JPH09507834A

JPH09507834A - セラピー

Info

Publication number: JPH09507834A
Application number: JP7513695A
Authority: JP
Inventors: スミス、ケイリー・キース; ブルーメンコプフ、トッド・アンドリュー; コリー、マイケル
Original assignee: ザ・ウェルカム・ファウンデーション・リミテッド
Priority date: 1993-11-12
Filing date: 1994-11-11
Publication date: 1997-08-12
Also published as: CA2176024A1; ES2204935T3; AU8148894A; ZA948987B; ATE246516T1; IL111601A0; AU688412B2; MY114140A; WO1995013095A3; DE69433015T2; DK0728018T3; EP0728018B1; NZ276137A; EP0728018A1; US6140100A; DE69433015D1; GB9323429D0; WO1995013095A2; US6319702B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、抗体に向けられた酵素プロドラッグ治療（ＡＤＥＰＴ）を含めたターゲット化された酵素プロドラッグ治療における改善に関する。特に、本発明はＡＤＥＰＴに使用するための新規な酵素及びプロドラッグに関する。

Description

【発明の詳細な説明】セラピー本発明は、抗体に向けられた酵素プロドラッグ治療（ＡでＰＴ）を含めたターゲット化された酵素プロドラッグ治療に関する。本発明は特に、新規な酵素及びＡＤＥＰＴに使用するためのプロドラッグに関する。種々の症状の治療において、医薬は、個々の細胞副次集団にのみ輸送されることが好ましい。例えば、癌の治療における医薬の使用は、細胞毒性薬が正常な細胞分裂を起こす細胞と新生物性分裂を起こす細胞との間を識別できないことよって制限される。従って、治療は、臨床的に許容しうる範囲にまで達成されておらず、健常な細胞が細胞毒性にさらされる。薬剤と抗体、好ましくはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）との複合体は、ターゲッティング抗体（targetting antibody ）が結合する抗原決定部位を発現する特別の細胞副次集団に薬剤をターゲッティングすることを可能にする。しかし、複合体が関連した組織に入り込めないこと、抗体が結合した複合体からの薬剤の放出が乏しいこと、及び多くの利用可能な抗体結合部位によって運ばれうる薬剤の量に制限があること、のようなファクターがこのアプローチの効果を制限している。このような制限を回避することは、相対的に非毒性の「プロドラッグを抗体結合部位で低分子量の細胞毒素に変換することができる抗体と酵素のターゲッティング複合体のコンセプトに繋がる。この一般的なコンセプトは、欧州特許出願８４３０２２１８.７でRoseによって開示されている。Bagshawe及び共同研究者は、このコンセプトをＡＤＥＰＴ（Antibody Directed Enzyme Prodrug Therapy）と称している（Bags hawe K.D．et al.，Br.J．Cancer［1987］56，531-532，Bagshawe K.D．et al. ，Br．J．Cancer［1988］50，700-703及びＷＯ９０／１０１４０）。この方法では、１つの複合体が、プロドラッグの活性化の酵素触媒のラウンドを繰り返すことによって標的部位で比例してより大量の薬剤を生じうる。ＥＰ３８２４１１には、プロドラッグが種々の微生物から単離されたベータ− ラクタマーゼ、Ｌ−ピログルタメートアミノペプチダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、Ｄ−アミノ酸ペプチダーゼ、アルカリ性フォスファターゼのアイソエンザイム及び種々のカルボキシペプチダーゼを含む酵素によって細胞毒性薬に変換されうるＡＤＥＰＴが開示されている。ＷＯ９１／１１２０１には、プロドラッグがβ−グリコシダーゼ又は通常は植物由来のβ−グルコシダーゼによって酵素的に開裂され、シアニドを生じうるＡＤＥＰＴが開示されている。ＥＰ３０２４７３には、酵素であるアルカリ性フォスファターゼがマイトマイシンの新規なプロドラッグを開裂するために使用されうるＡＤＥＰＴ、ペニシリンＶアミダーゼアドリアマイシンの新規なプロドラッグを開裂するのに使用されうるＡＤＥＰＴ、又はシトシンデアミナーゼがプロドラッグである５−フルオロシトシンと使用されるうるＡＤＥＰＴが開示されている。ＥＰ４８４８７０には、β−ラクタマーゼがセファロスポリンプロドラッグを活性化し、細胞毒性性のナイトロジェンマスタードを生じさせるのに使用しうるＡＤＥＰＴが開示されている。ＷＯ８８／０７３７８には、安息香酸ナイトロジェンマスタードグルタミドがカルポキシペプチダーゼの作用下でナイトロジェンマスタードに変換されうるＡＤＥＰＴが開示されている。 Vitols，K．S.，et al，Pteridines 3，[1992]，125-126には、多くのＭＴＸ −アミノ酸プロドラッグであって、ＡＤＥＰＴの一部としてカルポキシペプチダーゼ−Ａｍｂ複合体によって活性化されるものが開示されている。ＷＯ９１／０９１３４には、ＡＤＥＰＴに使用するための二重特異性ハイブリッドＡｍｂであって、該Ａｍｂがヒト癌細胞抗原及びプロドラッグ活性化酵素の量に対して特異性を有するものが開示されている。先に開示された全てのＡＤＥＰＴ法は、２つのカテゴリーに分類されうる。これは、関連したプロドラッグを活性化するためにヒト酵素を用いるもの及びヒト以外（例えばバクテリア）の酵素を用いるものである。両戦略とも効果的な治療を提供するこれらの可能性を制限する内在する問題を有している。ヒト酵素の使用では、内因性ヒト酵素活性が自然に起こりうる標的部位に遠い部位でプロドラッグが活性化されうるので、in vivo において結合したプロドラッグが不安定となる。明らかに、これはまた、身体の非標的領域に可能な細胞毒性化合物を生じ、可能性として致命的な結果となる非常に好ましくない効果を有しうる。ヒト以外の酵素の使用により、ヒト以外の酵素活性によってのみ活性化される結合したプロドラッグが内因性酵素により活性化されるのを防止し、これによってin viv oにおいて標的部位で薬剤に変換されるまで安定となる。しかし、このようなヒト以外の酵素は、in vivoで導入された場合には免疫応答を顕在化し得、害酵素に対して産生された抗体が、プロドラッグを活性化するその能力を制限若しくは破壊する。ＷＯ９０／０７９２９では、非免疫抗原性酵素によって提供される内因性以外の触媒活性の特に必要なものが同定されているが、これが「遺伝的に維持された」酵素の使用によって、又は「遺伝的に同様な種」からのものによって達成されることのみが教示されている。しかし、これがどのように達成されうるかを教示していない。 in vivoで安定であり、免疫原生でない酵素によってまだ活性化されるプロドラッグを提供する必要性から生じる明かな矛盾が、触媒活性を維持するが新規な基質特異性を有する突然変異哺乳動物酵素の産生により解決されることが今回明かなった。結合されたプロドラッグは、突然変異酵素の触媒活性によって活性化されうるが、突然変異酵素の基質特異性が天然に存在するものではないので、プロドラッグが標的部位で薬剤に変換されるまでin vivoで安定なまま残る。本発明に従った非免疫原生酵素を使用する可能性は、更に治療の繰り返しのラウンドが管理できるという利点を提供する。これは、ＡＤＥＰＴに対する公知のプロセスと対照的である。このプロセスでは、系への酵素の最初の導入は、これが治療の最初のラウンドの間に「準備された（primed）」免疫反応によって抗体から除去されるであろうから、同じ酵素での更なる治療を効果的に妨げる免疫応答を誘導する。本発明の第一の側面は、特異的な細胞タイプに対するが各療法剤をターゲッティングする方法であって、（ｉ）効果的な量の、細胞タイプに特異的なターゲッティング分子と化学療法剤の機能的に不活性な前駆体をその活性型に触媒することができる突然変異哺乳動物酵素との複合体、及び（ii）効果的な量の、化学療法剤に対する内因性の触媒作用に不応である化学療法剤の機能的に不活性な前駆体を哺乳動物に投与することを具備する方法を提供する。内因性の触媒作用は、化学療法剤の機能的に不活性な前駆体を、in vivoにおいて天然に存在する酵素によってその化学療法剤に変換することを意味する。明らかに、ターゲット化された突然変異哺乳動物酵素によって触媒される標的部位で起こる変換は、内因性触媒作用であるとは考えられない。本発明の更なる側面は、これ以後説明される症状のいずれかに対して治療が必要な動物を治療するための方法であって、効果的な量の、薬剤の機能的に不活性な前駆体をその活性型に触媒することができる突然変異哺乳動物酵素と複合体形成した細胞タイプに特異的なターゲッティング分子を、効果的な量の、内因性の触媒作用を防ぐ薬剤の機能的に不活性な前駆体と組み合わせて哺乳動物に投与することを具備した方法を提供する。ここで使用される突然変異ヒト酵素は、何れかのヒト酵素であって、治療が適用される患者のその酵素の１以上のアミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸が異なった配列を有するものであると理解されるべきである。ここで使用される「細胞タイプ」の語は、基本的には病理学的な状態、例えば癌胚抗原を発現する癌細胞、Ｔａｇ−７２、ムチン、又は抗体、Ｉｎｇ−１、１７−１Ａ、３２３／Ａ３、ＮＲ−ＬＵ−１０、ｃ１７４、ＰＲ．１Ａ３、ＭＯＶ１８、Ｇ２５０、Ｕ３６、Ｅ４８、ＮＲ−ＣＯ０２の何れかによって認識される抗原又は表３に示される他の抗原に選択的な一般の決定因子を有する何れかの局在化若しくは分散された細胞の集団を意味する。細胞タイプに特異的なターゲッティング分子は、突然変異酵素と非共有結合的若しくは共有結合的に結合若しくは複合体形成されうる何れかの分子であり得、これは細胞表面マーカーに対する結合親和性に選択性を示しうる。このような分子には、一方の抗体のアームが突然変異酵素と共有結合的に結合し、他方が細胞特異的ターゲッティングを行う二重特異性抗体を含むポリクローナル及びモノクローナル抗体が含まれる（U．Sahin，et al，Cancer Research 50，6944,1990）。突然変異哺乳動物酵素に結合し、複合体を形成しうる他のターゲッティング分子には、ホルモン、リガンド、サイトカイン、抗原、オリゴヌクレオチド及び疑似ペプチド（pepti- domimetics）が含まれる。ターゲッティング分子の選択は、ターゲット化される細胞の性質に依存するが、おそらくは抗体であり、好ましくはｍＡｂが最も高い選択性を持つのでモノクローナル抗体であろう。「化学療法剤（ここでは「薬剤」とも称する。）」には、ヒトの治療に活性を有するいずれの分子も含まれる。このような化学療法剤には、癌若しくはウイルス感染の治療に用いられる細胞増殖抑制性若しくは細胞毒性化合物が含まれるが、これらに限定されない。「機能的に不活性な前駆体（ここでは「プロドラッグ」とも称される。）」には、酵素の作用下で化学療法剤に変換されうるいずれの化合物も含まれる。このような機能的に不活性な前駆体は、典型的には、機能的に不活性な前駆体を酵素的に開裂し、化学療法剤及び「プロドラッグ部分」を生じることによって化学療法剤に変換されうる。このような機能的に不活性な前駆体から化学療法剤への変換は、酵素的に媒介される異性化によっても起こる。機能的に不活性な前駆体は、化学療法剤によって与えられる臨床的に十分なレベルの治療活性を一般には示さない。ここで、該前駆体は酵素的に該化学療法剤に変換され、その正常な薬理学的活性を減少するように化学的に派生される。細胞毒性化学療法剤の機能的に不活性な前駆体は、それ自身臨床的に十分な細胞毒性を示さず、治療の間、臨床的に十分なレベルの細胞毒性が、機能的に不活性な前駆体を化学療法剤に変換する部位、即ち突然変異酵素がターゲット化される部位でのみ大規模に生じる程度にin vivoで十分に安定である。突然変異哺乳動物酵素は、好ましくは、ヒトの治療で投与されたとき、十分な免疫学的応答を起こさずに新規な基質特異性を生じる１以上の転換部位を有する野生型の哺乳動物酵素である。十分な免疫学的応答は、ヒトの治療でのこのような酵素の臨床的使用を排除するものとみなされうる。本発明の突然変異哺乳動物酵素の基本的な性質は、この突然変異体基質結合部位の側面に位置するアミノ酸配列に関係ない突然変異体の基質結合部位の存在である。従って、突然変異体基質結合部位を含有し、１以上の異なった酵素から誘導される配列を側面に位置したキメラ酵素は、本発明の突然変異哺乳動物酵素の定義に含まれる。このようなキメラ酵素は、組換えＤＮＡ技術及び／又はタンパク質工学によって生じうる。指示された突然変異体誘発に適した酵素には、プロドラッグを薬剤に変換しうる酵素活性を有する酵素が含まれる。このような触媒活性には、トランスフェラーゼ、ヒドラーゼ、オキシリダクターゼ、イソメラーゼ、リアーゼ、又はリガーゼが含まれる。指示された突然変異体誘発は、新規な基質特異性を生じるが、関連した触媒活性の種類を保持する。例えば、本発明の突然変異体イソメラーゼは、突然変異体イソメラーゼによる活性化を受けやすいプロドラッグがイソメラーゼの存在下で実質的に安定なままであることを保証するように、突然変異イソメラーゼが誘導されるイソメラーゼと十分に異なった新規なイソメラーゼ活性を有するであろう。活性におけるこの劇的なシフトが、触媒部位のできるだけ小さな１つの残基の変化で達成されうることが示される。活性の所望のシフトを得るのに必要な最小数の残基の変化は、酵素の構造の継続を保証し、従って突然変異酵素が身体に導入されたとき負の免疫学的な効果を防ぐことができる。本発明の好ましい突然変異酵素は、突然変異哺乳動物カルボキシペプチダーゼＡ（ＣＰＡ）である。この酵素は、カルボキシ末端芳香族及び脂肪族アミノ酸残基を開裂する一般的な活性を有し、種の相違及び組織依存性変異体で特徴づけられる。特に好ましい突然変異カルポキシペプチダーゼには、ヒト膵臓カルボキシペプチダーゼＡ１（Catasus L．et al.，Biochem．J．287，299-303，1992）、ヒトマスト細胞カルボキシペプチダーゼＡ（Reynolds D.S.etal.，J．Clin．Inv est．89 273-282，1992）及びヒト膵臓カルボキシペプチダーゼＡ２（以下の図９）から誘導される突然変異体が含まれる。これらのカルボキシペプチダーゼの一般的特性は、ＣＰＡ−様の基質結合ポケットの存在であり、酵素の全配列若しくは構造に関わりのない酵素活性に関連すること、並びにこのＣＰＡ−様基質結合ポケットを有する酵素のいずれもが本発明の突然変異カルボキシペプチダーゼに対して変化の影響を受けやすいことが認識されるであろう。本発明の特に好ましい態様では、突然変異酵素は、突然変異ヒト膵臓カルボキシペプチダーゼＡ１若しくはＡ２（ＣＰＡ１若しくはＣＰＡ２）であり、更に好ましくは、アミノ酸の置換が、表４に示されるアミノ酸配列（これはそれぞれＣＰＡ及びＣＰＡ２の野生型（ｗ．ｔ．）配列を表す。）の１以上の残基、２０３、２１０、２４２、２４４、２５０、２５３、２５５、２６７、２６８、２６９及び３０５で起こっているＣＰＡ１若しくはＣＰＡ２である。残基の置換の特に好ましい組合せには、残基２５３及び２５５がｗ．ｔ．である場合、２５０及び２６８のＧｌｙ；２５０及び２５５がｗ．ｔ．の場合、２５３及び２６８のＧｌｙ；２５３及び２５５がｗ．ｔ．の場合、２５０のＧｌｙ及び２６８のＨｉｓ；２５３、２５５及び２６８がｗ．ｔ．の場合、２５０のＧｌｙ；２５０及び２５３がｗ．ｔ．の場合、２５５のＡｌａ及び２６８のＨｉｓ；並びに２５０、２５３及び２５５がｗ．ｔ．である場合、２６８のＨｉｓが含まれる。最も好ましい突然変異体は、１つの置換、即ち２６８でのＧｌｙを含むカルボキシペプチダーゼＡ１若しくはＡ２である。本発明の最も好ましい複合体は、ｍＡｂＣＡＭＰＡＴＨ− 一部、並びに表５に示されるようにアミノ酸の位置２６８にグリシンが存在する突然変異哺乳動物酵素ＣＰＡ１若しくはＣＰＡ２の何れかの少なくとも基質結合ドメインを具備する。ヒト膵臓カルボキシペプチダーゼＡは、プロ酵素にプロセッシングされ、続いて成熟した酵素にプロセッシングされるプレプロ酵素（図２）として発現される。本発明の突然変異カルポキシペプチダーゼは、プレプロ酵素、プロ酵素又は成熟した酵素の突然変異体であるが、好ましくは成熟した酵素の突然変異体である。これらの突然変異体は、プレプロ酵素、プロ酵素又は成熟した酵素から誘導されうるか、プロ酵素から誘導されることが好ましい。突然変異されたプロ酵素（又はプレプロ酵素）は次に、トリプシン化のような標準の方法により対応した成熟した酵素に変換されうる。本発明の成熟した酵素は、分子生物学の分野で周知の方法、特に、以下に例において説明する方法によって先に議論した活性を有する何れかの酵素のＤＮＡ又はＲＮＡ源から生じうる。本発明の酵素活性の選択及び成熟した酵素の一次配列は、関連したプロドラッグの性質、及びプロドラッグ部分の除去によって活性化されるタイプのプロドラッグであれば、その部分の正確な構造に明かに依存する。突然変異酵素の基質結合部位又は活性部位は、対応した突然変異でない酵素と異なって、酵素触媒が促進されるような方法でプロドラッグと相互作用することができなければならない。この活性を実施するための突然変異酵素の能力は、活性部位の三次元構造に微妙な変化に依存し、これはまた、タンパク質のこの領域の一次アミノ酸配列に依存する。タンパク質工学の標準的な技術による酵素の一次配列の変化は、対応するするプロドラッグを有する本発明に従った使用のための適切な突然変異酵素を生成させるであろう。新規なプロドラッグは、式（II）のもの、並びにその塩、Ｎ−オキシド、溶媒和化合物、生理学的に機能的な誘導体を含有する。但し、ＸはＮＨ又はＯを表し、Ｒ²は、ＣＯ₂Ｈ，ＳＯ₃Ｈ，ＳＯ₂Ｈ、ＯＳＯ₃Ｈ，ＰＯ₃Ｈ₂、ＯＰＯ₃Ｈ₂ 、Ｃ_1-6アルキルエステル化されたＣＯ₂Ｈ，Ｃ_1-6エステル化されたＰＯ₃Ｈ₃、Ｃ_4-12アルキル、Ｃ_4-12アルケニル、Ｃ_4-12アルキニル、Ｃ_4-12の枝分かれしたアルキル、Ｃ_1-8アルキル若しくはＣ_3-8の枝分かれしたアルキルであって、ＣＯ₂ Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、ＳＯ₂Ｈ、ＯＳＯ₃Ｈ、ＰＯ₃Ｈ₂、ＯＰＯ₃Ｈ₂、Ｃ_1-6アルキルエステル化されたＣＯ₂Ｈ、Ｃ_1-6アルキルエステル化されたＰＯ₃Ｈ₂、ヒドロキシル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、シアノ又はカルボキサミドで置換されたもの；Ｃ_3-8シクロアルキル、アリール若しくはヘテロアリールであって、Ｃ_1-8 アルキル、Ｃ_3-8枝分かれしたアルキル、Ｃ_3-8シクロアルキル、Ｃ_3-6アルケニル、Ｃ_2-6アルキニル、Ｃ_4-6シクロアルケニル、トリ置換シリル、即ち（Ｒ¹³）（Ｒ¹⁴）（Ｒ¹⁵）Ｓｉ（但し、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、及びＲ¹⁵はＣ_1-6アルキル、Ｃ_3-6枝分かれしたアルキルＣ_3-6シクロアルキル、Ｃ_3-6アルケニル、Ｃ_2-6シクロアルキニル、Ｃ_4-6シクロアルケニル、アリール、又はヘテロアリールであり、Ｒ¹³ 、Ｒ¹⁴、及びＲ¹⁵はそれぞれ同じ基であるか又は異なった基である（例えば、トリメチルシリル、tert−ブチルジメチルシリル、シクロヘキシルジメチルシリル、又はフェニルジメチルシリル））、アリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、ＳＯ₂Ｈ、ＯＳＯ₃Ｈ，ＰＯ₃Ｈ₂、ＯＰＯ₃Ｈ₂、Ｃ_1-6アルキルエステル化されたＣＯ₂Ｈ、Ｃ₁ _-6 アルキルエステル化されたＰＯ₃Ｈ₂、カルポキサミド、ヒドロキシル、Ｃ_1-6 アルコキシ、Ｃ_1-6アルキルチオ、メルカプト、ハロ、ハロアルキル、ニトロ又はシアノで任意に置換されたものを表わす。Ｒ^2a及びＲ^2bは、Ｈ、ヒドロキシ、メルカプト、アルコキシ、アルキルチオ、ハロ、シアノ、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、ＳＯ₂Ｈ、ＯＳＯ₃Ｈ、ＰＯ₃Ｈ₂、ＯＰＯ₃Ｈ₂、Ｃ_1-6アルキルエステル化されたＣＯ₂Ｈ、カルボキサミド、Ｃ_1-6アルキルエステル化されたＰＯ₃Ｈ₂、環状Ｃ_2-6 ［即ち、Ｒ^2a及びＲ^2bは、一緒になって（ＣＨ₂）_2-6を表す。］、三置換されたシリル、即ち（Ｒ¹³）（Ｒ¹⁴）（Ｒ¹⁵）Ｓｉ（但し、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、及びＲ¹⁵はＣ_1-6 アルキル、Ｃ_3-6の枝分かれしたアルキル、Ｃ_3-6シクロアルキル、Ｃ_3-6アルケニル、Ｃ_2-6アルキニル、Ｃ_4-6シクロアルケニル、アリール、又はヘテロアリールであり、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、及びＲ¹⁵は同じ基であってもまた異なった基でもよい、例えば、トリメチルシリル、tert−ブチルジメチルシリル、シクロヘキシルジメチルシリル、若しくはフェニルジメチルシリル；又はＣ_1-6若しくはＣ_1-6の枝分かれしたアルキル或いはＣ_1-6シクロアルキル又はアリール若しくはヘテロアリールであって、ヒドロキシ、メルカプト、Ｃ_1-6アルコキシ、Ｃ_1-6アルキルチオ、ハロ、シアノ、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、ＳＯ₂Ｈ、ＯＳＯ₃Ｈ、ニトロ、ＰＯ₃Ｈ₂、ＯＰＯ₃Ｈ₂、Ｃ_1-6アルキルエステル化されたＣＯ₂Ｈ、カルポキサミド、Ｃ_1-6アルキルエステル化されたＰＯ₃Ｈ₂、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_1-6の枝分かれしたアルキル、Ｃ_1-6 シクロアルキル、三置換されたシリル、即ち（Ｒ¹³）（Ｒ¹⁴）（Ｒ¹⁵）Ｓｉ（但し、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、及びＲ¹⁵はＣ_1-6アルキル、Ｃ_3-6の枝分かれしたアルキル、Ｃ_3-6 シクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールであり、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、及びＲ¹⁵は同じ基であってもまた異なった基でもよい、例えば、トリメチルシリル、 tert−ブチルシメチルシリル若しくはフェニルシメチルシリルで任意に置換されたものを表わすが、Ｒ^2a及びＲ^2bは両方ともヒドロキシ又はメルカプトでないという条件が付く。Ｆは式（IV）の部分を含有する但し、Ｒ¹はα−アミノ酸の側鎖に対応する基、例えばＨ、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_1-6アルケニル、Ｃ_1-6アルキニルであって、ＣＯ₂Ｈ、Ｃ_1-6アルキルでエステル化されたＣＯ₂Ｈ，ＯＰＯ₃Ｈ₂、ＰＯ₃Ｈ₂、Ｃ_1-6アルキルでエステル化されたＰＯ₃Ｈ₂、ハロ、ヒドロキシ、カルボキサミド、Ｃ_1-6アルキルで任意に置換されたアミノ、シアノ又はニトロで任意に置換されたものを表す。Ｅは、を表し、これらの各々は、１以上のヒドロキシ、１以上のアルコキシ、ハロ、又は１以上のヒドロキシ、Ｃ_1-6アルコキシ若しくはハロで任意に置換されたＣ_1-6 アルキルで任意に置換されうる。Ｄは、−ＣＨ₂ＣＨ（Ｒ³）−、−ＣＨ₂−ＮＲ³−、−ＮＲ³−ＣＨ₂−、− ＣＨ₂Ｓ−又は−ＣＨ₂Ｏ−（但し、Ｒ³はＨ、Ｃ_1-6アルキル、アリル又はプロパルギルであって、１以上のＣ_1-6アルコキシハロ、ヒドロキシ若しくはシアノで任意に置換されたものを表す。並びに、Ｂは、但し、Ｒ⁴は、Ｈ、Ｃ_3-6の枝分かれしたアルキル、Ｃ_3-6シクロアルキル、又はＣ_1-6アルキルを表し；Ｒ⁵は、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_3-6の枝分かれしたアルキル、Ｃ_3-6シクロアルキル、アミノ（Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_1-6アルカノイル若しくはベンジルで任意に置換されたもの）を表し；Ｒ⁶は、Ｈ、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_3-6の枝分かれしたアルキル、Ｃ_3-6シクロアルキル、アミノ（Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_1-6アルカノイル若しくはベンジルで任意に置換されたもの。）、Ｃ_1-6アルコキシ又はＣ_1-6アルキルチオを表し；Ｒ⁷は、Ｈ、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_3-6の枝分かれしたアルキル、Ｃ_3-6シクロアルキル、ハロＣ_1-6アルキル又はハロを表す。但し、以下の化合物は新規なプロドラッグの定義の範囲内に含まれないが、治療におけるこれらの化合物の使用は、本発明の位置態様を形成する。Ｎ−（Ｎ−（４−（（（２−アミノ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−６−キナゾリニル）メチル）（２−プロピニル）アミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−アスパラギン酸、Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−フェニルアラニン、４−ビス（２−クロロエチル）アミノ）−フェニルアラニルフェニルアラニン、及び４−ビス（２−クロロエチル）アミノ）−フェニルアラニル−３，５−ジメチル−４−メトキシフェニルアラニン。本発明に従ったプロドラッグの好ましい態様では、ＸはＮＨであり：Ｒ²は、Ｃ_3-8シクロアルキル又はアリールであって、Ｃ_1-8アルキル、Ｃ_3-8シクロアルキル、Ｃ_3-9の枝分かれしたアルキル若しくは三置換されたシリル、即ち（Ｒ¹³）（Ｒ¹⁴）（Ｒ¹⁵）Ｓｉ（但し、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、及びＲ¹⁵は、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_3-6の枝分かれしたアルキル、Ｃ_3-6シクロアルキル、アリール、若しくはヘテロアリールであり、更にＲ¹³、Ｒ¹⁴、及びＲ¹⁵は、同じ基であるか若しくは異なった基（例えば、トリメチルシリル、tert-ブチルジメチルシリル、シクロヘキシルジメチルシリル、若しくはフェニルジメチルシリル）である。）で置換されたものであり；Ｒ^2a及びＲ^2bは両方ともＨであり；Ｒ¹は、Ｈ、Ｃ_1-6アルキル、ＣＨ₂ＣＯ₂Ｈ、ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯ₂Ｈ又はＣＨ₂ＣＨ₂ ＣＨ₂ＮＨ₂であり；Ｅは、であり、Ｄは−ＣＨ₂ＮＨ−、−ＣＨ₂Ｎ（ＣＨ₃）−、−ＣＨ₂Ｎ（ＣＨ₂Ｃ≡ＣＨ）− 、−ＣＨ₂ＣＨ₂−又は−ＣＨ₂−ＣＨ（Ｃ₂Ｈ₅）−であり；並びに、Ｂは、であり、並びに、これらの塩、Ｎ−オキシド、溶媒和化合物及び生理学的に機能的な誘導体である。本発明に従ったプロドラッグの最も好ましい態様では、ＸはＮＨである：Ｒ²は、フェニル若しくはパラ−ヒドロキシフェニルであって、シクロペンチル、シクロブチル若しくはtert−ブチルで置換されているものである。該シクロペンチル、シクロブチル及びtert−ブチル基はオルト−若しくはメタ−の両方であるか、これらの何れかであり得るが、好ましくはメタ−であり、Ｒ^2a及びＲ^2b はＨである。Ｒ¹はＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯ₂Ｈである。Ｅは、である。Ｄは、−ＣＨ₂Ｎ（ＣＨ₃）−であり、Ｂは、であり、これらの塩、Ｎ−オキシド、溶媒和化合物及び生理学的に機能的な誘導体である。上記のようなプロドラッグにキラル中心が存在する場合、これらは、各々独立にＳ又はＲ配置の何れかであるか、又はＳ及びＲ配置の混合物であり得る。これらは、「Ｆ」及びＸに隣接した式（II）のキラル炭素に対してＳ−配置であることが好ましい。本発明に従った使用のための好ましいプロドラッグは、アルケラン（Alkeran ）(T.M.The Wellcome Foundation limted)の名称で商業的に利用可能であり、４ −［ビス（２−クロロエチル）アミノ］−１−フェニルアラニンの化学名を有する細胞毒性薬、メルファラン（melphalan）（ＵＫ７５０，１５５）のプロドラッグである。本発明に従ったメルファランのプロドラッグは、下記の一般式を有する。但し、Ｒ²、Ｒ^2a、Ｒ^2b及びＸは先に定義したとおりである。以下のものが本発明に従った特に好ましい新規なプロドラッグである。Ｎ−（（Ｓ）−４−カルボキシ−２−（５−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（Ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−１− オキソ−２−イソインドリニル）ブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロブチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１ −イル−３−トリメチルシリル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−tert−ブチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−（４−（（３−（２，４−ジアミノ−１，６−ジヒドロ−６−オキソ−５ −ピリミジニル）プロピル）アミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル −３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−（４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（Ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル−メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−チロシン、Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３，５−ジヨード−Ｌ−チロシン、Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−シクロペンチル−Ｌ−チロシン、（Ｓ）−３−（３−シクロペンチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−（（Ｎ −（４（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル）オキシ）プロピオン酸、Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−tert−ブチル−Ｌ−チロシン、及びこれらの塩、Ｎ−オキシド、溶媒和化合物及び生理学的に機能的な誘導体。本発明に従った最も好ましいプロドラッグは、Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−チロシンである。ここで説明される化合物のいずれの化学構造の、いずれのキラル中心も、Ｒ及びＳ配置であり得る。化学構造のこれらのキラル中心は、好ましいＳ−配置で描写されるが、Ｒ−配置のキラル中心を有する対応する化学構造、並びにこれらの化合物のエナンチオマー及びジアステレオマー混合物も本発明に関係するものとして考慮されると解される。Ｂ、Ｄ及びＥが式（III）で定義したとおりであり、Ｘ、Ｒ¹及びＲ²が式（IV ）及び（II）で定義したとおりである式（V）のプロドラッグは、Ｒ⁸が、メチル、エチル、tert−ブチル若しくはシクロヘキシルのようなアルキル、分岐アルキル、又は環状アルキル基；又はフェニル、２,６−ジメチルフェニルのようなアリール；ベンジル（これは、ハロ、アルコキシ、若しくはアルキル基、例えばメチル若しくはtert−ブチルで任意に置換されている。）；又は９−フルオレニルメチル（Ｆｍ）である式（VI）エステルを、ＮａＯＨ、ＬｉＯＨのような塩基；又はＲ⁸ がＦｍである場合は、ジエチルアミン若しくはピペリジンの存在下において；又はＨＣｌ若しくはトリフルオロ酢酸のような酸の存在下において、ＴＨＦ、ニトロメタン若しくはＴＨＦ：Ｈ₂Ｏのような溶媒若しくは溶媒混合物中、所定の温度、例えば０℃から還流温度、適切には室温で、或いは、ＨＣｌ若しくはトリフルオロ酢酸のような酸の存在下、ＴＨＦ若しくはニトロメタンのような溶媒中、所定の温度、例えば０℃から還流温度、適切には室温で加水分解することによって、又は、Ｒ⁸がメチル、若しくはtert−ブチルのようなアルキル基で任意に置換された９−フルオレニルメチル（Ｆｍ）若しくはベンジルである場合には、周囲又は上昇された圧力、例えば１〜７５kgcm^-2から７．０Kgcm^-2、好ましくは３．５kgcm^-2で、パラジウム−炭素のような触媒の存在下において、極性溶媒、例えばメタノール若しくはエタノール若しくはメタノールとジクロロメタンの混合物中、周囲温度で水素を用いて加水素化分解をすることによって、又は、Rylander,P.N.,有機合成における触媒水素化(Catalytic Hydrogenation in Organic Syntheses)、Academic Press: New York，1979、又はRylander，P．N.，水素化法（Hydrogenation Methods）、Academic Press: Lo ndon，1985、又はBodanszky，M.，et al.，ペプチド合成の実際（The Practice of Peptide Synthesis）、Springer-Verlag: Berlin，1984（これらは参照文献として本明細書の一部を成す。）に開示された方法のような当業者に公知の方法によって製造されうる。或いは、Ｒ⁸が、メチル若しくはtert−ブチルのような適切なアルキル基で任意に置換されたアルコキシで置換（好ましくはフェニルリングの２−、４−、又は６−位で）されたフェニル若しくはベンジルである場合は、硝酸アンモニウムセリウム（ceric ammonium nitrate）又はジクロロジシアノキノン（ＤＤＱ）のような適切な酸化剤の存在下において、メタノール、水、ジクロロメタン、若しくはこれらの組合せのような適切な溶媒中で酸化することによって、Heathcock，C．H.，et al.，Tetrahedron，1981，37，4087に開示された方法；又はGreene，T．W.，et al.，有機合成における保護基、第二版（Pro tective Groups in Organic Synthesis，second edition）、John Wiley & Sons : New York，1991に開示された方法のような当業者に公知の方法によって酸化することによって製造されうる。或いは、Ｒ⁸が２−（トリメチルシリル）エチルである場合は、フッ化カリウム若しくはフッ化テトラブチルアンモニウムのような適切な求核剤の供給権と反応することによって製造される。これらの方法は、 Greene，T.W．et al.，有機合成における保護基、第二版(Protective Groups in Organic Synthesis， second edition)、John Wiley & Sons: New York，1991、若しくは Bodanszky， M.，et al.，ペプチド合成の実際（The Practice of Peptide Synthesis）、Spr inger-Verlag: Berlin，1984、若しくはJones，J.，ペプチドの化学合成（The C hemical Synthesis of Peptides）、Clarendon Press: Oxford，England，1991 （これらは参照文献として本明細書の一部をなす。）に開示されたような当業者に公知の方法である。或いは、Ｒ⁸がオルトニトロフェノールのような光除去されうる基である場合は、Cama，L．D．et al.，J．Am．Chem．Soc.，1978，100， 8006、若しくはPillai，V.N.R.，Synthesis，1980，1、若しくは Pillai，V.N.R .，Org．Photochem.，1987，9，225（これらは、参照文献として本明細書の一部をなす。）で開示されたような当業者に公知の光分解法によって製造される。側鎖Ｒ¹又はＲ²に存在するエステルは、Ｒ⁸を加水分解するために用いられた同じ反応混合物ないで加水分解されてもされなくてもよく、これはエステル基及び反応条件の選択に依存する。エステル（VI）は、Ｒ¹が式（IV）で定義したとおりであり、Ｒ²及びＸが式（ II）で先に定義したとおりであり、Ｒ⁸が式（VI）で先に定義したとおりである式（VII）のアミンを、式（VIII）のカルボン酸と反応することによって製造することができる。但し、Ｂ及びＤは先に定義したとおりであり、Ｇは基（IX）、 −（ＣＨ₂）_n− （IX）但し、ｎ＝３〜７又は１，４−シクロヘキシル（Ｘ）但し、１−及び４−置換基は、シス−若しくはトランス−配置の何れか又はこの２種類の配置の混合物である。又は以下のものから選択される芳香族基を表す。式（VII）のアミンと、式（VIII）のカルボン酸との反応は、カップリング剤（これには、ジエチルシアノホスホネート（XI）、１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（XII）、又はジシクロヘキシルカルボジイミド（XIIa）が含まれるがこれに限定されない。）の存在下において、必要に応じて１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）のような活性基の存在下、非プロトン性極性溶媒、適切にはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）又はＮ，Ｎ−ジメチルプロピレン尿素（ＤＭＰＵ）中、所定の温度、例えば０℃から８０℃、適切には室温で行われる。この他には、式（VI）のエステルは、カルボン酸（VIII）及びトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、若しくはＮ−メチルモルホリンのような三級アミン塩基の混合物を、ＤＭＦ若しくはＤＭＰＵのような非プロトン性溶媒中、０ ℃から２５℃の温度で、クロロ蟻酸イソブチル若しくはクロロ蟻酸エチルのようなアシル化剤を用いて処理し、次いでアミン（VII）を添加することによって製造することができる。幾つかの好ましいカルボン酸（VIII）は、商業的な供給者から購入することができる。例えば、（XIII）はアルドリッチケミカル社(Aldrch Chemical Co)から購入することができる。或いは、文献に記載の方法を介して調製することができる。例えば、（XIV）：De Graw，J I，et al.，J．Med Chem.，1982，25，1227; Ibid，1986，29，1056．（XV）：Jonse，TR，et al.，J．Med．Chem.，1986，2 9 ，1114; Nair，M G，et al.，Ibid，1986，29，1754; Ghazola，M，et al.，Ib id ，1986，29，1263; Acharya S.P．et al.，J．Heterocyclic Chem，1975，12 ，1283．（XVI）：Barnett，C J，et al，Tetrahedron Lett，1989，30，6291．（XVII）：Styles，V L，et al.，J．Med Chem，1990，33，561，Taylor，E.c. ，et al．J．Med．Chem. 1992，32 1517：（XVIIa）：Bisset，G.M.F．et al J ．Med．Chem. 1992 35 859。式（VIII）のカルボン酸は、式（XVIII）（但し、Ｂ及びＤは式（III）で先に定義したとおりであり、Ｇは式（VIII）で細に定義したとおりであり、Ｒ⁹はメチル、エチル、若しくは tert−ブチルのような適切な基である。）のエステルを、通常はＮａＯＨ若しくはＬｉＯＨのような適切な塩基、又はＨＣｌ若しくはトリフルオロ酢酸のような適切な酸の存在下において、ＴＨＦ、ニトロメタン、若しくはＴＨＦ：Ｈ₂Ｏのような適切な溶媒若しくは溶媒混合物中、所定の温度、例えば０℃から還流温度、適切には室温で加水分解することによって製造することができる。Ｂ−Ｄ−Ｇ−ＣＯ₂−Ｒ⁹ （XVIII）式（III）又は（XVIII）のＤが−ＣＨ₂−ＮＲ³を表すプロドラッグに対しては、式（XVIII）のエステルは、以下のようにして製造されうる。（ａ）式（XIX）の化合物と、Ｒ¹⁰−Ｇ−ＣＯ₂Ｒ⁹ （XIX）但し、Ｇは式（VIII）で先に定義したとおりであり、Ｒ⁹は（XVIII）で先に定義したとおりであり、Ｒ¹⁰はＮＨＲ³（ここでＲ³は式（III）で先に定義したとおりである）を表す。式（XX）の化合物を反応すること。Ｋ−Ｒ¹¹ （XX）但し、Ｒ¹¹はアルデヒド基若しくはシアノ基であり、Ｋは式（III）のＢで定義したようなヘテロ環基若しくはＺ＝Ｏである（XXI）のような基、又は式（III）のＢで定義したような基若しくはより適切な反応剤を提供するための適切な保護基で置換されたＺ＝Ｏである（XXI）のような基（適切な基にはＮ −ピバロイル、Ｎ−ベンゾイル、Ｎ−カルボベンゾイル（N-cbz）、若しくはＮ −tert−ブトキシカルボニル（N-t-BOC）が含まれるがこれらに限定されない。）である。このような保護基は、適切な場合には、Greene，T.W.，et al.，有機合成における保護基、第二版 (Protective Groups in Organic Synthesis，second edition)、John Wiley & Sons: New York，1991（これは参照文献として本明細書の一部をなす。）に開示された方法のような当業者に公知の標準的な方法を用いてこの合成の後の段階で除去することができる。式（XVIII）のエステルは、ＴＨＦ、ＤＭＰＵ、ＤＭＦ、エタノール、若しくは酢酸のような溶媒中、２５℃から１００℃の間の温度で、反応の間に必要に応じて水を除去しながら（XVI）と（XX）を反応し、次いで当業者に公知の標準的な反応条件でナトリウムシアノボロハイドライドで、若しくはラネーニッケルのような適切な触媒の存在下に水素ガスで還元することによって製造されうる。（ｂ）（ａ）で定義した式（XIX）の化合物を、Ｋが（ａ）で定義した式（XX）であるが、Ｒ¹¹がＣＨ₂Ｙ（Ｙはクロロ、ブロモ、ヨード、メシル、若しくはトシルのような脱離基として定義される。）として定義されるものと、ＴＨＦのような適切な溶媒中、ＮａＨＣＯ₃、Ｎａ₂ＣＯ₃、Ｋ₂ＣＯ₃、トリエチルアミン、若しくはジイソプロピルエチルアミンのような塩基の存在下に上昇された温度、例えば５０から１５０℃、適切には８０℃から１２０℃で反応すること。式（III）及び式（XVIII）のＤが−ＮＲ³−ＣＨ₂−を表すプロドラッグに対しては、式（XVIII）のエステルは、式（XIX）の化合物（但し、Ｒ¹⁰はアルデヒド基を表し、Ｇは式（VIII）で先に定義したとおりである。）を、式（XX）の化合物（但し、Ｋは式（XX）で先に定義したとおりであり、Ｒ¹¹はＨＮＲ³（但し、Ｒ³は式（III）で先に定義したとおりである。）で定義される。）と、ＴＨＦ、ＤＭＦ、ＤＭＰＵ、若しくは酢酸のような適切な溶媒中、２５℃から１００℃の間の温度で、必要に応じて反応中に水を除去しながら反応し、次いで、ナトリウムシアノボロハイドライドで、又はラネーニッケルのような適切な触媒の存在下に水素ガスで還元することによって製造するこつができる。式（III）及び式（XVIII）のＤが−ＣＨ₂Ｏ−若しくは−ＣＨ₂Ｓ−を表すプロドラッグに対しては、式（XVIII）のエステルは、Ｒ⁹が式（XVIII）で定義したとおりであり、Ｇが式（VIII）で定義したとおりであり、Ｒ¹⁰がＯＨ若しくはＳＨである式（XIX）の化合物を、Ｋが式（XX）で定義したとおりであり、Ｒ¹¹がＣＨ₂Ｙ（Ｙはクロロ、ブロモ、ヨード、メシル、若しくはトシルのような脱離基として定義される。）である式（XX）の化合物と、ＤＭＦ、ＤＭＰＵ、若しくはアセトンのような適切な溶媒中、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、炭酸セシウム、重炭酸セシウム、炭酸ナトリウム、若しくは重炭酸ナトリウムのような塩基の存在下において２５℃から８０℃の温度で反応することによって製造することができる。式（III）及び式（XVIII）のＤが−ＣＨ₂ＣＨ₂−を表すプロドラッグに対しては、式（XVIII）のエステルは以下のように製造される。（ａ）Ｋが式（XX）で定義したとおりであり、Ｒ¹¹がＣＨ₂Ｂｒである式（XX）の化合物とトリフェニルホスフィンとを、極性溶媒、例えばＣ_1-4アルカノール若しくはグリコール、適切にはメタノール若しくはエタノール中、塩基、例えば金属と該溶媒から適切に形成されるアルカリアルコキシド、即ちナトリウムメトキシド若しくはナトリウムエトキシドの存在下に、０℃から還流温度で反応し、次いで、Ｒ⁹が式（XVIII）で定義したとおりであり、Ｇが式（VIII）で定義したとおりであり、Ｒ¹⁰がアルデヒド基である式（XIX）の化合物を添加し、次いで極性溶媒、例えばメタノール若しくはエタノール又はメタノールとジクロロメタンの混合物中、周囲温度においてパラジウム−炭のような適切な触媒の存在下に上昇された圧力、例えば１．７５ kgcm^-2及び７．０kgcm^-2の間、適切には３．５kgcm^-2で水素で還元すること。（ｂ）Ｒ⁹が式（XVIII）で定義したとおりであり、Ｇが式（VIII）で定義したとおりであり、Ｒ¹⁰がＣＨ₂Ｂｒである式（XIX）の化合物とトリフェニルホスフィンとを、極性溶媒、例えばＣ_1-4アルカノール若しくはグリコール、適切にはメタノール若しくはエタノール中、通常は塩基、例えば金属と該溶媒から適切に形成される金属アルコキシド、即ちナトリウムメトキシド若しくはナトリウムエトキシドの存在下、０℃から還流温度の温度で反応し、次いでＫが式（XX）で定義したとおりであり、Ｒ¹¹がアルデヒド基である式（XX）の化合物を添加し、次いで極性溶媒、例えばメタノール若しくはエタノール又はメタノールとジクロロメタンの混合物中、周囲温度においてパラジウム−炭のような適切な触媒の存在下に上昇された圧力、例えば１．７５kgcm^-2及び７．０kgcm^-2の間、適切には３．５kgcm^-2で水素で還元すること。（ｃ）Ｋが式（XX）で定義したとおりであり、Ｒ¹¹がクロロ、ブロモ、若しくはヨードである式（XX）の化合物と、Ｒ⁹が式（XVIII）で定義したとおりであり、Ｇが式（VIII）で定義したとおりであり、Ｒ¹⁰がアセチレン基Ｃ≡ＣＨである式（XIX）の化合物と反応すること。この反応は、Ｐｄ（０）触媒、適切にはトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム、及びトリエチルアミン若しくはジイソプロピルエチルアミンのような塩基の存在下において、ＤＭＦ若しくはＤＭＰＵのような非プロトン性極性溶媒中、２５℃から５０℃の温度で行われ、引き続いて、極性溶媒、例えばメタノール若しくはエタノール又はメタノールとジクロロメタンの混合物中、周囲温度においてパラジウム−炭のような適切な触媒の存在下に上昇された圧力、例えば１．７５kgcm^-2及び７．０kgcm^-2の間、適切には３．５kgcm^-2で水素で還元される。式（III）及び式（XVIII）のＤが−ＣＨ₂ＣＨ（Ｒ³）−（但し、Ｒ³は式（III ）で定義されたとおりである。）プロドラッグに対しては、式（XVIII）のエステルは、Ｋが式（XX）で定義したとおりであり、Ｒ¹¹がＣＨ₂Ｂｒである式（XX ）の化合物とトリブチルホスフィン若しくはトリフェニルホスフィンとを、極性溶媒、例えばＣ_1-4アルカノール若しくはグリコール、適切にはメタノール若しくはエタノール中、通常は、塩基、例えば金属と該溶媒から適切に形成されるアルカリアルコキシド、即ちナトリウムメトキシド若しくはナトリウムエトキシドの存在下において、又はジメチルスルホキシドと水素化ナトリウムのような塩基の溶液中２５℃から８０℃で反応し、次いで、Ｒ⁹が式（XVIII）で定義したとおりであり、Ｇが式（VIII）で定義したとおりであり、Ｒ¹⁰がケト基−（ＣＯ）−Ｒ³ （但し、Ｒ³は式（III）で定義したとおりである。）である式（XIX）の化合物を添加し、引き続き反応混合物を２５℃から還流温度で４から９６時間、適切には２４から４８時間の広範な期間撹拌し、次いで極性溶媒、例えばメタノール若しくはエタノール又はメタノールとジクロロメタンの混合物中、周囲温度においてパラジウム−炭若しくは酸化白金のような適切な触媒の存在下に上昇された圧力、例えば１．７５kgcm^-2及び７．０kgcm^-2の間、適切には３．５kgcm^-2で水素で還元される。Ｋが先に定義されたとおりであり、Ｒ¹¹がＣＨ₂Ｂｒである式（XX）の化合物は当業者に利用可能な方法論を用いて製造することができる（Piper，K R et al ，J Org Chem，1977，42，208; Piper，L R et al，J Med Chem，1986，29，108 0; Oakes，V，et al，J Chem Soc，1956，4433; Acharya，S P，et al，J Heter ocvclic Chem ，1975，12，1283; Bird，O D，et al，プテリジンの化学内（in P teridine Chemisty ）、Pfleiderer W & Taylor E C，Eds，Pergamon Press，Oxf ord，1964，p.417; Piper，J R，et al，J Heterocvclic Chem，1974，279）。Ｋが先に定義したとおりであり、Ｒ¹¹がアルデヒド基である式（XX）の化合物は、当業者に利用可能な方法論を用いて製造することができる（Taylor，E C，et al，J Org Chem，1983，48，4852; Ar nold，A，et al，Collect Czech Chem Commun，1960，25，1318; Beardsley，G P，et al，Proc Am Assoc Cancer Res1986 1027）。Ｋが先に定義したとおりであり、Ｒ¹¹がシアノ基である式（XX）の化合物は、当業者に利用可能な方法論を用いて製造することができる（Elsager，E F，et a l，Lect Heterocvclic Chem，1974，2，S-97; Davoll，J，et al，J Chem Soc(C ) ，1970，997; Jones，T.R.，Eur．J．Cancer，1981，17，11; Kondo，T.，et a l.，Chem．Lett.，1980，559）。Ｋが先に定義したとおりであり、Ｒ¹¹がアミノ基である式（XX）の化合物は、当業者に利用可能な方法論を用いて製造することができる（Hynes，J B，et al ，J Med Chem，1975，18，632，1191; Davoll，J，et al，J Med Chem，1972，1 5 ，837; Bernetti，R et al，J Org Chem，1962，27，2863）。Ｋが先に定義したとおりであり、Ｒ¹¹がブロモ、クロロ若しくはヨード基である式（XX）の化合物は、当業者に利用可能な方法論を用いて製造することができる（Taylor，E C，et al，J Med Chem，1992，35，4450; Taylor，E C，et al， J Org Chem，1989，54，3618; Jones，J H，et al，J Med Chem，1968，11，322 ）。Ａが式（XXI）（但しＺ＝Ｓである。）の基である式（VIII）のカルボン酸は、Ｃが式（XXI）（但しＺ＝Ｏである。）の基である式（VIII）の基から、ピリジンのような溶媒中、２５℃と還流温度の間の温度でＰ₂Ｓ₅のような硫化剤と反応することによって製造されうる。Ｇが式（VIII）で定義したとおりであり、Ｒ⁹が式（XVIII）で定義したとおりであり、Ｒ¹⁰がＮＨＲ³（Ｒ³が式（III）で定義したとおりである。）である式（XIX）の化合物は、Ｇ及びＲ⁹が先に定義したとおりであり、Ｒ¹⁰がＮＨ₂である式（XIX）の化合物から、化合物Ｒ³−Ｙ（但し、Ｙはクロロ、ブロモ、ヨード、メシル、若しくはトシルのような脱離基として定義される。）と２，６−ルチジンのような適切な塩基の存在において、ＤＭＦ若しくはジメチルアセトアミドのような非プロトン性極性溶媒中、５０℃と１００℃の間の上昇された温度で反応することによって製造することができる。Ｇがフェニル若しくはフリル基であり、Ｒ¹⁰がＮＨ₂であり、Ｒ⁹が式（XVIII ）で定義したとおりである、式（XIX）の化合物は、商業的供給者から得ることができるか、又は商業的供給者から利用可能な化合物から容易に製造することができる。このような好ましい化合物の１つである式（XXII）の化合物は、N Soundararaja n及びM S Platzによって開示された方法によって製造することができる（Sounda rarajan N et al，J Org Chem，1990，55，2034）。このような好ましい化合物の１つは、式（XXIIa）であり、これはMackay，D.，Can J．Chem，1966，44，28 81;若しくはPaul，H.，et al.，Arch．Pharm，1978，52 538に開示された方法によって製造されうる。Ｇがシクロヘキシル基であり、Ｒ¹⁰がＮＨ₂であり、Ｒ⁹が式（XVIII）で定義したとおりである式（XIX）の化合物は、商業的供給者から得ることができるか、又は当業者に利用可能な標準的方法を用いて容易に製造することができる（Ba nfi，A，et al，Synth Commun，1989，19，1787; Krieg，R，et al，J Prakt Ch em ，1987，329，1123; Johnston，T P，et al，J Med Chem，1977，20，279）。Ｇがチエニル基であり、Ｒ¹⁰がＮＨ₂であり、Ｒ⁹が式（XVIII）で定義したとおりである式（XIX）の化合物は、当業者に利用可能な方法論によって製造することができる（Goddard，C J，J Heterocvclic Chem，1991，28，17; Decriox， B，et al，J Chem Res（S），1978，134; Paul，H，et al，Arch Pharm，1978，311 ，679; Mackay，D，Can J Chem，1966，44，2881）。Ｇがチアゾール基であり、Ｒ¹⁰がＮＨ₂であり、Ｒ⁹が式（XVIII）で定義したとおりである式（XIX）の化合物は、エステル化及び当業者に公知の還元方法を用いて、５−ニトロチアゾール−２−カルボン酸（Strehlke，P，Chem Ber，197 3，106，721）から製造しうる。Ｇがピリジル基であり、Ｒ¹⁰がＮＨ₂であり、Ｒ⁹が式（XVIII）で定義したとおりである式（XIX）の化合物は、当業者に利用可能な方法論を用いて製造することができる（Dawson，M I,et al，J Med Chem，1983，26，1282; Finch，N et al，J Med C hem ，1978，21，1269; Cooper，G H，et al，J Chem Soc(C)，1971，3257; Dead y，L W，et al，Aust J Chem，1971，24，385）。Ｇがピリジル基であり、Ｒ¹⁰がＮＨ₂であり、Ｒ⁹が（XVIII）で定義したとおりである式（XIX）の化合物は、P R Marsham らによって開示された方法に類似の方法を用いて製造することができる（Marsham，P R，et al，J Med Chem，199 1，34，1594）。式（VIII）を合成するための一般的方法は、２つの最近の総説に開示されている（Palmer，D C，et al，Prog Med Chem，1988，25，85; Rosowsky，A，Prog M ed Chem ，1989，26 ，1）。Ｅが下式で定義される式（VI）のエステルは、Ｒ¹¹がＣＨ₂Ｂｒである式（XX）の化合物と、Ｒ¹が式（IV）で定義されたとおりである式（XXIII）の化合物とを、但し、Ｒ²は式（II）で定義したとおりであり、Ｒ⁸は式（VI）で定義したとおりである。ＤＭＦ若しくはＤＭＰＵのような極性溶媒中、重炭酸ナトリウム、重炭酸セシウム、炭酸ナトリウム若しくは炭酸セリウムのような塩基の存在下において、上昇された温度、例えば５０℃から１００℃、適切には１００℃ で反応することによって製造することができる。式（XXIII）の化合物は、式（V II）の化合物と式（XXIV）の化合物をW Pendergast等(Pendergast，W，et al，J Med Chem，[1994]，37 p838)又は特許出願ＷＯ０１／１９７００（これらは参照文献として本明細書の一部をなす。）によって開示された方法に類似の方法によって製造することができる。式（VII）の化合物は、Ｒ¹が式（IV）で定義したとおりであり、Ｒ²及びＸが式（II）で定義したとおりであり、Ｒ⁸が式（VI）で定義したとおりであり、Ｒ¹ ² がＮ−tert−ブトキシカルボニル（N-t-Boc）若しくはＮ−カルボベンゾイルオキシ（N-Cbz）のような適切な保護基を表す式（XXV）の化合物から製造することができる。この方法は、Greene，T．W.，et al.，有機合成における保護基、第二版（Protective Groups in Organic Synthesis，second edition）、John Wil ey & Sons: New York，1991（これは参照文献として本明細書の一部をなす。）に開示された方法のように当業者に公知である。式（XXV）の化合物は、式（XXVI）のカルボン酸及び式（XXVII）の化合物（但し、Ｘは式（II）で定義したとおりである。）を反応することによって製造することができる。ＸがＮＨである化合物に対しては、式（XXV）の化合物は、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド若しくはジシクロヘキシルカルボジイミドのような適切なカップリング剤の存在下、Ｎ−メチルモルホリンのような適切な塩基の存在下、ジクロロメタン若しくはＤＭＦのような非プロトン性溶媒中、０ ℃から５０℃で式（XXVI）のカルボン酸と式（XXVII）のアミン（但し、ＸはＮＨである。）との反応によって、又はBodanszky，M.，et al.，ペプチド合成の実際（The Practice of Peptide Synthesis）、Springer-Verlag: Berlin，1984 若しくはJones，J.，ペプチドの化学合成（The Chemical Synthesis of Peptide s ）、Claredon Press: Oxford，England，1991（これらは参照文献として本明細書の一部をなす。）に開示された方法のような当業者に公知の方法によって製造することができる。ジクロロメタン又はＤＭＦ０℃から５０℃で、この方法は、Greene，T．W.，et al.，有機合成における保護基、第二版（Protective Groups in Organic Synthe sis，second edition）、John Wiley & Sons: New York，1991（これは参照文献として本明細書の一部をなす。）に開示された方法のように当業者に公知である。ＸがＯである式（XXV）の化合物に対して、式（XXV）の化合物は式（XXVI）のカルボン酸をパラトルエンスルホニルクロライド若しくはベンゼンスルホニルクロライドのような適切な活性化剤と、ピリジン若しくはルチジンのような適切な溶媒中、０℃と２５℃の間の温度で反応し、次いでＸがＯである式（XXVII）のアルコールを添加することによって製造することができる。Ｘが式（II）で定義した通りである式（XXVII）のエステルは、当業者に公知の標準的な方法を用いて式（XXVIII）のカルボン酸から製造することができる。この方法は、Greene，T.W.，et al.，有機合成における保護基、第二版（Protecti ve Groups in Organic Synthesis，second edition）、John Wiley & Sons: New York，1991（これは参照文献として本明細書の一部をなす。）に開示された方法のように当業者に公知である。ＸがＯである式（XXVIII）のカルボン酸は、CMorinら(Morin，C，et al，Synt hesis ，1987，479)及びK Moriら（Mori，K，et al，Tetrahedron，1982，38，37 05）によって開示されている方法に類似の方法によってＸがＮＨである式（XXVI II）のカルボン酸から製造されうる。ＸがＮＨである式（XXVIII）のカルボン酸は、Ｗがクロロ、ブロモ、ヨード、メシル、若しくはトシルのような脱離基であり、Ｒ²が式（II）で定義されたとおりである式（XXIX）の化合物から、ＷＣＨ₂Ｒ² （XXIX） R M Williams（Williams，R M，Aldrichimica Acta，1992，25，11 及びこれに記載された文献）、又はM J O'Donnell ら（O'Donnell，M J，et al，J Am Chem Soc ，1989，111，2353）に開示されたのと類似の方法で製造されうる。Ｗがクロロ、ブロモ、ヨード、メシル、若しくはトシルのような脱離基である式（XXIX）の化合物は、Ｗがヒドロキシル基である式（XXIX）の化合物から製造することができる。この方法は、March，J.，Advanced Organic Chemistry．fou rth edition ，John Wiley & Sons: New York，1992（これは参照文献として本出願の一部をなす。）に開示された方法のように当業者に公知である。Ｒ²がＣ_1-8アルキル、Ｃ_3-8分岐アルキル、若しくはＣ_3-8シクロアルキルで置換されたフェニル基である式（XXIX）の好ましい化合物の幾つかは、Ｗがヒドロキシル基、若しくは、当業者に公知の標準的な方法でこの合成の適切なところで結合され、後に除去される適切な保護基を有するヒドロキシル基であり、Ｒ²がヨード若しくはブロモ基で置換されたフェニル基である（XXIX）の化合物の反応によって製造されうる。この反応は、 H A Dieckら（Dieck，H A，et al，J Am Chem Soc，1974，96，1133）により開示された方法に類似の方法によってＰｄ触媒の存在下適切なオレフィンを添加し、次いで当業者に公知の標準的な条件を用いて適切な触媒の存在下、水素ガスで還元すること（この方法は、Rylander，P.N.，有機合成における触媒水素化（Ca talytic Hydrogenation in Organic Synthesis）、Academic Press: New York， 1985、若しくはRylander，P.N.，水素化方法(Hydrogenation Methods)、Academi c Press: London，1985（これは参照文献として本明細書の一部をなす。）に開示された方法のように当業者に公知である。）により行われうるか、又は該反応は、ＴＨＦのようなエーテル系溶媒中、低い温度、例えば−１００℃から−２０ ℃、適切には−７８℃でｎ−ブチルリチウム試薬のような適切なアルキルリチウムと反応し、次いでC T West 等（West，C T，et al，J Org Chem，1973，38，2 675）に開示された方法と類似の方法で、得られたベンジロニックアルコール基を添加することによって行われうる。Ｒ²が、カルボキシル若しくはエステル化されたカルボキシル基で置換されたフェニル基である式（XXIX）の好ましい化合物の幾つかは、Ｗがヒドロキシル基であり、Ｒ²がブロモ若しくはヨード基で置換されたフェニル基である式（XXIX）の化合物と一酸化炭素とを、適切なアルカノール溶媒中においてA Schoenberら（Schoenber，A， et al，J Org Chem，1974，39，3318）に開示された方法と類似の方法で反応し、次いで所望であれば、得られたエステルを加水分解することによって製造することができる。この加水分解方法は、Greene，T.W.，et al.，有機合成における保護基、第二版（Protective Groups in Organic Synthesis，second edition）、John Wiley & Sons: New York，1991（これは参照文献として本明細書の一部をなす。）に開示された方法のように当業者に公知である。ＸがＮＨであり、Ｒ²がＣ_1-8アルキル、Ｃ_3-8分岐アルキル、又はＣ_3-8シクロアルキルである式（XXVIII）の好ましいカルボン酸の幾つかは、ブロモ若しくはヨード基でフェニル基が置換されたチロシンを、H A Dieckら（Dieck，H A，et al，J Am Chem Soc，1974，96，1133）によって開示された方法と類似の方法でＰｄ触媒の存在下適切なオレフィンと反応し、次いで当業者に公知の標準的な条件を用いて適切な触媒の存在下、水素ガスで還元することすることによって製造できる。この場合、アミノ及び／又はカルボキシル基は合成の適切な段階で結合され、後に除去されうる適切な保護基で必要に応じて置換されており、この方法は、Greene，T.W.，et al.，有機合成における保護基、第二版（Protective Gro ups in Organic Synthesis，second edition）、John Wiley & Sons: New York ，1991（これは参照文献として本明細書の一部をなす。）に開示された方法のように当業者に公知である。ＸがＮＨであり、Ｒ²がカルボキシル若しくはエステル化されたカルボキシル基で置換されたパラ−ヒドロキシフェニル基である式（XXVIII）の好ましいカルボン酸の幾つかは、ブロモ若しくはヨード基でフェニル基が置換されたチロシンと一酸化炭素とを、Schoenberg，A，et al，J Org Chem，1974，39，3318に開示された方法と類似の方法で、適切なアルカノール溶媒中において反応し、次いで所望であれば、当業者に公知の方法を用いて、得られたエステルを加水分解することによって製造できる。この場合、アミノ及び／又はカルボキシル基は、合成の適切な段階で結合され、後に除去される適切な保護基で必要に応じて置換され得、この方法は、Greene，T.W.，et al.，有機合成における保護基、第二版（Pr otective Groups in Organic Synthesis，second edition）、John Wiley & Son s: New York，1991（これは参照文献として本明細書の一部をなす。）に開示された方法のように当業者に公知である。式（VI）の化合物を合成するための他の方法には、Ｋが式（XX）で定義したとおりであり、Ｒ¹¹がアルデヒド基、シアノ基、ＮＨＲ³基（但し、Ｒ³は式（III ）で先に定義したとおりである。）であるか、又はＣＨ₂Ｙ基（但し、Ｙはクロロ、ブロモ、ヨード、メシル若しくはトシルのような脱離基として定義される。）である式（XX）の化合物と、Ｒ¹が式（IV）で定義したとおりであり、Ｒ²及びＸが式（II）で定義したとおりであり、Ｒ⁸が式（VI）で定義したとおりであり、Ｇが式（VIII）で定義したとおりであり、Ｒ¹⁰がＯＨ、ＳＨ、ＮＨＲ³（但し、Ｒ³は式（III）で先に定義したとおりである。）、アルデヒド基、ケト基− （ＣＯ）−Ｒ³（但し、Ｒ³は式（III）で定義したとおりであるか若しくはＣＨ₂ Ｙ基（但し、Ｙはクロロ、ブロモ、ヨード、メシル、若しくはトシルのような脱離基である。）として定義される式（XXX）の化合物とを、式（XX）の化合物と式（XIX）の化合物との反応による式（XVIII）の化合物の製造で説明した方法と類似の方法により反応することが含まれる。Ｒ¹が式（IV）で定義されたとおりであり、Ｒ²及びＸが式（II）で定義されたとおりであり、Ｒ⁸が式（VI）で定義されたとおりであり、Ｇが式（VIII）で定義されたとおりであり、Ｒ¹⁰がＣＨ₂Ｙ（但し、Ｙはクロロ、ブロモ、ヨード、メシル、若しくはトシルのような脱離基である。）である式（XXX）の化合物は、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ⁸、Ｘ及びＧが先に定義したとおりであり、Ｒ¹⁰がＣＨ₂ＯＨである式（XXX）の化合物から製造されうる。この方法は、March，J.，Advanced Org anic Chemistry ，fourth eddition，John Wiley & Sons: New York，1992（これは、参照文献として本明細書の一部をなす。）に開示された方法のように当業者に公知である。Ｒ¹が式（IV）で定義したとおりであり、Ｒ²及びＸが式（II）で定義したとおりであり、Ｒ⁸は式（VI）で定義したとおりであり、Ｇが式（VII I）で定義したとおりであり、Ｒ¹⁰がＯＨ、ＳＨ、ＣＨ₂ＯＨ、ＮＨＲ³（但しＲ³ は式（III）で定義したとおりである。）、アルデヒド基、若しくはケト基−（ＣＯ）−Ｒ³として定義される式（XXX）の化合物は、式（VII）の化合物と式（V III）の化合物との反応による式（VI）の化合物の製造で説明したのと類似の方法で、Ｒ⁹が水素であり、Ｒ¹⁰が先に定義したとおりである式（XIX）の化合物を用いて、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ⁸、及びＸが先に定義したとおりである式（VII）の化合物から製造できる。Ｒ¹⁰が、ＯＨ、ＳＨ、ＣＨ₂ＯＨ、ＮＨＲ³である場合、式（VI I）の化合物との反応の前に、Ｒ¹⁰に保護基を付加することが好ましい。このような保護基は付加され、合成の後の段階で除去されうる。この方法は、Greene， T．W.，et al.，有機合成における保護基、第二版（Protective Groups in Orga nic Synthesis，second edition）、John Wiley & Sons: New York，1991（これは参照文献として本明細書の一部をなす。）に開示された方法のように当業者に公知である。上記の、Ｒ⁹が水素であり、Ｒ¹⁰が、ＯＨ、ＳＨ、ＣＨ₂ＯＨ、ＮＨＲ³（但しＲ³は式（III）で定義したとおりである。）、アルデヒド基、若しくはケト基− （ＣＯ）−Ｒ³として定義される式（XIX）の化合物は、Ｒ⁹が式（XVIII）で定義したとおりであり、Ｒ¹⁰が先に定義したとおりである式（XIX）の化合物から製造できる。この方法は、Greene，T.W.，et al.，有機合成における保護基、第二版（Protective Groups in Organic Synthesis，second edition）、John Wiley & Sons: New York，199 1（これは参照文献として本明細書の一部をなす。）に開示された方法のように当業者に公知である。Ｘ及びＲ²が式（II）で定義したとおりである一般構造（XXXI）のプロドラッグは、Ｒ¹²が式（XXV）で定義したとおりであり、Ｒ²が式（II）で定義したとおりであり、Ｒ⁸が式（VI）で定義したとおりである式（XXXII）の化合物から製造される。この方法は、Greene，T.W.，et al.，有機合成における保護基、第二版（Prot ective Groups in Organic Synthesis，second edition）、John Wiley & Sons: New York，1991（これは参照文献として本明細書の一部をなす。）に開示された方法のように当業者に公知である。式（XXXII）の化合物は、Ｒ¹²が式（XXV）で定義したとおりである式（XXXIII ）の化合物と、ＸがＮＨ若しくはＯであり、Ｒ²が式（II）で定義したとおりであり、Ｒ８が式（ＶＩ）で定義したとおりである式（XXVII）の化合物とを、式（XXVI）と（XXV II）の化合物から式（XXV）の化合物を製造するために説明した方法に類似の方法を用いて反応することによって製造できる。