el
tratamiento de la forma convencional dio un residuo amarillo claro.
La purificación del material bruto por cromatografía ultrarrápida
sobre 85 g de gel de sílice (8:2 de hexano:EtOAc) produjo 1,35 g
(91%) de
(2R,3S,5S)-6-oxo-2,3-difenil-5-(3-ciclobutilbencil)morfolina
en forma de un semisólido transparente viscoso.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 7,24-7,02 (m,
10H, CH aromático), 6,92 (m, 4H, CH aromático), 5,71 (s, 1H,
morfolina 2-H), 4,64 (m, 1H, morfolina
3-H), 4,24 (m, 1H, morfolina 5-H),
3,42 (m, 1H, ciclobutil metina), 3,26 (m, 1H, ArCH_{2}), 3,10 (m,
1H, ArCH_{2}), 2,76 (t, H, J = 5,3, NH), 2,15 (m, 2H, ciclobutil
CH_{2}), 2,02-2,81 (m, 3H, ciclobutil CH_{2}),
1,71 (m, 1H, ciclobutil CH_{2}).
De acuerdo con el ejemplo 53, se hidrogenaron
1,35 g de
(2R,3S,5S)-6-oxo-2,3-difenil-5-(3-ciclobutilbencil)morfolina
en 60 ml de 1:1 de THF:EtOH usando 0,42 g de PdCl_{2} para
producir 0,79 g (91%) de
3-ciclobutil-L-fenilalanina
en forma de un polvo blanco, p.f. >200ºC.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,40 (s a, 3H,
NH_{3}^{+}), 7,26 (m, 1H, CH aromático), 7,13 (m, 2H, CH
aromático), 7,08 (d, 1H, J = 7,4, CH aromático), 4,13 (m, 1H,
metina), 3,50 (m, 1H, ciclobutil metina), 3,11 (d, 2H, J = 7,4,
ArCH_{2}), 2,29 (m, 2H, ciclobutil CH_{2}),
2,18-1,88 (m, 3H, ciclobutil CH_{2}), 1,83 (m, 1H,
ciclobutil CH_{2}).
De acuerdo con el ejemplo 54, se trataron 0,65 g
de
3-ciclobutil-L-fenilalanina\cdotHCl
con 25 ml de isobutileno en 25 ml de 1,4-dioxano en
presencia de 0,5 ml de H_{2}SO_{4} conc. El tratamiento de la
forma convencional seguido de acidificación de la amina libre con
HCl etéreo produjo 0,64 g (81%) de
3-Ciclobutil-L-fenilalaninato
de terc-butilo en forma de un polvo blanco, p.f.
173-174ºC.
De acuerdo con el ejemplo 9, se acoplaron 0,64 g
de
3-ciclobutil-L-fenilalaninato
de terc-butilo\cdotHCl con 0,69 g de
\gamma-terc-butil éster del ácido
N-Cbz-L-glutámico (Sigma)
usando 0,41 g de EDC (Aldrich) y 0,23 ml de N-metilmorfolina.
El producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre
85 g de gel de sílice (7:3 de hexano:EtOAc) para producir 0,98 g
(80%) de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-ciclobutil-1-fenilalaninato
de terc-butilo en forma de un aceite transparente
viscoso.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,21 (d, 1H, J = 7,3, NH),
7,33 (m, 6H, CH aromático, NH), 7,18 (m, 1H, CH aromático), 7,02 (m,
3H, CH aromático), 5,00 (m, 2H, PhCH_{2}O), 4,32 (m, 1H, metina),
4,05 (m, 1H, metina), 3,47 (m, 1H, ciclobutil metina), 2,92 (d, 2H,
J = 7,6, ArCH_{2}), 2,31-2,12 (m, 4H, glu
4-CH_{2}, ciclobutil CH_{2}),
2,11-1,62 (m, 6H, glu 3-CH_{2},
ciclobutil CH_{2}), 1,37 (s, 9H, t-Bu), 1,29 (s,
9H, t-Bu).
De acuerdo con el ejemplo 48, se hidrogenaron
0,98 g de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-ciclobutil-L-fenilalaninato
de terc-butilo usando 0,17 g de Pd(C) al 10% en 55 ml
de MeOH. Esto produjo 0,76 g (100%) de
5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-ciclobutil-L-fenilalaninato
de terc-butilo en forma de un aceite transparente viscoso.
Se preparó una muestra de la sal HCl correspondiente para el
análisis por ^{1}H-RMN por tratamiento de 10 mg
del producto con exceso de HCl etéreo 1 N y concentración a
sequedad.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,92 (d, 1H, J = 7,0, NH),
8,25 (s a, 3H, NH_{3}^{+}), 7,20 (m, 1H, CH aromático), 7,08 (m,
3H, CH aromático), 4,38 (m, 1H, metina), 3,83 (m, 1H, metina), 3,48
(m, 1H, ciclobutil metina), 2,94 (d, 2H, J = 7,8, ArCH_{2}), 2,16
(m, 4H, glu 4-CH_{2}, ciclobutil CH_{2}),
2,15-1,86 (m, 5H, glu 3-CH_{2},
ciclobutil CH_{2}), 1,79 (m, 1H, ciclobutil CH_{2}), 1,38 (s,
9H, t-Bu), 1,31 (s, 9H, t-Bu).
De acuerdo con el ejemplo 49, se acoplaron 0,285
g de hemiclorhidrato del ácido
4-(N-(2,4-diamino-6-pteridinil-
metil)-N-metilamino)benzoico dihidrato (Aldrich) con 038 g de 5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-ciclobutil-L-fenilalaninato de terc-butilo usando 0,34 ml de DECP (Aldrich) y 0,37 ml de Et_{3}N en 25 ml de DMF. El producto bruto se sometió a cromatografía ultrarrápida sobre 100 g de gel sílice (7:7:1 de CH_{2}Cl_{2}:acetona:MeOH) para producir 0,45 g (78%) de N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-ciclobutil-L-fenilalaninato de terc-butilo en forma de un polvo amarillo, p.f. 120-125ºC.
metil)-N-metilamino)benzoico dihidrato (Aldrich) con 038 g de 5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-ciclobutil-L-fenilalaninato de terc-butilo usando 0,34 ml de DECP (Aldrich) y 0,37 ml de Et_{3}N en 25 ml de DMF. El producto bruto se sometió a cromatografía ultrarrápida sobre 100 g de gel sílice (7:7:1 de CH_{2}Cl_{2}:acetona:MeOH) para producir 0,45 g (78%) de N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-ciclobutil-L-fenilalaninato de terc-butilo en forma de un polvo amarillo, p.f. 120-125ºC.
De acuerdo con el ejemplo 50, se trataron 0,40 g
de
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-ciclobutil-L-fenilalaninato
de terc-butilo con HCl gaseoso en 60 ml de CH_{3}NO_{2}
durante 1 h. El tratamiento y el aislamiento de la forma
convencional produjeron 0,281 g (79%) de
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclobutil-L-fenilalanina
en forma de un polvo amarillo, p.f. 175ºC (desc.)
HPLC: un pico sobre C18, k' = 2,50,
65:35:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA, caudal = 1 ml/min.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 12,85-11,75
(m a, COOH), 8,58 (s, 1H, pteridinil 7-CH), 8,04
(d, 1H, J = 8,1, amida NH), 8,00 (d, 1H, J = 8,7, amida NH), 7,75
(s a, 1H, NH_{2}), 7,71 (d, 2H, J = 8,9, CH aromático), 7,55 (s a,
1H, NH_{2}), 7,10-6,92 (m, 4H, CH aromático),
6,82 (d, 2H, J = 8,9, CH aromático), 6,70 (s a, 2H, NH_{2}), 4,79
(s, 2H, pteridinil-CH_{2}), 4,39 (m, 2H, metinas),
3,40 (m, 1H, ciclobutil metina), 3,21 (s, 3H,
N-CH_{3}), 3,00 (m, 1H, ArCH_{2}), 2,88 (m, 1H,
ArCH_{2}), 2,29-2,08 (m, 4H, glu
4-CH_{2}, ciclobutil CH_{2}),
2,07-1,65 (m, 6H, glu 3-CH_{2},
ciclobutil CH_{2}).
Análisis Elemental: Calc. para
C_{33}H_{37}N_{9}O_{6}\cdot1,6 H_{2}O (PM 684,54), C,
57,90; H, 5,92; N, 18,42. Encontrado: C, 57,88; H, 5,90; N,
18,52.
Espectro de Masas: (Nebulización Iónica)
656 (M + H)^{+}.
Espectro UV: (tampón pH 7) \lambda_{max}
(\varepsilon) 259,5 (22100), 308,0 (22300), 373,7 (6740).
\lambda_{min} (\varepsilon) 241,2 (12900),
274,5 (14600), 345,6 (5130).
De acuerdo con el ejemplo 4, se sometió 1,00 g de
3,4-dihidro-2,6-dimetil-4-oxoquinazolina
(Sen, A. B.; Gupta, J.K. J. Indian Chem. Soc., 1962,
31, 369) a bromación usando 1,05 g de N-bromosuccinimida
(Aldrich) y 0,17 g de peróxido de benzoílo en 50 ml de
1,2-dicloro-etano durante 30 min
para producir 0,95 g (64%) de
6-bromometil-3,4-dihidro-2-metil-4-oxoquinazolina
en forma de un sólido castaño.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,17 (s, 1H, CH aromático),
7,85 (d, 1H, J = 8,5, CH aromático), 7,58 (d, 1H, J = 8,5, CH
aromático), 4,88 (s, 2H, ArCH_{2}Br), 2,39 (s, 3H, CH_{3}).
Una mezcla de 2,0 g de
5-amino-2-tiofenocarboxilato
de etilo (Mackay, D. Can J. Chem., 1966, 44,
2881-2891; Paul, H., Migulla, H. Arch.
Pharm., 1978, 311, 679-691), 2,05 g de
yoduro de metilo (Aldrich) y 2,58 g de 2,6-lutidina
(Aldrich) en 80 ml de DMF se agitó a 70ºC en una atmósfera de
nitrógeno durante 24 h. El análisis de la mezcla de reacción por
tlc (SiO_{2}, 3:2 de hexano:EtOAc) indicó material de partida a
R_{f} = 0,51 y un nuevo componente a R_{f} = 0,60. La mezcla se
trató con 1,71 g más de yoduro de metilo y se agitó a 70ºC durante 8
h, a TA durante 72 h y a 70ºC durante 8 h más. La mezcla de reacción
se mezcló con 75 ml de agua y se extrajo con EtOAc (3 x 150 ml). Los
extractos de EtOAc combinados se lavaron con salmuera acuosa
saturada, se secaron sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y se
concentraron al vacío a sequedad. El residuo bruto se sometió a
cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (75:25 de
hexano:EtOAc) para producir 0,67 g (38%) de
5-N-metilamino-2-tiofenocarboxilato
de etilo en forma de un sólido pardo, p.f.
41-43ºC.
Un matraz de fondo redondo de 100 ml equipado con
un condensador y un agitador magnético se cargó con 0,66 g de
6-bromometil-3,4-dihidro-2-metil-4-oxoquinazolina,
0,44 g de
5-N-metilamino-2-tiofenocarboxilato
de etilo, 0,25 g de 2,6-lutidina y 30 ml de DMF
anhidra. La mezcla se agitó a 80ºC durante 18 h. El análisis de la
mezcla de reacción por tlc (SiO_{2}, 95:5 de
CH_{2}Cl_{2}:MeOH) indicó materiales de partida y un nuevo
componente a R_{f} = 0,41. La mezcla se concentró al vacío a
sequedad y el residuo se sometió a cromatografía ultrarrápida sobre
110 g de gel de sílice (95:5 de CH_{2}Cl_{2}:MeOH). Las
fracciones que contenían el componente de R_{f} = 0,41 se
combinaron y se concentraron para producir 0,42 g (49%) de
5-(((3,4-dihidro-2-metil-4-oxo-6-quinazolinil)metil)metilamino)-2-tiofenocarboxilato
de etilo en forma de un polvo castaño claro, p.f. >200ºC.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 12,22 (s a, 1H, NH), 7,92 (s,
1H, CH aromático), 7,65 (d, 1H, J = 8,4, CH aromático), 7,56 (d,
1H, J = 8,5, CH aromático), 7,48 (d, 1H, J = 4,4, tienil CH), 6,07
(d, 1H, J = 4,3, tienil CH), 4,70 (s, 2H,
quinazolinil-CH_{2}), 4,16 (q, 2H, J = 7,2, etil
CH_{2}), 3,09 (s, 3H, N-CH_{3}), 2,33 (s, 3H,
quinazolinil 2-CH_{3}), 1,22 (t, 3H, J = 7,2, etil
CH_{3}).
Un matraz de 25 ml de 3 bocas equipado con un
condensador, un termómetro y un agitador magnético, se cargó con
0,20 g de
5-(((3,4-dihidro-2-metil-4-oxo-6-quinazolinil)metil)metilamino)-2-tiofeno-carboxilato
de etilo, 6 ml de EtOH y 6 ml de NaOH acuoso 1 N. La solución
resultante se agitó en una atmósfera de nitrógeno a TA durante 25
min y después a 55ºC durante 2 h. El análisis por tlc (SiO_{2},
95:5 de CH_{2}Cl_{2}) indicó que no quedaba material de partida
y un nuevo componente a R_{f} = 0,06. La solución se enfrió a TA y
se sometió a evaporación rotatoria para retirar el EtOH. La solución
restante se diluyó con 10 ml de agua y se acidificó a pH = 3,5 por
la adición de HCl acuoso 1 N. Se formó un precipitado castaño que se
recogió por centrifugación, se lavó con 4 ciclos de suspensión
acuosa-centrifugación-decantación y
se liofilizó para producir 0,116 g (63%) de ácido
5-(((3,4-dihidro-2-metil-4-oxo-6-quinazolin)metil)metilamino)-2-tiofeno-carboxílico
en forma de un polvo blanco, p.f. 195ºC (desc.).
^{1}H RMN: (200 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 12,40-11,90
(m a, COOH, NH), 7,95 (s, 1H, CH aromático), 7,69 (m, 1H, CH
aromático), 7,58 (d, 1H, J = 8,2, CH aromático), 7,42 (d, 1H, J =
4,2, tienil CH), 6,04 (d, 1H, J = 4,2, tienil CH), 4,70 (s, 2H,
quinazolinil-CH_{2}), 3,09 (s, 3H,
N-CH_{3}), 2,35 (s, 3H, quinazolinil
2-CH_{3}).
Un matraz de 50 ml de 3 bocas seco, equipado con
una entrada de nitrógeno y un agitador magnético, se cargó con
0,115 g de ácido
5-(((3,4-dihidro-2-metil-4-oxo-6-quinazolin)metil)metilamino)-2-tiofeno-carboxílico,
0,165 g de
5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-fenilalaninato
de terc-butilo, 0,06 ml de Et_{3}N y 7 ml de DMF anhidra.
La solución amarilla se trató con 0,06 ml de DECP y se agitó a TA en
una atmósfera de nitrógeno. Después de 2 h, la tlc (SiO_{2}, 95:5
de CH_{2}Cl_{2}:MeOH) indicó material de partida a R_{f} =
0,02, un nuevo componente mayoritario a R_{f} = 0,37 y componentes
minoritarios a R_{f} = 0,31 y 0,40. La mezcla de reacción se trató
con 0,03 ml más de DECP y 0,03 ml de Et_{3}N y se agitó durante 1
h más a TA. La tlc indicó una pequeña conversión adicional. La
solución se concentró al vacío a sequedad y el residuo se disolvió
en 60 ml de CHCl_{3}. La solución se lavó con NaHCO_{3} acuoso
al 5% (3 x 50 ml), se secó sobre MgSO_{4} anhidro y se concentró
para dar un aceite amarillo claro. El producto bruto se sometió a
cromatografía ultrarrápida dos veces (SiO_{2}, 95:5 de EtOAc:MeOH;
SiO_{2}, 97:3 CH_{2}Cl_{2}:MeOH) para producir 0,119 g (46%)
de
N-((5-(((3,4-dihidro-2-metil-4-oxo-6-quinazolin)metil)metilamino)-2-tienil)carbonil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-fenilalaninato
de terc-butilo en forma de una espuma de color castaño.
^{1}H RMN: (400 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 12,19 (s, 1H, NH de
quinazolina), 8,18 (d, 1H, J = 7,1, amida NH), 7,92 (m, 2H, amida
NH, CH aromático), 7,63 (dd; 1H; J = 7,9, 1,8; CH aromático), 7,57
(d, 1H, J = 4,1, tienil CH), 7,54 (d, 1H, J = 8,0, CH aromático),
7,12-6,94 (m, 4H, CH aromático), 5,97 (d, 1H, J =
4,1, tienil CH), 4,63 (s, 2H,
quinazolinil-CH_{2}), 4,40-4,27
(m, 2H, metinas), 3,02 (s, 3H, N-CH_{3}), 2,87 (m,
3H, ArCH_{2}, ciclopentil metina), 2,31 (s, 3H, quinazolinil
2-CH_{3}), 2,20 (t, 2H, J = 7,7, glu
4-CH_{2}), 1,91 (m, 3H, glu
3-CH_{2}, ciclopentil CH_{2}),
1,83-1,40 (m, 7H, ciclopentil CH_{2}), 1,35 (s,
9H, t-Bu), 1,27 (s, 9H, t-Bu).
De acuerdo con el ejemplo 50, se trataron 0,117 g
de
N-((5-(((3,4-dihidro-2-metil-4-oxo-6-quinazolin)metil)metilamino)-2-tienil)carbonil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-fenilalaninato
de terc-butilo con HCl gaseoso en 25 ml de CH_{3}NO_{2}
durante 45 min. La retirada del CH_{3}NO_{2} al vacío dio un
residuo castaño que se purificó por HPLC de fase inversa
semi-preparativa (C18, 70: 30: 0,1 \rightarrow 60:
40: 0,1 de H_{2}O: MeCN: TFA durante 25 min). Las fracciones que
contenían el componente mayoritario (k' = 1,61 en la HPLC analítica
C18, 60:40: 0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA) se combinaron, se
concentraron hasta 25 ml y se liofilizaron para producir 0,052 g
(42%) de
N-((5-(((3,4-dihidro-2-metil-4-oxo-6-quinazolinil)metil)metilamino)-2-tienil)carbonil)-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-fenilalanina
en forma de un polvo amarillo, p.f. 125ºC (desc.)
HPLC: un pico sobre C18, k' = 1,62,
60:40:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA, caudal = 1 ml/min.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,09 (d, 1H, J = 7,5, amida
NH), 7,93 (m, 2H, amida NH, CH aromático), 7,69 (d, 1H, J = 8,0, CH
aromático), 7,56 (m, 2H, CH aromático, tienil CH),
7,10-6,92 (m, 4H, CH aromático), 5,97 (d, 1H, J =
4,3, tienil CH), 4,66 (s, 2H,
quinazolinil-CH_{2}), 4,33 (m, 2H, metinas), 3,06
(s, 3H, N-CH_{3}), 2,99 (m, 1H, ArCH_{2}), 2,85
(m, 1H, ArCH_{2}), 2,38 (s, 3H, quinazolinil
2-CH_{3}), 2,22 (t, 2H, J = 7,5, glu
4-CH_{2}), 2,02-1,37 (m, 10H, glu
3-CH_{2}, ciclopentil CH_{2}).
^{19}F-RMN: (376 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 0,57 (con respecto a un
patrón externo de TFA).
Análisis Elemental: Calc. para
C_{35}H_{39}N_{5}O_{7}S\cdot1,2 TFA\cdot1,3 H_{2}O (PM
834,03), C, 53,86; H, 5,17; N, 8,40; S, 3,84. Encontrado: C, 53,85;
H, 5,11; N, 8,36, S, 3,92.
Espectro de Masas: (Nebulización Iónica)
691 (M + NH_{4}^{+}).
Espectro UV: (tampón pH 7) \lambda_{max}
(\varepsilon) 225,2 (36600), 265,6 (10300), 353,1 (22200).
\lambda_{min} (\varepsilon) 214,3 (35200),
252,1 (9230), 288,4 (4120).
Un matraz de 25 ml de 3 bocas, equipado con un
agitador magnético y un entrada de nitrógeno, se cargó con 0,258 g
del ácido
4-(N-(3-(2,4-diamino-1,6-dihidro-6-oxo-5-pirimidinil)propil)trifluoroacetamido)benzoico
(Styles, V.L., et al., J. Heterocyclic Chem., 1990,
27, 1809), 0,250 g de
5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-fenilalaninato
de terc-butilo, 0,077 g de
1-hidroxibenzotriazol hidrato (Aldrich), 5 ml de DMF
anhidra y 0,07 ml de Et_{3}N. La solución se trató con 0,104 g de
DCC (Fluka) y se agitó a TA en una atmósfera de nitrógeno durante 24
h. La mezcla se filtró y el filtrado se concentró al vacío a
sequedad. El residuo se disolvió en 70 ml de CH_{2}Cl_{2}, se
lavó con NaHCO_{3} acuoso al 5% (3 x 50 ml), se secó sobre
MgSO_{4} anhidro y se concentró para dar un aceite castaño. Este
material se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre gel de
sílice (95:5 \AE 90:10 de CH_{2}Cl_{2}:MeOH) para producir
0,304 g (70%) de
5-O-terc-butil-N-(4-((3-(2,4-diamino-1,6-dihidro-6-oxo-5-piridimidinil)propil)-trifluoroacetamido)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-fenilalaninato
de terc-butilo en forma un vidrio castaño, p.f.
124-130ºC.
A un matraz de fondo redondo de 100 ml equipado
con una entrada de nitrógeno y un agitador magnético, se le
añadieron 0,268 g de
5-O-terc-butil-N-(4-((3-(2,4-diamino-1,6-dihidro-6-oxo-5-piridimidinil)propil)-trifluoroacetamido)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-fenilalaninato
de terc-butilo y 7 ml de MeOH. La solución se trató con 0,18
ml de dimetilamina al 40%/agua (p/p) (Aldrich) seguido de 0,45 ml de
agua y se agitó a TA en una atmósfera de nitrógeno durante 24 h. La
solución se concentró al vacío a sequedad y el residuo se sometió a
cromatografía ultrarrápida sobre 60 g de gel sílice (92:8 de
CH_{2}Cl_{2}:MeOH) para producir 0,185 g (78%) de
5-O-terc-butil-N-(4-((3-(2,4-diamino-1,6-dihidro-6-oxo-5-pirimidinil)propil)amino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-fenilalaninato
de terc-butilo en forma de un semi- sólido transparente
viscoso.
^{1}H RMN: (200 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 9,80 (s a, 1H, pirimidinil
NH), 8,20 (d, 1H, J = 7,2, amida NH), 7,90 (d, 1H, J = 8,0, amida
NH), 7,67 (d, 2H, J = 8,6, CH aromático), 7,20-6,98
(m, 4H, CH aromático), 6,55 (d, 2H, J = 8,6, CH aromático), 6,25 (m,
1H, NH), 5,94 (s a, 2H, NH_{2}), 5,77 (s a, 2H, NH_{2}),
4,54-4,29 (m, 2H, metinas),
3,12-2,80 (m, 5H, ciclopentil metina, ArCH_{2},
pirimidinil-CH_{2}CH_{2}CH_{2}N), 2,27 (m,
4H, glu 4-CH_{2},
pirimidinil-CH_{2}CH_{2}CH_{2}N),
2,10-1,82 (4H, glu 3-CH_{2},
ciclopentil CH_{2}), 1,80-1,45 (m, 8H, ciclopentil
CH_{2}, pirimidinil-CH_{2}CH_{2}CH_{2}N),
1,39 (s, 9H, t-Bu), 1,32 (s, 9H,
t-Bu).
Un matraz de fondo redondo de 100 ml equipado con
un agitador magnético, se cargó con 0,180 g de
5-O-terc-butil-N-(4-((3-(2,4-diamino-1,6-dihidro-6-oxo-5-pirimidinil)propil)amino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-fenilalaninato
de terc-butilo y 25 ml de CH_{3}NO_{2}. La mezcla se
acidificó burbujeando gas HCl a su través durante 5 min, sin
embargo, el material de partida sólido no se disolvió. El análisis
de la mezcla de reacción por tlc (SiO_{2} 92:8 de
CH_{2}Cl_{2}:MeOH) indicó una conversión mínima del material de
partida. La mezcla se concentró al vacío a sequedad. Se produjo un
residuo amarillo que se suspendió en 20 ml CH_{2}Cl_{2} y se
trató con 1 ml de anisol seguido de 15 ml de TFA. El sólido
rápidamente se disolvió dando una solución amarilla que se agitó a
TA en una atmósfera de nitrógeno. Después de 1 h, la tlc indicó que
no quedaba material de partida y una nueva mancha a R_{f} = 0,0.
La solución se concentró a sequedad y el residuo se purificó por
HPLC de fase inversa semi-preparativa (C18,
70:30:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA). Las fracciones que contenían el
material puro se combinaron, se concentraron hasta 30 ml y se
liofilizaron par producir 0,098 g (47%) de
N-(4-((3-(2,4-diamino-1,6-dihidro-6-oxo-5-pirimidinil)propil)-amino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-fenilalanina
en forma de un sólido blanco esponjoso, p.f. 125ºC (desc.)
HPLC: un pico sobre C18, k' = 1,64,
70:30:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA, caudal = 1 ml/min.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 12,91-11,10
(s a, COOH, pirimidinil NH), 8,07 (d, 1H, J = 7,6, amida NH), 7,88
(d, 1H, J = 7,9, amida NH), 7,70 (s a, 1H, NH_{2}), 7,62 (m, 3H,
NH_{2}, CH aromático), 7,13-6,70 (m, 6H, NH_{2},
CH aromático), 6,53 (d, 2H, J = 8,6, CH aromático), 4,40 (m, 2H,
metinas), 3,01 (m, 3H, ciclopentil metina,
pirimidinil-CH_{2}CH_{2}CH_{2}N), 2,86 (m, 2H,
ArCH_{2}), 2,25 (m, 4H, glu 4-CH_{2},
pirimidinil-CH_{2}CH_{2}CH_{2}N),
2,01-1,78 (m, 4H, glu 3-CH_{2},
ciclopentil CH_{2}), 1,76-1,37 (m, 8H,
ciclopentil CH_{2},
pirimidinil-CH_{2}CH_{2}CH_{2}N).
^{19}F-RMN: (282 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 3,92 (con respecto a un
patrón externo de TFA).
Análisis Elemental: Calc. para
C_{33}H_{41}N_{7}O_{7}\cdot1,8 TFA\cdot1,6 H_{2}O (PM
881,80), C, 49,85; H, 5,26; N, 11,12. Encontrado: C, 49,81; H, 5,24;
N, 11,11.
Espectro de Masas: (Nebulización Iónica)
648 (M + H)^{+}.
Espectro UV: (tampón pH 7) \lambda_{max}
(\varepsilon) 280,1 (29700).
\lambda_{min} (\varepsilon) 247,4 (7590), sh
(\varepsilon) 302,9 (20400).
De acuerdo con el ejemplo 9, se acopló 1,00 g de
clorhidrato de di-t-butil éster del
ácido L-aspártico (Sigma) con un 1,20 g de
\gamma-t-butil éster del ácido
N-Cbz-L-glutámico (Sigma)
usando 0,72 g de EDC (Aldrich) y 0,39 ml de N-metilmorfolina.
El producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre
80 g de gel de sílice (75:25 de hexano:EtOAc) para producir 1,10 g
(55%) de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-4-O-terc-butil-L-aspartato
de terc-butilo en forma de un sólido blanco, p.f.
119-120ºC.
De acuerdo con el ejemplo 48, se hidrogenaron
0,389 g de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-4-O-terc-butil-L-aspartato
de terc-butilo usando 0,07 g de Pd(C) al 10% en 40 ml
de MeOH. Esto produjo 0,29 g (98%) de
5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-L-aspartato
de di-terc-butilo en forma de un aceite transparente viscoso.
Se preparó una muestra de la sal Hcl correspondiente para el
análisis por ^{1}H-RMN tratando 10 mg del
producto con exceso de HCl etéreo 1 N y concentración a
sequedad.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,91 (d, 1H, J = 7,8, NH),
8,31 (s a, 3H, NH_{3}^{+}), 4,52 (m, 1H, metina), 3,83 (m, 1H,
metina), 2,63 (d, 2H, J = 6,1, asp CH_{2}), 2,36 (m, 2H, glu
4-CH_{2}), 1,94 (m, 2H, glu
3-CH_{2}), 1,38 (s, 27H,
t-Bu).
