CN101103018A - 治疗cns和淀粉样蛋白-相关疾病的化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了用于治疗或预防CNS和淀粉样蛋白相关疾病的方法、化合物、药用组合物和药剂盒。也描述了用于检测、诊断、监测和治疗或预防CNS和淀粉样蛋白相关疾病的方法、化合物、药用组合物和药剂盒。特别是描述了改进的血脑屏障(BBB)载体如苯丙氨酸衍生物，以提供选择CNS药物候选物的参数，所述CNS药物候选物被设计采用特殊的活性转运蛋白而渗透进脑内。

Description

治疗CNS和淀粉样蛋白-相关疾病的化合物
相关申请
本申请涉及并要求2004年11月16日提交的U.S.临时申请系列号60/628,631的优先权。
背景
淀粉样变性指以出现淀粉样蛋白原纤维为特征的病理性疾病。淀粉样蛋白是一类不同但却特殊的蛋白沉积物(细胞内或细胞外)的总称，其见于各种不同疾病。尽管它们的表现不同，但所有淀粉样蛋白沉积物都具有共同的形态学特征，可用特殊染料(如刚果红)染色，染色后在偏振光中具有特征性红-绿双折射表现。它们还具有共同的超微结构特点和共同的X线衍射和红外光谱。
淀粉样蛋白-相关疾病既可局限于一种器官也可扩散至几种器官。第一种情况称为“局限性淀粉样变性”，第二种称为“系统性淀粉样变性”。
虽然一些淀粉样蛋白疾病为特发性，但这些疾病大多作为先前存在的疾病的并发症出现。例如，出现原发性淀粉样变性(AL淀粉样蛋白)可以不伴随任何其它疾病，或者可以继发于浆细胞恶性增生或多发性骨髓瘤。
继发性淀粉样变性通常与慢性感染(如结核病)或慢性炎症(如类风湿性关节炎)有关。家族型继发性淀粉样变性可见于其它类型家族型淀粉样变性，如家族性地中海热(FMF)。这种家族型淀粉样变性是基因遗传疾病，可见于特殊人群。在原发性和继发性淀粉样变性中，都可在几种器官中发现沉积物，因此称为系统性淀粉样蛋白病。
“局限性淀粉样变性”通常涉及单一器官系统。也可通过沉积物中存在的蛋白类型鉴定不同的淀粉样蛋白。例如，神经变性疾病如羊瘙痒病、牛海绵状脑炎、克雅氏病等的特征是耐蛋白酶形式的朊病毒蛋白(称为AScr或PrP-27)在中枢神经系统的出现和积聚。类似地，另一种神经变性疾病阿尔茨海默氏病的特征是神经蚀斑和神经原纤维缠结。在这种情况下，在实质和血管中发现的淀粉样蛋白蚀斑通过原纤维Aβ淀粉样蛋白沉积形成。其它疾病如成年型糖尿病(II型糖尿病)的特征是淀粉样蛋白原纤维在胰腺中局部积聚。
一旦形成这些淀粉样蛋白，尚无显著原位溶解淀粉样蛋白沉积物、预防更多淀粉样蛋白沉积或者预防淀粉样蛋白开始沉积的被广泛接受的治疗或疗法。
每种淀粉样蛋白源性蛋白都能够进行构象变化，组织成β-折叠，形成可细胞外或细胞内沉积的不溶性原纤维。每种淀粉样蛋白源性蛋白，虽然氨基酸序列不同，但它们具有相同的形成原纤维和与其它成分(如蛋白多糖、淀粉样蛋白P和补体成分)结合的特征。而且，每种淀粉样蛋白源性蛋白的氨基酸序列虽然不同，但具有相似性，如能够与蛋白多糖的葡萄糖胺聚糖(GAG)段结合的区域(称为GAG结合位点)以及其它促进β-折叠形成的区域。蛋白多糖是各种大小和结构的大分子，几乎分布在机体各处。它们可出现在细胞内腔隙、在细胞表面和作为细胞外基质的一部分。所有蛋白多糖的基本结构都包括核心蛋白和至少一种(但通常多种)与核心蛋白连接的多糖链(GAG)。业已发现各种不同的GAG，包括硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素和透明质烷。
在特殊情况下，一旦淀粉样蛋白原纤维沉积，可对周围细胞产生毒性。例如，业已显示组成老年斑的Aβ原纤维与阿尔茨海默氏病患者死亡的神经元细胞、营养不良性神经炎、星形细胞增多和小神经胶质细胞增生有关。在体外测试时，显示低聚物(可溶性)以及原纤维状Aβ肽能够触发小神经胶质细胞(脑巨噬细胞)的活化过程，这可解释在阿尔茨海默氏病患者脑中发现的小神经胶质细胞增生和脑部炎症。低聚物和原纤维状Aβ肽在体外都可诱发神经元细胞死亡。参见如MP Lambert等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，6448-53(1998)。
在可见于II型糖尿病患者的另一类型淀粉样变性中，业已显示当淀粉样蛋白源性蛋白IAPP组成低聚物形式或原纤维时，在体外诱发β-岛细胞毒性。因此，在II型糖尿病患者的胰腺中出现IAPP原纤维促成β岛细胞(朗格汉斯)丢失和器官功能障碍，这可导致胰岛素血症。
另一类型淀粉样变性与β2微球蛋白有关，可见于长期血液透析患者。接受长期血液透析的患者在腕管和几个关节的富胶原组织处将出现β2-微球蛋白原纤维。这导致严重疼痛、关节僵直和肿胀。
淀粉样变性也是阿尔茨海默氏病的特征。阿尔茨海默氏病是脑的破坏性病变，引起导致痴呆的进行性记忆丧失、身体残疾，经过相当长的时间后引起死亡。随着发达国家中人群的老化，阿尔茨海默氏病患者的数量正趋于流行化的比例。
患阿尔茨海默氏病的人在成年期出现进行性痴呆，同时伴随3种主要的脑部结构变化：脑内多处神经元的弥漫性丧失；称为神经原纤维缠结的细胞内蛋白沉积物的积聚；和称为淀粉样蛋白或老年斑的细胞外蛋白沉积物的积聚，被畸形神经末梢(营养不良性神经炎)和活性小神经胶质细胞(小神经胶质细胞增生和星形细胞增多)包围。这些淀粉样蛋白蚀斑的主要成分是淀粉样蛋白-β肽(Aβ)，39-43个氨基酸蛋白，通过β-淀粉样蛋白前体蛋白(APP)分裂产生。对于Aβ沉积物在阿尔茨海默氏病中的相关性已进行广泛研究，参见如Selkoe，Trends in Cell Biology 8，447-453(1998)。Aβ天然来源于淀粉样蛋白前体蛋白(“APP”)在内质网(“ER”)、高尔基体或核内质溶酶体途径的代谢过程，多数正常分泌为40(“Aβ1-40”)或42(“Aβ1-42”)氨基酸肽(Selkoe，Annu.Rev.Cell Biol.10，373-403(1994))。Aβ为阿尔茨海默氏病的主要病因的支持点是在阿尔茨海默氏病的老年斑中出现细胞外Aβ沉积物，在含有突变的阿尔茨海默氏病相关基因的细胞中Aβ的产生增加，如淀粉样蛋白前体蛋白、早老素I和早老素II；和细胞外可溶性(低聚物)或原纤维状Aβ对培养细胞的毒性。参见如Gervais，Eur.Biopharm.Review，40-42(2001年8月)；May，DDT6，459-62(2001)。虽然存在对系统性治疗阿尔茨海默氏病的需求，但现在无法预防或治愈这种疾病。
阿尔茨海默氏病的特征是弥漫和神经蚀斑以及神经原纤维缠结。蚀斑和血管淀粉样蛋白相信是通过不溶性Aβ淀粉样蛋白沉积形成，这可被描述为弥散或原纤维的。可溶性低聚物Aβ和原纤维状Aβ都被认为是神经毒性和炎性的。
另一类型淀粉样变性是大脑淀粉样蛋白血管病(CAA)。CAA是淀粉样蛋白-β原纤维在软脑膜和皮质动脉、小动脉和静脉壁上的特殊沉积。它通常与阿尔茨海默氏病、唐氏综合征和正常老化，以及与各种涉及中风或痴呆的家族性疾病有关(参见Frangione等，Amyloid：J.Protein Folding Disord.8，Suppl.1，36-42(2001))。
目前可用的治疗β-淀粉样蛋白疾病的疗法几乎全部是系统性的，只可提供暂时或不完全的临床效益。例如对于阿尔茨海默氏病，尽管声称一些药物可缓解部分症状，但目前尚无有效预防或治疗的周全的药物疗法.