Ｒ¹²が式（XXV）で定義したとおりである適切な保護基である式（XXXIII）の化合物は、アルケラン（Alkeran）（T.M.The Wellcome Foundation Limited）の名称で商業的に利用可能であり、４−［ビス（２−クロロフェニル）アミノ］− １−フェニルアラニンの化学名を有するメルファラン（UK 750，155）から製造することができる。この方法は、Greene，T.W.， et al.，有機合成における保護基、第二版（Protective Groups in Organic Syn thesis，second edition）、John Wiley & Sons: New York，1991（これは参照文献として本明細書の一部をなす。）に開示された方法のように当業者に公知である。蛋白工学の語は、特異的な所望の新たな一連のタンパク質特性、又はこの関係において正確な酵素活性を得るためのタンパク質の構造に着目した修飾を意味する。タンパク質の特異性及び反応性を修飾するために２つのアプローチを使用することができる。これらのアプローチの差は、特異的な酵素に対して利用可能な化学的及び構造的情報に依存する。化学的な構造の情報がタンパク質に関して全く知られていない場合は、ランダムな突然変異が単一に若しくはグループとして導入され、分子生物学の分野で周知の技術を用いて特異的なアミノ酸残基の重要性が決定される。しかし、所定部位に向けられた突然変異誘発を用いたより直接的なアプローチは、タンパク質に関して利用可能な詳細な化学的及び構造的な情報がある場合に行うことができる。これは、化学的及び構造的データが所望の酵素活性を決定するのに重要な残基であることを示唆するアミノ酸残基に対する特異的な変化を含む。３次元構造データが利用可能な場合は、提案された突然変異の分子モデルを更に提供する方法論がもたらされうる。これらのモデルは、特異的な部位に向けられた突然変異の相対的な安定性若しくは反応性の評価を与えることができる。典型的には、コンピュータによってアシストされた蛋白工学のアプローチにおいて、Ｘ−線結晶構造若しくはモデルに基づいたコンピュータモデルが、相同性モデルの構築によって使用される相同性タンパク質のＸ−線構造から構築される。多くの場合、初めの結晶学的構造は、公に利用可能なブルックヘブンタンパク質データベース（Brookhaven Protein D atabase）から得ることができる。タンパク質の構造及びここのアミノ酸の機能の広範な研究が、構造、安定性、活性又は触媒作用におけるこれらの重要性に関して、残基の分類を可能にした。タンパク質の多くの活性部位アミノ酸は、通常化学的な活性を示し、これらの化学反応性は、タンパク質の触媒特性を特徴づける。この化学反応性は活性部位及び活性部位内の活性でない関連した残基の同定を助ける。化学反応性の情報と共に結晶学的な研究は、活性部位の位置を明確に示すことができる。加えて、幾つかのタンパク質は、活性部位に基質若しくは阻害剤を持って結晶化されるであろう。これらの個々の構造情報の全てを組み合わせ、所定の部位に向けられた突然変異誘発の候補としての特異的な残基に対して設計の焦点を集中することができる。タンパク質の活性の特異的な所望の変化は、注目されている部位でのアミノ酸の特異的な変化によって得ることができる。アミノ酸残基が挿入され得、これによって空間的に機能性基が分離されるか、又は存在する残基が欠失され、機能性基がお互いにより隣接しうる。加えて、タンパク質の構造の変化は、側鎖若しくは主鎖のねじれ角、及びアミノ酸上の機能性基を変化することによって行われうる。これらのねじれ角は、アミノ酸残基の変化、欠失又は挿入によって変化しうる。構造データが利用できる場合は、全てのこれらの変化は、コンピュータでアシストされた分子モデル技術を用いてモデル化することができる。タンパクの構造に関する力の相互作用は、分子力学又は分子動力学の力場を用いてコンピュータでモデル化することができる。タンパク質の範囲内に結合するリガンドが利用しうる空間は、アミノ酸側鎖の容積の変化によって修飾される。イソロイシン若しくはロイシンのような嵩高い残基をアラニン若しくはグリシンに変化することで、疎水性部位を明確に変化させることなくリガンド結合部位内にポケットを提供することができる。逆の変化は、特異的なタンパク質への結合から嵩高い基質を排除する。活性部位を形成するアミノ酸の機能性基の変化を含む突然変異は、容積の許容度若しくは立体的な変化よりも劇的な変化をもたらしうる。多くのこれらのタイプの変化の例は、文献に見出すことができる（例えば、Recktenwald，A，et al ，J．Biotech，1993，28，1-23 及びこれに記載された文献；及びLesk,A,et al 「抗体工学:実用の手引き(Antibody Engineering: A Practical Guide)」、Ed． C．A K．Borrebaeck et al，1991，1-75参照）。高品質の構造データを用いたシステムでは、特異的な水素結合基が極性基質の相互作用を改善するために挿入されうる。アルギニン、リジン、若しくはヒスチジンを有する繰り返しの未変化の残基は、負に荷電した基質と相互作用しうる基を挿入する。グルタミン酸若しくはアスパラギン酸を有する繰り返し残基は、正に荷電した基質との相互作用を提供し、これによって酵素基質相互作用の特異性を変化する。本発明の更なる側面では、以下で説明するターゲッティング抗体及び本発明の突然変異酵素を含有する組換え複合体を提供する。このような組換え複合体は、一本鎖ＤＮＡ構築物から発現されるか、又は一本鎖ＲＮＡ転写物から翻訳される。また、本発明の範囲に含まれるものには、このような複合体をコードする対応したＤＮＡ及びＲＮＡがある。このような複合体の好ましい態様は、先に明示されたその２つの成分の活性に対する好ましい態様の組合せを反映する。このような組換え複合体は、酵素と抗原特異性を付与するｍＡｂの全部若しくは一部を別々にコードするＤＮＡのフラグメントをin vitroで結合させることによって産生される融合構築物の発現によって産生されうる（Pastan，I．et al， (1984)Cell，47，641-648）。このような融合は、アミノ末端若しくはカルボキシ末端、好ましくはアミノ末端にポリペプチドの基質結合部位若しくは活性部位を配置することによって組換え分子生物学の標準的技術で構築されうる。該構築物のｍＡｂ部分は、一本鎖種の抗体が５’末端において可変軽鎖若しくは可変重鎖ドメインの何れかと酵素部分に結合するようにデザインされる。これらの場合において、可変軽鎖及び可変重鎖遺伝子領域は、抗体の可変領域の正確な空間的配列を達成するペプチドリンカーをコードする合成ＤＮＡフラグメントと連結されるであろう。融合構築物の抗体部分を酵素部分に連結するこのような合成ＤＮＡ領域も望まれうる。他の形態では、酵素をコードする遺伝子は、Ｆａｂ若しくはＦ（ａｂ’）₂種を形成するように伸張された重鎖若しくは軽鎖遺伝子の可変領域の５’末端に融合されうる。重鎖遺伝子の他のバリエーションは、酵素／抗体組換え複合体を形成するために使用されうる。このようなパリエーションには、天然の重鎖アイソタイプ、全ての抗体アイソタイプの修飾された全長の重鎖遺伝子、及び種々の欠失が含まれ、特にＣ_H2 ドメインの欠失した重鎖が所望の薬動力学的特性を付与しうる。この他には、融合は、共有結合性二重特異性抗体：酵素複合体を産生しうる。この複合体は、抗体の一方のアームがDe Sutter，K and Fiers，W．Mol Immunol 31 261（1994 ）（これに限定されない。）に開示されているのと同様の融合により酵素で置換されている。ここで使用される「複合体（conjugate）の語は、このような組換え複合体を含む。独特の細胞特異性を有するように設計された抗体は、当分野で周知のいずれの方法でも生成されうる。組換えＤＮＡ技術で生成された抗体のフラグメントは、ターゲッティング分子としても使用されうる。使用のための好ましい抗体は、天然若しくはヒトから誘導された組換え細胞系から発現されるものであるが、治療を有為に阻害しうる程度の免疫原生を有さない抗体、又は該抗体が、in vivoで免疫反応をもはや起こさないように「ヒト化」されているものを提供する他の抗体産生哺乳動物細胞系から得た抗体を開発することができる。このようなヒト化抗体はキメラ抗体である(Morrison，et al P.N.A.S．(1084)，81，6851-6855; Boulian ne et al，Nature，1985，314，268-270及び Neuberger et al，Nature，1985，314 ，269-70)か、又はＣＤＲ−グラフト化抗体である(James et al，Nature，19 86，321，522-525; Riechmann et al，Nature，1988，332，323-327)。本発明に従った使用のための抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体又はそのフラグメントである。従って、該抗体は、完全な抗体、（Ｆａｂ’）₂フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆａｂフラグメント、軽鎖二量体若しくは重鎖二量体、又は重鎖及び軽鎖から得た可変領域を含有する一本鎖種を含有する。該抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４のようなＩｇＧ；又はＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ若しくはＩｇＤであり得る。抗体重鎖の定常ドメインは、適応して選択されうる。軽鎖の定常ドメインは、カッパ又はラムダ定常ドメインであり得る。抗体は、ＷＯ８６／０１５３３で開示されたタイプのキメラ抗体であり得る。ＷＯ８６／０１５３３に従ったキメラ抗体は、抗原結合領域と非免疫グロブリン領域を含有する。抗体結合領域は抗体軽鎖可変ドメイン及び／又は重鎖可変ドメインである。典型的には、キメラ抗体は軽鎖及び重鎖可変領域の両方を含有する。非免疫グロブリン領域は抗体結合領域のＣ−末端に融合される。非免疫グロブリン領域は、典型的には非免疫グロブリンタンパク質であり、好ましくは酵素領域である。キメラ抗体の２つの領域が開裂可能なリンカー配列を介して結合されうる。上述した何れかのクラスの抗体は、個々の標的の何れかの抗原特性に対して生じ、個々の標的に基本的に制限されうる。このような標的には、全てのタイプのヒト病原体、形質転換若しくはウイルス感染の結果として抗原を発現する細胞、特別な組織適合性抗原を発現する細胞、炎症反応に関係する細胞、フィブリンに対する抗体によってターゲッティングされうる血塊等が含まれる。本発明に従った使用のための好ましい抗体、これらがターゲッティングする抗原及び関連した徴候を図８に示した。本発明に従った使用のための特に好ましい抗体には、 17-1A、NR-LU-10、U36、NR-CO-O2、並びにムチンをターゲッティングする抗体又は癌胚抗原が含まれる。ターゲッティング部分が抗体である場合のヒトの治療に対しては、抗体自身に対すて免疫反応を起こすリスクを持たない抗体を用いることが好ましい。従って、マウス若しくはラットのモノクローナル抗体を用いることができるが、組換えＤＮＡ技術によって産生される抗体、及び免疫反応を起こすリスクを減少させるように操作された抗体を使用することが好ましい。従って、マウス若しくはラット抗体の定常領域をヒト抗体の定常領域で置き換えたキメラ抗体を使用することができる。しかし、ヒトの治療に対しては、ヒト化された抗体若しくはＣＤＲ− グラフト化された抗体、即ちマウス若しくはラット抗体から得た相補性決定領域が１以上のヒト抗体からから得たフレームワーク領域及び定常ドメインと組み合わされた抗体を使用することが好ましい。一つの好ましい態様では、本発明に従った方法は、ＣＤＲ−グラフト化抗体 C AMPUTH-1H を使用して行われる（Riechmann et al，Nature，322，323-327 1988 )）。上記のように、抗体CAMPATH-1Hは、初めに開示されたようにラットミエローマ細胞内で産生されるか、何れかの他の発現系、特に正確に保持され、グリコシル化された哺乳動物タンパク質を産生するのに適した発現系で産生されうる。 CAMPATH-1Hは、一般に扱うことができるＣＨＯ細胞系（Page and Sydenham，Bio technology，9，64-68(1991)）で発現することにより高収率で得ることができる。酵素へのターゲッティング分子の複合体形成は、結合特異性及びターゲッテイング分子の能力を阻害せず、酵素の触媒活性も阻害しない何れかの適切な方法で行われうる。タンパク質性ターゲッテイング分子の場合、複合体形成は、直接の共有結合とこれに続くタンパク質修飾化剤を用いた処理による反応性基の生成によって、又はホモ若しくはヘテロ二官能性交差結合分子（homo or heterobifunc tional cross-linking molecules）の使用によって行われる。アミノ基若しくはヒドラジド基を有する市販品として利用可能なリンカーは、糖タンパクの糖部分及び糖鎖（carbohydrates）の酸化によって生成されるアルデヒドと反応され、シッフ塩基を形成する（SelaM.ら、細胞毒性薬と抗体の複合体。免疫複合体。癌の放射線イメージング及び治療における抗体複合体（Conjug ates of Antibodies with Cytotoxic Drugs． Immunobonjugates．Antibody Conjugates in Radioimaging and Therapy of Can cer）、（C.-W．Vogel，ed.）189-216，(1987)）。他のリンカーは、抗体若しくは酵素のアミノ基、カルボキシル基若しくはスルフヒドリル基と反応しうる（Wa wrzynczak P.E.ら、免疫毒性剤を製造する方法：活性及び安定性における結合の影響：癌の放射線イメージング及び治療における免疫複合体：抗体複合体内（Me thods for Preparing Immunotoxins: Effect of the Linkage on Active & Stab ility In: Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimaging and Ther apy of Cancer）、（C.-W．Vogel，ed.）78-85，(1987)）。共有結合は、スルフヒドリル基の生成によって、及び特に抗体の場合はジスルフィド結合によって得られうる。このような遊離のスルフヒドリル基はハロアルキル基、ｐ−マーキュリーベンゾエート（mercuribenzoate）基、マレイミドのようなマイケル型の富化反応が可能な基若しくはMitra et al，J Amer Chem Soc ，101，3097-3110 1979による基と反応しうる。酵素と抗体のを結合するための他の方法には、リジンのイプシロンアミノ基を使用することが含まれる。反応性スクシンイミドエステル、環状チオエステル又は無水物は、リジンアミノ基と反応しうるカルボニル官能基を導入するため、又はここで議論するようなチオール反応性基を導入するために使用されうる。この他には、カルボニル官能基が、カルボジイミドで活性化され、カルボキサミド結合を形成するか、又はリジンアミノ基がメチルアミデートエステルと反応しアミジニウム結合を形成する。本発明の１つの特別な利用は、in vitro又はin vivoでの診断へのその適用である。例えば、in vitroでは、特別な抗原の検出が、抗原に結合しうる抗体のようなターゲッテイング部分を含有する本発明の複合体に診断サンプルをさらし、引き続いて本発明のメトトレキゼート（methotrexate）プロドラッグのようなプロドラッグにさらすことによって達成することができる。ここで、該プロドラッグは、抗原が存在し、複合体が該抗原に結合する場合、複合体の酵素によってメトトレキゼートに対して触媒化されうる。プロドラッグは、未結合の複合体が除去された後に加えられるべきである。ＭＴＸのような触媒されたプロドラッグは、標準的なＨＰＬＣ分析によって、又はここで説明される分光分析法を組み合わせることによって検出されうる。本発明のin vivoでの診断への応用には、腫瘍イメージングで使用される可能性が含まれる。この応用の使用に対する特に好ましい複合体には、腫瘍関連抗原に対する抗体とメトトレキゼートを触媒することができる突然変異酵素とを含有するもの、即ち¹³¹Ｉでベンゼン環がラベルされたＭＴＸ−プロドラッグが含まれる。このようなプロドラッグは、これ以外では内因性の触媒作用に対して無反応性のものであるべきである。複合体及びプロドラッグは、本発明の治療への応用と類似の方法で投与され、触媒されたプロドラッグ、即ち¹³¹ＩＭＴＸの位置の検出が、放射性同意元素の減衰を検出するための標準的な装置を用いて達成される。本発明のプロドラッグの塩には、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）塩、アンモニウム及びＮＸ＋４（但し、ＸはＣ_1-4アルキルである。）塩のような適切な塩から誘導される薬学的に許容しうる塩基の塩が含まれる。適切な薬学的に許容しうる塩には、以下の酸から誘導されるものも含まれるが、これに限定されない。該酸は、塩酸、臭素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、サリチル酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸、蟻酸、琥珀酸、ナフタレン−２−スルホン酸、イセチオン酸、ラクトビオン酸及びベンゼンスルホン酸である。薬学的に許容しうるプロドラッグ塩は、例えば適切な塩基若しくは酸で処理することによって、従来の方法にで調製することができる。本発明に従った治療法では、複合体とプロドラッグの投与の方法は、疾患及びその重篤度に依存し、処置をする医者の判断に任されるであろう。複合体及びプロドラッグは両方とも、静脈内的、腹腔内的、リンパ管内的(intralymphaticall y)、皮下的、皮内的、筋肉内的、経口的又は腫瘍の場合には腫瘍に直接注入することを含めた当業者に周知の渋滞の方法で投与されうる。プロドラッグ及び複合体は両方とも巨丸剤（bolus）として静脈内的に、又は連続的な点滴によって投与されることが好ましい。好ましくは、投与される複合体の投与量は、１日につき１kg体重あたり０．１から１００mgの範囲、最も好ましくは１日につき１kg体重あたり１．０から４０mgの間である。投与されるプロドラッグの好ましい投与量は、１日につき１ kg体重あたり０．０１から１００mg、好ましくは１日につき１kg体重あたり１．０から５０mgの間である。ターゲッティング分子と突然変異酵素の複合体は、プロドラッグの投与に先立って患者に投与されることが好ましい。複合体とプロドラッグの投与の間隔は、標的細胞への複合体のターゲッティングを保証し、標的細胞に結合していない過剰の複合体を系から効果的に除去することを保証するのに十分でなければならない。未結合の複合体は、標的細胞から離れた部位に存在する未結合の複合体によって引き続いて投与されたプロドラッグが活性化されないように効果的に除去されなければならない。複合体とプロドラッグの投与の間隔は、好ましくは、０．５日から７日の間であるが、系からのこのような複合体の排泄を促進する何れかの公知の技術を使用するによって、特に、効果的な量の抗酵素抗体（これは突然変異酵素に結合し、次いで放出を促進する。）を輸送すること、又は適切な親和性マトリクッスのカラムを通すような方法によって未結合の複合体を除去することを含む体外循環（Nilsson，I M，et al，Plasma Ther．Transfus Technol，19 84，5，127; Wallmark，A，et al，Artificial Organs，1984，8，72）によってこの期間を減少することができる。肝細胞レクチンを介して未結合の複合体の排泄を促進するために複合体にガラクトシル残基を結合することも望ましい。本発明に従った治療が可能な症状は、明らかに、該症状に対する先に定義した公知の化学療法剤及びこれらの対応するプロドラッグが存在し、本発明の複合体の結合が可能な病理学的な特性を有するものが含まれるであろう。このような症状には、新生物形成性及び非新生物形成性の細胞形質転換、自己免疫疾患、炎症性疾患、ウイルス、バクテリア、真菌、マイコプラズマ若しくは寄生虫感染が含まれる。本発明に従った治療の方法は、治療の効果を増加できる多くの薬剤を共に投与することを更に包含する。例えば、インターフェロンは、幾つかの可能なＡＤＥＰＴ標的抗原の発現のレベルを増加させることが知られており、従って、複合体の投与前に適切なインターフェロンを投与することは、標的細胞に結合する複合体のレベルを増加しうる。グリシンアミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼ（ＧＡＲＴＦａｓｅ）の阻害剤のようなプリン合成阻害剤のプロドラッグ又はチミジンシンセターゼ（ＴＳ）の阻害剤のようなピリミジン合成阻害剤のプロドラッグの組合せは、このような治療の一部としてジヒドロフォレート（ＤＨＦＲ）阻害剤のプロドラッグと組み合わせて投与されることが好ましい（Galivan，J．et al，J．Biol．Chem ．264，10685，1989，Ferguson，K．et al Cancer Chemother．Pharmacol．23 1 73，1989）。ＧＡＲＴＦａｓｅの阻害剤のようなプリン合成阻害剤のプロドラッグ又はＴＳの阻害剤のようなピリミジン合成阻害剤のプロドラッグの組み合せがＤＨＦＲ阻害剤と組み合わせて投与すること、又はＧＡＲＴＦａｓｅの阻害剤のようなプリン合成阻害剤のプロドラッグ又はＴＳの阻害剤のようなピリミジン合成阻害剤のプロドラッグの組み合せが、このような治療の一部としてＤＨＦＲのプロドラッグと組み合わせて投与されることが好ましい。本発明の更なる側面には、何れかの抗ウイルス性化合物を強めるための方法であって、その薬効が細胞内キナーゼ活性の上昇によって増加されうるものを包含する。本発明のこの更なる側面の好ましい態様に従えば、複合体をウイルスで感染された細胞に向けることができるターゲッティング分子及びフォレート拮抗剤のプロドラッグであって、１以上のチミジレートシンセターゼ（ＴＳ）阻害剤、ジヒドロフォレートリダクターゼ（ＤＦＨＲ）阻害剤又はＧＡＲトランスホルミラーゼでありうるものを含有する本発明の複合体は、治療を受ける患者のウイルスに感染した細胞に直接に抗投与量のフォレート拮抗剤を輸送するのに使用される。ウイルス性感染は、ＤＮＡ合成のレベルを増加することに関連するので、ＤＮＡ合成の阻害が抗ウイルス化合物をホスホリル化するために利用する細胞内キナーゼのレベルを増加するであろうから、この様な抗ウイルス剤と組み合わせてＤＮＡ合成の阻害剤の輸送が治療として試されることが提案される。本発明のこの側面の好ましい態様では、抗ウイルス剤は、アサイクロビル（ac yclovir）（ＧＢ１５２３８６５）、バラサイクロビル（valacyclovir）（ＥＰ３０８０６５）、ファムシクロビル（famciclovir）（ＥＰ１８２０２４）、ペンシクロビル（penciclocvir）（ＥＰ１４１９２７）、ガンシクロビル（gancic lovir）（ＥＰ００７２０２７）、フォスカーネット（foscarnet）（ＧＢ１５８５６１５）、ヨードデオキシウリジン、５− ブロモビニル−２’−デオキシウリジン（ＧＢ１６０１０２０）、アラビノフラノシル−５−ブロモビニル−２’−デオキシウリジン（ＥＰ００３１１２８）、ベンズイミダゾールヌクレオシド、１−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５− （１−プロピニル）ウラシル（ＥＰ２７２０６５）及び２’−デオキシ−５−エチル−β−４’−チオウリジン（ＥＰ４０９５７５）から選択される抗ヘルペス化合物であるか、又は２’，３’−ジデオキシイノシン（ＥＰ２０６４９７）、２’，３’−ジデオキシシチジン（J．Org．Chem．32(3) 817-818(1967)）、（２Ｒ，５Ｓ）−５−フルオロ−１−（２−（ヒドロキシメチル）−１，３−オキサチオラン−５−イル）シトシン（ＵＳ５２１００８５）、（２Ｒ，５Ｓ）−１ −（２−（ヒドロキシメチル）−１，３−オキサチオラン−５−イル）シトシン（ＥＰ０３８２５２６）、５−クロロ−２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロウリジン（ＥＰ０３０５１１７）及び（１Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノ−６ −（シクロプロピルアミノ）−９Ｈ−プリン−９−イル）−２−シクロペンテン −１−メタノール（ＥＰ０４３４４５０）から選択される抗−ＨＩＶ化合物であるか、抗インフルエンザ化合物、９−（２−デオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ− リボフラノシル）グアニン）（ＥＰ０４１７９９９）である。本発明のこの更なる態様の最も好ましい態様では、抗ウイルス化合物は、ジドブジン（ＥＰ１９６１８５）(Retrovir:The Wellcome Foundation Limitedの登録された商標）のような抗−ＨＩＶ化合物を包含し、複合体は、ＧＰ１２０のようなＨＩＶ関連抗原に対する抗体を包含し、プロドラッグは、ＴＳ阻害剤のプロドラッグである。本発明は、治療における使用、又は先に定議したような何れかの症状の治療に使用するための医薬の製造への、先に定義した本発明の新規なプロドラッグ、特にこれらの薬学的に許容しうる塩、溶媒和化合物、Ｎ−オキシド若しくは生理学的に機能的な誘導体の使用を提供する。また、治療における使用、又は先に定議したような何れかの症状の治療に使用するための医薬の製造への、本発明の突然変異酵素、若しくは先に定義したこれらの複合体の使用を提供する。突然変異酵素、抗体及びプロドラッグのための薬学的処方剤には、各々、溶液、懸濁液、錠剤、粉末、及び当業者に公知の他の処方剤が含まれるが、これに限定されない。該処方剤には、ヒト血清アルブミン若しくは他のタンパクを含めた薬学的に許容しうる安定剤及び担体、ｐＨ緩衝剤、及び生理学的な塩若しくは他の非毒性の塩、並びに当業者に公知の非毒性の安定化剤が含まれうる。好ましくは、突然変異酵素及び抗体の薬学的処方剤には、無菌の複合体溶液が含まれる。プロドラッグの薬学的処方剤には、好ましくは無菌溶液若しくは固体が包含される。本発明の更なる側面は、複合他の薬学的処方剤及びプロドラッグ（これはその複合体によって薬剤に変換されうる。）の薬学的処方剤を含有するキットを包含する。本発明の更なる側面は、先に定義したような本発明のプロドラッグと複合体の組合せを包含する。本発明の更なる側面は、先に説明した何れかの症状の治療に使用するための医薬の製造に使用するための、先に述べた条件を除いた先に定義したような新規なプロドラッグを使用することを包含する。本発明の更なる側面は、先に説明した何れかの症状の治療に使用するために、先に述べた条件を除いた先に定義したような新規なプロドラッグを使用することを包含する。本発明の更なる側面は、先に定義した本発明の複合体を予め投与された患者の治療に使用するための医薬の製造にプロドラッグを使用することを包含する。本発明の更なる側面は、ここで説明したクローン化されたヒトカルボキシペプチダーゼＡ２並びにカルボキシペプチダーゼＡ２をコードするＤＮＡを包含する。本発明の更なる側面は、本発明に従った使用のための突然変異酵素をコードするＤＮＡ配列、このようなＤＮＡを含有したプラスミド、発現ベクター、及び細胞系を包含する。このようなＤＮＡは、好ましくはここで説明した突然変異カルボキシペプチダーゼＡ１若しくはＡ２、最も好ましくは、２６８の位置がグリシンである突然変異カルボキシペプチダーゼＡ１若しくはＡ２をコードする。本発明の更なる側面は、本発明に従った複合体及びプラスミドをコードするＤＮＡ配列、この様なＤＮＡを含有する発現ベクター、及び細胞系を包含する。本発明の更なる側面は、プロドラッグを細胞に対して細胞毒性である薬剤に変換する方法である。他のパターンの化学的置換体のようなここでの他の関連した全てのものは、排除されるものではなく、含められるものとして解釈されるべきである。ここで使用される「ハロ」の語は、フルオロ、クロロ、ブロモ若しくはヨードを意味する。「アリール」の語は、フェニル、ナフチル若しくはアントラセニルであって、任意に１以上のハロ、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチル、Ｃ_1- ₆ アルキル、Ｃ_1-6アルコキシ若しくはＣ_1-6アルキルで任意に置換されたアミノで置換されたものを意味する。「ヘテロアリール」の語は、５から１０の炭素原子を含有する芳香族単環性若しくは二環性の縮合環系であって、１以上の環原子が独立に窒素、酸素若しくは硫黄から選択されるものを意味する。「カルボキサミド」基は無置換若しくは置換されたＣ_1-6アルキルでありうる。ここで使用される突然変異哺乳動物酵素は、治療が行われる哺乳動物内の何れかの酵素であって、その酵素の１又は複数のアミノ酸配列から少なくとも１つのアミノ酸が異なった配列を有するものとなるべきである。好ましくは、治療が行われる哺乳動物はヒト患者であり、突然変異哺乳動物酵素のアミノ酸配列が、治療を受ける動物内のその酵素の１若しくは複数のアミノ酸配列と１５％以上異なっていないことが好ましい。アミノ酸残基の番号に対する先の関連事項及びこれ以後の請求の範囲の関連事項の全ては、ここに含まれる表で示した残基の番号に関連し、別のナンバーリングコンベンションに従った配列表で与えられる残基の番号ではない。実験手順一般的説明全ての溶媒は、試薬グレートであり、更に精製することなく使用した。無水溶媒は、乾燥させたシリンジを用いて、アルドリッチの確実にシールしたボトルから分配した。化学品は試薬グレードであり、更に精製することなく使用した。該試薬の供給者のフルネームと住所は最初の記載箇所に示した。それ以後は、略名を使用した。 ¹Ｈ−ＭＮＲスペクトルは、バリアンＸＬ−２００若しくはＸＬ−３００分光計を用いて、それぞれ２００MHz及び３００MHzで得た。化学シフトは、トリメチルシランからのダウンフィールドで、ppm で表した。スペクトルデータは、多重度（ｓ、一重線；ｄ、二重線；ｔ、三重線；ｑ、四重線；ｍ、多重線；ｂｒ、ブロード）、水素の数、ヘルツで表したカップリング定数、記述子（descriptor）の順に表した。化学イオン化（ＣＩ）質量スペクトルを Oneida Research Servi ces，Inc.，Whitesboro，NY 13492で行った。常圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）質量スペクトルをFisonsプラットホーム質量分析計を用いて得た。高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量スペクトルを、VG Analytical 70SQ分光計を用いて得た。イオンスプレー質量スペクトルを、Sciex API III分光計を用いて得た。元素分析を、Atrantic Microlabs，Inc.，Atlanta，GA 30366で行った。逆相分析ＨＰＬＣを、600Eシステムコントローラー、715 Ultra Wispサンプルプロセッサー、及び991 フォトダイオードアレイ検出器よりなるWaters HPLCシステムを用いてＣ１８分析カラムで行った。半分取ＨＰＬＣ（semipreparative HPLC）を、手動用のインジェクターを備えた同様のシステムを用いてRegisカラム（Ｃ１８、Prep-100-60-ODS-F EC、１０mmパッキング、２５cm×２１．１mmi.d.）で行った。使用した略号は、グラム（ｇ）、ミリリットル（mL）、リットル（Ｌ）、時間（ｈ）、分（min）、室温（ＲＴ）、計算値（calcd.）、分解（dec.）、分子量（mw）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２（Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジエチルシアノホスホネート（ＤＥＣＰ）、（ベンジルオキシ）カルボニル（Ｃｂｚ）、及びトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）である。調製された幾つかのサンプルは、水及び／又は他のヒドロキシル溶媒（例えばＤＭＦ）を非常に強固に含有し、及び／又は全部若しくは部分的に有機若しくは無機酸（例えば、トリフルオロ酢酸、塩酸）の塩として得られる。このような付加物は適切な例の分析データで示した。これらの付加物は、化合物名の一部として示されないが、単離された生成物中でのこれらの存在は、適切な例の分子式及び分析データで塩及び水和物データとして示すことによって記述される。例１：２−フルオロ−４−ニトロ安息香酸磁気撹拌器を備えた３Ｌの三口フラスコに、２５．００ｇの２−フルオロ−４ −ニトロトルエン（アルドリッチケミカルＣｏ．ミルウォーキー、ＷＩ、５３２３３）、１．６５Ｌの１ＮＮａＯＨ、及び２５．００ｇのＫＭｎＯ₄を充填した。得られた混合物を撹拌しながら９５℃に加熱した。更に２５．００ｇづつのＫＭｎＯ₄を１ｈ及び２ｈ後に加えた。更に１時間９５℃で撹拌した後、反応混合物をＲＴに冷却し、セライトを通して濾過しＭｎＯ₂を除去した。濾液を減圧下に５００mLまで濃縮し、濃Ｈ₂ＳＯ₄を加えてｐＨ２に酸性化した。黄−橙色の沈殿が生成され、これを真空濾過によって集めた。粗製の固体を３００mLの１ＮＮａＯＨ水溶液に溶解し、ｐＨ２に酸性化し、混合物をＣＨ₂Ｃｌ₂（４×１５０mL ）で抽出した。ＣＨ₂Ｃｌ₂抽出物を合わせ、０．１ＮＨＣｌ水溶液で洗浄（２× １００mL）し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、減圧下に濃縮して、１２．４４ｇ（４２％）の２−フルオロ−４−ニトロ安息香酸を黄色の結晶性固体として得た。ｍ．ｐ．＝１６５〜１６７℃。例２：エチル２−フルオロにトロベンゾエート磁気撹拌器及び窒素導入管を備えた乾燥した１００mLの三口フラスコに３．００ｇの２−フルオロ−４−ニトロ安息香酸、３．００ｇのＮａＨＣＯ₃、及び２０mLの無水ジメチルアセトアミドを加えた。この懸濁液を、３．５０mLの沃化エチルで処理し、Ｎ₂下、ＲＴで１８ｈ撹拌した。反応混合物を濾過して固体を除去し、濾液を減圧下に濃縮してオレンジ色の残渣を得た。この残渣を１００mL のＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解した。この溶液を飽和ＮａＨＣＯ₃水（３×５０mL）、水（１×６０mL）で洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥した。乾燥剤を濾過及びシリカゲルプラグ（３×５cm）を通して除き、淡い黄色の溶液を得た。これを減圧下に濃縮し、３．１０ｇ（９０％）のエチル２−フルオロ−４−ニトロベンゾエートを淡い黄色の結晶性固体として得た。ｍ．ｐ．＝７０〜７３℃。例３：エチル４−ニトロ−２−フルオロベンゾエート磁気撹拌器を備えた２５０mL丸底フラスコに、３．００ｇのエチル２−フルオロ−４−ニトロベンゾエート及び１００mLのＭｅＯＨを加えた。この溶液を、窒素を１０分間バブリングして脱酸素化し、次いで２．００ｇのラネーニッケル（Raney 3200，Davison Chemical，Chattanooga，TN 37406）で処理し、これを水及びＥｔＯＨで洗浄した。この溶液を１atmで４０ min撹拌しながら水素化にかけた。フラスコを窒素でパージし、触媒を濾過にして除いた。濾液を減圧下に濃縮し、２．４０ｇ（９３％）のエチル−４−アミノ−２−フルオロベンゾエートを過食の結晶性固体として得た。ｍ．ｐ．＝１１０〜１１２℃ 例４：９−ブロモメチル−３−メチルベンゾ（ｆ）キナゾリン−１（２Ｈ）−オン磁気撹拌器、窒素導入管、及び還流冷却器を備えた３Ｌの三口フラスコに、１．４Ｌの１，２−ジクロロエタンを加えた。この溶液を還流するように加熱し、１０．００ｇの３，９−ジメチルベンゾ（ｆ）キナゾリン−１（２Ｈ）−オン（国際特許出願ＷＯ９１／１９７００に開示された方法に従って調製した。）をゆっくり加えた。続いて、これに８．７３ｇのＮ−ブロモ琥珀酸イミド（アルドリッチ）及び１．００ｇの過酸化ベンゾイル（アルドリッチ）を添加した。２ｈ還流温度で加熱した後、反応混合物を室温に冷却し、減圧下に濃縮した。残渣を６０mLのＥｔＯＨでスラリー化し、固体を真空濾過によって集めた。生成物を５０ mLのＥｔＯＨで洗浄し、減圧下に乾燥して、１２．３９ｇの淡褐色の固体を得た。ｍ．ｐ．＝＞２００℃。¹Ｈ−ＮＭＲによる分析で、８０％の９−ブロモメチル−３−メチルベンゾ（ｆ）キナゾリン−１（２Ｈ）−オンと２０％の出発物質よりなる混合物であることが示された。この物質を更に精製することなく次のステップを行った。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ9.86(s，1H，芳香族CH)，8.28(d，1H，J=9.0，芳香族CH)，8.06(d，1H，J=8.4，芳香族CH)，7.72(d，1H，J=8.2，芳香族CH)，7.6 5(d，1H，J=8.8，芳香族CH)，4.94(s，2H，ArCH₂Br)，2.49(s，3H，CH₃)．例５：エチル４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾエート磁気撹拌器、窒素導入管、及び還流冷却器を備えた５００mLの三口フラスコに５．００ｇの９−ブロモメチル−３−メチルベンゾ（ｆ）キナゾリン−１（２Ｈ）−オン、３．０２ｇのエチル４−アミノ−２−フルオロベンゾエート，４．１７ｇのＮａＨＣＯ₃、及び４２mLの無水ＤＭＦを加えた。この反応混合物を、窒素下で撹拌しながら１．５ｈ１００℃に加熱した。ＲＴに冷却した後、この混合物を濾過して固体を除き、シリカゲルの存在下に濾液を濃縮することによって粗製の生成物を３０ｇのシリカゲル上に沈積させた。この生成物／シリカゲル混合物をカラム（３６０ｇ、ＳｉＯ₂）にかけ、ＭｅＯＨ−ＥｔＯＡｃのグラジェント溶出液（ＥｔＯＡｃ→２％ＭｅＯＨ−ＥｔＯＡｃ）を用いてフラッシュクロマトグラフィーで精製した。これにより３．５０ｇ（６５％）のエチル４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９− イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾエートを白色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝＞２００℃。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ12.54(s，1H，NH)，9.85(s，1H，芳香族CH)，8.2 3(d，1H，J=8.7，芳香族CH)，8.01(d，1H，J=8.2，芳香族CH)，7.69-7.50(m，3H ，芳香族CH)，6.52(dd; 1H; J=1.8，8.9; 芳香族CH)，6.40(dd; 1H; J=1.7; 14. 7; 芳香族CH)，4.58(d，2H，J=5.6，ArCH₂N)，4.19(q，2H，J=7.0，エチルCH₂)，2. 44(s，3H，CH₃)，1.24(t，3H，J=7.0,エチルCH₃)．例６：４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロ安息香酸磁気撹拌器を備えた１００mLの三口フラスコに、０．２００ｇのエチル４− （（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９ −イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾエート、１８mLの１ＮＮａＯＨ、及び２０mLのＥｔＯＨを充填した。ＲＴで一夜撹拌した後、溶液を減圧下に２０mLまで濃縮し、濃ＨＣｌを加えてｐＨ２．５に酸性化した。得られた沈殿を真空濾過により集め、１５mLの水で洗浄し、減圧家に乾燥して０．１５ｇ（７７％）の４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロ安息香酸を白色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝＞２５０℃。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ13.20-12.30(br s，1H，COOH)，9.83(s，1H，芳香族CH)，8.24(d，1H，J=8.6，芳香族CH)，8.06(d，1H，J=8.4，芳香族CH)，7.8 0-7.40(m，4H，芳香族CH)，6.51(d，1H，J=7.9，芳香族CH)，6.37(d，1H，J=14. 2，芳香族CH)，4.60(s，2H，ArCH₂N)，2.48(s，3H，CH₃)．例７：Ｎ−（（ベンゾイルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン酸磁気撹拌器及び温度計を備えた２Ｌの三口フラスコに、２５．０ｇのグルタミン酸 γ−エチルエステル（シグマケミカルＣｏ．、セントルイス、ＭＯ、６３１７８）及び１Ｌの蒸留水を充填した。この溶液を撹拌しながら６０℃に加熱し、３０ｇのＮａＨＣＯ₃、次いで２５mL のクロロ蟻酸ベンジル（アルドリッチ）で処理した。フラスコをＲＴに冷却し、撹拌を２ｈ続けた。この混合物をエチルエーテル（５×１００mL）で抽出し、エーテル抽出物を捨てた。水層を濃ＨＣｌ水溶液でコンゴレッドの終点まで酸性化し、得られたエマルジョンをＣＨ₂Ｃｌ₂（５×１００mL）で抽出した。ＣＨ₂Ｃｌ₂抽出物を合わせ０．０５ＮＨＣｌ水溶液（２×１００mL）で洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、５０mLの容積まで減圧下に濃縮した。この溶液を氷水浴で冷却し、２００mLのペンタンを加えて粉末化した。得られた固体を真空濾過により集め減圧下に乾燥して３７．０ｇ（８３％）のＮ−（（ベンゾイルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン酸を白色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝８２〜８４℃。例８：エチル３−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニネート磁気撹拌器及び還流冷却器を備えた２５０mLの三口フラスコに、３．００ｇの３−（１’−ナフチル）−Ｌ−アラニン（Schweizerhall，Inc.，Piscataway，N J, 08854）及び７５mLの無水ＥｔＯＨを加えた。溶液が透明になるまでＨＣｌガスをバブリングすることによってこの懸濁液を酸性化し、この溶液を撹拌しながら５ｈ加熱還流した。この溶液をＲＴに冷却し、減圧下に濃縮して白色の固体を得た。この固体を１００mLの５％ＮａＨＣＯ₃水溶液に懸濁し、ＥｔＯＡｃ（３×６０mL）で抽出した。ＥｔＯＡｃ抽出物を合わせ、５％ＮａＨＣＯ₃水溶液（３×５０mL）、水（１×５０mL）で洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥した。乾燥剤を濾過によって除き、濾液を減圧下に濃縮してオイルを得た。このオイルを４０mLのエチルエーテルに溶解した。エーテル溶液を１３．９mLの１ＮＨＣｌエーテル溶液で処理し、得られた沈殿を減圧濾過により集め、減圧下に乾燥して３．７０ｇ（９５％）のエチル３−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニネート・ＨＣｌを白色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１８２〜１８４℃。例９：エチルＮ−（（ベンゾイルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−エチル −Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニネート磁気撹拌器及び窒素導入管を備えた２５０mLの三口フラスコに、３．７０ｇのエチル３−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニネート・ＨＣｌ、４．０９ｇのＮ− （（ベンゾイル）カルボニル）−５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン酸、６０mLのＣＨ₂Ｃｌ₂、及び１．４５mLのＮ−メチルモルホリンを充填した。この混合物を氷浴で０℃に冷却し、２．６６ｇのＥＤＣ（アルドリッチ）で処理し、窒素下で撹拌した。０℃で１ｈ後、この溶液をＲＴまで暖め、更に３ｈ撹拌を続けた。この溶液を減圧下に濃縮し、残渣を１００mLのＥｔＯＡｃに溶解した。このＥｔＯＡｃ溶液を１０％クエン酸水溶液（３×５０mL）、次いで、５％ＮａＨＣＯ₃水溶液（３×５０mL）で洗浄した。この溶液を無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、２０mLまで減圧下に濃縮し、５０mLのペンタンを加えて粉末化した。得られた固体を真空濾過により集め、減圧下に乾燥して５．８０ｇ（８２％）のエチルＮ−（（ベンゾイルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニネートを白色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１２４〜１２６℃。例１０：エチル５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（１− ナフチル）−Ｌ−アラニネート５００mLのパール（Parr）の容器に０．１９ｇの１０％Ｐｄ（Ｃ）と６０mLの無水ＥｔＯＨを窒素下で充填した。この触媒−溶媒混合物を５分間窒素をバブリングすることによって脱酸素化し、０．１４mLの塩化アセチル、次いで１．０２ｇのエチルＮ−（（ベンゾイルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−エチル−Ｌ− グルタミン−１−イル−３−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニネートで処理した。この混合物を４５psiで１８ｈ水素化した。この溶液を窒素でパージし、触媒をセライトを通して濾過して除いた。濾液を減圧下に濃縮し、０．８１ｇ（９７％）のエチル５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニネート・ＨＣｌを淡黄色の発泡体として得た。ｍ．ｐ．＝８５〜９０℃（dec.）。例１１：エチルＮ−（Ｎ−（４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾイル）−５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン−１−イル）−３−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニネート窒素導入管と磁気撹拌器を備えた１００mLの三口フラスコに、０．５０ｇの４ −（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン− ９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロ安息香酸及び１０mLのＤＭＰＵ（アルドリッチ）を充填した。この混合物に、加熱と超音波をかけることを交互に行い、固体を溶解し、得られた溶液を０．５０ｇの３Ａのモレキュラーシーブの存在下、窒素下で１８ｈ撹拌した。この混合物を、氷浴で０℃に冷却し、０．１５ mLのＮ−メチルモルホリン、次いで０．１７mLのクロロ蟻酸イソブチルで処理した。０℃で１５分撹拌した後、反応混合物を０．６９ｇのエチル５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニネート・ＨＣｌ及び０．１７mLのＮ−メチルモルホリンの４mL無水ＤＭＦ溶液で処理した。反応物を０℃に１時間保持し、次いでＲＴまで暖め、更に４ｈ撹拌した。この混合物を濾過して固体を除き、濾液を１５０mLの水と混合した。得られた粗製の固体を濾過によって集め、減圧下に乾燥し、２００ｇのシリカゲルでフラッシュクロマトグラフィーにかけ（１％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ→５％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ）、０．４０ｇ（４０％）のエチルＮ−（Ｎ−（４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９ −イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾイル）−５−Ｏ−エチル−Ｌ− グルタミン−１−イル）−３−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニネートを白色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝２２５℃（dec.）。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ12.55(s，1H，ベンゾキナゾリンNH)，9.87(s，1H，芳香族 CH)，8.63(d，1H，J=7.5，アミドNH)，8.24(d，1H，J=8.3，芳香族CH)，8.09(d，1H ，J=7.7，芳香族CH)，8.03(d，1H，J=8.0，芳香族CH)，7.92(d，1H，J=7.1，芳香族CH)，7.79(t，1H，J=5.6，4-アミノベンゾイルNH)，7.68-7.30(m，9H，芳香族CH，アミド NH)，6.56(d，1H，J=7.9，芳香族CH)，6.42(d，1H，J=14.4，芳香族CH)，4.68 -4.43(m，4H，ベンゾキナゾリン-9-CH₂，glu メチン，ナフチルala メチン)，4.10-3.92(m，4H，エチル CH₂)，3.63-3.30(m，2H，ナフチル-CH₂)，2.45(ベンゾキナゾリンCH₃)，2.29(m，2H，glu 4-C H₂)，2.07-1.74(m，2H，glu3-CH₂)，1.14(t，3H，J=7.1，エチルCH₃),1.03(t，3H， J=7.1，エチルCH₃)．例１２：Ｎ−（Ｎ−（４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル）−３−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニン磁気撹拌器と窒素導入管を備えた５０mLの三口フラスコに、０．１５ｇのエチルＮ−（Ｎ−（４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾイル） −５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン−１−イル）−３−（１−ナフチル）−Ｌ− アラニネート、８mLの１：１ＴＨＦ：Ｈ₂Ｏ、及び２０mgのＬｉＯＨ・Ｈ₂Ｏを加えた。この混合物をＲＴ、窒素下で撹拌した。１ｈ後、ｔｌｃ（ＳｉＯ₂、３％ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂）によって溶液を分析し、出発物質が残っていないことが示され、新たな化合物はＲｆ＝０．０を示した。この溶液を、１ＮＨＣｌ水溶液を添加することによりｐＨ５に酸性化し、生じた白色の懸濁液を乾燥するまで減圧下に濃縮した。逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８、６５：３５：０．１Ｈ₂Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ）による残渣の分折で、主要成分（９５％）はｋ’＝３．１７、マイナー成分（５％）はｋ’＝４．９０であることが示された。粗生成物は、グラジェント溶出液を用いた半分取逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８、７０：Ａ、１０分以上）で精製した。純粋なフラクション（分析用のＨＰＬＣで決定した。）を合わせ、減圧下に２０mLまで濃縮し、凍結乾燥して７６mg（５０％）のＮ−（Ｎ−（４−(((１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル）−３−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニンを灰色がかった白色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１８０℃（dec.）。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ13.30-12.20(brm，COOH)，9.82(s，1H，芳香族CH )，8.44(d，1H，J=8.1，アミドNH)，8.26(d，1H，J=8.9，芳香族CH)，8.11(d，1H， J=8.3，芳香族CH)，8.03 (d，1H，J=8.3，芳香族CH)，7.84(d，1H，J=8.2，芳香族CH)，7.73(d，1H，J=7. 8，芳香族CH)，7.67-7.27(m，9H，芳香族CH，arnide NH)，6.53(d，1H，J=8.5，芳香族CH)，6.38(d，1H，J=14.7，芳香族CH)，4.63-4.38(m，4H，ベンゾキナゾリン-9-CH₂ ，gluメチン，ナフチルala メチン)，3.55(m，1H，ナフチル-CH₂)，3.27(m，1H，ナフチル-CH₂)，2 .43(s，3H，ベンゾキナゾリンCH₃)，2.18(m，2H，glu 4-CH₂)，2.00-1.70(m，2H，glu 3- CH₂)．元素分析 : Calcd. for C₃₉H₃₄N₅O₇F・1.5 H₂O・0.5 TFA(MW 787.76): C，60.99; H ，4.80; N，8.89．Found: C，60.96; H，4.82; N，8.98．質量スペクトル : (FAB)704(M+H)⁺，613，489，371，309．ＵＶスペクトル : (pH 7 バッファー)λ_max（ε）223.4(82600)，266.4(53100)，348.6 (5500)． λ_min（ε）243.2(23500)，340.2(3430)．例１３：エチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン−１− イル−３−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニネート１００mLの三口フラスコ内の０．２４mLのＤＥＣＰ（アルドリッチ）及び０．２２mLのＥｔ₃Ｎの２０mL無水ＤＭＦ溶液へ３mLのＤＭＰＵに溶解した０．２０ｇの４−(Ｎ−(２，４−ジアミノ−６−プテリジニルメチル)−Ｎ−メチルアミノ)安息香酸半塩酸塩二水和物（アルドリッチケミカルＣｏ．、ミルウオーキー、ＷＩ、５３２３３）及び０．０４mLＥｔ₃ Ｎを加えた。溶液を窒素下、ＲＴで３ｈ撹拌し、０．２３ｇのエチル５−Ｏ− エチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニネート・ＨＣｌ及び０。１５mLのＥｔ₃Ｎの２mL無水ＤＭＦ溶液で処理した。７０ｈ撹拌した後、反応混合物を３mLまで減圧下に濃縮し、６０mLのエチルエーテルで処理し、粗生成物を粘着性のオレンジ色の固体として沈殿させた。エーテルをデカンテーションし、生成物を６０mLのＣＨＣｌ₃に溶解した。この溶液を１％ＮＨ₄ ＯＨ水溶液で抽出し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、乾燥するまで濃縮した。黄−橙色の残渣を１５０ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（７：７：１ＣＨ₂Ｃｌ₂：アセトン：ＭｅＯＨ）で精製し、０．２６ｇ（７０％）のエチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニネートを黄色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１３５℃（de c.）。 ¹H-NMR: (200 MHz，DMSO-d₆)δ8.59(s，1H，プテリジニル-7-CH)，8.45(d，1H，J=7. 2，アミドNH)，8.10(d，1H，J=8.0，芳香族CH)，8.04(d，1H，J=8.2，芳香族CH)，7 .92(d，1H，J=6.8，芳香族CH)，7.83-7.45(m，6H，芳香族CH，NH₂)，7.41-7.23( m，2H，芳香族CH)，6.84(d，2H，J=8.8，芳香族CH)，6.65(br s，2H，NH₂)，4.8 1(s，2H，プテリジニル-CH₂)，4.63-4.39(m，2H，glu メチン，ナフチルala メチン)，4.13-3.91( m，4H，エチルCH₂)，3.63-3.32(m，2H，ナフチル-CH₂)，3.24(s，3H，N-CH₃)，2.34(t， 2H，J=7.6，glu-4-CH₂)，2.10-1.80(m，2H，glu-3-CH₂)，1.17(t，3H，J=7.1，エチル -CH₃)，1.03(t，3H，J=7.1，エチル-CH₃)．例１４：Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニン磁気撹拌器及び窒素導入管を備えた５０mL三口フラスコに０．１３ｇのＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（１−ナフチル） −Ｌ−アラニネート、１０mLのＥｔＯＨ、及び１５mLの０．２ＮＮａＯＨを加えた。得られた溶液をＮ₂下、ＲＴで２．５ｈ撹拌し、１ＮＨＣｌ水溶液を加えてｐＨ５に酸性化し、乾燥するまで減圧下に濃縮した。逆相ＨＰＬＣ（Ｃｌ８、７０：３０：０．１Ｈ₂Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ）による黄色の固体の分析で主要成分（９３％）はｋ’＝４．３を示し、４種類のマイナー成分はｋ’＝６．８、３．５、２．９及び１．９を示した。粗生成物の内の７０mgを半分取逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８、７０：３０：０．１Ｈ₂Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ）で精製した。純粋なフラクション（分析用ＨＰＬＣで決定した。）を合わせ、２０mLまで濃縮し、凍結乾燥して３６mg（５３％）のＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル −３−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニンを黄色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１７５℃（dec.）。HPLC :C18で１つのピーク、k'=3.23，70: 30: 0.1 H₂O: MeCN: TFA、流速=１ mL/ min． ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ13.00-11.95(brm，2H，COOH)，8.65(s，1H，プテリジニル -7-CH)，8.45(br，1H，NH₂)，8.36-8.18(br，1H，NH₂)，8.25(d，1H，J=7.5，アミド NH)，8.10(d，1H，J=8.6，芳香族CH)，7.96(d，1H，J=7.8，芳香族CH)，7.90 (d，1H，J=7.7，芳香族CH)，7.70(m，3H，芳香族CH)，7.60-7.45(m，3H，芳香族 CH，NH₂)，7.39-7.15(m，3H，芳香族CH，アミドNH，NH₂)，6.81(d，2H，J=8.6，芳香族CH，4.84(s，2H，プテリジニル-CH₂)，4.51(m，1H，ナフチルala メチン)，4.42(m，1H，g luメチン)，3.57(m，1H，ナフチルala-CH₂)，3.28(m，H2Oのピークと重なっている、ナフチル ala CH₂)，3.25(s，3H，N-CH₃)，2.23(t，2H，J=7.5，glu-4-CH₂)，2.02-1.72( m，2H，glu-3-CH₂)．元素分析 : Calcd. for C₃₃H₃₃N₉O₆・1.5 H₂O・0.5 TFA(MW 735.72): C,55.51; H， 5.00; N，17.13．Found: C，55.65; H5.09; N，16.92．質量スペクトル : (FAB)652(M+H)₊，581，461，371，309．ＵＶスペクトル : (pH 7 バッファー)λ_max（ε）224.3(74700)，260.3(24900)，295.9 (24100)，372.5(7150)．λ_min（ε）242.3(15200)，271.0(20500)，345.2(5550) ．例１５：Ｎ−（（ベンゾイルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−メチル−Ｌ− グルタミン酸温度計及び磁気撹拌器を備えた１Ｌの三口フラスコに、４．９０ｇのＬ−グルタミン酸 γ−メチルエステル（シグマ）及び２００mLの水を加えた。この溶液を６０℃に加熱し、６．４０ｇのＮａＨＣＯ₃、次いで５．２０mLのクロロ蟻酸ベンジル（アルドリッチ）で処置し、激しく撹拌しながらＲＴまで冷却した。４ｈ後、反応混合物をエチルエーテル（４×１００mL）で抽出し、該エーテル抽出物を捨てた。水溶液を、濃ＨＣｌを加えてコンゴレッドの終点まで酸性化した。油状のエマルジョンが生じ、これをＣＨ₂Ｃｌ₂（４×６０mL）で抽出した。有機抽出物を合わせ、０．０５ＮＨＣｌ水溶液（２×６０mL）で洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、減圧下に濃縮して８．２３ｇ（９２％）のＮ− （（ベンゾイルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−メチル−Ｌ−グルタミン酸を白色の結晶性固体として得た。ｍ．ｐ．＝６１〜６３℃。例１６：グリシン tert−ブチルエステル−ベンゾフェノンイミン磁気撹拌器及び窒素導入管を備えた５００mLの三口フラスコに、１０．００ｇのグリシン tert−ブチルエステル・ＨＣｌ（シグマ）及び２００mLの無水ＣＨ₂ Ｃｌ₂を充填した。この溶液を１０．８０ｇのベンゾフェノンイミン（アルドリッチ）で処理し、窒素下、ＲＴで２４ｈ撹拌した。反応の間にＮＨ₄Ｃｌの細かい白色の沈殿が生成した。この混合物を乾燥するまで減圧下に濃縮し、白色の固体を得た。この固体を２５０mLのエチルエーテルに懸濁し、水（３×２００mL）で洗浄し、ＮＨ₄Ｃｌを除去した。エーテル溶液を無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、減圧下に濃縮し、白色固体を得た。この物質を３０mLのＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解し、１５０mLのペンタンを加えて粉末化した。白色の結晶性固体が生成し、これを付加によって集め、減圧下に乾燥し、¹Ｈ−ＮＭＲでグリシンt ert−ブチルエステル−ベンゾフェノンイミンであると同定した。収率＝１５．０ｇ（８５％）。ｍ．ｐ．＝１１０〜１１２℃。例１７：２−ヨードベンジルブロマイド窒素導入管及び磁気撹拌器を備えた乾燥させた１００mLの三口フラスコに、５．００ｇの２−ヨードベンジルアルコール（アルドリッチ）及び２０mLの無水ＣＨ₂Ｃｌ₂を加えた。得られた懸濁液を、０℃に冷却し、０．７１mLのｐＢｒ３（アルドリッチ）を２分間かけて滴下して処理した。固体がゆっくり溶解し、淡い黄色の溶液が得られた。この溶液を窒素下、０℃で２ｈ撹拌し、次いで１８ｈ撹拌を継続しながらＲＴまで暖めた。この溶液を乾燥するまで減圧下に濃縮し、残渣を６０mLのエチルエーテルに溶解した。エーテル溶液を氷冷した５％ＮａＨＣＯ₃水溶液（３×５０mL）で洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、減圧下に濃縮して５．６５ｇ（８９％）の２−ヨードベンジルブロマイドを白色の結晶性固体として得た。ｍ．ｐ．＝５２〜５４℃。例１８：２−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン tert−ブチルエステル−ベンゾフェノンイミン窒素導入管及び磁気撹拌器を備えた５００mLの三口フラスコに、２０．００ｇのグリシン tert−ブチルエステル−ベンゾフェノンイミン、２４．１３ｇの２ −ヨードベンジルブロマイド、２．８５ｇのＮ−ベンジルシンコニジウムクロライド（フルカケミカル Corp.、Ronkonkoma、NY、11779）、及び１０５mLのＣＨ₂ Ｃｌ₂を充填した。得られた溶液を１１０mLの５０％（ｗ／ｗ）ＮａＯＨ水溶液で処理し、混合物を窒素下、ＲＴで激しく撹拌した。２４ｈ後、ｔｌｃ（シリカゲル。７：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で主要な新たな成分はＲｆ＝０．６５であり、実反応の出発物質はＲｆ＝０．８５であり、３種類のマイナー成分はＲｆ＝０．２０〜０．４５であった。ＣＨ₂Ｃｌ₂層を分離し、水（３×７０mL）で洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、減圧下に濃縮して濃いピンク色のオイルを得た。この粗生成物を、７：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃで溶出する５５０ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（カラム容積の２倍の０．５％のＥｔ₃Ｎを含む７：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃを通してカラムを予め処理した。）にかけ、２６．４ｇ（７６％）の所望のエナンチオマー混合物（¹Ｈ−ＮＭＲで同定した。）をえた。生成物は、キラルＨＰＬＣ（Pirkleフェニルグリシン、９９：１ヘキサン：イソプロパノール、流速１mL/min）でｋ’＝３．６６（７６％）、ｋ’＝３．２８（２４％）の２種類のエナンチオマーであると決定した。この混合物を１６０mLのヘキサンに溶解し、４℃で２日間結晶化させた。固体を濾過によって分離し、減圧下に乾燥して１０．７２ｇ（３１％）のラセミ物質を得た。濾液を減圧下に濃縮し、１５．７２ｇ（４５％）のエナンチオマーの富化された物質（２−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン tert−ブチルエステル−ベンゾフェノンイミン、ｅｅ＝８６％）を透明で粘稠なオイルとして得た。この生成物を更に生成することなく次のステップに使用した。 ¹H-NMR : (200 MHz，CDCl₃)δ7.72(d，1H，J=7.8，芳香族CH)，7.60(m，2H，芳香族CH)，7.41-7.21(m，6H，芳香族CH)，7.19(m，2H，芳香族CH)，6.86(m，1H，芳香族CH)，6.55(d，2H，J=6.6，芳香族CH)，4.34(dd; 1H; J=3.9，9.6; メチン)，3. 48-3.21(m，2H，Ar-CH₂)，1.47(s，9H，t-Bu)．質量スペクトル : (CI，CH₄)512(M+H)⁺，484，456，410，384，217．例１９：２−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン還流冷却器及び磁気撹拌器を備えた５００mLの丸底フラスコに、１５．７２ｇの２−ヨード−Ｌ−フェニルアラニンtert−ブチルエステル−ベンゾフェノンイミン（８６％ｅｅ）及び１６５mLの６ＮＨＣｌ水溶液を充填した。此の混合物を４ｈ撹拌しながら加熱還流し、ＲＴに冷却し、白色の結晶性固体と混合しないオレンジ色の層（ベンゾフェノン）の混合物を得た。この混合物を水（１００mL）とエチルエーテル（７０mL）の間に分配した。水層を分離し、更に７０mLのエーテルで４回洗浄し、乾燥するまで減圧下に濃縮し、９．５ｇ（９４％）の２−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン・ＨＣｌをふわふわした白色の固体として得た。ｍ．ｐ．＝２４０℃ （dec.）。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ8.90-8.23(br s，3H，-NH₃ ⁺)，7.88(d，1H，J=8. 1，芳香族CH)，7.39(m，2H，芳香族CH)，7.04(m，1H，芳香族CH)，4.06(t，1H， J=7.4，メチン)，3.23(2H，Ar-CH₂)．例２０：メチル２−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン磁気撹拌器及び還流冷却器を備えた５００mL三口フラスコに、５．００ｇの２ −ヨード−Ｌ−フェニルアラニン・ＨＣｌ及び１００mLの無水ＭｅＯＨを加えた。この混合物を撹拌し、ＨＣｌガスを３分間バブリングして通すことによって酸性化した。透明な溶液が得られ、これを５ｈ加熱還流した。この溶液をＲＴまで冷却し、乾燥するまで減圧下に濃縮し、白色の固体を得た。この部室を１２０mL のＣＨ₂Ｃｌ₂に懸濁し、５％ＮａＨＣＯ₃水溶液（４×８０mL）で洗浄した。ＣＨ₂Ｃｌ₂溶液を２０mLの容積まで濃縮し、ジエチルエーテルで６０mLに希釈し、１６mLの１ＭＨＣｌエーテル溶液で処理した。白色固体が沈殿し、これを真空濾過して集め、減圧下に乾燥して４．９０ｇ（９４％）のメチル２−ヨード−Ｌ −フェニルアラニネート・ＨＣｌを得た。ｍ．ｐ．＝１９４〜１９６℃。例２１：メチルＮ−（（ベンゾイルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−メチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−ヨード−Ｌ−フェニルアラニネート窒素導入管及び磁気撹拌器を備えた乾燥した５００mL三口フラスコに、３．００ｇのメチル２−ヨード−Ｌ−フェニルアラニネート・ＨＣｌ及び８０mLのＣＨ₂Ｃｌ₂を充填した。この混合物を氷水浴で０℃に冷却し、０．９７mLのＮ−メチルモルホリン、次いで１．７７ｇのＥＤＣ（アルドリッチ）で処理した。反応混合物を０℃で１ｈ撹拌し、更に３ｈ連続して撹拌しながらＲＴまで暖めた。この溶液を１００mLのＣＨ₂Ｃｌ₂で希釈し、５％クエン酸水溶液（３×７０mL）、５％ＮａＨＣＯ₃水溶液（３×７０mL）で洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥した。乾燥剤を濾過によって除去し、濾液を減圧下に濃縮して４．３０ｇ（８４％）の灰色がかった白色の結晶性固体を得た。ｍ．ｐ．＝１１０〜１１２℃。¹Ｈ−ＮＭＲの試験で、約４％の（Ｓ，Ｒ）−ジアステレオマーを不純物として含有するメチルＮ−（（ベンゾイルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−メチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−ヨード−Ｌ−フェニルアラニネートであることが示された。この粗生成物を１：１ＥｔＯＨ−Ｈ₂Ｏで２回再結晶し、３．４７ｇ（６８％）の純粋な（Ｓ，Ｓ）−ジアステレオマーを白色の固体として得た。ｍ．ｐ．＝１１４〜１１６℃。例２２：メチルＮ−（（ベンゾイルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−メチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−（メトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニネート温度計、磁気撹拌器、及び還流冷却器を備えた乾燥した１００mL三口フラスコに、１．５０ｇのメチルＮ−（（ベンゾイルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−メチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−ヨード−Ｌ−フェニルアラニネート、０．１４９ｇのＰｄ（Ｐｈ₃Ｐ）₄（アルドリッチ）、及び３５mLの１：１ＭｅＯＨ：ＴＨＦを窒素フラッシュ下で加えた。