De acuerdo con el ejemplo 49, se acoplaron 0,30 g
de hemiclorhidrato del ácido
4-(N-(2,4-diamino-6-pteridinilme-
til)-N-metilamino)benzoico dihidrato (Aldrich) con 0,34 g de 5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-L-aspartato de di-terc-butilo usando 0,36 ml de DECP (Aldrich) y 0,39 ml de Et_{3}N en 25 ml de DMF. El producto bruto se sometió a cromatografía ultrarrápida dos veces (SiO_{2} 7:7:1 de CH_{2}Cl_{2}:acetona:MeOH; y SiO_{2}, 96:4 \rightarrow95:5 de CH_{2}Cl_{2}:MeOH) para producir 0,213 g (37%) de 5-O-terc-butil-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-L-aspartato de di-terc-butilo en forma de un polvo amarillo, p.f. 130-135ºC.
til)-N-metilamino)benzoico dihidrato (Aldrich) con 0,34 g de 5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-L-aspartato de di-terc-butilo usando 0,36 ml de DECP (Aldrich) y 0,39 ml de Et_{3}N en 25 ml de DMF. El producto bruto se sometió a cromatografía ultrarrápida dos veces (SiO_{2} 7:7:1 de CH_{2}Cl_{2}:acetona:MeOH; y SiO_{2}, 96:4 \rightarrow95:5 de CH_{2}Cl_{2}:MeOH) para producir 0,213 g (37%) de 5-O-terc-butil-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-L-aspartato de di-terc-butilo en forma de un polvo amarillo, p.f. 130-135ºC.
Para el Procedimiento A para preparar este
compuesto, véase el Ejemplo 33.
De acuerdo con el ejemplo 50, se trataron 0,307 g
de
5-O-terc-butil-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-L-aspartato
de di-terc-butilo con HCl gaseoso en 40 ml de
CH_{3}NO_{2} durante 1,5 h. La mezcla de reacción se concentró
hasta 5 ml y se mezcló con 50 ml de éter. El sólido resultante se
recogió por filtración y se secó al vacío. El producto se disolvió
en 25 ml de agua, se filtró y se liofilizó para producir 0,246 g
(89%) del ácido
N-4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)-benzoil)-L-glutam-1-il-L-aspártico
en forma de un polvo amarillo-naranja, p.f. 160ºC
(desc.).
HPLC: un pico sobre C18, k' = 0,70,
85:15:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA, caudal = 1 ml/min.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,12 (s a, COOH), 9,31 (s,
1H, NH_{2}), 9,08 (s, 1H, NH_{2}), 8,72 (s, 1H, pteridinil
7-CH), 8,68 (s a, 1H, NH_{2}), 8,22 (d, 1H, J =
8,0, amida NH), 8,09 (d, 1H, J = 7,9, amida NH), 7,79 (s a, 1H,
NH_{2}), 7,75 (d, 2H, J = 8,9, CH aromático), 6,82 (d, 2H, J 8,9,
CH aromático), 4,87 (s, 2H, pteridinil-CH_{2}),
4,59-4,40 (m, 2H, metinas), 3,24 (s, 3H,
N-CH_{3}), 2,75-2,52 (m, 2H, asp
CH_{2}), 2,27 (t, 2H, J = 7,8, glu 4-CH_{2}),
2,10-1,78 (m, 2H, glu
3-CH_{2}).
Análisis Elemental: Calc. para
C_{24}H_{27}N_{9}O_{8}\cdot2 Hcl\cdot1,3 H_{2}O (PM
665,87), C, 43,29; H, 4,78; N, 18,93, Cl 10,65. Encontrado: C,
43,42; H, 4,90; N, 18,83; Cl, 10,46.
Espectro de Masas: (FAB) 570 (M +
H)^{+}.
Espectro UV: (tampón pH 7) \lambda_{max}
(\varepsilon) 258,7 (21900), 306,4 (23800), 372,2 (7250).
\lambda_{min} (\varepsilon) 240,1 (13400),
272,4 (15200), 345,0 (5740).
De acuerdo con el ejemplo 9, se acoplaron 0,88 g
de clorhidrato di-t-butil éster del
ácido L-glutámico (Sigma) con 1,00 g de
\gamma-t-butil éster del ácido
N-Cbz-L-glutámico (Sigma)
usando 0,60 g de EDC (Aldrich) y 0,33 ml de N-morfolina. El
producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre gel
de sílice (75:25 de hexano:EtOAc) para producir 1,49 g (87%) de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-5-O-terc-butil-L-glutamato
de terc-butilo en forma de un aceite transparente
viscoso.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,21 (d, 1H, J = 7,6, NH),
7,42 (d, 1H, J = 8,2, NH), 7,33 (m, 5H, CH aromático), 5,01 (m, 2H,
PhCH_{2}O), 4,17-3,96 (m, 2H, metina), 2,24 (m,
4H, glu 4-CH_{2}), 1,96-1,64 (m,
4H, glu 3-CH_{2}), 1,37 (s, 27H,
t-Bu).
De acuerdo con el ejemplo 48, se hidrogenaron
0,60 g de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-5-O-terc-butil-L-glutamato
de terc-butilo usando 0,10 g de Pd(C) al 10% en 45 ml
de MeOH. Esto produjo 0,45 g (98%) de
5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-L-glutamato
de di-terc-butilo en forma de un aceite transparente viscoso.
Se preparó una muestra de la sal Hcl correspondiente para el
análisis por ^{1}H-RMN tratando 10 mg del producto
con un exceso de HCl etéreo 1 N y concentración a sequedad.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,86 (d, 1H, J = 7,3, NH),
8,31 (s a, 3H, NH_{3}^{+}), 4,21 (m, 1H, metina), 3,87 (m, 1H,
metina), 2,35 (m, 4H, glu 4-CH_{2}),
2,07-1,66 (m, 4H, glu 3-CH_{2}),
1,39 (s, 27H, t-Bu).
De acuerdo con el ejemplo 49, se acoplaron 0,30 g
de hemiclorhidrato del ácido
4-(N-(2,4-diamino-6-pteridinilme-
til)-N-metilamino)benzoico dihidrato (Aldrich) con 0,386 g de 5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-L-glutamato de di-terc-butilo usando 0,36 ml de DECP (Aldrich) y 0,39 ml de Et_{3}N en 25 ml de DMF. El producto bruto se sometió a cromatografía ultrarrápida sobre 150 g de gel de sílice (7:7:1 de CH_{2}Cl_{2}:acetona:MeOH) para producir 0,432 g (73%) de 5-O-terc-butil-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-L-glutamato de di-terc-butilo en forma de un polvo amarillo, p.f. 130-145ºC.
til)-N-metilamino)benzoico dihidrato (Aldrich) con 0,386 g de 5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-L-glutamato de di-terc-butilo usando 0,36 ml de DECP (Aldrich) y 0,39 ml de Et_{3}N en 25 ml de DMF. El producto bruto se sometió a cromatografía ultrarrápida sobre 150 g de gel de sílice (7:7:1 de CH_{2}Cl_{2}:acetona:MeOH) para producir 0,432 g (73%) de 5-O-terc-butil-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-L-glutamato de di-terc-butilo en forma de un polvo amarillo, p.f. 130-145ºC.
Para el Procedimiento A para preparar este
compuesto, véase el Ejemplo 39.
De acuerdo con el ejemplo 50, se trataron 0,382 g
de
5-O-terc-butil-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-L-glutamato
de di-terc-butilo con HCl gaseoso en 50 ml de
CH_{3}NO_{2} durante 1 h. La mezcla de reacción se concentró
hasta 10 ml y se mezcló con 50 ml de éter. El sólido resultante se
recogió por filtración y se secó al vacío. El producto se disolvió
en 25 ml de agua, se filtró y se liofilizó para producir 0,265 g
(76%) del ácido
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-L-glutámico
en forma de un polvo amarillo-naranja, p.f. 155ºC
(desc.).
HPLC: un pico sobre C18, k' = 0,88,
85:15:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA, caudal = 1 ml/min.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,18 (s a, COOH), 9,29 (s,
1H, NH_{2}), 9,07 (s, 1H, NH_{2}), 8,72 (s, 1H, pteridinil
7-CH), 8,69 (s a, 1H, NH_{2}), 8,19 (d, 1H, J =
7,7, amida NH), 8,09 (d, 1H, J = 7,9, amida NH), 7,87 (s a, 1H,
NH_{2}), 7,74 (d, 2H, J = 8,9, CH aromático), 6,81 (d, 2H, J =
8,9, CH aromático), 4,87 (s, 2H,
pteridinil-CH_{2}), 4,42 (m, 1H, metina), 4,19
(m, 1H, metina), 3,24 (s, 3H, N-CH_{3}), 2,28 (m,
4H, glu 4-CH_{2}), 2,07-1,71 (m,
4H, glu 3-CH_{2})
Análisis Elemental: Calc. para
C_{25}H_{29}N_{9}O_{8}\cdot1,9 HCl\cdot2 H_{2}O (PM
688,87), C, 43,59; H, 5,11; N, 18,30, Cl 9,78. Encontrado: C, 43,72;
H, 5,07; N, 18,16; Cl, 9,97.
Espectro de Masas: (FAB) 584 (M +
H)^{+}.
Espectro UV: (tampón pH 7) \lambda_{max}
(\varepsilon) 258,8 (23700), 306,2 (25600), 371,9 (7830).
\lambda_{min} (\varepsilon) 240,4 (14300),
272,9 (16600), 344,6 (6150).
Para el Procedimiento A para preparar este
compuesto, véase el Ejemplo 97.
De acuerdo con el ejemplo 50, se trataron 3,51 g
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-terc-butil-L-fenilalaninato
de terc-butilo con HCl gaseoso en 150 ml de CH_{3}NO_{2}
durante 1 h. La mezcla de reacción se concentró al vacío hasta una
suspensión y se mezcló con 100 ml de éter. El sólido se recogió por
filtración al vacío y se disolvió en 150 ml de 6:4 de MeCN:H_{2}O.
La solución se sometió a evaporación rotatoria para el retirar el
MeCN y la suspensión resultante se congeló y se liofilizó para
producir 3,167 g (93%)
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-terc-butil-L-fenilalanina
en forma de un polvo amarillo-naranja, p.f. 165ºC
(desc.).
HPLC: un pico sobre C18, k' = 2,30,
70:30:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA, caudal = 1 ml/min.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,35-12,95
(s a, COOH), 9,30 (s, 1H, NH_{2}), 9,07 (s, 1H, NH_{2}), 8,71
(s, 1H, pteridinil 7-CH), 8,68 (s a, 1H, NH_{2}),
8,14 (d, 1H, J = 7,6, amida NH), 8,02 (d, 1H, J = 7,8, amida NH),
7,89 (s a, 1H, NH_{2}), 7,71 (d, 2H, J = 8,9, CH aromático), 7,21
(s, 1H, CH aromático), 7,18-7,05 (m, 2H, CH
aromático), 6,98 (d, 1H, J = 7,4, CH aromático), 6,79 (d, 2H, J =
8,9, CH aromático), 4,85 (s, 2H, pteridinil CH_{2}), 4,39 (m, 2H,
metinas), 3,23 (s, 3H, N-CH_{3}), 3,03 (m, 1H,
ArCH_{2}), 2,90 (m, 1H, ArCH_{2}), 2,20 (t, 2H, J = 7,6, glu
4-CH_{2}), 2,01-1,76 (m, 2H, glu
3-CH_{2}), 1,19 (s, 9H, t-Bu)
Análisis Elemental: Calc. para
C_{33}H_{39}N_{9}O_{6}\cdot1,5HCl\cdot1,8 H_{2}O (PM
744,85), C, 53,21; H, 5,97; N, 16,92, Cl 7,14. Encontrado: C, 53,20;
H, 5,97; N, 168,96; Cl, 7,20.
Espectro de Masas: (Nebulización Iónica)
658 (M + H)^{+}.
Espectro UV: (tampón pH 7) \lambda_{max}
(\varepsilon) 259,5 (24400), 308,0 (24400), 371,5 (7410).
\lambda_{min} (\varepsilon) 241,4 (14600),
274,2 (16200), 345,1 (5680).
Un matraz de 50 ml de 3 bocas seco, equipado con
un agitador magnético y una entrada de nitrógeno, se cargó con
0,150 g del ácido
4-(((1,2-dihidro-3-metil-1-
oxobenzo(f)quinazolin-9-il)metil)amino)-2-fluorobenzoico,
0,198 g de
5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-fenilalaninato
de terc-butilo y 7 ml de DMF anhidra. La mezcla se enfrió a
0ºC y se trató con 0,058 ml de Et_{3}N seguido de 0,063 ml de
DECP. El material de partida sólido se disolvió rápidamente para dar
una solución transparente. La solución se dejó calentar a TA y se
agitó a TA en una atmósfera de nitrógeno. Después de 3 h, la tlc
(SiO_{2}, 95:5 de CH_{2}Cl_{2}:MeOH) indicó un nuevo
componente mayoritario a R_{f} = 0,41 y componentes minoritarios
a R_{f} = 0,38 y 0,06. La solución se concentró al vacío a
sequedad y el residuo se disolvió en 70 ml de CHCl_{3}. La
solución de CHCl_{3} se lavó con NaHCO_{3} acuoso al 5% (3 x 60
ml), se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y se concentró para dar
un vidrio amarillo. El producto bruto se purificó por cromatografía
ultrarrápida sobre gel de sílice (95:5 \rightarrow 93:7
CH_{2}Cl_{2}:MeOH) para producir 0,258 g (80%) de
5-O-terc-butil-N-(4-(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(f)quinazolin-9-il)metil)amino)-2-fluorobenzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-fenilalaninato
de terc-butilo en forma de un vidrio transparente.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 12,54 (s, 1H,
benzoquinazolina NH), 9,86 (s, 1H, CH aromático), 8,39 (d, 1H, J =
7,6, amida NH), 8,23 (d, 1H, J = 9,0, CH aromático), 8,02 (d, 1H, J
= 8,4, CH aromático), 7,68-7,41 (m, 4H, CH
aromático, amida NH), 7,35 (m, 1H, 4-aminobenzoil
NH), 7,21-6,97 (m, 4H, CH aromático), 6,56 (d, 1H, J
= 8,8, CH aromático), 6,41 (d, 1H, J = 15,0, CH aromático),
4,67-4,30 (m, 4H, benzoquinazolina
9-CH_{2}, metinas), 3,06-2,77 (m,
3H, ArCH_{2}, ciclopentil metina), 2,43 (s, 3H, CH_{3}), 2,19
(m, 2H, glu 4-CH_{2}), 2,00-1,38
(m, 10H, glu 3-CH_{2}, ciclopentil CH_{2}), 1,35
(s, 9H, t-Bu), 1,32 (s, 9H,
t-Bu).
De acuerdo con el ejemplo 50, se trataron 0,25 g
de
5-O-terc-butil-N-(4-(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(f)quinazolin-9-il)metil)amino)-2-fluorobenzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-fenilalaninato
de terc-butilo con HCl gaseoso en 40 ml de CH_{3}NO_{2}
durante 1 h. La mezcla de reacción se concentró al vacío para dar un
residuo amarillo. El análisis de este material por HPLC (C18,
65:35:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA) indicó un componente mayoritario a
k' = 2,82 y componentes minoritarios a k' = 3,33, 1,53 y 0,83. El
producto bruto se sometió a HPLC de fase inversa
semi-preparativa (C18, 65:35:0,1 de
H_{2}O:MeCN:TFA). Las fracciones que contenían el producto puro
(según se determinó por la HPLC analítica) se combinaron y se
concentraron a sequedad. El residuo se mezcló con 20 ml de agua y
se trató con suficiente NaOH acuoso 1 N para dar una solución
completa. La solución se filtró y se acidificó a pH 3,0 por la
adición de HCl acuoso 1 N. Se produjo un precipitado que se separó
por centrifugación, se lavó con cuatro ciclos de suspensión
acuosa-centrifugación-decantación, y
se liofilizó para producir 0,141 g (62%) de
N-(4-(1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(f)quinazolin-9-il)metil)amino)-2-fluorobenzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-fenilalanina
en forma de un polvo blanco esponjoso, p.f. >200ºC.
HPLC: un pico sobre C18, k' = 2,77,
65:55:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA, caudal = 1 ml/min.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 12,90-11,80
(m a, COOH, benzoquinazolina NH), 9,82 (s, 1H, CH aromático), 8,27
(d, 1H, J = 7,9, amida NH), 8,19 (d, 1H, J = 8,7, CH aromático),7,99
(d, 1H, J = 8,4, CH aromático), 7,58 (m, 2H, CH aromático), 7,45 (m,
2H, CH aromático, amida NH), 7,31 (m, 1H,
4-aminobenzoil NH), 7,05 (m, 2H, CH aromático), 6,97
(d, 2H, J = 7,9, CH aromático), 6,51 (d, 1H, J = 8,7, CH
aromático), 6,37 (d, 1H, J = 15,2, CH aromático), 4,55 (d, 2H, J =
5,2, benzoquinazolina 9-CH_{2}), 4,43 (m, 2H,
metinas), 3,02 (m, 1H, ArCH_{2}), 2,82 (m, 2H, ArCH_{2},
ciclopentil metina), 2,41 (s, 3H, CH_{3}), 2,16 (t, 2H, J = 7,7,
glu 4-CH_{2}), 1,98-1,71 (m, 4H,
glu 3-CH_{2}, ciclopentil CH_{2}),
1,69-1,31 (m, 6H, ciclopentil CH_{2}).
Análisis Elemental: Calc. para
C_{40}H_{40}N_{5}O_{7}F\cdot0,5H_{2}O (PM 730,79): C,
65,74; H, 5,65; N, 9,58. Encontrado: C, 65,76; H, 5,68; N, 9,57.
Espectro de Masas: (FAB) 722 (M +
H)^{+}.
Espectro UV: (tampón pH 7) \lambda_{max}
(\varepsilon) 265,9 (47900), 299,6 (27300), 348,4 (5710).
\lambda_{min} (\varepsilon) 240,6 (19900),
284,5 (24900), 340,0 (3450) sh (e) 332,2 (6780).
Un matraz de 50 ml de 3 bocas, equipado con un
agitador magnético y una entrada de nitrógeno, se cargó con 0,097 g
de ácido
4-(((2-amino-3,4-dihidro-4-oxo-6-quinazolinil)metil)(2-propinil)amino)benzoico
(Jones, T.R. et al., J. Med. Chem. 1986, 29,
1114; Nair, M.G., et al., J. Med. Chem., 1986,
29, 1754; Ghazala, M., et al., J. Med. Chem.,
1986, 29, 1263; Acharya, S.P., et al., J.
Heterocyclic Chem., 1975, 12, 1283), 0,142 g de
5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-fenilalaninato
de terc-butilo, 0,044 g de
3-hidroxi-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-ona
(Aldrich) y 7 ml de DMF anhidra. La mezcla se trató con 0,057 g de
EDC y se agitó a TA en una atmósfera de nitrógeno. El material de
partida sólido se disolvió lentamente para dar una solución
transparente. Después de 3 días, la solución se concentró al vacío
a sequedad y el residuo se sometió a cromatografía ultrarrápida
sobre gel de sílice (98:2 \rightarrow 95:5 de
CH_{2}Cl_{2}:MeOH) para producir 0,142 g (65%) de
N-(4-(((2-amino-3,4-dihidro-4-oxo-6-quinazolinil)metil)(2-propinil)amino)benzoil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-fenilalaninato
de terc-butilo en forma de un sólido blanco, p.f. 115ºC
(desc.).
De acuerdo con el ejemplo 50, se trataron 0,114 g
de
N-(4-(((2-amino-3,4-dihidro-4-oxo-6-quinazolinil)metil)(2-propinil)amino)benzoil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-fenilalaninato
de terc-butilo con HCl gaseoso en CH_{3}NO_{2} durante 2
h. La mezcla de reacción se concentró a sequedad y el residuo se
suspendió en 50 ml de éter. El sólido resultante se recogió por
filtración y se secó al vacío. El producto bruto se purificó por
HPLC de fase inversa semipreparativa (C18, 68:32:0,1 \rightarrow
60:40:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA). Las fracciones que contenían el
producto puro (según se determinó por la HPLC analítica) se
combinaron y se concentraron a sequedad. El residuo se suspendió en
agua y se liofilizó para producir 0,053 g (45%) de
N-(4-(((2-amino-3,4-dihidro-4-oxo-6-quinazolinil)metil)(2-propinil)amino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-fenilalanina
en forma de un sólido blanco esponjoso, p.f. 158ºC (desc.).
HPLC: un pico sobre C18, k' = 1,27
(98,8%), k' = 0,50 (1,2%); 63:38:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA, caudal =
1 ml/min.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 12,90-11,80
(m a, COOH), 8,07 (d, 1H, J = 7,9, amida NH), 8,03 (d, 1H, J = 7,9,
amida NH), 7,87 (s, 1H, CH aromático), 7,71 (d, 2H, J = 8,7, CH
aromático), 7,62 (d, 1H, J = 8,6, CH aromático),
7,57-7,24 (s a, 2H, NH_{2}), 7,31 (d, 1H, J = 8,6,
CH aromático), 7,13-6,95 (m, 4H, CH aromático), 6,82
(d, 2H, J = 8,8, CH aromático), 4,71 (s, 2H,
quinazolinil-CH_{2}), 4,41 (m, 2H, metinas), 4,30
(s, 2H, propargil CH_{2}), 3,19 (s, 1H, propargil CH),
3,10-2,77 (m, 3H, ArCH_{2}, ciclopentil metina),
2,23 (t, 2H, J = 7,6, glu 4-CH_{2}),
2,02-1,76 (m, 4H, glu 3-CH_{2},
ciclopentil CH_{2}), 1,75-1,38 (m, 6H, ciclopentil
CH_{2}).
^{19}F-RMN: (282 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 1,53 (con respecto a un
patrón externo de TFA).
Análisis Elemental: Calc. para
C_{38}H_{40}N_{6}O_{7}\cdotTFA\cdot2,2H_{2}O (PM
846,43): C, 56,76; H, 5,41; N, 9,93. Encontrado: C, 56,79; H, 5,42;
N, 9,95.
Espectro de Masas: (FAB) 693 (M +
H)^{+}.
Espectro UV: (tampón pH 7) \lambda_{max}
(\varepsilon) 227,2 (48400), 306,4 (24500).
\lambda_{min} (\varepsilon) 213,5 (40200),
252,2 (11500).
Un matraz de fondo redondo de 500 ml equipado con
un agitador magnético y una entrada de nitrógeno, se cargó con 10,0
g de \gamma-etil éster del ácido
N-benciloxicarbonil-L-glutámico,
7,43 g de clorhidrato del éster etílico de
L-fenilalanina (Aldrich), 100 ml de
CH_{2}Cl_{2} y 4,51 ml de Et_{3}N. La solución se enfrió a 0ºC
y se trató con una solución de 6,67 g de DCC (Fluka) en 25 ml de
CH_{2}Cl_{2}. La solución se agitó a 0ºC durante 1 h y después
se dejó calentar a TA. Después de 3 h más, la mezcla se filtró para
retirar la diciclohexilurea. El filtrado se lavó con ácido cítrico
acuoso al 10% (3 x 50 ml) y NaHCO_{3} acuoso saturado (3 x 50
ml), seguido de una porción de 60 ml de agua. La solución se secó
sobre Na_{2}SO_{4} anhidro, se concentró hasta 30 ml y se
trituró con la adición de 50 ml de éter seguido de 150 ml de
pentano. El precipitado resultante se enfrió por filtración y se
secó la vacío para producir 12,9 g (82%) de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-etil-L-glutam-1-il-L-fenilalaninato
de etilo en forma de un sólido blanco cristalino, p.f.
85-87ºC.
De acuerdo con el ejemplo 10, se hidrogenaron
13,08 g de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-etil-L-glutam-1-il-L-fenilalaninato
de etilo en 300 ml de EtOH usando 2,43 g de Pd(C) al 10% y 2
ml de cloruro de acetilo para producir 9,84 g (94%) de
5-O-etil-L-glutam-1-il-L-fenilalaninato
de etilo\cdotHCl en forma de una espuma blanca.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 9,08 (d, 1H, J = 7,0, NH),
7,90-7,40 (s a, 3H, NH_{3}^{+}), 7,29 (m, 5H, CH
aromático), 4,50 (m, 1H, metina), 4,07 (m, 4H, etil CH_{2}), 3,80
(m, 1H, metina), 3,04 (m, 2H, ArCH_{2}), 2,46 (m, 2H, glu
4-CH_{2}), 1,99 (m, 2H, glu CH_{2}), 1,20 (t,
3H, J = 7,1, etil CH_{3}), 1,13 (t, 3H, J = 7,1, etil
CH_{3}).
Un matraz de fondo redondo de 1 l equipado con un
agitador magnético, un condensador, una entrada de nitrógeno y un
purgador Dean Stark se cargó con 7,28 g de
5-O-etil-L-glutam-1-il-L-fenilalaninato
de etilo\cdotHCl, 3,68 g de anhídrido
4-nitroftálico (American Tokyo Kasei, Portland, OR
97203), 300 ml de tolueno y 2,43 g de diisopropiletilamina
(Aldrich). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 2 h,
se dejó enfriar a TA y se agitó a TA durante una noche en una
atmósfera de nitrógeno. El tolueno se retiró por evaporación
rotatoria y el residuo se disolvió en 400 ml de CH_{2}Cl_{2}.
La solución se lavó con agua (2 x 200 ml), NaHCO_{3} acuoso al 5%
(2 x 250 ml) y se secó sobre MgSO_{4} anhidro. El agente de secado
se retiró por filtración y el filtrado se concentró hasta 100 ml. El
concentrado se mezcló con exceso de éter para inducir la
precipitación. El precipitado se recogió por filtración y se secó al
vacío para producir 6,72 g (67%) de
N((S)-4-(etoxicarbonil)-2-(4-nitroftalimido)butanoil)-L-fenilalaninato
de etilo en forma de un sólido blanco.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,65 (m, 2H, CH aromático,
NH), 8,49 (s, 1H, CH aromático), 8,13 (d, 1H, J = 8,6, CH aromático,
CH), 7,27-7,06 (m, 5H, CH aromático), 4,70 (m, 1H,
metina), 4,39 (m, 1H, metina), 4,04 (q, 2H, J = 7,1, etil CH_{2}),
3,93 (q, 2H, J = 7,1, etil CH_{2}), 2,94 (dd; 1H; J = 13,7, 5,8;
ArCH_{2}), 2,82 (dd; 1H; J = 13,6, 9,4; ArCH_{2}), 2,34 (m, 3H,
glu 4-CH_{2}, glu 3-CH_{2}),
2,18 (m, 1H, glu 3-CH_{2}), 1,11 (t, 6H, J = 7,1,
etil CH_{3}).
A un recipiente Parr de 300 ml se le añadieron
1,17 g de Pd(C) al 10% y 20 ml de EtOAC en una cantidad
abundante de nitrógeno. A esta mezcla se le añadió una solución de
6,72 g de
N-((S)-4-(etoxicarbonil)-2-(4-nitroftalimido)butanoil)-L-fenilalaninato
de etilo en 200 ml de EtOAc. La mezcla se desoxigenó burbujeando
nitrógeno a su través y después se hidrogenó a 45 psi durante 1 h.
El recipiente se purgó con nitrógeno y el catalizador se retiró por
filtración a través de celite. El filtrado se concentró al vacío
para dar un residuo que se purificó por cromatografía ultrarrápida
sobre gel de sílice (1:1 \rightarrow 3:7 de hexano:EtOAc). Esto
produjo 5,66 g (88%) de
N-((S)-2-(4-aminoftalimido)-4-(etoxicarbonil)butanoil)-L-fenilalaninato
en forma de un sólido amarillo brillante.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,50 (d, 1H, J = 7,4, NH),
7,48 (d, 1H, J = 8,2, CH aromático), 7,26-7,08 (m,
5H, CH aromático), 6,92 (s, 1H, CH aromático), 6,82 (dd; 1H; J =
8,3, 1,6: CH aromático), 6,47 (s, 2H, NH_{2}), 4,54 (m, 1H,
metina), 4,35 (q, 1H, J = 7,4, metina), 4,07-3,86
(m, 4H, etil CH_{2}), 2,92 (m, 2H, ArCH_{2}),
2,40-2,13 (m, 4H, glu 4-CH_{2},
glu 3-CH_{2}), 1,09 (m, 6H, etil CH_{3}).
Se preparó una amalgama de
cinc-mercurio agitando 19,8 g de polvo de cinc
(Mallinckrodt, Inc., Paris, KY, 40361) en 500 ml de HCl acuoso al
10% durante 10 min. La solución de HCl se decantó y el cinc se lavó
con agua hasta que se consiguió un pH neutro. Al cinc se le añadió
una solución caliente de 0,10 g de HgCl_{2} en agua y la mezcla
se agitó durante 10 min. La amalgama se recogió por filtración, se
lavó consecutivamente con agua, EtOH y éter y se secó al aire. La
amalgama seca se añadió a una solución de 3,0 g de
N-((S)-2-(4-aminoftalimido)-4-(etoxicarbonil)butanoil)-L-fenilalaninato
de etilo y 60 ml de HCl etéreo 1 N en 250 ml de EtOH que se mantuvo
a 0ºC en un baño de hielo. Después de agitar a 0ºC durante 25 min,
la tlc (SiO_{2}, 3:7 de hexano:EtOAc) indicó sólo una pequeña
cantidad de material de partida a R_{f} = 0,58 y dos nuevos
componentes a R_{f} = 0,52 y 0,63. La mezcla de reacción se filtró
para retirar la amalgama y el filtrado se concentró al vacío hasta
200 ml. La solución se hidrogenó a 50 psi (344,73 kPa) en presencia
de 0,54 g de Pd(C) al 10% durante 18 h. El catalizador se
retiró por filtración a través de celite y el filtrado se neutralizó
por la adición de un exceso de NaHCO_{3} y después se concentró a
sequedad. El residuo se repartió entre agua y CH_{2}Cl_{2} y
las capas se separaron. La solución de CH_{2}Cl_{2} se lavó con
agua (2 x 200 ml) y la capa acuosa se extrajo con EtOAc (200 ml).