中枢神经系统(CNS)疾病或病症为一类神经病学疾病。CNS疾病可由药物诱导；也可归因于遗传易感受性、感染或创伤；或可具有未知的病因。CNS疾病可包括神经精神疾病、神经疾病和精神病；还包括神经变性疾病、行为异常，认知障碍和认知情感障碍。有几种CNS疾病，其临床表现归属于CNS机能障碍(即，由不当水平的神经递质释放、神经递质受体的不当特性和/或神经递质和神经递质受体之间的不当相互作用引起的疾病)。几种CNS疾病可归因于胆碱能缺乏、多巴胺能缺乏、肾上腺素能缺乏和/或5-羟色胺能缺乏。CNS疾病可能与淀粉样蛋白沉积有关或无关，或因淀粉样蛋白沉积引起。
发明概述
治疗CNS疾病和某些淀粉样蛋白相关疾病的一个长期问题是将治疗剂传递到脑中。本发明的目的是提供用于治疗CNS疾病和淀粉样蛋白相关疾病的化合物和组合物，它们有助于通过血脑屏障。已有两种通过血脑屏障的通用方法。第一种是被动扩散，需要高亲脂性结构以通过该屏障。第二种方法利用主动转运蛋白以促进跨过血脑屏障(BBB)的转运。本发明试图通过将BBB转运介质(如大的中性氨基酸)和用于治疗淀粉样变性的治疗剂结合成一种单一的化合物而构思在BBB中的主动转运蛋白。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及式I化合物：
A——Y——Q
其中：
Q是BBB转运介质；
Y为直接键或连接基团；
A是氢、烷基、烷氧基、链烯基、链烯基氧基、炔基、炔基氧基、碳环基、杂环基、二环基、芳基、杂芳基、稠环芳基或杂芳基、芳氧基、芳基烷基、芳基烷氧基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、噻唑基、三唑基、咪唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、
R4-S-CH2-、
Figure A20058004670400121
Figure A20058004670400122
R4-O-CH2-，或
Figure A20058004670400123
其各自可任选被取代；和
R4和R5与氮原子一起形成5或6元杂环，或各自独立选自氢、烷基、烷氧基、链烯基、链烯基氧基、炔基、炔基氧基、环烷基、芳基、芳氧基、芳基烷基、芳基烷氧基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、噻唑基、三唑基、咪唑基、苯并噻唑基和苯并咪唑基，其各自可任选被取代；
或其药学上可接受的盐、酯或前药。
在一些实施方案中，Q为5或6元芳族或杂芳族部分，其可被进一步取代。在其它实施方案中，Q为氨基酸部分或其类似物。Q可以是碱性氨基酸部分或其类似物，如精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和/或其类似物。Q还可以是酸性氨基酸部分或其类似物，如天门冬氨酸、谷氨酸和/或其类似物。而且，Q可以是小的中性氨基酸部分或其类似物，如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸和/或其类似物。Q也可以是大的中性氨基酸部分或其类似物，如苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、组氨酸、缬氨酸、苏氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷酰胺和/或其类似物。在其它实施方案中，连接基团为二硫键、醚键、硫醚键、亚烷基或亚烯基键、氨基或肼基(hydrozino)键、酯基(ester-based)键、硫代酸酯键、酰胺键、酸-不稳定键或席夫碱(Schiff base)键。
在另一个实施方案中，本发明涉及式II化合物：
Figure A20058004670400131
其中：
X为氧、氮或硫；
Y为直接键或连接基团；
Z1、Z2、Z3各自独立为C、CH、CH2、P、N、NH、S，或不存在；
R1和R2各自独立不存在，或为氢、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳基、芳烷基或酰基，其各自可任选被取代；
R3选自氢、烷基、芳基、酰氨基、芳基酰氨基、烷基羰基、芳基羰基、芳基氨基羰基、烷氧基羰基、烷磺酰基、芳烃磺酰基、环烷基磺酰基和杂芳烃磺酰基，其各自可任选被取代；
A是氢、烷基、烷氧基、链烯基、链烯基氧基、炔基、炔基氧基、碳环基、杂环基、二环基、芳基、杂芳基、稠环芳基或杂芳基、芳氧基、芳基烷基、芳基烷氧基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、噻唑基、三唑基、咪唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、
R4-S-CH2-、
Figure A20058004670400141
R4-O-CH2-，或
Figure A20058004670400142
其各自可任选被取代；和
R4和R5与氮原子一起形成5或6元杂环，或各自独立为氢、烷基、烷氧基、链烯基、链烯基氧基、炔基、炔基氧基、环烷基、芳基、芳氧基、芳基烷基、芳基烷氧基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、噻唑基、三唑基、咪唑基、苯并噻唑基或苯并咪唑基，其各自可任选被取代；
或其药学上可接受的盐、酯或前药。
在一个实施方案中，X为氧或氮。在另一个实施方案中，Y为直接键。在再一个实施方案中，Z1、Z2和Z3为N、C或CH。在又一个实施方案中，R1和R2各自独立不存在或为氢。在另一个实施方案中，R3为氢、芳基氨基、芳基氨基羰基或芳烃磺酰基，其各自可任选被取代。在再一个实施方案中，A为下列基团之一：R4-S-CH2-、
Figure A20058004670400143
或 其各自可任选被取代。