この溶液を、１０分間窒素を通してバブリングしながら脱酸素化し、次いで１０分間ＣＯを通しながらバブリングしてＣＯを飽和した。この間、この溶液の色は黄色から明るいオレンジ色に変化した。反応容器を、ＣＯを満たした風船を取り付けることによってガス導入アダプターを介した凝縮器までＣＯの風船の圧力下に置きいた。反応混合物を撹拌しながら６０℃に加熱した。３ｈ後、ｔｌｃ（ＳｉＯ₂、１：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）による分析で、発物質が残っていないことが示され、新たな成分はＲｆ＝０．４０であり、Ｒｆ＝０．９０〜０．９５であることが示された。この物質は、８５ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィ（１：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、１．２３ｇ（９３％）のメチルＮ−（（ベンゾイルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−メチル−Ｌ−グルタミン−１−イル −２−（メトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニネートを白色の結晶性固体として得た。ｍ．ｐ．＝１２８〜１３０℃。例２３：メチル５−Ｏ−メチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−（メトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニネート例１０に従って、１．１０ｇのメチルＮ−（（ベンゾイルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−メチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−（メトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニネートを、０．２１４ｇの１０％Ｐｄ（Ｃ）及び０．１８ｇmLの塩化アセチルの存在下で水素化し、０．８６ｇ（９７％）のメチル５ −Ｏ−メチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−（メトキシカルボニル）−Ｌ− フェニルアラニネート・ＨＣｌを淡い黄色の発泡体としてえた。ｍ．ｐ．＝７７〜８０℃。例２４：メチルＮ−（Ｎ−（４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル− １−オキソ−ベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）−アミノ）−２−フルオロベンゾイル）−５−Ｏ−メチル−Ｌ−グルタミン−１−イル）−２−（メトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニネート例１１に従って、０．５０ｇの４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１ −オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロ安息香酸を、０。１７mgのクロロ蟻酸イソブチル及び０．１４mL（２×）のＮ− メチルモルホリンを用いて、０．５５ｇのメチル５−Ｏ−メチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−（メトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニネート・ＨＣｌとカップリングした。粗生成物を２５０ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（９７：３→９５：５ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）で精製し、０．２９ｇのメチルＮ−（Ｎ−（４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソ−ベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾイル）−５−Ｏ−メチル−Ｌ−グルタミン−１−イル）−２−（メトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニネートを白色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１８０℃（dec.）。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ12.52(s，1H，ベンゾキナゾリンNH)，9.86(s，1H，芳香族 CH)，8.52(d，1H，J=7.6，アミドNH)，8.23(d，1H，J=8.8，芳香族CH)，8.03(d，1H ，J=8.4，芳香族CH)，7.80(d，1H，J=7.2，芳香族CH)，7.59(m，2H，芳香族CH， 4-アミノベンゾイルNH)，7.50(t，1H，J=7.6，芳香族 CH)，7.44-7.21(m，5H，芳香族CH ，アミドNH)，6.53(d，1H，J=8.0，芳香族CH)，6.40(d，1H，J=14.5，芳香族CH)，4 .58(m，3H，ベンゾキナゾリン9-CH₂，メチン)，4.45(m，1H，メチン)，3.82(s，3H，ArCO₂CH₃) ，3.57(s，3H，ArCO₂CH₃)3.55(s，3H，CO₂CH₃)，3.48(m，1H，phe Ar-CH₂)，3.1 0(m，1H，phe Ar-CH₂)，2.45(s，3H，CH₃)，2.27(t，2H，J=7.5，glu 4-CH₂)，2 .01-1.73(m，2H，glu 3-CH₂)．例２５：Ｎ− Ｎ−（４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソ−ベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル）−２−カルボキシ−Ｌ−フェニルアラニン窒素導入管及び磁気撹拌器を備えた５０mL三口フラスコに、０．１１ｇのメチルＮ−（Ｎ−（４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソ−ベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾイル）−５−Ｏ−メチル −Ｌ−グルタミン−１−イル）−２−（メトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニネート及び１５mLの１：１ＴＨＦ：Ｈ₂Ｏを充填した。この溶液を、６２mg のＬｉＯＨ(フィッシャーサイエンティフィックＣｏ.FairLawn,NJ)で処理し、窒素下、ＲＴで撹拌した。１８ｈ後、ＨＰＬＣ（Ｃ１８、７０：３０：０．１Ｈ₂ Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ）による分析で、出発物質（ｋ’＝４．８９）が残っておらず、ｋ’＝２．２９の新たな成分及びｋ’＝０．７２と１．３３の間に三種類のマイナーな成分が示された。この溶液を７mLまで減圧下に濃縮し、半分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８、８０：Ａ、２５分かけて）にかけた。純粋なフラクション（分析用ＨＰＬＣで決定した。）を合わせ、乾燥するまで減圧下に濃縮した。残渣を２０mLの０．１７ＭＬｉＯＨ水溶液に溶解し、濾過し、１ＮＨＣｌ水溶液を加えてｐＨ＝３．５に酸性化した。白色固体が生成し、これを遠心により分離し、水性懸濁−遠心−デカンテーションのサイクルで４回洗浄した。生成物を１０mLの水に懸濁し、凍結し、凍結乾燥して６０mg（５６％）のＮ−（Ｎ−（４−（（（１，２−ジヒドロ−３− メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２ −フルオロベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル）−２−カルボキシ−Ｌ− フェニルアラニンをふわふわした白色の固体として得た。ｍ.ｐ.＝２４５℃（de c.）。HPLC: C18 で１つのピークであった。k'=1.86，70:30:0.1 H₂O:MeCN:TFA、流速=１ mL/min． ¹H-NMR: (300 MHz，DMSO-d₆)δ13.00-11.70(br s，COOH)，12.54(s，1H，ベンゾキナゾリン NH)，9.84(s，1H 芳香族CH)，8.35(d，1H，J=7.9，アミドNH)，8.22(d，1H，J=9. 1，芳香族CH)，8.01(d，1H，J=8.2，芳香族CH)，7.78(d，1H，J=7.8，芳香族CH) ，7.60(m，2H，芳香族 CH，4-アミノベンゾイルNH)，7.50(t，1H，J=7.8，芳香族CH)，7. 45-7.18(m，5H，芳香族CH，アミドNH)，6.53(d，1H，J=8.5，芳香族CH)，6.39(d，1 H，J=14.7，芳香族CH)，4.67-4.46(m，3H，ベンゾキナゾリン9-CH2，メチン)，4.41(m，1H，メチン )，3.55(dd; 1H; J=4.0，12.3; phe Ar-CH₂)，3.06(dd; 1H，J=10.2，12.9; phe Ar-CH₂)，2.42(s，3H，CH₃)，2.16(t，2H，J=7.3，glu 4-CH₂)，1.98-1.64( m，2H，glu 3-CH₂)元素分析 : Calcd．for C₃₆H₃₂N₅O₉F・H₂O(MW 715.69): C，60.42; H，4.79; N，9 .79．Found: C，60.49; H，4.83; N，9.76．質量スペクトル : (イオンスプレー) 698 (M+H)⁺，489，361．ＵＶスペクトル： (pH7 バッファー)λ_max（ε）265.2(43700)，298.4(25600)，347.9 (5320)．¹min(e)241.S(20300)，284.9(24600)，340.0(3140)．例２６：メチルＮ−（Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−Ｌ−グルタミン−１−イル）−２−メトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニネート例１３に従って、０．２９ｇの４−（Ｎ−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニルメチル）−Ｎ−メチルアミノ）安息香酸半塩酸塩二水和物（アルドリッチ）を、０．３５mLのでＣＰ（アルドリッチ）及び０．５８mLのＥｔ₃Ｎを用いて、０．３２ｇのメチル５−Ｏ−メチル− Ｌ−グルタミン−１−イル−２−（メトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニネート・ＨＣｌと反応した。粗生成物を１００ｇのシリカゲルでフラッシュクロマトグラフィー（７：７：１ＣＨ₂Ｃｌ₂：アセトン：ＭｅＯＨ）で精製し、０．２７ｇ（５１％）のメチルＮ−（Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６− プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−Ｌ−グルタミン −１−イル）−２−メトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニネートを黄色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１２５〜１３０℃。例２７：Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−カルボキシ− Ｌ−フェニルアラニン磁気撹拌器と窒素導入管を備えた５０mL三口フラスコに、０．１２ｇのメチルＮ−（Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−Ｌ−グルタミン−１−イル）−２−メトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニネート及び１：１Ｈ₂Ｏ：ＴＨＦを加えた。この混合物を、２９mgのＬｉＯＨ・Ｈ₂Ｏ（J.T．Baker Chemical Co.，Philli psburg，NJ）と処理し、窒素下、ＲＴで撹拌した。４８ｈ後、ＨＰＬＣ（Ｃ１８、７５：２５：０．１Ｈ₂Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ）による分析で、ｋ’＝１．７０に主要な新たな成分（約９０％）とＫ’＝０．６０、１．０３、及び２．２５に三種類のマイナーな成分が示された。この溶液を、１ＮＨＣｌ水溶液を滴下することによって中和し、乾燥するまで減圧下に濃縮した。残渣を１０mLのＭｅＯＨに溶解し、２０mLの水で希釈し、生成物を沈殿させた。ＭｅＯＨをロータリーエバポレーションにより除去し、残りの懸濁液を凍結し、凍結乾燥して６５mg（４５％）のＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−カルボキシ−Ｌ− フェニルアラニンを黄色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１６０℃（dec.）。HPLC : C18で２つのピークがある。k'=2.49(98%)，k'=5.65(2%); 78:22:0.1 H₂O: MeCN:TFA、流速=１ mL/min． ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ13.10-11.90(br5，COOH)，8.64(s，1H，プテリジニル7- CH)，8.62(br s，1H NH₂)，8.18(d，1H，J=8.0，アミドNH)，7.92(d，1H，J=8.0，アミド NH)，7.80-7.20(br m，2H，NH₂)，7.77(d，1H，J=7.3，芳香族CH)，7.70(d，2 H，J=8.9，芳香族CH)，7.25(m，3H，芳香族CH)，6.81(d，2H，J=9.0，芳香族CH) ，4.84(s，2H，プテリジニル-CH₂)，4.49(m，1H，メチン)，4.39(m，1H，メチン)，3.51(m，1 H phe Ar-CH₂)，3.24(s，3H，N-CH₃)，3.08(m，1H，phe Ar-CH₂)，2.19(t，2H， J=7.6，glu 4-CH₂)，1.97-1.72(m，2H glu 3-CH₂)．元素分析 : Calcd．for C₃₀H₃₁N₉O₈・2.7H₂O・1.2TFA(MW 831.10): C，46.82; H，4 .56; N，15.17．Found: C，46.76; H， 4.48; N，15.15．質量スペクトル : (イオンスプレー)646(M+H)⁺，410，369，185．ＵＶスペクトル : (pH7 バッファー)λ_max（ε）: 258.8(23400)，307.0(24200)，372. 8(7540)． l_min(e) 242.0(16000)，273.2 (16200)，344.3(5900)．例２８：ジメチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−メチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−アスパルテート例９に従って、２．０１ｇのＬ−アスパラギン酸ジメチルエステル・ＨＣｌ（シグマ）を、２．０５ｇのＥＤＣ（アルドリッチ）及び１．１２mLのＮ−メチルモルホリンを用いて３．００ｇのＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５− Ｏ−メチル−Ｌ−グルタミン酸とカップリングした。これにより、３．９３ｇ（８８％）のジメチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−メチル −Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−アスパルテートを結晶性の白色固体として得た。ｍ．ｐ．＝８６〜８８℃。例２９：ジメチル５−Ｏ−メチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−アスパルテート例１０に従って、２．００ｇのジメチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−メチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−アスパルテートを０．４５ｇの１０％Ｐｄ（Ｃ）及び０．３９mLの塩化アセチルの存在下で水素化し、１．５６ｇ（１００％）のジメチル５−Ｏ−メチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−アスパルテート・ＨＣｌを淡黄色の発泡体としてえた。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ9.14(d，1H，J=7.4，NH)，8.40(br s，3H，NH₃ ⁺) ，4.72(m，1H，glu メチン)，3.89(m，1H，aspメチン)，3.66(s，3H，CO₂CH₃)，3.65(s ，3H，CO₂CH₃)，3.64(s，3H，CO₂CH₃)，2.85(d，2H，J=6.2，asp CH₂)，2.49(m ，2H，glu 4-CH₂)，2.04(m，2H，glu 3-CH₂)．例３０：ジメチルＮ−（Ｎ−（４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル −１−オキソ−ベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾイル）−５−Ｏ−メチル−Ｌ−グルタミン−１−イル）−Ｌ−アスパルテート例１１に従って、０．５０ｇの４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１ −オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロ安息香酸を、０．１７mLのクロロ蟻酸イソブチル及び０．１４mL（２×）のＮ− メチルモルホリンを用いて０．４５ｇのジメチル５−Ｏ−メチル−Ｌ−グルタミン−１−Ｌ−アスパルテート・ＨＣｌとカップリングした。粗生成物を、２５０ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（９５：５ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）で精製し、０．３３ｇ（３８％）のジメチルＮ−（Ｎ−（４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソ−ベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ） −２−フルオロベンゾイル）−５−Ｏ−メチル−Ｌ−グルタミン−１−イル）− Ｌ−アスパルテートを白色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１９８〜２００℃。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ12.54(s，1H，ベンゾキナゾリンNH)，9.85(s，1H，芳香族 CH)，8.55(d，1H，J=7.7，アミドNH)，8.23(d，1H，J=8.8，芳香族CH)，8.02(d，1H ，J=8.4，芳香族CH)，7.70-7.45(m，4H，芳香族CH，アミドNH)，7.33(m，1H，4-アミノベンゾイル NH)，6.55(dd; 1H; J=8.8，l.9; 芳香族CH)，6.42(dd; 1H; J=15.3，1.7; 芳香族CH)，4.72-4.41(m，4H，ベンゾキナゾリン9-CH₂，ｇlｕ及び asp メチン)，3.62(s， 3H，CO₂CH₃)，3.60(s，3H，CO₂CH₃)，3.55(s，3H，CO₂CH₃)，2.91-2.66(m，2H， asp CH₂)，2.42(s，3H，CH₃)，2.34(t，2H，J=7.7，glu 4-CH₂)，2.13-1.80(m， 2H，glu 3-CH₂)．例３１：Ｎ−（Ｎ−（４−（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル）−Ｌ−アスパラギン酸例１２に従って、０．１２ｇのジメチルＮ−（Ｎ−（４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソ−ベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾイル）−５−Ｏ−メチル−Ｌ−グルタミン−１ −イル）−Ｌ−アスパルテートを４５mgのＬｉＯＨ・Ｈ₂Ｏ（Baker）を用いて８ mLの１：１ＴＨＦ：Ｈ₂Ｏ中でケン化した。逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８、８０：２０：０．１Ｈ₂Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ）による粗生成物の分析で、ｋ’＝１．７３（９０％）の主要成分と、ｋ’＝１．２８のマイナー成分が示された。この物質を、グラジェント溶出液を用いる半分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８、８０：２０：０．１→７５：２５：０．１Ｈ₂Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ２０分かけて）精製した。純粋なフラクション（分生用ＨＰＬＣで決定した。）を合わせ、減圧下に濃縮した。残渣を２０mL の水と混合し、十分なＬｉＯＨ・Ｈ₂Ｏで処理し、固体を溶解した。この溶液を濾過し、１ＮＨＣｌを加えてｐＨ３．０に酸性化した。白色固体が生成し、これを遠心によって分離し、水性懸濁液−遠心−デカンテーションのサイクルで４回洗浄し、凍結乾燥し、５７mg（４８％）のＮ−（Ｎ−（４−（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−アスパラギン酸を灰色がかった白色の固体として得た。ｍ．ｐ．＝１８５℃（dec.）。 HPLC: C18 で１つのピークであった。k'=1.42，75:25:0.1H₂O:MeCN:TFA、流速= １ mL/min． ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ12.85-12.00(br s，COOH)，12.53(s，1H，ベンゾキナゾリン NH)，9.84(s，1H，芳香族CH)，8.36(d，1H，J=7.9，アミドNH)，8.21(d，1H，J=8 .8，芳香族CH)，8.01(d，1H，J=8.3，芳香族CH)，7.67-7.46(m，4H，芳香族CH，アミド NH)，7.32(m，1H，4-アミノベンゾイル NH)，6.53(d，1H，J=8.5，芳香族CH)，6.40(d ，1H，J=14.8，芳香族CH)，4.64-4.44(m，4H，ベンゾキナゾリン9-CH₂，glu メチン，asp メチン )， 2.75-2.53(m，2H，asp CH₂)，2.42(s，3H，CH3)，2.25(t，2H，J=7.3，glu 4-CH₂ )，1.98(m，1H，glu 3-CH₂)，1.83(m，1H，glu 3-CH₂)元素分析 : Calcd．for C₃₀H2₈N₅O₉F 1.8H₂O(MW 654.01): C，55.10; H，4.87; N ，10.71．Found: C，55.04; H，4.82; N，10.61．質量スペクトル : (イオンスプレー)622(M+H)⁺，316，213，156．ＵＶスペクトル: (pH7 バッファー)λ_max（ε）264.8(46200)，298.4(28500)，347.8( 6180)．l_min(e)237.9(19500)，285.7(27900)，340.0(3820)．例３２：ジメチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−メチル−Ｌ−グルタミン−１ −イル）−Ｌ−アスパルテート例１３に従って、０．２００ｇの４−（Ｎ−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニルメチル）−Ｎ−メチルアミノ）安息香酸半塩酸塩二水和物（アルドリッチ）を、０．２４mLのＤＥＣＰ（アルドリッチ）及び０．４１mLのＥｔ₃Ｎを用いて０．１８ｇのジメチル５−Ｏ−メチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−アスパルテート・ＨＣｌとカップリングした。粗生成物を１００ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（７：７：１ＣＨ₂Ｃｌ₂：アセトン：ＭｅＯＨ）で精製し、０．１７ｇ（５３％）のジメチルＮ−（４−(((２，４−ジアミノ−６−プテリジニル)メチル)メチルアミノ)ベンゾイル）−５−Ｏ−メチル− Ｌ−グルタミン−１−イル）−Ｌ−アスパルテートを黄色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１３０〜１３５ ℃。例３３：Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−アスパラギン酸（方法Ａ）この化合物を製造するための方法Ｂは例１２５を参照。磁気撹拌器と窒素導入管を備えた５０mL三口フラスコに、０．１６ｇのジメチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−メチル−Ｌ−グルタミン−１−イル）−Ｌ−アスパルテート及び１０mLの−１：１ＴＨＦ：Ｈ₂Ｏを充填した。この溶液を４４m LのＬｉＯＨ・Ｈ₂Ｏ（Baker）で処理し、Ｎ₂下、ＲＴで撹拌した。３ｈ後、ｔｌｃ（ＳｉＯ₂、７：７：1 ＣＨ₂Ｃｌ₂：アセトン：ＭｅＯＨ）で、Ｒｆ＝０．３０の出発物質が残っていないこと、及びＲｆ＝０．０の単一のスポットが示された。逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８、８５：１５：０．１Ｈ₂Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ）による分析で、ｋ’＝２．６５（９０％）の主要成分と、ｋ’＝１．９４のマイナー成分が示された。この溶液を１ＮＨＣｌを加えて中和し、乾燥するまで濃縮した。粗生成物を半分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８、８７：１３：０．１Ｈ₂Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ）で精製した。純粋なフラクション（分析用ＨＰＬＣで決定した。）を合わせ、乾燥するまで濃縮した。残渣を２０mLのＨ₂Ｏに溶解し、凍結乾燥して６５mg（３２％）のＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ− グルタミン−１−イル−Ｌ−アスパラギン酸を黄−橙色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１６５〜１８０℃（dec.）。HPLC :C18 で１つのピークであった。k'=2.45，85:15:0.1H₂O:MeCN:TFA、流速=１ mL/min． ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ13.00-11.85(br s，COOH)，9.17(br s，1H，NH₂) ，8.96(br s，1H，NH₂)，8.71(s，1H，プテリジニル7-CH)，8.60-8.30(br s，1H，NH₂) ，8.21(d，1H，J=8.0，アミドNH)，8.06(d，1H，J=7.8，アミドNH)，7.85-7.43(br s， 1H，NH₂)，7.75(d，2H，J=8.7，芳香族CH)，6.82(d，2H，J=8.8，芳香族CH)，4. 87(s，2H，プテリジニル-CH₂)，4.59-4.38(m，2H，2 メチン)，3.25(s，3H，N-CH₃)，2.75 -2.53(m，2H，asp CH₂)，2.28(t，2H，J=7.5，glu 4-CH₂)，2.01(m，1H，glu 3- CH₂)，1.88(m，1H，glu 3-CH₂)．元素分析 : Calcd．for C₂₄H₂₇N₉O₈・1.9H₂O 1.6TFA(MW 786.20): C，41.55; H，4 .15; N，16.03．Found: C，41.53; H，4.19; N，16.00．質量スペクトル : (イオンスプレー)570(M+H)⁺，223．ＵＶスペクトル: (pH7 バッファー)λ_ma _x （ε）258.7(24400)，307.3(26800)，372.9(8080)．lmin(e)240.0(14800)，272 .9(17000)，345.0(6420)．例３４：ジエチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）５−Ｏ−エチル −Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−グルタメート例９に従って、３．１７ｇのＬ−グルタミン酸ジエチルエステル・ＨＣｌ（シグマ）を、２．６６ｇのＥＤＣ（アルドリッチＡ）及び１．４５mLのＮ−メチルモルホリンを用いて４．０９ｇのＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル−５−Ｏ −エチル−Ｌ−グルタミン酸とカップリングした。これにより、４．８０ｇ（７４％）のジエチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）５−Ｏ−エチル−Ｌ −グルタミン−１−イル−Ｌ−グルタメートを白色の結晶性固体として得た。ｍ．ｐ．＝１０４℃。例３５：ジエチル５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−グルタメート５００mLのパールの容器に０．７５ｇのジエチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−グルタメート、０．１４ｇの１０％Ｐｄ（Ｃ）及び６０mLのＥｔＯＨをＮ₂フラッシュ下で加えた。この混合物を、７分間Ｎ₂をバブリングして脱酸素化し、１．５２mLの１ＭＨＣｌエーテル溶液で処理し、４５psiで１８ｈ水素化した。この容器をＮ₂でパージし、触媒をセライトを通して濾過により除き、濾液を乾燥するまで減圧下に濃縮し、０．６０ｇ（９９％）のジエチル５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン− １−イル−Ｌ−グルタメート・ＨＣｌを淡黄色の発泡体として得た。 ¹H-NMR: (300 MHz，DMSO-d₆)δ9.11(d，1H，I=7.5，NH)，8.41 (br s，3H，NH₃ ⁺)，4.32(m，1H，メチン)，4.06(m，6H，エチル CH₂)，3.92(m，1H ，メチン)，2.47(m，4H，glu 4-CH₂)，2.12-1.79(m，4H，glu 3-CH₂)，1.19(t，9H ，J=7.1，エチル CH₃)．例３６：ジエチルＮ−（Ｎ−（４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル −１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾイル）−５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン−１−イル）−Ｌ−グルタメート例１１に従って、０．５７ｇの（４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル− １−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロ安息香酸を、０．２０mLのクロロ蟻酸イソブチル及び０．１７mL（２×）のＮ −メチルモルホリンを用いて、０．６０ｇのジエチル５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−グルタメート・ＨＣｌとカップリングした。粗生成物を、３５０ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ→９８：２ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ）で精製し、０．２７ｇ（２５％）のジエチルＮ −（Ｎ−（４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾイル）−５−Ｏ −エチル−Ｌ−グルタミン−１−イル）−Ｌ−グルタメートを白色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１８５〜１８７℃。例３７：Ｎ−（Ｎ−（４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾイル）−５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン−１−イル）−Ｌ−グルタミン磁気撹拌器と窒素導入管を備えた２５０mL三口フラスコに、０．２１７ｇのジエチルＮ−（Ｎ−（４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾイル）−５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン−１−イル）−Ｌ−グルタメート、４０mL の０．２ＮＮａＯＨ水溶液、及び１５mLのＥｔＯＨを充填した。この混合物をＮ₂ 下、ＲＴで撹拌した。固体の出発物質が徐々に溶解し、透明な溶液が得られた。２ｈ後、ｔｌｃ（ＳｉＯ₂、ＥｔＯＡｃ）で、Ｒｆ＝０．１５の出発物質が残っていないこと、及びＲｆ＝０．０の新たなスポットが示された。この溶液を１ＮＨＣｌを加えることによってｐＨ＝３．００に酸性化した。白色の固体が沈殿し、これを遠心によって分離し、水性懸濁−遠心−デカンテーションのサイクルで４回洗浄し、凍結乾燥して０．１７ｇ（８４％）のＮ−（Ｎ−（４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾイル）−５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン−１−イル）−Ｌ−グルタミン酸を白色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１８０ ℃（dec.）。生成物は、ＨＰＬＣにより純粋であること決定した。HPLC: C18で１つのピークであった。k'=1.66，75:25:0.1 H₂O:MeCN:TFA、流速=１mL/min． ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ12.65-11.90(br s，COOH)，12.53(s，1H，ベンゾキナゾリン NH)，9.84(s，1H，芳香族 CH)，8.29(d，1H，J=7.5，アミドNH)，8.22(d，1H，J= 8.9，芳香族CH)，8.01(d，1H，J=8.0，芳香族CH)，7.60(m，3H，芳香族CH，アミドN H)，7.51(t，1H，J=9.0，芳香族CH)，7.33(m，1H，4-アミノベンゾイルNH)，6.54(dd; 1H ; J=8.5，1.9; 芳香族CH)，6.41(dd; 1H; J=13.9，1.4; 芳香族CH)，4.57(d，2H ，J=5.2，ベンゾキナゾリン9-CH₂)，4.49(m，1H，メチン)，4.22(m，1H，メチン)，2.43(s，3H ，CH₃)，2.28(m，4H，glu 4-CH₂),2.10-1.70(m，4H，glu 3-CH₂)．元素分析 : Calcd．for C₃₁H₃₀N₅O₉F・2H₂O(MW 671.64): C，55.44; H，5.10; N， 10.43．Found: C，55.38; H，5.12; N，10.26．質量スペクトル : (FAB)636(M+H)⁺，613，581，549．ＵＶスペクトル : (pH7 バッファー)λ_max（ε）264.9(45100)，296.1(28000)，331.4( 7280)，348.1(5990)．l_min(e)285.6(27200)，329.3(7040)，339.8(3700)．lsh(e )271.5(41900)．例３８：ジエチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン−１ −イル−Ｌ−グルタメート例１３に従って、０．１４２ｇの４−（Ｎ−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニルメチル）−Ｎ−メチルアミノ）安息香酸半塩酸塩二水和物（アルドリッチ）を、０．１８mLのＤＥＣＰ（アルドリッチ）及び０．３１mLのＥｔ₃Ｎを用いて０．１５ｇのジエチル５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−グルタメート・ＨＣｌとカップリングした。粗生成物を１２０ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（７：７：１ＣＨ₂Ｃｌ₂：アセトン：ＭｅＯＨ）で精製し、０．１４ｇ（５６％）のジエチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン− １−イル−Ｌ−グルタメートを黄色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１０５〜１０９℃。例３９：Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−グルタミン酸（方法Ａ）この化合物を製造するための方法Ｂは例１２９を参照。例３３に従って、０．１２５ｇのジエチルＮ−(４−(((２，４−ジアミノ− ６−プテリジニル)メチル)メチルアミノ)ベンゾイル)−５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−グルタメートを、２３mgのＬｉＯＨ（フィッシャー）を用いて１０mLの１：１ＴＨＦ：Ｈ₂Ｏ中でケン化した。Ｎ２下、ＲＴで１８ｈ撹拌した後、１ＮＨＣｌを加えてｐＨ＝２．０に酸性化し、減圧下に乾燥するまで濃縮した。ＨＰＬＣ（Ｃ１８、８５：１５：０．１Ｈ₂Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ）による残渣の分析で、ｋ’＝２．８９（９０％）の主要成分とｋ’＝２．４６及び１．１７のマイナー成分が示された。粗生成物を半分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８、８７：１３：０．５Ｈ₂Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ）で精製し、凍結乾燥し、３７mg（２４％）のＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ −グルタミン−１−イル−Ｌ−グルタミン酸を黄色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１７８℃HPLC : C18 で１つのピークであった。k'=2.90，85:15:0.1H₂O:MeCN:TFA、流速= １mL/min． ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ13.20-12.00(br s，COOH)，9.30(br s，1H，NH₂) ，9.10(br s，1H，NH₂)，8.74(s，1H，プテリジニル7-CH)，8.72-8.42(brs，1H，NH₂) ，8.20(d，1H，J=7.5，アミドNH)，8.07(d，1H，J=7.5，アミドNH)，7.76(d，2H，J=8. 8，芳香族CH)，7.61-7.40(br s，1H，NH₂)，6.83(d，2H，J=8.8，芳香族CH)，4. 90(s，2H，プテリジニル-CH₂)，4.43(m，1H，メチン)，4.20(m，1H，メチン)，3.27(s，3H，N -CH₃)，2.30(m，4H，glu 4-CH₂)，2.08-1.77(m，4H，glu 3-CH₂)．元素分析: Calcd．for C₂₅H₂₉N₉O₈・2.3H₂O・1.7TFA(MW 818.84): C，41.66; H， 4.35; N，15.40．Found: C，41.61; H，4.25; N，15.44．質量スペクトル : (FAB)584(M+H)⁺，309，275，176，155，119．ＵＶスペクトル : (pH7 バッファー)λ_max（ε）220.9(20500)，258.5(21500)，306.7( 23200)，372.5(7180)．lmin(e)240.1(13400)，272.5(15100)，344.8(5730)．例４０：３−シアノ−Ｌ−チロシン５．７０ｇの３−アミノ−Ｌ−チロシン（アルドリッチ）の２．１５ＮＨＣｌ水溶液の３５mL溶液を０℃に冷却し、１．４１ｇのＮａＮＯ₂（アルドリッチ）の５mL水溶液、次いで２．９７ｇのＮａ₂ＣＯ₃で処理した。０℃で７分撹拌した後、この溶液を、コンデンサーを備えた２５０mL三口フラスコ内で７５℃に維持され、撹拌された、３．５８ｇのＣｕＣＮ（アルドリッチ）、５．８８ｇのＮａＣＮ（アルドリッチ）及び５．７２ｇのＮａ₂ＣＯ₃の４０mLの水中混合物にゆっくり加えた。添加の間、窒素の激しい発生が起こり、反応混合物は暗赤橙色に色が変化した。この反応混合物を７５℃で２ｈ撹拌し、９５℃に加熱し、更に１ｈ撹拌した。ＲＴに冷却した後、反応混合物を、滴下ロートを通して濃ＨＣｌを添加することによってｐＨ＝２．０に酸性化した。発生したガスを２０％ＮａＯＨ水溶液のとラップ、次いで５％ＮａＯＣｌ（Chlorox）トラップを通して洗浄した。混合物を濾過し、濾液のｐＨを濃ＮＨ₄ＯＨで６．０に調整した。茶色の溶液を３００mLの水と混合し、３００ｇのダウエックス５ＯＷＸ−８イオン交換樹脂（酸性型）と撹拌した。樹脂を溶かし、１Ｌの水で洗浄し、５００mLの水と混合し、この混合物を濃ＮＨ₄ＯＨを加えることによってｐＨ１１に塩基性にした。この混合物を濾過し、濾液を乾燥するまで減圧下に濃縮した。暗茶色の残渣を２０mLの水に懸濁し、固体を溶解するのに十分な１ＮＮａＯＨ水溶液で処理した。次に、ｐＨを１ＮＨＣｌ水溶液を加わえてｐＨ６．０に調整した。沈殿が精製し、これを濾過によって集め、減圧下に乾燥して１．４５ｇ（３５％）の３−シアノ−Ｌ−チロシンをチョコレート様の茶色の固体として得た。ｍ．ｐ．＞２５０℃。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ9.60-7.20(br s，NH₂)，7.39(s，1H，芳香族CH) ，7.30(m，1H，芳香族CH)，6.98(m，1H，芳香族CH)，3.52(m，1H，メチン)，2.92(m ，2H，ArCH₂)．例４１：メチル３−（メトキシカルボニル）−Ｌ−チロシネート還流冷却器及び磁気撹拌器を備えた２５０mL三口フラスコに、１．４５ｇの３ −シアノ−Ｌ−チロシン、５０mLの濃ＨＣｌ、及び５０mLの水を充填した。この溶液を撹拌しながら加熱還流した。２日後、ＨＰＬＣ（Ｃ１８、９０：１０：０．１Ｈ₂Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ）による反応混合物の分析で、ｋ’＝２．２３の主要成分（７５％）と、ｋ’＝１．５９（２５％）のマイナー成分が示された。４日後、ＨＰＬＣでｋ’＝２．２３の物質のみが示された。この反応混合物をＲＴに冷却し、濾過し、濾液を乾燥するまで減圧下に濃縮し、１．２ｇの３−カルボキシ−Ｌ−チロシンを暗茶色の固体として得た。ＩＲ（ヌジョール）分析で、３−シアノ−Ｌ−チロシンの２２２３cm^-1のニトリルの伸縮が消失していることが示された。粗製の固体を、コンデンサー及び磁気撹拌器を備えた２５０mLの三口フラスコ内の６０mLの無水メタノールに加えた。この混合物を、５分間ＨＣｌガスをバブリングすることによって酸性化し、撹拌しながら加熱還流した。６ｈ後、反応混合物をＲＴに冷却し、固体のＮａＨＣＯ₃で中和した。この混合物を乾燥するまで濃縮し、１００mLの水と混合し、ＣＨ₂Ｃｌ₂（４×５０mL）で抽出した。抽出物を合わせ、５％ＮａＨＣＯ₃水溶液で洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、１０mLまで減圧下に濃縮した。この溶液を３５mL のエーテルで希釈し、５．５mLの１ＭＨＣｌエーテル溶液で処理した。固体が沈殿し、これを濾過により集め、エーテルで洗浄し、減圧下に乾燥し、０．９０（５０％）のメチル３−（メトキシカルボニル）−Ｌ−チロシネート・ＨＣｌを灰色がかった白色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝２１１〜２１３℃。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ10.45(s，1H，OH)，8.59(br s，3H，NH₃ ⁺)，7.66 (s，1H，芳香族CH)，7.38(dd; 1H: J=7.9，1.1，芳香族CH)，6.97(d，1H，J=7.9 ，芳香族CH)，4.26(m，1H，メチン)，3.89(s，3H，CO₂CH₃)，3.68(s，3H，CO₂CH₃) ，309(m，2H，ArCH₂)．例４２：メチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−メチル −Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（メトキシカルボニル）−Ｌ−チロシネート例９に従って、０．８０ｇのメチル３−（メトキシカルボニル）−Ｌ−チロシネート・ＨＣｌを、０．５６ｇのＥＤＣ（アルドリッチ）及び０．３０mLのＮ −メチルモルホリンを用いて、０．８２ｇのＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル−５−Ｏ−メチル−Ｌ−グルタミン酸とカップリングした。これにより、１．２４ｇ（８５％）のメチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−メチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３− （メトキシカルボニル）−Ｌ−チロシネートを白色の固体として得た。ｍ．ｐ．＝１４２〜１４４℃。例４３：メチル５−Ｏ−メチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（メトキシカルボニル）−Ｌ−チロシネート例１０に従って、０．９９ｇのメチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−メチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（メトキシカルボニル） −Ｌ−チロシネートを、０．１９ｇの１０％Ｐｄ（Ｃ）及び０．１５mLの塩化アセチルを用いて、９０mLの２：１ＥｔＯＨ：ＥｔＯＡｃ中で水素化し、０．７５ｇ（９７％）のメチル５−Ｏ−メチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（メトキシカルボニル）−Ｌ−チロシネート・ＨＣｌを淡黄色の発泡体として得た。ｍ．ｐ．＝９５〜９７℃。例４４：メチル（Ｎ−（Ｎ−（４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル −１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾイル）−５−Ｏ−メチル−Ｌ−グルタミン−１−イル）−３−（メトキシカルボニル）−Ｌ−チロシネート例１１に従って、０．６５ｇの４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１ −オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロ安息香酸を、０．２２mLのクロロ蟻酸メチル及び０．１９mL（２×）のＮ−メチルモルホリンを用いて０．７５ｇのメチル５−Ｏ−メチル−Ｌ−グルタミン− １−イル−３−（メトキシカルボニル）−Ｌ−チロシネート・ＨＣｌとカップリングした。粗生成物を、３００ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（９９：１→９４：６ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ）で精製し、０．５３ｇ（４０％）のメチル（Ｎ−（Ｎ−（４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾイル）−５−Ｏ−メチル−Ｌ−グルタミン−１−イル）−３−（メトキシカルボニル）−Ｌ−チロシネートを白色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１９５〜２０３℃（dec.）。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ12.52(ベンゾキナゾリンNH)，10.38(s，1H，OH)，9.83(s ，1H，芳香族CH)，8.45(d，1H，J=7.5，アミドNH)，8.21(d，1H，J=8.9，芳香族CH) ，8.00(d，1H，J=8.3，芳香族CH)，7.60(m，3H，芳香族CH，4-アミノベンゾイルNH)，7.4 8(m，2H，芳香族CH)，7.36(m，2H，芳香族CH，アミドNH)，6.86(d，1H，J=8.6，芳香族CH)，6.52(dd; 1H; J=8.5，1.9; 芳香族CH)，6.39(dd; 1H; J=13.9，1.5; 芳香族CH)，4.57(d，2H，J=5.6，ベンゾキナゾリン9-CH₂)，4.45(m，2H，メチン)，3.84(s， 3H，CO₂CH₃)，3.58(s，3H，CO₂CH₃)，3.52(s，3H，CO₂CH₃)，3.05-2.80(m，2H， ArCH₂)，2.42(s，3H，CH₃)，2.25(t，2H，J=7.8，glu 4-CH₂)，2.00-1 77(m，2H ，glu 3-CH₂)．例４５：３−カルボキシ−Ｎ−（Ｎ−（４−（（（１，２−ジヒドロ−３− メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル）−Ｌ−チロシン０．１５ｇのメチル（Ｎ−（Ｎ−（４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾイル）−５−Ｏ−メチル−Ｌ−グルタミン−１−イル）−３−（メトキシカルボニル）−Ｌ−チロシネートの０．２Ｎ水性ＮａＯＨの２０mL溶液をＮ₂下、ＲＴで１８ｈ撹拌した。ＨＰＬＣ（Ｃ１８、７０：３０：０．１Ｈ₂Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ）による溶液の分析で、ｋ’＝１．９（９０％）の主要成分と、ｋ’＝１．０及び２．６の２種類のマイナー成分が示された。この溶液を、１ＮＨＣｌを加えてｐＨ２．５に酸性化した。白色の沈殿が生じ、これを遠心によって分離し、半分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８、７５：２５：０．１Ｈ₂Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ）で精製した。純粋なフラクション（分析用のＨＰＬＣで決定した。）を合わせ、乾燥するまで減圧下に濃縮した。残渣を２０mLの０．１５ＮＮａＯＨ水溶液に溶解し、この溶液を１ＮＨＣｌを加えてｐＨ＝３．０に酸性化した。得られた白色の沈殿を遠心によって分離し、水性懸濁−遠心−デカンテーションのサイクルで４回洗浄し、凍結乾燥して３９mg（２６％）の３−カルボキシ−Ｎ −(Ｎ−(４−(((１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル)メチル)アミノ)−２−フルオロベンゾイル)−Ｌ−グルタミン −１−イル)−Ｌ−チロシンを白色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１９８〜２０５℃（dec.）。HPLC : C18で１つのピークであった。k'=1.86，70:30:0.1H₂O:MeCN:TFA、流速=１ mL/min． ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ13.00-11.00(brm，COOH，ベンゾキナゾリンNH)，9.86(s， 1H，芳香族CH)，8.28(d，1H，J=7.5，アミドNH)，8.24(d，1H，J=8.9，芳香族CH)， 8.03(d，1H，J=8.4，芳香族CH)，7.70-7.42(m，5H，芳香族CH，4-アミノベンゾイル NH) ，7.40-7.24(m，2H，芳香族CH，アミドNH)，6.78(d，1H，J=8.6，芳香族CH)，6.55( dd; 1H; J=8.5，1.9; 芳香族CH)，6.42(dd; 1H; J=13.9，1.5; 芳香族CH)，4.58 (d，2H，J=5.8，ベンゾキナゾリン9-CH₂)，4.55-4.31(m，2H，メチン)，3.06-2.75(m，2H，A rCH₂)，2.24(s，3H，CH₃)，2.21(t，2H，J=7.6，glu 4-CH₂)，2.08-1.70(m，2H ，glu 3-CH₂)元素分析 : Calcd．for C₃₆H₃₂N₅O₁₀F・2.2H₂O(MW 753.31): C，57.40; H，4.87; N，9.30．Found: C，57.37; H，4.97; N，9.28．質量スペクトル : (FAB)714(M+H)⁺，613，549，461，360，309．ＵＶスペクトル : (pH7 バッファー)^lmax(e)265.9(44700)，300.2(28200)，348.3(5270 )．^l min(e) 246.3(23400)，285.2(25500)，340.8(3630)．例４６：tert−ブチル３−（tert−ブトキシカルボニル）−Ｌ−チロシネート磁気撹拌器とコンデンサーを備えた２５０mL三口フラスコに、４．１ｇの３− シアノ−Ｌ−チロシン及び１００mLの６ＮＨＣｌ水溶液を充填した。この混合物を撹拌しながら加熱還流した。３６ｈ後、ＨＰＬＣ（Ｃ１８、９０：１０：０．１Ｈ₂Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ）で、ｋ’＝１．３３の種発物質が残っていないこと、及びｋ’＝１．６９の新たな主要成分が示された。反応混合物をＲＴに冷却し、濾過して固体を除き、乾燥するまで減圧下に濃縮した。残渣を１００mLの８：２Ｈ₂Ｏ：ＭｅＯＨに溶解し、この溶液を、２つのＣ１８プラグ（３．５ ×４．５cm、ＥＭセパレーションズLiChroprep RP-18）を通しながら８：２Ｈ₂ Ｏ：ＭｅＯＨで洗浄した。濾液を乾燥するまで濃縮し、４．５ｇの３−カルボキシチロシンを茶色の固体として得た。この物質の一部（１．３０ｇ）を２mLのＨ₂ＳＯ₄を含有する４０mLの１，４−ジオキサンに溶解し、この溶液を、磁気撹拌器を備えた３００mLの圧力容器内の３０mLのイソブチレン（−７８℃で凝縮したもの）に加えた。この容器を密栓し、ＲＴに暖め、撹拌した。４８ｈ後、この容器を氷水浴で０℃に冷却し、開放し、混合物を２０ｇのＮａＨＣＯ₃で処理した。イソブチレンを蒸発させた後、混合物を３００mLの水に懸濁し、ＣＨ₂Ｃｌ₂ （４×１００mL）で抽出した。ＣＨ₂Ｃｌ₂抽出物を合わせ、５％ＮａＨＣＯ₃水溶液（２×５０mL）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、減圧下に濃縮し黄−茶色のオイルを得た。ｔｌｃ（ＳｉＯ２、９７：３ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）による分析で、Ｒｆ＝０．４１の主要成分と、Ｒｆ＝０．３０、０．２５及び０．０の三種類のマイナー成分が示された。粗製の物質を、７５ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（９４：６ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）で精製し、１．２ｇの淡黄色のオイルを得た。このオイルを４０mLのエーテルに溶解し、３．９mLの１ＭＨＣｌエーテル溶液で処理した。沈殿が生成し、これを濾過によって集め、減圧下に乾燥して１．１４ｇ（５３％）のtert−ブチル３−（tert−ブトキシカルボニル）−Ｌ−チロシネート・ＨＣｌをふわふわした白色の固体として得た。分析用のサンプル（２６mg）をＭｅＯＨ−エーテルから再結晶して調製した。ｍ．ｐ．＝２０５℃（dec.）。 ¹H-NMR : 300 MHz，DMSO-d₆)δ10.69(s，1H，OH)，8.39(brs，3H，NH₃ ⁺)，7.57(d ，1H，J=2.2，芳香族CH)，7.43(dd; 1H; J=8.6，2.2; 芳香族CH)，6.96(d，1H， J=8.4，芳香族CH)，4.12(m，1H，メチン)，3.11(dd; 1H; J=14.3，5.3; ArCH₂)，2. 97(dd; 1H，J=14.1，8.1; ArCH₂)，1.57(s，9H，t-Bu)，1.36(s，9H，t-Bu)．例４７：tert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ− tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（tert−ブトキシカルボニル） −Ｌ−チロシネート例９に従って、０．３２３ｇのtert−ブチル３−（tert−ブトキシカルボニル）−Ｌ−チロシネート・ＨＣｌを、０．１７４ｇのＥＤＣ（アルドリッチ）及び０．０９５mLのＮ−メチルモルホリンを用いて、０．２９２ｇのＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸 γ−ｔ−ブチルエステル（シグマ）とカップリングした。粗生成物を、８５ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（７５：２５ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、０．４９ｇ（８９％）の tert −ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ −グルタミン−１−イル−３−（tert−ブトキシカルボニル）−Ｌ−チロシネートを粘着性の白色発泡体として得た。 ¹H-NMR: (300 MHz，DMSO-d₆)δ10.67(s，1H，OH)，8.21(d，1H，J=74，NH)，7.5 6(s，1H，芳香族CH)，7.46-7.26(m，7H，芳香族CH，NH)，6.86(d，1H，J=8.5，芳香族CH)，5.00(m，2H，PhCH₂O)，4.31(m，1H，メチン)，4.06(m，1H，メチン)，2.89 (d，2H，J=6.9，ArCH₂)，2.21(t，2H，J=7.7，glu 4-CH₂)，1.92-1.64(m，2H，g lu 3-CH₂)，1.57(s，9H，t-Bu)，l138(s，9H，t-Bu)，1.33(s，9H，t-Bu)．例４８：tert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル −３−（tert−ブトキシカルボニル）−Ｌ−チロシネート３００mLのパールの容器に０.０７６ｇの１０％Ｐｄ（Ｃ）及び２０mLのＭｅＯＨを窒素フラッシュ下で加えた。これに０．４９ｇのtert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１− イル−３−（tert−ブトキシカルボニル）−Ｌ−チロシネートの５０mL溶液を加えた。この混合物を、７分間窒素をバブリングすることによって脱酸素化し、５０psiで３ｈ水素化した。容器を窒素でパージし、触媒をセライトを通して濾過し、濾液を減圧下に濃縮して濃密なオイルを得た。この物質を７０ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（９８：２ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）で精製し、０．３１ｇ（８２％）のtert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（tert−ブトキシカルボニル）−Ｌ−チロシネートを濃密な透明のオイルとして得た。１Ｈ−ＮＭＲ分析用の対応するＨＣｌ塩の少量サンプルを、５mgの生成物を過剰の１ＮＨＣｌエーテル溶液で処理し、乾燥するまで濃縮することによって調製した。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ10.68(s，1H，OH)，8.99(d，1H，J=7.1，NH)，8. 33(br s，3H，NH₃ ⁺)，7.60(d，1H; J=2.0，芳香族CH)，7.47(dd; 1H; J=8.6，2. 2; 芳香族CH)，6.92(d，1H，J=8.4，芳香族CH)，4.38(m，1H，メチン)，3.87(m，1H ，メチン)，2.92(d，2H，J=7.1，ArCH₂)，2.34(m，2H，glu 4-CH₂)，2.00(m，2H，g lu 3-CH₂)，1.59(5，9H，t-Bu)，1.41(s，9H，t-Bu)，1.35(s，9H，t-Bu)．例４９：tert−ブチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（tert−ブトキシカルボニル）−Ｌ−チロシネート窒素導入管と磁気撹拌器を備えた乾燥した１００mL三口フラスコに、２５mLの無水ＤＭＦ、０．２６mLのＤＥＣＰ（アルドリッチ）及び０．２８mLのＥｔ₃Ｎを充填した。この溶液に、０．２１７ｇの４−（Ｎ−（２，４−ジアミノ−６− プテリジニルメチル）−Ｎ−メチルアミノ）安息香酸半塩酸塩二水和物（アルドリッチ）を加えた。この固体の出発物質は徐々に溶解し、淡黄色の溶液となった。Ｎ₂下で３ｈ撹拌した後、この溶液を０．２９ｇのtert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１− イル−３−（tert−ブトキシカルボニル）−Ｌ−チロシネートの５mLＤＭＦ溶液で処理した。この溶液を、ＲＴで１８ｈ撹拌し、次いで乾燥するまで濃縮した。残渣を８５mLのＣＨＣｌ₃に溶解した。得られた溶液を１％ＮＨ₄ＯＨ（３×６０ mL）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、濃密な黄−橙色のオイルを得た。この物質を１５０ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（７：７：１ＣＨ₂Ｃｌ₂：アセトン：ＭｅＯＨ）で精製し、０．２４５ｇ（５２％）のtert−ブチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３ −（tert−ブトキシカルボニル）−Ｌ−チロシネートを淡黄色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１４０〜１４３℃。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ10.64(s，1H，0H)，8.57(s，1H，プテリジニル7-CH)，8 .15(d，1H，J=7.4，アミドNH)，7.99(d，1H，J=7.9，アミドNH)，7.71(d，2H，J=8.8，芳香族CH)，7.67(br s，1H，NH₂)，7.53(d，1H，J=2.0，芳香族CH)，7.43(br s ，1H，NH₂)，7.37(dd; 1H; J=8.6，2.1; 芳香族CH)，6.81(m，3H，芳香族CH)，6 .59(br s，2H，NH₂)，4.79(s，2H，プテリジニル-CH₂)，4.43(m 1H，メチン)，4.32(m，1 H，メチン)，3.21(s，3H，N-CH₃)，2.90(d，2H，J=7.1，ArCH₂)，2.24(t，2H，J=7. 9，glu4-CH₂)，2.03-1.78(m，2H，glu3-CH₂)，1.54(5，9H，t-Bu)， 1.36(s，9H，t-Bu)，1.30(s，9H，t-Bu)．例５０：Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−カルボキシ−Ｌ −チロシン磁気撹拌器及び窒素導入管を備えた１００mL三口フラスコに、０．２０ｇのte rt−ブチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（tert−ブトキシカルボニル）−Ｌ−チロシネート及び２０mLのＣＨ₃ ＮＯ₂を充填した。黄色の溶液をＲＴで撹拌し、ＨＣｌガスを１０分間バブリングすることによって酸性にした。ＨＣｌ処理の時に、色が黄色からオレンジ、より淡い黄色に変化し、固体が沈殿し始めた。この混合物をＮ₂下、ＲＴで１．５ｈ撹拌し、次いで乾燥するまで減圧下に濃縮した。得られた黄色の固体を１５mL の水に懸濁し、十分な１ＮＮａＯＨ水溶液で処理し、完全溶液を得た。この溶液を濾過し、１ＮＨＣｌ水溶液を加えて中和した。黄色の沈殿が生じ、これを遠心で分離し、水性懸濁−遠心−デカンテーションのサイクルで４回洗浄し、凍結乾燥し、１４０mg（８８％）のＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３− カルボキシ−Ｌ−チロシンを黄−橙色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１９５℃（ dec.）。HPLC : two peaks on C18; k'=3.16(98％)，k'=6.0 (2％); 80:20.0.1 H2O:MeCN:TFA:flow rate=１mL/min． ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ13.15-11.80(br s，COOH)，8.62(s，1H，プテリジニル７-CH)，8.19(br s，1H，NH₂)，8.00(m，3H，アミドNH(2)，NH₂)，7.72(d，2H，J=8 .7，芳香族CH)，7.61(d，1H，J=2.1，芳香族CH)，7.22(m，3H，NH₂(2)，芳香族C H)，6.81(d，2H，J=8.7，芳香族CH)，6.66(d，1H，J=7.8，芳香族CH)，4.81(s， 2H，プテリジニル-CH₂)，3.39(m，2H，メチン)，3.21(s，3H，N-CH₃)，2.94(m，1H，ArCH₂ )，2.86(m，1H，ArCH₂)，2.27(t，2H，J=7.9，glu 4-CH₂)，2.05-1.72(m，2H，g lu3-CH₂)．元素分析 : Calcd．for C₃₀H₃₁N₉O₉・1.8H₂O(MW 694.06): C，51.92; H，5.02; N ，18.16．Found: C，S 1.84; H，5.02; N，18.19．質量スペクトル : (イオンスプレー)662(M+H)⁺，385，306，2357 157．ＵＶスペクトル : (pH7 バッファー)λ_max（ε）258.6(19900)，306.3(23500)，372.6( 5490)．^lmin(e)245.4(14800)，272.8(12600)，347.0(4040)．例５１：（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−ベンジル３−（３−ヨードベンジル）− ２−オキソ−２，３−ジフェニル−４−モルホリンカルボキシレート磁気撹拌器及び窒素導入管を備えた乾燥した５００mLの三口フラスコに、３．０ｇのベンジル（２Ｒ，３Ｓ）−６−オキソ−２，３−ジフェニル−４−モルホリンカルボキシレート（アルドリッチ）及び１８０mLの無水ＴＨＦを充填した。この混合物を穏やかに暖め、固体の出発物質を溶解した後、この溶液を−７８℃に冷却し、８．１３mLの１Ｍナトリウムビス（トリメチルシリル）アミドのＴＨＦ溶液（アルドリッチ）をラバーセプタムを通したシリンジを介してゆっくり加えることにより処理した。この溶液をＮ２下、−７８℃で４０分撹拌し、次いで２．４１ｇの臭化３−ヨードベンジル（ランカスター、Windham，NH 03087 ）の５mL無水ＴＨＦ溶液で処理した。反応混合物を−７８℃で２．５ｈ撹拌し、１００mLの水と混合し、得られた混合物を乾燥するまで減圧下に濃縮した。残渣を１００mLのＥｔＯＡｃに溶解し、水（３×１００mL）で洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、乾燥するまで減圧下に濃縮して褐色の固体を得た。ｔｌｃ（ＳｉＯ２、８：２ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）による分析でＲｆ＝０．３５の出発物質が残っていないこと、Ｒｆ＝０．５０の新たな主要成分、及びＲｆ＝０．８０の未反応の臭化３−ヨードベンジルが示された。粗生成物を１５０ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（８：２ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、２．８ｇ（６０％）の（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−ベンジル３−（３−ヨードベンジル）−２−オキソ−２，３−ジフェニル−４−モルホリンカルボキシレートを白色の結晶性固体として得た。ｍ．ｐ．＝１６７〜１６８℃ 例５２：（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−ベンジル３−（３−メトキシカルボニル）−２−オキソ−２，３−ジフェニル−４−モルホリンカルボキシレート磁気撹拌器、還流冷却器、及び温度計を備えた１００mL三口フラスコに、２．５６ｇの（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−ベンジル３−（３−ヨードベンジル）−２− オキソ−２，３−ジフェニル−４−モルホリンカルボキシレート及び５０mLの１：１ＴＨＦ：ＭｅＯＨを充填した。この混合物を、１０分間Ｎ₂をバブリングすることによって脱酸素化し、１．０mLのＥｔ₃Ｎ、次いで０．２４ｇのＰｄ（Ｐｈ₃Ｐ）₄（アルドリッチ）で処理した。この混合物をＣＯで飽和し、撹拌しながら加熱還流（６５℃）した。鉱油のバブラーを備えたＣＯガス導入アダプターをコンデンサーに連結することによってＣＯのわずかな加圧を維持した。還流温度で４ｈ後、ｔｌc（ＳｉＯ₂、８：２ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）でＲｆ＝０．５０の出発物質がないこと、及びＲｆ＝０．３０の新たな成分が示された。反応混合物をＲＴに冷却し、この時点で容積の大きい白色結晶が沈殿した。この懸濁液を１００mLのＣＨ₂Ｃｌ₂と混合し、得られた溶液をシリカゲルプラグ（２．５× ３cm）を通して濾過し、減圧下に濃縮し、淡黄色の固体を得た。この物質を１５０ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（８：２ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、２．０ｇ（８８％）の（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−ベンジル３− （３−メトキシカルボニル）−２−オキソ−５，６−ジフェニル−４−モルホリンカルボキシレートを灰色がかった白色の結晶性固体として得た。ｍ．ｐ．＝１８０〜１８２℃。