Las soluciones de CH_{2}Cl_{2} y EtOAc se combinaron, se secaron
sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y se concentraron para dar 2,77 g de
una espuma de color amarillo pálido. El análisis de este material
por tlc (SiO_{2}, 9:1 de CH_{2}Cl_{2}:acetona) indicó cuatro
componentes mayoritarios a R_{f} = 0,50, 0,41, 0,29 y 0,20. Estos
materiales se separaron por cromatografía ultrarrápida sobre gel de
sílice (9:1 de CH_{2}Cl_{2}:acetona). El análisis de
^{1}H-RMN comparativo indicó que el material de
R_{f} = 0,29 era
N-((S)-2-(5-amino-1-oxo-2-isoindolinil)-4-(etoxicarbonil)butanoil)-L-fenilalaninato
de etilo. El producto se obtuvo en forma de una espuma de color
amarillo pálido, 0,646 g (22%).
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,48 (d, 1H, J = 7,7, NH),
7,32 (d, 1H, J = 8,2, CH aromático), 7,14 (s, 5H, CH aromático),
6,59 (m, 2H, CH aromático), 5,78 (s, 2H, NH_{2}), 4,73 (m, 1H,
metina), 4,43 (m, 1H, metina), 4,13-3,90 (m, 6H,
etil CH_{2}, isoindolinil metileno), 3,07-2,85 (m,
2H, ArCH_{2}), 2,26-2,01 (m, 3H, glu
4-CH_{2}, glu 3-CH_{2}), 1,88
(m, 1H, glu 3-CH_{2}), 1,12 (m, 6H, etil
CH_{3}).
De acuerdo con el ejemplo 5, se hicieron
reaccionar 1,04 g de
9-bromometil-3-metilbenzo(f)quinazolin-1(2H)-ona
con 1,65 g de
N-((S)-2-(5-amino-1-oxo-2-isoindolinil)-4-(etoxicarbonil)butanoil)-L-fenilalaninato
de etilo usando 0,84 g de NaHCO_{3}. La mezcla de reacción se
agitó a 100ºC durante 5 h, se enfrió a TA y se agitó a TA durante 18
h. El análisis por tlc (SiO_{2}, 4:1 de CH_{2}Cl_{2}:acetona)
indicó que la reacción estaba incompleta. Se añadieron 0,3 g más de
9-bromo-3-metilbenzo(f)quinazolin-1(2H)-ona
y la mezcla de reacción se agitó a 100ºC durante 4 h. La mezcla se
enfrió a TA y se filtró para retirar los sólidos. El producto bruto
se absorbió en 25 g de gel de sílice añadiendo gel de sílice al
filtrado, concentrándolo a sequedad y almacenándolo al vacío. La
mezcla del producto/gel de sílice se cargó en una columna (1000 g de
SiO_{2}) y se sometió a cromatografía ultrarrápida
(CH_{2}Cl_{2} \rightarrow 95:5 de CH_{2}Cl_{2}:MeOH) para
dar 0,30 g de producto puro. Las fracciones de cromatografía impura
se combinaron, se concentraron y se sometieron a cromatografía
ultrarrápida una segunda vez (98:2 \rightarrow 95:5 de
CH_{2}Cl_{2}:MeOH) para dar 0,26 g de producto puro. Esto
produjo un rendimiento total de 0,56 g (23%) de
N-((S)-2-(5-(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(f)quinazolin-9-il)metil)amino)-1-oxo-2-isoindolinil)-4-(etoxicarbonil)butanoil)-L-fenilalaninato
de etilo en forma de un sólido blanco, p.f. 140ºC (desc.).
A un matraz de 100 ml de 3 bocas, equipado con un
agitador magnético y una entrada de nitrógeno, se le añadieron 0,90
g de
N-((S)-2-(5-(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(f)quinazolin-9-il)metil)amino)-1-oxo-2-isoindolinil)-4-(etoxicarbonil)butanoil)-L-fenilalaninato
de etilo, 3 ml de EtOH y 10 ml de NaOH acuoso 0,2 N. La solución se
agitó a TA en una atmósfera de nitrógeno durante 2 h y se acidificó
a pH 3,0 por la adición de HCl 1 N. Se produjo un precipitado
blanco que se separó por centrifugación. El análisis de este
material por HPLC analítica (C18, 70:30:0,10 de H_{2}O:MeCN:TFA)
indicó un componente mayoritario k' = 1,93 (90%) y un componente
minoritario k' = 2,41. El producto bruto se purificó por HPCL de
fase inversa semi-preparativa (C18, 75:25:0,1 de
H_{2}O:MeCN:TFA). Las fracciones que contenían el producto puro
(k' = 1,93 por HPLC analítica usando las condiciones descritas
anteriormente) se combinaron y concentraron al vacío a sequedad. El
residuo se disolvió en 15 ml de NaOH 0,1 N y la solución se ajusto
a pH 3,0 por la adición de HCl 1 N. El precipitado resultante se
recogió por centrifugación, se lavó con cuatro ciclos de suspensión
acuosa-centrifugación- decantación y se liofilizó
para producir 0,035 g (40%) de
N-((S)-4-carboxi-2-(5-(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(f)quinazolin-9-il)metil)amino)-1-oxo-2-isoindolinil)butanoil)-L-fenilalanina
en forma de un polvo blanco, p.f. 180ºC.
HPLC: un pico sobre C18, k' = 2,3;
70:30:0,10 de H_{2}O:MeCN:TFA, caudal = 1 ml/min.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 12,83-12,56
(s a, 1H, COOH), 12,53 (s, 1H, benzoquinazolina NH),
12,20-11,90 (s a, 1H, COOH), 9,88 (s, 1H, CH
aromático), 8,19 (m, 2H, amida NH, CH aromático), 8,00 (d, 1H, J =
8,4, CH aromático), 7,66 (d, 1H, J = 7,4, CH aromático), 7,57 (d,
1H, J = 8,7, CH aromático), 7,33 (d, 1H, J = 8,6, CH aromático),
7,17 (m, 1h, isoindolinil 5-NH), 7,03 (d, 2H, J =
7,2, CH aromático), 6,90 (m, 3H, CH aromático), 6,72 (d, 1H, J =
7,8, CH aromático), 6,59 (s, 1H, CH aromático), 4,67 (m, 1H,
metina), 4,57 (d, 2H, J = 5,9, benzoquinazolina
9-CH_{2}), 4,38 (m, 1H, metina), 4,02 (d, 1H, J =
16,8, isoindolinil metileno), 3,76 (d, 1H, J = 16,9, isoindolinil
metileno), 3,00 (m, 1H, ArCH_{2}), 2,80 (m, 1H, ArCH_{2}), 2,41
(s, 3H, CH_{3}), 2,02 (m, 3H, glu 4-CH_{2}, glu
3-CH_{2}), 1,76 (m, 1H, glu
3-CH_{2}).
Análisis Elemental: Calc. para
C_{36}H_{33}N_{5}O_{7}\cdot2,3H_{2}O (PM 689,12): C,
62,75; H, 5,50; N, 10,16. Encontrado: C, 62,82; H, 5,50; N,
10,18.
Espectro de Masas: (FAB) 648 (M +
H)^{+}.
Espectro UV: (tampón pH 7) \lambda_{max}
(\varepsilon) 265,6 (38900), 301,7 (21100), 348,4 (4870).
\lambda_{min} (\varepsilon) 245,1 (19700),
284,1 (18300), 341,8 (3420), sh (\varepsilon) 331,7 (7570).
Un matraz de 250 ml de 3 bocas seco, equipado con
un agitador magnético y una entrada de nitrógeno, se cargó con 2,08
g de bromuro de
(2R,3S)-(-)-6-oxo-2,3-difenil-4-morfolinacarboxilato
de t-butilo (Aldrich), 1,43 g de bromuro de
3-(trimetilsilil)bencilo (Yamakawa, T., et al., J
Med. Chem., 1990, 33, 1430) y 45 ml de THF. La solución se
enfrió a -78ºC y se trató con 6,17 ml de
bis(trimetilsilil)amida sódica 1 M/THF (Aldrich)
mediante un jeringa a través de un tabique de caucho. La solución se
agitó a -78ºC durante 3,5 h y después se vertió en 150 ml de agua.
La mezcla resultante se extrajo con EtOAc (4 x 50 ml). Los
extractos de EtOAC combinados se lavaron con salmuera saturada (3 x
100 ml), se secaron sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y se
concentraron al vacío para dar un aceite amarillo claro. El material
bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice
(9:1 de hexano:EtOAc para producir 2,6 g (88%) de
(2R,3S,5S)-6-oxo-2,3-difenil-5-(3-(trimetilsilil)bencil)-4-morfolinacarboxilato
de terc-butilo en forma de un polvo blanco, p.f.
88-90ºC.
De acuerdo con el ejemplo 82, se trataron 2,47 g
de
(2R,3S,5S)-6-oxo-2,3-difenil-5-(3-(trimetilsilil)bencil)-4-morfolinacarboxilato
de terc-butilo con 4,1 ml de TFA en 40 ml de
CH_{2}Cl_{2} durante 3 h. La neutralización con 8 ml de
Et_{3}N y el tratamiento de la forma convencional dieron un aceite
viscoso. La purificación del material bruto y la cromatografía
ultrarrápida sobre 80 g de gel de sílice (85:15 de hexano:EtOAc)
produjeron 1,70 g (83%) de
(2R,3S,5S)-6-Oxo-2,3-difenil-5-(3-(trimetilsilil)bencil)-morfolina
en forma de un sólido blanco cristalino, p.f.
94-95ºC.
De acuerdo con el ejemplo 53, se hidrogenaron
1,58 g de
(2R,3S,5S)-6-Oxo-2,3-difenil-5-(3-(trimetilsilil)bencil)morfolina
en 70 ml de 1:1 de THF:EtOH usando 0,70 g de PdCl_{2}. El
análisis del producto por ^{1}H-RMN indicó la
desililación parcial del anillo de fenilo. La mezcla se sometió a
esterificación de acuerdo con el ejemplo 54 usando 25 ml de
isobutileno y 0,5 ml de H_{2}SO_{4} concentrado en 20 ml de
1,4-dioxano. El tratamiento de la forma
convencional produjo un aceite amarillo claro que, según mostró la
tlc (SiO_{2}, EtOAc), constaba de dos componentes a R_{f} =
0,53 y 0,47. El material de R_{f} = 0,53 se aisló por
cromatografía ultrarrápida dos veces sobre gel de sílice (EtOAc y
después 1:1 de hexano:EtOAc). Esto dio 0,161 g (15%) de
3-(trimetilsilil)-L-fenilalaninato
de terc-butilo en forma de un aceite transparente. Se preparó
una muestra de la sal HCl correspondiente para
^{1}H-RMN por tratamiento de 5 mg de producto con
un exceso de HCl etéreo 1 N y concentración a sequedad.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,53 (s a, 3H,
NH_{3}^{+}), 7,50-7,20 (m, 4H, CH aromático),
4,14 (m, 1H, metina), 3,21 (m, 1H, ArCH_{2}), 2,98 (m, 1H,
ArCH_{2}), 1,26 (s, 9H, t-Bu), 0,23 (s, 9H,
trimetilsililo).
A un matraz de 50 ml de 3 bocas equipado con un
agitador magnético y una entrada de nitrógeno, se le añadieron 0,161
g de
3-(trimetilsilil)-L-fenilalaninato
de terc-butilo, 0,194 g de \gamma-terc-butil éster
del ácido N-Cbz-L-glutámico
(Sigma) y 10 ml de CH_{2}Cl_{2}. La solución se enfrió a 0ºC y
se trató con 0,110 g de EDC. La mezcla de reacción se agitó a 0ºC
durante 1,5 h y después se dejó calentar a TA. Después de 16 h más
de agitación a TA, la solución se concentró al vacío a sequedad en
presencia de 5 g de gel de sílice. La mezcla resultante se aplicó a
una columna y el producto se aisló por cromatografía en columna
(SiO_{2}, 75:25 de hexano:EtOAc) para producir 0,320 g (95%) de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-(trimetilsilil)-L-fenilalaninato
de terc-butilo en forma de un vidrio viscoso
transparente.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,29 (d, 1H, J = 7,0, NH),
7,50-7,18 (m, 10H, CH aromático, NH), 5,02 (s, 2H,
PhCH_{2}O), 4,38 (m, 1H, metina), 4,07 (m, 1H, metina), 2,97 (d,
2H, J = 7,3, ArCH_{2}), 2,23 (t, 2H, J = 7,6, glu
4-CH_{2}), 1,96-1,60 (m, 2H, glu
3-CH_{2}), 1,40 (s, 9H, t-Bu),
1,31 (s, 9H, t-Bu), 0,24 (s, 9H,
trimetilsililo).
De acuerdo con el ejemplo 48, se hidrogenaron
0,315 g de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-(trimetilsilil)-L-fenilalaninato
de terc-butilo usando 0,051 g de Pd(C) al 10% en 35 ml
de MeOH. Esto produjo 0,24 g (98%) de
5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-(trimetilsilil)-L-fenilalaninato
de terc-butilo en forma de un aceite transparente viscoso. Se
preparó una muestra de la sal HCl correspondiente para análisis por
^{1}H-RMN por tratamiento de 5 mg del producto con
exceso de HCl etéreo 1 N y concentración a sequedad.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,99 (d, 1H, J = 7,2, NH),
8,28 (s a, 3H, NH_{3}^{+}), 7,47-7,24 (m, 4H, CH
aromático), 4,42 (m, 1H, metina), 3,86 (m, 1H, metina), 3,01 (d,
2H, J = 7,2, ArCH_{2}), 2,37 (m, 2H, glu
4-CH_{2}), 2,01 (m, 2H, glu
3-CH_{2}), 1,42 (s, 9H, t-Bu),
1,32 (s, 9H, t-Bu), 0,26 (s, 9H,
trimetilsililo).
De acuerdo con el ejemplo 49, se acoplaron 0,095
g de hemiclorhidrato del ácido
4-(N-(2,4-diamino-6-pteridinil-
metil)-N-metilamino)benzoico dihidrato (Aldrich) con 0,12 g de 5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-(trimetisilil)-L-fenilalaninato de terc-butilo usando 0,11 ml de DECP (Aldrich) y 0,12 ml de Et_{3}N en 11 ml de DMF. El producto bruto se sometió a cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (7:7:1 de CH_{2}Cl_{2}:acetona:MeOH) para producir 0,141 g (72%) de N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-(trimetilsilil)-L-fenilalaninato de terc-butilo en forma de un polvo amarillo, p.f. 118-125ºC.
metil)-N-metilamino)benzoico dihidrato (Aldrich) con 0,12 g de 5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-(trimetisilil)-L-fenilalaninato de terc-butilo usando 0,11 ml de DECP (Aldrich) y 0,12 ml de Et_{3}N en 11 ml de DMF. El producto bruto se sometió a cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (7:7:1 de CH_{2}Cl_{2}:acetona:MeOH) para producir 0,141 g (72%) de N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-(trimetilsilil)-L-fenilalaninato de terc-butilo en forma de un polvo amarillo, p.f. 118-125ºC.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,58 (s, 1H, pteridinil
7-CH), 8,23 (d, 1H, J = 7,5, amida NH), 8,00 (d, 1H,
J = 7,8, amida NH), 7,74 (d, 2H, J = 8,7, CH aromático), 7,70 (s a,
1H, NH_{2}), 7,48 (s a, 1H, NH_{2}), 7,33 (m, 2H, CH aromático),
7,22 (m, 2H, CH aromático), 6,83 (d, 2H, J = 8,8, CH aromático),
6,63 (s a, 2H, NH_{2}), 4,79 (s, 2H,
pteridinil-CH_{2}), 4,53-4,29 (m,
2H, metina), 3,23 (s, 3H, N-CH_{3}), 2,96 (d, 2H,
J = 7,0, ArCH_{2}), 2,23 (m, 2H, glu 4-CH_{2}),
2,04-1,77 (m, 2H, glu 3-CH_{2}),
1,38 (s, 9H, t-Bu), 1,28 (s, 9H,
t-Bu), 0,21 (s, 9H, trimetilsililo).
Un matraz de 100 ml de 3 bocas, equipado con un
agitador magnético y una entrada de nitrógeno, se cargó con 0,111 g
de
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-(trimetilsilil)-L-fenilalaninato
de terc-butilo y 25 ml de CH_{3}NO_{2}. La solución
resultante se trató con 5 ml de TFA y se agitó a TA. Después de 1 h,
la solución se concentró al vacío a sequedad. El residuo se
disolvió en 3 ml de CH_{3}NO_{2} y la solución se trató con 20
ml de éter etílico. Se precipitó un sólido amarillo que se recogió
por filtración y se secó al vacío. El producto se disolvió en 3 ml
de 1:1 de H_{2}O:CH_{3}CN y la solución se mezcló con 50 ml de
agua. Se produjo una suspensión que se congeló y se liofilizó para
producir 0,90 g (82%) de
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-(trimetilsilil)-L-fenilalanina
en forma de un polvo amarillo, p.f. 155ºC (desc.).
HPLC: un pico sobre C18, k' = 1,55,
65:35:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA, caudal = 1 ml/min.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,00-11,75
(s a, COOH), 8,64 (s, 1H, pteridinil 7-CH), 8,60 (s
a, 1H, NH_{2}), 8,39 (s a, 1H, NH_{2}), 8,11 (d, 1H, J = 7,7,
amida NH), 7,97 (d, 1H, J = 8,1, amida NH),
7,75-7,10 (m a, 2H, NH_{2}), 7,69 (d, 2H, J = 8,9,
CH aromático), 7,28 (m, 2H, CH aromático), 7,14 (m, 2H, CH
aromático), 6,79 (d, 2H, J = 8,9, CH aromático), 4,82 (s, 2H,
pteridinil-CH_{2}), 4,39 (m, 2H, metinas), 3,21
(s, 3H, N-CH_{3}), 3,02 (m, 1H, ArCH_{2}), 2,88
(m, 1H, ArCH_{2}), 2,20 (t, 2H, J = 7,8, glu
4-CH_{2}), 2,00-1,72 (m, 2H, glu
3-CH_{2}), 0,17 (s, 9H, trimetilsililo).
Análisis Elemental: Calc. para
C_{32}H_{39}N_{9}O_{6}Si\cdot0,8 TFA\cdot1,2 H_{2}O
(PM 786,64), C, 51,30; H, 5,41; N, 16,03. Encontrado: C, 51,24; H,
5,39; N, 16,07.
Espectro de Masas: (FAB) 674 (M +
NH_{4}^{+}).
Espectro UV: (tampón pH 7) \lambda_{max}
(\varepsilon) 259,5 (23500), 308,0 (24300), 373,2 (7210).
\lambda_{min} (\varepsilon) 240,7 (12700),
273,9 (15500), 345,0 (5210).
Una mezcla de 5,0 g de
3-yodo-L-tirosina
(Aldrich) y 2,5 ml de H_{2}SO_{4} concentrado en 85 ml de
1,4-dioxano se añadió a 30 ml de isobutileno líquido
(condensado a -78ºC) en un recipiente de presión de 300 ml. El
recipiente se tapó y los contenidos se agitaron a TA. Después de 3
días, el recipiente se enfrió en un baño de agua enfriada con
hielo, se abrió y la solución se vertió en una mezcla de 10 g de
NaHCO_{3} en 150 ml de agua. La mezcla resultante se sometió a
evaporación rotatoria para retirar el isobutileno y el dioxano. Se
produjo un sólido blanco que se recogió por filtración y se secó al
vacío, el análisis por tlc (SiO_{2}, 95:5 de CH_{2}Cl_{2}
indicó componentes mayoritarios y minoritarios a R_{f} = 0,52 y
0,60 respectivamente. El producto bruto se purificó por
cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (95:5 de
CH_{2}Cl_{2}:MeOH) para producir 3,4 g (58%) de
3-yodo-L-tirosinato
de terc-butilo en forma de un sólido blanco cristalino, p.f.
158-159ºC.
Un matraz de fondo redondo de 500 ml equipado con
una agitador magnético y una entrada de nitrógeno se cargó con 5,15
g de
3-yodo-L-tirosinato
de terc-butilo, 250 ml de 1,4-dioxano y 4,55
ml de Et_{3}N. La solución resultante se trató con 4,66 ml de
cloroformiato de bencilo por adición lenta. Después de 30 min, la
tlc (SiO_{2}, 8:2 de hexano:EtOAc) indicó que no quedaba material
de partida y un único nuevo componente a R_{f} = 0,50. La solución
se concentró al vacío y el residuo se mezcló con 200 ml de agua. La
mezcla se extrajo con EtOAc (4 x 50 ml). Los extractos de EtOAc
combinados se lavaron con NaHCO_{3} acuoso al 5%, se secaron sobre
MgSO_{4} anhidro y se concentraron al vacío. El producto bruto se
sometió a cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (8:2 de
hexano:EtOAc) para producir 7,49 g (84%) de
N-((benciloxi)carbonil)-4-O-((benciloxi)carbonil)-3-yodo-L-tirosinato
de terc-butilo en forma de una espuma transparente.
^{1}H RMN: (200 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 7,77 (m, 2H, NH, CH
aromático),7,53-7,21 (m, 12H, CH aromático), 5,32
(s, 2H, PhCH_{2}O), 5,20 (s, 2H, PhCH_{2}O), 4,12 (m, 1H,
metina), 2,92 (m, 2H, ArCH_{2}), 1,35 (s, 9H,
t-Bu).
Una bomba Parr de 300 ml se cargó con 5,13 g de
N-((benciloxi)carbonil)-4-O-((benciloxi)carbonil)-3-yodo-L-tirosinato
de terc-butilo, 120 ml de tolueno, 30 ml de ciclopenteno y
0,49 g de tri-orto-tolilfosfina. La
solución se desoxigenó burbujeando nitrógeno a su través durante 10
min y se trató con 0,182 g de Pd(OAc)_{2} y 1,24 ml
de Et_{3}N. La bomba se lavó abundantemente con nitrógeno, se
cerró y se calentó a 110ºC durante 48 h. El recipiente se enfrió a
TA, se purgó con nitrógeno y se abrió. La mezcla de reacción se
filtró para retirar los sólidos y el filtrado se concentró al vacío
a sequedad. El residuo se disolvió en 200 ml de EtOAc y la solución
se lavó con agua (4 x 100 ml), se secó sobre NaSO_{4} anhidro y se
concentró para dar un aceite pardo viscoso. El análisis por tlc
(SiO_{2}, 8:2 de hexano:EtOAc) indicó dos componentes mayoritarios
a R_{f} = 0,50 y 0,40. La mezcla bruta se sometió a cromatografía
ultrarrápida sobre gel de sílice (8:2 de hexano:EtOAc). Esto
produjo 2,0 g (43%) del material de R_{f} = 0,50 identificado como
la mezcla de bis(benciloxicarbonil)olefina por
^{1}H-RMN. Además, se obtuvieron 0,90 g (25%) del
material de R_{f} = 0,40 y se identificó como la mezcla de
N-benciloxicarbonil olefina resultante de la pérdida del
grupo O-benciloxicarbonilo. La mezcla de
bis(benciloxicarbonil)olefina (2,00 g) se sometió a
hidrogenación catalítica (45 psi (310,26 kPa)) en presencia de 0,35
g de Pd(C) al 10% en 70 ml de MeOH durante 18 h. El producto
bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida (SiO_{2}, EtOAc)
para dar 0,99 g (93%) del
3-ciclopentil-L-tirosinato
de terc-butilo en forma de un vidrio transparente. La mezcla
de N-benciloxicarbonil olefina (0,90 g) se hidrogenó de forma
similar y se purificó para producir 0,52 g (83%) de
3-ciclopentil-L-tirosinato
de terc-butilo.
^{1}H RMN: (200 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 9,05 (s, 1H, OH), 6,92 (d,
1H, J = 1,9, CH aromático), 6,80 (dd; 1H; J = 8,0, 2,0; CH
aromático), 6,66 (d, 1H, J = 8,0, CH aromático), 3,16 (m, 1H,
ciclopentil metina), 2,67 (d, 2H, J = 6,6, ArCH_{2}),
2,00-1,40 (m, 10H, ciclopentil CH_{2}, NH_{2}),
1,33 (s, 9H, t-Bu).
De acuerdo con el ejemplo 145, se acoplaron 0,99
g de
3-ciclopentil-L-tirosina
de terc-butilo con 1,09 g de \gamma-terc-butil éster
del ácido N-Cbz-L-glutámico
(Sigma) usando 0,65 g de EDC en 20 ml de CH_{2}Cl_{2} durante 4
h. El producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida
sobre gel de sílice (7:3 de hexano:EtOAc) para producir 1,8 g (89%)
de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-tirosinato
de terc-butilo en forma de una espuma incolora.
^{1}H RMN: (200 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 9,08 (s, 1H, OH), 8,17 (d,
1H, J = 7,5, NH), 7,36 (m, 6H, aromático, CH, NH), 6,96 (s, 1H, CH
aromático), 6,81 (d, 1H, J = 8,1, CH aromático), 6,67 (d, 1H, J =
8,1, CH aromático), 5,01 (m, 2H, PhCH_{2}O), 4,28 (m, 1H, metina),
4,08 (m, 1H, metina), 3,17 (m, 1H, ciclopentil metina), 2,82 (d, 2H,
J = 6,9, ArCH_{2}), 2,21 (t, 2H, J = 7,7, glu
4-CH_{2}), 1,99-1,46 (m, 10H, glu
3-CH_{2}, ciclopentil CH_{2}), 1,40 (s, 9H,
t-Bu), 1,33 (s, 9H, t-Bu).
De acuerdo con el ejemplo 48, se hidrogenaron
1,75 g de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-tirosinato
de terc-butilo usando 0,28 g de Pd(C) al 10% en 70 ml
de MeOH durante 3 h. El producto bruto se sometió a cromatografía
ultrarrápida sobre gel de sílice (95:5 de CH_{2}Cl_{2}:MeOH)
para producir 1,26 g (92%) de
5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-tirosinato
de terc-butilo en forma de un sólido blanco cristalino, p.f.
108-110ºC.
A un matraz de 100 ml de 3 bocas seco, equipado
con un agitador magnético y una entrada de nitrógeno, se le
añadieron 35 ml de DMF anhidra, 1,14 ml de Et_{3}N y 0,99 ml de
DECP. A la solución resultante se le añadieron 1,24 g de
hemiclorhidrato del ácido
4-(N-(2,4-diamino-6-pteridinilmetil)-N-metilamino)benzoico
dihidrato (Aldrich). El material de partida sólido se disolvió
lentamente para dar una solución amarilla. Después de 45 min, se
añadió una solución de 1,60 g de
5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-tirosinato
de terc-butilo en 8 ml de DMF. La solución se agitó a TA
durante 24 h y después se concentró al vacío a sequedad. El residuo
se disolvió en 150 ml de CHCl_{3}. La solución se lavó con
NH_{4}OH acuoso al 5% (3 x 70 ml), se secó sobre MgSO_{4}
anhidro y se concentró al vacío. El producto bruto se sometió a
cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice dos veces (7:7:1 de
CH_{2}Cl_{2}:acetona:MeOH, 93:7 de CH_{2}Cl_{2}:MeOH) para
producir 2,08 g (80%) de
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-tirosinato
de terc-butilo en forma de un polvo amarillo, p.f.
145-148ºC.
De acuerdo con el ejemplo 50, se trataron 2,04 g
de
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-tirosinato
de terc-butilo con HCl gaseoso en 65 ml de CH_{3}NO_{2}
durante 1 h. La suspensión amarilla se concentró hasta una
suspensión y se mezcló con 80 ml de éter etílico. El precipitado
resultante se recogió por filtración y se secó al vacío. El producto
se disolvió en 40 ml de 8:2 de H_{2}O:MeCN y la solución se
filtró y se concentró hasta 30 ml. Se obtuvo una solución amarilla
que se diluyó con 150 ml de agua, se congeló y se liofilizó para
dar 1,71 g (86%) de
N-(4-((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-tirosina
en forma de un polvo amarillo-naranja, p.f. 175ºC
(desc.).