在又一个实施方案中，R4和R5各自独立为环烷基、芳基、芳氧基、芳基烷基、芳基烷氧基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、噻唑基、三唑基、咪唑基、苯并噻唑基或苯并咪唑基，其各自可任选被取代。在一些实施方案中，R4和R5各自独立为吡啶、嘧啶、嘧啶酮、四氢吡啶、哌啶、哌嗪、咪唑、苯并咪唑、唑、二唑、苯并唑、三唑、噻唑、苯并噻唑、四唑、噻二唑、吡唑并嘧啶、异喹啉或四氢异喹啉，其各自可任选被取代。在另一个实施方案中，R4和R5与氮原子一起形成被一个或多个另外的杂原子任选间断的6元环。在一些实施方案中，生成的6元环为非稠合环。在其它实施方案中，连接基团为二硫键、醚键、硫醚键、亚烷基或亚烯基键、氨基或肼基键、酯基键、硫代酸酯键、酰胺键、酸-不稳定键或席夫碱键。在一些实施方案中，本发明化合物为在表2或3或表2和3中显示的化合物。
在一个实施方案中，本文公开的化合物用于治疗CNS疾病或淀粉样蛋白相关疾病。可以用本发明化合物治疗的示例性疾病包括，但不限于阿尔茨海默氏病、脑淀粉样蛋白血管病、包涵体肌炎、黄斑变性、MCI、唐氏综合征、癫痫发作、神经病性疼痛、阿伯克龙比氏变性、获得性癫痫样失语症、Landau-Kleffner综合征、急性播散性脑脊髓炎、肾上腺白质营养不良(Adrenoleukodystrophy)、脑白质营养不良、认识不能、亚历山大病、大脑灰质营养不良(Alpers’Disease)、进行性致硬化神经灰质营养不良(poliodystrophy)、交替性偏瘫、肌萎缩性侧索硬化、Lou Gehrig’s病、Angelman综合征、毛细管扩张性运动失调、共济失调和小脑/脊髓小脑变性、注意力缺乏症、早老退化性痴呆、皮质下痴呆、Canavan病、脑低氧症、脑-眼-面-骨胳综合征、Pena Shokeir II型综合征、Charcot-Marie-牙、慢性炎性脱髓鞘多神经病(CIDP)、基于皮质的变性、克-雅病、退化性膝关节炎、糖尿病性神经病、早期婴幼儿癫痫性脑病、Ohtahara综合征、癫痫症、弗里德希氏共济失调、格-巴二氏综合征(GBS)、急性特发性多神经炎、哈-斯二氏病、伴有脑铁积聚的神经变性、杭廷顿氏舞蹈病、克腊伯氏病、Kugelberg-Welander病、脊柱肌萎缩(SMA)、I型SMA、II型SMA、III型SMA、肯尼迪氏综合征、进行性脊髓延髓肌萎缩、伴有关节弯曲的先天性SMA、成人SMA、莱内氏病、伦-加综合征、马-约病、3型脊髓小脑共济失调、单肢肌萎缩、多发性硬化、神经棘红细胞增多症、尼-皮病、橄榄体脑桥小脑萎缩、瘤外综合征、神经瘤外综合征、Lambert-Eaton肌无力综合征、僵人综合征、脑脊髓炎、重症肌无力、小脑退化、缘和/或脑干脑炎、神经肌强直、斜视眼阵挛和感觉神经病、帕金森氏病、佩-梅病、Pick’s病、原发性侧索硬化、进行性运动共济失调、梅毒性脊柱硬化、背侧脊髓痨(Tabes Dorsalis)、进行性核上麻痹、腊斯默森氏脑炎(Rasmussen’s Encephalitis)、Rett综合征、图雷特氏综合征、厄舍综合征、韦斯特综合征、婴儿抽搐、威尔逊氏病和肝豆状核变性。
在一个实施方案中，本文公开的化合物预防或抑制淀粉样蛋白在体内装配成不溶性原纤维沉积于各种器官中，或者它们可在已经出现沉积物的患者中清除形成的沉积物或减缓沉积。在另一个实施方案中，化合物也可预防淀粉样蛋白以其可溶性低聚物形式或其原纤维形式与细胞表面结合或粘附其上，引起细胞损伤或毒性。在还一个实施方案中，化合物可阻断淀粉样蛋白-诱发的细胞毒性或巨噬细胞活化。在另一个实施方案中，化合物可阻断淀粉样蛋白-诱发的神经毒性或小神经胶质细胞活化。在另一个实施方案中，化合物保护细胞免受淀粉样蛋白诱发的对胰腺β-胰岛细胞的细胞毒性。在另一个实施方案中，化合物可促进从特殊器官(如脑)中的清除，或者它可降低淀粉样蛋白蛋白浓度，以便在靶器官中预防淀粉样蛋白原纤维的形成。
本发明化合物可治疗性或预防性给药，以治疗与淀粉样蛋白原纤维形成、聚集或沉积有关的疾病。本发明化合物可用于改善淀粉样蛋白相关疾病的病程，通过任何一种下列机制(列举的内容仅用于说明而非限制性的)：减缓淀粉样蛋白原纤维形成或沉积的速率；减轻淀粉样蛋白沉积的程度；抑制、减少或预防淀粉样蛋白原纤维形成；抑制淀粉样蛋白诱发的神经变性或细胞毒性；抑制淀粉样蛋白诱发的炎症；促进淀粉样蛋白的清除；或者有助于淀粉样蛋白在其组成纤维之前降解。本发明化合物也可发挥改善CNS病的过程的作用，包括但不限于减轻癫痫发作的强度，预防癫痫发作或减轻神经病性疼痛。
本发明化合物可治疗性或预防性给药，以治疗与淀粉样蛋白-β原纤维形成、聚集或沉积有关的疾病。本发明化合物可用于改善淀粉样蛋白-β相关疾病的病程，通过任何一种下列机制(列举的内容仅用于说明而非限制性的)：减缓淀粉样蛋白-β原纤维形成或沉积的速率；减轻淀粉样蛋白-β沉积的程度；抑制、减少或预防淀粉样蛋白-β原纤维形成；抑制淀粉样蛋白-β诱发的神经变性或细胞毒性；抑制淀粉样蛋白-β诱发的炎症；促进淀粉样蛋白-β从脑内清除；或者有助于淀粉样蛋白-β蛋白在其组成原纤维之前降解
无论在它们进入脑(穿透血脑屏障后)之后或来自外周中，本发明的治疗化合物都可有效控制淀粉样蛋白-β沉积。当从外周作用后，化合物可改变脑与血浆之间的Aβ平衡，以促进Aβ从脑内排出。它也可增加神经元Aβ的分解代谢，改变从脑内排出的速率。Aβ从脑内排出增加将导致脑和脑脊液(CSF)中的Aβ浓度降低，因此有助于减少Aβ沉积。或者，穿透脑的化合物可通过直接作用于脑部Aβ来控制沉积，如通过维持其处于非低聚的或非原纤维形式帮助其从脑内清除，或者通过减缓APP加工。这些化合物还可预防脑内Aβ与细胞表面相互作用，从而预防神经毒性、神经变性或炎症。它们还可通过活化小神经胶质细胞减少Aβ产生。化合物还可通过巨噬细胞或神经元细胞增加降解。
类似地，本发明的治疗化合物在其进入脑(穿透血脑屏障)后或来自外周的化合物可有效地治疗CNS病或淀粉样蛋白相关疾病。优选本发明的治疗化合物促进越过BBB的转运且在其进入脑后通常可更加有效。
在一个实施方案中，该方法用于治疗阿尔茨海默氏病(如散发性、家族性或早期AD)。该方法也可用于预防性或治疗性治疗其它淀粉样蛋白-β沉积的临床事件，如唐氏综合征个体以及大脑淀粉样蛋白血管病(“CAA”)或遗传性脑出血患者。
在另一个实施方案中，该方法用于治疗轻度认知损伤。轻度认知损伤(“MCI”)是以思考能力处于轻度但可以测定的损伤状态为特征的疾病，它不一定伴随有痴呆出现。MCI通常，但不一定在阿尔茨海默氏病之前出现。