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ8.05-7.80(m，2H，芳香族CH)，7.72-6.97(m，14H ，芳香族CH)，6.73(m，1H芳香族 CH)，6.58(m，2H，芳香族CH)，6.25，6.16(d，J=2.2: d，J=2.6; トータル1H; カルバメートコンホーマーによるモルホリン２−Ｈの２種類の共鳴)，5.36，5.31(d ，J=2.6; d,J=2.6; トータル1H; カルバメートコンホーマーによるモルホリン３−Ｈの２種類の共鳴)，5.16-4.88(m，3H，モルホリン5-H，PhCH₂O)，3.88，3.85(5，5，トータル 3H，CO₂CH₃，コンホーマー)，3.71-3.40(m，2H，ArCH₂)．例５３：メトキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン５００mLのパールの容器に、２．０ｇの（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−ベンジル３ −（３−メトキシカルボニル）−２−オキソ−５，６−ジフェニル−４−モルホリンカルボキシレート、０．４６ｇのＰｄＣｌ₂（アルドリッチ）及び６０mLの１：１ＴＨＦ：ＭｅＯＨを加えた。この混合物を、１０分間Ｎ₂をバブリングすることによって脱酸素化し、次いで４５psiで１８時間水素化した。容器をＮ₂ でパージし、混合物を濾過して触媒を除いた。濾液を減圧下に５mLまで濃縮し、５０mLのエーテルを加えて粉末化した。白色の固体が沈殿し、これを真空濾過によって集め、３０mLのエーテルで洗浄し、減圧下に乾燥して、０．８８ｇ（９１％）の３−メトキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン・ＨＣｌを得た。ｍ．ｐ．＞２００℃ ¹H-MNR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ8.50(br s，3H，NH₃ ⁺)，7.89(m，2H，芳香族CH) ，7.67-7.43(m，2H，芳香族CH)，4.21(m，1H，メチン)，3.87(s，3H，CO₂CH₃)，3.2 2(d，2H，J=6.5，ArCH₂)．例５４：tert−ブチル３−メトキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニネート０．８８ｇの３−メトキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン・ＨＣｌ、及び１．５mLの濃Ｈ₂ＳＯ₄の２０mL１，４−ジオキサン溶液を、磁気撹拌器を備えた３００mLの圧力容器内の２０mLの液体イソブチレン（−７８℃で凝縮したもの）に加えた。この容器を密封し、混合物を撹拌しながらＲＴまで暖めた。ＲＴで１８ｈ撹拌した後、初めには不均一な混合物がわずかに曇った溶液になった。４８ｈ後、容器を氷水浴で冷却し、開放し、内容物を１３ｇの固体ＮａＨＣＯ₃で処理した。イソブチレンを蒸発させ、残った混合物を乾燥するまで減圧下に濃縮した。残渣を１００mlの水に懸濁し、ＥｔＯＡｃ（４×４０mL）で抽出した。ＥｔＯＡｃ抽出物を５％ＮａＨＣＯ₃水溶液（３×５０mL）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄ で乾燥し、減圧下に濃縮してオイルを得た。この物質を３０mLのエーテルに溶解し、３．４mLの１ＭＨＣｌエーテル溶液で処理した。白色の固体が沈殿し、これを濾過して集め、減圧下に乾燥して０．７９ｇ（７４％）のtert−ブチル３− メトキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニネート・ＨＣｌを得た。ｍ．ｐ．＝１６５℃（dec.）。例５５：tert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ− tert−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−メトキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニネート例９に従って、０．７９ｇのtert−ブチル３−メトキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニネート・ＨＣｌを、０５０ｇのＥＤＣ（アルドリッチ）及び０．２７mLのＮ−メチルモルホリンを用いて、０．８４ｇのＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸 γ−tert−ブチルエステル（シグマ）とカップリングした。粗生成物を、８５ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（７０：３０ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、１．３８ｇ（９３％）のtert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−tert−Ｌ−グルタミン− １−イル−３−メトキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニネートを透明なガラス状物として得た。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ8.26(d，1H，J=7.5，NH)，7.80(m，2H，NH，芳香族CH)，7.43(d，1H，J=7.7，芳香族CH)，7.44-7.23(m，7H，芳香族CH)，4.99(m ，2H，PhCH₂O)，4.38(m，1H，メチン)，4.01(m，1H，メチン)，3.83(s，3H，CO₂CH₃)， 3.02(m，2H，ArCH₂)，2.19(t，2H，J=7.7，glu 4-CH₂)，1.90-1.61(m，2H，glu 3-CH₂)，1.38(s，9H，t-Bu)，1.32(s，9H，t-Bu)．例５６：tert−ブチル５−Ｏ−tert−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−メトキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニネート例４８に従って、１．３８ｇのtert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−tert−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−メトキシカルボニル −Ｌ−フェニルアラニネートを、０．２３ｇの１０％Ｐｄ（Ｃ）を用いて６０mL のメタノール中で水素化した。これにより１．０ｇ（９４％）のtert−ブチル５−Ｏ−tert−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−メトキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニネートを濃密な透明のオイルとして得た。この生成物を更に生成することなく次のステップに移行した。¹Ｈ−ＮＭＲ分析のための対応するＨＣｌ塩のサンプルを、過剰の１ＭＨＣｌエーテル溶液で７mgの生成物を処理し、乾燥するまで濃縮することによって調製した。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ9.12(d，1H，J=7.6，NH)，8.39(br s，3H，NH₃ ⁺) ，7.82(m，2H，芳香族CH)，7.60(d，1H，J=7.5，芳香族CH)，7.46(t，1H，J=69 ，芳香族CH)，4.40(m，1H，メチン)，3.85(m，1H，メチン)，3.83(s，3H，CO₂CH₃)，3. 05(d，2H，J=8.4，ArCH₂)，2.33(t，2H，J=7.7，glu 4-CH2)，1.97(m，2H，glu 3-CH₂)，1.37(s，9H，t-Bu)，1.31(s，9H，t-Bu)．例５７：tert−ブチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（メトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニネート例４９に従って、０．２００ｇの４−（Ｎ−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニルメチル）−Ｎ−メチルアミノ）安息香酸半塩酸塩二水和物（アルドリッチ）を、０．２４mLのＤＥＣＰ（アルドリッチ）及び０．２６mLのＥｔ₃Ｎを用いて２０mLのＤＭＦ中で０.２４５ｇのtert−ブチル５−Ｏ−tert−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−メトキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニネートとカップリングした。粗生成物を１３０ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（１２：１２：１ＣＨ₂Ｃｌ₂：アセトン：ＭｅＯＨ）で精製し、０．２９７ｇ（７３％）のtert−ブチルＮ−（４− （（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（メトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニネートを黄色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１３０℃（dec.）。例５８：Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−カルボキシ−Ｌ −フェニルアラニン例５０に従って、０．１５ｇのtert−ブチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−tert −ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（メトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニネートを２０mLのＣＨ₃ＮＯ₂中でＨＣｌガスで処理した。ＲＴで１ｈ混合物を撹拌した後、混合物を乾燥するまで減圧下に濃縮し、黄−橙色の固体を得た。¹Ｈ−ＮＭＲによるこの物質の分析で、出発物質のtert−ブチル基が完全に消失していることが示された。ＨＰＬＣ（Ｃ１８、７５：２５：０．１Ｈ₂ Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ）でｋ’＝３．５０の単一の成分が示された。このちゅかんたいめちるエステルを２５mLの１：１ＴＨＦ：Ｈ₂Ｏに溶解し、４９mgのＬｉＯＨ・Ｈ₂Ｏ（Baker）で処理し、この溶液をＮ２下、ＲＴで１８ｈ撹拌した。ＨＰＬＣ分析でＫ’＝３．５０の物質が残っていないこと、及びｋ’＝１．５８の新たな単一の成分が示された。この溶液を、１ＮＨＣｌ水溶液を加えて中和した。黄色のスラリーが生じ、これを２mLまで減圧下に濃縮し、２０mlの水で希釈した。沈殿を遠心によって分離し、水性懸濁−遠心−デカンテーションのサイクルで４回洗浄し、凍結乾燥し、０．１０９ｇ（８４％）のＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ− グルタミン−１−イル−３−カルボキシ−Ｌ−フェニルアラニンを黄橙色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１９５℃（dec.）。HPLC : C18で１つのピークであった。k'=1.93，78:22:0.1H₂O:MeCN:TFA，flow ra te=１mL/min． ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ13.00-12.10(br s，COOH)，8.58(s，1H，プテリジニル7 -CH)，8.08(d，1H，J=7.8，アミドNH)，7.98(d，1H，J=8.0，アミドNH)，7.80(s，1H，芳香族CH)，7.79-7.60(m，4H，NH₂(1)，芳香族CH)，7.49(br s，1H，NH₂)，7.44 (d，1H，J=7.7，芳香族CH)，7.30(t，1H，J=7.6，芳香族CH)，6.81(d，2H，J=9. 0，芳香族CH)，6.63(br s，2H，NH₂)，4.79(s，2H，プテリジニル-CH₂)，4.41(m，2H，メチン )，3.20(s，3H，N-CH₃)，3.10(m，1H，ArCH₂)，2.97(m，1H，ArCH₂)，2.23(t ，2H，J=7.8，glu 4-CH₂)，2.00-1.73(m，2H，glu 3-CH₂)．元素分析 : Calcd．for C₃₀H₃₁N₉O₈・1.5H₂O(MW 672.65)C，53.57; H，509; N，18 .74．Found: C，53.58; H，5.11; N，18.72．質量スペクトル : (イオンスプレー)646(M+H)⁺，437，340，308，175．ＵＶスペクトル : (pH7 バッファー)λ_max（ε）258.7(24300)，307.5(25000)，372.7( 7880)．λ_min（ε）244.0(17900)，272.7(16900)，346.2(6440)．例５９：tert−ブチルＮ−（４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル− １−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾイル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（メトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニネート磁気撹拌器及び窒素導入管を備えた１００mL三口フラスコに、０．１５０ｇの４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン −９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロ安息香酸、０．２２１ｇのtert− ブチル５−Ｏ−tert−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−メトキシカルボニル− Ｌ−フェニルアラニネート、６５mgの３−ヒドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン（アルドリッチ）、及び２４mLの無水ＤＭＦを充填した。得られた淡黄色の溶液を８４mgのＥＤＣ（アルドリッチ）で処理し、Ｎ２下、ＲＴで４８ｈ撹拌した。ＤＭＦを減圧下に除去し、残渣を、１５０ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（９８：１→９６：４ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）で精製し、０．２５５ｇ（７８％）のtert−ブチルＮ−（４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２ −フルオロベンゾイル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル− ３−（メトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニネートを白色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１５５〜１５７℃。例６０：Ｎ−（４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾイル） −グルタミン−１−イル−３−カルボキシ−Ｌ−フェニルアラニン例５０に従って、０．２１９ｇのtert−ブチルＮ−（４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾイル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン −１−イル−３−（メトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニネートを２０mL のＣＨ₃ＮＯ₂中でＨＣｌガスで処理した。ＣＨ₃ＮＯ₂を減圧下に除去した後、残渣を２０mLの１：１ＴＨＦ：Ｈ₂Ｏ中において６６mgのＬｉＯＨ・Ｈ₂Ｏ（Bake r）で１８ｈケン化した。この溶液を１ＮＨＣｌを加えることによってｐＨ＝２．５に酸性化し、生じた沈殿を常法に従って単離し、凍結乾燥して０．１６２ｇ（８４％）のＮ−（４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾイル） −グルタミン−１−イル−３−カルボキシ−Ｌ−フェニルアラニンを白色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１８７℃（dec.）。HPLC : C18で１つのピークであった。k'=4.29，75:25:0.1H₂O:MeCN:TFA、流速=１ mL/min ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ13.00-12.25(br m，COOH，ベンゾキナゾリンNH)，9.83(s ，1H，芳香族CH)，8.32(d，1H，J=7.4，アミドNH)，8.22(d，1H，J=9.0，芳香族CH) ，8.00(d，1H，J=8.5，芳香族CH)，7.81(s，1H，芳香族CH)，7.75(d，1H，J=8.0 ，芳香族CH)，7.60(m，2H，芳香族CH)，7.49(m，3H，芳香族CH，4-アミノベンゾイル NH) ，7.35(m，2H 芳香族CH，アミドNH)，6.52(d，1H，J=8.8，芳香族CH)，6.39(d，1H ，J=15.2，芳香族CH)，4.57(br s，2H，ベンゾキナゾリン9-CH₂)，4.45(m，2H，メチン)，3. 12(m，1H，ArCH₂)，2.96(m，1H，ArCH₂)，2.42(s，3H，CH₃)，2.19(m，2H，glu 4-CH₂)，2.01-1.70(m，2H，glu3-CH₂)．元素分析 : Calcd．for C₃₆H₃₂N₅O₉F・1.7H₂O(MW 728.30): C，59.37; H，4.90; N ，9.62．Found: C，59.45; H，4.93; N，9.42．質量スペクトル: (イオンスプレー)698(M+H)⁺．ＵＶスペクトル: (pH7 バッファー)λ_max（ε）265.3(45500)，296.5(26100)，348.0( 5530)．λ_min（ε）244.4(22600)，287.0(25500)，340.1(3540)．例６１：２−シクロペンチルベンジルアルコール３００mLのパールの容器に、１０．０ｇの２−ヨードベンジルアルコール（アルドリッチ）、８０mLのトルエン、３０mLのシクロペンテン（アルドリッチ）、２．６０ｇのトリ−オルト−トリルホスフィン（アルドリッチ）、及び６．６mL のＥｔ₃Ｎを充填した。この混合物を、１０分間Ｎ₂でバブリングすることによって脱酸素化し、次いで０．９６ｇのＰｄ（ＯＡｃ）₂（アルドリッチ）で処理した。容器をＮ２でフラッシュし、密栓し、１００℃で１８ｈ加熱した。容器をＲＴに冷却し、Ｎ₂でパージし、開放した。暗赤色の反応溶液を減圧下に濃縮し、赤茶色のシロップを得た。この物質を２００mLのＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解し、水（４× １００mL）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、減圧下に濃縮して茶色のオイルを得た。ｔｌｃ（ＳｉＯ₂、８：２ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）による分析で、Ｒｆ＝０．４５及び０．５０の２つの新たな成分、Ｒｆ＝０．９０のトリ−ｏ−トリルホスフィン、及びＲｆ＝０．６０、０．７０、０．８５及び０．０の４種のマイナーな成分が示された。粗生成物を２００ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（９：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）（二回）で精製し、６．１ｇ（８２％）の、Ｒｆ＝０．４５及び０．５０の混合物を得た。この物質は、¹Ｈ −ＮＭＲで二重結合の異性体の混合物であると決定した。次に、この生成物（６．０ｇ）を、０．６０ｇの５％Ｐｔ（Ｃ）（アルドリッチ）の存在下、４０mLのＭｅＯＨ中において４０psiで４ｈ水素化した。触媒をセライトを通して濾過により除き、濾液を減圧下に濃縮し、５．４７ｇ（２−ヨードベンジルアルコールから７４％）の２−シクロペンチルベンジルアルコールを淡黄−茶色液体として得た。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ7.40-7.07(m，4H，芳香族CH)，5.06(t，1H，J=5. 4，OH)，4.58(d，2H，J=5.4，ArCH₂O)， 3.24(m，1H，シクロペンチルメチン)，1.97(m，2H，シクロペンチル CH₂)，1.89-1.42(m，6H，シクロペンチル CH₂)．例６２：２−シクロペンチルベンジルブロマイド例１７に従って、５．４７ｇの２−シクロペンチルベンジルアルコールを、２５mLの無水ＣＨ₂Ｃｌ₂中で１．０３mLのＰＢｒ₃と処理し、６．９ｇ（９３％）の２−シクロペンチルベンジルブロマイドを透明な液体として得た。 ¹H-MNR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ7.40-7.24(m，3H，芳香族CH)，7.14(m，1H，芳香族CH)，4.78(s，2H，ArCH₂Br)，3.31(m，1H，シクロペンチルメチン)，2.05(m，2H，シクロペンチル CH₂)，1.88-1.47(m，6H，シクロペンチル CH₂)．例６３：（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−ベンジル３−（３−シクロペンチルベンジル）−２−オキソ−２，３−ジフェニル−４−モルホリンカルボキシレート例５１に従って、１．４７ｇのベンジル（２Ｒ，３Ｓ）−６−オキソ−２，３ −ジフェニル−４−モルホリンカルボキシレート（アルドリッチ）を、３．９９ mLの１Ｍナトリウムビス（トリメチルシリル）アミンのＴＨＦ溶液（アルドリッチ）を用いて２−シクロペンチルベンジルブロマイドでアルキル化した。粗生成物を、１２５ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（８：２ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、１．０７ｇ（５２％）の（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−ベンジル３−（３−シクロペンチルベンジル）−２−オキソ −２，３−ジフェニル−４−モルホリンカルボキシレートを白色の固体として得た。ｍ．ｐ．＝１６１〜１６３℃ 例６４：２−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニン例５３に従って、１．０ｇの（２Ｒ，３Ｓ．５Ｓ）−ベンジル３−（３−シクロペンチルベンジル）−２−オキソ−５，６−ジフェニル−４−モルホリンカルボキシレートを、０．２３ｇのＰｄＣｌ₂を用いて４０mLの１：１ＴＨＦ：ＭｅＯＨ中で水素化し、０．３７３ｇ（７６％）の２−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニン・ＨＣｌを灰色がかった白色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１７５℃（dec.）。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ8.49(br s，3H，NH₃ ⁺)，7.38-7.07(m，4H，芳香族CH)，3.92(m，1H，メチン)，3.18(m，シクロペンチルメチン)，1.98(m，2H，シクロペンチル CH₂) ，1.90-1.41(m，6H，シクロペンチル CH₂)．例６５：tert−ブチル２−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネート例５４に従って、０．２３ｇの２−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニン・ＨＣｌを、０．１３mLの濃Ｈ₂ＳＯ₄の存在下、２０mLの１，４−ジオキサン中で２５mLのイソブチレンで処理した。後処理をし、透明な溶液を得、これを２０mL のエーテルに溶解した。この溶液を、１mLの１ＭＨＣｌエーテル溶液で処理し、乾燥するまで減圧下に濃縮して０．２８ｇ（１００％）のtert−ブチル２−シクロペンチル− Ｌ−フェニルアラニネート・ＨＣｌを淡黄色のガラス状物として得た。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ8.59(br s，3H，NH₃ ⁺)，7.28(m，2H，芳香族CH) ，7.10(m，2H，芳香族CH)，3.91(m，1H，メチン)，3.30(m，1H，ArCH₂)，3.18(m，1 H，シクロペンチルメチン)，2.99(dd; 1H; J=10.1，12.4; ArCH₂)，1.98(m，2H，シクロペンチル CH₂)，1.89-1 46(m，6H，シクロペンチル CH₂)，1.19(s，9H，t-Bu)．例６６：tert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ− tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネート例９に従って、０．２５ｇのtert−ブチル２−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネート・ＨＣｌを、０．１６ｇのＥＤＣ（アルドリッチ）及び０．０８４mLのＮ−メチルモルホリンを用いてＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸 γ−tert−ブチルエステル（シグマ）とカップリングした。粗生成物を８５ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（８：２ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、０．３５５ｇ（７６％）のtert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル− ２−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネートを白色固体としてえた。ｍ．ｐ．＝９５〜９６℃。例６７：tert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル −２−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネート例４８に従って、０．３５５ｇのtert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネートを、６０mgの１０％Ｐｄ（Ｃ）を用いて４５ mLのＭｅＯＨ中で水素化した。これにより０．２３６ｇ（８５％）のtert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−シクロペンチル− Ｌ−フェニルアラニネートを濃密な透明のオイルとして得た。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ8.23(m，1H，NH)，7.34-7.00(m，4H，芳香族CH) ，4.37(m，1H，メチン)，3.36-2.85(m，5H，ArCH₂，シクロペンチルメチン，NH₂)，2.27-1.92 (m，4H，glu 4-CH₂，glu 3-CH₂)，1.90-1.46(m，8H，シクロペンチル CH₂)，1.39(s，9H ，t-Bu)，1.32(s，9H，t-Bu)．例６８：tert−ブチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネート例４９に従って、０．１８９ｇの４−（Ｎ−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニルメチル）−Ｎ−メチルアミノ）安息香酸半塩酸塩二水和物（アルドリッチ）を、０．２３mLのＤＥＣＰ（アルドリッチ）及び０．２４mLのＥｔ３Ｎを用いて２０mLのＤＭＦ中において０．２３６ｇのtert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル −Ｌ−グルタミン−１−イル−２−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネートとカップリングした。粗生成物を、８５ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（１２：１２：１ＣＨ₂Ｃｌ₂：アセトン：ＭｅＯＨ）で精製し、０．１９５ｇ（５０％）のtert−ブチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネートをを黄色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１３０〜１４０℃。例６９：Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−シクロペンチル −Ｌ−フェニルアラニン例５０に従って、０．１６７ｇのtert−ブチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−te rt−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネートを１５mLのＣＨ₃ＮＯ₂中でＨＣｌガスで１ｈ処理した。反応混合物を乾燥するまで濃縮し、黄色の固体を得た。この物質を、エーテルに懸濁し、真空濾過によって集め、減圧下に乾燥して０．１５ｇ（９１％）のＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）− Ｌ−グルタミン−１−イル−２−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニンを淡黄色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１５５℃（dec.）．HPLC : C18で１つのピークであった。k'=3.25，65:35:0.1H₂O:MeCN:TFA、流速=１ mL/min． ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ13.25-12.95(br s，COOH)，9.31(s，1H，NH₂)，9 .09(s，1H，NH₂)，8.80-8.58(br s，1N，NH₂)，8.72(s，1H，プテリジニル7-CH)，8.24 (d，1H，Ｊ=8.0，アミドNH)，8.01 (d，1H，J=8.0，アミドNH)，7.74(m，3H，NH₂(1) ，芳香族CH)，7.22(d，1H，J=8.1，芳香族CH)，7.12(m，2H，芳香族CH)，6.93(t ，1H，J=7.4，芳香族CH)，6.82(d，2H，J=9.0，芳香族CH)，4.88(s，2H，プテリジニル -CH₂)，4.45(m，1H，メチン)，4.34(m，1H，メチン)，3.26-3.10(m，2H，ArCH₂，シクロペンチルメチン)，2.88(m，1H，ArCH₂)，2.23(t，2H，J=7.6，glu4-CH₂)，2.06-1.40(m， 10H，glu 3-CH2，シクロペンチル CH₂)．元素分析 : Calcd．for C₃₄H₃₉N₉O₆・1.7 HCl・2.2H₂O(MW 771.36): C，52.94; H， 5.89; N，16.34; Cl，7.81．Found: C，52.57; H 5.74; N，16.13; Cl，7.52．質量スペクトル : (イオンスプレー)670(M+H)⁺，613，459，391，309，275．ＵＶスペクトル : (pH7 バッファー)λ_max（ε）259.5(24000)，308.5(24000)，373.0( 7450)．λ_min（ε）241.0(14400)，274.2(16200)，346.5(5840) 例７０：３−シクロペンチルベンジルアルコール例６１に従って、１０．０ｇの３−ヨードベンジルアルコール（アルドリッチ）を、０．９６ｇのＰｄ（ＯＡｃ）２、２．６０ｇのトリ−オルト−トリルホスフィン、及び６．６mLのＥｔ₃Ｎを用いて３０mLのシクロペンテンと処理した。得られたオレフィン混合物を０．６２ｇの５％Ｐｔ（Ｃ）を用いてＭｅＯＨ中で２．５ｈ水素化し、５．７７ｇ（７６％）の３−シクロペンチルベンジルアルコールを淡黄色の液体として得た。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ7.32-7.17(m，2H，芳香族CH)，7.15(m，2H，芳香族CHO，5.14(t，1H J=5.5，OH)，4.48(d，2H，J=5.6，ArCH₂O)，2.96(m，1H，シクロペンチルメチン)，2.01(m，2H，シクロペンチル CH₂)，1.88-1.42(m，6H，シクロペンチル CH₂)．例７１：３−シクロペンチルベンジルブロマイド例１７に従って、５．７７ｇの３−シクロペンチルベンジルアルコールを、２５mLの無水ＣＨ₂Ｃｌ₂中で１．０９mLのＰＢｒ₃で処理し、７．８５ｇ（１００％）の３−シクロペンチルベンジルブロマイドを淡黄色のオイルとして得た。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ7.37-7.14(m，4H，芳香族CH)，4.68(s，2H，ArCH₂ Br)，2.96(m，1H，シクロペンチルメチン)，2.00(m，2H，シクロペンチル CH₂)，1.84-1.42(m，6 H，シクロペンチルCH₂)．例７２：（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−ベンジル３−（３−シクロペンチルベンジル）−２−オキソ−２，３−ジフェニル−４−モルホリンカルボキシレート窒素導入管及び磁気撹拌器を備えた乾燥した５００mLの三口フラスコに、１．４７ｇのベンジル（２Ｒ，３Ｓ）−６−オキソ−２，３ −ジフェニル−４−モルホリンカルボキシレート（アルドリッチ）、１．００ｇの３−シクロペンチルベンジルブロマイド、及び８０mLの無水ＴＨＦを充填した。この混合物を撹拌しながら穏やかに加熱し、固体の出発物質を溶解し、得られた溶液を−７８℃に冷却した。この溶液をシリンジによりラバーセプタムを通してゆっくり加えることによって、４．０mLの１Ｍナトリウムビス（トリメチルシリル）アミドのＴＨＦ溶液で処理した。−７８℃で４ｈ撹拌した後、溶液を８０ mLの水と混合し、例５１に従って後処理した。粗生成物を、８５ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（８５：１５ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、１．４４ｇ（７０％）の（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−ベンジル３−（３−シクロペンチルベンジル）−２−オキソ−２，３−ジフェニル−４−モルホリンカルボキシレートを白色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝８２〜８４℃。例７３：３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニン例５３に従って、１．３７ｇの（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−ベンジル３−（３− シクロペンチルベンジル）−２−オキソ−２，３−ジフェニル−４−モルホリンカルボキシレートを、０．３１ｇのＰｄＣｌ₂を用いて８０mLの１：１ＴＨＦ：ＭｅＯＨ中で水素化し、０．６３ｇ（９３％）の３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニン・ＨＣｌを白色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＞２００℃。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ8.39(br s，3H，NH₃ ⁺)，7.31-7.12(m，3H，芳香族CH)，7.08(d，1H，J=7.3，芳香族CH)，4.17(m，1H，メチン)，3.11(d，H，J=6.1 ，ArCH₂)，2.96(m，1H，シクロペンチルメチン)，1.99(m，2H，シクロペンチル CH₂)，1.88-1.45( m，6H，シクロペンチル CH₂)．例７４：tert−ブチル３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネート例５４に従って、０．５０ｇの３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニン・ＨＣｌを、０．３mLの濃Ｈ₂ＳＯ₄の存在下、２０mLの１，４−ジオキサン中で２５mLのイソブチレンで処理した。後処理し、次いで遊離のアミンをＨＣｌエーテル溶液で酸性化し、０．４９ｇ（８２％）のtert−ブチル３−シクロペンチル −Ｌ−フェニルアラニネート・ＨＣｌを白色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１５４〜１５６℃。例７５：tert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ− tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネート例９に従って、０．４９ｇのtert−ブチル３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネート・ＨＣｌを、０．３０ｇのＥＤＣ（アルドリッチ）及び０．１６ mLのＮ−メチルモルホリンを用いて０．５１ｇのＮ−Ｃｂｚ−Ｌ−グルタミン酸 γ−tert−ブチルエステル（シグマ）とカップリングした。粗生成物を、８０ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（８：２ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、０．７５ｇ（８２％）のte rt−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−tert−ブチル− Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネートを濃密な透明のオイルとして得た。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ8.22(d，1H，J=7.3，NH)，7.33(m，6H，芳香族CH )，7.20-6.97(m，3H，芳香族CH，NH)，5.01(m，2H，PhCH₂O)，4.33(m，1H，メチン) ，4.05(m，1H，メチン)，2.91(m，3H，ArCH₂，シクロペンチルメチン)，2.20(t，2H，J=7.7， glu4-CH₂)，1.97(m，2H，glu 3-CH₂)，1.88-1.43(m，8H，シクロペンチル CH₂)，1.38(s ，9H，t-Bu)，1.31(s，9H，t-Bu)．例７６：tert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル −３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネート例４８に従って、０．７５ｇのtert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネートを、６０mLのＭｅＯＨ中で０．１２ｇの１０％Ｐｄ（Ｃ）を用いて水素化した。これにより０．５８ｇ（９９％）のtert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル− Ｌ−フェニルアラニネートを透明なオイルとして得た。¹Ｈ−ＮＭＲ分析用の対応するＨＣｌ塩のサンプルを、過剰の１ＮＨＣｌエーテル溶液で１０mgの生成物を処理し、乾燥するまで減圧下に濃縮して調製した。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ8.99(d，1H，J=7.0，NH)．8.32(br s，3H，NH₃ ⁺) ，7.24-7.01(m，4H，芳香族CH)，4.38(m，1H，メチン)，3.85(m，1H，メチン)，2.93(m ，3H，ArCH₂，シクロペンチルメチン)，2.34(t，2H，J=7.7，glu4-CH₂)，1.96(m，4H，glu 3-CH₂，シクロペンチル CH₂)，1.82-1.44(m，6H，シクロペンチル CH₂)，1.40(s，9H，t-Bu)，1 .31(s，9H，t-Bu)．例７７:tert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｎ−（４−（（（２，４− ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネート例４９に従って、０．２００ｇの４−（Ｎ−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニルメチル）−Ｎ−メチルアミノ）安息香酸半塩酸塩二水和物（アルドリッチ）を、０．２４mLのＤＥＣＰ（アルドリッチ）及び０．２６mLのＥｔ₃Ｎを用いて、２０mLのＤＭＦ中で０．２５ｇのtert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ −グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネートとカップリングした。粗生成物を、１５０ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（７：７：１ＣＨ₂Ｃｌ₂：アセトン：ＭｅＯＨ）で精製し、０．１９５ｇ（４７％）のtert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｎ−（４−（（（２，４ −ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネートを黄色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１１５〜１２０℃。例７８：Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル −Ｌ−フェニルアラニン例５０に従って、０.１８ｇのtert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネートを２０mLのＣＨ₃ＮＯ₂中でＨＣｌガスで１．２５ｈ処理した。常法に従って後処理し、単離して０．１３５ｇ（８４％）のＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニンを黄−橙色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１７０℃（dec.）。HPLC : C18で１つのピークであった。k'=2.86，65:35:0.1H₂O:MeCN:TFA、流速=１ mL/min． ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ12.90-11.85(brm，COOH)，8.58(s，1H，プテリジニル 7 -CH)，8.04(d，1H，J=7.7，アミドNH)，8.00(d，1H，J=8.1，アミド NH)，7.72(br s， 1H，NH₂)，7.71(d，2H，J=8.8，芳香族CH)，7.53(br s，1H，NH₂)，7.08-6.93(m ，4H，芳香族CH)，6.81(d，2H，J=8.9，芳香族CH)，6.69(br s，2N，NH₂)，4.79 (s，2H，プテリジニル-CH₂)，4.40(m，2H，メチン )，3.22(s，3H，N-CH₃)，3.01(m，1H，ArCH₂)，2.94-2.75(m，2H，ArCH₂，シクロペンチルメチン)，2.24(t，2H，J=7.7，glu 4-CH₂)，2.03-1.76(m，4H，glu 3-CH₂，シクロペンチル CH₂)，1.73-1.35(m，6H，シクロペンチル CH₂)．元素分析 : Calcd．for C₃₄H₃₉N₉O₆・1.6H₂O(MW 698.56): C，58.46; H，6.09; N ，18.05．Found: C，58.50; H，6.08; N，18.10．質量スペクトル : (FAB)670(M+H)⁺，613，437，309，275．ＵＶスペクトル : (pH7 バッファー)λ_max（ε）259.7(23300)，308.3(23500)，371.7( 7030)．λ_min（ε）241.0(13500)，274.8(15300)，346.1(5260)．例７９：２−シクロヘキシルベンジルアルコール例６１に従って、１０．０ｇの２−ヨードベンジルアルコール（アルドリッチ）を、０．９６ｇのＰｄ（ＯＡｃ）２、２．６０ｇのトリ−オルト−トリルホスフイン、及び６．６mLのＥｔ₃Ｎを用いて１１０℃で４８ｈ、２５mLのシクロヘキセン（アルドリッチ）と処理した。得られたオレフィン混合物を０．３６ｇの５％Ｐｔ（Ｃ）を用いてＭｅＯＨ中で６．５ｈ水素化し、３．３７ｇ（４２％）の３−シクロヘキシルベンジルアルコールを淡黄色の液体として得た。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ7.33(d，1H，J=7.4，芳香族CH)，7.27-7.08(m，3 H，芳香族CH)，5.03(t，1H，J=5.4，OH)，4.34(d，2H，J=5.4，ArCH₂O)，2.76(m ，1H，シクロヘキシルメチン)，1.85-1.61(m，5H，シクロヘキシル CH₂)，1.48-1.22(m，5H シクロヘキシル CH₂)．例８０：２−シクロヘキシルベンジルブロマイド例１７に従って、３．３７ｇの２−シクロヘキシルベンジルアルコールを、２５mLの無水ＣＨ₂Ｃｌ₂中で０．５９mLのＰＢｒ₃で処理し、３．９０ｇの粗生成物を得た（¹Ｈ−ＮＭＲにより９０％純度）。この物質を、ショートパスを通して真空蒸留し（１．０mmHg、１１７〜１２０℃）、３．５４ｇの２−シクロヘキシルベンジルブロマイドを透明のオイルとして得た。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ7.39(d，1H，J=5.7，芳香族CH)，7.29(m，2H，芳香族CH)，7.13(m，1H，芳香族CH)，4.76(s，2H，ArCH₂Br)，2.86(m，1H，シクロヘキシルメチン)，1.83-1.63(m，5H，シクロヘキシル CH₂)，1.53-1.20(m，5H，シクロヘキシル CH₂)．例８１：（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−tert−ブチル３−（２−シクロヘキシルベンジル）−２−オキソ−２，３−ジフェニル−４−モルホリンカルボキシレート磁気撹拌器及び窒素導入管を備えた乾燥した２５０mLの三口フラスコに、１．４７ｇのtert−ブチル（２Ｒ，３Ｓ）−（−）−６−オキソ−２，３−ジフェニル−４−モルホリンカルボキシレート（アルドリッチ）の３０mLの無水ＴＨＦ溶液、１．００ｇの２−シクロヘキシルベンジルブロマイドの８mLの無水ＴＨＦ溶液を加えた。両用液は３Åのモレキュラーシーブで２４時間乾燥した。無水ＴＨＦを洗浄（３０mL）に使用し、全体で６８mLの容積の容積となった。得られた溶液を−７８℃に冷却し、シリンジによりラバーセプタムを通してゆっくり加えることによって、４．１５mLの１Ｍナトリウムビス（トリメチルシリル）アミドのＴＨＦ溶液で処理した。−７８℃で３．５ｈ撹拌した後、反応混合物を８０mLの水と混合し、ロータリーエバポレーションにかけ、ＴＨＦを除いた。得られた混合物をＥｔＯＡｃ（４×５０mL）で抽出した。ＥｔＯＡｃ抽出物を合わせ、飽和ＮａＣｌ水（２×７０mL）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、減圧下に濃縮して白色の固体を得た。この物質を、２００ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（８：２ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、１．２ｇ（５８％）の（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−tert−ブチル３−（２−シクロヘキシルベンジル）− ２−オキソ−２，３−ジフェニル−４−モルホリンカルボキシレートを白色の結晶性固体として得た。ｍ．ｐ．＝１９５〜１９８℃ 例８２：（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−６−オキソ−２，３−ジフェニル−５−（２−シクロヘキシルベンジル）モルホリン窒素導入管と磁気撹拌器を備えた乾燥した５０mLの三口フラスコに、２．１０ｇの（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−tert−ブチル３−（２−シクロヘキシルベンジル）−２−オキソ−５，６−ジフェニル−４−モルホリンカルボキシレート、３３ mLの無水ＣＨ₂Ｃｌ₂を充填した。この溶液をＲＴで撹拌し、３．３mLのＴＦＡで処理した。３．５ｈ後、ｔｌｃ（ＳｉＯ₂、８５：１５ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で出発物質が残っていないこと、Ｒｆ＝０．４５の新たな主要成分、及びＲｆ＝０．６８及び０．７０の２つのマイナーな成分が示された。この溶液を、９mLのＥｔ₃Ｎを添加して中和し、減圧下に濃縮して濃密なオイルを得た。この物質を８０mLのＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解し、水（３×６０mL）、次いで５％ＮａＨＣＯ₃（３×６０mL）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄で乾燥した。乾燥剤を濾過によって除き、濾液を減圧下に濃縮して白色の固体を得た。１５０ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（８：２ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）による粗生成物の精製、次いでＥｔＯＨ−Ｈ₂Ｏからの再結晶により１．２７ｇ（７５％）の（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−６−オキソ−２，３ −ジフェニル−５−（２−シクロヘキシルベンジル）モルホリンを白色の結晶性固体として得た。ｍ．ｐ．＝１５９〜１６０℃。例８３：２−シクロヘキシル−Ｌ−フェニルアラニン例５３に従って、１．１７ｇの（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−６−オキソ−２，３− ジフェニル−５−（２−シクロヘキシルベンジル）モルホリンを、０．３４ｇのＰｄＣｌ₂を用いて６０mLの１：１ＴＨＦ：ＭｅＯＨ中で水素化し、０．８３ｇの２−シクロヘキシル−Ｌ−フェニルアラニン・ＨＣｌをふわふわした白色の固体として得た。ｍ．ｐ．＝１４０℃（dec.）。例８４：tert−ブチル２−シクロヘキシル−Ｌ−フェニルアラニネート例５４に従って、０．７３ｇの２−シクロヘキシル−Ｌ−フェニルアラニン・ＨＣｌを、０．４mLの濃Ｈ₂ＳＯ₄の存在下、２５mLの１，４−ジオキサン中で２５mLのイソブチレンで処理した。後処理し、次いで遊離のアミンをＨＣｌエーテル溶液で酸性化し、０．７０ｇ（８０％）のtert−ブチル２−シクロヘキシル −Ｌ−フェニルアラニネート・ＨＣｌを黄色の発泡体として得た。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ8.53(br s，3H，NH₃ ⁺)，7.27(m，2H，芳香族CH) ，7.10(m，2H，芳香族CH)，3.86(m，1H，メチン)，3.24(m，1H，ArCH₂)，2.97(m，1 H，ArCH₂)，2.72(m，1H，シクロヘキシルメチン)，1.86-1.60(m，5H，シクロヘキシル CH₂)，1.56 -1.30(m，5H，シクロヘキシル CH₂)，1.19(s，9H，t-Bu)．例８５：tert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ− tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−シクロヘキシル−Ｌ−フェニルアラニネート例９に従って、０．７０ｇのtert−ブチル２−シクロヘキシル−Ｌ−フェニルアラニネート・ＨＣｌを、０．４２ｇのＥＤＣ（アルドリッチ）及び０．２３ mLのＮ−メチルモルホリンを用いてＮ−Ｃｂｚ−Ｌ−グルタミン酸 γ−tert− ブチルエステル（シグマ）とカップリングした。粗生成物を、１５０ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（８：２ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、０．９７ｇ（７６％）のtert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−tert −ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−シクロヘキシル−Ｌ−フェニルアラニネートを白色の発泡体として得た。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ8.32(d，1H，J=7.6，NH)，7.40-6.97(m，10H，芳香族CH，NH)，5.00(m，2H，PhCH₂O)，4.26(m，1H，メチン)，4.04(m，1H，メチン)，3. 07(m，1H，ArCH₂)，2.93-2.70(m，2H，ArCH₂，シクロヘキシルメチン)，2.19(t，2H，J=7. 7，glu 4-CH₂)，1.90-1.62(m，7H，glu 3-CH₂，シクロヘキシル CH₂)，1.56-1.33(m，5H ，シクロヘキシル CH₂)，1.38(s，9H，t-Bu)，1.32(s，9H，t-Bu)．質量スペクトル : (CI，CH₄)623(M+H)⁺，567，539，511，489，433，193．例８６：tert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル −２−シクロヘキシル−Ｌ−フェニルアラニネート例４８に従って、０．９７ｇのtert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−シクロヘキシル−Ｌ−フェニルアラニネートを、５０mLのＭｅＯＨ中で０．１６ｇの１０％Ｐｄ（Ｃ）を用いて水素化した。これにより０．７６ｇ（１００％）のtert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−シクロヘキシル −Ｌ−フェニルアラニネートを濃密な透明なオイルとして得た。¹Ｈ−ＮＭＲ分析用の対応するＨＣｌ塩のサンプルを、過剰の１ＮＨＣｌエーテル溶液で１０mgの生成物を処理し、乾燥するまで減圧下に濃縮して調製した。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ9.05(d，1H，J=7.5，NH)，8.24(br s，3H，NH₃ ⁺) ，7.20(m，3H，芳香族CH)，7.07(t，1H，J=7.1，芳香族CH)，4.28(m，1H，メチン) ，3.83(m，1H，メチン)，3.08(m，1H，ArCH₂)，2.91(m，1H，ArCH₂)，1.78(m，1H，シクロヘキシルメチン)，2.34(m，2H，glu 4-CH₂)，2.00(m，2H，glu 3-CH₂)，1.89-1.60( m，5H，シクロヘキシル CH₂)，1.57-1.20(m，5H，シクロヘキシル CH₂)，1.40(s，9H，t-Bu)，1 .33(s，9H，t-Bu)．例８７：tert−ブチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−シクロヘキシル−Ｌ−フェニルアラニネート例４９に従って、０．２４７ｇの４−（Ｎ−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニルメチル）−Ｎ−メチルアミノ）安息香酸半塩酸塩二水和物（アルドリッチ）を、０．３０mLのＤＥＣＰ（アルドリッチ）及び０．３２mLのＥｔ₃Ｎを用いて、２５mLのＤＭＦ中で０．３５ｇのtert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ −グルタミン−１−イル−２−シクロヘキシル−Ｌ−フェニルアラニネートとカップリングした。粗生成物を、フラッシュクロマトグラフィーで二回（１５０ｇ、ＳｉＯ₂、７：７：１ＣＨ₂Ｃｌ₂：アセトン：ＭｅＯＨ；１５０ｇ、ＳｉＯ₂ 、９５：５ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）精製し、０．２９７ｇ（５７％）のtert−ブチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−tert −ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−シクロヘキシル−Ｌ−フェニルアラニネートを黄色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１３５〜１４０℃。例８８：Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−シクロヘキシル −Ｌ−フェニルアラニン例５０に従って、０．１８ｇのtert−ブチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−tert −ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−シクロヘキシル−Ｌ−フェニルアラニネートを２０mLのＣＨ₃ＮＯ₂中でＨＣｌガスで１．５ｈ処理した。常法に従って後処理し、単離して０．１９１ｇ（７９％）のＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−シクロヘキシル−Ｌ−フェニルアラニンを黄−橙色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１７５℃（dec.）。HPLC : C18で１つのピークであった。k'=4.05，65:35:0.1H₂O:MeCN:TFA、流速=１ mL/min． ¹H-NMR: (300 MHz，DMSO-d₆)d 12.75-11.90(br s，COOH)，8.58(s，1H プテリジニル 7-CH)，8.20(d，1H，J=7.9，アミド NH)，7.98(d，1H，J=8.1，アミド NH)， 7.79(br s，1H，NH₂)，7.72(d，2H，J=8.9，芳香族CH)，7.59(br s，1H，NH₂)， 7.19(m，1H，芳香族CH)，7.08(m，2H，芳香族CH)，6.92(m，1H，芳香族CH)，6.8 3(d，2H，J=8.9，芳香族CH)，6.75(br s，2H，NH₂)，4.80(s，2H，プテリジニル-CH₂) ，4.43(m，1H，メチン)，4.31(m，1H，メチン)，3.21(s，3H，N-CH₃)，3.12(m，1H，Ar CH₂)，3.92-3.70(m，2H，ArCH₂，シクロヘキシルメチン)，2.23(t，2H，J=7.7，glu4-CH₂) ，2.05-1.60(m，7H，glu 3-CH₂，シクロヘキシル CH₂)，1.50-1.16(m，5H，シクロヘキシルCH₂) ．元素分析 : Calcd．for C₃₆H₄₁N₉O₆．1.5H₂O(MW 710.79): C，59.14; H，6.24; N ，17.74．Found: C，59.11; H 6.20; N，17.73．質量スペクトル : (FAB)684(M+H)⁺，613，510，385，309．ＵＶスペクトル : (pH7 バッファー)λ_max（ε）259.7(22300)，308.8(22700)，374.0( 6850)．λ_min（ε）241.7(12800)，275.2(14700)，346.3(5170)．例８９：３−tert−ブチルベンジルブロマイド窒素導入管、コンデンサー、温度計、及び磁気撹拌器を備えた乾燥した１００ mLの三口フラスコに、２.０ｇの３−tert−ブチルトルエン(Wiley Organics，Co shocton，OH 43812)、２．４０ｇのＮ−ブロモ琥珀酸イミド（アルドリッチ）、及び３０mLのＣＣｌ₄を充填した。この混合物を０．１６ｇの過酸かベンゾイル（アルドリッチ）で処理し、Ｎ₂下、６０℃で加熱した。注意深い温度制御が、副生成物の生成を最小にするのに重要である。６０℃で１ｈ後、反応混合物を０ ℃に冷却し、濾過してスクシンイミドを除去し、濾液を減圧下に濃縮し、淡黄色の液体を得た。この物質のｔｌｃ（ＳｉＯ₂、ヘキサン）による分析で、Ｒｆ＝０．５０の主要成分と、Ｒｆ＝０．５５のマイナー成分、及びＲｆ＝０．７５の微量の３−tert−ブチルトルエンが示された。この粗生成物を、１００ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン）で精製し、１．０６ｇ（３５％）の３−tert−ブチルベンジルブロマイドを透明な液体として得た。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ7.47(s，1H，芳香族CH)，7.39-7.21(m，3H，芳香族CH)，4.69(s，2H，ArCH₂Br)，1.27(s，9H，t-Bu)．例９０：（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−tert−ブチル３−（３−tert−ブチルベンジル）−２−オキソ−２，３−ジフェニル−４−モルホリンカルボキシレート例８１に従って、１．６３ｇのtert−ブチル（２Ｒ，３Ｓ）−（−）−６− オキソ−２，３−ジフェニル−４−モルホリンカルボキシレート（アルドリッチ）を、７０mL無水ＴＨＦ中、４．６２mLの１Ｍナトリウムビス（トリメチルシリル）アミドのＴＨＦ溶液（アルドリッチ）を用いて１．０ｇの３−tert−ブチルベンジルブロマイドでアルキル化した。粗生成物を、１５０ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（９：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、１．８４ｇ（８０％）の（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−tert−ブチル３−（３−tert−ブチルベンジル）−２−オキソ−２，３−ジフェニル−４−モルホリンカルボキシレートを白色の発泡体として得た。ｍ．ｐ．＝６５〜９０℃。例９１：（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−６−オキソ−２，３−ジフェニル−５−（ −tert−ブチルベンジル）モルホリン例８２に従って、１．７２ｇの（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−tert−ブチル３−（３−tert−ブチルベンジル）−２−オキソ−２，３−ジフェニル−４−モルホリンカルボキシレートを、３０mLのＣＨ₂Ｃｌ₂中で３．４ｈ、３mLのＴＦＡで処理した。７．７mLのＥｔ₃Ｎで中和し、常法で後処理し、濃密なオイルを得た。１２５ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（７５：２５ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）による精製で０．９０ｇ（６３％）の（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−６− オキソ−２，３−ジフェニル−５−（３−tert−ブチルベンジル）モルホリンを白色の結晶性固体として得た。ｍ．ｐ．＝１３６〜１３７℃。例９２：３−tert−ブチル−Ｌ−フェニルアラニン例５３に従って、１．７９ｇの（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−６−オキソ−２，３− ジフェニル−５−（３−tert−ブチルベンジル）モルホリンを、０．２８ｇのＰｄＣｌ₂を用いて４０mLの１：１ＴＨＦ：ＥｔＯＨ中で水素化し、０．５７ｇ（９９％）の３−tert−ブチル−Ｌ−フェニルアラニン・ＨＣｌを白色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＞２５０℃。 ¹H-MNR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ8.42(br s，3H，NH₃ ⁺)，7.26 (m，3H，芳香族CH)，7.08(dd; 1H; J=7.0，1.3; 芳香族CH)，4.12(m，1H，メチン) ，3.12(d，2H，J=6.1，ArCH)，1.27(s，9H，t-Bu)．例９３：３−tert−ブチル３−tert−ブチル−Ｌ−フェニルアラニネート例５４に従って、０．５０ｇの３−tert−ブチル−Ｌ−フェニルアラニン・ＨＣｌを、０．４mLの濃Ｈ₂ＳＯ₄の存在下、２５mLの１，４−ジオキサン中で３０ mLのイソブチレンで処理した。常法により後処理をし、次いで遊離のアミンをＨＣｌエーテル溶液で酸性化し、０．５３ｇ（８７％）のtert−ブチル３−tert −ブチル−Ｌ−フェニルアラニネート・ＨＣｌを淡黄色の発泡体として得た。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ8.48(br s，3H，NH₃+)，7.36-7.20(m，3H，芳香族CH)，7.08(d，1H，J=7.1，芳香族CH)，4.16(m，1H，メチン)，3.19(dd; 1H; J=13 .9，5.7; ArCH₂)，2.95(dd; 1H;J=13.9，8.6; ArCH₂)，1.28(s，9H，t-Bu)，1.2 7(s，9H，t-Bu)．例９４：tert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ− tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−tert−ブチル−Ｌ−フェニルアラニネート例９に従って、０．５２ｇのtert−ブチル３−tert−ブチル−Ｌ−フェニルアラニネート・ＨＣｌを、０．３３ｇのＥＤＣ（アルドリッチ）及び０．１８mL のＮ−メチルモルホリンを用いて０．５６ｇのＮ−Ｃｂｚ−Ｌ−グルタミン酸γ−tert−ブチルエステル（シグマ）とカップリングした。粗生成物を、１１０ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（７５：２５ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、０．７７ｇ（７８％）のtert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）− ５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−tert−ブチル−Ｌ−フェニルアラニネートを濃密な透明のオイルとして得た。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ8.28(d，1H，J=7.3，NH)，7.42-7.13(m，9H，芳香族CH，NH)，7.04(d，1H，J=6.6，芳香族CH)，5.02(s，2H，PhCH₂O)，4.37(m， 1H，メチン)，4.07(m，1H，メチン)，2.96(d，2H，J=7.6，ArCH₂)，2.21(t，2N，J=7.7 .glu4-CH₂)，1.97-1.60(m，2H，glu3-CH₂)，1.39(s，9H，t-Bu)，1.31(s，9H，t -Bu)，1.27(s，9H，t-Bu)．例９５：tert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル −３−tert−ブチル−Ｌ−フェニルアラニネート例４８に従って、０．７６ｇのtert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−tert−ブチル−Ｌ−フェニルアラニネートを、６０mLのＭｅＯＨ中で０．１３ｇの１０％Ｐｄ（Ｃ）を用いて水素化した。これにより０．５８ｇ（９９％）のtert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−tert−ブチル−Ｌ− フェニルアラニネートを濃密な透明なオイルとして得た。¹Ｈ−ＮＭＲ分析用の対応するＨＣｌ塩のサンプルを、過剰の１ＮＨＣｌエーテル溶液で１０mgの生成物を処理し、乾燥するまで減圧下に濃縮して調製した。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ8.97(t，1H，J=7.0，NH)，8.27(br s，3H，NH3⁺) ，7.31-7.15(m，3H，芳香族CH)，7.06(d，1H，J=6.8，芳香族CH)，4.38(m，1H，メチン )，3.82(m，1H，メチン)，2.96(d，2H，J=7.2，ArCH₂)，2.33(m，2H，glu4-CH₂) ，1.98(m，2H，glu 3-CH₂)，1.38(s，9H，t-Bu)，1.29(s，9H，t-Bu)，1.26(s， 9H，t-Bu)．例９６：tert−ブチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−tert−ブチル−Ｌ−フェニルアラニネート例４９に従って、０．２２３ｇの４−（Ｎ−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニルメチル）−Ｎ−メチルアミノ）安息香酸半塩酸塩二水和物（アルドリッチ）を、０．２７mLのＤＥＣＰ（アルドリッチ）及び０．２９mLのＥｔ₃Ｎを用いて、２５mLのＤＭＦ中で０．２５ｇのtert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ −グルタミン−１−イル−３−tert−ブチル−Ｌ−フェニルアラニネートとカップリングした。粗生成物を、フラッシュクロマトグラフィーに二回かけ（１８０ｇＳｉＯ₂、７：７：１ＣＨ₂Ｃｌ₂：アセトン：ＭｅＯＨ；１８５ｇＳｉＯ₂、９５：５ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）、０．３２３ｇ（７１％）のtert−ブチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ− ６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−tert−ブチル−Ｌ−フェニルアラニネートを黄色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１２８〜１３５℃。