HPLC: un pico sobre C18, k' = 2,98,
75:25:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA, caudal = 1 ml/min.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,12 (m, a, COOH), 9,30 (s,
1H, NH_{2}), 9,09 (s, 1H, NH_{2}), 8,71 (s, 1H, pteridinil
7-CH), 8,67 (s a, 1H, NH_{2}), 8,02 (m, 2H, amida
NH), 7,78 (s a, 1H, NH_{2}), 7,71 (d, 2H, J = 8,7, CH aromático),
6,91 (s, 1H, CH aromático), 6,79 (m, 3H, CH aromático), 6,61 (d, 1H,
J = 8,1, CH aromático), 4,86 (s, 2H,
pteridinil-CH_{2}), 4,42 (m, 1H, metina), 4,29 (m,
1H, metina), 3,24 (s, 3H, N-CH_{3}), 3,09 (m, 1H,
ciclopentil metina), 2,93-2,71 (m, 2H, ArCH_{2}),
2,23 (t, 2H, J = 7,8, glu 4-CH_{2}),
2,03-1,74 (m, 4H, glu 3-CH_{2},
ciclopentil CH_{2}), 1,73-1,37 (m, 6H, ciclopentil
CH_{2})
Análisis Elemental: Calc. para
C_{34}H_{39}N_{9}O_{7}\cdot1,6 Hcl\cdot1,7 H_{2}O (PM
774,70), C, 52,71; H, 5,72; N, 16,27; Cl, 7,32. Encontrado: C,
52,79; H, 5,71; N, 16,16, Cl, 7,35.
Espectro de Masas: (Nebulización Iónica)
686 (M + NH_{4}^{+}).
Espectro UV: (tampón pH 7) \lambda_{max}
(\varepsilon) 259,3 (24700), 307,8 (24800), 372,5 (7780).
\lambda_{min} (\varepsilon) 242,3 (15500),
272,9 (17800), 344,6 (6080). Sh (e) 221,3 (28900 = , 286,4
(21100).
A un matraz de 250 ml de 3 bocas seco, equipado
con un agitador magnético y una entrada de nitrógeno, se le
añadieron 5,0 g de
3-yodo-O-(terc-butildimetilsilil)bencil
alcohol y 40 ml de éter etílico anhidro. La solución se enfrió a
-78ºC en una atmósfera de nitrógeno y se trató con 23,2 ml de
sec-butillitio 1,3 M/ciclohexano (Aldrich) mediante
una jeringa. Después de 20 min, la solución se trató con 3,1 ml de
3-pentanona (Aldrich). La mezcla de reacción se
agitó -78ºC durante 1,5 h y después se dejó calentar a TA. Después
de 3 h a TA, la solución se inactivó por la adición de 5 ml de agua,
se agitó durante varios minutos y después se mezcló con 80 ml de
agua. Las dos fases se separaron y la solución acuosa se extrajo con
una porción adicional de 50 ml de éter. El extracto de éter se
combinó con la solución de éter original. Esta solución se lavó con
salmuera acuosa saturada (3 x 50 ml), se secó sobre MgSO_{4}
anhidro y se concentró para producir un líquido transparente. El
análisis por tlc (SiO_{2}, 9:1 de hexano:EtOAc) indicó un nuevo
componente mayoritario a R_{f} = 0,47. El producto bruto se
purificó por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (9:1 de
hexano:EtOAc) para producir 3,9 g (88%) de
3-(3-hidroxi-3-pentil)-O-(terc-butiltrimetilsilil)bencil
alcohol en forma de un líquido transparente.
^{1}H RMN: (200 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 7,33 (s, 1H, CH aromático),
7,26 (m, 2H, CH aromático), 7,12 (m, 1H, CH aromático), 4,72 (s, 2H,
ArCH_{2}O), 4,48 (s, 1H, OH), 1,72 (m, 4H, pentil CH_{2}), 0,90
(s, 9H, t-Bu), 0,64 (t, 6H, J = 7,5, pentil
CH_{3}), 0,06 (s, 6H, SiMe_{2}).
Un matraz de fondo redondo de 250 ml equipado con
una entrada de nitrógeno un agitador magnético se cargó con 3,9 g de
3-(3-hidroxi-3-pentil)-O-(terc-butiltrimetilsilil)bencil
alcohol y 25 ml de CH_{2}Cl_{2}. La solución se enfrió a 0ºC en
un baño de hielo y se trató con 15 ml de TFA seguido de 5 ml de
Et_{3}SiH (Aldrich). Después de 30 min a 0ºC el baño de hielo se
retiró y la solución se agitó a TA durante 18 h. La solución se
concentró hasta un líquido viscoso. Este material se disolvió en
éter (60 ml), se lavó con NaHCO_{3} acuoso al 5% (3 x 50 ml), se
secó sobre MgSO_{4} anhidro y se concentró al vacío. El líquido
resultante se disolvió en 10 ml de THF y se trató con 63 ml de
Bu_{4}NF 1 M/THF (Aldrich). Después de agitar a TA durante 18 h,
la solución se concentró y el jarabe resultante se mezcló con 80 ml
de agua. La mezcla se extrajo con éter (4 x 30 ml). Los extractos
combinados se lavaron con NaHCO_{3} acuoso al 5% (3 x 50 ml), se
secaron sobre MgSO_{4} anhidro y se concentraron para producir un
líquido amarillo claro. El análisis por tlc (SiO_{2}, 9:1 de
hexano:EtOAc) indicó un nuevo componente mayoritario a R_{f} =
0,30. El producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida
sobre gel de sílice (85:15 de hexano:EtOAc) para dar 1,84 g (82%) de
3-(3-pentil)bencil alcohol en forma de un
líquido transparente.
^{1}H RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 7,21 (t, 1H, J = 7,5, CH
aromático), 7,10 (m, 2H, CH aromático), 6,99 (d, 1H, J = 7,4, CH
aromático), 5,12 (t, 1H, J = 5,8, OH), 4,46 (d, 2H, J = 5,8,
ArCH_{2}O), 2,26 (m, 1H, pentil metina), 1,62 (m, 2H, pentil
CH_{2}), 1,49 (m, 2H, pentil CH_{2}), 0,69 (t, 6H, J = 7,4,
pentil CH_{3}).
De acuerdo con el ejemplo 17, se trataron 1,84 g
de 3-(3-pentil)bencil alcohol con 0,34 ml de
Pbr_{3} en 25 ml de CH_{2}Cl_{2} anhidro para producir 2,23 g
(90%) de bromuro de 3-(3-pentil)bencilo en
forma de un líquido transparente.
^{1}H RMN: (200 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 7,26 (m, 3H, CH aromático),
7,12 (m, 1H, CH aromático). 4,70 (s, 2H, ArCH_{2}), 2,33 (m, 1H,
pentil metina), 1,78-1,40 (m, 4H, pentil CH_{2}),
0,73 (t, 6H, J = 7,3, pentil CH_{3}).
De acuerdo con el ejemplo 142, se alquilaron 3,27
g de
(2R,3S)-(-)-6-oxo-2,3-difenil-4-morfolinacarboxilato
de terc-butilo con 2,23 g de bromuro de
3-(3-pentil)bencilo en 70 ml de THF anhidro
usando 9,71 ml de bis(trimetilsilil)amida sódica 1 M
en THF. El producto bruto se sometió a cromatografía ultrarrápida
sobre gel de sílice (9:1 de hexano:EtOAc) y después se recristalizó
en EtOH-agua para producir 2,26 g (48%) de
(2R,3S,5S)-6-oxo-2,3-difenil-5-(3-(3-pentil)bencil)-4-morfolina-carboxilato
de terc-butilo en forma de un sólido blanco cristalino, p.f.
143-144ºC.
A un matraz de fondo redondo de 250 ml equipado
con una agitador magnético y una entrada de nitrógeno se le
añadieron 2,19 g de
(2R,3S,5S)-6-oxo-2,3-difenil-5-(3-(3-pentil)bencil)-4-morfolinacarboxilato
de terc-butilo y 45 ml de CH_{2}Cl_{2} anhidro. La
solución se enfrió a 0ºC y se trató con 3,5 ml de TFA. La solución
se dejó calentar a TA y se agitó en una atmósfera de nitrógeno.
Después de 5 h, la tlc (SiO_{2}, 9:1 de hexano:EtOAc) indicó una
pequeña cantidad de material de partida y un nuevo componente
mayoritario a R_{f} = 0,42. La mezcla de reacción se vertió en 150
ml de NaHCO_{3} acuoso al 6% y se agitó durante varios minutos.
Las fases se separaron y la porción acuosa se extrajo con 3
porciones adicionales de 40 ml de CH_{2}Cl_{2}. Los extractos
se combinaron con la solución de CH_{2}Cl_{2} original y se
lavaron con NaHCO_{3} acuoso al 5% (3 x 60 ml). La solución se
secó sobre MgSO_{4} anhidro y se concentró para dar un sólido
castaño claro. Este material se purificó por cromatografía
ultrarrápida sobre gel de sílice (85:15 de hexano:EtOAc) para
producir 1,47 g (84%) de
(2R,3S,5S)-6-oxo-2,3-difenil-5-(3-(3-pentil)bencil)morfolina
en forma de un sólido blanco cristalino. Se preparó una muestra
analítica por recristalización en EtOH-H_{2}O.
Punto de fusión, 96-97ºC.
A un recipiente Parr de 300 ml se le añadieron
0,41 g de PdCl_{2}, 1,36 g de
(2R,3S,5S)-6-Oxo-2,3-difenil-5-(3-(3-pentil)bencil)morfolina,
50 ml de EtOH y 30 ml de THF. La mezcla se desoxigenó burbujeando
nitrógeno a su través durante 10 min y se hidrogenó a 45 psi (310,26
kPa) durante 18 h. El recipiente se purgó con nitrógeno, el
catalizador se retiró por filtración a través de celite y el
filtrado se concentró al vacío hasta un volumen de 15 ml. La
solución se enfrió en un baño de hielo y se trituró con la adición
de 50 ml de hexano. Se formó lentamente un precipitado fino. Después
del almacenamiento a 5ºC durante una noche, el sólido se recogió por
filtración y se secó al vacío para producir 0,65 g (72%) de
3-(3-pentil)-L-fenilalanina\cdotHCl
en forma de un polvo blanco, p.f. 170ºC (desc.).
De acuerdo con el ejemplo 54, se trataron 0,60 g
de
3-(3-pentil)-L-fenilalanina\cdotHCl
con 30 ml de isobutileno en 35 ml de 1,4-dioxano en
presencia de 0,5 ml de H_{2}SO_{4} conc. El tratamiento de la
forma convencional seguido de la acidificación con 2 ml de HCl
etéreo 1 N produjo 0,53 g (74%) de
3-(3-pentil)-L-fenilalaninato
de terc-butilo\cdotHCl en forma de un vidrio amarillo
claro.
^{1}H RMN: (200 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,63 (s a, 3H,
NH_{3}^{+}), 7,28 (t, 1H, J = 7,45, CH aromático), 7,10 (m, 3H,
CH aromático), 4,12 (m, 1H, metina), 3,23 (dd; 1H, J = 13,9, 5,1;
ArCH_{2}), 2,96 (dd; 1H; J = 13,9, 9,1; ArCH_{2}), 2,32 (m, 1H,
pentil metina), 1,78-1,40 (m, 4H, pentil CH_{2}),
1,28 (s, 9H, t-Bu), 0,74 (t, 6H, J = 7,3, pentil
CH_{3}).
De acuerdo con el ejemplo 145, se acoplaron 0,53
g de
3-(3-pentil)-L-fenilalaninato
de terc-butilo\cdotHCl con 0,55 g de
\gamma-terc-butil éster del ácido
N-Cbz-L-glutámico usando 0,33
g de EDC y 0,18 ml de N-metilmorfolina en 15 ml de
CH_{2}Cl_{2} anhidro. El producto bruto se purificó por
cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (8:2 de hexano:EtOAc)
para producir 0,80 g (81%) de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-(3-pentil)-L-fenilalaninato
de terc-butilo en forma de un sólido blanco cristalino, p.f.
50-53ºC.
De acuerdo con el ejemplo 48, se hidrogenaron
0,72 g de
N-(benciloxi)carbonil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-(3-pentil)-L-fenilalaninato
de terc-butilo usando 0,12 g de Pd(C) al 10% en 70 ml
de MeOH. Esto produjo 0,51 g (91%) de
5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-(3-pentil)-L-fenilalaninato
de terc-butilo en forma de un aceite transparente viscoso. Se
preparó una muestra de la sal Hcl correspondiente para el análisis
por ^{1}H-RMN tratando 5 mg del producto con un
exceso de HCl etéreo 1 N y concentración a sequedad.
^{1}H-RMN: (200 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 9,03 (d, 1H, J = 6,9, NH),
8,38 (s a, 3H, NH_{3}^{+}), 7,23 (t, 1H, J = 7,2, CH aromático),
7,06 (m, 3H, CH aromático), 4,39 (m, 1H, metina), 3,87 (m, 1H,
metina), 3,01 (d, 2H, J = 7,4, ArCH_{2}), 2,35 (m, 3H, pentil
metina, glu 4-CH_{2}), 2,01 (m, 2H, glu
3-CH_{2}), 1,75-1,48 (m, 4H,
pentil CH_{2}), 1,41 (s, 9H, t-Bu), 1,32 (s, 9H,
t-Bu), 0,73 (t, 6H, J = 7,3, pentil CH_{3}).
De acuerdo con el ejemplo 49, se acoplaron 0,199
g de hemiclorhidrato del ácido
4-(N-(2,4-diamino-6-pteridinil-metil)-N-metilamino)benzoico
dihidrato con 0,25 g de
5-O-terc-butilo-L-glutam-1-il-3-(3-pentil)-L-fenilalaninato
de terc-butilo usando 0,24 ml de DECP y 0,26 ml de Et_{3}N
en 25 ml de DMF. El producto bruto se sometió a cromatografía
ultrarrápida dos veces sobre gel de sílice (7:7:1 de
CH_{2}Cl_{2}:acetona:MeOH; y 95:5 de CH_{2}Cl_{2}:MeOH) para
producir 0,215 g (52%) de
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-(3-pentil)-L-fenilalaninato
de terc-butilo en forma de un polvo amarillo, p.f. 175ºC
(desc.).
De acuerdo con el ejemplo 50, se trataron 0,184 g
de
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-(3-pentil)-L-fenilalaninato
de terc-butilo con HCl gaseoso en 25 ml de CH_{3}NO_{2}
durante 45 min. La suspensión amarilla se concentró al vacío a
sequedad. El análisis del producto por HPLC (C18, 65:35:0,1 de
H_{2}O:MeCN:TFA) indicó un componente mayoritario a k' = 1,61 y
un componente minoritario a k' = 0,25. El producto bruto se purificó
por HPLC semi- preparativa (C18, 65:35:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA).
Las fracciones que contenían el producto puro (HPLC analítica) se
combinaron y se sometieron a evaporación rotatoria para retirar el
CH_{3}CN. Se produjo una suspensión amarilla que se congeló y se
liofilizó para producir 0,12 g (58%) de
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)-metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-(3-pentil)-L-fenilalanina
en forma de un polvo amarillo, p.f. 120ºC.
HPLC: un pico sobre C18, k' = 1,61,
65:35,0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA, caudal = 1 ml/min.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 12,87-11,90
(m a, 2H, COOH), 2,90 (s a, 1H, NH_{2}), 9,00 (s a, 1H,
NH_{2}), 8,70 (s, 1H, pteridinil 7-CH),
8,60-8,23 (m a, 2H, NH_{2}), 8,11 (d, 1H, J = 7,6,
amida NH), 7,96 (d, 1H, J = 7,8, amida NH), 7,70 (d, 2H, J = 8,7, CH
aromático), 7,07 (m, 1H, CH aromático), 6,98 (d, 2H, J = 7,9, CH
aromático), 6,90 (d, 1H, J = 7,6, CH aromático), 6,80 (d, 2H, H =
8,6, CH aromático), 4,86 (s, 2H,
pteridinil-CH_{2}), 4,41 (m, 2H, metinas), 3,23
(s, 3H, N-CH_{3}), 2,92 (m, 2H, ArCH_{2}), 2,21
(m, 3H, pentil metina, glu 4-CH_{2}),
2,03-1,77 (m, 2H, glu 3-CH_{2}9,
1,68-1,37 (m, 4H, pentil CH_{2}), 0,62 (m, 6H,
pentil CH_{3}).
Análisis Elemental: Calc. para
C_{34}H_{41}N_{9}O_{6}\cdot1,5TFA\cdot1,8 H_{2}O (PM
875,22): C, 50,78; H, 5,31; N,14,40. Encontrado: C, 50,76; H, 5,40;
N, 14,34.
Espectro de Masas: (Nebulización Iónica)
672 (M+H)^{+}.
Espectro UV: (tampón pH 7) \lambda_{max}
(\varepsilon) 259,8 (20000), 308,7 (19800), 373,7 (5890).
\lambda_{min} (\varepsilon) 241,5 (11600),
275,0 (13200), 345,8 (4420).
Un matraz de fondo redondo de 250 ml equipado con
un agitador magnético se cargó con 60 ml de ácido sulfúrico fumante
(Aldrich) y 12,1 g de yodo (Aldrich). A la solución de color rojo
oscuro resultante se le añadieron 10,0 g de
4-nitro-L-fenilalanina
mediante adición lenta. El matraz se equipó con un tubo de secado de
CaCl_{2} y la mezcla de reacción se agitó a TA durante 18 h. La
mezcla después se vertió en 300 g de hielo picado. Se produjo una
emulsión amarillo-parda que se trató con 7,4 g de
tiosulfato sódico y se agitó. La suspensión de color pardo claro
resultante se basificó a pH = 9 por la adición de NaCO_{3}
sólido. Esto se continuo por la acidificación de pH = 5,5 por la
adición de H_{2}SO_{4} conc. Precipitó un sólido pardo que se
recogió por filtración y se secó al vacío. Esto produjo 6,54 g
(41%) de
2-yodo-4-nitro-L-fenilalanina
en forma de un polvo pardo, p.f. >200ºC.
^{1}H-RMN: (200 MHz,
DMSO-d_{6}/TFA) \delta 8,62 (s, 1H, CH
aromático), 8,46 (s a, 3H, NH_{3}^{+}), 8,26 (d, 1H, J = 8,5, CH
aromático), 7,65 (d, 1H, J = 8,5, CH aromático), 4,22 (m, 1H,
metina), 3,34 (m, 2H, ArCH_{2}).
De acuerdo con el ejemplo 8, se esterificaron
1,40 g de
2-yodo-4-nitro-L-fenilalanina
por calentamiento a reflujo en 50 ml de HCl etanólico durante 18 h.
El tratamiento de la forma convencional seguido de cromatografía
ultrarrápida sobre gel de sílice (95:5 de CH_{2}Cl_{2}:MeOH)
produjo 1,19 g (78%) de
2-yodo-4-nitro-L-fenilalaninato
de etilo en forma de un sólido amarillo cristalino, p.f.
33-34ºC.
A un matraz de fondo redondo de 250 ml equipado
con un agitador magnético y una entrada de nitrógeno se le
añadieron 4,7 g de
2-yodo-4-nitro-L-fenilalaninato
de etilo, 125 ml de 1,4-dioxano, y 2,2 ml de
Et_{3}N. La solución se enfrió en un baño de hielo y se trató con
2,2 ml de cloroformiato de bencilo por adición lenta. El baño de
hielo se retiró y la mezcla de reacción se agitó a TA durante 18 h.
La mezcla se filtró y el filtrado se concentró a sequedad. El
residuo pardo se disolvió en EtOAc, se lavó con NaHCO_{3} acuoso
al 5% (4 x 75 ml), se secó sobre MgSO_{4} anhidro y se concentró
al vacío. El análisis del producto bruto por tlc (SiO_{2}, 75:25
de hexano:EtOAc) indicó un nuevo componente mayoritario a R_{f} =
0,35 y componentes minoritarios a R_{f} = 0,40 y 0,25. El
producto de R_{f} = 0,35 se aisló por cromatografía ultrarrápida
sobre gel de sílice (75:25 de hexano:EtOAc). Esto produjo 2,08 g
(32%) de
N-(benciloxi)carbonil)-2-yodo-4-nitro-L-fenilalaninato
de etilo, en forma de un polvo blanco, p.f.
85-87ºC.
De acuerdo con el ejemplo 151, se sometieron 1,65
g de
N-(benciloxi)carbonil)-2-yodo-4-nitro-L-fenilalaninato
de etilo a acoplamiento de Heck con 20 ml de ciclopenteno usando 60
ml de tolueno, 0,074 g de Pd(OAc)_{2}, 0,20 g de
tri-orto-tolilfosfina, y 0,51 ml de
Et_{3}N. La reacción se realizó a 110ºC durante 24 h. El análisis
del producto bruto por tlc (SiO_{2} de 8:2 de hexano:EtOAc) indicó
un producto mayoritario R_{f} = 0,40 y componentes minoritarios a
R_{f} = 0,38, 0,60 y 0,95. El material de R_{f} = 0,40 se aisló
por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (8:2 de
hexano:EtOAc). Esto produjo 1,03 g (71%) de la mezcla de la olefina
deseada en forma de un líquido transparente. Este material se
sometió a hidrogenación catalítica a 45 psi (310,26 kPa) durante 18
h usando 55 ml de MeOH y 0,25 g de Pd(C) al 10%. El producto
bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida (SiO_{2}, 99:1 de
EtOAc:MeOH) para dar 0,56 g (61% para las dos etapas) de
4-amino-2-ciclopentil-L-fenilalaninato
de etilo en forma de un aceite transparente viscoso.
^{1}H-RMN: (200 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 6,72 (d, 1H, J = 8,2, CH
aromático), 6,50 (d, 1H, J = 2,3, CH aromático), 6,29 (dd; 1H; J =
8,1, 2,3; CH aromático), 4,80 (s a, 2H, NH_{2} aromático, 4,00 (q,
2H, J = 7,1, etil CH_{2}), 3,12 (m, 1H, ciclopentil metina), 2,72
(m, 2H, ArCH_{2}), 2,03-1,37 (m, 10H, ciclopentil
CH_{2}, NH_{2}), 1,11 (t, 3H, J = 7,1, etil CH_{3}).
A un matraz de 500 ml de 3 bocas, equipado con
una entrada de nitrógeno y un agitador magnético, se le añadió una
solución de 0,56 g de
4-amino-2-ciclopentil-L-fenilalaninato
de etilo en 60 ml de H_{2}SO_{4} acuoso 0,1 M. Después de
enfriar a 3ºC, la solución se trató con una solución de 0,148 g de
nitrito sódico (Aldrich) en 10 ml de agua. La solución se agitó a
3ºC durante 10 min y después se trató con 95 ml de CuSO_{4} acuoso
1,5 M seguido de 0,25 g de Cu_{2}O (Aldrich). La mezcla se calentó
a 45ºC durante 35 min con agitación. El desprendimiento de gas fue
evidente durante este periodo. La mezcla se enfrió a TA y se
filtró. El filtrado azul se trató con NaOH acuoso 1 N a pH = 5,5.
La suspensión azul-verde resultante se transfirió a
un embudo de decantación y se extrajo con CHCl_{3} (5 x 100 ml).
Los extractos de CHCl_{3} combinados se secaron sobre MgSO_{4}
y se concentraron para dar 0,12 g de un aceite verde. La suspensión
azul-verde después se trató con NaHCO_{3} sólido
hasta que cesó el desprendimiento de gas y se extrajo con CHCl_{3}
una segunda vez (4 x 50 ml). Los extractos combinados se lavaron con
agua, se secaron (MgSO_{4}) y se concentraron para dar 0,076 g de
un aceite. Este material se combinó con los 0,12 g de producto
original y se purificó por cromatografía ultrarrápida (SiO_{2},
95:5 de CH_{2}Cl_{2}:MeOH) para producir 0,168 g (30%) de
2-ciclopentil-L-tirosinato
de etilo en forma un aceite transparente viscoso.
^{1}H-RMN: (200 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 9,07 (s, 1H, OH), 6,87 (d,
1H, J = 8,2, CH aromático), 6,66 (d, 1H, J = 2,4, CH aromático),
6,48 (dd; 1H; J = 8,1, 2,4; CH aromático), 4,00 (q, 2H, J = 7,1,
etil CH_{2}), 3,16 (m, 1H, ciclopentil metina), 2,78 (m, 2H,
ArCH_{2}), 2,05-1,32 (m, 10H, ciclopentil
CH_{2}, NH_{2}), 1,10 (t, 3H, J = 7,1, etil CH_{3}).
De acuerdo con el ejemplo 145, se acoplaron 0,53
g de
2-ciclopentil-L-tirosinato
de etilo con 0,171 g de \gamma-etil éster del
ácido N-Cbz-L-glutámico
usando 0,111 g de EDC en 8 ml de CH_{2}Cl_{2} durante 4,5 h. El
producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida dos veces
sobre gel de sílice (1:1 de hexano:EtOAc; 95:5 de
CH_{2}Cl_{2}:MeOH) para producir 0,245 g (78%) de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-etil-L-glutam-1-il-2-ciclopentil-L-tirosinato
de etilo en forma de una espuma incolora.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 9,09 (s, 1H, OH), 8,37 (d,
1H, J = 7,3, NH), 7,33 (m, 6H, CH aromático, NH), 6,88 (d, 1H, J =
8,4, CH aromático), 6,63 (s, 1H, CH aromático), 6,43 (d, 1H, J =
8,3, CH aromático), 4,99 (m, 2H, PhCH_{2}O), 4,28 (m, 1H, metina),
4,00 (m, 5H, etil CH_{2}, metina), 3,09 (m, 1H, ciclopentil
metina), 2,96 (m, 1H, ArCH_{2}), 2,83 (m, 1H, ArCH_{2}), 2,29
(t, 2H, J = 7,9, glu 4-CH_{2}),
2,02-1,53 (m, 8H, glu 3-CH_{2},
ciclopentil CH_{2}), 1,46 (m, 2H, ciclopentil CH_{2}), 1,15 (t,
3H, J = 7,1, etil CH_{3}), 1,04 (t, 3H, J = 7,1, etil
CH_{3}).
De acuerdo con el ejemplo 48, se hidrogenaron
0,24 g de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-etil-L-glutam-1-il-2-ciclopentil-L-tirosinato
de etilo usando 0,042 g de Pd(C) al 10% en 85 ml de MeOH. El
producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida
(SiO_{2}, 95:5 de CH_{2}Cl_{2}:MeOH) para producir 0,154 g
(84%) de
5-O-etil-L-glutam-1-il-2-ciclopentil-L-tirosinato
de etilo en forma de un aceite transparente viscoso.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 9,08 (s, 1H, OH), 8,23 (d,
1H, J = 7,9, NH), 6,87 (d, 1H, J = 8,1, CH aromático), 6,63 (d, 1H,
J = 2,1, CH aromático), 6,44 (dd; 1H; J = 8,1, 2,1; CH aromático),
4,31 (m, 1H, metina), 4,00 (m, 4H, etil CH_{2}), 3,12 (m, 2H, glu
metina, ciclopentil metina), 2,98 (m, 1H, ArCH_{2}), 2,82 (m, 1H,
ArCH_{2}), 2,27 (t, 2H, J = 7,9, glu 4-CH_{2}),
2,00-1,35 (m, 12H, glu 3-CH_{2},
NH_{2}, ciclopentil CH_{2}), 1,07 (t, 3H, J = 7,1, etil
CH_{3}), 1,16 (t, 3H, J = 7,1, etil CH_{3}).
De acuerdo con el ejemplo 49, se acoplaron 0,131
g de hemiclorhidrato del ácido
4-(N-(2,4-diamino-6-pteridinil-metil)-N-metilamino)benzoico
dihidrato con 0,15 g de
5-O-etil-L-glutam-1-il-2-ciclopentil-L-tirosinato
de etilo usando 0,08 ml de DECP y 0,10 ml de Et_{3}N en 12 ml de
DMF. El producto bruto se sometió a cromatografía ultrarrápida dos
veces sobre gel de sílice (93:7 de CH_{2}Cl_{2}:MeOH; y 92:8 de
CH_{2}Cl_{2}:MeOH) para producir 0,134 g (52%) de
N-4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-etil-L-glutam-1-il-2-ciclopentil-L-tirosinato
de etilo en forma de un polvo amarillo, p.f.
135-150ºC.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 9,06 (s, 1H, OH), 8,54 (s,
1H, pteridinil 7-CH), 8,34 (d, 1H, J = 7,4, amida
NH), 7,96 (d, 1H, J = 8,2, amida NH); 7,70 (d, 2H, J = 8,6, CH
aromático), 7,63 (s a, 1H, NH_{2}), 7,43 (s a, 1H, NH_{2}), 6,86
(d, 1H, J = 8,4, CH aromático), 6,80 (d, 2H, J = 8,9, CH aromático),
6,60 (m, 3H, CH aromático, NH_{2}), 6,40 (dd; 1H; J = 8,2, 1,9; CH
aromático), 4,77 (s, 2H, pteridinil-CH_{2}), 4,42
(m, 1H, metina), 4,25 (m, 1H, metina), 4,07-3,89 (m,
4H, etil CH_{2}), 3,19 (s, 3H, N-CH_{3}), 3,08
(m, 1H, ciclopentil metina), 2,94 (m, 1H, ArCH_{2}), 2,82 (m, 1H,
ArCH_{2}), 2,31 (t, 2H, J = 7,9, glu 4-CH_{2}),
2,04-1,32 (m, 10H, glu 3-CH_{2},
ciclopentil CH_{2}), 1,13 (t, 3H, J = 7,1, etil CH_{3}), 1,02
(t, 3H, J = 7,1, etil CH_{3}).