另外，APP和淀粉样蛋白-β蛋白在肌纤维中的异常聚集涉及散发性包涵体肌炎(IBM)(Askanas等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，1314-1319(1996)；Askanas等，Current Opinion in Rheumatology 7，486-496(1995))。因此，本发明化合物可用于预防性或治疗性治疗其中淀粉样蛋白-β蛋白异常沉积在非神经学部位的疾病，如通过将化合物传递至肌纤维治疗IBM。
另外，业已显示Aβ与异常细胞外沉积物(称为脉络膜小疣)有关，在年龄相关性黄斑变性(AMD)患者中，所述沉积物沿视网膜色素上皮细胞的基底面积聚。AMD是老年个体不可逆性视力丧失的原因。相信Aβ沉积可能是局部炎症事件的重要组分，其促使视网膜色素上皮细胞萎缩、脉络膜小疣生物发生和AMD发病(Johnson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(18)，11830-5(2002))。
因此，本发明涉及式I、式II化合物或本文描述的其它化合物在预防或治疗CNS疾病或淀粉样蛋白相关疾病中的用途，所述疾病特别包括阿尔茨海默氏病、脑淀粉样蛋白血管病、轻度认知损害、包涵体肌炎、唐氏综合征、黄斑变性，以及其它类型的淀粉样变性如IAPP相关的淀粉样变性(即，糖尿病)、原发性(AL)淀粉样变性、继发性(AA)淀粉样变性和β2微球蛋白-相关(渗析-相关)淀粉样变性；癫痫发作、神经病性疼痛、阿伯克龙比氏变性、获得性癫痫样失语症、兰-克综合征、急性播散性脑脊髓炎、肾上腺白质营养不良、脑白质营养不良、认识不能、亚历山大病、大脑灰质营养不良、进行性致硬化神经灰质营养不良、交替性偏瘫、肌萎缩性侧索硬化、Lou Gehrig’s病、安格尔曼综合征、毛细管扩张性运动失调、共济失调和小脑/脊髓小脑变性、注意力缺乏症、早老退化性痴呆、皮质下痴呆、Canavan病、脑低氧症、脑-眼-面-骨胳综合征、Pena Shokeir II型综合征、Charcot-Marie-牙、慢性炎性脱髓鞘多神经病(CIDP)、基于皮质的变性、克-雅病、退化性膝关节炎、糖尿病性神经病、早期婴幼儿癫痫性脑病、Ohtahara综合征、癫痫症、弗里德希氏共济失调、格-巴二氏综合征(GBS)、急性特发性多神经炎、哈-斯二氏病、伴有脑铁积聚的神经变性、杭廷顿氏舞蹈病、克腊伯氏病、Kugelberg-Welander病、脊柱肌萎缩(SMA)、I型SMA、II型SMA、III型SMA、肯尼迪氏综合征、进行性脊髓延髓肌萎缩、伴有关节弯曲的先天性SMA、成人SMA、莱内氏病、伦-加综合征、马-约病、3型脊髓小脑共济失调、单肢肌萎缩、多发性硬化、神经棘红细胞增多症、尼-皮病、橄榄体脑桥小脑萎缩、瘤外综合征、神经瘤外综合征、Lambert-Eaton肌无力综合征、僵人综合征、脑脊髓炎、重症肌无力、小脑退化、缘和/或脑干脑炎、神经肌强直、斜视眼阵挛和感觉神经病、帕金森氏病、佩-梅病、Pick’s病、原发性侧索硬化、进行性运动共济失调、梅毒性脊柱硬化、背侧脊髓痨、进行性核上麻痹、腊斯默森氏脑炎、Rett综合征、图雷特氏综合征、厄舍综合征、韦斯特综合征、婴儿抽搐、威尔逊氏病和肝豆状核变性(hepatolenticular degeneration)。
在II型糖尿病相关性淀粉样变性(IAPP)中，当淀粉样蛋白源性蛋白IAPP构成低聚物形式或原纤维时，可诱发β-胰岛细胞毒性。因此，在II型糖尿病患者的胰腺中IAPP原纤维的出现促使β胰岛细胞(朗格汉斯细胞)丢失和器官功能障碍，导致胰岛素血症。
原发性淀粉样变性(AL淀粉样蛋白)通常与浆细胞恶性增生和多发性骨髓瘤有关。还发现它是一种特发性疾病。
继发性(AA)淀粉样变性通常与慢性感染(如结核病)或慢性炎症(如类风湿性关节炎)有关。家族型继发性淀粉样变性也可见于家族性地中海热(FMF)。
β2微球蛋白-相关性(透析-相关性)淀粉样变性可见于长期血液透析患者。接受长期血液透析的患者的腕管和几个关节的富胶原组织中将出现β2-微球蛋白原纤维。这引起严重疼痛、关节僵直和肿胀。这些沉积物归因于在透析患者的血浆中不能保持低水平β2M。β2M蛋白血浆浓度增加将诱发结构改变，可能导致修饰的β2M作为不溶性原纤维沉积在关节中。
发明详述
本发明涉及式I化合物、式II化合物或本文描述的其它化合物在治疗中枢神经系统(CNS)疾病和/或淀粉样蛋白相关疾病中的用途。为方便起见，在下文列出本文涉及的一些术语定义。
中枢神经系统疾病
本文所用的术语“中枢神经系统疾病”和″CNS疾病″指在CNS，如脑和脊柱中的神经和/或精神病学改变，其表现为各种症状。CNS疾病状态的实例包括，但不限于偏头痛；脑血管供血不足；精神病包括妄想狂、精神分裂症、注意力缺乏和孤独症；强迫性障碍包括食欲缺乏和食欲过盛；惊厥疾病包括癫痫和成瘾物质的戒断症；认知障碍包括帕金森氏病和痴呆；和焦虑/抑郁症如事先(anticipatory)焦虑(如手术、牙科手术等之前发生的焦虑)、抑郁、躁狂、季节性情感的障碍(SAD)；和惊厥和成瘾物质如鸦片、苯并二氮杂、尼古丁、酒精、可卡因和其它滥用物质的戒断引起的焦虑。CNS疾病的其它非限制性实例包括，但不限于阿伯克龙比氏变性、获得性癫痫样语言不能(兰-克综合征)，急性播散性脑脊髓炎、肾上腺白质营养不良、认识不能、亚历山大病、大脑灰质营养不良、交替性偏瘫、肌萎缩性侧索硬化、安格尔曼综合征、毛细管扩张性运动失调、共济失调和小脑/脊髓小脑变性、注意力缺乏症、早老退化性痴呆、Canavan病、脑低氧症、脑-眼-面-骨胳综合征、Charcot-Marie-牙、慢性炎性脱髓鞘多神经病(CIDP)、基于皮质的变性、克-雅病、退化性膝关节炎、糖尿病性神经病、早期婴幼儿癫痫性脑病(Ohtahara综合征)，癫痫症、弗里德希氏共济失调、格-巴二氏综合征(GBS)、哈-斯二氏病、杭廷顿氏舞蹈病、克腊伯氏病、Kugelberg-Welander病(Spinal Muscular Atrophy)，莱内氏病、伦-加综合征、马-约病、黄斑变性，单肢肌萎缩、多发性硬化、神经棘红细胞增多症、尼-皮病、橄榄体脑桥小脑萎缩、瘤外综合征、帕金森氏病、佩-梅病、Pick’s病、原发性侧索硬化、进行性行动共济失调(梅毒性脊柱硬化、背侧脊髓痨)，进行性核上麻痹、腊斯默森氏脑炎、Rett综合征、图雷特氏综合征和厄舍综合征、West综合征(婴儿抽搐)和Wilson病。这样的疾病的一般特征为本领域所知。本领域技术人无需过度的实验，即能够鉴定本领域已知的其它的CNS疾病。