例９７：Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−tert−ブチル− Ｌ−フェニルアラニン（手順Ａ）この化合物を製造するための手順Ｂは例１３０を参照。例５０に従って、０．３０３ｇのtert−ブチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−te rt−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−tert−ブチル−Ｌ−フェニルアラニネートを４０mLのＣＨ₃ＮＯ₂中でＨＣｌガスで１．５ｈ処理した。常法に従って後処理し、単離して０．２１５ｇ（７９％）のＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−tert−ブチル−Ｌ−フェニルアラニンを黄色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１８３℃。HPLC : C18で１つのピークであった。k'=2.54，70:30:0.1H20:MeCN:TFA、流速=１ mL/min． ¹H-NMR : (300 MHz，DMSOd₆)δ12.90-11.80(br s，COOH)，8.59(s，1H，プテリジニル 7 -CH)，8.08(d，1H，J=7.6，アミド NH)， 7.98(d，1H，J=8.0，アミド NH)，7.89(br s，1H，NH₂)，7.70(d，2H，J=8.9，芳香族CH)，7.69(br s，1H，NH₂)，7.21(s，1H，芳香族CH)，7.16(d，1H，J=7.7，芳香族CH)，7.08(t，1H，J=7.6，芳香族CH)，6.99(d，1H，J=7.4，芳香族CH)，6.8 1(m，4H，芳香族CH，NH₂)，4.79(s，2H，プテリジニル CH₂)，4.43(m，2H，メチン)，3.21 (s，3H，N-CH₃)，3.03(m，1H，ArCH₂)，2.91(m，1H，ArCH₂)，2.24(t，2H，J=7. 8．glu 4-CH₂)，2.04-1.74(m，2H，glu 3-CH₂)，1.20(s，9H，t-Bu)．元素分析 : Calcd．for C₃₃H₃₉N₉O・1.8 H₂O(MW 690.16): C，57.43; H，6.22; N ，18.27.Found: C，57.34; H6.07; N，18.26．質量スペクトル: (FAB)658(M+H)⁺，459，307．ＵＶスペクトル : (pH7 バッファー)λ_max（ε）259.4(22800)，308.1(23000)，372.5( 7040)．λ_min（ε）241.0(13400)，274.6(15200)，345.2(5380)．例９８：Ｎ−（（tert−ブトキシ）カルボニル）−４−（ビス（２−クロロエチル）アミノ）−Ｌ−フェニルアラニン磁気撹拌器及び窒素導入管を備えた乾燥した５０mLの三口フラスコに、０．１０ｇの４’−（ビス（２−クロロエチル）アミノ）−Ｌ−フェニルアラニン・Ｈ₂ Ｏ（シグマ）、１４mLの１：１ＤＭＦ：ＣＨ₃ＣＮ、及び１９mLのＥｔ₃Ｎを充填した。この混合物を９１mgの２−（ｔert−ブトキシカルボニルイミノ）− ２−フェニルアセトニトリル（ＢＯＣ−ＯＮ、フルカ）と処理し、Ｎ₂下、ＲＴで撹拌した。１８ｈ後、固体の出発物質が溶解し、淡黄色の溶液が得られ、これを減圧下に乾燥するまで濃縮した。ｔｌｃ（ＳｉＯ₂、９：１ＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨ）による残渣の分析で、Ｒｆ＝０．６５の新たな主要な成分、Ｒｆ＝１．０及び０．７１のＢＯＣ−ＯＮ由来の成分、並びにＲｆ＝０．６０及び０．３５の２つの微量成分が示された。粗生成物を、６０ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（９：１ＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨ）で精製し、０．１０ｇ（８０％）のＮ−（(tert −ブトキシ）カルボニル）−４−（ビス（２−クロロエチル）アミノ）−Ｌ−フェニルアラニンを淡黄色のガラス状物として得た。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ7.04(d，2H，J=8.6，芳香族CH)，6.62(d，2H，J= 8.5，芳香族CH)，6.46(br s，1H，NH)，3.87(m，1H，メチン)，3.67(s，8H，N(CH₂ CH₂Cl)₂)，2.90(m，1H，ArCH₂)，2.73(m，1H，ArCH₂)，1.33(s，9H，t-Bu)．例９９：tert−ブチルＮ−（（tert−ブトキシ）カルボニル）−４−（ビス（２−クロロエチル）アミノ）−Ｌ−フェニルアラニル−（３−シクロペンチル）−Ｌ−フェニルアラニネート磁気撹拌器を備えた５０mLの丸底フラスコに９６mgのＮ−（（tert−ブトキシ）カルボニル）−４−(ビス(２−クロロエチル)アミノ)−Ｌ−フェニルアラニン、７７mgのtert−ブチル３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネート・ＨＣｌ、及び１０mLのＣＨ₂Ｃｌ₂を充填した。この溶液を０℃に冷却し、４８mgのＥＤＣ（アルドリッチ）、次いで０．０２６mLのＮ −メチルモルホリンで処理した。この反応混合物を０℃で２０分撹拌し、ＲＴに温め、更に２ｈ撹拌した。ｔｌｃ（ＳｉＯ₂、７：３ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）による残渣の分析で、Ｒｆ＝０．５４の新たな主要な成分、Ｒｆ＝０．４、０．３７、０．１６及び０．０の４つのマイナー成分が示された。この溶液を、乾燥するまで減圧下に濃縮し、残渣を５０ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにかけ、７３mg（４６％）のtert−ブチルＮ−((tert−ブトキシ)カルボニル)−４−（ビス（２−クロロエチル）アミノ）−Ｌ−フェニルアラニル− （３−シクロペンチル）−Ｌ−フェニルアラニネートを濃密な半固体として得た。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ8.18(d，1H，J=7.8,NH)，7.19(m，1H，芳香族CH) ，7.13-7.00(m，5H，芳香族CH，NH)，6.77(d，1H，J=8.8，芳香族CH)，6.63(d， 2H，J=8.9，芳香族CH)，4.35(m，1H，メチン)，4.05(m，1H，メチン)，3.68(s，8H，N( CH₂CH₂Cl)₂)，2.93(m，3H，ArCH₂，シクロペンチルメチン)，2.79(m，1H，ArCH₂)，2.58(m ，1H，ArCH₂)，1.80-1.43(m，8H，シクロペンチル CH₂)，1.29(s，18H，t-Bu)．例１００：４−（ビス（２−クロロエチル）アミノ）−Ｌ−フェニルアラニル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニン窒素導入管及び磁気撹拌器を備えた２５mLの三口フラスコに、６５mgのtert− ブチルＮ−（（tert−ブトキシ）カルボニル）−４−（ビス（２−クロロエチル）アミノ）−Ｌ−フェニルアラニル −（３−シクロペンチル）−Ｌ−フェニルアラニネート及び８mLのＣＨ₃ＮＯ₂を充填した。この溶液を、１０分間ＨＣｌガスをバブリングして酸性化した。Ｎ₂ 下、ＲＴで３０min撹拌した後、溶液を乾燥するまで減圧下に濃縮した。得られた固体のＨＰＬＣ（Ｃ１８、５０：５０：０．１Ｈ₂Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ）による分析で、ｋ’＝１．１４（９６％）の主要成分とｋ’＝１．６０（４％）のマイナー成分が示された。純粋な生成物を含むフラクション（分析用ＨＰＬＣでｋ’＝１．１４）を合わせ、２０mLまで濃縮した。得られた懸濁液を凍結し、凍結乾燥して３５mg（５５％）のを白色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝８０〜９０℃ ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ8.85(d，1H，J=7.8,NH)，8.00(br s，3H，NH₃ ⁺) ，7.25-7.00(m，6H，芳香族CH)，6.70(d，2H，J=8.5，芳香族CH)，4.50(m，1H，メチン )，3.89(m，1H，メチン)，3.69(5,8H，N(CH₂CH₂Cl)₂)，3.12-2.83(m，4H，ArCH₂ ，シクロペンチルメチン)，2.77(m，1H，ArCH₂)，1.97(m，2H，シクロペンチル CH₂)，1.84-1.43( m，6H，シクロペンチル CH₂)． ¹⁹F-NMR : (282 MHz，DMSO-d₆): d 1.26(ＴＦＡ外部標準に対して)．元素分析: Calcd．for C₂₇H₃₅N₃O₃Cl₂・TFA・1.6 H₂O(MW 663.35): C，52.51; H，5.96; N， 6.33．Found: C，52.16; H，5.69; N,6.69．質量スペクトル: (FAB)520(M+H)⁺ ，273．ＵＶスペクトル: (2.5x10^-3MNaOH)λmax（ε）261.5(18700)，303.9(2 090)，λmin（ε）232.3(5270)，288.2(1760)．例１０１：３−ヨード−Ｏ−(tert−ブチルジメチルシリル）ベンジルアルコール磁気撹拌器と窒素導入管を備えた１００mLの３口フラスコに、５．０ｇの３− ヨードベンジルアルコール（アルドリッチ）、３．８６ｇのtert−ブチルジメチルシリルクロライド、３．２０ｇのイミダゾール（アルドリッチ）、及び３０mL の無水ＤＭＦを充填した。得られた溶液を４ｈ窒素下で撹拌し、減圧下に濃縮し、透明な粘稠なオイルを得た。この物質を１５０mLのＥｔＯＡｃに溶解し、この溶液を５％ＮａＨＣＯ₃水溶液（３×７０mL）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、減圧下に濃縮して透明な液体を得た。粗生成物を２００ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン）で精製し、７．０１ｇ（９４％）の３− ヨード−Ｏ−(tert−ブチルジメチルシリル）ベンジルアルコールを透明な液体として得た。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ7.67(s，1H，芳香族CH)，7.56(d，1H，J=7.3，芳香族CH)，7.27(d，1H，J=9.2，芳香族CH)，7.06(t，1H，J=7.6，芳香族CH)，4.6 8(s，2H，ArCH₂O)，0.94(s，9H，t-Bu)，0.10(s，6H，SiMe₂)．例１０２：３−（１−ヒドロキシシクロブチル）−Ｏ−（tert−ブチルトリメチルシリル）ベンジルアルコール窒素導入管と磁気撹拌器を備えた乾燥した５００mL三口フラスコに、７．０ｇの３−ヨード−Ｏ−（tert−ブチルジメチルシリル）ベンジルアルコール及び１００mLの無水ＴＨＦを加えた。この溶液をドライアイス−イソプロパノール浴で−７８に冷却し、９．７mLの２．５Ｍｎ−ブチルリチウム／ヘキサン（アルドリッチ）をラバーセプタムを通してシリンジにより滴下することによって処理した。−７８℃で２０ min撹拌した後、溶液を１．８mLのシクロブタノン（アルドリッチ）を滴下することによって処理した。反応混合物を−７８℃で２０min撹拌し、次いでＲＴに温めた。ＲＴで３０min後、溶液を１００mLの水と混合し、ロータリーエバポレーションにかけ、ＴＨＦを除いた。得られたエマルジョンをＥｔＯＡｃ（４×６０mL）で抽出した。ＥｔＯＡｃ抽出物を合わせ、飽和食塩水で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、減圧下に濃縮して淡黄色のオイルを得た。この物質を１６０ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（９：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、３．９８ｇ（６８％）の３−（１−ヒドロキシシクロブチル）−Ｏ −(tert−ブチルトリメチルシリル）ベンジルアルコールを透明な液体として得た。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ7.44(s，1H，芳香族CH)，7.38-7.23(m，2H，芳香族CH)，7.15(d，1H，J=7.4，芳香族CH)，5.45(s，1H，OH)，4.72(s，2H，ArCH₂O )，2.41-2.18(m，4H，シクロブチル CH₂)，1.88(m，1H，シクロブチル CH₂)，1.61(m，1H，シクロブチル CH₂)，0.90(s，9H，t-Bu)，0.08(s，6H，SiMe₂)．例１０３：３−シクロブチルベンジルアルコール窒素導入管及び磁気撹拌器を備えた乾燥した５００mLの三口フラスコに、３．９８ｇの３−（１−ヒドロキシシクロブチル）−Ｏ−（te rt−ブチルトリメチルシリル）ベンジルアルコール及び８５mLのＣＨ₂Ｃｌ₂を充填した。この溶液を窒素下で０℃に冷却し、１５．７mLのＴＦＡ、次いで４．７８mLのトリエチルシランで処理した。０℃で１ｈ撹拌した後、この溶液をＲＴまで温めた。ＲＴで３．５ｈ後、ｔｌｃ（ＳｉＯ₂、８：２ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）による分析で、Ｒｆ＝０．１５の未反応の出発物質と、Ｒｆ＝０．６５の新たな成分が示された。この溶液を更に３mLのトリエチルシランで処理しＲＴで１８ｈ撹拌した。この溶液を０℃に冷却し、３０mLのＥｔ３Ｎをゆっくり加えて中和した。この混合物を減圧下に濃縮し、淡黄色の液体を得、これを１００mLのＥｔＯＡｃに溶解した。得られた溶液を、飽和食塩水（３×８０mL）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、濃縮して透明な液体を得た。この物質を８０mLの無水ＴＨＦに溶解し、５００mLの三口フラスコ中で６０mLの１Ｎ（ｎ−Ｂｕ）₄ＮＦ（アルドリッチ）で処理した。ＲＴで１８ｈ撹拌した後、溶液を減圧下に濃縮し、残渣を１００mLのＥｔＯＡｃに溶解した。この溶液を飽和食塩水（４×８０mL）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、濃縮して透明なオイルを得た。この粗生成物を１２０ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（８：２ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、１．２９ｇ（５９％）の３−シクロブチルベンジルアルコールを透明な液体として得た。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ7.29-7.05(m，4H，芳香族 CH)，5.14(t，J=5.7，OH)，4.48(d，J=5.8，ArCH₂O)，3.51(m，1H，シクロブチルメチン) ，2.30(m，2H，シクロブチル CH₂)，2.17-1.88(m，3H:，シクロブチル CH₂)，1.82(m，1H，シクロブチル CH₂)．例１０４：３−シクロブチルベンジルブロマイド例１７に従って、１．２９ｇの３−シクロブチルベンジルアルコールを、１５ mLの無水ＣＨ₂Ｃｌ₂中において０．２６mLのＰＢｒ₃で処理し、１．６９ｇの粗生成物（¹Ｈ−ＮＭＲにより９２％の純度であった。）を得た。この物質を６５ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン）で精製し、１．５９ｇ（８９％）の３−シクロブチルベンジルブロマイドを透明な液体として得た。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ7.35-7.13(m，4H，芳香族CH)，4.70(ｓ，2H ArCH₂ Br)，3.53(m，1H，シクロブチルメチン)，2.39-1.75(m，6H，シクロブチル CH₂)．例１０５：tert−ブチル（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ，−６−オキソ−２，３−ジフェニル−５−（３−シクロブチルベンジル）−４−モルホリンカルボキシレート例８１に従って、２．５０ｇのtert−ブチル（２Ｒ，３Ｓ）−（−）−６− オキソ−２，３−ジフェニル−４−モルホリンカルボキシレート（アルドリッチ）を、８０mLの無水ＴＨＦ中、７．４１mLの１Ｍナトリウムビス（トリメチルシリル）アミドのＴＨＦ溶液（アルドリッチ）を用いて１．５９ｇの３−シクロブチルベンジルブロマイドでアルキル化した。粗生成物を、１２０ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（８：２ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）、次いでＥｔＯＨ−水空の再結晶で精製し、１．９０ｇ（５４％）のtert−ブチル（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−６−オキソ−２，３− ジフェニル−５−（３−シクロブチルベンジル）−４−モルホリンカルボキシレートを白色の発泡体として得た。ｍ．ｐ．＝１４５〜１４７℃ 例１０６：（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−６−オキソ−２，３−ジフェニル−５− （３−シクロブチルベンジル）モルホリン例８２に従って、１．８７ｇのtert−ブチル（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−６−オキソ−２，３−ジフェニル−５−（３−シクロブチルベンジル）−４−モルホリンカルボキシレートを、３０mLのＣＨ₂Ｃｌ₂中で４ｈ、３．１mLのＴＦＡで処理した。８mLのＥｔ₃Ｎで中和し、常法で後処理し、淡黄色の残渣を得た。８５ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（７５：２５ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）による粗製物質の精製で１．３５ｇ（９１％）の（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）− ６−オキソ−２，３−ジフェニル−５−（３−シクロブチルベンジル）モルホリンを濃密な透明の半固体として得た。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ7.24-7.02(m，10H，芳香族CH)，6.92(m，4H，芳香族CH)，5.71(s，1H，モルホリン 2-H)，4.64(m，1H，モルホリン 3-H)，4.24(m，1H，モルホリン 5-H)，3.42(m，1H，シクロブチルメチン)，3.26(m，1H，ArCH₂)，3.10(m，1H，ArCH₂) ， 2.76(t，1H，J=5.3，NH)，2.15(m，2H，シクロブチル CH₂)，2.02-2.81(m，3H，シクロブチル CH₂)，1.71(m，1H，シクロブチルCH₂)．例１０７：３−シクロブチル−Ｌ−フェニルアラニン例５３に従って、１．３５ｇの（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−６−オキソ−２，３− ジフェニル−５−（３−シクロブチルベンジル）モルホリンを、０．４２ｇのＰｄＣｌ₂を用いて６０mLの１：１ＴＨＦ：ＥｔＯＨ中で水素化し、０．７９ｇ（９１％）の３−シクロブチル−Ｌ−フェニルアラニン・ＨＣｌを白色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＞２００℃。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ8.40(br s，3H，NH₃ ⁺)，7.26(m，1H，芳香族CH) ，7.13(m，2H，芳香族CH)，7.08(d，1H，J=7.4，芳香族CH)，4.13(m，1H，メチン) ，3.50(m，1H，シクロブチルメチン)，3.11(d，2H，J=7.4，ArCH₂)，2.29(m，2H，シクロブチル CH₂)，2.18-1.88(m，3H，シクロブチル CH₂)，1.83(m，1H，シクロブチル CH₂)．例１０８：tert−ブチル３−シクロブチル−Ｌ−フェニルアラニン例５４に従って、０．６５ｇの３−シクロブチル−Ｌ−フェニルアラニン・ＨＣｌを、０．５mLの濃Ｈ₂ＳＯ₄の存在下、２５mLの１，４−ジオキサン中で２５ mLのイソブチレンで処理した。常法により後処理をし、次いで遊離のアミンをＨＣｌエーテル溶液で酸性化し、０．６４ｇ（８１％）の tert−ブチル３−シクロブチル−Ｌ−フェニルアラニネート・ＨＣｌを白色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１７３〜１７４℃。例１０９：tert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ −tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロブチル−Ｌ−フェニルアラニネート例９に従って、０．６４ｇのtert−ブチル３−シクロブチル−Ｌ−フェニルアラニネート・ＨＣｌを、０．４１ｇのＥＤＣ（アルドリッチ）及び０．２３mL のＮ−メチルモルホリンを用いて０．６９ｇのＮ−Ｃｂｚ−Ｌ−グルタミン酸γ −tert−ブチルエステル（シグマ）とカップリングした。粗生成物を、８５ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（７：３ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、０．９８ｇ（８０％）のtert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロブチル−Ｌ−フェニルアラニネートを濃密な透明のオイルとして得た。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ8.21(d，1H，J=7.3,NH)，7.33(m，6H，芳香族CH ，NH)，7.18(m，1H，芳香族CH)，7.02(m，3H，芳香族CH)，5.00(m，2H，PhCH₂O) ，4.32(m，1H，メチン)，4.05(m，1H，メチン)，3.47(m，1H，シクロブチルメチン)，2.92(d，2 H，J=7.6，ArCH₂)，2.31-2.12(m，4H，glu4-CH₂，シクロブチル CH₂)，2.11-1.62(m，6 H，glu 3-CH₂，シクロブチル CH₂)，1 37(s，9H，t-Bu)，1.29(s，9H，t-Bu)．例１１０：tert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロブチル−Ｌ−フェニルアラニネート例４８に従って、０．９８ｇのtert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロブチル−Ｌ−フェニルアラニネートを、５５mLのＭｅＯＨ中で０．１７ｇの１０％Ｐｄ（Ｃ）を用いて水素化した。これにより０．７６ｇ（１００％）のtert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロブチル−Ｌ −フェニルアラニネートを濃密な透明なオイルとして得た。¹Ｈ−ＮＭＲ分析用の対応するＨＣｌ塩のサンプルを、過剰の１ＮＨＣｌエーテル溶液で１０mgの生成物を処理し、乾燥するまで減圧下に濃縮して調製した。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ8.92(d，1H，J=7.0，NH)，8.25(br s，3H，NH₃ ⁺) ，7.20(m，1H，芳香族CH)，7.08(m，3H，芳香族CH)，4.38(m，1H，メチン)，3.83(m ，1H，メチン)，3.48(m，1H，シクロブチルメチン)，2.94(d，2H，J=7.8，ArCH₂)，2.16(m， 4H，glu 4-CH₂，シクロブチル CH₂)，2.15-1.86(m，5H，glu 3-CH₂，シクロブチル CH₂)，1.7 9(m，1H，シクロブチル CH₂)，1.38(s，9H，t-Bu)，1.31(s，9H，t-Bu)．例１１１：tert−ブチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロブチル −Ｌ−フェニルアラニネート例４９に従って、０．２８５ｇの４−（Ｎ−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニルメチル）−Ｎ−メチルアミノ）安息香酸半塩酸塩二水和物（アルドリッチ）を、０．３４mLのＤＥＣＰ（アルドリッチ）及び０．３７mLのＥｔ₃Ｎを用いて、２５mLのＤＭＦ中で０．３８ｇのtert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ −グルタミン−１−イル−３−シクロブチル−Ｌ−フェニルアラニネートとカップリングした。粗生成物を、１００ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（７：７：１ＣＨ₂Ｃｌ₂：アセトン：ＭｅＯＨ）にかけ、０．４５ｇ（７８％）のtert−ブチルＮ−（４−(((２，４−ジアミノ−６−プテリジニル)メチル)メチルアミノ)ベンゾイル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１ −イル−３−シクロブチル−Ｌ−フェニルアラニネートを黄色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１２０〜１２５℃。例１１２：Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロブチル −Ｌ−フェニルアラニン例５０に従って、０．４０ｇのtert−ブチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−tert −ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロブチル−Ｌ−フェニルアラニネートを６０mLのＣＨ₃ＮＯ₂中でＨＣｌガスで１ｈ処理した。常法に従って後処理し、単離して０．２８１ｇ（７９％）のＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ− ６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１ −イル−３−シクロブチル−Ｌ−フェニルアラニンを黄色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１７５℃(dec.)。HPLC : C18で１つのピークであった。ｋ'=2.50，65:35:0.1H₂O:MeCN:TFA、流速= １mL/min． ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ12.85-11.75(brm，COOH)，8.58(s，1H，プテリジニル 7 -CH)，8.04(d，1H，J=8.1，アミド NH)，8.00(d，1H，J=8.7，アミド NH)，7.75(br s ，1H，NH₂)．7.71(d，2H，J=8.9，芳香族CH)，7.55(br s，1H，NH₂)，7.10-6.92 (m，4H，芳香族CH)，6.82(d，2H，J=8.9，芳香族CH)，6.70(br s，2H，NH₂),4.7 9(s，2H，プテリジニル-CH₂)，4.39(m，2H，メチンs)，3.40(m，1H，シクロブチルメチン)，3.21(s ，3H，N-CH₃)，3.00(m，1H，ArCH₂)，2.88(m，1H，ArCH₂)，2.29-2.08(m，4H，g lu 4-CH₂，シクロブチル CH₂)，2.07-1.65(m，6H，glu 3-CH₂，シクロブチル CH₂)．元素分析 : Calcd．for C₃₃H₃₇N₉O₆・1.6 H₂O(MW 684.54): C，57.90; H，5.92; N ，18.42. Found: C，57.88; H，5.90; N，18.52.質量スペクトル : (Ion Spray)656(M+H)⁺．ＵＶスペクトル：(pH7 バッファー)λ_max（ε）259.5(22100)，308.0(22300)，373.7( 6740)．λ_min（ε）241.2(12900)，274.5(14600)，345.6(5130)．例１１３：６−ブロモメチル−３，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソキゾリン例４に従って、１．００ｇの３，４−ジヒドロ−２，６−ジメチル−４−オキソキナゾリン（Sen,A.B.；Gupta,J.K.J.Indian Chem．Soc.，1962，31，369）を、１．０５ｇのＮ−ブロモ琥珀酸イミド（アルドリッチ）及び０．１７ｇの過酸化ベンゾイルを用いて５０mLの１，２−ジクロロエタン中で３０min臭素化にかけ、０．９５ｇ（６４％）の６−ブロモメチル−３，４−ジヒドロ−２−メチル −４−オキソキナゾリンを褐色の固体として得た。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ8.17(s，1H，芳香族CH)，7.85(d，1H，J=8.5，芳香族CH)，7.58(d，1H，J=8.5，芳香族CH)，4.88(s，2H，ArCH₂Br)，2.39(s，3H ，CH3)．例１１４：エチル５−Ｎ−メチルアミノ−２−チオフェンカルボキシレート２．０ｇのエチル５−ブロモ−２−チオフェンカルボキシレート（Mackay， D．Can．J．Chem.，1966，44，2881-2891;Paul，H.:Migulla，H．Arch．Pharm. ，1978，311，679-691.）、２．０５ｇの沃化メチル（アルドリッチ）、及び２．５８ｇの２，６−ルチジン（アルドリッチ）の８０mLのＤＭＦ混合物を窒素下、７０℃で２４ｈ撹拌した。ｔｌｃ（ＳｉＯ₂、３：２ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）による反応混合物の分析で、Ｒｆ＝０．５１の出発物質と、Ｒｆ＝０．６０の新たな主要な成分が示された。この混合物を、更に１．７１ｇの沃化メチルと処理し、７０℃で８ｈ、ＲＴで７２ｈ、及び７０℃で更に８ｈ撹拌した。反応混合物を７５mLの水と混合し、ＥｔＯＡｃ（３×１５０mL）で抽出した。ＥｔＯＡｃ抽出物を合わせ、飽和食塩水で洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、減圧下に乾燥するまで濃縮した。粗生成物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（７５：２５ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）にかけ、０．６５ｇ（３８％）のエチル５−Ｎ−メチルアミノ−２−チオフェンカルボキシレートを茶色の固体として得た。ｍ．ｐ．＝４１〜４３℃。例１１５：エチル５−（（（３，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソ −６−キナゾリニル）メチル）メチルアミノ）−２−チオフェン−カルボキシレートコンデンサー及び磁気撹拌器を備えた１００mLの丸底フラスコに、０．６６ｇの６−ブロモメチル−３，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソキナゾリン、０．４４ｇのエチル５−Ｎ−メチルアミノ−２−チオフェンカルボキシレート、０．２５ｇの２，６−ルチジン、及び３０mLの無水ＤＭＦを充填した。この混合物を８０℃で１８ｈ撹拌した。ｔｌｃ（ＳｉＯ₂、９５：５ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）による反応混合物の分析で、出発物質と、Ｒｆ＝０．４１の新たな主要な成分が示された。この混合物を減圧下に乾燥するまで濃縮し、残渣を１１０ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（９５：５ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）にかけた。Ｒｆ＝０．４１の成分を含むフラクションを集め、濃縮して０．４２ｇ（４９％）のエチル５−（（（３，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソ−６−キナゾリニル）メチル）メチルアミノ）−２−チオフェン−カルボキシレートを淡褐色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝＞２００℃。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ12.22(br s，1H，NH)，7.92(s，1H，芳香族CH)， 7.65(d，1H，J=8.4，芳香族CH)，7.56(d，1H，J=8.5，芳香族CH)，7.48(d，1H， J=4.4，チエニル CH)，6.07(d，1H，J=4.3，チエニル CH)，4.70(s，2H，キナゾリニル-CH2)，4 .16(q，2H，J=7.2，エチル CH₂)，3.09(s，3H，N-CH₃)，2.33(s，3H，キナゾリニル 2-CH₃ )，1.22(t，3H，J=7.2，エチル CH₃)．例１１６：５−（（（３，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソ−６−キナゾリニル）メチル）メチルアミノ）−２−チオフェン−カルボンコンデンサー、温度計、及び磁気撹拌器を備えた２５mLの三口フラスコに、０．２０ｇのエチル５−（（（３，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソ−６ −キナゾリニル）メチル）メチルアミノ）−２−チオフェン−カルボキシレート、及び６mLの１ＮＮａＯＨ水溶液を充填した。得られた溶液を、窒素下においてＲＴで２５min、次いで５５℃で２ｈ撹拌した。ｔｌｃ（ＳｉＯ₂、９５：５ＣＨ₂Ｃｌ₂）による分析で、出発物質が残っていないこと、Ｒｆ＝０．０６の新たな成分が示された。この溶液をＲＴに冷却し、ロータリーエバポレーシヨンにかけ、ＥｔＯＨを除いた。残りの溶液を１０mLの水で希釈し、１ＮＨＣｌ水溶液を加えてｐＨ＝３．５に酸性化した。褐色の沈殿が精製し、これを遠心によって集め、水性懸濁−遠心− デカンテーションのサイクルで４回洗浄し、凍結乾燥して０．１１６ｇ（６３％）の５−（（（３，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソ−６−キナゾリニル）メチル）メチルアミノ）−２−チオフェン−カルボン酸を白色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１９５℃(dec.)。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ12.40-11.90(br m，COOH，NH)，7.95(s，1H，芳香族CH)，7.69(m，1H，芳香族CH)，7.58(d，1H，J=8.2，芳香族CH)，7.42(d，1H ，J=4.2，チエニル CH)，6.04(d，1H，J=4.2，チエニル CH)，4.70(s，2H，キナゾリニル-CH₂) ，3.09(s，3H，N-CH₃)，2 35(s，3H，キナゾリニル 2-CH₃)．例１１７：tert−ブチルＮ−（（５−（（（３，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソ−６−キナゾリニル）メチル）メチルアミノ）−２−チエニル）カルボニル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラにレート窒素導入管及び磁気撹拌器を備えた乾燥した５０mLの三口フラスコに、０．１１５ｇの５−（（（３，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソ−６−キナゾリニル）メチル）メチルアミノ）−２−チオフェン−カルボン酸、０．１６５ｇの tert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネート、０．０６mLのＥｔ₃Ｎ、及び７mLの無水ＤＭＦを充填した。この黄色の溶液を、０．０６mLのＤＥＣＰで処理し、窒素下、ＲＴで撹拌した。２ｈ後、ｔｌｃ（ＳｉＯ₂、９５：５ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）による残渣の分析で、Ｒｆ＝０．０２の出発物質、Ｒｆ＝０．３７の新たな主要な成分、Ｒｆ＝０．３１及び０．４０のマイナー成分が示された。この反応混合物を更に０．０３mLのＤＥＣＰ及び０．０３mLのＥｔ₃Ｎで処理し、更にＲＴで１ｈ撹拌した。ＴＬＣで更なる変換はほとんど示されなかった。この溶液を乾燥するまで減圧下に濃縮し、残渣を６０mLのＣＨＣｌ₃に溶解した。この溶液を５％ＮａＨＣＯ₃水溶液（３×５０mL）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、濃縮して、淡黄色のオイルを得た。粗生成物を、フラッシュクロマトグラフィーに二回かけ（ＳｉＯ₂、９５：５ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ；ＳｉＯ₂、９７：３ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）、０．１１９ｇ（４６％）のtert−ブチルＮ−（（５−（（（３，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソ−６−キナゾリニル）メチル）メチルアミノ）−２−チエニル）カルボニル）−５−Ｏ−tert−ブチル− Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニレートを褐色の発泡体として得た。 ¹H-NMR : (400 MHz，DMSO-d₆)δ12.19(s，1H，キナゾリン NH)，8.18(d，1H，J=7.1，アミド NH)，7.92(m，2H，アミド NH，芳香族CH)，7.63 (dd; 1H; J=7.9，1.8; 芳香族C H)，7.57(d，1H，J=4.1，チエニル CH)，7.54(d，1H，J=8.0，芳香族 CH)，7.12-6.9 4(m，4H，芳香族CH)，5.97(d，1H，J=4.1，チエニル CH)，4.63(s，2H，キナゾリニル-CH₂) ，4.40-4.27(m，2H，メチン)，3.02(s，3H，N-CH₃)，2.87(m，3H，ArCH₂，シクロペンチルメチン )，2.31(s，3H，キナゾリニル 2-CH₃)，2.20(t，2H，J=7.7，glu 4-CH₂)，1.91(m，3H，glu 3-CH₂．シクロペンチル CH₂)．1.83-1.40(m，7H，シクロペンチル CH₂)，1.35(s，9H，t-Bu)，1.27(s，9H ，t-Bu)．例１１８：Ｎ−（（５−（（（３，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソ −６−キナゾリニル）メチル）メチルアミノ）−２−チエニル）カルボニル）− Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニン例５０に従って、０．１１７ｇのtert−ブチルＮ−（（５-（（（３，４− ジヒドロ−２−メチル−４−オキソ−６−キナゾリニル）メチル）メチルアミノ）−２−チエニル）カルボニル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１ −イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニレートを２５mLのＣＨ₃ＮＯ₂ 中で４５minＨＣｌガスで処理した。減圧下にＣＨ₃ＮＯ₂を除去し、褐色の残渣を得、これを半分取逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８、７０：３０：０．１→６０：４０：０．１Ｈ₂Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ、２５分かけて）によって精製した。主要成分を含むフラクション（分析用ＨＰＬＣ、Ｃ１８、６０：４０：０．１Ｈ₂Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡｄｅｋ’＝１．６１）を集め、２５mLまで濃縮し、凍結乾燥して０．０５２ｇ（４２％）のＮ−（（５−（（（３，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソ−６−キナゾリニル）メチル）メチルアミノ）−２−チエニル）カルボニル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニンを黄色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１２５℃(dec.)。 ¹H-NMR :(300MHz，DMSO-d₆)δ8.09(d，1H，J=7.5,アミド NH)，7.93(m，2H，アミド NH 芳香族CH)，7.69(d，1H，J=8.0，芳香族CH)，7.56(m，2H，芳香族CH，チエニル CH) ，7.10-6.92(m，4H，芳香族CH)，5.97(d，1H，J=4.3，チエニル CH)，4.66(s，2H，キナゾリニル -CH₂)，4.33(m，2H，メチン),3.06(s，3H，N-CH₃)，2.99(m，1H，ArCH₂)，2.8 5(m，1H，ArCH₂)，2.38(s，3H，キナゾリニル 2-CH₃)，2.22(t，2H，J=7.5,glu 4-CH₂) ，2.02-1.37(m，10H，glu 3-CH₂，シクロペンチル CH₂)． ¹⁹F-NMR : (376MHz，DMSO-d₆)δ0.57(ＴＦＡ外部標準に対して)．元素分析: Calcd．for C₃₅H₃₉N₅O₇S・1.2 TFA・1.3 H₂O(MW 834.03): C，53.86; H 5.17; N，8.40; S，3.84.Found: C，53.85; H，5.11; N，8.36; S，3.92．質量スペクトル : (イオンスプレー)691(M+NH₄ ⁺)．ＵＶスペクトル : (pH 7 バッファー)λ_max（ε）225.2 (36600)，265.6(10300)，353. 1(22200)．λ_min（ε）214.3(35200)，252.1(9230)，288.4(4120)．例１１９：tert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｎ−（４−（（３−（２，４−ジアミノ−１，６−ジヒドロ−６−オキソ−５−ピリミジニル）プロピル）−トリフルオロアセトアミド）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３ −シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネート磁気撹拌器及び窒素導入管を備えた２５mL三口フラスコに、０．２５８ｇの４ −（Ｎ−（３−（２，４−ジアミノ− １，６−ジヒドロ−６−オキソ−５−ピリミジニル）プロピル）トリフルオロアセトアミド）安息香酸（Styles，V.L.，et al，J．Heterocyclic Chem.，1990，27 ，1809）、０．２５０ｇのtert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネート、０．０７７ｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（アルドリッチ）、５mLの無水ＤＭＦ、及び０．０７mLのＥｔ₃Ｎを充填した。この溶液を、０．１０４ｇのＤＣＣ（フルカ）で処理し、窒素下、ＲＴで２４ｈ撹拌した。この混合物を、濾過し、濾液を乾燥するまで減圧下に濃縮した。残渣を７０mLのＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解し、５％ＮａＨＣＯ₃水溶液（３×５０mL）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、濃縮して褐色のオイルを得た。この物質を、シリカゲルのフラッＭｅＯＨ）で精製し、０．３０４ｇ（７０％）のtert−ブチル５−Ｏ−tert− ブチル−Ｎ−（４−（（３−（２，４−ジアミノ−１，６−ジヒドロ−６−オキソ−５−ピリミジニル）プロピル）トリフルオロアセトアミド）−ベンゾイル） −Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネートを褐色のガラスとして得た。ｍ．ｐ．＝１２４〜１３０℃。例１２０：tert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｎ−（４−（（３−（２，４−ジアミノ−１，６−ジヒドロ−６−オキソ−５−ピリミジニル）プロピル）アミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネート窒素導入管及び磁気撹拌器を備えた１００mLの丸底フラスコに、０．２６８ｇのtert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｎ−（４−（（３−（２，４−ジアミノ−１，６−ジヒドロ−６−オキソ−５−ピリミジニル）プロピル）トリフルオロアセトアミド）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネート、及び７mLのメタノールを加えた。この溶液を、０．１８mLの４０％（ｗ／ｗ）ジメチルアミン／水（アルドリッチ）、次いで０．４５mLの水で処理し、窒素下、ＲＴで２４ｈ撹拌した。この溶液を乾燥するまで減圧下に濃縮し、残渣を６０ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（９２：８ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）にかけ、０．１８５ｇ（７８％）のtert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｎ−（４−（（３−（２，４−ジアミノ−１，６ −ジヒドロ−６−オキソ−５−ピリミジニル）プロピル）アミノ）ベンゾイル） −Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネートを濃密な透明の半固体として得た。 ¹H-NMR : (200 DMSO-d₆)δ9.80(br s，1H，ピリミジニル NH)，8.20(d，1H，J=7.2，アミド NH)，7.90(d，1H，J=8.0，アミドNH)，7.67(d，2H，J=8.6，芳香族CH)，7.20-6.98( m，4H，芳香族CH)，6.55(d，2H，J=8.6，芳香族CH)，6.25(m，1H，NH)，5.94(br s，2H，NH₂)，5.77(br s，2H，NH₂)，4.54-4.29(m，2H，メチン)，3.12-2.80(m，5 H，シクロペンチルメチン，ArCH₂，ピリミジニル- CH₂CH₂CH₂N)，2.27(m，4H，glu4-CH₂，ピリミジニル-CH₂CH₂CH₂N)，2.10-1.82(4H，glu 3-CH₂，シクロペンチルCH₂)，1.80-1.45(m，8H，シクロペンチルCH₂，ピリミジニル-CH₂CH₂CH₂N)，1. 39(s，9H，t-Bu)，1.32(s，9H，t-Bu)．例１２１：Ｎ−（４−（（３−（２，４−ジアミノ−１，６−ジヒドロ−６ −オキソ−５−ピリミジニル）プロピル）アミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニン磁気撹拌器を備えた１００mL丸底フラスコに、０．１８０ｇのtert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｎ−（４−((３−（２，４−ジアミノ−１，６−ジヒドロ−６−オキソ−５−ピリミジニル）プロピル)アミノ)ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネート及び２５mL のＣＨ₃ＮＯ₂を充填した。この混合物を、ＨＣｌガスを通して５分間バブリングすることによって酸性化したが、固体の出発物質は溶解しなかった。ｔｌｃ（ＳｉＯ₂、９２：８ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）による反応混合物の分析で、出発物質の変換は最小であることが示された。この混合物を乾燥するまで減圧下に濃縮した。黄色の残渣が生じ、これを２０mLのＣＨ₂Ｃｌ₂に懸濁し、１mLのアニソール、次いで１５mLのＴＦＡで処理した。固体は迅速に溶解し、黄色の溶液となった。この溶液を窒素下、ＲＴで撹拌した。１ｈ後、ｔｌｃで出発物質が残っていないことが示され、新たなスポットはＲｆ＝０．０であった。この溶液を乾燥するまで濃縮し、残渣を半分取逆層ＨＰＬＣ（Ｃ１８、７０：３０：０．１Ｈ₂ Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ）で精製した。純粋な物質を含有するフラクションを集め、３０mLまで濃縮し、凍結乾燥し、０．０９８ｇ（４７％）のＮ−（４−（（３ −（２，４−ジアミノ−１，６−ジヒドロ−６−オキソ−５−ピリミジニル）プロピル）アミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニンをふわふわした白色の固体を得た。ｍ．ｐ．＝１２５ ℃(dec.)。HPLC: C18で１つのピークであった。k'=1.64，70:30:0.1H₂O:MeCN:TFA、流速=１ mL/min． ¹H-NMR: (300 MHz，DMSO-d₆)δ12.91-11.10(br s，COOH，ピリミジニルNH)，8.07(d，1 H，J=7.6，アミドNH)，7.88(d，1H，J=7.9，アミドNH)，7.70(br s，1H，NH₂)，7.62(m ，3H，NH2，芳香族CH)，7.13-6.70(m，6H，NH₂，芳香族CH)，6.53(d，2H，J=8.6 ，芳香族CH)，4.40(m，2H，メチン)，3.01(m，3H，シクロペンチルメチン，ピリミジニル-CH₂CH₂CH₂ N)，2.86(m，2H,ArCH₂)，2.25(m，4H，glu 4-CH₂，ピリミジニル-CH₂CH₂CH₂N)，2.01-1 .78(m，4H，glu3-CH₂，シクロペンチルCH₂)，1.76-1.37(m，8H，シクロペンチルCH₂，ピリミジニル-CH₂ CH₂CH₂N)． ¹⁹F-NMR : (282 MHz，DMSO-d₆)δ3.92(外部標準TFAに対する相対値)．元素分析 : Calcd．for C₃₃H₄₁N₇O₇・1.8TFA・1.6H₂O(MW 881.80)：C，49.85; H ，5.26; N，11.12．Found: C，49.81; H，5.24; N，11.11．質量スペクトル : （イオンスプレー）648(M+H)⁺．ＵＶスペクトル : （pH7 バッファー)λ_max（ε）280.1(29700)．λ_min（ε）247.4(75 90)．sh（e）302.9(20400)．例１２２：ジ−tert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５ −Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−アスパルテート例９に従って、１．００ｇのＬ−アスパラギン酸ジ−ｔ−ブチルエステル塩酸塩（シグマ）を、０．７２ｇのＥＤＣ（アルドリッチ）及び０．３９mLのＮ− メチルモルホリンを用いてＮ−Ｃｂｚ−Ｌ−グルタミン酸 γ−ブチルエステル（シグマ）とカップリングした。粗生成物を８０ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（７５：２５ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、１．１０ｇ（５５％）のtert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ− tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−４−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−アスパルテートを白色の固体として得た。ｍ．ｐ．＝１１９〜１２０℃。例１２３：ジ−tert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１ −イル−Ｌ−アスパルテート例４８に従って、０．３８９ｇのtert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−４−Ｏ−tert −ブチル−Ｌ−アスパルテートを、０．０７ｇの１０％Ｐｄ（Ｃ）を用いて４０ mL ＭｅＯＨ中で水素化した。これにより０．２９ｇ（９８％）のジ−tert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−アスパルテートを濃密な透明のオイルを得た。¹Ｈ−ＮＭＲ分析のための対応するＨＣｌ塩のサンプルを、１０mgの生成物を過剰の１ＮＨＣｌエーテル溶液で処理し、乾燥するまで濃縮することによって調製した。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ8.91(d，1H J=7.8,NH)，8.31(br s，3H，NH₃ ⁺)， 4.52(m，1H，メチン)，3.83(m，1H，メチン)，2.63(d，2H，J=6.1，asp CH₂)，2.36(m ，2H，glu4-CH₂)，1.94(m，2H，glu 3-CH₂)，1.38(s，27H，t-Bu)．例１２４：ジ−tert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｎ−（４−（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ− グルタミン−１−イル−Ｌ−アスパルテート例４９に従って、０．３０ｇの４−（Ｎ−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニルメチル）−Ｎ−メチルアミノ）安息香酸半塩酸塩二水和物（アルドリッチ）を、０．３６mLのＤＥＰＣ（アルドリッチ）及び０．３９mLのＥｔ₃Ｎを用いて２５mLのＤＭＦ中において０．３４ｇのジ−tert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル −Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−アスパルテートとカップリングした。粗生成物を２回フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ₂、７：７：１ＣＨ₂Ｃｌ₂：アセトン：ＭｅＯＨ；ＳｉＯ₂９６：４→９５：５ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）にかけ０．２１３ｇ（３７％）のジ−tert− ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル− Ｌ−アスパルテートを黄色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１３０〜１３５℃ 例１２５：Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−アスパラギン酸この化合物を製造するための手順Ａは例３３を参照。例５０に従って、０．３０７ｇのジ−tert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル− Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−アスパルテートを、４０mLのＣＨ₃ＮＯ₂中でＨＣｌガスと１．５ｈ処理した。反応混合物を５mLまで濃縮し、５０mLのエーテルと混合した。得られた固体を濾過によって集め、減圧下に乾燥した。生成物を２５mLの水に溶解し、濾過し、凍結乾燥して０．２４６ｇ（８９％）のＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−アスパラギン酸を黄− 橙色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１６０℃(dec.)。HPLC :C18で１つのピークであった。k'=0.70，85:15:0.1H₂O:MeCN:TFA、流速=１m L/min． ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ13.12(br s，COOH)，9.31(s，1H，NH₂)，9.08(s ，1H，NH₂)，8.72(s，1H，プテリジニル7-CH)， 8.68(br s，1H，NH₂)，8.22(d，1H，J=8.0，アミドNH)，8.09(d，1H，J=7.9，アミドNH )，7.79(br s，1H，NH₂)，7.75(d，2H，J=8.9，芳香族CH)，6.82(d，2H，J=8.9 ，芳香族CH)，4.87(s，2H，プテリジニル-CH₂)，4.59-4.40(m，2H，メチン)，3.24(s，3H ，N-CH₃)，2.75-2.52(m，2H，asp CH₂)，2.27(t，2H，J=7.8，glu 4-CH₂)，2.10 -1.78(m，2H，glu 3-CH₂)．元素分析: Calcd．for C₂₄H₂₇N₉O₈・2HCl・1.3H₂O(MW 665.87): C，43.29; H，4.7 8; N，18.93;Cl，10.65．Found: C，43.42; H，4.90; N，18.83; Cl，10.46．質量スペクトル : (FAB)570(M+H)⁺．ＵＶスペクトル : (pH7バッファー)λ_max（ε）258.7(21900)，306.4(23800)，372.2(7 250)． λ_min（ε）240.1(13400)，272.4(15200)，345.0(5740)．例１２６：ジ−tert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５ −Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−グルタメート例９に従って、０．８８ｇのＬ−グルタミン酸ジ−tert−ブチルエステル塩酸塩（シグマ）を、０．６０ｇのＥＤＣ（アルドリッチ）及び０．３３ｇのＮ−メチルモルホリンを用いて１．００ｇのＮ−Ｃｂｚ−Ｌ−グルタミン酸 γ−ｔ− ブチルエステル（シグマ）とカップリングした。粗生成物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（７５：２５ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、１．４９ｇ（８７％）のtert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５ −Ｏ −tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタメートを濃密な透明なオイルとして得た。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ8.86(d，1H，J=7.3,NH)，8.31(br s，3H，NH₃ ⁺) ，4.21(m，1H，メチン)，3.87(m，1H，メチン)，2.35(m，4H，glu 4-CH₂)，2.07-1.66( m，4H，glu 3-CH₂)，1.39(s，27H，t-Bu)．例１２７：ジ−tert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１ −イル−Ｌ−グルタメート例４８に従って、０．６０ｇのtert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−５−Ｏ−tert− ブチル−Ｌ−グルタメートを、０．１０ｇの１０％Ｐｄ（Ｃ）を用いて４５mLのメタノール中で水素化した。これにより０．４５ｇ（９８％）のジ−tert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−グルタメートを濃密な透明なオイルとしてえた。１Ｈ−ＮＭＲ分析用の対応するＨＣｌ塩のサンプルを、過剰の１ＮＨＣｌエーテル溶液で１０mgの生成物を処理し、乾燥するまで濃縮することによって調製した。 ¹H-NMR: (200 MHz，DMSO-d₆)δ8.86(d，1H，J=7.3,NH)，8.31(br s，3H，NH₃ ⁺) ，4.21(m，1H，メチン)，3.87(m，1H，メチン)，2.35(m，4H，glu 4-CH₂)，2.07-1.66( m，4H，glu 3-CH₂)，1.39(s，27H，t-Bu)．例１２８：ジ−tert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ −グルタミン−１−イル−Ｌ−グルタメート例４９に従って、０．３０ｇの４−（Ｎ−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニルメチル）−Ｎ−メチルアミノ）安息香酸半塩酸塩二水和物（アルドリッチ）を、０．３６mLのＤＥＣＰ（アルドリッチ）及び０．３９mLのＥｔ₃Ｎを用いて２５mLのＤＭＦ中で０．３８６ｇのジ−tert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル− Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−グルタメートとカップリングした。粗生成物を１５０ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（７：７：１ＣＨ₂Ｃｌ₂：アセトン：ＭｅＯＨ）にかけ、０．４３２ｇ（７３％）のジ−tert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ− グルタメートを黄色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１３０〜１４５℃。例１２９：Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−グルタミン酸（手順Ｂ）この化合物を製造するための手順Ａは例３９参照。例５０に従って、０．３８２ｇのジ−tert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル− Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６ −プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１− イル−Ｌ−グルタメートを５０mLのＣＨ₃ＮＯ₂中でＨＣｌガスで１ｈ処理した。反応混合物を１０mLまで濃縮し、５０mLのエーテルと混合した。得られた固体を濾過によって集め、減圧下に乾燥した。生成物を２５mLの水に溶解し、濾過し、凍結乾燥して０．２６５ｇ（７６％）のＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６ −プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１− イル−Ｌ−グルタミン酸を黄−橙色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１５５℃(dec .)。HPLC: C18で１つのピークであった。k'=0.88，85:15:0.1H₂O:MeCN:TFA、流速=１ mL/min． ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ13.18(br s，COOH)，9.29(s，1H，NH₂)，9.07(s ，1H，NH₂)，8.72(s，1H，プテリジニル 7-CH)，8.69(br s，1H，NH₂)，8.19(d，1H，J =7.7，アミドNH)，8.09(d，1H，J=7.9，アミドNH)，7.87(br s，1H，NH₂)，7.74(d，2H ，J=8.9，芳香族CH)，6.81(d，2H，J=8.9，芳香族CH)，4.87(s，2H，プテリジニル-CH₂ )，4.42(m，1H，メチン)，4.19(m，1H，メチン)，3.24(s，3H，N-CH₃)，2.28(m，4H，g lu 4-CH₂)，2.07-1.71(m，4H，glu 3-CH₂)．元素分析: Calcd．for C₂₅H₂₉N₉O₈・1.9HCl・2H₂O(MW 688.87): C，43.59; H，5.1 1;N，18.30; Cl，9.78．Found: C，43.72; H，5.07; N，18.16; Cl，9.97．質量スペクトル : (FAB)584(M+H)⁺．ＵＶスペクトル : (pH 7バッファー)λ_max（ε）258.8(23700)，306.2 (25600)，371.9(7830)．λ_min（ε）240.4(14300)，272.9(16600)，344.6(6150) ．例１３０：Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−tert−ブチル −Ｌ−フェニルアラニン（手順Ｂ）この化合物を製造するための手順Ａは例９７を参照。例５０に従って、３．５１ｇのtert−ブチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−tert −ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−tert−ブチル−Ｌ−フェニルアラニネートを１５０mLのＣＨ₃ＮＯ₂中で１ｈ、ＨＣｌガスで処理した。反応混合物を減圧下にスラリーになるまで濃縮し、１００mLのエーテルと混合した。固体を真空濾過によって集め、１５０mLの６：４ＭｅＣＮ：Ｈ₂Ｏに溶解した。この溶液をロータリーエバポレーションにかけＭｅＣＮを除去し、得られた懸濁液を凍結し、凍結乾燥して３．７６７ｇ（９３％）のＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン −１−イル−３−tert−ブチル−Ｌ−フェニルアラニンを黄−橙色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１６５℃(dec.)。HPLC: C18で１つのピークであった。k'=2.30，70:30:0.1H₂O:MeCN:TFA、流速=１ mL/min． ¹H-NMR: (300 MHz，DMSO-d₆)δ13.35-12.95(br s，COOH)，9.30 (s，1H，NH₂)，9.07 (s，1H，NH₂)，8.71 (s，1H，プテリジニル7-CH)，8.68(br s，1 H，NH₂)，8.14(d，1H，J=7.6，アミドNH)，8.02(d，1H，J=7.8，アミドNH)，7.89(br s ，1H，NH₂)，7.71(d，2H，J=8.9，芳香族CH)，7.21(s，1H，芳香族CH)，7.18-7. 05(m，2H，芳香族CH)，6.98(d，1H，J=7.4，芳香族CH)，6.79(d，2H，J=8.9，芳香族CH)，4.85(s，2H，プテリジニル-CH₂)，4.39(m，2H，メチン)，3.23(s，3H，N-CH₃)， 3.03(m，1H，ArCH₂)，2.90(m，1H，ArCH₂)，2.20(t，2H，J=7.6，glu 4-CH₂)，2 .01-1.76(m，2H，glu 3-CH₂)，1.19(s，9H，t-Bu)．元素分析 : Calcd．for C₃₃H₃₉N₉O6・1.5HCl・1.8 H₂O(MW 744.85)：C，53.21; H ，5.97; N，16.92; Cl，7.14．Found: C，53.20; H，5.97; N，16.96; Cl，7.20 ．質量スペクトル: (イオンスプレー)658(M+H)⁺．ＵＶスペクトル: (pH 7バッファー)λ_max（ε）259.5(24400)，308.0(24400)，371.5 (7410)．λ_min（ε）41.4(14600)，274.2(16200)，345.1(5680). 例１３１：tert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｎ−（４−（（（１，２ −ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネート磁気撹拌器及び窒素導入管を備えた乾燥させた５０mL三口フラスコに、０．１５０ｇの４−（（（１，２−ジヒドロ −３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロ安息香酸、０．１９８ｇのtert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネート、及び７mLの無水ＤＭＦを充填した。この混合物を０℃に冷却し、０．０５８ mLのＥｔ₃Ｎ、次いで０．０６３mLのＤＥＣＰで処理した。固体の出発物質は迅速に溶解し、透明な溶液となった。この溶液をＲＴまで温め、窒素下においてＲＴで撹拌した。３ｈ後、ｔｌｃ（ＳｉＯ₂９５：５ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）でＲｆ＝０．４１の新たな主要成分とＲｆ＝０．３８及び０．０６のマイナーな成分が示された。この溶液を乾燥するまで減圧下に濃縮し、残渣を７０mLのＣＨＣｌ₃に溶解した。ＣＨＣｌ₃溶液を５％ＮａＨＣＯ₃水溶液（３×６０mL）で洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、濃縮して黄色のガラス状物を得た。この粗生成物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（９５：５→９３：７ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）で精製し、０．２５８ｇ（８０％）のtert−ブチル５−Ｏ−t ert−ブチル−Ｎ−（４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネートを透明なガラス状物として得た。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ12.54(s，1H，ベンゾキナゾリン NH)，9.86(s，1H，芳香族CH)，8.39(d，1H，J=7.6，アミドNH)，8.23(d，1H，J=9.0，芳香族CH)，8.02(d， 1H，J=8.4，芳香族CH)， 7.68-7.41(m，4H，芳香族CH，アミドNH)，7.35(m，1H，4-アミノベンゾイル NH)，7.21-6.97 (m，4H，芳香族CH)，6.56(d，1H，J=8.8，芳香族CH)，6.41(d，1H，J=15.0，芳香族CH)，4.67-4.30(m，4H，ベンゾキナゾリン 9-CH₂，メチン)，3.06-2.77(m，3H，ArCH₂，シクロペンチルメチン)，2.43(s，3H，CH₃)，2.19(m，2H，glu 4-CH₂)，2.00-1.38(m，10H ，glu 3-CH₂，シクロペンチル CH₂)，1.35(s，9H，t-Bu)，1.32(s，9H，t-Bu)．例１３２：Ｎ−（４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニン例５０に従って、０．