Una solución de 0,130 g de
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-etil-L-glutam-1-il-2-ciclopentil-L-tirosinato
de etilo en 10 ml de 1:1 de THF:H_{2}O se trató con 17 mg de LiOH
y la solución se agitó a TA en una atmósfera de nitrógeno. La
hidrólisis se controló por HPLC (C18, 70:30;0,1 de
H_{2}O:MeCN:TFA, caudal = 1 ml/min). Después de 3 h, se añadió una
porción adicional de 10 mg de LiOH. El análisis por HPLC (en las
condiciones descritas anteriormente) 2 h después de la segunda
adición de LiOH indicó un solo componente a k' = 0,62. La solución
se neutralizó por la adición de HCl 1 N . Se produjo un precipitado
amarillo que se recogió por centrifugación, se lavó con cuatro
ciclos de suspensión
acuosa-centrifugación-decantación,
se congeló y se liofilizó para producir 0,106 g (83%) de
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-2-ciclopentil-L-tirosina
en forma de un polvo amarillo, p.f. 185ºC (desc.).
HPLC: un pico sobre C18, k' = 2,10,
75:25,0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA, caudal = 1 ml/min.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 12,75-11,85
(m a, COOH), 9,03 (s a, 1H, OH), 8,56 (s, 1H, pteridinil
7-CH), 8,13 (d, 1H, J = 7,9, amida NH), 7,96 (d, 1H,
J = 7,8, amida NH), 7,72 (s a, 1H, NH_{2}), 7,70 (d, 2H, J = 8,7,
CH aromático), 7,53 (s a, 1H, NH_{2}), 6,89 (d, 1H, J = 8,4, CH
aromático), 6,80 (m, 3H, CH aromático, NH_{2}), 6,69 (s a, 1H,
NH_{2}), 6,60 (s, 1H, CH aromático), 6,38 (dd; 1H; J = 8,3, 2,2;
CH aromático), 4,78 (s, 2H, pteridinil-CH_{2}),
4,41 (m, 1H, metina), 4,22 (m, 1H, metina), 3,21 (s, 3H,
N-CH_{3}), 3,12 (m, 1H, ciclopentil metina), 3,00
(dd; 1H; J = 14,3, 5,3; ArCH_{2}), 2,76 (dd; 1H; J = 14,3, 8,8;
ArCH_{2}), 2,23 (t, 2H, J = 7,9, glu 4-CH_{2}),
2,05-1,30 (m, 10H, glu 3-CH_{2},
ciclopentil CH_{2}).
Análisis Elemental: Calc. para
C_{34}H_{39}N_{9}O_{7}\cdot2,5 H_{2}O (PM 730,78): C,
55,88; H, 6,07; N, 17,25. Encontrado: C, 55,91; H, 5,94; N,
17,10.
Espectro de Masas: (Nebulización Iónica)
686 (M+H)^{+}.
Espectro UV: (tampón pH 7) \lambda_{max}
(\varepsilon) 259,0 (25000), 308,2 (25500), 371,5 (7960).
\lambda_{min} (\varepsilon) 242,3 (16000),
273,0 (17700), 346,8 (6350), sh (\varepsilon) 220,9 (30100),
288,1 (21000).
Una solución de 5,0 g de
3,5-diyodo-L-tirosina
y 0,95 ml de HclO_{4} acuoso al 70% en 155 ml de acetato de
terc-butilo se agitó a TA en una atmósfera de nitrógeno
durante 4 días. La solución se neutralizó por la adición de 150 ml
de NaHCO_{3} acuoso al 5% y la mezcla se sometió a evaporación
rotatoria para retirar el acetato de terc-butilo. Se produjo
un precipitado blanquecino que se recogió por filtración y se secó
al vacío. El producto bruto se sometió a cromatografía ultrarrápida
sobre gel de sílice (97:3 de CH_{2}Cl_{2}:MeOH) para producir
4,2 g (75%) de
3,5-diyodo-L-tirosinato
de terc-butilo en forma de un polvo blanco, p.f.
165-168ºC.
De acuerdo con el ejemplo 145, se acoplaron 1,50
g de
3,5-diyodo-L-tirosinato
de terc-butilo con 1,31 g de \gamma-terc-butil éster
del ácido N-FOMC-L-glutámico
usando 0,62 g de EDC en 45 ml de CH_{2}Cl_{2} durante 3 h. El
producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre gel
de sílice (7:3 de hexano:EtOAc) para producir 1,78 g (65%) de
N-(9-fluorenilmetiloxicarbonil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3,5-diyodo-L-tirosinato
de terc-butilo en forma de una espuma de color pardo
claro.
^{1}H-RMN: (200 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 9,41 (s, 1H, OH), 8,27 (d,
1H, J = 7,0, NH), 7,91 (d, 2H, J = 7,2, CH aromático), 7,75 (m, 2H,
CH aromático), 7,61 (s, 2H, CH aromático), 7,57-7,28
(m, 5H, CH aromático, NH), 4,26 (m, 4H,
fluorenil-CH_{2}O, fluorenil metina,
\alpha-metina), 4,08 (m, 1H,
\alpha-metina), 2,83 (d, 2H, J = 7,4, ArCH_{2}),
2,25 (t, 2H, J = 7,9, glu 4-CH_{2}), 1,83 (m a,
2H, glu 3-CH_{2}), 1,41 (s, 9H,
t-Bu), 1,33 (s, 9H, t-Bu).
A una solución de 1,66 g de
N-(9-fluorenilmetiloxicarbonil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3,5-diyodo-L-tirosinato
de terc-butilo en 7 ml de DMF anhidra se le añadieron 1,71
ml de piperidina (Sigma). Después de agitar a TA en una atmósfera de
nitrógeno durante 1 h, la solución se mezcló con 75 ml de agua y se
extrajo con CH_{2}Cl_{2}. Las soluciones de CH_{2}Cl_{2}
combinadas se lavaron con NaCl acuoso (4 x 30 ml), se secaron sobre
MgSO_{4} y se concentraron al vacío para dar un sólido blanco. El
análisis del producto bruto por tlc (SiO_{2}, 95:5 de
CH_{2}Cl_{2}:MeOH) indicó un nuevos componentes mayoritarios a
R_{f} = 0,4 y 0,5. El material de R_{f} = 0,4 se aisló por
cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (95:5 de
CH_{2}Cl_{2}:MeOH) para producir 1,1 g (87%) de
5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3,5-diyodo-L-tirosinato
de terc-butilo en forma de una espuma blanca, p.f.
45-57ºC. Se preparó una muestra de la sal Hcl
correspondiente para RMN por tratamiento de 10 mg de producto con
HCl etéreo 1 N y concentración a sequedad.
^{1}H-RMN: (200 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 9,42 (s a, 1H, OH), 8,98 (d,
1H, J = 7,0, NH), 8,33 (s a, 3H, NH_{3}^{+}), 7,67 (s, 2H, CH
aromático), 4,36 (m, 1H, metina), 3,88 (m, 1H, metina), 2,86 (d, 2H,
J = 7,0, ArCH_{2}), 2,38 (m, 2H, glu 4-CH_{2}),
2,01 (m, 2H, glu 3-CH_{2}), 1,41 (s, 9H,
t-Bu), 1,35 (s, 9H, t-Bu).
De acuerdo con el ejemplo 154, se acoplaron 0,25
g de
5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3,5-diyodo-L-tirosinato
de terc-butilo con 0,132 g de hemiclorhidrato del ácido
4-(N-(2,4-diamino-6-pteridinilmetil)-N-metilamino)benzoico
dihidrato usando 0,06 ml de DECP, 0,07 ml de Et_{3}N y 10 ml de
DMF. El producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida
sobre gel de sílice (95:5 de CH_{2}Cl_{2}:MeOH) para producir
0,18 g (50%) de
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3,5-diyodo-L-tirosinato
de terc-butilo en forma de un polvo amarillo, p.f. 172ºC
(desc.).
De acuerdo con el ejemplo 50, se trataron 0,119 g
de
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3,5-diyodo-L-tirosinato
de terc-butilo con HCl gaseoso en 15 ml de CH_{3}NO_{2}
durante 30 min. La suspensión amarilla se concentró al vacío a
sequedad. El análisis del producto por ^{1}H-RMN y
HPLC de fase inversa indicó el producto deseado contaminado con
impurezas minoritarias. La mezcla se purificó por HPLC
semipreparativa (C18, 77:23:0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA). Las
fracciones que contenían el producto puro se combinaron y se
sometieron a evaporación rotatoria para retirar el MeCN. La
suspensión resultante se congeló y se liofilizó para producir 0,024
g (18%) de
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3,5-diyodo-L-tirosina
en forma de un polvo amarillo, p.f. 205ºC (desc.).
HPLC: un pico sobre C18, k' = 2,74,
77:23,0,1 de H_{2}O:MeCN:TFA, caudal = 1 ml/min.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,20-11,90
(m a, COOH), 9,35 (s, 1H, OH), 9,21 (s a, 1H, NH_{2}), 9,02 (s a,
1H, NH_{2}), 8,70 (s, 1H, pteridinil 7-CH), 8,52
(s a, 1H, NH_{2}), 8,13 (d, 1H, J = 7,6, amida NH), 7,98 (d, 1H, J
= 7,9, amida NH), 7,72 (d, 2H, J = 9,0, CH aromático), 7,57 (s, 2H,
CH aromático), 7,51 (s a, 1H, NH_{2}), 6,80 (d, 2H, J = 8,9, CH
aromático), 4,86 (s, 2H, pteridinil-CH_{2}), 4,41
(m, 1H, metina), 4,30 (m, 1H, metina), 3,23 (s, 3H,
N-CH_{3}), 2,81 (m, 2H, ArCH_{2}), 2,25 (t, 2H,
J = 7,6, glu 4-CH_{2}), 1,90 (m, 2H, glu
3-CH_{2}).
Análisis Elemental: Calc. para
C_{29}H_{29}N_{9}O_{7}I_{2}\cdot1,7 TFA\cdot2,3
H_{2}O (PM 1104,69): C, 35,23; H, 3,22; N,11,41. Encontrado: C,
35,25; H, 3,24; N, 11,44.
Espectro de Masas: (Nebulización Iónica)
870 (M+H)^{+}.
Espectro UV: (tampón pH 7) \lambda_{max}
(\varepsilon) 219,7 (48900), 258,0 (26500), 306,0 (26200), 373,3
(7780).
\lambda_{min} (\varepsilon) 214,9 (48300),
246,0 (23700), 273,7 (18400), 347,6 (6200)
A un matraz de 500 ml de 3 bocas, equipado con un
agitador magnético, un termómetro y un condensador, se le añadieron
10,0 g de 4-hidroxibenzoato de metilo (Aldrich) y
30 ml de ácido acético glacial. A esta suspensión se le añadió una
solución de 11,74 g de monocloruro de yodo en 30 ml de ácido acético
glacial mediante un embudo de adición. La solución se calentó a
80ºC durante 1 h, a 45ºC durante 18 h, y a 90ºC durante 4 h más. La
refrigeración a TA produjo una suspensión viscosa de color
rojo-naranja que se transfirió a un embudo de
decantación de 1 l y se disolvió en 500 ml de CHCl_{3} por
agitación vigorosa. La solución de color púrpura oscuro se lavó con
agua (2 x 100 ml), tiosulfato sódico acuoso saturado (2 x 100 ml) y
NaHCO_{3} acuoso al 5% (2 x 100 ml). Se produjo una solución de
color amarillo claro que se secó sobre MgSO_{4} y se concentró al
vacío para dar un sólido blanco. Este material se recristalizó en
agua-MeOH para producir 14,92 g (82%) de
4-hidroxi-3-yodobenzoato
de metilo en forma de un sólido blanco cristalino, p.f.
145-146ºC.
De acuerdo con el ejemplo 151, se sometieron 5,0
g de
4-hidroxi-3-yodobenzoato
de metilo a acoplamiento de Heck con 25 ml de ciclopenteno, usando
80 ml de tolueno, 0,40 g de Pd(OAc)_{2}, 1,10 g de
tri-orto-tolilfosfina y 2,76 ml de
Et_{3}N. La reacción se realizó a 110ºC durante 24 h. El análisis
del producto bruto por tlc (SiO_{2}, 75:25 hexano:EtOAc) indicó un
nuevo componente mayoritario a R_{f} = 0,50. Este material se
aisló por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (75:25 de
hexano:EtOAc). Esto dio 2,97 g (76%) de la mezcla de la olefina
deseada (^{1}H-RMN) en forma de un sólido pardo.
Este material se sometió a hidrogenación catalítica a 45 psi (310,26
kPa) durante 18 h usando 80 ml de MeOH y 1,0 g de Pd(c) al
10%. Esto produjo 2,59 g (65% para las dos etapas) de
4-hidroxi-3-ciclopentilbenzoato
de metilo en forma de un sólido blanco, p.f.
114-116ºC.
Un matraz de 100 ml de 3 bocas, equipado con un
agitador magnético y una entrada de nitrógeno, se cargó con 1,79 g
de
4-hidroxi-3-ciclopentilbenzoato
de metilo, 1,22 g de imidazol (Aldrich), 30 ml de DMF anhidra y
1,47 g de cloruro de terc-butildimetilsililo (Aldrich). La
solución se agitó a TA en una atmósfera de nitrógeno durante 24 h y
después se concentró al vacío para dar un aceite viscoso. Este
material se sometió a cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice
(95:5 de hexano:EtOAc) para producir 2,43 g (89%) de
4-((terc-butildimetilsilil)oxi)-3-ciclopentilbenzoato
de metilo en forma de un líquido transparente.
^{1}H-RMN: (200 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 7,81 (d, 1H, J = 2,0, CH
aromático), 7,72 (dd; 1H; J = 8,4, 2,0; CH aromático), 6,93 (d, 1H,
J = 8,4, CH aromático), 3,80 (s, 3H, CH_{3}), 3,30 (m, 1H,
ciclopentil metina), 2,06-1,37 (m, 8H, ciclopentil
CH_{2}), 0,98 (s, 9H, t-Bu), 0,27 (s, 6H,
SiMe_{2}).
\newpage
A un matraz de 100 ml de 3 bocas, equipado con un
agitador magnético y una entrada de nitrógeno, se le añadieron 2,58
g de
4-((terc-butildimetilsilil)oxi)-3-ciclopentilbenzoato
de metilo y 15 ml de tolueno anhidro. La solución se enfrió en un
baño de agua enfriada con hielo y se trató con 19,3 ml de hidruro de
diisobutilaluminio 1 M en tolueno (Aldrich). La solución se agitó a
0ºC durante 30 min y se dejó calentar a TA. Después de 2 h a TA, la
solución se vertió en 130 ml de tartrato de potasio y sodio acuoso
saturado y la mezcla resultante se agitó durante 20 min. La mezcla
después se extrajo con éter etílico (3 x 70 ml). Los extractos de
éter combinados se lavaron con agua (3 x 70 ml), se secaron sobre
MgSO_{4} anhidro y se concentraron para dar un aceite turbio. El
producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre gel
de sílice (8:2 de hexano:EtOAc) para producir 1,94 de (82%) de
4-((terc-butildimetilsilil)oxi)-3-ciclopentilbencil
alcohol en forma de un líquido transparente.
^{1}H-RMN: (200 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 7,18 (d, 1H, J = 2,0, CH
aromático), 7,02 (dd; 1H; J = 8,2, 2,2; CH aromático), 6,76 (d, 1H,
J = 8,0, CH aromático), 5,02 (t, 1H, J = 5,8, OH), 4,40 (d, 2H, J =
5,6, ArCH_{2}O), 3,29 (m, 1H, ciclopentil metina),
2,04-1,38 (m, 8H, ciclopentil CH_{2}), 1,03 (s,
9H, t-Bu), 0,22 (s, 6H, SiMe_{2}).
Una solución de 1,94 g de
4-((terc-butildimetilsilil)oxi)-3-ciclopentilbencil
alcohol en 70 ml de CH_{2}Cl_{2} anhidro se trató con 2,05 g de
clorocromato de piridinio (Aldrich) y se agitó a TA en una
atmósfera de nitrógeno. Después de 30 min, la tlc (SiO_{2}, 85:15
de hexano:EtOAc) indicó que no quedaba material de partida y un
nuevo componente mayoritario a R_{f} = 0,80. La mezcla se filtró
para retirar los sólidos y el filtrado se lavó con ácido cítrico
acuoso al 5% (4 x 50 ml) seguido de NaHCO_{3} acuoso al 5% (4 x 50
ml). La solución de CH_{2}Cl_{2} se secó sobre MgSO_{4}
anhidro y se concentró al vacío para dar un aceite pardo. Este
material se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre gel de
sílice (9:1 de hexano:EtOAc) para producir 1,52 g (79%) de
4-((terc-butildimetilsilil)oxi)-3-ciclopentilbenzaldehído
en forma un aceite transparente.
^{1}H-RMN: (200 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 9,88 (s, 1H, aldehído CH),
7,80 (d, 1H, J = 2,0 CH aromático), 7,69 (dd; 1H; J = 8,2, 2,0; CH
aromático), 7,03 (d, 1H, J = 8,3, CH aromático), 3,29 (m, 1H,
ciclopentil metina), 2,08-1,43 (m, 8H, ciclopentil
CH_{2}), 1,01 (s, 9H, t-Bu), 0,30 (s, 6H,
SiMe_{2}).
A un matraz de 100 ml de 3 bocas, equipado con un
agitador magnético, una entrada de nitrógeno y un condensador de
reflujo se le añadieron 1,57 g de dietilfosfonoacetato de
terc-butilo (Aldrich) y 20 ml de éter etílico anhidro. Esto
se continuó por la adición de 0,40 g de una dispersión en aceite
mineral al 60% de NaH. La solución turbia resultante se calentó a
reflujo durante 25 min, se enfrió a 0ºC y se trató con una solución
de 1,52 g de
4-((terc-butildimetilsilil)oxi)-3-ciclopentilbenzaldehído
en 10 ml de éter. Se produjo un gel amarillo viscoso que se
descompuso con una espátula. La mezcla se dejó calentar a TA y se
continuó agitando durante 1 h más. El análisis por tlc (SiO_{2},
95:5 de hexano:EtOAc) indicó un nuevo componente mayoritario a
R_{f} = 0,48 y componentes minoritarios a R_{f} = 0,06, 0,41 y
0,98. La mezcla se diluyó con 70 ml de éter, se lavó con salmuera
saturada y se secó sobre MgSO_{4} anhidro. El agente de secado se
retiró por filtración y el filtrado se concentró para dar un aceite
amarillo. Este material se purificó por cromatografía ultrarrápida
sobre gel de sílice (97:3 de hexano:EtOAc) para producir 1:53 g
(77%) de
trans-4-((terc-butildimetilsilil)oxi)-3-ciclopentilcinamato
de terc-butilo en forma de un aceite transparente.
^{1}H-RMN: (200 NHz,
DMSO-d_{6}) \delta 7,59-7,36 (m,
3H, CH aromático, CH olefínico), 6,83 (d, 1H, J = 8,4, CH
aromático), 6,38 (d, 1H, J = 15,8, CH olefínico), 3,27 (m, 1H,
ciclopentil metina), 2,02-1,52 (m, 8H, ciclopentil
CH_{2}), 1,49 (s, 9H, t-Bu), 1,00 (s, 9H,
Si-t-Bu), 0,25 (s, 6H,
SiMe_{2}).
A un matraz de 250 ml de 3 bocas, equipado con un
agitador magnético y una entrada de nitrógeno, se le añadieron 20 ml
de alcohol terc-butílico, 20 ml de agua, 5,32 g de
AD-mix-\alpha (Sharpless, K.B.;
et al., J. Org. Chem., 1992, 57,
2768-2771; reactivo adquirido de Aldrich) y 0,36 g
de metanosulfonamida (Aldrich). Esto se continuó por la adición de
1,53 g de
trans-4-((terc-butildimetilsilil)oxi)-3-ciclopentilcinamato
de terc-butilo. La mezcla de reacción se agitó a TA en una
atmósfera de nitrógeno. Después de 18 h, se añadieron 5,7 g de
sulfito sódico y la mezcla se agitó durante 30 min. La mezcla se
concentró al vacío hasta 15 ml, se diluyó con 100 ml de agua y se
extrajo con EtOAc (4 x 50 ml). Los extractos de EtOAc combinados se
lavaron con agua (3 x 50 ml), se secaron sobre MgSO_{4} anhidro y
se concentraron para dar un aceite turbio. Este material se
purificó por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (75:25
de hexano:EtOAc) para producir 1,44 g (87%) de
3-(4-(terc-butildimetilsilil)oxi)-3-ciclopentilfenil)-2,3-dihidroxipropionato
de (2R,3S)-terc-butilo en forma de un aceite
transparente viscoso.
^{1}H-RMN: (200 NHz,
DMSO-d_{6}) \delta 7,16 (s, 1H, CH aromático),
7,01 (d, 1H, J = 8,2, CH aromático), 6,73 (d, 1H, J = 8,2, CH
aromático), 5,28 (d, 1H, J = 5,4, OH), 5,25 (d, 1H, J = 7,1, OH),
4,55 (t, 1H, J = 5,6, propionato 2-metina), 3,93 (t,
1H, J = 6,8, propionato 3-metina), 3,27 (m, 1H,
ciclopentil metina), 2,04-1,37 (m, 8H, ciclopentil
CH_{2}), 1,24 (s, 9H, t-Bu), 0,99 (s, 9H,
Si-t-Bu), 0,21 (s, 6H, SiMe2).
A un recipiente Parr de 300 ml se le añadieron
0,35 g de Pd(C) al 10% y 20 ml de alcohol
terc-butílico en una cantidad abundante de nitrógeno. A esto
se le añadió una solución de 1,42 g de
3-(4-(terc-butildimetilsilil)oxi)-3-ciclopentilfenil)-2,3-dihidroxipropionato
de (2R,3S)-terc-butilo en 40 ml de alcohol
terc-butílico. La mezcla se desoxigenó burbujeando nitrógeno
a su través durante 5 min mientras se calentaba suavemente el
recipiente para evitar la congelación del alcohol
terc-butílico. La mezcla se trató con 4 gotas de HclO_{4}
concentrado y se hidrogenó a 45 psi (310,26) y a 40ºC durante 72 h.
El recipiente se purgó con nitrógeno, el catalizador se retiró por
filtración a través de celite y el filtrado se concentró al vacío
hasta 20 ml. La solución se mezcló con 60 ml de NaHCO_{3} acuoso
al 5% y la mezcla se extrajo con EtOAc (4 x 40 ml). Los extractos de
EtOAc combinados se lavaron con NaHCO_{3} acuoso al 5% (3 x 50
ml), se secaron sobre MgSO_{4} anhidro y se concentraron para dar
un aceite turbio. Este material se purificó por cromatografía
ultrarrápida sobre gel de sílice (9:1 de hexano:EtOAc) para producir
1,17 g (86%) de
3-(4-((terc-butildimetilsilil)oxi)-3-ciclopentilfenil)-2-hidroxipropionato
de (R)-terc-butilo en forma de un aceite transparente
viscoso.
^{1}H-RMN: (200 NHz,
DMSO-d_{6}) \delta 7,05 (d, 1H, J = 2,1, CH
aromático), 6,92 (dd; 1H; J = 8,4, 2,1; CH aromático), 6,69 (d, 1H,
J = 8,2, CH aromático), 5,33 (d, 1H, J = 5,7, OH), 4,08 (m, 1H,
metina), 3,23 (m, 1H, ciclopentil metina), 2,78 (d, 2H, J = 6,1,
ArCH_{2}), 2,00-1,38 (m, 8H, ciclopentil
CH_{2}), 1,32 (s, 9H, t-Bu), 0,99 (s, 9H,
Si-t-Bu), 0,20 (s, 6H, SiMe2).
A un matraz de 100 ml de 3 bocas, equipado con un
agitador magnético y una entrada de nitrógeno, se le añadieron 1,14
g de
3-(4-((terc-butildimetilsilil)oxi)-3-ciclopentilfenil)-2-hidroxipropionato
de (R)-terc-butilo, 20 ml de THF anhidro, 1,01 g de
\gamma-terc-butil éster del ácido
N-Cbz-L-glutámico (Sigma) y
0,78 g de trifenilfosfina (Aldrich). La solución se enfrió a 0ºC y
se trató con 0,47 ml de azodicarboxilato de dietilo (Aldrich) por
adición gota a gota. La solución se dejó calentar a TA y se continuó
agitando en una atmósfera de nitrógeno. Después de 3,5 h, la tlc
(SiO_{2}, 85:15 de hexano:EtOAc) indicó un nuevo componente
mayoritario a R_{f} = 0,46 y algo del material de partida
alcohólico restante a R_{f} = 0,51. La solución se enfrió de nuevo
a 0ºC y se trató con 0,18 g más de \gamma-terc-butil éster
del ácido N-Cbz-L-glutámico,
0,14 g de trifenilfosfina y 0,085 ml de azodicarboxilato de dietilo.
Después de calentar a TA y de agitar durante 18 h, la tlc indicó
sólo una pequeña cantidad de material de partida. La solución se
concentró al vacío a sequedad y el producto bruto se purificó por
cromatografía ultrarrápida (SiO_{2}, 85:15 de hexano:EtOAc). Esto
produjo 1,86 g (84%) de
2-((N-((benciloxi)carbonil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il)oxi)-3-(4-(terc-butildimetilsilil)oxi)-3-ciclopentilfenil)propionato
de (S)-terc-butilo en forma de un aceite transparente
viscoso.
^{1}H-RMN: (200 NHz,
DMSO-d_{6}) \delta 7,76 (d, 1H, J = 8,0, NH),
7,34 (m, 5H, CH aromático), 7,11 (s, 1H, CH aromático), 6,96 (d, 1H,
J = 8,1, CH aromático), 6,68 (d, 1H, J = 8,1, CH aromático), 5,01
(m, 3H, PhCH_{2}O, propionato metina), 4,19 (m, 1H, glu metina),
3,21 (m, 1H, ciclopentil metina), 3,01 (d, 2H, J = 5,1, ArCH_{2}),
2,32 (t, 2H, J = 7,8, glu 4-CH_{2}),
2,12-1,43 (m, 10H, glu 3-CH_{2},
ciclopentil CH_{2}), 1,39 (s, 9H, t-Bu), 1,26 (s,
9H, t-Bu), 0,98 (s, 9H,
Si-t-Bu), 0,19 (s, 9H,
SiMe_{2}).
Una solución de 1,85 g de
2-((N-((benciloxi)carbonil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il)oxi)-3-(4-((terc-butildimetilsi-
lil)oxi)-3-ciclopentilfenil)propionato de (S)-terc-butilo en 20 ml de THF anhidro se trató con 2,63 ml de fluoruro de tetrabutilamonio 1 M/THF (Aldrich) y se agitó a 0ºC en una atmósfera de nitrógeno. Después de 15 min, la tlc (SiO_{2}, 75:25 hexano:EtOAc) indicó que no quedaba material de partida y un único nuevo componente al R_{f} = 0,41. La solución se mezcló con 80 ml de agua y se extrajo con EtOAc (4 x 40 ml). Los extractos de EtOAc combinados se lavaron con salmuera saturada (3 x 60 ml), se secaron sobre MgSO_{4} anhidro y se concentraron al vacío para dar un aceite transparente. Este material se sometió a cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (75:25 de hexano:EtOAc) para producir 1,5 g (96%) de 2-(N-((benciloxi)carbonil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il)oxi)-3-(3-ciclopentil-4-hidroxifenil)propionato de (S)-terc-butilo en forma de un espuma blanca.
lil)oxi)-3-ciclopentilfenil)propionato de (S)-terc-butilo en 20 ml de THF anhidro se trató con 2,63 ml de fluoruro de tetrabutilamonio 1 M/THF (Aldrich) y se agitó a 0ºC en una atmósfera de nitrógeno. Después de 15 min, la tlc (SiO_{2}, 75:25 hexano:EtOAc) indicó que no quedaba material de partida y un único nuevo componente al R_{f} = 0,41. La solución se mezcló con 80 ml de agua y se extrajo con EtOAc (4 x 40 ml). Los extractos de EtOAc combinados se lavaron con salmuera saturada (3 x 60 ml), se secaron sobre MgSO_{4} anhidro y se concentraron al vacío para dar un aceite transparente. Este material se sometió a cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (75:25 de hexano:EtOAc) para producir 1,5 g (96%) de 2-(N-((benciloxi)carbonil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il)oxi)-3-(3-ciclopentil-4-hidroxifenil)propionato de (S)-terc-butilo en forma de un espuma blanca.
^{1}H-RMN: (200 NHz,
DMSO-d_{6}) \delta 9,11 (s, 1H, OH), 7,77 (d,
1H, J = 8,2, NH), 7,33 (m, 5H, CH aromático), 7,01 (d, 1H, J = 1,6,
CH aromático), 8,85 (dd; 1H; J = 8,2, 1,7; CH aromático), 6,68 (d,
1H, J = 8,2, CH aromático), 5,04 (s, 2H, PhCH_{2}O), 4,97 (m, 1H,
propionato metina), 4,18 (m, 1H, glu metina), 3,17 (m, 1H,
ciclopentil metina), 2,96 (d, 2H, J = 6,0, ArCH_{2}), 2,34 (t, 2H,
J = 7,4, glu 4-CH_{2}), 2,13-1,43
(m, 10H, glu 3-CH_{2}, ciclopentil CH_{2}), 1,40
(s, 9H, t-Bu), 1,29 (s, 9H,
t-Bu).