淀粉样蛋白相关疾病
以下为淀粉样蛋白相关疾病的非限制性实例。有些(但并非全部)淀粉样蛋白相关疾病也是CNS疾病。类似地，有些(但并非全部)CNS疾病为淀粉样蛋白相关疾病。列出这些疾病并不意味着相互排斥或是全部包含在内。
AA(反应性)淀粉样变性
一般而言，AA淀粉样变性是引起持续急性期反应的多种疾病的表现。此类疾病包括慢性炎性疾病、慢性局限性或系统性微生物感染和恶性肿瘤。最常见的反应性或继发性(AA)淀粉样变性形式是长期炎性疾病的结果。例如，类风湿性关节炎或家族性地中海热(一种遗传性疾病)患者可出现AA淀粉样变性。术语“AA淀粉样变性”和“继发性(AA)淀粉样变性”可互换使用。
AA原纤维通常由8,000道尔顿片段(AA肽或蛋白)组成，后者通过血清淀粉样蛋白A蛋白(ApoSAA)的蛋白水解的裂解形成，该蛋白是一种主要对诸如IL-1、IL-6和TNF的细胞因子反应性合成于肝细胞中的循环载脂蛋白。一旦分泌，ApoSAA与HDL复合。AA原纤维可广泛沉积在机体各处，优选实质器官。肾是常见的沉积部位，肝和脾脏也可受累。沉积还可见于心脏、胃肠道和皮肤。
可导致发生AA淀粉样变性的潜在性疾病包括，但不限于炎性疾病，如类风湿性关节炎、青少年慢性关节炎、强直性脊柱炎、牛皮癣、牛皮癣性关节病、莱特尔氏综合征、斯提耳氏病、贝切特氏综合征和克罗恩氏病。AA沉积物还由于慢性微生物感染产生，如麻风病、结核病、支气管扩张、褥疮、慢性肾盂肾炎、骨髓炎和惠普耳氏病。某些恶性肿瘤也可导致AA原纤维淀粉样蛋白沉积。此类疾病包括如何杰金氏淋巴瘤、肾癌、肠、肺和泌尿生殖道癌症、基底细胞癌和毛细胞性白血病。其它可能与AA淀粉样变性有关的潜在性疾病是Castleman’s病和Schnitzler’s综合征。
AL淀粉样变性(原发性淀粉样变性)
AL淀粉样蛋白沉积通常与几乎任何一种B淋巴细胞系恶液质有关，从浆细胞恶性肿瘤(多发性骨髓瘤)至良性单克隆性丙种球蛋白病。有时候，出现淀粉样蛋白沉积物可能是潜在性恶液质的最初指标。AL淀粉样变性还详细描述于Current Drug Targets，2004，5159-171中。
AL淀粉样蛋白沉积物的原纤维由单克隆免疫球蛋白轻链或其片段组成。更具体来讲，所述片段来源于轻链的N-末端区域(κ或λ)，包含其全部或部分可变(VL)区(variable domain)。沉积物通常出现在间充质组织中，导致周围和自主神经病、腕管综合征、巨舌症、限制性心肌病、大关节关节病、免疫性恶液质、骨髓瘤以及潜隐性恶液质。然而，应注意几乎任何一种组织，特别是内脏器官如肾、肝、脾脏和心脏都可能受累。
遗传性系统性淀粉样变性
遗传性系统性淀粉样变性有多种形式。尽管它们是相对罕见的疾病，但成人症状的发生和它们的遗传方式(通常为常染色体显性)导致此类疾病在普通人群中持续存在。一般而言，所述综合征是由于前体蛋白的点突变，产生不同的淀粉样蛋白源性肽或蛋白。例如，来自转甲状腺蛋白(transthyretin)和片段的ATTR蛋白、载脂蛋白AI(apoAI)的N-末端片段、来自载脂蛋白AII的AapoAII、溶菌酶(Alys)、纤维根α链片段、凝溶胶蛋白(Gelsolin)片段(Agel)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C片段(ACys)、衍生自淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的β-淀粉样蛋白(Aβ)、衍生自Prp前体蛋白(51-91插入片段)的朊病毒蛋白(PrP，APrPSC)、衍生自血清淀粉样蛋白A蛋白的AA(ApoSAA)、衍生自免疫球蛋白重链(γI)的AH淀粉样蛋白、来自(pro)降钙素的ACal淀粉样蛋白、来自心房促尿钠排泄因子的AANF淀粉样蛋白、来自催乳激素的Apro或来自ABri肽的Abri/ADan的点突变可导致临床综合征，其包括但不限于家族性淀粉样蛋白多神经病(FAP)、无神经病的占主导的心脏受累、老年性系统淀粉样变性、腱鞘炎(Tenosynovium)、非-神经病Ostertag-型淀粉样变性、家族性淀粉样变性、伴有晶体角膜营养不良的颅神经病、遗传性脑出血(CAA)-冰岛型、家族性阿尔茨海默氏病、阿尔茨海默氏病、唐氏综合征、伴有淀粉样变性的遗传性脑出血-荷兰型、家族性痴呆、家族性克-雅病；Gerstmann-Strussler-Scheinker综合征、遗传性海绵状脑病、朊病毒疾病、主要表现为肾受累的家族性地中海热、穆-韦二氏综合征、肾病、耳聋、荨麻疹、肢痛、伴有持续性心房停顿的心肌病、皮肤沉积(大疱性、丘疹性、脓疱性皮肤病)、骨髓瘤相关淀粉样变性、甲状腺性骨髓癌、孤立的心房淀粉样蛋白、催乳素瘤和/或英国和丹麦家族性痴呆。这些疾病的总的特征为本领域所知。这些点突变和临床综合征为示例性的，而并不打算限制本发明的范围。例如，已描述了转甲状腺蛋白基因中的超过40个独立的点突变，它们全部产生临床上类似形式的家族性淀粉样蛋白多神经病。
一般而言，任何遗传性淀粉样蛋白疾病也可散发出现，遗传性和散发形式的疾病在淀粉样蛋白方面都表现相同特征。例如，最常见形式的继发性AA淀粉样变性散发出现，如作为正在发生的炎症的结果，与家族性地中海热无关。因此在下文中与遗传性淀粉样蛋白紊乱有关的广泛讨论也可适用于散发性淀粉样变性。
转甲状腺蛋白(TTR)是一种14千道尔顿蛋白，有时也称为前白蛋白。它由肝和脉络丛产生，其功能是转运甲状腺激素和维生素A。该蛋白至少有50种变形，每种的特征在于单个氨基酸改变，它们对各种形式的家族性淀粉样蛋白多神经病负责。例如，在55位用脯氨酸取代亮氨酸引起显著进行性的神经病变；在111位用蛋氨酸取代亮氨酸导致丹麦(Danish)患者的严重心脏病。