２５ｇのtert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｎ−（４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン −９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾイル）−Ｌ−グルタミン− １−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネートを４０mLのＣＨ₃ＮＯ₂中でＨＣｌガスで１ｈ処理した。反応混合物を減圧下に濃縮し、黄色の残渣を得た。この物質のＨＰＬＣ（Ｃ１８、６５：３５：０．１Ｈ₂Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ）による分析で、ｋ’＝２．８２の主要成分とｋ’＝３．３３、１．３５、及び０．８３のマイナー成分が示された。粗生成物を半分取逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８、６５：３５：０．１Ｈ₂Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ）にかけた。純粋な生成物を含有するフラクション（分析用ＨＰＬＣで決定した。）を合わせ、乾燥するまで濃縮した。この残渣を２０mLの水と混合し、十分な１ＮＮａＯＨ水溶液で処理し、完全な溶液にした。この溶液を濾過し、１ＮＨＣｌ水溶液を加えたｐＨ３．０に酸性化した。白色の沈殿が生じ、これを遠心により単離し、水性懸濁−遠心−デカンテーションのサイクルで４回洗浄し、凍結乾燥して０．１４１ｇ（６２％）のＮ−（４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２− フルオロベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ− フェニルアラニンをふわふわした白色のの粉末として得た。ｍ．ｐ．＞２００℃ 。HPLC: C18で１つのピークであった。k'=2.77，65:55:0．1H₂O:MeCN:TFA流速=１m L/min． ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ12.90-11.80(br m，COOH，ベンゾキナゾリンNH)，9.82(s ，1H，芳香族CH)，8.27(d，1H，J=7.9，アミドNH)，8.19(d，1H，J=8.7，芳香族CH) ，7.99(d，1H，J=8.4，芳香族CH)，7.58(m，2H，芳香族CH)，7.45(m，2H，芳香族CH，アミドNH)，7.31(m，1H，4-アミノベンゾイル NH)，7.05(m，2H，芳香族CH)，6.97(d ，2H，J=7.9，芳香族CH)，6.51(d，1H，J=8.7，芳香族CH)，6.37(d，1H，J=15.2 ，芳香族CH)，4.55(d，2H，J=5.2，ベンゾキナゾリン9-CH₂)，4.43(m，2H，メチン)，3.02(m ，1H，ArCH₂)，2.82(m，2H，ArCH₂，シクロペンチルメチン)，2.41(s，3H，CH₃)，2.16(t ，2H，J=7.7，glu 4-CH₂)，1.98-1.71(m，4H，glu 3-CH₂，シクロペンチル CH₂)，1.69- 1.31(m，6H，シクロペンチル CH₂)．元素分析: Calcd．for C₄₀H₄₀N₅O₇F・0.5H₂O(MW 730.79): C，65.74; H，5.65; N ,9.58．Found: C，65.76; H，5.68;N，9.57．質量スペクトル : (FAB)722(M+H)⁺．ＵＶスペクトル : (pH7 バッファー)λ_max（ε）265.9(47900)，299.6(27300)，348.4( 5710)．λ_min（ε）240.6(19900)，284.5(24900)，340.0(3450)．sh（e）332.3( 6780)．例１３３：tert−ブチルＮ−（４−（（（２−アミノ−３，４−ジヒドロ −４−オキソ−６−キナゾリニル）メチル）（２−プロピニル）アミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネート磁気撹拌器及び窒素導入管を備えた５０mLの三口フラスコに、０，０９７ｇの４−（（（２−アミノ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−６−キナゾリニル）メチル）（２−プロピニル）アミノ）安息香酸(Jones，T.R.，et al，J．Med.Chem . ，1986，29，1114; Nair，M.G.，et al.，J．Med.Chem.，1986，29，1754; Gha zala，M，et al.，J．Med.Chem.，1986，29，1263; Acharya，S.P.，et al.，J ．Hetelocyclic Chem. ，1975，12，1283）、０．１４２ｇのtert−ブチル５− Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロプロピル−Ｌ−フェニルアラニネート、０．０４４ｇの３−ヒドロキシ１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン（アルドリッチ）及び７mLの無水ＤＭＦを充填した。この混合物を０．０５７ｇのＥＤＣで処理し、窒素下、ＲＴで撹拌した。固体の出発物質はゆっくりと溶解し、透明な溶液となった。３日後、溶液を乾燥するまで減圧下に濃縮し、残渣をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（９８：２→９５：５ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）にかけ、０．１４２ｇ（６５％）のtert −ブチルＮ−（４−（（（２−アミノ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−６− キナゾリニル）メチル）（２−プロピニル）アミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−te rt−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネートを白色の固体として得た。ｍ．ｐ．１５０℃(dec.)。例１３４：Ｎ−（４−（（（２−アミノ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ− ６−キナゾリニル）メチル）（２−プロピニル）アミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニン例５０に従って、０．１１４ｇのtert−ブチルＮ−（４−（（（２−アミノ −３，４−ジヒドロ−４−オキソ−６−キナゾリニル）メチル）（２−プロピニル）アミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル −３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネートをＣＨ₃ＮＯ₂中でＨＣｌガスで２ｈ処理した。反応混合物を乾燥するまで濃縮し、残渣を５０mLのエーテルに懸濁した。生じた固体を濾過によって集め、減圧下に乾燥した。この粗生成物を半分取逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８、６８：３２：０．１→６０：４０：０．１Ｈ₂ Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ）で精製した。純粋な生成物を含有するフラクション（分析用ＨＰＬＣで決定した。）を合わせ、乾燥するまで濃縮した。この残渣を水に懸濁し凍結乾燥して、０．０５３ｇ（４５％）のＮ−（４−（（（２−アミノ−３，４−ジヒドロ− ４−オキソ−６−キナゾリニル）メチル）（２−プロピニル）アミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニンをふわふわした白色のの粉末として得た。ｍ．ｐ．１５８℃(dec.)。HPLC : C18で２つのピークであった。k'=1.27(98.8%)，K'=0.50(1.2%)，62:38:0. 1 H₂O:MeCN:TFA流速=１mL/min． ¹H-NMR: (300 MHz，DMSO-d₆)δ12.90-11.80(br m，COOH)，8.07(d，1H，J=7.9，アミド NH)，8.03(d，1H，J=7.9，アミドNH)，7.87(s，1H，芳香族CH)，7.71(d，2H，J= 8.7，芳香族CH)，7.62(d，1H，1=8.6，芳香族CH)，7.57-7.24(br s，2H，NH₂)． 7.31(d，1H，J=8.6，芳香族CH)，7.13-6.95(m，4H，芳香族CH)，6.82(d，2H，J= 8.8，芳香族CH)，4.71(s，2H，キナゾリニル-CH₂)，4.41(m，2H，メチン)，4.30(s，2H，プロパルギル CH₂)，3.19(s，1H，プロパルギル CH)，3.10-2.77(m，3H，ArCH₂，シクロペンチルメチン) ，2.23(t，2H，J=7.6，glu 4-CH₂)，2.02-1.76(m，4H，glu 3-CH₂，シクロペンチル CH₂ )，1.75-1.38(m，6H，シクロペンチル CH₂)． ¹⁹F-NMR : (282MHz，DMSO-d₆)δ1.53(ＴＦＡ外部標準に対して)．元素分析: Calcd．for C₃₈H₄₀N₆O₇・TFA・2.2H₂O(MW 846.43): C，56.76，H，5.41 ; N，9.93．Found: C，56.79; H，5.42; N，9.95.質量スペクトル: (FAB)693(M+H)⁺．ＵＶスペクトル : (pH 7バッファー)λ_max（ε）227.2(48400)，306.4(24500)．λ_min （ε）213.5(40200)，252.2(11500)．例１３５：エチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−フェニルアラニネート磁気撹拌器と窒素導入管を備えた５００mLの丸底フラスコに、１０．０ｇのＮ −ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸 γ−エチルエステル、７．３４ｇのＬ−フェニルアラニンエチルエステル塩酸塩（アルドリッチ）、１００ mLのＣＨ₂Ｃｌ₂、及び４．１５mLのＥｔ₃Ｎを充填した。この溶液を０℃に冷却し、６．６７ｇのＤＣＣ（フルカ）の２５mLＣＨ₂Ｃｌ₂溶液で処理した。この溶液を０℃で１ｈ撹拌し、次いでＲＴに温めた。更に３時間後、混合物を濾過し、ジシクロヘキシル尿素を除去した。濾液を１０％クエン酸水溶液（３×５０mL）、飽和ＮａＨＣＯ₃水溶液（３×５０mL）、次いで６０mLの水で１回洗浄した。この溶液を無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、３０mLまで濃縮し、５０mLのエーテル、次いで１５０mLのペンタンを加えて粉末化した。生じた沈殿を濾過によって集め、減圧下に乾燥して１２．９ｇ（８２％）のエチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−フェニルアラニネートを白色の結晶性固体として得た。ｍ．ｐ．＝８５〜８７℃。例１３６：エチル５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−フェニルアラニネート例１０に従って、１３．０８ｇのエチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−フェニルアラニネートを、２．４３ｇの１０％Ｐｄ（Ｃ）及び２mLの塩化アセチルを用いて３００mLのＥｔＯＨ中で水素化し、９．８４ｇ（９４％）のエチル５−Ｏ−エチル−Ｌ− グルタミン−１−イル−Ｌ−フェニルアラニネート・ＨＣｌを白色の発泡体として得た。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ9.08(d，1H，J=7.0，NH)，7.90-7.40(br s，3H， NH₃ ⁺)，7.29(m，5H，芳香族CH)，4.50(m，1H，メチン)，4.07(m，4H，ethyl CH₂)， 3.80(m，1H，メチン)，3.04(m，2H，ArCH₂)，2.46(m，2H，glu 4-CH₂)，1.99(m，2H ，glu 3-CH₂)，1.20(t，3H，J=7.1，エチル CH₃)，1.13(t，3H，J=7.1，エチル CH₃)．例１３７：エチルＮ−（（Ｓ）−４−（エトキシカルボニル）−２−（４ −ニトロフタルイミド）ブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニネート磁気撹拌器、コンデンサー、窒素導入管、及びDean Starkトラップを備えた１Ｌ丸底フラスコに、７．２８ｇのエチル５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン−１− イル−Ｌ−フェニルアラニネート・ＨＣｌ、３．６８ｇの４−ニトロフタル酸無水物（アメリカン東京化成、ポートランド、ＯＲ、９７２０３）、３００mLのトルエン、及び２．４３ｇのジイソプロピルエチルアミン（アルドリッチ）を充填した。反応混合物を２ｈ加熱還流し、ＲＴに冷却し、窒素下、ＲＴで一夜撹拌した。トルエンをロータリーエバポレーシヨンで徐々し、残渣を４００mLのＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解した。この溶液を水（２×２００mL）、５％ＮａＨＣＯ₃水溶液（２×２５０mL）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄で乾燥した。乾燥剤を濾過によって除き、濾液を１００mLまで濃縮した。この濃縮物を沈殿が生じるまで過剰のエーテルと混合した。沈殿を濾過によって集め、減圧下に乾燥して６．７２ｇ（６７％）のエチルＮ−（（Ｓ）−４−（エトキシカルボニル）−２−（４−ニトロフタルイミド）ブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニネートを白色の固体として得た。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ8.65(m，2H，芳香族CH，NH)，8.49(s，1H，芳香族CH)，8.13(d，1H，J=8.6，芳香族CH)，7.27-7.06(m，5H，芳香族CH)，4.70(m ，1H，メチン)，4.39(m，1H，メチン)，4.04(q，2H，J=7.1，エチル CH₂)，3.93(q，2H，J =7.1，エチル CH₂)，2.94(dd; 1H，J=13.7，5.8; ArCH₂)，2.82(dd; 1H; J=13.6，9 .4; ArCH₂)，2.34(m，3H，glu 4-CH2，glu 3-CH₂)，2.18(m，1H，glu 3-CH₂)，1 .11(t，6H，J=7.1，エチル CH₃)．例１３８：エチルＮ−（（Ｓ）−２−（４−（アミノフタルイミド）−４ −（エトキシカルボニル）ブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニネート３００mLのパールの容器に１．１７ｇの１０％Ｐｄ（Ｃ）と２０mLのＥｔＯＡｃを窒素フラッシュ下で加えた。この混合物に、６．７２ｇのエチルＮ−（（Ｓ）−４−（エトキシカルボニル）−２−（４−ニトロフタルイミド）ブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニネートの２００mLＥｔＯＡｃ溶液を加えた。この混合物を窒素をバブリングすることによって脱酸素化し、４５ps iで１ｈ水素化した。容器を窒素でパージし、触媒をセライトを通して濾過して除いた。濾液を減圧下に濃縮して残渣を得、これをシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（１：１→３：７ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製した。これにより、５．６６ｇ（８８％）のエチルＮ−（（Ｓ）−２−（４−（アミノフタルイミド）−４−（エトキシカルボニル）ブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニネートを淡黄色の固体として得た。 ¹H-NMR: (300 MHz，DMSO-d₆)δ8.50(d，1H，J=7.4，NH)，7.48(d，1H，J=8.2，芳香族CH)，7 26-7.08(m，5H，芳香族CH)，6.92(s，1H，芳香族CH)，6.82(dd; 1 H，J=8.3，1.6; 芳香族CH)，6.47(s，2H，NH₂)，4.54(m，1H，メチン)，4.35(q，1H ，J=7.4，メチン)，4.07-3.86(m，4H，エチル CH₂)，2.92(m，2H，ArCH₂)，2.40-2.13( m，4H，glu 4-CH₂，glu 3-CH₂)，1.09(m，6H，エチル CH₃)．例１３９：エチルＮ−（（Ｓ）−２−（５−（アミノ−１−オキソ−２− イソインドリニル）−４−（エトキシカルボニル）ブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニネート亜鉛−水銀アマルガムを、１９．８ｇの亜鉛屑（Mallin- ckrodt，Inc.，Paris，KY，40361）を５００mLの１０％ＨＣｌ水溶液中で１０分間撹拌することによって調製した。ＨＣｌ溶液をデカンテーションし、亜鉛をｐＨが中性になるまで水で洗浄した。０．１０ｇのＨｇＣｌ₂温水溶液をこの亜鉛に加え、混合物を１０分間撹拌した。アマルガムを濾過によって集め、水、ＥｔＯＨ及びエーテルで連続的に洗浄し、空気乾燥した。乾燥したアマルガムを、氷浴で０に維持された３．０ｇのエチルＮ−（（Ｓ）−２−（４−（アミノフタルイミド）−４−（エトキシカルボニル）ブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニネート及び６０mLの１ＮＨＣｌエーテル溶液の２５０mlＥｔＯＨ溶液に加えた。０ ℃で２５min撹拌した後、ｔｌｃ（ＳｉＯ₂、３：７ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で、Ｒｆ＝０．５８の微量の出発物質と、Ｒｆ＝０．５２及び０．６３の新たな２つの成分のみが示された。反応混合物を濾過してアマルガムを除去し、濾液を２００mLまで減圧下に濃縮した。この溶液を０．５４ｇの１０％Ｐｄ（Ｃ）の存在下、５０psiで１８ｈ水素化した。触媒をセライトを通して濾過し、濾液を過剰のＮａＨＣＯ₃水溶液を加えて中和し、次いで乾燥するまで濃縮した。残渣を水及びＣＨ₂Ｃｌ₂の間に分配し、これらの層を分離した。ＣＨ₂Ｃｌ₂溶液を水（２ ×２００mL）で洗浄し、水層をＥｔＯＡｃ（２００mL）で抽出した。ＣＨ₂Ｃｌ₂ 及びＥｔＯＡｃ溶液を合わせ、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、濃縮して２．７７ｇの薄い黄色の発泡体として得た。この物質のｔｌｃ（ＳｉＯ₂、９：１ＣＨ₂Ｃｌ₂ ：アセトン）による残渣の分析で、Ｒｆ＝０．５０、０．４１、０．２９、及び０．２０の４つの主要な成分が示された。これらの物質をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（９：１ＣＨ₂Ｃｌ₂：アセトン）で分離した。¹Ｈ−ＮＭＲ分析を比較して、Ｒｆ＝０．２９の物質がエチルＮ −（（Ｓ）−２−（５−（アミノ−１−オキソ−２−イソインドリニル）−４− （エトキシカルボニル）ブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニネートであることが示された。生成物は薄い黄色の発泡体として得られた。０．６４６ｇ（２２％）． ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ8.48(d，1H，J=7.7，NH)，7.32(d，1H，J=8.2，芳香族CH)，7.14(s，5H，芳香族CH)，6.59(m，2H，芳香族CH)，5.78(s，2H，NH₂ )，4.73(m，1H，メチン)，4.43(m，1H，メチン)，4.13-3.90(m，6H，エチル CH₂，イソインドリニルメチレン)，3.07-2.85(m，2H，ArCH₂)，2.26-2.01(m，3H，glu 4-CH₂，glu 3-CH₂) ，1.88(m，1H，glu 3-CH₂)，1.12(m，6H，エチル CH₃)．例１４０：エチルＮ−（（Ｓ）−２−（５−（（（１，２−ジヒドロ−３ −メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）− １−オキソ−２−イソインドリニル）−４−（エトキシカルボニル）ブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニネート例５に従って、１．０４ｇの９−ブロモメチル−３−メチルベンゾ（ｆ）キナゾリン−（２Ｈ）−オンを、０．８４ｇのＮａＨＣＯ₃を用いて１．６５ｇのエチルＮ−（（Ｓ）−２−（５−（アミノ−１−オキソ−２−イソインドリニル） −４−（エトキシカルボニル）ブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニネートと反応した。反応混合物を５ｈ１００℃で撹拌し、ＲＴに冷却し、ＲＴで１８ｈ撹拌した。ｔｌｃ（ＳｉＯ₂、４：１ＣＨＣｌ₃：アセトン）による分析で反応が終了していないことが示された。更に、０．３ｇの９−ブロモメチル−３−メチルベンゾ（ｆ）キナゾリン−（２Ｈ）−オンを加え、反応混合物を１００℃で４ｈ撹拌した。この混合物をＲＴに冷却し、濾過して固体を除いた。粗生成物を、濾液にシリカゲルを加えることによって２５ｇのシリカゲル上に吸着させ、乾燥するまで濃縮し、減圧下で保存した。生成物／シリカゲル混合物をカラム（１０００ｇ、ＳｉＯ₂）に導入し、フラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ₂Ｃｌ₂→９５：５ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）にかけ、０．３０ｇの純粋な生成物を得た。不純物を含むクロマトグラフィーのフラクションを合わせ、濃縮し、二回目のフラッシュクロマトグラフィー（９８：２→９５：５ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）にかけ、０．２６ｇの純粋な生成物を得た。これにより、０．５６ｇ（２３％）の全収量のエチルＮ−（（Ｓ）−２−（５−(((１，２−ジヒドロ−３−メチル−１− オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル)メチル)アミノ)−１−オキソ−２− イソインドリニル）−４−（エトキシカルボニル）ブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニネートを白色の固体として得た。ｍ．ｐ．１４０℃（dec.）。例１４１：Ｎ−（（Ｓ）−４−カルボキシ−２−（５− (((１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９− イル)メチル)アミノ)−１−オキソ−２−イソインドリニル）ブタノイル）−Ｌ −フェニルアラニン磁気撹拌器及び窒素導入管を備えた１００mLの三口フラスコに、０．９０ｇのエチルＮ−（（Ｓ）−２−(５−(((１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル)メチル)アミノ)−１−オキソ−２−イソインドリニル)−４−（エトキシカルボニル）ブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニネート、３mLのＥｔＯＨ、及び１０mLの０．２ＮＮａＯＨ水溶液を加えた。この溶液を窒素下、Ｒｔで２ｈ撹拌し、１ＮＨＣｌを加えてｐＨ３．０に酸性化した。白色の沈殿が生じ、これを遠心によって分離した。この物質のＨＰＬＣ（Ｃ１８、７０：３０：０．１Ｈ₂Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ）による分析で、ｋ’＝１．９３（９０％）の主要成分とｋ’＝２．４１のマイナー成分が示された。この粗生成物を半分取逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８、７５：２５：０．１Ｈ₂Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ）で精製した。純粋な生成物を含むフラクション（上記条件を用いた分析用ＨＰＬＣによりｋ’＝１．９３）を合わせ、乾燥するまで濃縮した。残渣を１５mLの０．１ＮＮａＯＨ水溶液に溶解し、１ＮＨＣｌを加えてｐＨ３．０に調整した。得られた沈殿を遠心によって集め、水性懸濁−遠心−デカンテーションのサイクルで４回洗浄し、凍結乾燥して０．０３５ｇ（４０％）のＮ−（（Ｓ）−４−カルボキシ−２−（５−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１− オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−１−オキソ−２−イソインドリニル）ブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニンを白色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１８０℃。HPLC: C18で１つのピークであった。k'=2.3，70:30:0.10H₂O:MeCN:TFA，flow ra te=１mL/min． ¹H-NMR: (300 MHz，DMSO-d₆)δ12.83-12.56(br s，1H，COOH)，12.53(s，1H，ベンゾキナゾリン NH)，12.20-11.90(br s，1H，COOH)，9.88(s，1H，芳香族CH)，8.19(m，2 H，アミドNH，芳香族CH)，8.00(d，1H，J=8.4，芳香族CH)，7.66(d，1H，J=7.4，芳香族CH)，7.57(d，1H，J=8.7，芳香族CH)，7.33(d，1H，J=8.6，芳香族 CH)，7. 17(m 1H，イソインドリニル 5-NH)，7.03 (d，2H，J=7.2，芳香族CH)，6.90(m，3H，芳香族CH)，6.72(d，1H，J=7.8，芳香族CH)，6.59(s，1H，芳香族CH)，4.67(m，1H ，メチン)，4.57(d，2H，J=5.9，ベンゾキナゾリン9-CH₂)，4.38(m，1H，メチン)，4.02(d，1H ，J=16.8，イソインドリニルメチレン)，3.76(d，1H，J=16.9，イソインドリニルメチレン)，3.00(m，1H ，ArCH₂)，2.80(m，1H，ArCH₂)，2.41(s，3H，CH₃)，2.02(m，3H，glu 4-CH₂,gl u 3-CH₂)，1.76(m，1H，glu 3-CH₂)元素分析 : Calcd．for C₃₆H₃₃N₅O₇・2.3H₂O(MW 689.12): C，62.75;H，5.50; N， 10.16.Found:C，62.82; H，5.50; N，10.18.質量スペクトル: (FAB)648(M+H)⁺．ＵＶスペクトル: (pH 7バッファー)λ_max（ε）265.6(38900)，301.7(21100)，348.4( 4870)．λ_min（ε）245.1(19700)，284.1(18300)，341.8(3420)．sh（e）331.7( 7570)．例１４２：tert−ブチル（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−６−オキソ−２，３−ジフェニル−５−（３−（トリメチルシリル）ベンジル）−４−モルホリンカルボキシレート磁気撹拌器及び窒素導入管を備えた乾燥した２５０mLの三口フラスコに、２．０８ｇのtert−ブチル（２Ｒ，３Ｓ）−６−オキソ−２，３−ジフェニル−４ −モルホリンカルボキシレート（アルドリッチ）、１．４３ｇの３−(トリメチルシリル)ベンジルブロマイド(Yamakawa，T.，et al.，J.Med.Chem.，1990，33 ，1430)、及び４５mLの無水ＴＨＦを充填した。この溶液を−７８℃に冷却し、６．１７mLの１Ｍナトリウムビス（トリメチルシリル）アミド／ＴＨＦ（アルドリッチ）をラバーセプタムを通したシリンジを介して処理した。この溶液をＮ₂ 下、−７８℃で３．５ｈ撹拌し、次いで１５０mLの水にあけた。得られた混合物をＥｔＯＡｃ（４×５０mL）で抽出した。ＥｔＯＡｃ抽出物を合わせ、飽和食塩水（３×１００mL）で洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、減圧下に濃縮して淡黄色の液体を得た。粗生成物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（９：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、２．６ｇ（８８％）のtert−ブチル（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−６−オキソ−２，３−ジフェニル−５−（３−（トリメチルシリル）ベンジル）−４−モルホリンカルボキシレートを白色の粉末として得た。ｍ．ｐ．８８〜９０℃。例１４３：（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−６−オキソ−２，３−ジフェニル−５− （３−（トリメチルシリル）ベンジルモルホリン例８２に従って、２．４７ｇのtert−ブチル（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−６−オキソ−２，３−ジフェニル−５−（３−（トリメチルシリル）ベンジル）−４− モルホリンカルボキシレートを、４０mLのＣＨ₂Ｃｌ₂中で３ｈ、４．１mLのＴＦＡで処理した。８mLのＥｔ₃Ｎで中和し、常法で後処理し、濃密なオイルを得た。８５ｇのシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（８５：１５ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）による精製で１．７０ｇ（８３％）の（２Ｒ，３Ｓ，，５Ｓ）− ６−オキソ−２，３−ジフェニル−５−（３−（トリメチルシリル）ベンジル）モルホリンを白色の結晶性固体として得た。ｍ．ｐ．＝９４〜９５℃。例１４４：tert−ブチル３−（トリメチルシリル）−Ｌ−フェニルアラニネート例５３に従って、１．５８ｇの（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−６−オキソ−２，３− ジフェニル−５−（３−（トリメチルシリル）ベンジル）モルホリンを、０．７０ｇのＰｄＣｌ₂を用いて７０mLの１：１ＴＨＦ：ＥｔＯＨ中で水素化した。¹ Ｈ−ＮＭＲによる生成物の分析で、フェニル環の部分的な立つシリルかが示された。この混合物を、例５４に従って、２５mLのイソブチレン及び０．５mLの濃Ｈ₂ ＳＯ₄を用いて２５mL １，４−ジオキサン中でエステル化した。常法で後処理して淡黄色のオイルを得た。これはｔｌｃ（ＳｉＯ₂、ＥｔＯＡｃ）による分析で、Ｒｆ＝０．５３及び０．４７の２成分より成る。Ｒｆ＝０．５３の物質を二回のシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ、次いで１：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で単離した。これにより、０．１６１ｇ（１５％）のtert−ブチル３−（トリメチルシリル） −Ｌ−フェニルアラニネートを透明なオイルとして得た。¹Ｈ−ＮＭＲ分析用の対応するＨＣｌ塩のサンプルを、過剰の１ＮＨＣｌエーテル溶液で５mgの生成物を処理し、乾燥するまで減圧下に濃縮して調製した。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ8.53(br s，3H，NH₃ ⁺)，7.50-7.20(m，4H，芳香族CH)，4.14(m，1H，メチン)，3.21(m，1H，ArCH₂)，2.98(m，1H，ArCH₂)，1.26(s ，9H，t-Bu)，0.23(s，9H，トリメチルシリル)．例１４５：tert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ −tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（トリメチルシリル）−Ｌ− フェニルアラニネート磁気撹拌器及び窒素導入管を備えた５０mLの三口フラスコに、０．１６１ｇの tert−ブチル３−（トリメチルシリル）−Ｌ−フェニルアラニネート、０．１９４ｇのＮ−Ｃｂｚ−Ｌ−グルタミン酸 γ−tert−ブチルエステル（シグマ）、及び１０mLのＣＨ₂Ｃｌ₂を加えた。この溶液を０℃に冷却し、０．１１０ｇのＥＤＣで処理した。反応混合物を０℃で１．５ｈ撹拌し、次いでＲＴに温めた。更にＲＴで１６ｈ撹拌した後、溶液を５ｇのシリカゲルの存在下に乾燥するまで減圧下に濃縮した。得られた混合物をカラムに塗布し、生成物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（７５：２５ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で単離し、０．３２０ｇ（９５％）のtert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（トリメチルシリル）−Ｌ−フェニルアラニネートを濃密な透明のガラス状物として得た。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ8.29(d，1H，J=7.0，NH)，7.50-7.18(m，10H，芳香族CH，NH)，5.02(s，2H，PhCH₂O)，4.38(m，1H，メチン)，4.07(m，1H，メチン)，2. 97(d，2H，J=7.3，ArCH₂)，2.23(t，2H，J=7.6，glu 4-CH₂)，1.96-1.60(m，2H ，glu 3-CH₂)，1.40(s，9H，t-Bu)，1.31(s，9H，t-Bu)，0.24(s，9H，トリメチルシリル )．例１４６：tert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（トリメチルシリル）−Ｌ−フェニルアラニネート例４８に従って、０．３１５ｇのtert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（トリメチルシリル）−Ｌ−フェニルアラニネートを、０．０５１ｇの１０％Ｐｄ（Ｃ）を用いて３５mLのメタノール中で水素化した。これにより０．２４ｇ（９８％）のtert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（トリメチルシリル）−Ｌ−フェニルアラニネートを濃密な透明のオイルとして得た。この生成物を更に生成することなく次のステップに移行した。¹Ｈ−ＮＭＲ分析のための対応するＨＣｌ塩のサンプルを、過剰の１ＭＨＣｌエーテル溶液で５mg の生成物を処理し、乾燥するまで濃縮することによって調製した。 ¹H-NMR : (200 MHz DMSO-d₆)δ8.99(d，1H，J=7.2，NH)，8.28(br s，3H，NH₃ ⁺) ，7.47-7.24(m，4H，芳香族CH)，4.42(m，1H，メチン)，3.86(m，1H，メチン)，3.01(d ，2H，J=7.2，ArCH₂)，2.37(m，2H，glu 4-CH₂)，2.01 (m，2H，glu 3-CH₂)，1. 42(s，9H，t-Bu)，1.32(s，9H，t-Bu)，0.26(s，9H，トリメチルシリル）．例１４７：tert−ブチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（トリメチルシリル）−Ｌ−フェニルアラニネート例４９に従って、０．０９５ｇの４−（Ｎ−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニルメチル）−Ｎ−メチルアミノ）安息香酸半塩酸塩二水和物（アルドリッチ）を、０．１１mLのＤＥＣＰ（アルドリッチ）及び０．１２mLのＥｔ₃Ｎを用いて１１mLのＤＭＦ中で０．１２ｇのtert−ブチル５−Ｏ−tert−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（トリメチルシリル）−Ｌ−フェニルアラニネートとカップリングした。粗生成物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（７：７：１ＣＨ₂Ｃｌ₂：アセトン：ＭｅＯＨ）にかけ、０．１４１ｇ（７２％）のtert −ブチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（トリメチルシリル）−Ｌ−フェニルアラニネートを黄色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１１８〜１２５℃。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ8.58(s，1H，プテリジニル 7-CH)，8.23(d，1H，J=7.5 ，アミドNH)，8.00(d，1H，J=7.8，アミドNH)，7.74(d，2H，J=8.7，芳香族CH)，7.70( br s，1H，NH₂)，7.48(br s，1H，NH₂)，7.33(m，2H，芳香族CH)，7.22(m，2H，芳香族CH)，6.83(d，2H，J=8.8，芳香族CH)，6.63（br s，2H，NH₂)，4.79(s，2 H，プテリジニル-CH₂)，4.53-4.29(m，2H，メチン)，3.23(s，3H，N-CH₃)，2.96(d，2H，J =7.0，ArCH₂)，2.23(m，2H，glu 4-CH₂)，2.04-1.77(m，2H，glu 3-CH₂)，1.38( s，9H，t-Bu)，1.28(s，9H，t-Bu)，0.21(s，9H，トリメチルシリル)．例１４８：Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（トリメチルシリル）−Ｌ−フェニルアラニン磁気撹拌器及び窒素導入管を備えた１００mL三口フラスコに、０．１１１ｇの tert−ブチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１− イル−３−（トリメチルシリル）−Ｌ−フェニルアラニネート及び２５mLのＣＨ₃ ＮＯ₂を充填した。得られた溶液を５mLのＴＦＡで処理し、ＲＴで撹拌した。１ｈ後、この混合物を乾燥するまで減圧下に濃縮した。残渣を３mLのＣＨ₃ＮＯ₂に溶解し、この溶液を２０mLのエチルエーテルで処理した。黄色の固体が沈殿し、これを濾過によって集め、減圧下に乾燥した。生成物を３mLの１：１Ｈ₂ Ｏ：ＣＨ₃ＣＮに溶解し、この溶液を５０mLの水と混合した。懸濁液が生じ、これを凍結し、凍結乾燥し、０．９０ｇ（８２％）のＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（トリメチルシリル）−Ｌ−フェニルアラニンを黄色の粉末として得た。ｍ．ｐ．１５５℃（dec.）。HPLC : C18で１つのピークであった。k'=1 .55，65:35:0.1H₂O:MeCN:TFA流速=１m L/min． ¹H-NMR: (300 MHz，DMSO-d₆)δ13.00-11.75(br s，COOH)，8.64(s，1H，プテリジニル 7-CH)，8.60(br s，1H，NH₂)，8.39(br s，1H，NH₂)，8.11(d，1H，J=7.7，アミドN H)，7.97(d，1H，J=8.1，アミドNH)，7.75-7.10(br m，2H，NH₂)，7.69(d，2H，J=8 .9，芳香族CH)，7.28(m，2H，芳香族CH)，7.14(m，2H，芳香族CH)，6.79(d，2H ，J=8.9，芳香族CH)，4.82(s，2H，プテリジニル-CH₂)，4.39(m，2H，メチン)，3.21(s，3 H，N-CH₃)，3.02(m，1H，ArCH₂)，2.88(m，1H，ArCH₂)，2.20(t，2H，J=7.8，gl u 4-CH₂)，2.00-1.72(m，2H，glu 3-CH₂)，0.17(s，9H，トリメチルシリル)．元素分析 : Calcd．for C₃₂H₃₉N₉O₆Si-0.8TFA・1.2 H₂O(MW 786.64)：C，51.30; H ，5.41; N，16.03．Found: C，51.24，H，5.39; N，16.07．質量スペクトル: (FAB)674(M+H)⁺．ＵＶスペクトル: (pH 7バッファー)λ_max（ε）259.5(23500)，308.0(24300)，373.2( 7210)．λ_min（ε）240.7(12700)，273.9(15500)，345.0(5210)．例１４９：tert−ブチル３−ヨード−Ｌ−チロシネート３−Ｌ−ヨードチロシン（アルドリッチ）及び２．５mLの濃Ｈ₂ＳＯ₄の８５mL １，４−ジオキサンの混合物を、３００mLの圧力容器内の３０mlの液体イソブチレン（−７８℃で凝縮した。）に加えた。容器に栓をし、内容物をＲＴでかく反した。３日後、容器を氷水浴で冷却し、開放し、溶液を１０ｇのＮａＨＣＯ₃の１５０mLの水混合物にあけた。得られた混合物を、ロータリーエバポレーションにかけ、イソブチレン及びジオキサンを除去した。白色の固体が生じ、これを濾過によって集め、減圧下に乾燥した。ｔｌｃ（ＳｉＯ₂、９５：５ＣＨ₂Ｃｌ₂ ：ＭｅＯＨ）による分析で、Ｒｆ＝０．５２及びＲｆ＝０．６０の主要成分及びマイナー成分がそれぞれ示された。粗生成物を、シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（９５：５ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）で精製し、３．４ｇ（５８％）のtert−ブチル３−ヨード−Ｌ−チロシネートを白色の結晶性固体として得た。ｍ．ｐ．＝１５８〜１５９℃。例１５０：tert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−４−Ｏ −（（ベンジルオキシ）カルボニル）− ３−ヨード−Ｌ−チロシネート磁気撹拌器及び窒素導入管を備えた５００mLの丸底フラスコに、５．１５ｇの tert−ブチル３−ヨード−Ｌ−チロシネート、２５０mLの１，４−ジオキサン、及び４．５５mLのＥｔ₃Ｎを充填した。得られた溶液を、４．６６mLのクロロ蟻酸ベンジルをゆっくり加えることにより処理した。３０min後、ｔｌｃ（ＳｉＯ₂、８：２ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）による分析で、出発物質が残っていないこと、及びＲｆ＝０．５０の新たな単一の成分が示された。この溶液を減圧下に濃縮し、残渣を２００mLの水と混合した。この混合物をＥｔＯＡｃ（４×５０mL ）で抽出した。ＥｔＯＡｃ抽出物を合わせ、５％ＮａＨＣＯ₃水溶液で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、減圧下に濃縮した。粗生成物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（８：２ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）にかけ７．４９ｇ（８４％）のtert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−４−Ｏ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−３−ヨード−Ｌ−チロシネートを透明な発泡体として得た。 ¹H-NMR: (200 MHz，DMSO-d₆)δ7.77(m，2H，NH，芳香族CH)，7.53-7.21(m，12H ，芳香族CH)，5.32(s，2H，PhCH₂O)，5.20(s，2H，PhCH₂O)，4.12(m，1H，メチン) ，2.92(m，2H，ArCH₂)，1.35(s，9H，t-Bu)．例１５１：tert−ブチル３−シクロペンチル−Ｌ−チロシネート３００mLのパールの容器に、５．１３ｇのtert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−４−Ｏ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−３−ヨード−Ｌ−チロシネート，１２０mLのトルエン、３０mLのシクロペンテン及び０．４９ｇのトリ−オルト−トリルホスフィンを充填した。この溶液を１０分間窒素をバブリングすることによって脱酸素化し、０．１８２ｇのＰｄ（ＯＡｃ）２及び１．２４mLのＥｔ₃Ｎで処理した。この容器を窒素でフラッシュし、密栓し、４８ｈ１１０℃に加熱した。容器を０℃に冷却し、窒素でパージし、開放した。反応混合物を濾過し、固体を除き、濾液を減圧下に乾燥するまで濃縮した。残渣を、２００mLのＥｔＯＡｃに溶解し、この溶液を水（４×１００mL）で洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、濃縮して濃密な茶色のオイルを得た。ｔｌｃ（ＳｉＯ₂、８：２ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）による分析で、Ｒｆ＝０．５０及び０．４０の２つの主要成分が示された。この粗製混合物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（８：２ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）にかけた。これにより、２．０ｇ（４３％）のＲｆ＝０．５０の物質（これは¹Ｈ−ＮＭＲによりビス（ベンゾイルオキシカルボニル）オレフィン混合物であると同定された。）を得た。加えて、０．９０ｇ（２５％）のＲｆ＝０．４０の物質が得られ、Ｏ−ベンジルオキシカルボニル基が消失することによって生じるＮ−ベンジルオキシカルボニルオレフィン混合物であると同定された。ビス（ベンゾイルオキシカルボニル）オレフィン混合物（２．００ｇ）を、０．３５ｇの１０％Ｐｄ（Ｃ）の存在下、７０mLのＭｅＯＨ中で１８ｈ触媒水素化(４５ psi)にかけた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ₂、ＥｔＯＡｃ）にかけ、０．９９ｇ（９３％）のtert−ブチル３−シクロペンチル−Ｌ− チロシネートを透明なガラス状物として得た。Ｎ−ベンジルオキシカルボニルオレフィン混合物（０．９０ｇ）を同様に水素化し、精製して０．５２ｇ（８３％）のtert−ブチル３−シクロペンチル−Ｌ−チロシネートを得た。 ¹H-NMR (200 MHz，DMSO-d₆)δ9.05(s，1H，OH)，6.92(d，1H，J=1.9，芳香族CH) ，6.80(dd; 1H; J=8.0，2.0;芳香族CH)，6.66(d，1H，J=8.0，芳香族CH)，3.16( m，1H，シクロペンチルメチン)，2.67(d，2H，J=6.6，ArCH₂)，2.00-1.40(m，10H，シクロペンチル CH₂，NH₂)，１．３３(s，9H，t-Bu)．例１５２：tert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ −tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−チロシネート例１４５に従って、０．９９ｇのtert−ブチル３−シクロペンチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−チロシンを、０．６５ｇのＥＤＣを用いて２０mLのＣＨ₂Ｃｌ₂中で４ｈ１．０９ｇのＮ−Ｃｂｚ−Ｌ−グルタミン酸 γ−tert−ブチルエステル（シグマ）とカップリングした。粗生成物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（７：３ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、１．８ｇ（８９％）のtert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル− ３−シクロペンチル−Ｌ−チロシネートを無色の発泡体として得た。 ¹H-NMR (200 MHz，DMSO-d₆)δ9.05(s，1H，OH)，6.92(d，1H，J=1.9，芳香族CH) ，6.80(dd; 1H; J=8.0，2.0; 芳香族CH)，6.66(d，1H，J=8.0，芳香族CH)，3.16 (m，1H，シクロペンチルメチン)，2.67(d，2H，J=6.6,ArCH₂)，2.00-1.40(m，10H，シクロペンチル CH₂，NH₂)，1.33(s，9H，t-Bu)．例１５３：tert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−チロシネート例４８に従って、１．７５ｇのtert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−チロシネートを、７０mLのＭｅＯＨ中で０．２８ｇの１０％Ｐｄ（Ｃ）を用いて水素化した。粗生成物を、シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（９５：５ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）にかけ、１．２６ｇ（９２％）のtert− ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−チロシネートを白色の結晶性固体として得た。ｍ．ｐ．＝１０８〜１１０℃。例１５４：tert−ブチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル −５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル −３−シクロペンチル−Ｌ−チロシネート磁気撹拌器及び窒素導入管を備えた、乾燥した１００mLの三口フラスコに、３５mLの無水ＤＭＦ、１．１４mLのＥｔ₃Ｎ、及び０．９９mLのＤＥＣＰを加えた。得られた溶液に、１．２４ｇの４−（Ｎ−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニルメチル）−Ｎ−メチルアミノ）安息香酸半塩酸塩二水和物（アルドリッチ）を加えた。固体の出発物質がゆっくり溶解し、黄色の溶液となった。４５min後、１．６０ｇのtert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−チロシネートの８mL ＤＭＦ溶液を加えた。この溶液を、ＲＴで２４ｈ撹拌し、次いで減圧下に乾燥するまで濃縮した。残渣を１５０mLのＣＨＣｌ₃に溶解した。この溶液を、５％ＮＨ₄ＯＨ水溶液（３×７０mL ）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、減圧下に濃縮した。粗生成物を、シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーに二回かけ（７：７：１ＣＨ₂Ｃｌ₂：アセトン：ＭｅＯＨ；９３：７ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）、２．０８ｇ（８０％）のtert−ブチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１ −イル−３−シクロペンチル−Ｌ−チロシネートを黄色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１４５〜１４８℃。例１５５：Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−チロシン例５０に従って、２．０４ｇのtert−ブチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−tert −ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−チロシネートを６５mLのＣＨ₃ＮＯ₂中でＨＣｌガスで１ｈ処理した。黄色の懸濁液をスラリーになるまで濃縮し、８０mLのエチルエーテルと混合した。得られた沈殿を濾過によって集め、減圧下に濃縮した。この生成物を４０mLの８：２Ｈ₂Ｏ：ＭｅＣＮに溶解し、この溶液を濾過し、３０mLまで濃縮した。黄色の懸濁液を得、これを１５０mLの水で希釈し、凍結し、凍結乾燥して１．７１ｇ（８６％）のＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−チロシンを黄 −橙色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１７５℃（dec.）。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ13.12(br m，COOH)，9.30(s，1H，NH₂)，9.09(s ，1H，NH₂)，8.71(s，1H，プテリジニル 7-CH)，8.67(br s，1H，NH₂)，8.02(m，2H，アミド NH's)，7.78(br s，1H，NH₂)，7.71(d，2H，J=8.7，芳香族CH)，6.91(s，1H，芳香族CH)，6.79(m，3H，芳香族CH)，6.61(d，1H，J=8.1，芳香族CH)，4.86(s， 2H，プテリジニル-CH₂)，4.42(m，1H，メチン)，4.29(m，1H，メチン)，3.24(s，3H，N-CH₃) ，3.09(m，1H，シクロペンチルメチン)，2.93-2.71(m，2H，ArCH₂)，2.23(t，2H，J=7.8， glu 4-CH₂)，2.03-1.74(m，4H，glu 3-CH₂，シクロペンチル CH₂)， 1.73-1.37(m，6H，シクロペンチル CH₂)．元素分析 : Calcd．for C₃₄H₃₉N₉O₇・1.6 HCl・1.7H₂O(MW 774.70)：C，52.71; H ，5.72; N，16.27; Cl，7.32．Found: C，52.79; H，5.71; N，16.16; Cl，7.35 ．質量スペクトル : (イオンスプレー)686(M+H)⁺．ＵＶスペクトル : (pH 7 Buffier)λ_max（e）259.3(24700)，307.8(24800)，372. 5(7780)．λ_min（e）242.3(15500)，272.9(17800)，344.6(6080)．sh（e）221.3 (28900)，286.4(21100)．例１５６：３−（３−ヒドロキシ−３−ペンチル）−Ｏ−（tert−ブチルトリメチルシリル）ベンジルアルコール磁気撹拌器及び窒素導入管を備えた乾燥した２５０mLの三口フラスコに、５．０ｇの３−ヨード−Ｏ−（tert−ブチルジメチルシリル）ベンジルアルコール及び４０mLの無水エチルエーテルを加えた。この溶液を窒素下で−７８℃に冷却し、２３．２mLの１．３Ｍ sec−ブチルリチウム／シクロヘキサン（アルドリッチ）でシリンジを介して処理した。２０min後、この溶液を３．１mLの３−ペンタノン（アルドリッチ）で処理した。反応混合物を−７８℃で１．５ｈ撹拌し、次いでＲＴに暖めた。ＲＴで３ｈ後、この溶液に５mLの水を加えて反応を停止、数分間撹拌し、次いで８０mLの水と混合した。二層を分離し、水層を更に５０mLのエーテルで抽出した。エーテル抽出物を最初のエーテル溶液と合わせた。この溶液を飽和食塩水（３×５０mL）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、濃縮して透明な液体を得た。ｔｌｃ（ＳｉＯ₂、９：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）による分析で、Ｒｆ＝０．４７の主要な新たな成分が示された。粗生成物を、シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（９：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、３．９ｇ（８８％）の３−（３−ヒドロキシ−３−ペンチル）−Ｏ−（tert−ブチルトリメチルシリル）ベンジルアルコールを透明な液体として得た。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ7.33(s，1H，芳香族CH)，7.26(m，2H，芳香族CH) ，7.12(m，1H 芳香族CH)，4.72(s，2H，ArCH₂O)，4.48(s，1H，OH)，1.72(m，4H ，ペンチル CH₂)，0.90(s，9H，t-Bu)，0.64(t，6H，J=7.5，ペンチル CH3)，0.06(s，6H ，SiMe₂). 例１５７：３−（３−ペンチル）ベンジルアルコール窒素導入管及び磁気撹拌器を備えた２５０mLの丸底フラスコに、３．９ｇの３ −（３−ヒドロキシ−３−ペンチル）−Ｏ−(tert−ブチルトリメチルシリル）ベンジルアルコール及び２５mLのＣＨ₂Ｃｌ₂を充填した。この溶液を氷浴中で０ ℃に冷却し、１５mLのＴＦＡ、次いで５mLのＥｔ₃ＳｉＨ（アルドリッチ）でで処理した。０℃で３０min後、氷浴を除去し、溶液をＲＴで１８ｈ撹拌した。この溶液を粘稠なオイルになるまで濃縮した。この物質をエーテル（６０mL）に溶解し、５％ＮａＨＣＯ₃水溶液（３×５０mL）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、減圧下に濃縮した。得られた液体を１０mLのＴＨＦに溶解し、６３mLの１ＭＢｕ₄ＮＦ／ＴＨＦ（アルドリッチ）で処理した。ＲＴで１８ｈ撹拌した後、溶液を濃縮し、得られたシロップを８０mLの水と混合した。この混合物をエーテル（４×３０mL）で抽出した。抽出物を合わせ、５％のＮａＨＣＯ₃水溶液（３ ×５０mL）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、濃縮して淡黄色の液体を得た。ｔｌｃ（ＳｉＯ₂、９：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）による分析で、Ｒｆ＝０．３０新たな主要成分が示された。この粗生成物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（８５：１５ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、１．８４ｇ（８２％）の３−（３−ペンチル）ベンジルアルコールを透明な溶液として得た。 ¹H-NMR: (300 MHz，DMSO-d₆)d 7.21(t，1H，J=7.5，芳香族CH)，7.10(m，2H，芳香族CH)，6.99(d，1H，J=7.4，芳香族CH)，5.12(t，1H，J=5.8，OH)，4.46(d，2 H，J=5.8，ArCH₂O)，2.26(m，1H，ペンチルメチン)，1.62(m，2H，ペンチル CH₂)，1.49(m ，2H，ペンチル CH₂)，0.69(t，6H，J=7.4，ペンチル CH₃)．例１５８：３−（３−ペンチル）ベンジルブロマイド例１７に従って、１．８４ｇの３−（３−ペンチル）ベンジルアルコールを、２５mLの無水ＣＨ₂Ｃｌ₂中において０．３４mLのＰＢｒ₃で処理し、２．２３ｇ（９０％）の３−（３−ペンチル）ベンジルブロマイドを透明な液体として得た。 ¹H-NMR: (200 MHz，DMSO-d₆)ｄ7.26(m，3H，芳香族CH)，7.12(m，1H，芳香族CH) ，4.70(s，2H，ArCH₂)，2.33(m，1H，ペンチルメチン)，1.78-1.40(m，4H，ペンチル CH₂) ，0.73(t，6H，J=7.3，ペンチル CH₃)．例１５９：tert−ブチル（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−６−オキソ−２，３−ジフェニル−５−（３−（３−ペンチル）ベンジル）−４−モルホリンカルボキシレート例１４２に従って、３．２７ｇのtert−ブチル（２Ｒ，３Ｓ）−（−）−６ −オキソ−２，３−ジフェニル−４−モルホリンカルボキシレートを、７０mLの無水ＴＨＦ中で、９．７１mLの１Ｍナトリウムビス（トリメチルシリル）アミドのＴＨＦ溶液を用いて２．２３ｇの３−（３−ペンチル）ベンジルブロマイドでアルキル化した。粗生成物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（９：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）にかけ、次いでＥｔＯＨ−水から再結晶し、２．２６ｇ（４８％）のtert−ブチル（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−６−オキソ−２，３ −ジフェニル−５−（３−（３−ペンチル）ベンジル）−４−モルホリンカルボキシレートを白色の結晶性固体として得た。ｍ．ｐ．＝１４３〜１４４℃。例１６０：（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−６−オキソ−２，３−ジフェニル−５− （３−（３−ペンチル）ベンジル）−４−モルホリン磁気撹拌器及び窒素導入管を備えた２５０mL丸底フラスコに、２．１９ｇのte rt−ブチル（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−６−オキソ−２，３−ジフェニル−５−（３−（３−ペンチル）ベンジル）−４−モルホリンカルボキシレート及び４５mL の無水ＣＨ₂Ｃｌ₂を加えた。この溶液を０℃に冷却し、３．５mLのＴＦＡで処理した。この溶液をＲＴに暖め、窒素下で撹拌した。５ｈ後、ｔｌｃ（ＳｉＯ₂、９：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）による分析で、微量の未反応の出発物質と、Ｒｆ＝０．４２の新たな主要成分が示された。この反応混合物を１５０mLの６％ＮａＨＣＯ₃水溶液にあけ、数分間撹拌した。層を分離し、水性部分を更に４０mLのＣＨ₂Ｃｌ₂で３回抽出した。抽出物を初めのＣＨ₂Ｃｌ₂溶液と合わせ、５％ＮａＨＣＯ₃水溶液（３×６０mL）で洗浄した。この溶液を無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、濃縮して淡褐色の固体を得た。この物質を、シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（８５：１５ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、１．４７ｇ（８４％）の（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−６−オキソ−２，３−ジフェニル−５−（３−（３−ペンチル）ベンジル）−４−モルホリンを白色の結晶性固体として得た。分析用のサンプルをＥｔＯＨ−Ｈ₂Ｏから再結晶して調製した。融点９６〜９７℃。例１６１：３−（３−ペンチル）−Ｌ−フェニルアラニン３００mLのパールの容器に０．４１ｇのＰｄＣｌ₂、１．３６ｇの（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−６−オキソ−２，３−ジフェニル−５−（３−（３−ペンチル）ベンジル）−４−モルホリン、５０mLのＥｔＯＡｃ及び３０mLのＴＨＦ加えた。この混合物を１０分間窒素をバブリングして脱酸素化し、４５psiで１８ｈ水素化した。容器を窒素でパージし、触媒をセライトを通して濾過して除き、濾液を減圧下に１５mLの容積まで濃縮した。この溶液を氷浴で冷却し、更に５０mLのヘキサンを加えて粉末化した。細かい沈殿がゆっくり生成した。５℃で一夜保存した後、固体を濾過によって集め、減圧下に乾燥して０．６５ｇ（７２％）の３−（３−ペンチル）− Ｌ−フェニルアラニン・ＨＣｌを白色の粉末として得た。ｍ．ｐ．１７０℃（de c.）。例１６２：tert−ブチル３−（３−ペンチル）−Ｌ−フェニルアラニネート例５４に従って、０．６０ｇの３−（３−ペンチル）−Ｌ−フェニルアラニン・ＨＣｌを０．５mLの濃Ｈ₂ＳＯ₄の存在下、３５mLの１，４−ジオキサン中で３０mLのイソブチレンで処理した。常法により後処理をし、次いで遊離のアミンを１ＮＨＣｌエーテル溶液で酸性化し、０．５３ｇ（７４％）のtert−ブチル３ −（３−ペンチル）−Ｌ−フェニルアラニネート・ＨＣｌを黄色のガラス状物として得た。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ8.63(br s，3H，NH₃ ⁺)，7.28(t，1H，J=7.45，芳香族CH)，7.10(m，3H，芳香族CH)，4.12(m，1H，メチン)，3.23(dd; 1H;J=13.9，5. 1;ArCH₂)，2.96(dd; 1H; J=13.9，9.1; ArCH₂)，2.32(m，1H，ペンチルメチン)，1.78- 1.40(m，4H，ペンチル CH₂)，1.28(s，9H，t-Bu)，0.74(t，6H，J=7.3，ペンチル CH₃)．例１６３：tert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ −tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１− イル−３−（３−ペンチル）−Ｌ−フェニルアラニネート例１４５に従って、０．５３ｇのtert−ブチル３−（３−ペンチル）−Ｌ− フェニルアラニネート・ＨＣｌを、０．３３ｇのＥＤＣ及び０．１８mLのＮ−メチルモルホリンを用いて１５mLの無水ＣＨ₂Ｃｌ₂中で０．５５ｇのＮ−Ｃｂｚ− Ｌ−グルタミン酸 γ−tert−ブチルエステルとカップリングした。粗生成物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（８：２ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、０．８０ｇ（８１％）のtert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（３−ペンチル）−Ｌ−フェニルアラニネートを白色の結晶性固体として得た。ｍ．ｐ．＝５０〜５３℃。例１６４：tert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（３−ペンチル）−Ｌ−フェニルアラニネート例４８に従って、０．７２ｇのtert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（３−ペンチル）−Ｌ−フェニルアラニネートを、７０mLのＭｅＯＨ中で０．１２ｇの１０％Ｐｄ（Ｃ）を用いて水素化した。これにより０．５１ｇ（９１％）のtert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（３−ペンチル）−Ｌ−フェニルアラニネートを濃密な透明なオイルとして得た。¹Ｈ−ＮＭＲ分折用の対応するＨＣｌ塩のサンプルを、過剰の１ＮＨＣｌエーテル溶液で５mgの生成物を処理し、乾燥するまで減圧下に濃縮して調製した。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ9.03(d，1H，J=6.9，NH)，8.38(br s，3H，NH₃ ⁺) ，7.23(t，1H，J=7.2，芳香族CH)，7.06(m，3H，芳香族 CH)，4.39(m，1H，メチン) ，3.87(m，1H，メチン)，3.01(d，2H，J=7.4，ArCH₂)，2.35(m，3H，ペンチルメチン，glu 4-CH₂)，2.01(m，2H，glu 3-CH₂)，1.75-1.48(m，4H，ペンチル CH₂)，1.41(s，9H ，t-Bu)，1.32(s，9H，t-Bu)，0.73(t，6H，J=7.3，ペンチル CH₃)．例１６５：tert−ブチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（３−ペンチル）−Ｌ−フェニルアラニネート例４９に従って、０．１９９ｇの４−（Ｎ−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニルメチル）−Ｎ−メチルアミノ）安息香酸半塩酸塩二水和物（アルドリッチ）を、０．２４mLのＤＥＣＰ（アルドリッチ）及び０．２６mLのＥｔ₃Ｎを用いて、２５mLのＤＭＦ中で０．２５ｇのtert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ −グルタミン−１−イル−３−（３−ペンチル）−Ｌ−フェニルアラニネートとカップリングした。粗生成物を、シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーに二回かけ（７：７：１ＣＨ₂Ｃｌ₂：アセトン：ＭｅＯＨ；９５：５ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）、０．２１５ｇ（５２％）のtert−ブチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６− プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−tert−ブチル− Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（３−ペンチル）−Ｌ−フェニルアラニネートを黄色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１７５℃（dec.）。例１６６：Ｎ−（４−（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（３−ペンチル）−Ｌ−フェニルアラニン例５０に従って、０．１８４ｇのtert−ブチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−te rt−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（３−ペンチル）−Ｌ−フェニルアラニネートを２５mLのＣＨ₃ＮＯ₂中でＨＣｌガスで４５min処理した。黄色の懸濁液を乾燥するまで濃縮した。ＨＰＬＣ（Ｃ１８、６５：３５：０．１Ｈ₂ Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ）による分析で、ｋ’＝１．６１の主要成分とｋ’＝０．２５のマイナーな成分が示された。この粗生成物を半分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８、６５：３５：０．１Ｈ₂Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ）で精製した。純粋な生成物を含むフラクション（分析用ＨＰＬＣ）を合わせ、ロータリーエバポレーションにかけ、ＣＨ₃ＣＮを除去した。黄色の懸濁液が生じ、これを凍結し、凍結乾燥して０．１２ｇ（５８％）のＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−（３ −ペンチル）−Ｌ−フェニルアラニンを黄色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１２０℃（ dec.）。