De acuerdo con el ejemplo 48, se hidrogenaron
1,49 g de
2-((N-((benciloxi)carbonil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il)oxi)-3-(3-ciclopentil-4-hidroxifenil)propionato
de (S)-terc-butilo usando 0,24 g de Pd(C) al
10% en 70 ml de MeOH. El análisis del producto bruto por tlc
(SiO_{2}, 4:6 de hexano:EtOAc) indicó un componente mayoritario a
R_{f} = 0,47 y componentes minoritarios a R_{f} = 0,60 y 0,15.
El producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre
gel de sílice (4:6 de hexano:EtOAc) para producir 0,76 g (65%) de
2-((5-O-terc-butil-L-glutam-1-il)oxi)-3-(3-ciclopentil-4-hidroxifenil)propionato
de (S)-terc-butilo en forma de una espuma blanca.
^{1}H-RMN: (200 NHz,
DMSO-d_{6}) \delta 9,12 (s, 1H, OH), 7,00 (s,
1H, CH aromático), 6,86 (d, 1H, J = 8,2, CH aromático), 6,68 (d,
1H, J = 8,2, CH aromático), 4,92 (t, 1H, J = 6,2, propionato de
metina), 4,04 (q, 1H, J = 7,0, glu metina), 3,19 (m, 1H, ciclopentil
metina), 2,95 (d, 2H, J = 6,4, ArCH_{2}), 2,33 (t, 2H, J = 7,4,
glu 4-CH_{2}), 2,00-1,48 (m, 12H,
glu 3-CH_{2}, NH_{2}, ciclopentil CH_{2}),
1,39 (s, 9H, t-Bu), 1,31 (s, 9H,
t-Bu).
De acuerdo con el ejemplo 154, se acoplaron 0,414
g de 2-((5-O-terc-butil-
L-glutam-1-il)oxi)-3-(3-ciclopentil-4-hidroxifenil)propionato
de (S)-terc-butilo con 0,32 g de hemiclorhidrato del
ácido
4-(N-(2,4-diamino-6-pteridinilme-
til)-N-metilamino)benzoico dihidrato usando 0,19 ml de DECP, 0,23 ml de Et_{3}N y 25 ml de DMF. El producto bruto se sometió a cromatografía ultrarrápida dos veces sobre gel de sílice (14:14:1 de CH_{2}Cl_{2}:acetona:MeOH; 95:5 \AE 91:9 de CH_{2}Cl_{2}:MeOH) para producir 0,46 g (69%) de 3-(3-ciclopentil-4-hidroxifenil)-2-((5-O-terc-butil-(4- (((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il)oxi)propionato de (S)-terc-butilo en forma de un polvo amarillo, p.f. 135-137ºC.
til)-N-metilamino)benzoico dihidrato usando 0,19 ml de DECP, 0,23 ml de Et_{3}N y 25 ml de DMF. El producto bruto se sometió a cromatografía ultrarrápida dos veces sobre gel de sílice (14:14:1 de CH_{2}Cl_{2}:acetona:MeOH; 95:5 \AE 91:9 de CH_{2}Cl_{2}:MeOH) para producir 0,46 g (69%) de 3-(3-ciclopentil-4-hidroxifenil)-2-((5-O-terc-butil-(4- (((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il)oxi)propionato de (S)-terc-butilo en forma de un polvo amarillo, p.f. 135-137ºC.
^{1}H-RMN: (200 NHz,
DMSO-d_{6}) \delta 9,07 (s, 1H, OH), 8,55 (s,
1H, pteridinil 7-CH), 8,30 (d, 1H, J = 7,6, amida
NH), 7,71 (d, 2H, J = 8,6, CH aromático), 7,64 (s a, 1H, NH_{2}),
7,42 (s a, 1H, NH_{2}), 6,97 (d, 1H, J = 1,6, CH aromático), 6,80
(m, 3H, CH aromático), 6,59 (m, 3H, CH aromático, NH_{2}), 4,92
(t, 1H, J = 6,1 propionato metina), 4,77 (s, 2H,
pteridinil-CH_{2}), 4,49 (m, 1H, glu metina), 3,19
(s, 3H, N-CH_{3}), 3,12 (m, 1H, ciclopentil
metina), 2,93 (m, 2H, ArCH_{2}), 2,33 (t, 2H, J = 7,2, glu
4-CH_{2}), 2,08 (m, 1H, glu
3-CH_{2}), 1,87 (m, 3H, glu
3-CH_{2}, ciclopentil CH_{2}),
1,77-1,40 (m, 6H, ciclopentil CH_{2}), 1,36 (s,
9H, t-Bu), 1,25 (s, 9H, t-Bu).
De acuerdo con el ejemplo 50, se trataron 0,43 g
de
3-(3-ciclopentil-4-hidroxifenil)-2-((5-O-terc-butil-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il)oxi)propionato
de (S)-terc-butilo con HCl gaseoso en 50 ml de
CH_{3}NO_{2} durante 45 min. La suspensión amarilla se concentró
al vacío a sequedad. El producto se suspendió en 25 ml de agua y se
trató con suficiente NaOH acuoso 1 N para dar una solución
completa. La solución se filtró y el pH se ajustó a 5,5 por la
adición de HCl 1 N. Se produjo un precipitado amarillo que se
separó por centrifugación, se lavó con cuatro ciclos de suspensión
acuosa-centrifugación-decantación,
se congeló y se liofilizó para producir 0,345 g (88%) de ácido
(S)-3-(3-ciclopentil-4-hidroxifenil)-2-((N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il)oxi)propiónico
en forma de un polvo amarillo-naranja, p.f. 165ºC
(desc.).
HPLC: un pico sobre C18, k' = 2,02; se
detectó un 3,6% de metotrexato a k' = 0,09; 70:30,0,1 de
H_{2}O:MeCN:TFA, caudal = 1 ml/min.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 12,40-11,90
(s a, COOH), 9,03 (s a, 1H, OH), 8,57 (s, 1H, pteridinil
7-CH), 8,27 (d, 1H, J = 7,6, amida NH), 7,86 (s a,
1H, NH_{2}), 7,70 (d, 2H, J = 8,9, CH aromático), 7,65 (s a, 1H,
NH_{2}), 6,97 (d, 1H, J = 1,6, CH aromático), 6,80 (m, 5H,
NH_{2}, CH aromático), 6,61 (d, 1H, J = 8,2, CH aromático), 4,96
(t, 1H, J = 5,6, metina), 4,78 (s, 2H,
pteridinil-CH_{2}), 4,49 (m, 1H, metina), 3,19 (s,
3H, N-CH_{3}), 3,16 (m, 1H, ciclopentil metina),
2,94 (d, 2H, J = 5,8, ArCH_{2}), 2,34 (t, 2H, J = 7,5, glu
4-CH_{2}), 2,10 (m, 1H, glu
3-CH_{2}), 1,87 (m, 3H, glu
3-CH_{2}, ciclopentil CH_{2}),
1,78-1,40 (m, 6H, ciclopentil CH_{2}).
Análisis Elemental: Calc. para
C_{34}H_{38}N_{8}O_{8}\cdot2,1 H_{2}O (PM 724,56): C,
56,36; H, 5,87; N,15,47. Encontrado: C, 56,13; H, 5,59; N,
15,46.
Espectro de Masas: (Nebulización Iónica)
687 (M+H)^{+}.
Espectro UV: (tampón pH 7) \lambda_{max}
(\varepsilon) 259,2 (23100), 307,3 (23300), 372,4 (7190).
\lambda_{min} (\varepsilon) 242,0 (14300),
272,9 (16900), 343,6 (5460). sh (\varepsilon) 219,8 (26400),
280,7 (19900).
A un matraz de 500 ml de 3 bocas, equipado con un
agitador magnético, una entrada de nitrógeno y un condensador, se le
añadieron 10,0 g de ácido
3-terc-butil-4-hidroxibenzoico
(ICN Biomedicals. Inc., Aurora, Ohio 44202) y 200 ml de MeOH. La
solución se acidificó burbujeando gas HCl a su través durante 5 min
y después se calentó a reflujo durante 5 h. La solución se enfrió a
TA y se concentró al vacío a sequedad. El sólido resultante se
disolvió en EtOAc. La solución se lavó tres veces con NaOHC_{3}
acuoso al 5%, se secó sobre MgSO_{4} anhidro y se concentró a
sequedad para producir 9,65 g (90%) de
3-terc-butil-4-hidroxibenzoato
de metilo en forma de un sólido blanco cristalino, p.f.
144-145ºC.
De acuerdo con el ejemplo 183, se sililaron 5,00
g de
3-terc-butil-4-hidroxibenzoato
de metilo usando 4,34 g de cloruro de
terc-butildimetilsililo, 3,59 g de imidazol y 70 ml de DMF
anhidra. El producto bruto se purificó por cromatografía
ultrarrápida sobre gel de sílice (9:1 de hexano:EtOAc) para producir
6,1 g (79%) de
3-terc-butil-4-((terc-butildimetilsilil)oxi)benzoato
de metilo en forma de un líquido transparente.
^{1}H-RMN: (200 NHz,
DMSO-d_{6}) \delta 7,89 (d, 1H, J = 2,3, CH
aromático), 7,76 (dd; 1H; J = 8,5, 2,3, CH aromático), 6,98 (d, 1H,
J = 8,4, CH aromático), 3,82 (s, 3H, CO_{2}CH_{3}), 1,37 (s, 9H,
t-Bu), 1,03 (s, 9H,
Si-t-Bu), 0,37 (s, 6H,
SiMe_{2}).
De acuerdo con el ejemplo 184, se redujeron 5,00
g de
3-terc-butil-4-((terc-butildimetilsilil)oxi)benzoato
de metilo usando 31,8 ml de hidruro de diisobutilaluminio 1
M/tolueno y 50 ml de tolueno anhidro. El análisis de la mezcla de
reacción por tlc después de 30 min indicó que aún quedaba algo de
material de partida. Para asegurar la reducción completa, se
añadieron 5 ml más de hidruro de diisobutilaluminio 1 M/tolueno y
la reacción se dejó continuar durante 5 min más. El tratamiento de
la forma habitual produjo 4,11 g (90%) de
3-terc-butil-4-((terc-butildimetilsilil)oxi)bencil
alcohol en forma de un aceite turbio. El producto se usó sin
purificación adicional.
^{1}H-RMN: (200 NHz,
DMSO-d_{6}) \delta 7,20 (d, 1H, J = 2,0, CH
aromático), 7,04 (dd; 1H; J = 8,2, 2,1; CH aromático), 6,80 (d, 1H,
J = 8,0, CH aromático), 5,01 (t, 1H, J = 5,7, OH), 4,39 (d, 2H,
ArCH_{2}O), 1,36 (s, 9H, t-Bu), 1,02 (s, 9H,
Si-t-Bu), 0,32 (s, 6H,
SiMe_{2}).
Un matraz de fondo redondo de 50 ml equipado con
un agitador magnético se cargó con 3,6 g de
3-terc-butil-4-((terc-butildimetilsilil)oxi)bencil
alcohol y 25 ml de CH_{2}Cl_{2} anhidro. La solución se enfrió
en un baño agua enfriada con hielo y se trató con 5,68 g de
dibromotrifenilfosforano (Aldrich). La mezcla de reacción se calentó
a TA, se agitó durante 2,5 h y después se diluyó con 100 ml de
CH_{2}Cl_{2}. La solución resultante se lavó con NaHCO_{3}
acuoso al 5% (4 x 60 ml), se secó sobre MgSO_{4} anhidro y se
concentró para dar un sólido blanco. El producto bruto se purificó
por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (95:5 de
hexano:EtOAc) para producir 3,86 g (88%) de bromuro de
3-terc-butil-4-((terc-butildimetilsilil)oxi)bencilo
en forma de un sólido blanco cristalino, p.f.
54-55ºC.
De acuerdo con el ejemplo 142, se alquilaron 3,82
g
(2R,3S)-(-)-6-oxo-2,3-difenil-4-morfolinacarboxilato
de terc-butilo con 3,86 g de bromuro de
3-terc-butil-4-((terc-butildimetilsilil)oxi)bencilo
en 80 ml de THF anhidro usando 11,34 ml de
bis(trimetilsilil)amida sódica 1 M en THF. El producto
bruto se sometió a cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice
(85:15 de hexano:EtOAc) para producir 4,85 g (71%) de
(2R,3S,5S)-6-oxo-2,3-difenil-5-(3-terc-butil-4-((terc-butildimetilsilil)oxi)bencil)-4-morfolinacarboxilato
de terc-butilo, en forma de una espuma blanca, p.f.
75-83ºC.
A un matraz de 250 ml de 3 bocas, equipado con
una entrada de nitrógeno y un agitador magnético, se le añadieron
4,51 g de
(2R,3S,5S)-6-oxo-2,3-difenil-5-(3-terc-butil-4-((terc-butildimetilsilil)oxi)bencil)-4-morfolinacarboxilato
de terc-butilo y 50 ml de THF anhidro. La solución se enfrió
en un baño de agua enfriada con hielo, se trató con 7,51 ml de
nBu_{4}NF 1 M/THF (Aldrich) y después se dejó calentar a TA con
agitación en una atmósfera de nitrógeno. Después de 1,5 h, la tlc
(SiO_{2}, 85:15 de hexano:EtOAc) indicó que no quedaba material de
partida y un único nuevo componente a R_{f} = 0,52. La solución se
diluyó con 125 ml de EtOAc, se lavó con agua (4 x 100 ml), se secó
sobre MgSO_{4} y se concentró para dar un aceite transparente
viscoso. El análisis del espectro de masas (APCI) indicó el
intermedio deseado con m/e = 538 (M+H+Na)^{+}. El aceite se
disolvió en 50 ml de CH_{2}Cl_{2} y la solución se trató con 15
ml de TFA. Después de agitar durante 40 min, la tlc (SiO_{2},
65:35 de hexano:EtOAc) indicó un único nuevo componente a R_{f} =
0,36. La solución se neutralizó por la adición de NaHCO_{3} acuoso
saturado. La mezcla se transfirió a un embudo de decantación y las
capas se separaron. La solución de CH_{2}Cl_{2} se lavó con más
NaHCO_{3} saturado (3 x 50 ml), se secó sobre MgSO_{4} y se
concentró al vacío para dar una espuma transparente. El producto
bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida (SiO_{2} 7:3 de
hexano:EtOAc) para producir 2,66 g (89%) de
(2R,3S,5S)-6-oxo-2,3-difenil-5-(3-terc-butil-4-hidroxibencil)morfolina
en forma de una espuma blanca, p.f. 76-80ºC.
A un recipiente Parr de 300 ml se le añadieron
0,73 g de PdCl_{2} y 20 ml de 1:1 de THF:EtOH. A esto se le
añadió una solución de 2,43 g de
(2R,3S,5S)-6-oxo-2,3-difenil-5-(3-terc-butil-4-hidroxibencil)morfolina
en 80 ml de 1:1 de THF:EtOH. La mezcla se desoxigenó burbujeando
nitrógeno a su través durante 10 min y se hidrogenó a 45 psi
(310,26 kPa) durante 18 h. El recipiente se purgó con nitrógeno, el
catalizador se retiró por filtración y el filtrado se concentró al
vacío. El residuo se repartió entre agua y hexano. La solución
acuosa se lavó con cuatro porciones más de 50 ml de hexano, se
sometió durante un corto espacio de tiempo a evaporación rotatoria
para retirar el hexano residual, se congeló y se liofilizó para
producir 1,47 g (92%) de
3-terc-butil-L-tirosina\cdotHCl
en forma de un sólido higroscópico castaño.
^{1}H-RMN: (200 NHz,
DMSO-d_{6}) \delta 9,40 (s a, 1H, OH), 8,36 (s
a, 3H, NH_{3}^{+}), 7,04 (s, 1H, CH aromático), 6,91 (d, 1H, J
= 8,2, CH aromático), 6,78 (d, 1H, J = 8,2, CH aromático), 4,05 (m,
1H, metina), 3,02 (d, 2H, J = 5,6, ArCH_{2}), 1,34 (s, 9H,
t-Bu).
A un matraz de fondo redondo de 250 ml equipado
con un agitador magnético se le añadieron 30 ml de isobutileno
(condensado a -78ºC), 1,30 g de
3-terc-butil-L-tirosina\cdotHCl,
60 ml de 1,4-dioxano y 0,5 ml de H_{2}SO_{2}
concentrado. El matraz se cerró herméticamente con un tabique de
caucho y un cierre de red metálica. Después de agitar a TA durante
18 h, el matraz se ventiló y los contenidos se vertieron en una
solución de 10 g de NaHCO_{3} en 150 ml de agua. La mezcla se
sometió a evaporación rotatoria para retirar el isobutileno. Se
produjo una emulsión que se extrajo con EtOAc (4 x 40 ml). Los
extractos combinados se lavaron con NaHCO_{3} acuoso al 5% (3 x 50
ml), se secaron sobre MgSO_{4} anhidro y se concentraron para dar
una espuma de color amarillo claro. El análisis del producto por tlc
(SiO_{2}, 95:5 de CH_{2}Cl_{2}:MeOH) indicó componentes
mayoritarios y minoritarios a R_{f} = 0,45 y 0,49 respectivamente.
El producto de R_{f} = 0,45 se aisló por cromatografía
ultrarrápida sobre gel de sílice (95:5 de CH_{2}Cl_{2}:MeOH)
para producir 0,61 g (44%) de
3-terc-butil-L-tirosinato de
terc-butilo en forma de una espuma blanca, p.f.
43-52ºC.
De acuerdo con el ejemplo 145, se acoplaron 0,57
g de
3-terc-butil-L-tirosinato de
terc-butilo con 0,66 g de \gamma-terc-butil éster
del ácido N-Cbz-L-glutámico
(Sigma) usando 0,39 g de EDC en 20 ml de CH_{2}Cl_{2} durante 4
h. El producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida
sobre gel de sílice (65:35 de hexano:EtOAc) para producir 0,99 g
(83%) de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-terc-butil-L-tirosinato
de terc-butilo en forma de un espuma blanca, p.f.
62-66ºC.
De acuerdo con el ejemplo 48, se hidrogenaron
0,93 g de
N-((benciloxi)carbonil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-terc-butil-L-tirosinato
de terc-butilo usando 0,15 g de Pd(C) al 10% en 70 ml
de MeOH durante 3,5 h. El producto se sometió a cromatografía
ultrarrápida sobre gel de sílice (EtOAc) para producir 0,63 g (87%)
de
5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-terc-butil-L-tirosinato
de terc-butilo en forma de un aceite transparente
viscoso.
^{1}H-RMN: (200 NHz,
DMSO-d_{6}) \delta 9,17 (s, 1H, OH), 8,11 (d,
1H, J = 7,8, NH), 6,96 (d, 1H, J = 1,7, CH aromático), 6,84 (dd;
1H; J = 8,1, 1,9; CH aromático), 6,68 (d, 1H, J = 8,0, CH
aromático), 4,33 (m, 1H, metina), 3,14 (m, 1H, metina), 2,84 (d, 2H,
J = 7,0, ArCH_{2}), 2,23 (t, 2H, J = 7,9, glu
4-CH_{2}), 1,88-1,46 (m, 4H, glu
3-CH_{2}, NH_{2}), 1,40 (s, 9H,
t-Bu), 1,33 (s ,18H, t-Bu).
De acuerdo con el ejemplo 154, se acoplaron 0,320
g de
5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-terc-butil-L-tirosinato
de terc-butilo con 0,254 g de hemiclorhidrato del ácido
4-(N-(2,4-diamino-6-pteridinilmetil)-N-metilamino)benzoico
dihidrato usando 0,15 ml de DECP, 0,19 ml de Et_{3}N y 20 ml de
DMF. El producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida
sobre gel de sílice (7:7:1 de CH_{2}Cl_{2}:acetona:MeOH) para
producir 0,32 g (61%) de
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-terc-butil-L-tirosinato
de terc-butilo en forma de un polvo amarillo, p.f. 125ºC
(desc.).
De acuerdo con el ejemplo 50, se trataron 0,287 g
de N-(4-(((2,4-Diamino-
6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-5-O-terc-butil-L-glutam-1-il-3-terc-butil-L-tirosinato
de terc-butilo con HCl gaseoso en 55 ml de CH_{3}NO_{2}
durante 1 h. La suspensión se concentró al vacío para dar un polvo
amarillo. Este material se suspendió en 30 ml de agua y se trató
con suficiente NaOH acuoso 1 N para completar la solución. La
solución amarilla se filtró y se acidificó a pH = 5,5 por la adición
de HCl acuoso 1 N. El precipitado amarillo resultante se separó por
centrifugación, se lavó con cuatro ciclos de suspensión
acuosa-centrifugación-decantación,
se congeló y se liofilizó para producir 0,178 g (68%) de
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-terc-butil-L-tirosina
en forma de un polvo amarillo, p.f. 185ºC (desc.).
HPLC: un pico sobre C18, k' = 3,14,
75:25,0,1 H_{2}O:MeCN:TFA, caudal = 1 ml/min.
^{1}H-RMN: (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 12,80-11,80
(s a), 9,09 (s, 1H, OH), 8,55 (s, 1H, pteridinil
7-CH), 8,01 (d, 1H, J = 7,9, amida NH), 7,97 (d, 1H,
J = 8,1, amida NH), 7,78 (s a, 1H, NH_{2}), 7,68 (d, 2H, J = 8,9,
CH aromático), 7,57 (s a, 1H, NH_{2}), 6,93 (d, 1H, J = 1,6, CH
aromático), 6,85-6,64 (m, 5H, CH aromático,
NH_{2}), 6,60 (d, 1H, J = 8,2, CH aromático), 4,77 (s, 2H,
pteridinil-CH_{2}), 4,42 (m, 1H, metina), 4,29 (m,
1H, metina), 3,19 (s, 3H, N-CH_{3}), 2,83 (m, 2H,
ArCH_{2}), 2,23 (t, 2H, J = 7,8, glu 4-CH_{2}),
1,90 (m, 2H, glu 3-CH_{2}), 1,25 (s, 9H,
t-Bu).
Análisis Elemental: Calc. para
C_{33}H_{39}N_{9}O_{7}\cdot2,3 H_{2}O (PM 715,16): C,
55,42; H, 6,14; N,17,53. Encontrado: C, 55,58; H, 5,97; N,
17,47.
Espectro de Masas: (Nebulización Iónica)
674 (M+H)^{+}.
Espectro UV: (tampón pH 7) \lambda_{max}
(\varepsilon) 259,4 (23700), 307,4 (23500), 372,5 (7330).
\lambda_{min} (\varepsilon) 242,8 (14900),
273,0 (17000), 344,7 (5660).sh (\varepsilon) 222,1 (26400), 287,2
(19600).
Se aisló un fragmento de ADNc
Hind-III-Sal I que codificaba la
preprocarboxipeptidasa A1 (CPA1) de rata (Gardell et al.,
Nature, 317:551-555, 1985) a partir de pMP36
proporcionado por el Dr. M. Phillips (UCSF). El ADNc Hind
III-Sal I de 1,2 kb de la CPA1 de rata se radiomarcó
con [^{32}P]dCTP y el kit Prime-it
(Stratagene) y después se usó para seleccionar una biblioteca de
ADNc de páncreas humano de lambda gt11 (Clontech) de acuerdo con el
método de Grunstein y Hogness (Proc. Nat. Acad. Sci 72:
5016-5020, 1975). Después de tres vueltas de
selección se obtuvieron placas aisladas purificadas que hibridaron
con la sonda de ADNc de CPA1 de rata.
Se preparó ADN lambda a partir de las placas
purificadas en cultivos líquidos de crecimiento durante una noche
usando columnas Qiagen y de acuerdo con el protocolo del fabricante
(Qiagen). Se liberaron insertos de ADNc de CPA1 humana a partir del
ADN lambda por digestión con EcoRI y purificación de los insertos de
ADNc por electroforesis en gel de agarosa de bajo punto de fusión.
Los insertos de ADNc EcoRI se clonaron en el sitio EcoRI de pGEM
7z(+) (Promega) y se denominaron plásmidos pHCPA. Después del
crecimiento durante una noche en cultivo líquido, se preparó ADN de
pHCPA usando columnas Qiagen.
La secuenciación del ADN de las placas HCPA1
lambda aisladas y de plásmidos que contenían ADNc de HCPA1 se
realizó con [^{35}S]dATP y el sistema de secuenciación
fmol (Promega). Inicialmente se usaron cebadores oligonucleotídicos
que flanqueaban el sitio de clonación de lambda gt11 o los
múltiples sitios de clonación de pGEM 7(+) y el vector TA
(Invitrogen) para determinar la secuencia de ADNc. Se sintetizaron
cebadores oligonucleotídicos que correspondían a regiones de la
secuencia determinada, que permitieron determinar la secuencia de
ADNc entera de las dos cadenas de HCPA1 (Sec ID 1).
La carboxipeptidasa A2 (CPA2) humana se clonó a
partir de una biblioteca de ADNc de páncreas humano construida en
lambda gt11 (Clontech). La sonda usada fue un fragmento de 1198
bases de la CPA2 de rata. Esta sonda se amplificó a partir de ADNc
de páncreas de rata QUICK-Clone (Clontech) usando
PCR. El cebador cadena arriba correspondía a la secuencia entre las
posiciones 12-33 en la secuencia codificante del
ADNc de rata
(5'-CCTGTTATTGGCTGCCCTACTT-3'),
mientras que el cebador cadena abajo era el complemento a la
secuencia entre las posiciones 1888 y 1209
(5'-AAGCCAGGTCTCTTCTGCTGTC-3')
(Gardell, S.J. J. Biol. Chem 263 17828 (1988)). Las
condiciones de PCR convencionales fueron una preincubación a 94ºC
seguida de 30 ciclos de un minuto a 94ºC, dos minutos a 56ºC y tres
minutos a 72ºC. El producto de PCR de 1198 pb se sometió a
extracción con 100 \mul de cloroformo y la fase acuosa superior
que contenía el ADN se pasó a través de una columna CHROMA
SPIN-100 (Clontech) para retirar los cebadores. La
secuencia del producto de PCR CPA2 de rata se confirmó por
secuenciación del ADN usando los cebadores de PCR como cebadores de
secuenciación. La secuenciación del ADN se realizó con [^{32}P]
dATP usando el kit de secuenciación fmol (Promega).
El ADN de la CPA2 de rata se radiomarcó con
[^{32}P]dCTP y el kit Prime-it II Random
Primer Labelling (Stratagene) y después se usó para seleccionar la
biblioteca de ADNc de páncreas humano. La biblioteca se cultivó
usando la cepa de E. coli Y1090r^{-} en placas de 150 mm
(aproximadamente 10.000 placas/placa de cultivo) y se realizaron
levantamientos duplicados en nitrocelulosa. Los filtros se
bloquearon en solución de hibridación (formamida al 50%, 5X SSPE,
50X solución de Denhardt, SDS al 0,1% y 100 \mug/ml de ADN de
esperma de salmón sonicado) durante 3 horas a 42ºC. Se añadió el
producto de PCR CPA2 de rata marcado y se hibridó con los filtros
durante una noche a 45ºC. Los filtros se lavaron durante 1 hora a
60ºC en 0,1X SSC y SDS al 0,1% y se expusieron a una película de
auto-radiografía mientras estaban húmedos. Se
seleccionó una placa duplicada de cada placa de cultivo y se sometió
a otra vuelta de selección como se ha descrito anteriormente.
Después de la segunda vuelta se selección se seleccionaron placas
positivas y el tamaño del ADN del inserto de lambda gt11 se
determinó usando PCR. Como cebadores de PCR cadena arriba y cadena
abajo se usaron, respectivamente, los cebadores de secuenciación de
avance e inverso de lambda gt11 (Clontech) que flanqueaban el sitio
de clonación EcoRI de lambda gt11. Se seleccionaron placas bien
aisladas, con una porción suspendida en 10 \mul de agua, y se
calentaron a 95ºC durante 5 minutos, usándose el resto para obtener
una solución madre de fago para una selección posterior. Los 10
\mul que contenían el ADN de las placas se usaron directamente
como molde en PCR usando las condiciones descritas
anteriormente.
El ADN del inserto amplificado se visualizó en
geles de agarosa y las dos placas que proporcionaban el mayor
inserto de ADN se seleccionaron por tercera vez. El ADN de lambda
de las dos placas se aisló y secuenció en las dos direcciones usando
el kit fmol (Promega) y los cebadores de avance e inverso de lambda
gt11 (Clontech). Un clon contenía regiones muy homólogas a las
regiones 5' y 3' de la CPA2 de rata y se eligió para un estudio
adicional.