从来自系统性淀粉样变性患者的心脏组织分离的淀粉样蛋白沉积物中，可见这些沉积物由TTR及其片段(总称为ATTR)的异质混合物组成，已鉴定出其全长序列。可根据本领域已知的方法，从这样的蚀斑中提取ATTR原纤维成分并确定它们的结构和序列(例如，Gustavsson，A.等，Laboratory Invest.73：703-708，1995；Kametani F.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.125；622-628，1984；Pras，M.等，PNAS 80：539-42，1983)。
在分子载脂蛋白Al(如Gly→Arg26；Trp→Arg50；Leu→Arg60)中发生点突变的人表现的淀粉样变性形式(“stertag型”)的特征在于蛋白质载脂蛋白AI或其片段(AApoAI)的沉积。这些患者具有低水平的高密度脂蛋白(HDL)，表现周围神经病或肾衰竭。
在酶溶菌酶α链中的突变(如Ile→Thr56或Asp→His57)是另一种形式的stertag-型非神经病性遗传性淀粉样蛋白的基础，在英国家族中有报道。这里，突变溶菌酶蛋白(Alys)的原纤维沉积，患者通常表现肾功能受损。这种蛋白与大多数本文描述的形成原纤维的蛋白不同，通常以完整(不分段的)形式存在(Benson，MD.等，CIBA Fdn.Symp.199：104-131，1996)。
免疫球蛋白轻链易于形成各种形态的聚集物，包括原纤维状(如AL淀粉样变性和AH淀粉样变性)、颗粒状(如轻链沉积病(LCDD)、重链沉积病(HCDD)和轻-重链沉积病(LHCDD))、晶状(如获得性Farconi’s综合征)和微管状(如冷球蛋白血症)。通过分别形成免疫球蛋白轻链和重链和/或它们的片段的不溶性原纤维，提示AL和AH淀粉样变性。在AL原纤维中，可发现诸如λVI链(λ6链)的λ(λ)链的浓度高于κ(κ)链。λIII链也轻度增加。Merlini等，CLIN CHEM LAB MED39(11)：1065-75(2001)。重链淀粉样变性(AH)的常见特征是IgG1亚类的γ链淀粉样蛋白聚集。Eulitz等，PROC NATL ACAD SCI USA 87：6542-46(1990)。
将淀粉样蛋白源性(amyloidogenic)轻链与非-淀粉样蛋白源性轻链比较，已经揭示前者可包括似乎动摇(destabilize)蛋白折叠和促进聚集的置换或取代。AL和LCDD与其它淀粉样蛋白疾病的区别在于它们的相对小的群体单克隆轻链，这些轻链由产生抗体的B细胞的瘤样扩散产生。AL聚集物通常是秩序井然的λ链原纤维。LCDD聚合物是相对无定形的κ和λ链的聚集物，主要是κ，有时是κIV。Bellotti等，JOURNAL OF STRUCTURAL BIOLOGY 13：280-89(2000)。将AH淀粉样变性患者的淀粉样蛋白源性与非-淀粉样蛋白源性重链比较，已经揭示缺少和/或改变的组分。Eulitz等，PROC NATL ACAD SCI USA87：6542-46(1990)(致病性重链的特征在于分子量明显低于非-淀粉样蛋白源性重链)；和Solomon 等，AM J HEMAT 45(2)171-6(1994)(淀粉样蛋白源性重链的特征是只由非-淀粉样蛋白源性重链的VH-D段组成)。
因此，检测和监测治疗患AL、LCDD、AH等的患者的有效方法，包括但不限于免疫测定血浆或尿中淀粉样蛋白源性轻或重链(如淀粉样蛋白λ、淀粉样蛋白κ、淀粉样蛋白κIV、淀粉样蛋白γ或淀粉样蛋白γl)沉积的存在或降低。
脑淀粉样变性
大脑淀粉样蛋白的最常见类型主要由Aβ肽原纤维组成，可导致与散发性(非遗传性)阿尔茨海默氏病相关的痴呆。事实上，散发性阿尔茨海默氏病的发生率大大超过遗传性所显示的形式。尽管如此，在两种类型中，原纤维肽形成的蚀斑非常相似。脑淀粉样变性包括那些其中病因因素为淀粉样蛋白的疾病、病症、病态和其它脑结构或功能异常。淀粉样蛋白相关疾病所影响的脑的区域可能是包括脉管系统的基质，或包括功能性或解剖性区域的软组织，或神经元本身。患者不需接受对具体已知的淀粉样蛋白相关疾病的明确性诊断。术语“淀粉样蛋白相关疾病”包括脑淀粉样变性。
淀粉样-β肽(“Aβ”)是一种39-43氨基酸肽，由已知为β淀粉样前体蛋白(“βAPP”)的较大的蛋白质的蛋白酶解获得。βAPP的突变导致家族性形式的阿尔茨海默氏病、唐氏综合征、脑淀粉样蛋白血管病和老年性痴呆，其均以Aβ原纤维和其它组分组成的蚀斑的脑沉积物为特征，以下将详细描述。与阿尔茨海默氏病有关的APP中的已知突变出现在与β或γ-分泌酶的断裂部位最近处，或在Aβ之内。例如：717位最接近于生成Aβ过程中的APP的γ-分泌酶断裂的部位；而670/671位最接近于β-分泌酶断裂的部位。在任何这些残基中的突变均可导致阿尔茨海默氏病，可能由APP生成的Aβ的42/43氨基酸形式数量的增长所引起。阿尔茨海默氏病的家族性形式仅占10％患者人群。最常发生的阿尔茨海默氏病是散发性病症，而其中APP和Aβ并不具有任何的突变。不同长度的Aβ肽的结构和序列是本领域熟知的。这类肽可依照本领域熟知的方法制备或依照已知方法从脑中提取(例如，Glenner and Wong，Biochem.Biophys.Res.Comm.129，885-90(1984)；Glenner and Wong，Biochem.Biophys.Res.Comm.122，1131-35(1984))。另外，商业上可提供各种形式的肽。APP在大多数细胞中被表达并被本质性地代谢。所述主要的代谢途径似乎是通过暂时性称之为α-分泌酶的酶断裂Aβ序列中APP，从而导致称之为APPsα的可溶性外区域片断的释放。该断裂阻止Aβ肽的形成。与这种非淀粉样蛋白生成途径相反，APP也在Aβ的N-和C-末端分别通过称之为β-和γ-分泌酶的酶断裂，随后将Aβ释放到细胞外空间中。迄今为止，已确定BACE是β-分泌酶(Vasser等，Science 286：735-741，1999)，而早老素与γ-分泌酶活性有关(De Strooper等，Nature391，387-90(1998))。所述39-43氨基酸Aβ肽通过β-和γ-分泌酶的酶的连续性蛋白水解断裂淀粉样前体蛋白(APP)而生成。尽管Aβ40是主要的生成形式，但Aβ总数的5-7％以Aβ42存在(Cappai等，Int.J.Biochem.CellBiol.31，885-89(1999))。