HPLC : one peak on C18，k'=1.61，65:35:0.1H₂O:MeCN:TFA，流速=１mL/min． ¹H -NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ12.87-11.90(br m，2H，COOH)，9.20(br s，1H，NH₂ )，9.00(br s，1H，NH₂)，8.70(s，1H，プテリジニル 7-CH)，8.60-8.23(br m，2H，N H₂)，8.11(d，1H，J=7.6，アミドNH)，7.96(d，1H，J=7.8，アミドNH)，7 70(d，2H，J =8.7，芳香族 CH)，7.07(m，1H，芳香族 CH)，6.98(d，2H，J=7.9，芳香族 CH) ，6.90(d，1H，J=7.6，芳香族 CH)，6.80(d，2H，J=8.6，芳香族 CH)，4.86(s， 2H，プテリジニル-CH₂)，4.41(m，2H，メチン)，3.23(s，3H，N-CH₃)，2.92(m，2H，ArCH₂ )，2.21(m，3H，ペンチルメチン，glu 4-CH₂)，2.03-1.77(m，2H，glu 3-CH₂)，1.68-1 .37(m，4H，ペンチル CH₂)，0.62(m，6H，ペンチル CH₃)．元素分析 : Calcd．for C₃₄H₄₁N₉O₆・1.5TFA・1.8H₂O(MW 875.22): C，50.78; H ，5.31; N，14.40．Found: C，50.76; H5.40; N，14.34質量スペクトル: (イオンスプレー)672(M+H)⁺．ＵＶスペクトル: (pH 7バッファー)λmax（ε）259.8(20000)，308.7(19800)，373.7( 5890)． λ_min（ε）241.5(11600)，275.0(13200)，345.8(4420)．例１６７：２−ヨード−４−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン磁気撹拌器を備えた２５０mLの丸底フラスコに、６０mL の発煙硫酸（アルドリッチ）及び１２．１ｇのヨウ素（アルドリッチ）を充填した。得られた暗赤色の溶液に、１０．０ｇの４−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンをゆっくり加えた。このフラスコにＣａＣｌ₂の乾燥管を取り付け、反応混合物をＲＴで１８ｈ撹拌した。次に、この混合物を３００mLの破砕氷にあけた。黄− 茶色のエマルジョンが生じ、これを、７．４ｇのチオ硫酸ナトリウムで処理し、撹拌した。得られた淡茶色の懸濁液を固体ＮａＣＯ₃を加えてｐＨ＝９に塩基性化した。これを続いて、濃Ｈ₂ＳＯ₄を加えてｐＨ５．５に酸性化した。茶色の固体が沈殿し、この固体を濾過によって集め、減圧下に乾燥した。これにより、６．５４ｇ（４１％）の２−ヨード−４−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンを茶色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＞２００℃。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆/TFA)d8.62(s，1H，芳香族 CH)，8.46(br s，3H，NH₃ ⁺ )，8.26(d，1H，J=8.5，芳香族 CH)，7.65(d，1H，J=8.5，芳香族 CH)，4.22( m，1H，メチン)，3.34(m，2H，ArCH₂)．例１６８：エチル２−ヨード−４−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニレート例８に従って、１．４０ｇの２−ヨード−４−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンを５０mLのＨＣｌエタノール溶液中で１８ｈ還流することによってエステル化した。常法により後処理し、次いでシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（９５：５ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）により１．１９ｇ（７８％）のエチル２−ヨード−４−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニレートを黄色の結晶性固体を得た。ｍ．ｐ．＝３３〜３４℃。例１６９：エチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−２−ヨード− ４−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニレート磁気撹拌器及び窒素導入管を備えた２５０mLの丸底フラスコに、４．７ｇのエチル２−ヨード−４−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニレート、１２５mLの１，４ −ジオキサン、及び２．２mLのＥｔ₃Ｎを加えた。この溶液を氷水浴で冷却し、２.２mLのクロロ蟻酸ベンジルをゆっくり添加して処理した。氷浴を除去し、反応混合物をＲＴで１８ｈ撹拌した。この混合物を濾過し、濾液を乾燥するまで濃縮した。茶色の残渣をＥｔＯＡｃに溶解し、５％ＮａＨＣＯ₃水溶液（４×７５m L）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、減圧下に濃縮した。粗生成物のｔｌｃ（ＳｉＯ₂、７５：２５ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）による分析で、Ｒｆ＝０．３５の主要な新たな成分と、Ｒｆ＝０．４０及び０．２５のマイナーな成分が示された。Ｒｆ＝０．３５の生成物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（７５：２５ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で単離した。これにより、２．０８ｇ（３２％）のエチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−２−ヨード−４−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニレートを白色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝８５〜８７ ℃。例１７０：エチル４−アミノ−２−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネート例１５１に従って、１．６５ｇのエチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−２−ヨード−４−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニレートを、６０mLのトルエン、０．０７４ｇのＰｄ（ＯＡｃ）₂、０．２０ｇのトリ−オルト−トリルホスフィン、及び０．５１mLのＥｔ₃Ｎを用いて、２０mLのシクロペンテンとヘックカップリングにかけた。反応を１１０℃で２４ｈ行った。ｔｌｃ（ＳｉＯ₂、８：２ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）による粗生成物の分析で、Ｒｆ＝０．４０の主要な生成物と、Ｒｆ＝０．３８、０．６０、及び０．９５のマイナーな成分が示された。Ｒｆ＝０．４０の物質をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（８：２ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で単離した。これにより、１．０３ｇ（７１％）の所望のオレフィン混合物を透明な液体として得た。この物質を、５５mLのＭｅＯＨ及び０．２５ｇの１０％Ｐｄ（Ｃ）を用いて、４５psiで１８ｈ触媒水素化にかけた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ₂、９９：１ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ）で精製し、０．５６ｇ（両ステップで６１％）のエチル４−アミノ−２−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネートを濃密な無色のオイルとして得た。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ6.72(d，1H，J=8.2，芳香族CH)，6.50(d，1H，J= 2.3，芳香族 CH)，6.29(dd; 1H;J=8.1，2.3; 芳香族 CH)，4.80(br s，2H，芳香族 NH₂)，4.00(q，2H，J=7.1，エチル CH₂)，3.12(m，1H，シクロペンチルメチン)，2.72(m， 2H， ArCH₂)，2.03-1.37(m，10H，シクロペンチル CH₂，NH₂)，1.11(t，3H，J=7.1，エチル CH₃) ．例１７１：エチル２−シクロペンチル−Ｌ−チロシネート窒素導入管及び磁気撹拌器を備えた５００mL三口フラスコに、０．５６ｇのエチル４−アミノ−２−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニネートの６０mLの０．１Ｍ水性Ｈ₂ＳＯ₄の溶液を加えた。３℃に冷却した後、溶液を０．１４８ｇの亜硝酸ナトリウム（アルドリッチ）の１０mL水溶液で処理した。この溶液を３ ℃で１０min撹拌し、次いで９５mLの１．５ＮＣｕＳＯ₄水溶液、次いで０．２５ｇのＣｕ₂Ｏ（アルドリッチ）で処理した。この混合物を４５℃で３５min撹拌しながら加熱した。ガスの発生がこの間に認められた。この混合物をＲＴに冷却し、濾過した。青色の濾液を１ＮＮａＯＨ水溶液で処理し、ｐＨ＝５．５にした。得られた青−緑色の懸濁液を分液ロートに移し、ＣＨＣｌ₃(５×１００mL)で抽出した。ＣＨＣｌ₃抽出物を合わせ、ＭｇＳＯ₄で乾燥し、濃縮して０．１２ｇの緑色のオイルを得た。次に青−緑色の懸濁液を、ガスの発生がやむまでＮａＨＣＯ₃で処理し、二回目のＣＨＣｌ₃での抽出（４×５０mL）を行った。抽出物を合わせ、水で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ₄）し、濃縮して０．０７６ｇのオイルを得た。このｂｖｕｓｓｉｔｕｗｏ最初の０．１２ｇの生成物と合わせ、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ₂、９５：５ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）で精製し、０．１６８ｇ（３０％）のエチル２−シクロペンチル−Ｌ−チロシネートを濃密な透明のオイルとして得た。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ9.07(s，1H，OH)，6.87(d，1H，J=8.2，芳香族 C H)，6.66(d，1H，J=2.4，芳香族 CH)，648(dd; 1H; J=8.1，2.4;芳香族 CH)，4. 00(q，2H，J=7.1，エチル CH₂)，3.16(m，1H，シクロペンチルメチン)，2.78(m，2H,ArCH₂)， 2.05-1.32(m，10H，シクロペンチル CH₂，NH₂)，1.10(t，3H，J=7.1，エチル CH₃)．例１７２：エチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−シクロペンチル−Ｌ−チロシネート例１４５に従って、０．１３５ｇのエチル２−シクロペンチル−Ｌ−チロシネートを、０．１１１ｇのＥＤＣを用いて８mLのＣＨ₂Ｃｌ₂中で４．５ｈ、０．１７１ｇのＮ−Ｃｂｚ−Ｌ−グルタミン酸 γ−エチルエステルとカップリングした。粗生成物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（１：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃ；９５：５ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）で精製し、０．２４５ｇ（７８％）のエチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−エチル− Ｌ−グルタミン−１−イル−２−シクロペンチル−Ｌ−チロシネートを無色の発泡体として得た。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ9.09(s，1H，OH)，8.37(d，1H，J=7.3NH)，7.33( m，6H，芳香族 CH，NH)，6.88(d，1H，J=8.4，芳香族 CH)，6.63(s，1H，芳香族 CH)，6.43(d，1H， J=8.3，芳香族 CH)，4.99(m，2H，PhCH₂O)，4.28(m，1H，メチン)，4.00(m，5H，エチル CH₂，メチン)，3.09(m，1H，シクロペンチルメチン)，2 96(m，1H，ArCH₂)，2.83(m，1H， ArCH₂)，2.29(t，2H，J=7.9，glu 4-CH₂)，2.02-1.53(m，8H，glu 3-CH₂，シクロペンチル CH₂)，1.46(m，2H，シクロペンチル CH₂)，1.15(t，3H，J=7.1，エチル CH₃)，1.04(t， 3H，J=7.1，エチル CH₃）．例１７３：エチル５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−シクロペンチル−Ｌ−チロシネート例４８に従って、０．２４ｇのエチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−シクロペンチル−Ｌ−チロシネートを、８５mLのＭｅＯＨ中で０．０４２ｇの１０％Ｐｄ（Ｃ）を用いて水素化した。粗生成物のフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ₂、９５：５ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）で精製し、０．１５４ｇ（８４％）のエチル５−Ｏ− エチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−シクロペンチル−Ｌ−チロシネートを濃密な透明なオイルとして得た。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ9.08(s，1H，OH)，8.23(d，1H，J=7.9，NH)，6.8 7(d，1H，J=8.1，芳香族 CH)，6.63(d，1H，J=2.1，芳香族 CH)，6.44(dd; 1H; J=8.1，2.1; 芳香族 CH)，4.31(m，1H，メチン)，4 00(m，4H，エチル CH₂)，3 12(m， 2H，glu メチン，シクロペンチルメチン)，2.98(m，1H，ArCH₂)，2.82(m，1H，ArCH₂)，2.27( t，2H，J=7.9，glu 4-CH₂)，2.00-1.35(m，12H，glu 3-CH₂，NH₂，シクロペンチル CH₂) ，1.07(t，3H，J=7.1，エチル CH₃)，1.16(t，3H，J=7.1，エチル CH₃)．例１７４：エチルＮ−（４−（（（２４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン−１ −イル−２−シクロペンチル−Ｌ−チロシネート例４９に従って、０．１３１ｇの４−（Ｎ−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニルメチル）−Ｎ−メチルアミノ）安息香酸半塩酸塩二水和物（アルドリッチ）を、０．０８mLのＤＥＣＰ（アルドリッチ）及び０．１０mLのＥｔ₃Ｎを用いて、１２mLのＤＭＦ中で０．１５ｇのエチル５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン −１−イル−２−シクロペンチル−Ｌ−チロシネートとカップリングした。粗生成物を、シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーに二回かけ（９３：７ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ；９２：８ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）、０．１３４ｇ（５２％）のエチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン−１−イル− ２−シクロペンチル−Ｌ−チロシネートを黄色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１３５〜１５０℃。 ¹H-NMR: (300 MHz，DMSO-d₆)δ9.06(s，1H，OH)，8.54(s，1H，プテリジニル 7-CH)，8 .34(d，1H，J=7.4，アミド NH)，7.96(d，1H，J=8.2，アミドNH)，7.70(d，2H，J=8.6 ，芳香族 CH)，7.63(br s，1H，NH₂)，7.43(br s，1H，NH₂)，6.86(d，1H，J=8. 4，芳香族 CH)，6.80(d，2H，J=8.9，芳香族 CH)，6.60(m，3H，芳香族 CH，NH₂)，6.40(dd; 1H; J=8.2，1.9;芳香族 CH)，4.77(s，2H，プテリジニル- CH₂)，4.42(m，1H，メチン)，4.25(m，1H，メチン)，4.07-3.89(m，4H，エチル CH₂)，3.1 9(s，3H，N-CH₃)，3.08(m，1H，シクロペンチルメチン)，2.94(m，1H，ArCH₂)，2.82(m，1 H，ArCH₂)，2.31(t，2H，J=7.9，glu 4-CH₂)，2.04-1.32(m，10H，glu 3-CH₂，シクロペンチル CH₂)，1.13(t，3H，J=7.1，エチル CH₃)，1.02(t，3H，J=7.1，エチル CH₃)．例１７５：Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−シクロペンチル−Ｌ−チロシン０．１３０ｇのエチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−エチル−Ｌ−グルタミン− １−イル−２−シクロペンチル−Ｌ−チロシネートの１０mLの１：１ＴＨＦ：Ｈ₂Ｏ溶液を、１７mgのＬｉＯＨで処理し、この溶液を窒素下、ＲＴで撹拌した。加水分解をＨＰＬＣ（Ｃ１８、７０：３０：０．１Ｈ₂Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ、流速＝１mL/min）でモニターした。３ｈ後、１０mgのＬｉＯＨを更に加えた。二回目のＬｉＯＨを添加した後、２ｈでのＨＰＬＣ分析（上記条件）で、ｋ’ ＝０．６２の単一の成分が示された。この溶液を１ＮＨＣｌを加えて中和した。黄色の沈殿が生じ、これを濾過によって集め、水性懸濁−遠心−デカンテーションのサイクルで４回洗浄し、凍結し、凍結乾燥して０．１０６ｇ（８３％）のＮ −（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−２− シクロペンチル−Ｌ−チロシンを黄色の粉末として得た。ｍ．ｐ．１８５℃（de c.）。HPLC : C18で１つのピークであった。k'=2.10，75:25:0.1H₂O:MeCN:TFA、流速=1 mL/min． ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ12.75-11.85(br m，COOH)，9.03(br s，1H，OH) ，8.56(s，1H，プテリジニル 7-CH)，8.13(d，1H，J=7.9，アミド NH)，7.96(d，1H，J=7. 8，アミド NH)，7.72(br s，1H，NH₂)，7.70(d，2H，J=8.7，芳香族 CH)，7.53(br s，1H，NH₂)，6.89(d，1H，J=8.4，芳香族 CH)，6.80(m，3H，芳香族 CH，NH₂) ，6.69(br s，1H，NH₂)，6.60(s，1H，芳香族 CH)，6.38(dd; 1H;J=8.3，2.2; 芳香族 CH)，4.78(s，2H，プテリジニル-CH₂)，4.41(m，1H，メチン)，4.22(m，1H，メチン) ，3.21(s，3H，N-CH₃)，3.12(m，1H，シクロペンチルメチン)，3.00(dd; 1H; J=14.3，5.3 ; ArCH₂)，2.76(dd; 1H; J=14.3，8.8; ArCH₂)，2.23(t，2H，J=7.9，glu 4-CH₂ )，2.05-1.30(m，10H，glu 3-CH₂，シクロペンチル CH₂)．元素分析 : Calcd．for C₃₄H₃₉N₉O₇ 2.5H₂O(MW 730.78): C，55.88; H，6.07; N ，17.25．Found: C，55.91;H，5.94;N，17.10．質量スペクトル : (イオンスプレー)686(M+H)⁺．ＵＶスペクトル : (pH 7バッファー)λ_max（ε）259.0(25000)，308.2(25500)，371.5( 7960)．λ_min（ε）243.3(16000)，273.0(17700)，346.8(6350)．sh（e）220.9( 30100)，288.1(21000)．例１７６：tert−ブチル３，５−ジヨード−Ｌ−チロシネート５．０ｇの３，５−ジヨード−Ｌ−チロシン及び０．９５mLの７０％のＨＣｌＯ₄水溶液の、１５５mL酢酸tert−ブチル溶液を窒素下、ＲＴで４日撹拌した。この溶液を１５０mLの５％ＮａＨＣＯ₃水溶液を加えて中和し、混合物をロータリーエバポレーションにかけ、酢酸tert−ブチルを除去した。灰色がかった白色の沈殿が生じ、これを濾過によって集め、減圧下に乾燥した。粗生成物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（９７：３ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）にかけ、４．２ｇ（７５％）のtert−ブチル３，５−ジヨード−Ｌ−チロシネートを白色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１６５〜１６８℃。例１７７：tert−ブチルＮ−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３，５−ジヨード−Ｌ −チロシネート例１４５に従って、１．５０ｇのtert−ブチル３，５−ジヨード−Ｌ−チロシネートを、０．６２ｇのＥＤＣを用いて４５mLのＣＨ₂Ｃｌ₂中で３ｈ、１．３１ｇのＮ−ＦＭＯＣ−Ｌ−グルタミン酸 γ−tert−ブチルエステルとカップリングした。粗生成物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（７：３ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、１．７８ｇ（６５％）のtert−ブチルＮ−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３，５−ジヨード−Ｌ−チロシネートを淡茶色の発泡体として得た。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ9.41(s，1H，OH)，8.27(d，1H，J=7.0，NH)，7.9 1(d，2H，J=7.2，芳香族 CH)，7.75(m，2H，芳香族 CH)，7.61(s，2H，芳香族 C H)，7.57-7.28(m，5H，芳香族 CH，NH)，4.26(m，4H，フルオレニル-CH₂O，フルオレニルメチン,α-メチン)，4.08(m，1H，α-メチン)，2.83(d，2H，J=7.4，ArCH₂)，2.25(t， 2H，J=7.9,glu 4-CH₂)，1.83(br m，2H，glu 3-CH₂)，1.41(s，9H，t-Bu)，1.33 (s，9H，t-Bu)．例１７８：tert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３，５−ジヨード−Ｌ−チロシネート１．６６ｇのtert−ブチルＮ−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３，５−ジヨード−Ｌ −チロシネートの７mL無水ＤＭＦ溶液へ、１．７１mLのピペリジン（シグマ）を加えた。窒素下ＲＴで１ｈ撹拌した後、溶液を７５mLの水と混合し、ＣＨ₂Ｃｌ₂ で抽出したＣＨ₂Ｃｌ₂溶液を合わせ、ＮａＣｌ水溶液（４×３０mL）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥し、減圧下に濃縮して白色の固体を得た。ｔｌｃ（ＳｉＯ₂、９５：５ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）による粗生成物の分析で、Ｒｆ＝０．４及び０．５の新たな主要成分が示された。Ｒｆ＝０．４の物質を、シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（９５：５ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）で単離し、１．１ｇ（８７％）のtert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ− トを白色の発泡体として得た。ｍ．ｐ．＝４５〜５７℃。ＮＭＲ分析のために、対応するＨＣｌ塩のサンプルを、過剰の１ＮＨＣｌエーテル溶液で１０mgの生成物を処理し、乾燥するまで減圧下に濃縮して調製した。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ9.42(br s，1H，OH)，8.98(d，1H，J=7.0，NH)， 8.33(br s，3H，NH₃ ⁺)，7.67(s，2H，芳香族 CH)，4.36(m，1H，メチン)，3.88(m， 1H，メチン)，2.86(d，2H，J=7.0，ArCH₂)，2.38(m，2H，glu 4-CH₂)，2.01(m，2H ，glu 3-CH₂)，1 41(s，9H，t-Bu)，1.35(s，9H，t-Bu)．例１７９：tert−ブチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３，５−ジヨード−Ｌ−チロシネート例１５４に従って、０．２５ｇのtert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ− グルタミン−１−イル−３，５−ジヨード−Ｌ−チロシネートを、０．０６mLのＤＥＣＰ、０．０７mLのＥｔ₃Ｎ、及び１０mLのＤＭＦを用いて、０．１３２ｇの４−（Ｎ−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニルメチル）−Ｎ−メチルアミノ）安息香酸半塩酸塩二水和物（アルドリッチ）とカップリングした。粗生成物を、シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（９５：５ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）にかけ、０．１８ｇ（５０％）のtert−ブチルＮ−（４-（（（２，４ −ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ −tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３，５−ジヨード−Ｌ−チロシネートを黄色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１７２℃（dec.）。例１８０：Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３，５−ジヨード −Ｌ−チロシン例５０に従って、０．１１９ｇのtert−ブチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−te rt−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３，５−ジヨード−Ｌ−チロシネートを１５mLのＣＨ₃ＮＯ₂中でＨＣｌガスで１ｈ処理した。黄色の懸濁液を乾燥するまで減圧下に濃縮した。¹Ｈ−ＮＭＲ及び逆相ＨＰＬＣによる分析で、マイナーな不純物を含有する所望の所望の生成物が示された。この混合物を半分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８、７７：２３：０．１Ｈ₂Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ）で精製した。純粋な生成物を含有するフラクションを合わせ、ロータリーエバポレーションにかけ、ＭｅＣＨを除いた。得られた懸濁液を凍結し、凍結乾燥して０．０２４ｇ（１８％）のＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３，５−ジヨード−Ｌ −チロシンを黄色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝２０５℃（dec.）。HPLC : C18で１つのピークであった。k’=2.74，77:23:0.1H20:MeCN:TFA、流速= １mL/min ¹H-NMR: (300 MHz，DMSO-d₆)δ13.20-11.90(brm，COOH)，9.35 (s，1H OH)，9.21(br s，1H，NH₂)，9.02(br s，1H，NH₂)，8.70(ｓ，1H，プテリジニル 7-CH)，8.52(br s，1H，NH₂)，8.13(d，1H，J=7.6，アミド NH)，7.98(d，1H，J= 7.9，アミド NH)，7.72(d，2H，J=9.0，芳香族CH)，7.57(s，2H，芳香族CH)，7.51( brs，1H，NH₂)，6.80(d，2H，J=8.9，芳香族CH)，4.86(s，2H，プテリジニル-CH₂)，4. 41(m 1H，メチン)，4.30(m，1H，メチン)，3.23(s，3H，N-CH₃)，2.81(m，2H，ArCH₂) ，2.25(t，2H，J=7.6，glu 4-CH₂)，1.90(m，2H，glu 3-CH₂)．元素分析 : Calcd．for C₂₉H₂₉N₉O₇I₂ ・1.7 TFA・2.3H₂O(MW 1104.69): C，35.23; H，3.22; N，11.41．Found: C，35.25; H，3.24; N，11.44．質量スペクトル : （イオンスプレー）870(M+H)⁺．ＵＶスペクトル : （pH 7 バッファー）λ_max（ε）219.7(48900)，258.0(26500)，306 .0(26200)， 373.3(7780)．λ_min（ε）214.9(48300)，246.0(23700)，273.7(18400)，347.6( 6200)．例１８１：メチル４−ヒドロキシ−３−ヨードベンゾエート磁気撹拌器、温度計、及びコンデンサーを備えた５００mLの三口フラスコに１０．０ｇの４−ヒドロキシ安息香酸メチル（アルドリッチ）及び３０mLの氷酢酸を加えた。この懸濁液に、１１．７４ｇの一塩化ヨウ素の３０mL氷酢酸溶液を滴下漏斗から加えた。この溶液を８０℃で１ｈ、４５℃で１８ｈ、９０℃で更に４ｈ加熱した。ＲＴに冷却し、濃密な赤橙色の懸濁液が生じ、これを１Ｌの分液漏斗に移し、５００mLのＣＨＣｌ₃に激しく振蘯することによって溶解した。暗紫色の溶液を水（２×１００mL）、飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液（２×１００mL）、及び５％ＮａＨＣＯ₃水溶液（２× １００mL）で洗浄した。淡黄色の溶液が生じ、これをＭｇＳＯ₄で乾燥し、減圧下に濃縮して白色の固体を得た。この物質を水−ＭｅＯＨから再結晶し、１４．９２ｇ（８２％）のメチル４−ヒドロキシ−３−ヨードベンゾエートを白色の結晶性固体として得た。ｍ．ｐ．＝１４５〜１４６℃。例１８２：メチル４−ヒドロキシ−３−シクロペンチルベンゾエート例１５１に従って、５．０ｇのメチル４−ヒドロキシ−３−ヨードベンゾエートを、８０mLのトルエン、０．４０ｇのＰｄ（ＯＡｃ）₂、１．１０ｇのトリ −オルト−トリルホスフィン、及び２．７６mLのＥｔ₃Ｎを用いて、２５mLのシクロペンテンとヘックカップリングにかけた。反応を１１０℃で２４ｈ行った。ｔｌｃ（ＳｉＯ₂、７５：２５ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）による粗生成物の分析で、Ｒｆ＝０．５０の主要な生成物が示された。この物質をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（７５：２５ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で単離した。これにより、２．９７ｇ（７６％）の所望のオレフィン混合物（¹Ｈ−ＮＭＲ）を茶色の固体として得た。この物質を、８０mLのＭｅＯＨ及び１．０ｇの１０％Ｐｄ（Ｃ）を用いて、４５psiで１８ｈ触媒水素化にかけた。これにより、２．５９ｇ（両ステップで６５％）のメチル４−ヒドロキシ−３ −シクロペンチルベンゾエートを白色の固体として得た。ｍ．ｐ．＝１１４〜１１６℃。例１８３：メチル４−（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ）−３−シクロペンチルベンゾエート磁気撹拌器及び窒素導入管を備えた１００mL三口フラスコに、１．７９ｇのメチル４−ヒドロキシ−３−シクロペンチルベンゾエート、１．２２ｇのイミダゾール（アルドリッチ）、３０mLの無水ＤＭＦ、及び１．４７ｇのtert-ブチルジメチルシリルクロライド（アルドリッチ）を充填した。この溶液を、窒素下、ＲＴで２４ｈ撹拌し、次いで減圧下に濃縮して、濃密なオイルを得た。この物質を、シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（９５：５ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）にかけ、２．４３ｇ（８３％）のメチル４−（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ）−３−シクロペンチルベンゾエートを透明な液体として得た。 ¹H-NMR: (200 MHz，DMSO-d₆)δ7.81(d，1H，J=2.0，芳香族CH)，7.72(dd; 1H; J =8.4，2.0; 芳香族CH)，6.93(d，1H，J=8.4，芳香族CH)，3.80(s，3H，CH₃)，3. 30(m，1H，シクロペンチルメチン)，2.06-1.37(m，8H，シクロペンチル CH₂)，0.98(s，9H，t-Bu) ，0.27(s，6H，SiMe₂)．例１８４：４−（（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ）−３−シクロペンチルベンジルアルコール磁気撹拌器及び窒素導入管を備えた１００mL三口フラスコに、２．５８ｇのメチル４−（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ）−３−シクロペンチルベンゾエート及び１５mLの無水トルエンを加えた。この溶液を氷浴で冷却し、１９．３mLの１Ｍジイソプロピルアルミニウムハイドライドのトルエン溶液（アルドリッチ）で処理した。この溶液を０℃で３０min撹拌し、ＲＴに暖めた。ＲＴで２ｈ後、この溶液を１３０mLの飽和酒石酸カリウムナトリウム水溶液にあけ、得られた混合物を２０min撹拌した。次いで、この混合物をエチルエーテル（３×７０mL）で抽出した。エーテル抽出物を合わせ、水（３×７０mL）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、濃縮して、曇ったオイルを得た。この粗生成物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（８：２ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、１．９４ｇ（８２％）の４−（（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ）−３ −シクロペンチルベンジルアルコールを透明な液体として得た。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO d₆)δ7.18(d，1H，J=2.0，芳香族CH)，7.02(dd; 1H; J =8.2，2.2; 芳香族CH)，6.76(d，1H，J=8.0，芳香族CH)，5.02(t，1H，J=5.8，O H)，4.40(d，2H，J=5.6，ArCH₂O)，3.29(m，1H，シクロペンチルメチン），2.04-1.38(m， 8H，シクロペンチル CH₂)，1.03(s，9H，t-Bu)，0.22(s，6H，SiMe₂)．例１８５：４−（（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ）−３−シクロペンチルベンジズアルデヒド１．９４ｇの４−（（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ）−３−シクロペンチルベンジルアルコールの７０mL無水ＣＨ₂Ｃｌ₂溶液を、２．０５ｇのピリジニウムクロロクロメート（アルドリッチ）で処理し、窒素下、ＲＴで撹拌した。３０min後、ｔｌｃ（ＳｉＯ₂、８５：１５ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）による分析で、出発物質が残っていないこと、及びＲｆ＝０．８０の新たな主要成分が示された。この混合物を濾過して固体を除き、濾液を５％クエン酸水溶液（４×５０mL）、次いで５％ＮａＨＣＯ₃（４×５０mL）で洗浄した。ＣＨ₂Ｃｌ₂溶液を無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、濃縮して茶色のオイルを得た。この物質をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（９：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、１．５２ｇ（７９％）の４−（（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ）−３−シクロペンチルベンジズアルデヒドを透明なオイルとして得た。 ¹H-NMR: (200 MHz，DMSO-d₆)δ9.88(s，1H，アルデヒドCH)，7.80(d，1H，J=2.0，芳香族CH)，7.69(dd; 1H; J=8.2，2.0; 芳香族CH)，7.03(d，1H，J=8.3，芳香族CH )，3.29(m，1H，シクロペンチルメチン)，208-1.43(rn，8H，シクロペンチル CH₂)，1.01(s，9H， t-Bu)，0.30(s，6H，SiMe₂)．例１８６：trans−４−（（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ）−３− シクロペンチル桂皮酸 tert−ブチル磁気撹拌器、窒素導入管及び還流コンデンサーを備えた１００mLの三口フラスコに１.５７ｇのtert−ブチルジエチルホスホノアセテート（アルドリッチ）及び２０mLの無水エチルエーテルを加えた。引き続いて、これに０．４０ｇの６０％ＮａＨの鉱油分散物を加えた。得られた濁った溶液を２５min加熱還流し、０℃に冷却し、１．５２ｇの４−（（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ）−３−シクロペンチルベンジズアルデヒドの１０mLエーテル溶液で処理した。濃密な黄色のゲルが生じ、これをスパチュラで粉砕した。この混合物をＲＴに暖め、撹拌を更に１ｈ続けた。ｔｌｃ（ＳｉＯ₂、９５：５ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）による分析で、Ｒｆ＝０．４８の新たな主要な成分と、Ｒｆ＝０．０６、０．４１及び０．９８のマイナーな成分が示された。この混合物を７０mLのエーテルで希釈し、飽和食塩水で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄で乾燥した。乾燥剤を濾過によって除き、濾液を濃縮して黄色のオイルを得た。この物質を、シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（９７：３ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、１．５３ｇ（７７％）のtr ans−４−（（tert-ブチルジメチルシリル）オキシ）−３−シクロペンチル桂皮酸tert−ブチルを透明なオイルとして得た。 ¹H-NMR: (200 MHz，DMSO-d₆)δ7.59-7.36(m，3H，芳香族CH，オレフィニック CH)，6.83 (d，1H，J=8.4，芳香族CH)，638(d，1H，J=15.8，オレフィニック CH)，3.27(m，1H，シクロペンチルメチン)，2.02-1.52(m，8H，シクロペンチル CH₂)，1.49(s，9H，t-Bu)，1.00(s，9H ，Si-t-Bu)，0.25(s，6H，SiMe₂)．例１８７：（２Ｒ，３Ｓ）−tert−ブチル３−（４−（（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ）−３−シクロペンチルフェニル）−２，３−ジヒドロキシプロピオネート磁気撹拌器及び窒素導入管を備えた２５０mLの三口フラスコに、２０mLのtert −ブチルアルコール、２０mLの水、５．３２ｇのＡＤ−ｍｉｘ−α（Sharpless ，K.B.；et al.J．Org．Chem.，1992，57，2768-2771;試薬はアルドリッチから購入した。）、及び０．３６ｇのメタンスルホンアミド（アルドリッチ）を加えた。引き続いて、これに１．５３ｇのtrans−４−（（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ）−３−シクロペンチル桂皮酸 tert−ブチルを加えた。反応混合物を窒素下、ＲＴで撹拌した。１８ｈ後、５．７ｇの亜流酸ナトリウムを加え、混合物を３０min撹拌した。この混合物を減圧下に１５mLまで濃縮し、１００mL の水で希釈し、ＥｔＯＡｃ（４×５０mL）で抽出した。ＥｔＯＡｃ抽出物を合わせ、水（３×５０mL）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、濃縮して濁ったオイルを得た。この物質を、シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（７５：２５ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、１．４４ｇ（８７％）のtert−ブチル（２Ｒ，３Ｓ）−３−（４−（（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ）−３− シクロペンチルフェニル）−２，３−ジヒドロキシプロピオネートを濃密な透明のオイルとして得た。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ7.16(s，1H，芳香族CH)，7.01(d，1H，J=8.2，芳香族CH)，6.73(d，1H，J=8.2，芳香族CH)，5.28(d，1H，J=5.4，OH)，5.25(d，1 H，J=7．1，OH)，4.55(ｔ，1H，J=5.6，プロピオネート 2-メチン)，3.93(t，1H，J=6.8，プロピオネート 3-メチン)，3.27(m，1H，シクロペンチルメチン)，2.04-1.37(m， 8H，シクロペンチル CH₂)，1.24(s，9H，t-Bu)，0.99(s，9H，Si-t-Bu)，0.21(s，6H，S iMe₂)．例１８８：（Ｒ）−tert−ブチル３−（４−（（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ）−３−シクロペンチルフェニル）−２−ヒドロキシプロピオネート３００mLのパールの容器に０．３５ｇの１０％Ｐｄ（Ｃ）と２０mLのtert−ブチルアルコールを窒素フラッシュ下で加えた。これに、１．４２ｇのtert−ブチル（２Ｒ，３Ｓ）−３−（４−（（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ）− ３−シクロペンチルフェニル）−２，３−ジヒドロキシプロピオネートの４０mL tert−ブチルアルコール溶液を加えた。この混合物を窒素を５分間、容器をtert −ブチルアルコールの凍結を防止するために穏やかに暖めながらバブリングすることによって脱酸素化した。この混合物を４滴のＨＣｌＯ₄で処理し、４５psi及び４０℃で７２ｈ水素化した。容器を窒素でパージし、触媒をセライトを通して濾過して除き、濾液を減圧下に２０mLに濃縮した。この溶液を、６０mLの５％ＮａＨＣＯ₃水溶液と混合し、この混合物をＥｔＯＡｃ（４×４０mL）で抽出した。ＥｔＯＡｃ層を合わせ、５％ＮａＨＣＯ₃水溶液（３×５０mL）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、濃縮して濁ったオイルを得た。この物質をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（９：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、１．１７ｇ（８６％）のtert−ブチル（Ｒ）−３−（４−（（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ）− ３−シクロペンチルフェニル）−２−ヒドロキシプロピオネートを濃密な透明なオイルとして得た。 ¹H-NMR : (200 MH₂，DMSO-d₆)δ7.05(d，1H，J=2.1，芳香族CH)，6.92(dd; 1H; J =8.4，2.1; 芳香族CH)，6.69(d，1H，J=8.2，芳香族CH)，5.33(d，1H，J=5.7，O H)，4.08(m，1H，メチン)，3.23(m，1H，シクロペンチルメチン)，2.78(d，2H，J=6．1，ArCH₂ )，2.00-1.38(m，8H，シクロペンチル CH₂)，1.32(s，9H，t-Bu)，0.99(s，9H，Si-t-B u)，0.20(s，6H，SiMe₂)．例１８９：（Ｓ）−tert−ブチル２−（（Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル）オキシ）−３−（４ −（（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ）−３−シクロペンチルフェニル）プロピオネート磁気撹拌器及び窒素導入管を備えた１００mLの三口フラスコに、１．１４ｇの tert−ブチル（Ｒ）−３−（４−（（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ） −３−シクロペンチルフェニル）−２−ヒドロキシプロピオネート、２０mLの無水ＴＨＦ、１．０１ｇのＮ−Ｃｂｚ−Ｌ−グルタミン酸 γ−tert−ブチルエステル（シグマ）、及び０．７８ｇのトリフェニルホスフィン（アルドリッチ）を加えた。この溶液を、０℃に冷却し、０．４７mLのジエチルアゾジカルボキシレート（アルドリッチ）を滴下することによって処理した。この溶液をＲＴに暖め、窒素下で撹拌を続けた。３．５ｈ後、ｔｌｃ（ＳｉＯ₂、８５：１５ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）による分析で、Ｒｆ＝０．４６主要な新たな成分と、Ｒｆ＝０．５１の幾つかの残りのアルコール出発物質が示された。この溶液を再度０℃に冷却し、０．１８ｇのＮ −Ｃｂｚ−Ｌ−グルタミン酸 γ−tert−ブチルエステル、０．１４ｇのトリフェニルホスフイン、及び０．０８５mLのジエチルアゾジカルボキシレートで更に処理した。ＲＴに暖め、１８ｈ撹拌した後、ｔｌｃで微量の出発物質のみが示された。この溶液を減圧下に乾燥するまで濃縮し、粗生成物を、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ₂、８５：１５ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製した。これにより１．８６ｇ（８４％）の（Ｓ）−tert−ブチル２−（（Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル）オキシ）−３−（４−（（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ）−３−シクロペンチルフェニル）プロピオネートを濃密なと名なオイルとして得た。 ¹H-NMR : (200 MH₂，DMSO-d₆)δ7.76(d，1H，J=8.0，NH)，7.34(m，5H，芳香族CH )，7.11(s，1H，芳香族CH)，6.96(d，1H，J=8.1，芳香族CH)，6.68(d，1H，J=8. 1，芳香族CH)，5.01(m，3H，PhCH₂O，プロピオネートメチン)，4.19(m，1H，glu メチン)，3. 21(m，1H，シクロペンチルメチン)，3.01(d，2H，J=5.1，ArCH₂)，2.32(t，2H，J=7.8，gl u4-CH₂)，2.12-1.43(m，10H，glu3-CH₂，シクロペンチル CH₂)，1.39(s，9H，t-Bu)，1. 26(s，9H，t-Bu)，0.98(s，9H，Si-t-Bu)，0.19(s，9H，SiMe₂)．例１９０：（Ｓ）−tert−ブチル２−（（Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル）オキシ）−３−（３−シクロペンチル−４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート１．８５ｇの（Ｓ）−tert−ブチル２−（（Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル）オキシ）−３−（４ −（（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ）−３−シクロペンチルフェニル）プロピオネートの２０mL無水ＴＨＦ溶液を、２．６３mLの１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライド／ＴＨＦ（アルドリッチ）で処理し、窒素下、０℃で撹拌した。１５min後、ｔｌｃ（ＳｉＯ₂、７５：２５ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）による分析で、出発物質が残っていないこと、及びＲｆ＝０．４１の単一の新たな成分が示された。この溶液を８０mLの水と混合し、ＥｔＯＡｃ（４×４０mL）で抽出した。ＥｔＯＡｃ抽出物を合わせ、飽和食塩水（３×６０mL）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、減圧下に濃縮して透明なオイルを得た。この物質をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（７５：２５ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）にかけ、１．５ｇ（９６％）の（Ｓ）−tert−ブチル２−（（Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル）オキシ）−３−（３−シクロペンチル−４−ヒドロキシフェニル）プロピオネートを白色の発泡体として得た。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ9.11(s，1H，OH)，7.77(d，1H，J=8.2，NH)，7.3 3(m，5H，芳香族CH)，701(d，1H，J=1.6，芳香族CH)，8.85(dd; 1H; J=8.2;1.7，芳香族CH)，6.68(d，1H，J=8.2，芳香族C H)，5.04(s，2H，PhCH₂O)，4.97(m，1H，プロピオネートメチン)，4.18(m，1H，glu メチン) ，3.17(m，1H，シクロペンチルメチン)，2.96(d，2H，J=6.0，ArCH₂)，2.34(t，2H，J=7.4 ，glu 4-CH₂)，2.13-1.43(m，10H，glu 3-CH₂，シクロペンチル CH₂)，1.40(s，9H，t-B u)，1.29(s，9H，t-Bu) 例１９１：（Ｓ）−tert−ブチル２−（（５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル）オキシ９−３−（３−シクロペンチル−４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート例４８に従って、１．４９ｇの（Ｓ）−tert−ブチル２−（（Ｎ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル）オキシ）−３−（３−シクロペンチル−４−ヒドロキシフェニル）プロピオネートを、７０mLのＭｅＯＨ中で０．２４ｇの１０％Ｐｄ（Ｃ）を用いて水素化した。粗生成物のｔｌｃ（ＳｉＯ₂、４：６ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）による分析で、Ｒｆ＝０．４７の主要成分と、Ｒｆ＝０．６０及び０．１５のマイナーな成分が示された。粗生成物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（４：６ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、０．７６ｇ（６５％）の（Ｓ）−tert−ブチル２−（（５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル）オキシ）− ３−（３−シクロペンチル−４−ヒドロキシフェニル）プロピオネートを白色の発泡体として得た。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ9.12(s，1H，OH)，7.00(s，1H，芳香族CH)，6.86 (d，1H，J=8.2，芳香族CH)，6.68(d，1H，J=8.2，芳香族CH)，4.92(t，1H，J=6. 2，プロピオネートメチン)，4.04(q，1H，J=7.0，glu メチン)，3.19(m，1H，シクロペンチルメチン)， 2.95(d，2H，J=6.4，ArCH₂)，2.33(t，2H，J=7.4，glu 4-CH₂)，2.00-1.48(m，1 2H，glu 3-CH₂，NH₂，シクロペンチル CH₂)，1.39(s，9H，t-Bu)，1.31(s，9H，t-Bu)．例１９２：（Ｓ）−tert−ブチル３−（３−シクロペンチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−（（５−Ｏ−tert−ブチル−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン −１−イル）オキシ）−プロピオネート例１５４に従って、０．４１４ｇの（Ｓ）−tert−ブチル２−（（５−Ｏ− tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル）オキシ）−３−（３−シクロペンチル−４−ヒドロキシフェニル）プロピオネートを、０．１９mLのＤＥＣＰ、０．２３mLのＥｔ₃Ｎ、及び２５mLのＤＭＦを用いて、０．３２ｇの４−（Ｎ−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニルメチル）−Ｎ−メチルアミノ）安息香酸半塩酸塩二水和物（アルドリッチ）とカップリングした。粗生成物を、シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（１４：１４：１ＣＨ₂Ｃｌ₂：ｅＯＨ）にかけ、０．４６ｇ（６９％）の（Ｓ）−tert−ブチル３−（３−シクロペンチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−（（５−Ｏ−tert−ブチル−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル）オキシ）−プロピオネートを黄色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１３５〜１３７℃。 ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ9.07(s，1H，OH)，8.55(s，1H，プテリジニル 7-CH)，8 .30(d，1H，J=7.6，アミド NH)，7.71(d，2H，J=8.6，芳香族CH)，7.64(br s，1H， NH₂)，7.42(br s，1H，NH₂)，6.97(d，1H，J=1.6，芳香族CH)，6.80(m，3H，芳香族CH)，6.59(m，3H，芳香族CH，NH₂)，4.92(t，1H，J=6.1，プロピオネートメチン)，4. 77(s，2H，プテリジニル-CH₂)，4.49(m，1H，glu メチン)，3.19(s，3H，N-CH₃)，3.12(m ，1H，シクロペンチルメチン)，2.93(m，2H，ArCH₂)，2.33(t，2H，J=7.2，glu 4-CH₂)，2 .08(m，1H，glu 3-CH₂)，1.87(m，3H，glu 3-CH₂，シクロペンチル CH₂)，1.77-1.40(m ，6H，シクロペンチル CH₂)，1.36(s，9H，t-Bu)，1.25(s，9H，t-Bu)．例１９３：（Ｓ）−３−（３−シクロペンチル−４−ヒドロキシフェニル） −２−（（Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル）オキシ）−プロピオネート例５０に従って、０．４３ｇの（Ｓ）−tert−ブチル３−（３−シクロペンチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−（（５−Ｏ−tert−ブチル−（４−（（（２，４−ジアミノ −６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン− １−イル）オキシ）プロピオネートを、５０mLのＣＨ₃ＮＯ₂中でＨＣｌガスと４５min処理した。黄色の懸濁液を乾燥するまで濃縮した。この生成物を２５mLの水に懸濁し、十分な１ＮＮａＯＨ水溶液で処理し、完全な溶液を得た。この溶液を濾過し、１ＮＨＣｌを添加してｐＨを５．５に調製した。黄色の沈殿が生じ、これを遠心で分離し、水性懸濁−遠心−デカンテーションのサイクルで４回洗浄し、凍結し、凍結乾燥して０．３４５ｇ（８８％）の（Ｓ）−３−（３−シクロペンチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−（（Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル）オキシ）プロピオネートを黄−橙色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１６５℃（dec.）。HPLC: Ｃ１８で１つのピークであった。k'=2.02; ３．６％のメトトレキゼートがｋ’＝０．０９で検出された；70:30:0.1 H₂O:MeCN:TFA、流速=１mL/min． ¹H-NMR: (300 MHz，DMSO-d₆)δ12.40-11.90(br s，COOH)，9.03(br s，1H，OH) ，8.57(s，1H，プテリジニル 7-CH)，8.27(d，1H，J=7.6，アミド NH)，7.86(br s，1H，N H₂)，7.70(d，2H，J=8.9，芳香族CH)，7.65(br s，1H，NH₂)，6.97(d，1H，J=1. 6，芳香族CH)，6.80(m，5H，NH₂，芳香族CH)，6.61(d，1H，J=8.2，芳香族CH)， 4.96(t，1H，J=5.9，メチン)，4.78 (s，2H，プテリジニル-CH₂)，4.49(m，1H，メチン)，3. 19(s，3H，N-CH₃)，3.16(m，1H，シクロペンチルメチン)，294(d，2H，J=5.8，ArCH₂)，2. 34 (t，2H，J=7.5，glu 4-CH₂)，2.10(m，1H，glu 3-CH₂)，1.87(m，3H，glu 3-CH₂ ，シクロペンチル CH₂)，1.78-1.40(m，6H，シクロペンチル CH₂)．元素分析 : Calcd．for C₃₄H₃₈N₈O₈ ・2.1 H₂O（MW 724.56)C，56.36; H，5.87; N ，15.47．Found: C，56.13; H，5.59; N，15.46．質量スペクトル : (イオンスプレー)687(M+H)⁺．ＵＶスペクトル : (pH 7 バッフアー)λ_max（ε）259.2(23100)，307.3(23300)，372.4 (7190)．λ_min（ε）242.0(14300)，272.9(16900)，343.6(5460)．sh（e）219.8 (26400)，280.7(19900)．例１９４：メチル３−tert−ブチル−４−ヒドロキシベンゾエート磁気撹拌器、窒素導入管、及びコンデンサーを備えた５００mLの三口フラスコに、１０．０ｇの３−tert−ブチル−４−ヒドロキシ安息香酸（ＩＣＮバイオメディカルズ．ＩＮｃ．Aurora，Phio 44202）、及び２００mLのＭｅＯＨを加えた。この溶液を５分間ＨＣｌガスをバブリングすることによって酸性化し、次いで５ｈ加熱還流した。この溶液をＲＴに冷却し、乾燥するまで減圧下に濃縮した。得られた固体をＥｔＯＡｃに溶解した。この溶液を３回５％ＮａＨＣＯ₃水溶液で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、乾燥するまで濃縮し、９．６５ｇ（９０％）のメチル３−tert−ブチル−４−ヒドロキシベンゾエートを白色の結晶性固体として得た。ｍ．ｐ．＝１４４〜１４５℃。例１９５：メチル３−tert−ブチル−４−（（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ）ベンゾエート例１８３に従って、５．００ｇのメチル３−tert−ブチル−４−ヒドロキシベンゾエートを、４．３４ｇのtert−ブチルジメチルシリルクロライド、３．５９ｇのイミダゾール、及び７０mLの無水ＤＭＦを用いてシリル化した。粗生成物を、シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（９：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、６．１ｇ（７９％）のメチル３−tert−ブチル−４−（（tert −ブチルジメチルシリル）オキシ）ベンゾエートを透明な液体として得た。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ7.89(d，1H，J=2.3，芳香族CH)，7.76 (dd; 1H; J=8.5，2.3; 芳香族CH)，6.98(d，1H，J=8,4，芳香族CH)，3.82(s，3H，CO₂CH₃) ，1.37(s，9H，t-Bu)，1.03(s，9H，Si-t-Bu)，0.37(s，6H，SiMe₂)．例１９６：３−tert−ブチル−４−（（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ）ベンジルアルコール例１８４に従って、５．００ｇのメチル３−tert−ブチル−４−（（tert− ブチルジメチルシリル）オキシ）ベンゾエートを、３１．８mLの１Ｍジイソブチルアルミニウムハイドライド／トルエン及び５０mLの無水トルエンを用いて還元した。反応混合物のｔｌｃ分析で若干の出発物質が残っていることが示された。反応を完結させるために、更に５mLの１Ｍジイソブチルアルミニウムハイドライド／トルエンを添加し、反応を更に５分間進行させた。常法で後処理し、４．１１ｇ（９０％）の３−tert−ブチル−４−（（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ）ベンジルアルコールを濁ったオイルとして得た。この生成物を更に精製することなく使用した。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ7.20(d，1H，J=2.0，芳香族CH)，7.04 (dd; 1H; J=8.2，2.1; 芳香族CH)，6.80(d，1H，J=8.0，芳香族CH)，5.01 (t，1H，J=5.7 ，OH)，4.39(d，2H，ArCH₂O)，1.36(s，9H，t-Bu)，1.02(s，9H，Si-t-Bu)，0.3 2(s，6H，SiMe₂)．例１９７：３−tert−ブチル−４−（（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ）ベンジルブロマイド磁気撹拌器を備えた５００mLの丸底フラスコに、３．６ｇの３−tert−ブチル −４−（（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ）ベンジルアルコール及び２５ mLの無水ＣＨ₂Ｃｌ₂を充填した。この溶液を氷水浴で冷却し、５．６８ｇのジブロモトリフェニルホスホラン（アルドリッチ）で処理した。反応混合物をＲＴに暖め、２．５ｈ撹拌し、次いで１００mLのＣＨ₂Ｃｌ₂で希釈した。得られた溶液を、５％ＮａＨＣＯ₃水溶液（４×６０mL）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、濃縮して白色の固体を得た。この粗生成物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（９５：５ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、３．８６ｇ（８８％）の３−tert−ブチル−４−（（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ）ベンジルブロマイドを白色の結晶性固体として得た。ｍ．ｐ．＝５４〜５５℃。例１９８：tert−ブチル（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−６−オキソ−２，３−ジフェニル−５−（３−tert−ブチル−４−（（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ）ベンジル）−４−モルホリンカルボキシレート例１４２に従って、３．８２ｇのtert−ブチル（２Ｒ，３Ｓ）−（−）−６ −オキソ−２，３−ジフェニル−４−モルホリンカルボキシレートを、８０mLの無水ＴＨＦ中で、１１．３４mLの１Ｍナトリウムビス（トリメチルシリル）アミドのＴＨＦ溶液を用いて３．６８ｇの３−tert−ブチル−４−（（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ）ベンジルブロマイドでアルキル化した。粗生成物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（８５：１５ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）にかけ、４．８５ｇ（７１％）のtert−ブチル（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−６ −オキソ−２，３−ジフェニル−５−（３−tert−ブチル−４−（（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ）ベンジル）−４−モルホリンカルボキシレートを白色の発泡体として得た。ｍ．ｐ．＝７５〜８３℃。例１９９：（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−６−オキソ−２，３−ジフェニル−５− （３−tert−ブチル−４−ヒドロキシベンジル）モルホリン窒素導入管及び磁気撹拌器を備えた２５０mLの三口フラスコに、４．５１ｇの tert−ブチル（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ） −６−オキソ−２，３−ジフェニル−５−（３−tert−ブチル−４−（（tert− ブチルジメチルシリル）オキシ）ベンジル）−４−モルホリンカルボキシレート及び５０mLの無水ＴＨＦを加えた。この溶液を氷水浴で冷却し、７．５１mLの１ＭｎＢｕ₄ＮＦ／ＴＨＦ（アルドリッチ）で処理し、次いでＲＴに暖め、窒素下で撹拌した。１．５ｈ後、ｔｌｃ（ＳｉＯ₂、８５：１５ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で、出発物質が残っていないこと、及びＲｆ＝０．５２の単一な新たな成分が示された。この溶液を１２５mLのＥｔＯＡｃで希釈し、水（４×１００mL）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥し、濃縮して濃密な透明なオイルを得た。質量スペクトル分析（ＡＰＣＩ）で、ｍ／ｅ＝（５３８（Ｍ＋Ｈ＋Ｎａ）⁺を有する所望の中間体が示された。このオイルを５０mLのＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解し、この溶液を１５ mLのＴＦＡで処理した。４０min撹拌した後、ｔｌｃ（ＳｉＯ₂、６５：３５ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で、Ｒｆ＝０．３６の単一の新たな成分が示された。この溶液を飽和ＮａＨＣＯ₃水溶液を添加して中和した。この混合物を分液ロートに移し、層を分離した、。ＣＨ₂Ｃｌ₂溶液を、更に飽和ＮａＨＣＯ₃（３×５０mL ）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥し、減圧下に濃縮し、透明な発泡体を得た。この粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（７：３ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、２．６６ｇ（８９％）の（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−６−オキソ−２，３− ジフェニル−５−（３−tert−ブチル−４−ヒドロキシベンジル）モルホリンを白色の発泡体として得た。ｍ．ｐ．＝７６〜８０℃。例２００：３−tert−ブチル−Ｌ−チロシン３００mLのパールの容器に０．７３ｇのＰｄＣｌ₂と２０mLの１：１ＴＨＦ：ＥｔＯＨを加えた。これに、２．４３ｇの（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−６−オキソ −２，３−ジフェニル−５−（３−tert−ブチル−４−ヒドロキシベンジル）モルホリンの８０mLの１：１ＴＨＦ：ＥｔＯＨを加えた。この混合物を窒素をバブリングすることによって脱酸素化し、４５psiで１８ｈ水素化した。容器を窒素でパージし、触媒をセライトを通して濾過して除き、濾液を減圧下に濃縮した。残渣を水とヘキサンの間に分配した。水層を更に５０mLづつのヘキサンで４回洗浄し、手短にロータリーエバポレーションにかけ、残りのヘキサンを除去し、凍結し、凍結乾燥して、１．４７ｇ（９２％）の３−tert−ブチル−Ｌ−チロシン・ＨＣｌを褐色の吸湿性の固体として得た。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ9.40(br s，1H，OH)，8.36(br s，3H，NH₃ ⁺)，7. 04(s，1H，芳香族CH)，6.91(d，1H，J=8.2，芳香族CH)，6.78(d，1H，J=8.2，芳香族CH)，4.05(m，1H，メチン)，3.02(d，2H，J=5.6，ArCH₂)，1.34(s，9H，t-Bu) ．例２０１：tert−ブチル３−tert−ブチル−Ｌ−チロシネート磁気撹拌器を備えた２５０mLの丸底フラスコに、３０mLのイソブチレン（−７８℃で凝縮したもの。）、１．３０ｇの３−tert−ブチル−Ｌ−チロシン・ＨＣｌ、６０mLの１，４−ジオキサン、及び０．５mLの濃Ｈ₂ＳＯ₄を加えた。フラスコをラバーセプタムで栓をし、針金で縛って密封した。ＲＴで１８ｈ撹拌した後、フラスコに孔をあけ、内容物を１０ｇのＮａＨＣＯ₃の１５０mL水溶液にあけた。混合物をロータリーエバポレーションにかけ、イソブチレンを除去した。エマルジョンが生じ、これをＥｔＯＡｃ（４×４０mL）で抽出した。