El ADNc del inserto se liberó del ADN de lambda
por digestión con EcoRI, se purificó en gel y se clonó en el sitio
EcoRI del vector pGEM-7Zf(+) (Promega). La
secuenciación se realizó usando [^{33}P] dATP y el kit fmol
(Promega) como se ha descrito anteriormente. Se sintetizaron
cebadores oligonucleotídicos que correspondían a regiones de la
secuencia determinada, lo que permitió determinar la secuencia
entera del ADNc de hCPA2. Se descubrió que el ADNc contenía una fase
de lectura abierta que codificaba una proteína de 417 aminoácidos.
Esta proteína comparte una identidad de 87% con la CPA2 de rata a
nivel de los aminoácidos y una identidad de 85% a nivel del ADNc.
Esta proteína comparte una identidad de 63% con la CPA1 humana tanto
a nivel de los aminoácidos como a nivel de los nucleótidos. De esta
manera, la proteína se clasificó como carboxipeptidasa A2 humana.
La Tabla 4 muestra una comparación entre las secuencias de
aminoácidos de la CPA1 y la CPA2 humanas. El esquema de numeración
de aminoácidos usado a lo largo de este documento es el de CPA1.
Todas las mutaciones descritas para CPA1 y CPA2 se refieren a este
esquema de numeración.
\newpage
El tamaño de los insertos de ADNc dentro de las
placas HCPA1 lambda aisladas se determinó usando cebadores
oligonucleotídicos que flanqueaban el sitio de clonación EcoRI de
lambda gt11 y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se
seleccionaron placas aisladas individuales, se suspendieron en 200
\mul de agua y se calentaron a 95ºC durante 5 minutos. Se usaron
10 \mul de cada suspensión para la amplificación por PCR de
acuerdo con las instrucciones del fabricante (Perkin Elmer/Cetus).
Las condiciones de reacción de PCR convencionales constaban de 1
minuto a 95ºC, 0,5 minutos a 50ºC y 3 minutos a 72ºC. Los productos
de reacción se visualizaron después de la electroforesis en gel de
agarosa.
| CPA-11 | 5'-gCT gAA gCT TCg gAg gAC TTT-3' |
| CPA-12 | 5'-TCT TgA CCg CCT ggA TgC Tg-3' |
La expresión de HCPA1 en S. cerevisiae se
basó en la estrategia empleada por Gardell et al (Nature,
317; 551-555, 1985). Se usaron dos cebadores
oligonucleotídicos, CPA 11 y 12, para amplificar un fragmento de 200
pb de pHCPA por PCR como se ha descrito anteriormente. El fragmento
amplificado contenía un nuevo sitio 5' Hind III creado por CPA 11
que permitiría la unión en fase con el líder del factor alfa de
pMP36 como se describe por Phillips et al (J. Biol. Chem,
265; 20692-20698, 1990). El fragmento de PCR se
unió al vector TA (Invitrogen) y la secuencia de ADN entera del
fragmento se determinó como se ha descrito anteriormente. Se
seleccionó una colonia que contenía la alteración 5' deseada para
uso posterior, TAHCPAexp.
El plásmido pHCPA se sometió a digestión de
restricción con Aat II y EcoRI para liberar un fragmento de HCPA1
de 1,1 kb. Este fragmento se purificó siguiendo una electroforesis
en gel de agarosa de bajo punto de fusión y se unió a TAHCPAexp que
se había sometido a digestión de restricción con AatII y EcoRI para
producir el plásmido TAHCPA. TAHCPA se digirió con EcoRI, se trató
con la ADN polimerasa de T4, se añadieron enlazadores Sal I y se
unió al extremo 3' de HCPA1 como se describe por Maniatis
(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press,
1989). TAHCPA, que ahora contenía sitios 5' Hind III y 3' Sal I, se
sometió a digestión de restricción con Hind III y Sal I para
liberar un fragmento de ADNc de HCPA1 de 1,2 kb. Este fragmento se
unió junto con el fragmento grande Hind III y el fragmento pequeño
Hind III-SalI de pMP36 para producir pMP36
HCPA1.
La expresión en levadura de la enzima humana
clonada se basa en el método de Phillips, M. et al, J. Biol.
Chem., 265, 20692 (1990). El plásmido pMP36 que contenía
HCPA1 se sometió a digestión de restricción secuencialmente con
BamHI, SalI y SspI con purificaciones intermedias por extracciones
con fenol o por el uso de Promega Magic Mini Columns con los
procedimientos suministrados por el fabricante. Como alternativa,
puede usarse un sistema tampón
One-Phor-All (Pharmacia) en una
restricción conjunta por las tres enzimas.
Después de la restricción con SspI, la mezcla se
separó en un gel de bajo punto de fusión al 1% proporcionando 5
bandas distintas. La banda de interés a aproximadamente 2,8 kb (la
segunda desde arriba) se escindió del gel y se purificó usando una
columna Elutip-D de Schleicher and Schuell con los
procedimientos suministrados.
El fragmento Bam/Sal/Ssp después se unió al
vector lanzadera pBS24.1 (producido a partir de
pBS24.1-AGC3 proporcionado amablemente por el Dr M
Phillips, UCSF con restricción con BamHI/SalI) durante una noche a
16ºC usando el sistema ligasa de T4 (Gibco BRL). El vector unido se
precipitó con acetato amónico y etanol a -80ºC durante 4 horas y se
resuspendió en 10 \mul de TE.
4 \mul del vector se introdujeron por
electroporación en 40 \mul de E. coli DH5alfa usando un Bio
Rad Gene Pulser a 2000 voltios con un tiempo constante de
aproximadamente 4. Se añadió un ml de caldo de Miller Hinton y la
muestra se incubó a 37ºC durante una hora. Se cultivaron en placas
tres muestras de 100 \mul de cada uno en placas LB que contenían
ampicilina.
Las colonias resultantes se volvieron a cultivar
en placas nuevas. Se inocularon volúmenes de 100 ml de caldo de
Müeller Hinton/ampicilina con colonias y se incubaron durante una
noche a 37ºC. El plásmido se extrajo usando el procedimiento de
extracción Qiagen Maxi.
Se introdujeron por electroporación de
aproximadamente 500 a 2000 ng del ADN del plásmido PBS24.1 extraído
anteriormente en 40 \mul de células de levadura DLM101 alfa
competentes. Inmediatamente después de la electroporación se añadió
1 ml de sorbitol para rescatar las células. Se cultivaron muestras
de 100 \mul en placas de YNB (caldo de nitrógeno de levadura) que
carecía de uracilo y se incubaron a 30ºC. Se seleccionaron clones
positivos. Los transformantes se cultivaron en medio sintético
mínimo (Wickersham, L.J., U.S. Dept. of Agric. Tech. Bull. Nº
1029 (1951), sin leucina durante 48 horas. Este cultivo después se
usó para sembrar un fermentador de 350 litros.
Un cultivo de 350 l de S. cerevisiae
productor de proCPA (T268G/p2619) se dejó crecer en un fermentador
New Brunswick de 500 l durante 65 horas a 30ºC con un flujo de aire
de 175 lpm, una presión superior de 5 psig (34,47 kPa) y una
agitación de 150 rpm. El medio contenía extracto de levadura al 1%
(Difco), triptona al 2% (Difco), glucosa al 1%, KPO4_{4} 20 mM,
pH 7,5, 50 \mug/ml de ampicilina y agente antiespumante Mazu DF
60P al 0,007% (v/v) (Mazei' Chemicals, Inc.). La DO_{600} final
fue de 14. Después de enfriar a 15-20ºC, las células
se retiraron del medio por filtración de flujo cruzado en un
sistema Sartorius Sartocon II equipado con 7 unidades de filtro de
poliolefina de 0,6 m^{2}. La proteína presente en el medio se
concentró con filtros de flujo cruzado 10K MWCO y el fluido se
cambió por diafiltración con Tris-Cl 20 mM, pH 8,
Zn-acetato 0,1 mM (tampón A). Todos los tampones
posteriores contenían Zn-acetato 0,1 mM. Se añadió
sulfato amónico (AS) a una concentración de 0,5 M al concentrado 10
K y se introdujo en una columna de Phenyl-Sepharose
de flujo radial de 250 ml equilibrada en tampón A con AS 0,5 M. La
proCPA se eluyó con 1,5 l de un gradiente de AS de
0,5-0 M seguido de un lavado con tampón A. El
procedimiento de Phenyl-Sepharose se repitió con el
material eluido para recuperar la proCPA no unida del primer ensayo.
Se reunieron las fracciones que contenían proCPA y se concentraron
y dializaron en un filtro Sartorius 10 K Easy Flow (0,2 m^{2}) en
tampón A. Esto se introdujo en una columna Hi Load 26/10
Q-Sepharose High Performance (Pharmacia) (53 ml) y
se eluyó con 1 litro de gradiente de NaCl de 0-0,5
M en tampón A. La proCPA eluyó entre NaCl 120-220 mM
con el pico a \sim150 mM. Se reunieron las fracciones que
contenían proCPA y la proCPA se escindió con tripsina (2 \mug/ml)
a 37ºC durante 1 h para dar proCPA madura. Se añadió PMSF (0,5 mM) y
el conjunto se dializó en tampón A. La etapa de
Q-Sepharose HP se repitió y la CPA activada eluyó
entre 80-140 mM con el pico a 120 mM. Los
experimentos de IEF previos han demostrado que la proCPA tiene un
pI = 4,75. mientras que la CPA madura tiene un pI = 6,2. Las
fracciones de CPA se reunieron y se concentraron con 10 K
Centripreps (Amicon) a 15 ml y se pasaron a través de una columna
HiLoad 26/60 Superdex 75 (Pharmacia) en 3 ensayos (5 ml cada uno).
El tampón de elución era tampón A con NaCl 150 mM. Las fracciones
de CPA se reunieron, se concentraron con 10 K Centripeps y se
cambiaron con PBS de Sigma que contenía Zn-acetato
0,1 mM. El volumen final (15 ml) se pasó a través de un filtro de
jeringa de 0,2 \mum y se almacenó a 4ºC. La proteína tenía una
concentración de 24,5 mg/ml por el ensayo de Lowry usando patrones
de BSA. La actividad específica para una preparación típica del
mutante con Gly en 268 fue de 163 u/mg. Proteína total = 368
mg.
La expresión de HCPA2 en S. cerevisiae
empleó la misma estrategia descrita para HCPA1 (Ejemplo 208) con
las siguientes excepciones: 1) los cebadores de PCR usados para
introducir el nuevo sitio 5' Hind III fueron:
Levadura 1: 5'-gCA gAA gCT TCA
gAA ACg TTT gTg ggA gAT CAA gTTCTT gAg ATT gTA
CC-3'
Levadura 2: 5'-CTC TTT gTC CAA
CAg gAC CTg-3'
2) se usó un sitio Hinc II en lugar de Aat II
para subclonar el fragmento de PCR mutagénico en el extremo 5' del
ADNc de HCPA2, y 3) el producto de PCR clonado se cortó del vector
TA y se subclonó en el vector pGEM-7Zf(+) que
contenía el ADNc de HCPA2. La PCR se realizó con los cebadores
LEVADURA 1 y 2 como se ha descrito para HCPA1. El producto de PCR
mutagénico se clonó en el vector TA y se confirmó la secuencia. Este
fragmento se cortó a partir del vector TA usando Hind III y Hinc II
y se clonó en los sitios correspondientes de pHCPA2 denominándose la
construcción resultante pHCPA2-Y. El único sitio 3'
Eco RI de pHCPA2-Y se cambió por un sitio Sal I
usando enlazadores como se ha descrito anteriormente, denominándose
la construcción resultante pHCPA2-YSal I. El
fragmento Hind III/Sal I de HCPA2 de 1,2 kb obtenido a partir de
pHCPA2-YSal I se escindió del vector y se unió junto
con el fragmento grande Hind III/Sal I de pMP36 (Phillips, M. et
al, J. Biol. Chem, 265, 20692-20698
(1990)) para producir pMP36HCPA2.
La expresión en levadura del clon HCPA2 fue como
se ha descrito anteriormente para HCPA1 (Ejemplo 144). La CPA2
humana tiene dos sitios Bam HI internos no presentes en la CPA1
humana, de forma que se necesitaba una digestión parcial para la
etapa de subclonación final. pMP36HCPA2 se digirió completamente con
Sal I y se digirió parcialmente con Bam HI (como se ha descrito
anteriormente) para producir el fragmento de 2,7 kb que contenía la
alcohol deshidrogenasa/promotor de GADPH y la región reguladora
(promotor A/G) unida a la CPA2 humana fusionada en fase con el
líder del factor \alpha de levadura. Este fragmento se unió al
sitio Sal I/Hind III de pBS24.1 formando pBSHCPA2. La construcción
se amplificó en DH5\alpha y se introdujo en levadura por
electroporación como se ha descrito anteriormente (Ejemplo 208).
Se usó un cultivo de una noche (crecimiento en
medio Leu^{-}) de S. cerevisiae que expresaba proCPA2 para
iniciar 2 l de cultivo en extracto de levadura al 1% (Difco),
triptona al 2% (Difco), glucosa al 1%, KPO_{4} 20 mM, pH 7,5 y 50
\mug/ml de ampicilina. El cultivo se dejó crecer durante 48 horas
a 30ºC y el sobrenadante se aclaró por centrifugación a 6000 X g
durante 10 minutos a 4ºC. La proteína presente en el sobrenadante se
concentró en una membrana Amicon PM-10
Ultrafiltration hasta 114 ml. EL sobrenadante concentrado se llevó
a Tris-HCl 20 mM (pH 8,0),
Zn-acetato 0,1 mM y sulfato amónico 0,5 M y se
introdujo en una columna de 1,8 X 20 cm de Phenyl- Sepharose
(Pharmacia) equilibrada en tampón A con sulfato amónico 0,5 M. La
proteína se eluyó con un gradiente lineal de 120 ml (1 ml/min) de
tampón B (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5,
Zn-acetato 0,1 mM) con sulfato amónico 0,5 M a
tampón B con etanol al 20% (v/v). Se reunieron las fracciones que
contenían actividad carboxipeptidasa y se dializaron frente a
tampón B. El conjunto dializado se introdujo en una columna HR 5/5
(1 ml) Mono Q (Pharmacia) y se eluyó con un gradiente lineal de 30
ml (1 ml/min) de NaCl 0-0,5 M en tampón B. Se
reunieron las fracciones que contenían actividad carboxipeptidasa y
se dializaron frente a tampón B. La proCPA2 reunida se activó con
tripsina (10 \mug/ml) a 37ºC durante 1 hora y la tripsina se
inactivó añadiendo PMSF a una concentración 0,5 mM. La CPA2 madura
se dializó frente a tampón B, se introdujo de nuevo en la columna
de 1 ml Mono Q (Pharmacia) y se eluyó como se ha indicado
anteriormente. Se reunieron las fracciones que contenían actividad
carboxipeptidasa, se dializaron frente a tampón B y se concentraron
diez veces en una celda de Ultrafiltración Amicon usando una
membrana PM-10. La CPA2 madura concentrada se
introdujo en una columna HR 10/30 Superose 12 (25 ml) y se eluyó
isocráticamente (0,4 ml/min) en solución salina tamponada con
fosfato (Na_{2}HPO_{4} 10 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,2). Para la
HCPA2 de tipo silvestre, la concentración de proteína fue de 0,65
mg/ml (4,13 mg total) y para la mutación 268 Gly la concentración
fue de 0,3 mg/ml (4,47 mg total) como se determina con el Micro BCA
Assay (Pierce Chemical Co.) usando patrones de BSA.
Las mutaciones A250G y T268G de HCPA2 se
construyeron como se ha descrito anteriormente (Ejemplo 149) para
las formas mutantes de HCPA1 usando el kit de mutagénesis in
vitro T7-Gen (United States Biochemical, Nº
74500). A continuación se muestran los cebadores oligonucleotídicos
mutagénicos (Oligos Etc.) para mutar la A250 (gCC) y la T268 (ACC)
a Gly (ggC):
A250G 5' - TCC TCC ACT gCC TTg gTA gAT -
3' Gly = ggC
T268G 5' - CAg TTC AAA gCC AAA TgA gTA -
3' Gly = ggC
Los codones mutagénicos están subrayados.
Usando estos cebadores oligonucleotídicos, se
produjeron las siguientes formas mutantes de HCPA2:
- 1. A250G
- 2. T268G
Cada uno de los cassettes de HCPA2 mutagenizados
anteriores se secuenció para verificar que sólo se habían producido
las mutaciones de ADN deseadas. Los cassettes mutagenizados se
subclonaron en pMP36HCPA2, que podía procesarse adicionalmente para
la expresión en S. cerevisiae usando los métodos descritos
en el ejemplo 152.
Se combinaron 2 mg de carboxipeptidasa A mutante
con 0,15 mg de Sulfo-SMCC (Pierce Chemical Co) en
475 \mul de Solución Salina Tamponada con Fosfato de Dulbecco
(PBS). La solución resultante se agitó durante 45 minutos a 25ºC. La
enzima modificada se purificó a través de una columna media de 1 x
13 cm G-25 equilibrada con PBS. El producto
purificado puede almacenarse a 4ºC durante 24 horas.
El contenido de maleimida se determinó combinando
0,5 ml de enzima modificada 6,3 \muM con 6 \mul de
mercaptoetanolamina 1 mM. Después de 30 minutos, se añadieron 20
\mul de reactivo de Ellman a una concentración de 4 mg/ml, y
después de otros 20 minutos se determinó la absorbancia a 412 nm.
Basándose en una capacidad de absorción molar de 13,6 mM^{-1}, se
descubrió que el producto purificado contenía una maleimida por
molécula de enzima. La modificación no tuvo ningún efecto sobre la
actividad enzimática.
El anticuerpo se modificó con
2-iminotiolano (Pierce Chemical Co). Se combinaron
0,35 mg de solución de anticuerpo con 0,055 mg de
2-iminotiolano en
trietanolamina-HCl 0,1 M, EDTA 2 mM, pH 8,0, en
condiciones anaerobias, y se hicieron reaccionar con agitación
durante 1 hora y 45 minutos. El anticuerpo modificado se purificó a
través de una columna media G-25 de 1 x 13 cm
equilibrada con acetato sódico 0,02 M, NaCl 0,1 M, pH 5,8,
burbujeada y mantenida bajo una atmósfera de He. La solución de
anticuerpo modificado purificada se recogió directamente en la
solución de carboxipeptidasa A modificada. La solución resultante
se ajustó a pH 7,4 con NaOH, se hico anaerobia y se dejó
reaccionar, con agitación, a 4ºC durante 18 horas. (Opcionalmente
pueden retirarse los grupos maleimida libres por reacción de la
solución con mercaptoetanolamina 0,3 mM a temperatura ambiente
durante 1 hora). La solución se concentró a 1 ml. El conjugado
concentrado resultante se purificó de los agregados, enzimas sin
reaccionar y moléculas pequeñas por cromatografía en Superose 12 HR
10/30. Se descubrió que la actividad específica de la enzima del
conjugado era apropiada para un conjugado de uno a uno con
anticuerpo. Se descubrió que tanto el porcentaje de
inmunorreactividad del anticuerpo (Campath-IH® o
ING-1) como la afinidad de unión al antígeno del
conjugado eran altos.
La enzima se modificó por el protocolo descrito
anteriormente para el Ejemplo 4, mientras que el anticuerpo se
modificó con ditiotreitol. Se combinaron 0,7 mg de solución de
anticuerpo con 0,035 \mumol de ditiotreitol en 350 \mul de
trietalonamina-HCl 0,1 M, EDTA 2 mM, pH a 8,0 en
condiciones anaerobias y se hicieron reaccionar con agitación
durante 1 hora. El anticuerpo modificado se purificó a través de una
columna media G-25 de 1 x 13 cm equilibrada con
acetato sódico 0,02 M, NaCl 0,1 M, pH 5,8, burbujeada y mantenida
bajo una atmósfera de He. La solución de anticuerpo purificada se
recogió directamente en la solución de carboxipeptidasa A
modificada. La solución resultante se ajustó a pH 7,4 con NaOH, se
hizo anaerobia y se dejó reaccionar, con agitación, a 24ºC durante
30 minutos y a 4ºC durante 18 horas. Después, la solución se
concentró a 1 ml. El conjugado concentrado resultante se purificó de
los agregados, la enzima que no había reaccionado y las moléculas
pequeñas por cromatografía en Superose 12 HR 10/30. Se descubrió que
la actividad específica de la enzima del conjugado era apropiada
para un conjugado de uno a uno con anticuerpo. Se descubrió que
tanto el porcentaje de inmunorreactividad del anticuerpo como la
afinidad de unión al antígeno eran altos.
La enzima se modificó por el protocolo descrito
anteriormente para el Ejemplo 4, mientras que el anticuerpo se
modificó con SATA (Pierce Chemical Co). Se combinaron 0,225 mg de
solución de anticuerpo con 0,003 \mumol de SATA en un volumen
total de 150 \mul de Solución Salina Tamponada con Fosfato de
Dulbecco (PBS) y se dejaron reaccionar con agitación durante 45
minutos. El anticuerpo modificado se purificó a través de una
columna media G-25 de 1 x 13 cm equilibrada con PBS.
La solución de anticuerpo modificado purificada se mezcló con la
enzima modificada y se hizo anaerobia, se añadieron 300 \mul de
NH_{2}OH 0,5 M anaerobio y la solución se dejó reaccionar, con
agitación, a 25ºC durante 2 horas seguido de 4ºC durante 18 horas.
Los grupos maleimida libres se retiraron haciendo reaccionar la
solución con mercaptoetanolamina 0,3 mM a temperatura ambiente
durante una hora, y la solución después se concentró a 1 ml. El
conjugado concentrado resultante se purificó de los agregados, la
enzima que no había reaccionado y las moléculas pequeñas por
cromatografía en Superose 12 IIR 10/30. Se descubrió que la
actividad específica de la enzima del conjugado era apropiada para
un conjugado de uno a uno con anticuerpo. Se descubrió que la
afinidad de unión al antígeno del anticuerpo era alta.
Se sometió a digestión de restricción pMP36 que
contenía ADNc de proHCPA1 de tipo silvestre (WT) (como una fusión
con el líder del factor alfa de levadura descrito anteriormente)
con Nco I y Sal I para liberar un fragmento de ADNc de 481 pb. Este
fragmento comienza en el nucleótido 893, sigue con el extremo 3' del
ADNc de HCPA1 y codifica los aminoácidos 186-309 de
la HCPA1 madura. El fragmento Nco I-Sal I de HCPA1
se unió a los sitios de clonación Nco I y Sal I de pGEM5zf(-)
(Promega) para generar pHCPAINS (Figura 3). pHCPAINS después se
sometió a digestión de restricción con Sph I y Sal I para liberar
el fragmento Nco I-Sal I de HCPA1 y la secuencia
adicional (9 pb) de pGEM5zf(-). Este fragmento Sph
I-Sal I se clonó en M13mp19 (BRL) usando sus sitios
de clonación Sph I y Sal I para generar M13mp19HCPA1 (Figura 4).
Como molde para la mutagénesis dirigida a
oligonucleótidos se usó ADN monocatenario de M13mp19HCPA1 usando el
kit de mutagénesis in vitro T7-GEN (United
States Biochemical, Nº 74500). Se usaron los cebadores
oligonucleotídicos mutagénicos (Oligos Etc) indicados a continuación
para mutar los restos I255 (ATT) y T268 (ACC) por separado o en
tándem.
| 1. | I255A 5' - ggT CCA gTC AgC AgT gCT TCC - 3' Ala = gCT |
| 2. | T268A 5' - gAg CTC gAA ggC gAA ggA gTA - 3' Ala = gCC |
| 3. | T268G 5' - gAg CTC gAA gCC gAA ggA gTA - 3' Gly = ggC |
Los codones mutagénicos están subrayados.
Usando estos cebadores oligonucleotídicos, se
produjeron las siguientes formas mutantes de HCPA1:
- 1. I255A
- 2. T268A
- 3. T268G
- 4. I255A/T268A
Cada uno de los cassettes de HCPA1 mutagenizados
anteriores se secuenció para verificar que sólo se producían las
mutaciones de ADN deseadas.
pMP36 HCPA1 w.t. se sometió a digestión de
restricción con NcoI para liberar un fragmento de 1,2 kb que se
clonó en el sitio Nco I de mutantes M13mp19HCPA1. Después de
verificar la orientación correcta del fragmento Nco I dentro de los
mutantes M13mp19 proHCPA1 (Figura 5) los ADN se sometieron a
digestión de restricción con Hind III y Sal I, con lo que se liberó
un fragmento de ADNc de 1,2 kb que codificaba la enzima mutante
proHCPA1 entera. Este fragmento después se unió a los sitios Hind
III y Sal I de pMP36 produciendo mutantes pMPHCPA1 (Figura 6) que
después podrían procesarse adicionalmente para la expresión en S.
cerevisiae usando los métodos descritos en los Ejemplos 2 y
3.
Como alternativa, las mutaciones se han generado
convenientemente en hCPA en el plásmido pMP36 (pMP36 HCPA1) por el
procedimiento de eliminación de un solo sitio (USE) de Clontech
Laboratories, Inc. usando los reactivos y protocolos de los
fabricantes.
En el protocolo, se usó la eliminación de un solo
sitio EcoRI en el plásmido pMP36 HCPA1 para la selección con el
oligonucleótido XS5 (TCC CCC GGG CTG CAG GAT ATC GAT AGC TGG GCT GTG
T). A continuación se proporcionan los oligonucleótidos usados para
generar tres mutaciones específicas en hCPA por este protocolo:
T 268 H (codón ACC a CAC) con el oligonucleótido
XT2
(ATC AAG TAC TCC TCC CAG CTC CGG
GAC)
S 253 G (codón AGC a GGT) con el oligonucleótido
XT3
(TTT ATC AAG CCA GTG GAG GTA TTG ACT GGA
CC)
A 250 G (codón GCC a GGC) con el oligonucleótido
XT4
(AAG GCA ATT TAT CAA GGC AGT GGA AGC ACT
ATT)
Las mutaciones se aislaron usando los
oligonucleótidos indicados anteriormente y XS5 (TCC CCC GGG CTG CAG
GAT ATC GAT AGC TGG GCT GTG T) que elimina un solo sitio
EcoRI. Se seleccionaron plásmidos que contenían las
mutaciones deseadas por digestión del pMP36(hCPA) de tipo
silvestre con EcoRI (los plásmidos no cortados producen una
transformación de 10 a 100 veces más eficaz que el plásmido
linealizado). Además, el oligonucleótido de selección XS5 introduce
un sitio EcoRV que después puede usarse para seleccionar
plásmidos mutantes. En los plásmidos mutantes, el sitio
EcoRV es único y, por lo tanto, puede usarse como un sitio de
selección para construir mutantes dobles con un oligonucleótido que
convierte el sitio EcoRV de nuevo en un sitio
EcoRI.
El mutante pMP36 HCPA generado de esta manera
después puede procesarse adicionalmente para le expresión en S.
cerevisiae usando los métodos descritos en los Ejemplos 2 y
3.
A un grupo de ratones se les dosificaron, i.p. o
i.v. en embolada, 50 mg/kg de profármaco por medio de la
administración de una solución de 5 mg/ml en PBS, pH
6-8. Los animales se sacrificaron después de 30
minutos y 2 horas y se recogieron el plasma y los tejidos. El
plasma se congeló a -70ºC y los tejidos se congelaron rápidamente
en nitrógeno líquido y se almacenaron a -70ºC. Se sacrificaron
animales por duplicado para cada punto de tiempo. El plasma se
preparó para la extracción por dilución de 4 veces con HCl 0,1 N
enfriado con hielo. Los tejidos se prepararon para la extracción
por homogeneización en 5 volúmenes de HCl 0,1 N enfriado con hielo
con un Polytron equipado con un generador PTA 7 (Brinkman
Instruments, Westbury, NY). Posteriormente se extrajeron los
fármacos añadiendo 500 \mul de acetonitrilo a -20ºC a 200 \mul
del homogeneizado de HCl 0,1 N. Después de una incubación de 5
minutos en hielo, las muestras se centrifugaron a 12.400 x g durante
15 minutos. Los sobrenadantes se recogieron y se diluyeron 3,57
veces con PBS para reducir la concentración de acetonitrilo final al
20%. Después se analizaron los sobrenadantes diluidos por HPLC como
se describe más adelante. La recuperación del fármaco se estimó
añadiendo cantidades conocidas de homogeneizados de tejidos de
control con fármaco o profármaco antes de la etapa de extracción
con acetonitrilo. Después de la corrección para la recuperación de
estos patrones, se calcularon los niveles de fármaco y profármaco
en los tejidos y la estabilidad del profármaco en estos tejidos
usando HPLC.
Se analizaron muestras en una columna de HPLC de
acero de 4 \mum C18 Nova-Pak 3,9 x 300 mm
equipada con una columna de seguridad C18 con detección UV a un
caudal de 1 ml/min.
Se inyectaron muestras en la columna de HPLC
equilibrada con ácido acético al 2%, pH 3,0, que contenía
acetonitrilo al 5% o al 20% dependiendo del compuesto a analizar.