Aβ肽的长度似乎能显著性地改变其生物化学/生物物理性质。明确地讲，Aβ42的C-末端上的另外两个氨基酸亲水性极差，由此可能增加Aβ42聚合的倾向。例如，Jarrett等人证实与Aβ40相比，Aβ42在体外聚合非常快，这表明Aβ的较长链形式可能是与最初播种阿尔茨海默氏病中神经炎性斑有关的重要的病理性蛋白质(Jarrett等，Biochemistry 32，4693-97(1993)；Jarrett等，Ann.N.Y. Acad.Sci.695，144-48(1993))。通过近来对遗传性家族形式的阿尔茨海默氏病(“FAD”)实例中Aβ特异形式的组成的分析，也基本证实了该假设。例如：与Aβ40相比，与FAD关联的APP的“London(伦敦)”突变形式(APPV717I)能选择性增加Aβ42/43形式的产生(Suzuki等，Science264，1336-40(1994))，而APP的“Swedish(瑞典)”突变形式(APPK670N/M671L)能增加Aβ40和Aβ42/43两者的水平(Citron等，Nature 360，672-674(1992)；Cai等，Science 259，514-16，(1993))。还观察到在早老素-1(“PS1”)或早老素-2(“PS2”)基因中与FAD-关联的突变将导致Aβ42/43产物的选择性地增加，而非Aβ40(Borchelt等，Neuron 17，1005-13(1996))。这种发现在表明在脑Aβ42中选择性增加的表达PS突变的转基因小鼠模型中得到证实(Borchelt，以上引用的文献，Duff等，Neurodegeneration 5(4)，293-98(1996))。关于阿尔茨海默氏病病因学的前提性假设是：由于Aβ42的产生和释放的增加或者清除(降解或脑清除)的降低所引起的Aβ42脑浓度的增加是该疾病病理学的原因性事件。
在Aβ或APP基因中多重突变部位已被确定，它们临床上与痴呆或脑出血有关。CAA疾病的实例包括，但不限于伴有冰岛型淀粉样变性的遗传性脑出血(HCHWA-I)；HCHWA的Dutch变型(HCHWA-D；一种Aβ中的突变)；Aβ的佛兰德突变；Aβ的北极区突变；Aβ的意大利突变；Aβ的爱荷华州突变；家族性英国痴呆(Britishdementia)；和家族性丹麦痴呆(Danish dementia)。CAA也可是散发性的。
除另有说明外，此处所用的术语“β淀粉样蛋白”、“淀粉样蛋白-β”等指淀粉样β蛋白质或肽，淀粉样β前体蛋白质或肽，其中间体、变体和片段。具体地讲，“Aβ”指通过APP基因产物蛋白水解过程生成的任何肽，特别是与淀粉样蛋白病理学有关的肽，包括Aβ1-39、Aβ1-40、Aβ1-41、Aβ1-42和Aβ1-43。为了便于命名，在此可将“Aβ1-42”称之为“Aβ(1-42)”或简单地为“Aβ42”或“Aβ42”(对在此讨论的任何其它淀粉样肽同法命名)。此处所用术语“β淀粉样蛋白”、“淀粉样蛋白-β”和“Aβ”意义相同。
除另有指定外，术语“淀粉样蛋白”指可溶性(例如：单体的或寡聚的)或不溶性(例如：具有原纤维结构或在淀粉样蛋白蚀斑中)的淀粉样生成的蛋白质、肽或其片段。参见例如：MP Lambert等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95，6448-53(1998)。“淀粉样变性”或“淀粉样蛋白病”或“淀粉样蛋白-相关疾病”指一种以淀粉样蛋白原纤维的存在为特征的病理症状。“淀粉样蛋白”是一个通用术语，是指在很多不同疾病中发现的一组多变但特定的蛋白质沉积(细胞内或细胞外)。虽然它们出现不同，但所有的淀粉样蛋白沉积具有共同的形态学特性、用特殊染料染色(例如刚果红)以及在染色后在偏振光下具有特征性的红-绿色双折射现象。它们还享有共同的超微特征和共同的X-射线衍射和红外光谱。
凝溶胶蛋白是一个连接片断和肌动蛋白丝的结合钙的蛋白质。蛋白质187位的突变(例如Asp→Asn；Asp→Tyr)导致形成遗传性全身性淀粉样变性，所述疾病通常在芬兰的患者以及荷兰或日本血统的人中发现。在患者中，凝溶胶蛋白片断(Agel)中形成的原纤维通常由氨基酸173-243(68kDa羧基末端片断)组成，在血管和基膜中沉积，导致角膜营养失调和头颅神经病，进一步发展为外周神经病、营养不良性皮肤改变和在其它器官中沉积(Kangas，H等，Human Mol.Genet.5(9)：1237-1243，1996)。
其它突变的蛋白质，例如原纤维原蛋白(AfibA)的突变α链和突变抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C(Acys)也形成原纤维并产生特征性的遗传性疾病。AfibA原纤维形成肾病的非神经病性遗传性淀粉样蛋白特征的沉积。Acys沉积是冰岛报道的遗传性脑淀粉样蛋白血管病的特征(Isselbacher，Harrison’s Principles of Internal Medicine，McGraw-Hill，San Francisco，1995；Benson等)。至少在某些情况中，已证明患有脑淀粉样蛋白血管病(CAA)的患者具有包含一种与淀粉样β蛋白质结合的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的非突变形式的淀粉样蛋白原纤维(Nagai，A.等，Molec.Chem.Neuropathol.33：63-78，1998)。
脑部淀粉样变性
淀粉样蛋白局部沉积在脑中是常见的，特别在老年人中。脑中最常见的淀粉样蛋白类型主要由Aβ肽原纤维构成，其导致痴呆或散发性(非遗传性的)阿尔茨海默氏病。脑部淀粉样变性最常出现的是散发性的而非家族性的。例如，散发性阿尔茨海默氏病和散发性CAA的发生率大大超出了家族性AD和CAA的发生率。此外，该疾病的散发性和家族性形式不能彼此区分(它们的区别仅在于存在或不存在遗传性的基因突变)；例如，散发性和家族性AD中的临床症状和形成的淀粉样蛋白蚀斑非常相象(如果不相同的话)。