抽出物を合わせ、５％ＮａＨＣＯ₃水溶液（３×５０mL）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、濃縮して淡黄色の発泡体を得た。この生成物のｔｌｃ（ＳｉＯ₂、９５：５ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）による分析で、Ｒｆ＝０．４５と、Ｒｆ＝０．４９主要及びマイナーな成分がそれぞれ示された。Ｒｆ＝０．４５の生成物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（９５：５ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ）で単離し、０．６１ｇ（４４％）のtert−ブチル３−tert−ブチル−Ｌ−チロシネートを白色の発泡体として得た。ｍ．ｐ．＝４３〜５２℃。例２０２：tert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ −tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−tert−ブチル−Ｌ−チロシネート例１４５に従って、０．５７ｇのtert−ブチル３−tert−ブチル−Ｌ−チロシネートを、０．３９ｇのＥＤＣを用いて２０mLのＣＨ₂Ｃｌ₂中で４ｈ、０．６６ｇのＮ−Ｃｂｚ−Ｌ−グルタミン酸 γ−tert−ブチルエステル（シグマ）とカップリングした。粗生成物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（６５：３５ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、０．９９ｇ（８３％）のtert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ− tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−tert−ブチル−Ｌ−チロシネートを無色の発泡体として得た。ｍ．ｐ．＝６２〜６６℃。例２０３：tert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−tert−ブチル−Ｌ−チロシネート例４８に従って、０．９３ｇのtert−ブチルＮ−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−tert−ブチル−Ｌ−チロシネートを、７０mLのＭｅＯＨ中で０．１５ｇの１０％Ｐｄ（Ｃ）を用いて３．５ｈ水素化した。粗生成物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ）にかけ、０．６３ｇ（８７％）のtert−ブチル５−Ｏ− tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−tert−ブチル−Ｌ−チロシネートを濃密な透明なオイルとして得た。 ¹H-NMR : (200 MHz，DMSO-d₆)δ9.17(s，1H，OH)，8.11(d，1H，J=7.8，NH)，6.9 6(d，1H，J=1.7，芳香族CH)，6.84(dd; 1H，J=8．1，1.9; 芳香族CH)，6.68(d， 1H，J=8.0，芳香族CH)，4.33(m，1H，メチン)，3.14(m，1H，メチン)，2.84(d，2H，J= 7.0，ArCH₂)，2.23(t，2H，J=7.9，glu 4-CH₂)，1.88-1.46(m，4H，glu 3-CH₂， NH₂)，1.40(s，9H，t-Bu)，1.33(s，18H，t-Bu's)．例２０４：tert−ブチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−tert−ブチル−Ｌ−チロシネート例１５４に従って、０．３２０ｇのtert−ブチル５−Ｏ−tert−ブチル−Ｌ −グルタミン−１−イル−３−tert−ブチル−Ｌ−チロシネートを、０．１５mL のＤＥＣＰ、０．１９mLのＥｔ₃Ｎ、及び２０mLのＤＭＦを用いて、０．２５４ｇの４−（Ｎ−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニルメチル）−Ｎ−メチルアミノ）安息香酸半塩酸塩二水和物とカップリングした。粗生成物を、シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（７：７：１ＣＨ₂Ｃｌ₂：アセトン：ＭｅＯＨ）で精製し、０．３２ｇ（６１％）のtert−ブチルＮ−（４−（（（２，４ −ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ −tert−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−tert−ブチル−Ｌ−チロシネートを黄色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１２５℃（dec.）。例２０５：Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−tert−ブチル −Ｌ−チロシン例５０に従って、０．２８７ｇのtert−ブチルＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−５−Ｏ−te rt−ブチル−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−tert−ブチル−Ｌ−チロシネートを、５５mLのＣＨ₃ ＮＯ₂中でＨＣｌガスと１ｈ処理した。懸濁液を濃縮し、黄色の粉末を得た。この物質を３０mLの水に懸濁し、十分な１ＮＮａＯＨ水溶液と処理し、完全な溶液にした。黄色の溶液を濾過し、１ＮＨＣｌ水溶液を加えてｐＨ＝５．５まで酸性にした。得られた黄色の沈殿を、遠心によって分離し、水性懸濁−遠心−デカンテーションのサイクルで４回洗浄し、凍結し、凍結乾燥して０．１７８ｇ（６８％）のＮ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−tert−ブチル−Ｌ−チロシンを黄色の粉末として得た。ｍ．ｐ．＝１８５℃（dec.）。HPLC : C18で１つのピークであった。k'=3.14，75:25:0.1 H₂O:MeCN:TFA、流速= １mL/min． ¹H-NMR : (300 MHz，DMSO-d₆)δ12.80-11.80(br m)，9.09(s，1H，OH)，8.55(s， 1H，プテリジニル 7-CH)，8.01(d，1H，J=7.9，アミド NH)，7.97(d，1H，J=8.1，アミド NH) ，7.78(br s，1H，NH₂).7.68(d，2H，J=8.9，芳香族CH)，7.57(br s，1H，NH₂) ，6.93(d，1H，J=1.6，芳香族CH)，6.85-6.64(m，5H，芳香族CH，NH₂)，6.60(d ，1H，J=8.2，芳香族CH)，4.77(s，2H，プテリジニル-CH₂)，4.42(m，1H，メチン)，4.29( m，1H，メチン)，3.19(s，3H，N-CH₃)，2.83(m，2H，ArCH₂)，2.23(t，2H，J=7.8， glu 4-CH₂)，1.90(m，2H，glu 3-CH₂)，1.25(s，9H，t-Bu)．元素分析: Calcd．for C₃₃H₃₉N₉O₇・2.3H₂O(MW 715.16): C，55.42; H，6.14; N ，17.63．Found: C，55.58; H，5.97; N，17.47．質量スペクトル : (イオンスプレー)674(M+H)⁺．ＵＶスペクトル: (pH 7 バッファー)λ_max（ε）259.4(23700)，307.4(23500)，372.5 (7330)．λ_min（ε）242.8(14900)，273.0(17000)，344.7(5660)．sh（e）222.1 (26400)，287.2(19600)．例205：N-(4-(((2,4-ジアミノ-6-プテリジニル)メチル)メチルアミノ)ベンゾイル)-L-グルタミン-1-イル-3-tert-ブチル-L-チロシン例50の方法により、0.287gのtert−ブチルN-(4-(((2,4-ジアミノ-6-プテリジニル)メチル)メチルアミノ)ベンゾイル)-5-O-tert-ブチル-L-グルタミン−1−イル-3-tert-ブチル-L-チロシン塩を55mlのCH₃NO₂中で気相のHClで１時間処理した。反応後懸濁液を真空濃縮すると黄色の粉末が生成した。この物質を３０mlの水に懸濁して、１規定のNaOH水溶液を加えて完全に溶解し、溶解液を作った。生成した黄色溶液をろ過して１規定のHCl水溶液を加えてpHを5.5に調整した。その結果生じた黄色の沈殿物を遠心によりまず分離し、次いでこの沈殿物を水溶液に懸濁、遠心、デカンテーションからなる操作を４回繰り返して洗浄し、凍結乾燥して、最終的に0.178ｇの黄色の粉末（68%）、N-(4-(((2,4-ジアミノ-6-プテリジニル)メチル)メチルアミノ)ベンゾイル)-L-グルタミン−1−イル-3-tert-ブチル -L-チロシン（融点185℃、(dec)）を得た。 HPLC ：C18で一つのピーク、k'=3.14、75:25:0.1 H₂O：MeCN：TFA、フローレート=１ml/min． ¹H-NMR: (300MHz、DMSO-d₆)δ12.80-11.80(br m)、9.09(s、1H 、OH、8.55(s、1H、プテリジニル7-CH)、8.01(d、1H、J=7.9、アミドNH)、7.97( d、1H、J=8.1 アミドNH)、7.78(dr s、 1H、NH₂)、7.68(d、2H、J=8.9、芳香族CH)、7.57(br s、1H、NH₂)、6.93(d、1H 、J=1.6、芳香族CH)、6.85-6.64(m、5H、芳香族CH、NH₂)、6.60(d、1H、J=8.2、芳香族CH)、4.77(s、2H、プテリジニル-CH₂)、4.42(m、1H、メチン)、4.29(m、1 H、メチン)、3.19(s、3H、N-CH₃)、2.83(m、2H、ArCH₂)、2.23(t、2H、J=7.8、g lu4-CH₂)、1.90(m、2H、glu3-CH₂)、1.25(s、9H、t-Bu)。元素分析: C₃₃H₃₉N₉O₇・2.3H₂O(分子量715.16)の計算値：C,55.42; H,6.14; N ,17.63．測定値：C,55.58; H,5.97; N,17.47．マススペクトル: (イオンスプレイ)674(M+H)⁺ UVスペクトル: (pH7緩衝液)λ_max（ε）259.4 (23700) 307.4(23500)372.5( 7330)λ_min（ε）242.8(14900) 273.0(17000)344.7(5660).sh（e）222.1(26400)，287.2(19600)．例206 ヒト・カルボキシペプチダーゼA1 cDNAの配列ラットのプロプレカルボキシペプチダーゼA1(CPA1)(Gardell et al.，Nature ，317：551-555,1985)をコードしているHindIII-SalI断片を、M．Phillips(UCSF )博士より譲与してもらったpMP36より分離した。1.2ｋbの、ラット CPA1 cDNAのHindIII-SalI断片を[³²P]dCTPとprime-It kit(Stratagene)とでラベルして、GrunsteinとHogness(Proc.Nat.Acad.Sci 72:5016-5020,1975)との方法で、ラムダgt11ヒト腎臓cDNAライブラリ(Clontech)のスクリーニングに用いた。スクリーニングを３回行い、ラットCPA1 cDNAプローブとハイブリダイズする分離精製プラークを得た。分離プラークのラムダDNAは、一晩液体培養したものをQiagenカラム(Qiagen) を製造業者の推奨する方法で使って得た。ヒトCPA1 cDNA挿入部はラムダDNAをEc oRIで切断し、低融点アガロースを使った電気泳動法でそのcDNAを分離した。そのEcoRI cDNA挿入部をpGEM7z(＋)(Promega)のEcoRI部位に入れて、pHCPAプラスミドとした。液体培養を一晩行った後、Qiagenカラムを使ってpHCPA DNAを調製した。分離したHCPA1ラムダDNAとHCPA1 cDNAをもつプラスミドの配列決定を[³⁵S]dAT Pとfmolシーケンシング・システム(Promega)で行った。最初の配列決定には、ラムダgt11のクローニング部位、もしくはpGEM７(＋)とTAベクタ(Invitorogen)の多クローニング部位の上流下流をはさむオリゴヌクレオチド・プライマを使った。配列が決定した領域に対応し、HCP1 cDNAの両鎖の全塩基配列決定を可能にするオリゴヌクレオチド・プライマを合成した（配列認識番号１）。例207 ヒトカルボキシペプチダーゼA2のクローニングヒトカルボキシペプチダーゼA2(CPA2)をラムダgt11(Clontech)中のヒト腎臓cD NAライブラリよりクローニングした。使用したプローブはラットCPA2の1198塩基の断片であった。このプローブは、QUICK-Cloneラット腎臓cDNA(Clontech)からP CRにより増幅した。上流プライマはラットcDNAの12-33番目のヌクレオチドにある、コード領域(5'-CCTGTTATTGGCTGCCCTACTT-3')に対応し、一方下流プライマは、1888-1209番目のヌクレオチドにある配列(5'-AAGCCAGGTCTCTTCTGCTGTC-3')に相補的なものに対応していた(Gardell,S.J.，J.Biol．Chem 26317828(1988))。 PCRの標準的な条件は、94℃でのプレ・インキュベーションを行い、30サイクルで94℃１分間、その後56℃２分間、更にその後72℃３分間の処理であった。1198 塩基対のPCR産物を100μlのクロロホルムで抽出し、DNAを含んだ上層の水相をCH ROMA SPIN-100カラム(Clontech)にかけてプライマを除去した。ラットCPA2のPCR 産物の配列はPCRプライマを配列決定用プライマとして使って確認した。DNAの配列決定は[³²P]dATPをfmolシーケンシング・キット(Promega)で使用して行った。ラットCPA2のDNAを[³²P]dCTPとPrime-It IIランダム・プライマ・ラベリング・キットで行い、ヒト腎臓cDNAライブラリのスクリーニングに使用した。150mm の培養皿上に大腸菌株、Y1090r^-をまいてライブラリをプレートし(10,000プラーク／皿) 、菌転移用ニトロセルロース膜を二枚一組作成した。フィルタをハイブリダイゼーション溶液(50%ホルムアミド、5X SSPE、50X Denhardtの溶液、0.1％SDS及び、100μg/mlの超音波処理済サケ精子DNA)で42℃3時間ブロッキングした。ラベルの入ったラットCPA2 PCR産物を加え、フィルタに45℃で一晩ハイブリダイゼーションした。フィルタを、0.1 X SSC、0.1%SDSで60℃1時間洗浄し、フィルタが湿っているうちにオートラジオグラフィー・フィルムに露出した。それぞれの皿より2つ一組のプラークのうち一つを使って二回目のスクリーニングを上述のように行った。二回目のスクリーニング後陽性クローンと判明したものを使って、そのラムダgt11の挿入部のDNAの長さをPCRで決定した。ラムダgt11のEcoRIクローニング部をはさんでいる、前向き及び後ろ向きシーケンシング・プライマ(Clont ech)のそれぞれをPCRの上流、下流プライマとして使った。他より十分に離れたプラークを分離して、その一部は10μlの水に懸濁して95℃で５分間加熱し、一方残り全部は後のスクリーニング用ファージストックとして保存した。プラーク DNAを含む上記の10μl懸濁液を直接鋳型として、上記の条件でPCRを行った。増幅されたDNA挿入部をアガロースゲルで検出し、最も長い挿入部DNAをもつ二つのプラークを三回目のスクリーニングにかけた。fmolキット(Promega)と、ラムダg t11の前向き及び後ろ向きプライマ (Clontech)を使い、上記した二つのプラークより分離したラムダDNAの配列をその両方向から決定した。そのうちの一つはラットCPA2の5’、3’領域に高い相同性を示し、以後のスクリーニングにはこのクローンを使った。ラムダDNAをEcoRIで切断して生じた挿入部のcDNAは、ゲルで精製し、pGEM-7Zf (＋)ベクタ(Promega)のEcoRI部位にクローニングした。[³²P]dATPとfmolキットを使って、上記の方法で配列決定を行った。hCPA2の全塩基配列決定が可能で、上記で決定した配列の領域に対応しているオリゴヌクレオチドを合成した。決定したcDNAは417アミノ酸からなるタンパク質をコードしたタンパク質読み取り枠を含んでいた。このタンパク質はアミノ酸レベルでCPA2と87％の相同性をもち、 cDNAレベルでは85％の相同性をもっていた。このタンパク質はヒトCPA1とアミノ酸、cDNAレベルの双方において63％の相同性をもっていた。それゆえに、このタンパク質はヒト・カルボキシペプチダーゼA2と分類される。表４はヒトCPA1とヒトCPA2のアミノ酸配列の比較を示している。この文書を通じて、アミノ酸の番号はCPA1のものと同じである。CPA1とCPA2の変異の部位の番号はこの番号づけの方法に添っている。例208 酵母中でのHCPA1の発現分離したHCPA1ラムダ・プラークのcDNA挿入部の大きさは、ラムダgt11のクローニング部位のEcoRIをはさむオリゴヌタレオチド・プライマをPCRで使って決定した。単一の分離プラークを取り、200μlの水に懸濁し、95℃で5分間加熱した。各懸濁液10μlを、製造業者の推奨する方法(Perkin Elmer/Cetus)にそい、PCR増幅に使った。標準的なPCR条件として、95℃1分、50℃0.5分、72℃3分で行った。反応物をアガロース電気泳動にかけた。 CPA-11 5'-gCTgAAgCTTCggAggACTTT-3' CPA-12 5'-TCTTgACCgCCTggATgCTg-3' HCPA1のS.cerevisae中での発現はGardelらの方法によった(Nature,317:551-55 5,1985)。二つのオリゴヌクレオチドCPA1とCPA2とを使って、上記に記載の方法によりPCRでpHCPA中の200塩基対の断片を増幅した。増幅された断片は、CPA1による加えられた新規のHindIII部位をもっていて、これによりPhillipsら(J.Biol .Chem．265:20692-20698,1990)の記載の方法により、pMP36のアルファ因子リーダと同じフレーム、になるように連結が可能となる。このPCR断片をTAベクタ(In vitrogen)へ連結し、上記の方法でその全塩基配列を決定した。所望の5’変異をもつコロニを選択し、以後これをTAHCPAexpとして用いた。プラスミドpHCPAをAatII及びEcoRIで切断し、1.1キロ塩基対のHCPA1断片を得た。この断片を低融点アガロースを使った電気泳動法で精製し、TAHCPAexpをAat II及びEcoRIで切断してプラスミドTAHCPAにしておいたものに連結した。Maniati sら(モレキュラー・クローニング：実験室マニュアル、Cold Spring Harbor Press,1989)の方法に添って、TAHCPAを EcoRIで切断してT4DNAポリメラーゼで処理し、更に、SalIリンカーを連結してHC PA1の3’に連結した。この時点で、5’HindIIIと3’SalI部位を含んでいたTAHCP AをHindIIIとSalIとで切断し、1.2キロ塩基対の断片を調製した。この断片をpMP 36の大型HindIII断片と小型HindIII-SalI断片と一緒に連結して、pMP36HCPA1を作成した。クローン化したヒトの酵素を酵母で発現する方法はM.Phillipsらの方法(J.Bio l.Chem．265,20692(1990))によった。HCPA1を含むプラスミドpMP36をBAMHI、SAL I、SSPIで順番に切断して、その間の精製はフェノール抽出もしくはPromega Mag ic Miniカラムを製造業者推奨の方法で使って行った。もしくはOne-Phor-All緩衝液システム(Pharmasia)を使って、３つ全ての制限酵素での切断を同時に行った。 SSPIでの消化後、消化物を1％の低融点アガロースで分離して5つの異なるバンドを検出した。約2.8キロ塩基対の目的のバンド（上から二番目）をゲルから切り出し、SchleicherとSchuellのElutip-Dカラムを添付説明書通りに使って精製した。 T4リガーゼ・システム(Gibco BRL)を使い、16℃一晩の反応系で、BAM/SAL/SSP 断片をpBS24.1シャトルベクタ（UCSFのM.Phillips博士より譲与された pBS24.1-AGC3をBamHI/SalI/SspIで消化して作成）へ連結した。連結したベクタは酢酸アンモニウムとエタノールにより−80℃４時間で沈殿化させて、沈殿物を 10μlのTEに再懸濁した。 Bio RadのGene Pulserを2000ボルト、時間定数約4に設定して、このベクタ、４μlを40μlの大脳菌、DH5alphaへ電気穿孔法で形質導入した。1mlのMiller Hi nton Brothを加え、検体を37℃で１時間インキュベーションした。それぞれ100 μlの検体3つをアンピシリン含有LB培地上にまいた。得られたコロニーを別の未使用の培地上に再びまいた。のコロニーを接種して37℃で一晩インキュベーションした。プラスミドはQiagen Maxi抽出方法により抽出した。上記の方法で抽出したおおよそ500から２000ng のpBS24.1のプラスミドDNAを電気穿孔法によりコンピテントDLM101アルファ酵母細胞へ形質導入した。1mlのソルビトールを形質導入後すぐに加えて細胞をレスキューした。100μlの検体を、ウラシル欠損YNB(酵母窒素培地)のプレートにまいて30℃でインキュベーションした。陽性クローンを選択した。形質転換体をロイシン欠損最小合成培地(Wickersham,L.J.，U.S.Dept.ofAgric.Tech.Bull No.1 029(1951))で48時間増殖させた。この培養物を次に350リットルの培養器に接種した。例209 酵母中からのHCPA1及びその変異体の精製プロCPA生成S.cerevisiae(T268G/p2619)の350リットル培養物を500リットルの New Brunswick培養器を使って30℃で65時間、175 1pmエアーフロー、5psig頭圧、150rpm震盪で増殖させた。培養液は１％酵母抽出物(Difco)、2%トリプトン(Di fco)、1%グルコース、20mM KPO₄、pH 7.5、50μg／mlアンピシリン及び0.007％（容量／容量）のMazu DF 60P泡立て防止剤(Mazei′Chemical，Inc.,)よりなっていた。最終的なOD₆₀₀は14であった。15-20℃に冷却した後、70.6m²のポリオレフィン・フィルタを装着したSartorius Sartcon IIシステムを使ったクロス・フロー・ろ過で細胞を培養液から分離した。培養液中のタンパク質は10K MWCOクロス・フロー・フィルタを使って濃縮し、20mM Tris-HCl pH 8、0.1mM酢酸亜鉛(緩衝液A)に対して完全に透析した。これ以降の緩衝液全てには0.1mMの酢酸亜鉛が含まれていた。10K濃縮物に硫酸アンモニウム(AS)を0.5M加えて、0.5MのASを含んだ緩衝液Aで平衡化した250mlのラジアル・フローのフェニル・セファロース・カラムにのせた。プロCPAを1.5リットルの0.5-OMのAS勾配で溶出して、緩衝液A で洗浄した。フロースルーを使ってこのフェニルセファロースの工程を繰り返し、カラムに結合しなかったプロCPAを一回目の試料から回収した。プロCPA画分をプールしてSartorious 10K Easy Flowフィルタ(0.2m²)を使って緩衝液Aに対して濃縮透析した。その結果得られたものをHi Load26/10 Q-セファロース・ハイ・パフォーマンス・カラム(Pharmasia)(53ml)にかけた後、１リットルの緩衝液A+0-0.5M NaClの勾配で溶出した。プロCPAは、NaClが120-220mMの範囲で溶出し、そのピークは約150mMであった。プロCPAを含む画分をプールして、プロCPAを37℃1時間トリプシン消化(2μg/ml)して成熟CPAを得た。PMSFを加え(0.5 mM)プールしておいた試料を緩衝液Aに対して透析した。このQ-セファロースHP 工程を繰り返し、活性化CPAをピークが100mMである80-140mMの範囲で溶出させた。以前のIEF実験ではプロCPAはpI=4.75であり、一方成熟CPAはpI=6.2であることが分かっていた。CPA画分をプールし10K Centriprep(Amicon)を使って15mlまで濃縮し、これをHiLoad26/60 Superdex 75カラム(Pharmasia)に(一回につき5mlで )３回通した。溶出用緩衝液は緩衝液A+150mM NaClであった。CPA画分をプールして10 K Centriprepで濃縮し、0.1mM酢酸亜鉛含有SigmaPBSで緩衝液交換を行った。最終容量(15ml)を0.2μのシリンジ・フィルタに通した後、4℃で保存した。タンパク質濃度をBSAを標準試料として使ったローリー法により、24.5mg/mlと決定した。268番目のアミノ酸がGlｙに置換された変異体の典型的な調製物の比活性は163単位/mgであった。全タンパク質量は368mgであった。例210 HCPA2の酵母中での発現 HCPA2のS.cerevisiae中での発現はHCPA1に対して行った方法と同様にした（例 208。ただし以下の点を除く）： 1）新たにHindIII部位を設けるのに使ったPCRプライマは：であった。 2） AatIIではなくてHincII部位を使い、HCPA2 cDNAの5’末端に対する変異型 PCR断片をサブ・クローニングした。 3）クローン化したPCR産物をTAベクタより切り出し、HCPA2 cDNAを含んだpGE M-7Zf(＋)ベクタへサブ・クローニングした。酵母１、酵母２プライマを使って、HCPA1の時のようにしてPCRを行った。変異体PCR産物はTAベクタへクローニングして配列を確認した。TAベクタをHindIIIとHincIIとで切断して、この断片を切り出し、pHCPA2のそれぞれ対応した部位へクローニングしてpHCOA2-Yを作成した。pHCPA2-Yに唯一ある3'EcoRI部位を上記した方法でリンカーを使い、SalI部位に変換して pHCPA2-YSalIを作成した。pHCPA2-YSalI由来で1.2キロ塩基対のHindIII/SalI HC PA2断片をベクタより切り出し、pMP36(M.Phillips et al.,J.Biol.Chem., 265,2 0692-20698(1990))の大型HindIII/SalI断片と連結してpMP36HCPA2を作成した。 HCPA2クローンの酵母中での発現はHCPA1(例144)の時と同じであった。ヒトCPA 2にはその内部に、ヒトHCPA1にはない二つのBamHI部位があり、最終サブ・クローニングの際には部分消化の必要があった。pMP36HCPA2をSalIで完全に消化し、 BamHIで（上記の方法で）部分消化して長さ2.7キロ塩基対の断片を得たが、この断片にはアルコール・デヒドロゲナーゼ/GADPHプロモータと、ヒトCPA2に接続した制御領域(A/Gプロモータ)とが酵母のアルファ因子リーダと同じフレームに存在している。この断片をpBS24.1のSalI/HindIII部位へ連結してpBSHCPA2を作成した。この構築物をDH5α中で増幅して上記したように酵母に電気穿孔法で導入した(例208)。例211 酵母中からのHCPA2もしくはその変異体の生成プロCPA発現S.cerevisiaeの(Leu^-培養液での増殖)一晩の培養物を使って、１％酵母抽出物(Difco)、2%トリプトン(Difco)、１％グルコース、20mM KPO₄、pH 7.5、50μg/mlアンピシリンからなる2リットルの培養を開始した。48時間、30℃で培養して増殖させ、6000 X g、10分４℃の遠心により上清を得た。上清中のタンパク質をAmicon PM-10 Ul trafilteration膜で114mlまで濃縮した。濃縮した上清を20mMTris-HCl(pH 8.0) 、0.1mM酢酸亜鉛、0.5M硫酸アンモニウムに調整して、緩衝液A+0.5M 硫酸アンモニウムで平衡化した1.8X20cmのフェニル-セファロース・カラム(Pharmasia)にかけた。タンパク質は、緩衝液B(20 mMTria-HCl pH 7.5、0.1mM酢酸亜鉛)+0.5M硫酸アンモニウムから緩衝液B+20％（容量／容量）エタノールへの120ml線形勾配( １ml/分)で溶出させた。カルボキシベプチダーゼ活性を持つ画分をプールし緩衝液Bに対して透析した。透析済みの試料をHR5/5(1ml)Mono Qカラム(Pharmasia)にかけて、緩衝液B+0-0.5M NaClの線形勾配(1ml/分)で溶出させた。カルボキシペプチダーゼ活性を有する画分をプールして緩衝液B対して透析した。プールしたプロCPA2は37℃１時間のトリプシン処理(10μg/ml)で活性化させ、トリプシンは PMSFを0.5mM加えて不活性化させた。成熟CPA2を緩衝液Bに対して透析して再び1m l Mono Qカラム(Pharmasia)にかけて上のように溶出させた。カルボキシペプチダーゼ活性を持つ画分をプールし、緩衝液Bに対して透析し、Amicon Ultrafiltr ation PM-10膜により10倍濃縮させた。濃縮した成熟CPA2を HR/10/30Superose 12カラム(25ml)にのせ、リン酸緩衝塩液(10 mM Na₂HPO₄、0.1 5M NaCl pH 7.2)でイソクラティックに(isocratically)溶出させた(0.4ml/分)。 BSAを標準試料にして行ったミクロBCAアッセイ(Pierce Chemical Co.)によるタンパク質濃度決定法では、野生型HCPA2に関しては0.65mg/ml(全タンパク質量4.1 3mg)で、変異型に関しては0.3mg/ml(全タンパク質量4.47mg)であった。例212 変異体HCPA2の発現 T7-Gen In Vitro Mutagenesis Kit(United States Biochemicals,No.74500)を使って、上記でHCPA1の変異体を作ったようにして、HCPA2のA250G変異体とT268G 変異体とを作成した。A250(gCC)とT268(ACC)とをGly(ggC)へ変異させる、変異オリゴヌクレオチド・プライマ(Oligos Etc.)は以下のとおりである：変異の入ったコドンには下線を引いてある。これらのオリゴヌクレオチド・プライマを使い、以下に示されたHCPA2の変異体を作成した： 1. A250G 2. T268G 上記変異体HCPA2カセットのそれぞれの配列を決定して、所望のDNA変異のみが入ったことを確認した。変異体カセットを、例152に示された方法でS.cerevisia e中で将来的に発現可能な形に処理できるpMP36ΠCPA2へサブクローニングした。例213 Campath-１-HもしくはING-１とヒトカルボキシペプチダーゼA変異体との間の化学的複合体の合成カルボキシペプチダーゼAの変異体2mgを、475μlのダルベッコのリン酸緩衝塩液中の(PBS)0.15mgのSulfo-SMCC(Pierce Chemical Co)と混ぜた。その混合液を2 5℃で45分間攪拌した。この修飾酵素を、PBSで平衡化した1X13cmのG-25ミジウム・カラムにかけて精製した。精製物は4℃で24時間保存が可能である。 0.5mlの6.3μM修飾酵素と6μlの1mMメルカプトエタノールアミンと混ぜて、マレイミド含量を決定した。30分後、20μｌの4mg/mlのEllman試薬を加え、更に20 分後412nmでの吸光度を測定した。モル吸光度(molar absorptivity)13.6mM^-1に基づき、精製酵素は1酵素当り1分Ｔのマレイミドを持っていることが分かった。この修飾には酵素活性への影響はなかった。 2-イミノチオラン(Piｅrce Chemical Co.)で抗体を修飾した。0.35mgの抗体溶液を0.055mgの、0.1Mトリエタノールアミン、2mM EDTA、pH 8.0中の2-イミノチオランと嫌気的条件下で混ぜて、１時間45分間攪拌して反応させた。修飾抗体は、0.02Mの酢酸ナトリウム、0.1M NaCl、pH5.8で平衡化し、Heガスで充填維持された1X13cmのG-25ミジウム・カラムにかけて精製した。この修飾抗体を直接、修飾カルボキシペプチダーゼA溶液に回収した。その結果得られた溶液をNaOHでpH を7.4に調整し、嫌気下で4℃18時間の攪拌により反応させた。（オプションとして、未反応のマレイミド基を室温で1時間0.3Mメルカプトエタノールと反応させて取り除くこともできる）。得られた濃縮複合体をSuperose 12HR 10/30によるクロマトグラフィにより、凝集物、未反応の酵素及び小分子より精製した。複合体の酵素比活性を調べて、複合体の抗体との比が１対１となるのに適当であることが分かった。抗体(Campath-IH^RもしくはING-1)％免疫反応性及び複合体の抗原結合親和性は共に高いことが分かった。例214 上記例４で記述したプロトコールで酵素を修飾し、一方抗体はジチオトレイトールで修飾した。0.7mgの抗体溶液を、350μlの0.1Mトリエタノールアミン-HCl 、2mMEDTA、pH8.0中の0.035μmolのジチオトレイトールと混合させ、嫌気下で１時間攪拌して反応させた。修飾済み抗体を、 0.02M酢酸ナトリウム、0.1M NaCl、pH5.8で平衡化し、Heガスで充填維持された１Xl3cm G-25ミジウム・カラム(medium column)にかけて精製した。精製抗体溶液を直接、修飾カルボキシペプチダーゼAの溶液に回収した。この溶液にNaOH加えてpHを7.4に調節し、嫌気的条件にして24℃で30分間、その次に４℃で18時間攪拌して反応させた。この溶液を1ml濃縮した。濃縮したこの複合体をSuperose 12 HR 10/30カラム・クロマトグラフィにより凝集物と未反応の酵素及び小分子から精製した。複合体の酵素比活性は複合体の抗体との比を1対1とするのに適当であることを示した。抗体％免疫反応性及び抗原結合親和性はともに高いことが分かった。例215 例４に記載のプロトコールで酵素の修飾を行ったが、一方抗体はSATA(Pierce Chemiacal Co.)で修飾した。0.225mgの抗体溶液を、全容量が150μlのダルベッコのリン酸緩衝塩液(PBS)中の0.003mgのSATAと混合し、45分間攪拌して反応させた。PBSで平衡化した1X13cmG-25ミジウム・カラムを使って、修飾済み抗体を精製した。精製修飾抗体を修飾酵素と混合し、嫌気下において、300μlの嫌気0.5M NH₂OHを加えて溶液を25℃2時間、その次に4℃18時間攪拌させて反応させた。未反応マレイミドを0.3mMのメルカプトエタノールと室温で1時間反応させて取り除き、その溶液を次に1mlにまで濃縮した。濃縮済み複合体をSuperose 12 H R 10/30により、凝集物、未反応酵素及び小分子より精製した。複合体の酵素比活性は複合体の抗体との比を１対１とするのに適当であることを示した。抗体抗原結合親和性は高いことが分かった。例216 変異体HCPA1の発現野生型(WT)プロCPA1 cDNA(上述した酵母アルファ因子リーダとの融合物)を持つpMP36をNcoI及びSalIで消化し、481塩基対のcDNA断片を得た。この断片はヌクレオチドの893番目より始まり、HCPA1の3’末端の最後の部分にまで延びていて、成熟HCPA1の186-309番目のアミノ酸配列をコードしている。上記NcoI-SalI断片をpGEM5zf(−)のNcoI、SalI部位へ連結してpHCPAINS（図3）を作成した。pHCP AINSを次にSphIとSalIとで消化し、HCPA1のNcoI-SalI部分ととpGEM5zf(−)由来の追加部（９塩基対）の配列とからなる断片を得た。このSphI-SalI断片をM13m1 9(BRL)へ、クローニング部にあるSphIとSalI部位とを使ってクローニングし、M1 3mp19HCPA1（図４）を作成した。 T7-GEN In Vitro Mutagenesis Kit(United States Biochemical,No 74500)を使ったオリゴヌクレオチドによる変異導入法における鋳型として、一本鎖 M13mp19HCPA1 DNAを使用した。上記のMutagenic oligonucleotideプライマ(Olig o Etc)を使って、1255(ATT)とT268(ACC)を別個にもしくは直列で(intandem)変異させた。変異コドンは下線を引いた。これらのオリゴヌクレオチド・プライマを使って、以下に示したHCPAIの変異体を作成した： 1. I255A 2. T268A 3. T268G 4. I255A/T268A 上記変異体HCPA1カセットのそれぞれについて配列を決めて所望のDNA変異のみが起きたことを確認した。 pMP36HCPA1w.t.をNcoIで消化して、1.2キロ塩基対の断片を得て、それをM13mp19HCPA1変異体のNcoI部位へクローニングした。NcoI 断片のM13mp19プロHCPA1変異体（図５）への挿入した向きを確認した後、そのDN AをHindIIIとSalIとで消化し、全プロHCPA1変異体酵素をコードしている1.2キロ塩基対の断片を得た。この断片をpMP36のHindIIIとSalI部位へ連結し、例２と３とにおいて示された方法によりS.cerevisiae中で発現させるのに使える、pMPHCP A1変異体を作成した。例217 変異体HCPA1の発現あるいは、Clontech Laboratories，Inc.の単一部位削除(USE)法を製造業者の推奨する試薬とプロトコールにより、pMP36プラスミド(pMP36HCPA1)中のhCPAに変異をうまく入れた。そのプロトコールでは、プラスミドpMP36HCPA1中の単一のEcoRI部位削除法を使い、オリゴヌクレオチドXS5(TCCCCCGGGCTGCAGGATATCGATAGCTGGGCTGTGT)による選択を行った。本プロトコールによってhCPA中に3つの特異的変異を発生させるために、以下のオリゴヌクレオチドを使った：オリゴヌクレオチド XT2(ATCAAGTACTCCTCCCAGCTCCGGG AC)を用いてT268H(ACCコドンをCACへ)変異を発生させた。オリゴヌクレオチド XT3(TTTATCAAGCCAGTGGAGGTATTGACT GGACC)を用いてS253G(AGCコドンをGGTへ)変異を発生させた。オリゴヌクレオチド XT4(AAGGCAATTTATCAAGGCAGTGGAAGC ACTATT)を用いてA253G(AGCコドンをGGTへ) 変異を発生させた。変異体は上記オリゴヌクレオチドと、単一EcoRI部位を削除する XS5(TCCCCCGGGCTGCAGGATATCGATAGCTGGGCTGTGT)とを用いて単離した。野生型pMP3 6(hCPA)をEcoRIで消化して、所望の変異を含むプラスミドを選択した(非切断のプラスミドは切断された線状のプラスミドに比べて10倍から100倍効率よく形質転換する)。更に、後の変異体選択に使えるEcoRV部位がXS5選択オリゴヌクレオチドによって導入される。変異体プラスミドでは、EcoRV部位は単一であり、そのためにEcoRV部位をEcoRI部位に復元するオリゴヌクレオチドを使って、二重変異を構築するための選択部位として使うことができる。このように構築された変異体pMP36HCPAは、次に例2と3とで記載された方法により、S.cerevisiae中での発現用に処理することが可能である。例218 プロドラッグの生体内での安定性と生体分布性 PBS(pH6-8)で5mg/mlの溶液にしたプロドラッグを、腹腔内もしくは静脈内投与により50mg/kgの一回投与でマウスに投与した。30分後及び2時間後に解剖して血しょうと組織を回収した。血しょうは-70℃で凍結し、組織は液体窒素で瞬時に凍結させた後に-70℃で保存した。解剖のそれぞれの時間において二匹で一組の検体として解剖した。血しょうは、氷冷した0.1NのHClでの４倍希釈により抽出用に調製した。組織は、氷冷した５倍量の0.1NのHCl中で、PTA 7ジェネレータを装着したPolytron(Brinkman Instruments，Westbury,NY)を使ったホモジナイズによる抽出用に調製した。次に、0.1Nホモジネート200μlに対して500μlの-20 ℃アセトニトリルを加えてドラッグを抽出した。氷中で５分間インキュベーションした後、試料を12,400 X ｇで15分間遠心した。上清を回収しPBSで3.57倍に希釈し、アセトニトリルの最終濃度を20％にまで下げた。希釈済み上清を以下に示す方法でHPLCにより分析した。ドラッグの回収率は対照の組織のホモジネートに、アセトニトリル抽出の前にドラッグもしくはプロドラッグを混ぜて推定した。これらの標準物の回収率を補正した後、組織中のドラッグ及びプロドラッグのレベルと、組織中のプロドラッグの安定性とを、HPLCにより計算した。試料は、UV検出機のついたC18ガード・カラムを装着した４μmC18 Nova-Pak 3.9X300mmスチールのHPLCカラムを使い、1ml/分の流速で分析した。分析用の化合物によりアセトニトリルの濃度を５％か20％のどちらかに変えてあるpH3.0の２％酢酸溶液で平衡化したHPLCカラムに試料をのせた。試料をカラムにかけて25分間もしくは35分間、線形勾配をかけてアセトニトリル濃度を50％にまで上昇させた。16％のアセトニトリルを含む、５mM硫酸水素テトラブチルアンモニウム、10mM NH₄H₂PO₄で平衡化した10μm C18 uBondapakカラム(3 .9X300mm)で３つの化合物(ASP-MTX,o-cyclopentyl-PHE-MTX,m-cyclopentyl-PHE- MTX)を分析した。次にカラムを線形勾配でアセトニトリル濃度を50%にまで30分間で上昇させて溶出させた。結果は表１に示した。これらの結果は、化合物番号10の様な、野生型CPAのよい基質は生体内では安定ではないことを示している。この種の化合物はADEPTには使えない。しかしながら、変異酵素に対してはよい基質であるが野生型酵素に対してはそうではない化合物、たとえば8、9、11、12、13、14などは生体内で安定であり、ADEPTに使うことができる。表１に示したデータは、分単位で検出したプロドラッグの濃度を、血しょうの場合はμMで、組織の場合はnmol/gで表示してある。括弧で囲んだ数字はプロドラッグの安定性を示しており、これは無変化のプロドラッグが、ドラッグとプロドラッグの総量に対してどれだけあるかという割合で表現した。とくに表示されていないときは、実験は全てCD-1ヌードマウスを用いて行った。表１に示したプロドラッグは以下のとおりである。１．N-(N-(4(((1,2-ジヒドロ-3-メチル-1-オクソベンゾ(F)キナゾリン-9-イル )メチル)アミノ)-2-フルオロベンゾイル)-L-グルタミン-1-イル)-L-グルタミン酸２．N-((S)4-カルボキシ-2-(5((（1,2-ジヒドロ-3-メチル-1-オクソベンゾ(F) キナゾリン-9-イル)メチル)アミノ)-1-オクソ-2-イソインドリニル)ブタノイル) -L-フェニルアラニン３．N-(N-(2-フルオロ-4-(((1,2-ジヒドロ-3-メチル-1-オクソベンゾ(F)キナゾリン-9-イル)メチル)アミノ)ベンゾイル)-L-グルタミン-1-イル)-3-(1-ナフチル)-L-アラニン４．N-(N-(4(((1,2-ジヒドロ-3-メチル-1-オクソベンゾ(F)キナゾリン-9-イル )メチル)アミノ)-2-フルオロベンゾイル)-L-グルタミン-1-イル)-2-カルボキシ- L-フェニルアラニン５．N-(N-(4(((1,2-ジヒドロ-3-メチル-1-オクソベンゾ(F)キナゾリン-9-イル )メチル)アミノ)-2-フルオロベンゾイル)-L-グルタミン-1-イル-2-ヨード-L-フェニルアラニン６．N-(4-((2,4-ジアミノ-6-プテリジニル)メチル)メチルアミノ)ベンゾイル) -L-グルタミン-1-イル-L-フェニルアラニン７．N-(4-((2,4-ジアミノ-6-プテリジニル)メチル)メチルアミノ)ベンゾイル) -L-グルタミン-1-イル-2-カルボキシ-L-フェニルアラニン８．N-(4-((2,4-ジアミノ-6-プテリジニル)メチル)メチルアミノ)ベンゾイル) -L-グルタミン-1-イル-2-シクロペンチル-L-フェニルアラニン９．N-(4-(((2,4-ジアミノ-6-プテリジニル)メチル)メチルアミノ)ベンゾイル )-L-グルタミン-1-イル-3-シクロペンチル-L-フェニルアラニン１０．N-(4-(((2,4-ジアミノ-6-プテリジニル)メチル)メチルアミノ)ベンゾイル)-L-グルタミン-1-イル-L-フェニルアラニン１１．N-(4-(((2,4-ジアミノ-6-プテリジニル)メチル)メチルアミノ)ベンゾイル)-L-グルタミン-1-イル-3-シクロブチル-L-フェニルアラニン１２．N-(4-(((2,4-ジアミノ-6-プテリジニル)メチル)メチルアミノ)ベンゾイル)-L-グルタミン-1-イル-3-tert-ブチル-L-フェニルアラニン１３．N-(4-(((2,4-ジアミノ-6-プテリジニル)メチル)メチルアミノ)ベンゾイル)-L-グルタミン-1-イル-3-シクロペンチル-L-チロシン１４．N-(4-(((2,4-ジアミノ-1,6-ジヒドロ-6-オクソ-5-ピリミジニル)アミノ )ベンゾイル)-L-グルタミン-1-イル-3-シクロペンチル-L-フェニルアラニン例219 ヒトCPA1の分子モデル化 Brookhavenタンパク質データベース(BernsteinF.C.et al.，J.Mol.Biol.112,5 35-542[1977])を使って配列相同性に基づいて検索し、ウシCPAがヒトCPA(HCPA) と最も構造的に似ているものとして同定された。HCPAモデルを作るために使用されたCOMPOSERアルゴリズムは、一部が商業的に入手可能なSYBYL分子モデル化パッケージであり、TRIPOS Associates(SYBYL Molecular Modeling Software,バージョン5.3、1989年11月)が販売している。COMPOSERアルゴリズムを使ってヒトCP A配列のアミノ酸残基を、ウシCPAの結晶構造の3D座標適合させ、最善のものを決定して、HCPAの3D立体構造を決定した。例220 細胞培養ターゲティグングと治療 Wein-133B-細胞リンパ腫の細胞を、野生型HCPA1とCampathとの複合体と共に30 分間培養した。細胞を洗浄して未結合の複合体を除去し、500,000細胞/mlの濃度で培養液へ戻した。プロドラッグMTX-Pheの濃度を種々に設定し、細胞を培養して増殖阻止のレベルを３日後に分析した。結果を図１に示した。変異体268GlｙとCampathとの複合体を、野生型を使った複合体の代わりに用いたときにも同様の結果が得られた。例221 プロドラッグの毒性本発明の安定なプロドラッグは生体内で安定であるのに加えて、宿主内でより毒性が低くあるべきであるが、それはより多量のプロドラッグ投与を可能にし、更にその結果として局所的に活性物を高濃度にすることを可能にするためである。マウス(メス、CD-1 nu/nu株)でのメトトレキセイトに関する最高の許容投与量は、4mg/kg IV一日一回５日間であることが判明した。N-(4-(((2,4-ジアミノ-6- プテリジニル)メチル)メチルアミノ)ベンゾイル)-L-グルタミン-1-イル-2-シクロペンチル-L-フェニルアラニンの許容投与量は最大で20mg/kg IV一日一回５日間で、N-(4-(((2,4-ジアミノ-6-プテリジニル)メチル)メチルアミノ)ベンゾイル )-L-グルタミン-1-イル-3-シクロペンチル-フェニルアラニンもしくはN-(4-(((2 ,4-ジアミノ-6-プテリジニル)スチル)メチルアミノ)ベンゾイル)-L-グルタミン- １-イル-3-tert-ブチル-L-フェニルアラニンは40mg/kg IV一日一回５日間の投与でも全く毒性を示さなかった；それゆえに、後者の二つの最大許容投与量は40mg /kgよりも大きい。Swiss nu/nuマウスではメトトレキセイトに対する最大許容投与量は2.5mg/kg IV毎日投与で五日間である。これらのマウスでは、N-(4-(((2,4 -ジアミノ-6-プテリジニル)メチル)メチルアミノ)ベンゾイル)-L-グルタミン-１-イル-3-シクロペンチル-L-チロシンは50mg/kg IV毎日投与で五日間まで許容し、一方N-(4-((（2,4- ジアミノ-6-プテリジニル)メチル)メチルアミノ)ベンゾイル)-L-グルタミン-１- イル-3-シクロブチル-L-フェニルアラニンは30mg/ml IV毎日投与で五日間では幾分の毒性を示した。ゆえに、Swiss nu/nuマウスではN-(4-(((2,4-ジアミノ-6-プテリジニル)メチル)メチルアミノ)ベンゾイル)-L-グルタミン-１-イル-3-シクロペンチル-L-チロシンとN-(4-(((2,4-ジアミノ-6-プテリジニル)メチル)メチルアミノ)ベンゾイル)-L-グルタミン-１-イル-3-シクロブチル-L-フェニルアラニンに対するMTDは五日間の毎日投与でそれぞれ＞50mg/ｋgと、＜30mg/kgである。それゆえに本発明のプロドラッグは実際にそれぞれの対応する活性物よりも、より許容される。例222 安定なプロドラッグ存在下でのヒトカルボキシペプチダーゼA1変異体の活性ここに記述するように、本発明で示されている生体内で安定なプロドラッグは、腫瘍部で選択的に活性化されるという点において野生型の酵素よりも変異型の酵素の方が優れている。表2には野生型カルボキシペプチダーゼA1もしくは268位のthrをAlaかGlyに変異させたものと数種類のメトトレキセイトプロドラッグとの酵素反応速度論を示している。表中で最も関連のある反応動力学定数はkcat/Kmであり、これにより、酵素が触媒するプロドラッグからメトトレキセイトへの変換の2次の反応速度定数を推定できる。それゆえにkcat/Kmが大きくなると、酵素がより効率よく特異的な基質に作用していることを示す。ヒトカルボキシペプチダーゼA1の野生型とそれに対する最良の基質のN-(4-(((2,4-ジアミノ-6-プテリジニル)メチル)メチルアミノ)ベンゾイル)-L-グルタミン-１-イル-L-フェニルアラニン、即ちMTXのプロドラッグ、との間のkcat／Kmは0.44／uM/secである。ヒトCPA1に対するN-(4 -(((2,4-ジアミノ-6-プテリジニル)メチル)メチルアミノ)ベンゾイル)-L-グルタミン-１-イル-3-シクロベンチル-L-フェニルアラニン、N-(4-(((2,4-ジアミノ-6 -ブテリジニル)メチル)メチルアミノ)ベンゾイル)-L-グルタミン-１-イル-3-ter tブチル-L-フェニルアラニン、N-(4-(((2,4-ジアミノ-6-プテリジニル)メチル) メチルアミノ)ベンゾイル)-L-グルタミン-１-イル-3-シクロブチル-L-フェニルアラニン、およびN-(4−(((2,4-ジアミノ-6-プテリジニル)メチル)メチルアミノ )ベンゾイル)-L-グルタミン-１-イル-3-シクロベンチル-L-チロシンのkcat/Km値はかなり低い；実際に後者の４つのプロドラッグをヒトPAが触媒する反応は測定できない。しかしながら、以上五つの安定なプロドラッグと268位がGlyの変異体とのkcat/Kmはそれぞれ0.157、0.092、0.38、1.8、0.18／uM/secである。268位の thrをglyに変換すると、野生型ではほとんど変換されなかった基質が、変異型では非常によい基質となった。実際に、N-(4-(((2,4-ジアミノ-6-プテリジニル)メチル)メチルアミノ)ベンゾイル)-L-グルタミン-１-イル-3-tertブチル-L-フェニルアラニンの場合268Glyのプロドラッグへの活性は、ヒトCPA1に対する最良の基質、N-(4-(((2,4-ジアミノ-6−プテリジニル)メチル)メチルアミノ)ベンゾイル) -L-グルタミン-１-イル-L-フェニルアラニンへの活性と違いがない。更に、N-(4 -(((2,4-ジアミノ-6-プテリジニル)メチル)メチルアミノ)ベンゾイル)-L-グルタミン-１-イル-3−シクロブチル-L-フェニルアラニンの場合、268Glyの活性はCPA 1のN-(4-(((2,4-ジアミノ-6-プテリジニル)メチル)メチルアミノ)ベンゾイル)-L -グルタミン-１-イル-L-フェニルアラニンに対する活性より四倍よい。それゆえに、以上の化合物は変異型酵素に対して野生型よりもよい基質であり、その反応により腫瘍に対して非常に特異的に非毒性で安定なプロドラッグを活性化物に変える。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:865） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ブルーメンコプフ、トッド・アンドリューアメリカ合衆国、ノース・カロライナ州 27516、チャペル・ヒル、ハンター・ヒル・ロード 201 (72)発明者コリー、マイケルアメリカ合衆国、ノース・カロライナ州 27514、チャペル・ヒル、シーダー・ストリート 55

Claims

【特許請求の範囲】１．特別な哺乳動物細胞に対する酵素を輸送することができるターゲッティング分子及び該ターゲッテイング分子に複合体形成され、機能的に不活性な化学療法剤の前駆体をその活性型に触媒できる哺乳動物酵素を含有する複合体であって、該酵素が突然変異体であり、該前駆体が野生型の酵素によって内因的の触媒作用に対して無反応性であるもの。２．請求の範囲第１項に記載の複合体であって、該酵素がヒドラーゼ、トランスフェラーゼ、オキシド−リダクターゼ、イソメラーゼ、リアーゼ、及びリガーゼの１つである複合体。３．請求の範囲第２項に記載の複合体であって、該ヒドラーゼがペプチダーゼである複合体。４．請求の範囲第２項に記載の複合体であって、該ヒドラーゼがエステラーゼである複合体。５．請求の範囲第３項に記載の複合体であって、該ペプチダーゼがエキソペプチダーゼである複合体。６．請求の範囲第３項若しくは４項に記載の複合体であって、請求の範囲第３項のペプチダーゼ又は請求の範囲第４項のエステラーゼが、カルボキシペプチダーゼである複合体。７．請求の範囲第６項に記載の複合体であって、該カルボキシペプチダーゼがヒトカルボキシペプチダーゼＡである複合体。８．請求の範囲第７項に記載の複合体であって、該ヒトカルボキシペプチダーゼＡが、残基２０３、２１０、２４２、２４４、２５０、２５３、２５５、２６７、２６８、２６９及び３０５の１以上でアミノ酸置換を有するＨＣＰＡ１若しくはＨＣＰＡ２である複合体。９．請求の範囲第８項に記載の複合体であって、該アミノ酸置換が以下から選択される複合体。２５０及び２６８のＧｌｙ２５３及び２６８のＧｌｙ２５０及び２６８のＨｉｓ２５０のＧｌｙ２５５のＡｌａ及び２６８のＨｉｓ２６８のＨｉｓ、及び２６８のＧｌｙ。１０．請求の範囲第９項に記載の複合体であって、置換が２６８のＧｌｙである複合体。１１．請求の範囲第８項から第１０項の何れかに記載の複合体であって、全ての他の残基が野生型である複合体。１２．請求の範囲第１項から第１１項に記載の複合体であって、該ターゲッティング分子が、抗体、ホルモン、リガンド、サイトカイン、抗原、オリゴヌクレオチド及び疑似ペプチドの１つである複合体。１３．請求の範囲第１２項に記載の複合体であって、該抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又はこれらのフラグメントである複合体。１４．請求の範囲第１３項に記載の複合体であって、該抗体又はそのフラグメントがヒト化された複合体。１５．請求の範囲第１項から第１４項の何れかに記載の複合体であって、該ターゲッティング分子がリンカー分子によって酵素と結合されている複合体。１６．請求の範囲第１項から第１４項の何れかに記載の複合体であって、単一のＲＮＡ転写若しくは多重のＲＮＡ転写から翻訳されるもの。１７．請求の範囲第１６項で請求される複合体をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ分子。１８．請求の範囲第１７項で請求されるＤＮＡ及びＲＮＡを含有するベクター。１９．請求の範囲第１７項で請求されるＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又は請求の範囲第１８項で請求されるベクターを含有する細胞系。２０．下記一般式IIの化合物並びにその塩、Ｎ−オキシド、溶媒和化合物、生理学的に機能的な誘導体。但し、ＸはＮＨ又はＯを表し、Ｒ²は、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、ＳＯ₂Ｈ、ＯＳＯ₃Ｈ、ＰＯ₃Ｈ₂、ＯＰＯ₃Ｈ₂ 、Ｃ_1-6アルキルエステル化されたＣＯ₂Ｈ、Ｃ_1-6エステル化されたＰＯ₃Ｈ₃、Ｃ_4-12 アルキル、Ｃ_4-12アルケニル、Ｃ_4-12アルキニル、Ｃ_4-12の枝分かれしたアルキル、Ｃ_1-8アルキル若しくはＣ_3-8の枝分かれしたアルキルであって、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、ＳＯ₂Ｈ、ＯＳＯ₃Ｈ、ＰＯ₃Ｈ₂、ＯＰＯ₃Ｈ₂、Ｃ_1-6アルキルエステル化されたＣＯ₂Ｈ、Ｃ_1-6アルキルエステル化されたＰＯ₃Ｈ₂、ヒドロキシル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、シアノ又はカルボキサミドで置換されたもの；Ｃ_3-8シクロアルキル、アリール若しくはヘテロアリールであって、Ｃ_1-8アルキル、Ｃ_3-8枝分かれしたアルキル、Ｃ_3-8シクロアルキル、Ｃ_3-6アルケニル、Ｃ₂ _-6 アルキニル、Ｃ_4-6シクロアルケニル、トリ置換シリル、即ち（Ｒ¹³）（Ｒ¹⁴ ）（Ｒ¹⁵）Ｓｉ（但し、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、及びＲ¹⁵はＣ_1-6アルキル、Ｃ_3-6枝分かれしたアルキルＣ_3-6シクロアルキル、Ｃ_3-6アルケニル、Ｃ_2-6シクロアルキニル、Ｃ_4-6シクロアルケニル、アリール、又はヘテロアリールであり、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴ 、及びＲ¹⁵はそれぞれ同じ基であるか又は異なった基である（例えば、トリメチルシリル、tert−ブチルジメチルシリル、シクロヘキシルジメチルシリル、又はフェニルジメチルシリル））、アリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、ＳＯ₂Ｈ、ＯＳＯ₃ Ｈ、ＰＯ₃Ｈ₂、ＯＰＯ₃Ｈ₂、Ｃ_1-6アルキルエステル化されたＣＯ₂Ｈ、Ｃ_1-6アルキルエステル化されたＰＯ₃Ｈ₂、カルボキサミド、ヒドロキシル、Ｃ_1-6アルコキシ、Ｃ_1-6アルキルチオ、メルカプト、ハロ、ハロアルキル、ニトロ又はシアノで任意に置換されたものを表わす。Ｒ^2a及びＲ^2bは、Ｈ、ヒドロキシ、メルカプト、アルコキシ、アルキルチオ、ハロ、シアノ、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、ＳＯ₂Ｈ、ＯＳＯ₃Ｈ、ＰＯ₃Ｈ₂、ＯＰＯ₃Ｈ₂、Ｃ_1-6アルキルエステル化されたＣＯ₂Ｈ、カルボキサミド、Ｃ_1-6アルキルエステル化されたＰＯ₃Ｈ₂、環状Ｃ_2-6［即ち、Ｒ^2a及びＲ^2b は、一緒になって（ＣＨ₂）_2-6を表す。］、三置換されたシリル、即ち（Ｒ¹³ ）（Ｒ¹⁴）（Ｒ¹⁵）Ｓｉ（但し、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、及びＲ¹⁵はＣ_1-6アルキル、Ｃ_3-6 の枝分かれしたアルキル、Ｃ_3-6シクロアルキル、Ｃ_3-6アルケニル、Ｃ_2-6アルキニル、Ｃ_4-6シクロアルケニル、アリール、又はヘテロアリールであり、Ｒ¹³ 、Ｒ¹⁴、及びＲ¹⁵は同じ基であってもまた異なった基でもよい、例えば、トリメチルシリル、tert−ブチルジメチルシリル、シクロヘキシルジメチルシリル、若しくはフェニルジメチルシリル；又はＣ_1-6若しくはＣ_1-6の枝分かれしたアルキル或いはＣ_1-6シクロアルキル又はアリール若しくはヘテロアリールであって、ヒドロキシ、メルカプト、Ｃ_1-6アルコキシ、Ｃ_1-6アルキルチオ、ハロ、シアノ、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、ＳＯ₂Ｈ、ＯＳＯ₃Ｈ、ニトロ、ＰＯ₃Ｈ₂、ＯＰＯ₃Ｈ₂、Ｃ_1-6 アルキルエステル化されたＣＯ₂Ｈ、カルボキサミド、Ｃ_1-6アルキルエステル化されたＰＯ₃Ｈ₂、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_1-6の枝分かれしたアルキル、Ｃ_1-6シクロアルキル、三置換されたシリル、即ち（Ｒ¹³）（Ｒ¹⁴）（Ｒ¹⁵）Ｓｉ（但し、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴ 、及びＲ¹⁵はＣ_1-6アルキル、Ｃ_3-6の枝分かれしたアルキル、Ｃ_3-6シクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールであり、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、及びＲ¹⁵は同じ基であってもまた異なった基でもよい、例えば、トリメチルシリル、tert−ブチルジメチルシリル若しくはフェニルジメチルシリルで任意に置換されたものを表わすが、Ｒ^2a及びＲ^2bは両方ともヒドロキシ又はメルカプトでないという条件が付く。Ｆは式（IV）の部分を含有する但し、Ｒ¹はα−アミノ酸の側鎖に対応する基、例えばＨ、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_1-6アルケニル、Ｃ_1-6アルキニルであって、ＣＯ₂Ｈ、Ｃ_1-6アルキルでエステル化されたＣＯ₂Ｈ、ＯＰＯ₃Ｈ₂、ＰＯ₃Ｈ₂、Ｃ_1-6アルキルでエステル化されたＰＯ₃Ｈ₂、ハロ、ヒドロキシ、カルボキサミド、Ｃ_1-6アルキルで任意に置換されたアミノ、シアノ又はニトロで任意に置換されたものを表す。Ｅは、を表し、これらの各々は、１以上のヒドロキシ、１以上のアルコキシ、ハロ、又は１以上のヒドロキシ、Ｃ_1-6アルコキシ若しくはハロで任意に置換されたＣ_1-6 アルキルで任意に置換されうる。Ｄは、−ＣＨ₂ＣＨ（Ｒ³）−、−ＣＨ₂−ＮＲ³−、−ＮＲ³−ＣＨ₂−、− ＣＨ₂Ｓ−又は−ＣＨ₂Ｏ−（但し、Ｒ³はＨ、Ｃ_1-6アルキル、アリル又はプロパルギルであって、１以上のＣ_1-6アルコキシハロ、ヒドロキシ若しくはシアノで任意に置換されたものを表す。並びに、Ｂは、但し、Ｒ⁴は、Ｈ、Ｃ_3-6の枝分かれしたアルキル、Ｃ_3-6シクロアルキル、又はＣ_1-6アルキルを表し；Ｒ⁵は、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_3-6の枝分かれしたアルキル、Ｃ_3-6シクロアルキル、アミノ（Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_1-6アルカノイル若しくはベンジルで任意に置換されたもの）を表し；Ｒ⁶は、Ｈ、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_3-6の枝分かれしたアルキル、Ｃ_3-6シクロアルキル、アミノ（Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_1-6アルカノイル若しくはベンジルで任意に置換されたもの。）、Ｃ_1-6アルコキシ又はＣ_1-6アルキルチオを表し；Ｒ⁷は、Ｈ、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_3-6の枝分かれしたアルキル、Ｃ_3-6シクロアルキル、ハロＣ_1-6アルキル又はハロを表す。但し、以下の化合物は新規なプロドラッグの定義の範囲内に含まれないが、治療におけるこれらの化合物の使用は、本発明の位置態様を形成する。Ｎ−（Ｎ−（４−（（（２−アミノ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−６−キナゾリニル）メチル）（２−プロピニル）アミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−アスパラギン酸、Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−Ｌ−フェニルアラニン、４−ビス（２−クロロエチル）アミノ）−フェニルアラニルフェニルアラニン、及び４−ビス（２−クロロエチル）アミノ）−フェニルアラニル−３，５−ジメチル−４−メトキシフェニルアラニン。２１．請求の範囲第２項に記載の化合物、並びにそれらの塩、Ｎ−オキシド、溶媒和化合物及び生理学的に機能的な誘導体であって、ＸはＮＨであり；Ｒ²は、Ｃ_3-6シクロアルキル又はアリールであって、Ｃ_1-8アルキル、Ｃ_3-8シクロアルキル、Ｃ_3-9の枝分かれしたアルキル若しくは三置換されたシリル、即ち（Ｒ¹³）（Ｒ¹⁴）（Ｒ¹⁵）Ｓｉ（但し、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、及びＲ¹⁵は、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_3-6の枝分かれしたアルキル、Ｃ_3-6シクロアルキル、アリール、若しくはヘテロアリールであり、更にＲ¹³、Ｒ¹⁴、及びＲ¹⁵は、同じ基であるか若しくは異なった基（例えば、トリメチルシリル、tert-ブチルジメチルシリル、シクロヘキシルジメチルシリル、若しくはフェニルジメチルシリル）である。）で置換されたものであり；Ｒ^2a及びＲ^2bは両方ともＨであり；Ｒ¹は、Ｈ、Ｃ_1-6アルキル、ＣＨ₂ＣＯ₂Ｈ、ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯ₂Ｈ又はＣＨ₂ＣＨ₂ ＣＨ₂ＮＨ₂であり；Ｅは、であり、Ｄは−ＣＨ₂ＮＨ−、−ＣＨ₂Ｎ（ＣＨ₃）−、−ＣＨ₂Ｎ（ＣＨ₂Ｃ≡ＣＨ）− 、−ＣＨ₂ＣＨ₂−又は−ＣＨ₂−ＣＨ（Ｃ₂Ｈ₅）−であり；並びに、Ｂは、であるもの。２２．請求の範囲第２０項に記載の化合物、並びにこれらの塩、Ｎ−オキシド、溶媒和化合物及び生理学的に機能定期な誘導体であって、ＸはＮＨである；Ｒ²は、フェニル若しくはパラ−ヒドロキシフェニルであって、シクロペンチル、シクロブチル若しくはtert−ブチルで置換されているものである。該シクロペンチル、シクロブチル及びtert−ブチル基はオルト−若しくはメタ−の両方であるか、これらの何れかであり得るが、好ましくはメタ−であり、Ｒ^2a及びＲ^2b はＨである。Ｒ¹はＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯ₂Ｈである。Ｅは、である。Ｄは、−ＣＨ₂Ｎ（ＣＨ₃）−であり、Ｂは、であるもの。２３．下式の化合物、及びこれらの塩、Ｎ−オキシド、溶媒和化合物及び生理学的に機能的な誘導体：Ｎ−（（Ｓ）−４−カルボキシ−２−（５−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（Ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−１− オキソ−２−イソインドリニル）ブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１ −イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロブチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−トリメチルシリル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−tert−ブチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−（４−（（３−（２，４−ジアミノ−１，６−ジヒドロ−６−オキソ−５ −ピリミジニル）プロピル）アミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル −３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−（４−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（Ｆ）キナゾリン−９−イル）メチル）アミノ）−２−フルオロベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル−メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ−チロシン、Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３，５−ジヨード−Ｌ−チロシン、Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル−Ｌ−グルタミン−１−イル−２−シクロペンチル−Ｌ−チロシン、（Ｓ）−３−（３−シクロペンチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−（（Ｎ −（４（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル）オキシ）プロピオン酸、Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−tert−ブチル−Ｌ−チロシン。２４．Ｎ−（４−（（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン−１−イル−３−シクロペンチル−Ｌ −チロシン及びこれらの塩、Ｎ−オキシド、溶媒和化合物及び生理学的に機能的な誘導体。２５．医学的な治療における請求の範囲第２０項から第２４項の何れかに記載の化合物の使用、又は請求の範囲第１項から第１６項のいずれかに記載の複合体の使用。２６．医学的な治療に使用するための医薬の製造のための、請求の範囲第２０項から第２４項の何れかに記載の化合物の使用、又は請求の範囲第１項から第１６項の何れかに記載の複合体の使用、又は請求の範囲第１９項に記載の細胞系の使用、又は請求の範囲第１８項に記載のベクターの使用、又は請求の範囲第１７項に記載のＤＮＡ若しくはＲＮＡの使用。２７．突然変異哺乳動物酵素及び細胞タイプに特異的なターゲッティング分子を含有する複合体の投与よりなるターゲット化された化学療法であって、該酵素が機能的に不活性な化学療法剤の前駆体を、該前駆体が内因性の触媒作用に無反応性であるその活性型に触媒することができる方法。２８．特別な細胞集団に結合する請求の範囲第１項から第１６項の何れかで請求された複合体を有する特別な細胞集団に対して治療が必要な患者の治療に使用するための医薬の製造における化学療法剤の前駆体の使用。２９．機能的に不活性な化学療法剤の前駆体をその活性型に触媒することができる突然変異哺乳動物酵素であって、該前駆体が内因性の触媒作用に無反応性であるもの。３０．請求の範囲第２９項に記載の酵素であって、該酵素がカルボキシペプチダーゼ活性を有するもの。３１．請求の範囲第３０項に記載の酵素であって、該酵素がヒトカルボキシペプチダーゼＡであるもの。３２．請求の範囲第３１項に記載の酵素であって、該酵素が、残基２０３、２１０、２４２、２４４、２５０、２５３、２５５、２６７、２６８、２６９及び３０５の１以上でアミノ酸置換を有するＨＣＰＡ１若しくはＨＣＰＡ２である酵素。３３．請求の範囲第３２項に記載の酵素であって、該アミノ酸置換が以下から選択される複合体。２５０及び２６８のＧｌｙ２５３及び２６８のＧｌｙ２５０及び２６８のＨｉｓ２５０のＧｌｙ２５５のＡｌａ及び２６８のＨｉｓ２６８のＨｉｓ、及び２６８のＧｌｙ。３４．請求の範囲第３３項に記載の酵素であって、該置換が２６８のＧｌｙである酵素。３５．請求の範囲第３２項から第３４項の何れかに記載の酵素であって、他の全ての残基が野生型である酵素。３６．請求の範囲第２９項から第３５項の何れかで請求した酵素をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ。３７．請求の範囲第３６項で請求したＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子を含有するベクター。３８．請求の範囲第３６項で請求したＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又は請求の範囲第３７項で請求したベクターを結合した細胞系。