Tras la inyección de la muestra, se inició un gradiente lineal de 25
a 35 minutos elevando la concentración de acetonitrilo a
acetonitrilo al 50%. Se analizaron tres compuestos
(ASP-MTX,
o-ciclopentil-PHE-MTX
y
m-ciclopentil-PHE-MTX)
en una columna de 10 \mum C18 Bondapak (3,9 x 300 mm) equilibrada
con acetonitrilo al 16% en hidrogenosulfato de tetrabutilamonio 5
mM, y NH_{4}H_{2}PO_{4} 10 mM. La columna después se eluyó
con un gradiente lineal de 30 minutos de hasta acetonitrilo al
50%.
Los resultados se indican en la Tabla 1. Los
resultados demuestran que un compuesto que es un buen sustrato para
la CPA de tipo silvestre, tal como el compuesto Nº 10, no es
estable in vivo. Este tipo de compuesto no es útil para una
ADEPT. Sin embargo, otros compuestos que son buenos sustratos para
una enzima mutante pero no para la enzima de tipo silvestre, tales
como los compuestos 8, 9, 11, 12, 13 y 14 y otros, son estables
in vivo y como tales son útiles en una ADEPT.
Los datos mostrados en la Tabla 1 indican la
concentración de profármaco detectada a lo largo del tiempo en
minutos como \muM en el caso del plasma o nmol/g en el caso de
los tejidos. Las cifras entre paréntesis indican la estabilidad del
profármaco expresada como el porcentaje de material (suma de fármaco
y profármaco) observado como profármaco intacto.
Excepto cuando se indica, todos los experimentos
se realizaron en ratones CD-1 desnudos.
(Tabla pasa a página
siguiente)
Los profármacos 1 a 14 que se muestran en la
Tabla 1 son los siguientes:
1. Ácido
N-(N-(4(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(F)quinazolin-9-il)metil)amino)-2-fluorobenzoil)-L-glutam-1-il)-L-glutámico.
2.
N-((S)-4-carboxi-2-(5-(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(F)quinazolin-9-il)metil)amino)-1-oxo-2-isoindolinil)butanoil)-L-fenilalanina.
3.
N-(N-(2-fluoro-4-(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(F)quinazolin-9-il)metil)amino)benzoil)-L-glutam-1-il)-3-(1-naftil)-L-alanina.
4.
N-(N-(4(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(F)quinazolin-9-il)metil)amino)-2-fluorobenzoil)-L-glutam-1-il)-2-
carboxi-L-fenilalanina.
carboxi-L-fenilalanina.
5.
N-(N-(4-(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(F)quinazolin-9-il)metil)amino)-2-fluorobenzoil)-L-glutam-1-il-2-
yodo-L-fenilalanina.
yodo-L-fenilalanina.
6. Ácido
N-(4-((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-L-aspártico.
7.
N-(4-((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-2-carboxi-L-fenilalanina.
8.
N-(4-((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-2-ciclopentil-L-fenilalanina.
9.
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-fenilalanina.
10.
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-L-fenilalanina.
11.
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclobutil-L-fenilalanina.
12.
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-terc-butil-L-fenilalanina.
13.
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-tirosina.
14.
N-(4-((3-(2,4-diamino-1,6-dihidro-6-oxo-5-pirimidinil)propil)amino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-fenilalanina.
Se buscó en la Base de Datos de Proteínas de
Brookhaven (Bernstein F.C. et al., J. Mol. Biol. 112,
535-542 [1977]) y se seleccionó la CPA bovina, ya
que probablemente tendría la mayor similitud estructural con la CPA
humana (HCPA) basándose en la homología de secuencias de bases. El
algoritmo COMPOSER que se usó para desarrollar el modelo de HCPA
forma parte del paquete de modelado molecular SYBYL disponible en el
mercado vendido por TRIPOS Associates (SYBYL Molecular Modeling
Software, Versión 5.3, Noviembre de 1989, TRIPOS Associates Inc., St
Louis, MO 63144). El algoritmo COMPOSER se usó para ajustar los
restos aminoacídicos de la secuencia de CPA humana en las
coordenadas 3D de la estructura cristalina de la CPA bovina para
determinar el mejor ajuste y por consiguiente una estructura 3D
proyectada para la HCPA.
Se incubaron células de linfoma de células B
Wein-133 con un conjugado de HCPA1 de tipo silvestre
y Campath durante 30 minutos. Las células después se lavaron para
retirar el conjugado no unido y se devolvieron a un cultivo celular
a 500.000 células ml^{-1}. Las células se cultivaron en presencia
de concentraciones variables del profármaco MTX-Phe
y se analizaron los niveles de inhibición del crecimiento después de
3 días. Los resultados se ilustran en la Fig. 1. Se obtuvieron
resultados similares cuando se sustituyó el conjugado de tipo
silvestre por el mutante 268 Gly con Campath.
El profármaco estable de la presente invención,
además de ser estable in vivo, también debe ser menos tóxico
en el hospedador que el fármaco parental para permitir mayores
niveles de dosificación del profármaco y a su vez la generación de
altas concentraciones locales de agente activo. Los presentes
solicitantes han descubierto que la dosis máxima tolerada para el
metotrexato en el ratón (hembra, cepa CD-1 nu/nu) es
de 4 mg/kg IV una vez al día durante 5 días. Se toleraron dosis de
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-2-ciclopentil-L-fenilalanina
de hasta 20 mg/kg IV una vez al día durante 5 días, y dosis de hasta
40 mg/kg de
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-fenilalanina
o
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-terc-butil-L-fenilalanina
IV una vez al día durante 5 días no produjeron ninguna toxicidad;
por lo tanto, las dosis máximas toleradas de los dos últimos
compuestos son mayores de 40 mg/kg. En ratones Swiss nu/nu, la
dosis máxima tolerada de metotrexato es de 2,5 mg/kg IV al día
durante 5 días. En estos ratones, la
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-tirosina
se toleró a dosis de hasta 50 mg/kg IV día durante 5 días, mientras
que la
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclobutil-L-fenilalanina
mostró alguna toxicidad a dosis de 30 mg/kg IV al dís durante 5
días. De esta manera, en ratones Swiss nu/nu, con este programa de 5
dosis al día, la MTD para la
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-tirosina
y la
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclobutil-L-fenilalanina
sería > 50 mg/kg y < 30 mg/kg respectivamente. De esta manera,
los profármacos de la presente invención efectivamente se toleran
mucho mejor que el agente activo correspondiente.
Como se indica en este documento, el profármaco
estable in vivo de la presente invención debería ser un
mejor sustrato para una enzima mutante que la correspondiente
enzima de tipo silvestre para que el profármaco estable se active
selectivamente en el tumor. La Tabla 2 muestra la cinética
enzimática para varios profármacos de metotrexato con la
carboxipeptidasa A1 humana de tipo silvestre y mutantes con la thr
268 mutada a Ala o Gly. La constante cinética más relevante en la
tabla es la kcat/Km, que proporciona una estimación de la constante
de velocidad de segundo orden para la conversión catalizada por la
enzima del profármaco en metrotrexato. De esta manera, cuanto mayor
es la kcat/Km, más eficaz es la enzima con un sustrato particular.
Puede verse que la kcat/Km para la CPA1 humana con uno de los
mejores sustratos para esta enzima de tipo silvestre
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-L-fenilalanina,
el profármaco de MTX, es de 0,44/\muM/seg. Los valores de kcat/Km
para la
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-2-ciclopentil-L-fenilalanina,
la
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-fenilalanina,
la
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-tercbutil-L-fenilalanina,
la
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclobutil-L-fenilalanina
y la
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-tirosina
para la CPA1 humana son mucho menores; de hecho, la reacciones
catalizadas por la CPA humana con los últimos cuatro profármacos no
fueron medibles. Sin embargo, los valores de kcat/Km para estos
cinco profármacos estables con 268Gly son 0,157, 0,092, 0,38, 1,8 y
0,18/\muM/sec, respectivamente. De esta manera, la única mutación
en 268 de thr a gly convirtió sustratos muy deficientes en la
enzima de tipo silvestre en excelentes sustratos en la enzima
mutante. De hecho, en el caso de la
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-tercbutil-L-fenilalanina,
la actividad de 268Gly con el profármaco no es diferente de la
actividad de la CPA1 humana con
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-L-fenilalanina,
uno de sus mejores sustratos. Además, en el caso de
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclobutil-L-fenilalanina,
la actividad de 268Gly es cuatro veces mejor que la actividad de la
CPA1 con
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-L-fenilalanina.
De esta manera, los compuestos son sustratos mucho mejores para la
enzima mutante que para la enzima de tipo silvestre, lo cual
permite una activación dirigida al tumor muy específica desde el
profármaco no tóxico estable al agente activo.
(Tabla pasa a página
siguiente)
La cinética se determinó por una modificación del
ensayo acoplado de Kuefner, et al (1989) Biochemistry 28
2288-2297 en el que el producto MTX se convierte por
un exceso de carboxipeptidasa G en el pteroato de MTX. En este
ensayo, la reacción se sigue espectrofotométricamente a 315 nM; a
esta longitud de onda, se determinó un cambio en la capacidad de
absorción molar para la reacción acoplada de 9,57 mM^{-1}
cm^{-1}. Los ensayos se realizaron a 25ºC en
Tris-HCl 25 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4. Los profármacos
se preincubaron a 25ºC con tampón y 17 miliunidades de
carboxipeptidasa G Sigma Nº C-9658 en un volumen
total de 1 ml. El ensayo se inició con carboxipeptidasa A o el
mutante apropiado. Se obtuvieron las velocidades iniciales y se
usaron los cálculos de Michaelis-Menten
convencionales para determinar las constantes cinéticas (en
Biochemistry, Lehninger, A.L. 1970, Worth Publishers, Inc,
NY).
* Se usa el esquema de numeración para la CPA1.
Las rayas en las posiciones 3 y 57 indican un hueco en la secuencia
de A2 necesario para una alineación óptima con A1.
Los dos puntos indican la identidad entre A1 y
A2.
- Prepro-CPA empieza en el aminoácido -110 y va hasta el +309.
- Pro-CPA empieza en el aminoácido -94 y va hasta el +309.
- La CPA madura empieza en el aminoácido +1 y va hasta el +309.
* Se usa el esquema de numeración para la CPA1.
Las rayas en las posiciones 3 y 57 indican un hueco en la secuencia
de A2 necesario para una alineación óptima con A1.
Los dos puntos indican la identidad entre A1 y
A2.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: The Wellcome Foundation Limited
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Unicorn House. 160 Euston Road
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Londres
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: no aplicable
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Inglaterra
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: NW1 2BP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: SMITH. Gary Keith
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 521 Mills Street
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Raleigh
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Carolina del Norte
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 27608
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: BLUMENKOPF. Todd Andrew
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 201 Hunter Hill Road
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Chapel Hill
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Carolina del Norte
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 27516
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: CORY. Michael
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 55 Cedar Street
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Chapel Hill
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Carolina del Norte
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 27514
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: TERAPIA
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 22
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatenIn Release Nº. 1.0, Versión Nº. 1.25 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A) LONGITUD: 1257 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B) TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C) CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D) TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1257
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 419 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1251 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1251
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 417 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCCTGTTATTG GCTGCCCTAC TT
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipAAGCCAGGTC TCTTCTGCTG TC
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGGTCCAGTCA GCAGTGCTTC C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGAGCTCGAAG GCGAAGGAGT A
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGAGCTCGAAG CCGAAGGAGT A
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTCCCCCGGGC TGCAGGATAT CGATAGCTGG GCTGTGT
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTCCCCCGGGC TGCAGGATAT CGATAGCTGG GCTGTGT
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipATCAAGTACT CCTCCCAGCT CCGGGAC
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTTTATCAAGC CAGTGGAGGT ATTGACTGGA CC
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTCCCCCGGGC TGCAGGATAT CGATAGCTGG GCTGTGT
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGCTGAAGCTT CGGAGGACTT T
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 16:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTCTTGACCGC CTGGATGCTG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 17:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 419 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 18:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 417 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 19:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGCAGAAGCTT CAGAAACGTT TGTGGGAGAT CAAGTTCTTG AGATTGTACC
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 20:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCTCTTTGTCC AACAGGACCT G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 21:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTCCTCCACTG CCTTGGTAGA T
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 22:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCAGTTCAAAG CCAAATGAGT A
\hfill21
Claims (37)
1. Un conjugado que comprende una molécula de
dirección capaz de suministrar una enzima a una célula de mamífero
particular y una enzima de mamífero conjugada con la molécula de
dirección y capaz de catalizar un precursor funcionalmente inactivo
de un agente quimioterapéutico para dar su forma activa, donde la
enzima es un mutante y el precursor es resistente a la catálisis
endógena por la forma de la enzima de tipo silvestre.
2. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación
1, donde la enzima es una de las siguientes: una hidrolasa, una
transferasa, una óxido-reductasa, una isomerasa,
una liasa y una ligasa.
3. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación
2, donde la hidrolasa es una peptidasa.
4. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación
2, donde la hidrolasa es una esterasa.
5. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación
3 ó 4, donde la peptidasa es una exopeptidasa.
6. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación
3 ó 4, donde la peptidasa de la reivindicación 3 o la esterasa de
la reivindicación 4 es una carboxipeptidasa.
7. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación
6, donde la carboxipeptidasa es una carboxipeptidasa A humana.
8. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación
7, donde la carboxipeptidasa A humana es HCPA1 o HCPA2 que posee
sustituciones de aminoácidos en uno o más de los siguientes restos:
203, 210, 242, 244, 250, 253, 255, 267, 268, 269 y 305.
9. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación
8, donde las sustituciones de aminoácidos se seleccionan entre las
siguientes:
- Gly en 250 y 268,
- Gly en 253 y 268,
- Gly en 250 e His en 268,
- Gly en 250,
- Ala en 255 e His en 268,
- His en 268, y
- Gly en 268.
10. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación
9, donde la sustitución es Gly en 268.
11. Un conjugado de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 10, donde todos los demás restos son de tipo
silvestre.
12. Un conjugado de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, donde la molécula de dirección es una de
las siguientes: un anticuerpo, una hormona, un ligando, una
citoquina, un antígeno, un oligonucleótido y un peptido
mimético.
13. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación
12, donde el anticuerpo es un anticuerpo policlonal, un anticuerpo
monoclonal o un fragmento del mismo.
14. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación
13, donde el anticuerpo o el fragmento del mismo está
humanizado.
15. Un conjugado de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, donde la molécula de dirección está unida
a la enzima por una molécula enlazadora.
16. Un conjugado de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, que se traduce a partir de un solo
transcrito de ARN o a partir de múltiples transcritos de ARN.
17. Una molécula de ADN o de ARN que codifica un
conjugado de acuerdo con la reivindicación 16.
18. Un vector que contiene el ADN o el ARN de
acuerdo con la reivindicación 17.
19. Una línea celular que contiene el ADN o el
ARN de acuerdo con la reivindicación 17 o un vector de acuerdo con
la reivindicación 18.
20. Un compuesto de fórmula general II
en la
que,
X representa NH u O y
R^{2} representa CO_{2}H, SO_{3}H,
SO_{2}H, OSO_{3}H, PO_{3}H_{2}, OPO_{3}H_{2}, CO_{2}H
esterificado con alquilo C_{1-6} , PO_{3}H_{2}
esterificado con alquilo C_{1-6}, alquilo
C_{4-12}, alquenilo C_{4-12},
alquinilo C_{4-12}, alquilo
C_{4-12} ramificado, alquilo
C_{1-8} o alquilo C_{3-8}
ramificado; sustituidos con CO_{2}H, SO_{3}H, SO_{2}H,
OSO_{3}H, PO_{3}H_{2}, OPO_{3}H_{2}, CO_{2}H
esterificado con alquilo C_{1-6}, PO_{3}H_{2}
esterificado con alquilo C_{1-6}, hidroxilo,
alcoxi, halo, haloalquilo, ciano o carboxamida; cicoalquilo
C_{3-8}, arilo o heteroarilo opcionalmente
sustituido con alquilo C1-8, alquilo
C_{3-8} ramificado, cicloalquilo
C_{3-8}, alquenilo C_{3-6},
alquinilo C_{2-6}, cicloalquenilo
C_{4-6}, sililo trisustituido, es decir,
(R^{13})(R^{14})(R^{15})Si, donde R^{13}, R^{14} y
R^{15} son alquilo C_{1-6}, alquilo
C_{3-6} ramificado, cicloalquilo
C_{3-6}, alquenilo C_{3-6},
alquinilo C_{2-6}, cicloalquenilo
C_{4-6}, arilo o heteroarilo, y donde cada uno de
R^{13}, R^{14} y R^{15} son el mismo grupo o grupos diferentes
(por ejemplo, trimetilsililo,
terc-butildimetilsililo, ciclohexildimetilsililo o
fenildimetilsililo), arilo, CO_{2}H, SO_{3}H, SO_{2}H,
OSO_{3}H, PO_{3}H_{2}, OPO_{3}H_{2}, CO_{2}H
esterificado con alquilo C_{1-6}, PO_{3}H_{2}
esterificado con alquilo C_{1-6}, carboxamida,
hidroxilo, alcoxi C_{1-6}, alquiltio
C_{1-6}, mercapto, halo, haloalquilo, nitro o
ciano, R^{2a} y R^{2b} representan H, hidroxi, mercapto, alcoxi,
alquiltio, halo, ciano, CO_{2}H, SO_{3}H, SO_{2}H, OSO_{3}H,
PO_{3}H_{2}, OPO_{3}H_{2}, CO_{2}H esterificado con
alquilo C_{1-6}, carboxamida, PO_{3}H_{2}
esterificado con alquilo C_{1-6},
C_{2-6} cíclico [es decir, R^{2a} y R^{2b}
conjuntamente representan
(CH_{2})_{2-6}], sililo trisustituido, es
decir (R^{13})(R^{14})(R^{15})Si, donde R^{13},
R^{14} y R^{15} son alquilo C_{1-6}, alquilo
C_{3-6} ramificado, cicloalquilo
C_{3-6}, alquenilo C_{3-6},
alquinilo C_{2-6}, cicloalquenilo
C_{4-6}, arilo o heteroarilo y donde R^{13},
R^{14} y R^{15} pueden ser el mismo grupo o grupos diferentes,
por ejemplo, trimetilsililo,
terc-butildimetilsililo, ciclohexildimetilsililo o
fenildimetilsililo; o alquilo C_{1-6} o alquilo
C_{1-6} ramificado o cicloalquilo
C_{1-6} o arilo o heteroarilo opcionalmente
sustituidos con hidroxi, mercapto, alcoxi C_{1-6},
alquiltio C_{1-6}, halo, ciano, CO_{2}H,
SO_{3}H, SO_{2}H, OSO_{3}H, nitro, PO_{3}H_{2},
OPO_{3}H_{2}, CO_{2}H esterificado con alquilo
C_{1-6}, carboxamida, PO_{3}H_{2} esterificado
con alquilo C_{1-6}, alquilo
C_{1-6}, alquilo C_{1-6}
ramificado, cicloalquilo C_{1-6}, sililo
trisustituido, es decir, (R^{13})(R^{14})(R^{15})Si,
donde R^{13}, R^{14} y R^{15} son alquilo
C_{1-6}, alquilo C_{3-6}
ramificado, cicloalquilo C_{3-6}, arilo o
heteroarilo, y donde R^{13}, R^{14} y R^{15} pueden ser el
mismo grupo o grupos diferentes, por ejemplo, trimetilsililo,
tercbutildimetilsililo o fenildimetilsililo; con la condición de que
R^{2a} y R^{2b} no sean ambos hidroxi o mercapto.
F comprende un resto de fórmula (IV)
en la que R^{1} representa un grupo que
corresponde a la cadena lateral de cualquier
\alpha-aminoácido, por ejemplo, H, alquilo
C_{1-6}, alquenilo C_{1-6},
alquinilo C_{1-6} opcionalmente sustituido con
CO_{2}H, CO_{2}H esterificado con alquilo
C_{1-6}, OPO_{3}, PO_{3}H_{2},
PO_{3}H_{2} esterificado con alquilo C_{1-6},
halo, hidroxi, carboxamida, amino opcionalmente sustituido con
alquilo C_{1-6}, ciano o
nitro,
\newpage
E representa
cada uno de los cuales puede estar opcionalmente
sustituido con uno o más de hidroxi, uno o más de alcoxilo, halo o
alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido con uno
o más de hidroxi, alcoxi C_{1-6} o
halo.
D representa
-CH_{2}-CH(R^{3})-,
-CH_{2}-NR^{3}-,
-NR^{3}-CH_{2}-, -CH_{2}S- o -CH_{2}O-,
donde R^{3} es H, alquilo C_{1-6}, alilo o
propargilo, opcionalmente sustituidos con uno o más de alcoxi
C_{1-6}, halo, hidroxi o ciano; y
B representa
donde,
R^{4} representa H, alquilo
C_{3-6} ramificado, cicloalquilo
C_{3-6}, o alquilo C_{1-6};
R^{5} representa alquilo
C_{1-6}, alquilo C_{3-6}
ramificado, cicloalquilo C_{3-6}, amino
(opcionalmente sustituido con alquilo C_{1-6},
alcanoílo C_{1-6} o bencilo);
R^{6} representa H, alquilo
C_{1-6}, alquilo C_{3-6}
ramificado, cicloalquilo C_{3-6}, amino
(opcionalmente sustituido con alquilo C_{1-6},
alcanoílo C_{1-6} o bencilo), alcoxilo
C_{1-6} o alquiltio C_{1-6};
y
R^{7} representa H, alquilo
C_{1-6}, alquilo C_{3-6}
ramificado, cicloalquilo C_{3-6}, haloalquilo
C_{1-6} o halo;
y sales, N-óxidos, solvatos y derivados
fisiológicamente funcionales de los
mismos;
con la condición de que los siguientes compuestos
no estén incluidos dentro de la fórmula:
ácido
N-(N-(4-(((2-amino-3,4-dihidro-4-oxo-6-quinazolinil)metil(2-propinil)amino)-benzoil)-L-glutam-1-il)-L-
glutámico,
glutámico,
ácido
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-L-glutámico,
ácido
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-L-aspártico,
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-L-fenilalanina,
4-bis(2-cloroetil)amino)-fenilalanilfenilalanina
y
4-bis(2-cloroetil)amino)-fenilalanil-3,5-dimetil-4-metoxifenilalanina.
21. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
20 y sales, N-óxidos, solvatos y derivados fisológicamente
funcionales del mismo, en el que
X es NH;
R^{2} es cicloaquilo C_{3-8}
o arilo sustituido con alquilo C_{1-8},
cicloalquilo C_{3-8}, alquilo
C_{3-9} ramificado o sililo trisustituido, es
decir, (R^{13})(R^{14})(R^{15})Si, donde R^{13},
R^{14} y R^{15} son alquilo C_{1-6}, alquilo
C_{3-6} ramificado, cicloalquilo
C_{3-6}, arilo o heteroarilo, y donde cada uno de
R^{13}, R^{14} y R^{15} es el mismo grupo o grupos diferentes
(por ejemplo, trimetilsililo, tercbutildimetilsililo,
ciclohexildimetilsililo, o fenildimetilsililo);
R^{2a} y R^{2b} son ambos H;
R^{1} es H, alquilo C_{1-6},
CH_{2}CO_{2}H, CH_{2}CH_{2}CO_{2}H o
CH_{2}CH_{2}CH_{2}NH_{2},
E es
D es -CH_{2}NH-, -CH_{2}N(CH_{3})-,
-CH_{2}N(CH_{2}C\equivCH)-, -CH_{2}CH_{2}- o
-CH_{2}-CH(C_{2}H_{5})-
y B es
22. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
20 y sales, N-óxidos, solvatos y derivados fisiológicamente
funcionales del mismo, en el que
X es NH;
R^{2} es fenilo o
para-hidroxifenilo sustituido con ciclopentilo,
ciclobutilo o terc-butilo. Los grupos ciclopentilo,
ciclobutilo y terc-butilo pueden estar en posición
orto o meta, pero preferiblemente están en posición meta, R^{2a} y
R^{2b} son H,
R^{1} es CH_{2}CH_{2}CO_{2}H
E es
D es
y B
es
23. Los siguientes compuestos y sales, N-óxidos,
solvatos y derivados fisiológicamente funcionales de los mismos:
N-((S)-4-carboxi-2-(5-(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(F)quinazolin-9-il)metil)amino)-1-oxo-2-isoindolinil)butanoil)-L-fenilalanina,
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-2-ciclopentil-L-fenilalanina,
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-fenilalanina,
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclobutil-L-fenilalanina,
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-trimetilsilil-L-fenilalanina,
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-terc-butil-L-fenilalanina,
N-(4-((3-(2,4-diamino-1,6-dihidro-6-oxo-5-pirimidinil)propil)amino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-fenilalanina,
N-(4-(((1,2-dihidro-3-metil-1-oxobenzo(F)quinazolin-9-il)metil)amino)-2-fluorobenzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclo-
pentil-L-fenilalanina,
pentil-L-fenilalanina,
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil-metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-tirosina,
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3,5-diyodo-L-tirosina,
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-2-ciclopentil-L-tirosina,
ácido
(S)-3-(3-ciclopentil-4-hidroxifenil)-2-((N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)-metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il)oxi)propiónico,
y
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-terc-butil-L-tirosina.
24.
N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinil)metil)metilamino)benzoil)-L-glutam-1-il-3-ciclopentil-L-tirosina
y sales, N-óxidos, solvatos y derivados fisiológicamente funcionales
del mismo.
25. El uso de un compuesto de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, de un conjugado de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, de una línea
celular de acuerdo con la reivindicación 19, de un vector de acuerdo
con la reivindicación 18, o de ADN o ARN de acuerdo con la
reivindicación 17, en la preparación de un medicamento para uso en
terapia médica.
26. Uso de un conjugado que comprende una enzima
mutante de mamífero y una molécula de dirección específica a un tipo
celular en la preparación de un medicamento para uso en un método
de quimioterapia dirigida, donde la enzima es capaz de catalizar la
conversión de un precursor funcionalmente inactivo de un agente
quimioterapéutico en su forma activa mientras que dicho precursor es
resistente a la catálisis endógena.
27. El uso de un precursor de un agente
quimioterapéutico en la preparación de un medicamento para uso en
el tratamiento de un paciente que requiere terapia en una población
celular particular que tiene un conjugado que comprende una molécula
de dirección y una enzima de mamífero de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 16 unida a esa población celular
particular, siendo dicho precursor funcionalmente inactivo pero
capaz de convertirse en su forma activa por la enzima de mamífero
presente en dicho conjugado pero resistente a la catálisis endógena
por la forma de la enzima de tipo silvestre.
28. Una enzima mutante de mamífero capaz de
catalizar la conversión de un precursor funcionalmente inactivo de
un agente quimioterapéutico en su forma activa, donde el precursor
es resistente a la catálisis endógena.
29. Una enzima de acuerdo con la reivindicación
28, donde la enzima posee actividad carboxipeptidasa.
30. Una enzima de acuerdo con la reivindicación
29, donde la enzima es una carboxipeptidasa A humana.
31. Una enzima de acuerdo con la reivindicación
30, donde la enzima es HCPA 1 o HCPA 2 que posee sustituciones de
aminoácidos en uno o más de los restos 203, 210, 242, 244, 250,
253, 255, 267, 269 y 305.
32. Una enzima de acuerdo con la reivindicación
31, donde las sustituciones de aminoácidos se seleccionan entre las
siguientes:
- Gly en 250 y 268,
- Gly en 253 y 268,
- Gly en 250 e His en 268,
- Gly en 250,
- Ala en 255 e His en 268,
- His en 268, y
- Gly en 268.
33. Una enzima de acuerdo con la reivindicación
32, donde la sustitución es Gly en 268.
34. Una enzima de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 31 a 33, donde todos los demás restos son de tipo
silvestre.
35. Una molécula de ADN o ARN que codifica una
enzima de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a
34.
36. Un vector que contiene una molécula de ADN o
ARN de acuerdo con la reivindicación 35.
37. Una línea celular que contiene una molécula
de ADN o ARN de acuerdo con la reivindicación 35 o un vector de
acuerdo con la reivindicación 36.
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| US20110002978A1 (en) | 2003-06-17 | 2011-01-06 | Harrison Roger G | Enzyme prodrug cancer therapy selectively targeted to tumor cells or tumor vasculature and methods of production and use thereof |
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| WO2006035008A1 (de) * | 2004-09-27 | 2006-04-06 | Merck Biosciences Ag | Rekombinante carboxypeptidase b |
| CA2586334A1 (en) * | 2004-11-16 | 2006-06-08 | Neurochem (International) Limited | Compounds for the treatment of cns and amyloid associated diseases |
| WO2009060198A1 (en) | 2007-11-09 | 2009-05-14 | Peregrine Pharmaceuticals, Inc. | Anti-vegf antibody compositions and methods |
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| US9340504B2 (en) * | 2013-11-21 | 2016-05-17 | Purdue Pharma L.P. | Pyridine and piperidine derivatives as novel sodium channel blockers |
| SG11201604993WA (en) * | 2013-12-17 | 2016-07-28 | Stella Pharma Corp | A method for producing 2-fluoro-4-borono-l-phenylalanine, and precursor of 2-fluoro-4-borono-l-phenylalanine |
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