脑部淀粉样蛋白血管病(CAA)指在leptomingeal和大脑皮层动脉、细动脉和静脉的壁中有淀粉样蛋白原纤维的特定沉积。它通常与阿尔茨海默氏病、唐氏综合病症和正常老化有关，也与各种涉及中风或痴呆的家族病有关(参见Frangione等，Amyloid：J.ProteinFolding Disord.8，Suppl.1，36-42(2001))。CAA可散发性或遗传性地发生。
老年性系统淀粉样变性
淀粉样蛋白沉积(系统性或局限性)随年龄增加。例如，轻型转甲状腺蛋白(TTR)的原纤维通常见于老年个体的心脏组织。这些可以是无症状、无临床表现的，或者可能导致心力衰竭。无症状的原纤维局部沉积也可发生在脑内(Aβ)、前列腺的淀粉样体(β2微球蛋白)、关节和精囊。
透析-相关性淀粉样变性(DRA)
由β2微球蛋白(β2M)原纤维组成的蚀斑通常在长期接受血液透析或腹膜透析的患者中出现。β2微球蛋白是一种11.8千道尔顿的多肽，是出现在所有有核细胞上的Class I MHC抗原的轻链。在正常环境下，β2M通常分布在细胞外空间，除非出现肾功能损坏，在这种情况下，β2M被转移至组织中，在该组织中其聚合形成淀粉样蛋白原纤维。诸如在肾功能损坏情况下的清除失败能导致在腕骨沟和其它部位的沉积(主要在关节的胶原质丰富的组织里)。不同于其它的原纤维蛋白，β2M分子不是由较长的前体蛋白质断裂而产生，而是一般以非片断形式出现在原纤维中。(Benson，同上)。已表明这种淀粉样蛋白前体的保留和沉积是DRA的主要致病过程。DRA特征为外周关节骨关节病(例如，关节硬化、疼痛、肿大等)。组织中β2M的异构体、糖化β2M或β2M的聚合体是最常见的淀粉样蛋白发生的形式(与天然的β2M相反)。不同于其它类型的淀粉样变性，β2M大部分局限在骨关节部位。很少见内脏的沉积物。这些沉积偶尔会与血管和其它重要的解剖学部位有关。
即使改进了清除β2M的透析方法，大多数患者的血浆β2M浓度仍保持显著高于正常。这些浓度提高的β2M通常引起透析-相关性淀粉样变性(DRA)和促成死亡率的共存病(cormorbidities)。
胰岛淀粉样蛋白多肽和糖尿病
在一个世纪前，当在患有严重的高血糖症的患者的胰腺中出现原纤维状蛋白质聚合体时，首次被描述为胰岛透明变性(淀粉样蛋白沉积)(Opie，EL.，J Exp.Med.，5：397-428，1901)。如今，主要由胰岛淀粉样多肽(IAPP)或糊精组成的胰岛淀粉样蛋白是90％以上的所有II型糖尿病(也称之为非胰岛素依赖型糖尿病或NIDDM)病例的特征性组织病理学的标志。这些原纤维状沉积物由胰岛淀粉样多肽(IAPP)或糊精聚合引起，糊精是源自一个较大的前体肽的37氨基酸肽，称为pro-IAPP。
IAPP在响应β-细胞促分泌素后，与胰岛素联合分泌。该病理特征与胰岛素依赖型(I型)糖尿病无关联，它是各种临床显型诊断为NIDDM(II型糖尿病)的一致的特征。
对猫的纵向研究和对猴子的免疫细胞化学研究表明胰岛淀粉样蛋白的逐渐增长与分泌胰岛素的β-细胞的数量的显著性降低以及疾病严重程度的增加有关。最近，转基因的研究强化了IAPP蚀斑形成和β-细胞凋亡及功能失调间的关系，表明淀粉样蛋白沉积是II型糖尿病严重程度增加的主要因素。
也已表明IAPP引起体外的β-胰岛细胞毒性，表明II型或I型糖尿病患者(胰岛移植后)的胰腺中出现的IAPP原纤维可促成胰岛β-细胞(Langerhans)的损失和器官功能失调。在II型糖尿病患者中，胰腺IAPP的沉积导致寡聚IAPP的形成，从而导致作为不溶性原纤维状沉积的IAPP-淀粉样蛋白集结，最终破坏生成胰岛素的胰岛β细胞，导致β细胞损耗和衰竭(Westermark，P.，Grimelius，L.，Acta Path.Microbiol.Scand.，sect.A.81： 291-300，1973；de Koning，EJP.，等，Diabetologia 36：378-384，1993；以及Lorenzo，A.，等，Nature 368：756-760，1994)。IAPP作为原纤维状沉积的聚集还可对前-IAPP对血浆中正常IAPP的比率造成影响，原因是在沉积物中捕获IAPP而增大了这个比率。β细胞质量的减少可通过高血糖症和胰岛素血症证明。这种β细胞质量的损失可导致需要胰岛素治疗。
通过将相关类型的细胞移植入患者健康细胞内，可治疗由于具体一种或多种类型细胞死亡或功能障碍引起的疾病。这种方法已被用于I型糖尿病患者。通常在移植前将捐献者的胰腺的胰岛细胞在体外培养，使它们在分离过程后恢复或降低其免疫原性。然而，在很多情况下，由于移植细胞的死亡，胰岛细胞的移植不成功。低成功率的一个原因是IAPP，IAPP构成有毒的低聚物。毒性作用可由原纤维低聚物的细胞内和细胞外的沉积造成。该IAPP低聚物可形成原纤维，并在体外转变成为对细胞有毒性的。另外，在细胞移植后，IAPP原纤维可能继续生长，导致细胞死亡或功能失调。甚至当细胞来自健康的捐献者并且接受移植的患者未患有以原纤维存在为特征的疾病时，也会出现上述情况。例如，依照在国际专利申请(PCT)号WO01/003680中描述的方法，也可将本发明化合物用于制备移植的组织或细胞中。
本发明化合物也可稳定前-IAPP/IAPP、前-胰岛素/胰岛素的浓度比率以及C-肽水平。另外，作为功效的生物学标记物，不同试验的结果，如所述精氨酸-胰岛素分泌试验、葡萄糖耐受性试验、胰岛素耐受性和灵敏性试验，都可用作β细胞质量降低和/或淀粉样蛋白沉积物的聚集的指标。可将这类药物与其它靶向作用于胰岛素抵抗、肝糖生成以及胰岛素分泌的药物共同使用。这些化合物可通过保护β-细胞功能而不需胰岛素治疗，并可用于保护胰岛的移植。
激素-衍生的淀粉样变性
内分泌器官可存在淀粉样蛋白沉积，尤其是在老年人中。分泌激素的肿瘤也可能包含源自激素的淀粉样蛋白蚀斑，其原纤维由多肽激素(如降钙素(甲状腺的髓质癌))和心脏的促尿钠排泄肽(单独的心脏淀粉样变性)构成。这些蛋白质的序列和结构在本领域是熟知的。
其它淀粉样变性
淀粉样蛋白病有多种其它形式，通常表现为淀粉样蛋白的局部沉积。这些疾病通常可能是特定的原纤维前体的局部产生或缺乏分解代谢或者原纤维沉积倾向于特定组织(例如关节)的结果。这种原发性沉积的实例瘤状AL淀粉样蛋白、皮肤淀粉样蛋白、内分泌淀粉样蛋白以及肿瘤-相关的淀粉样蛋白。其它淀粉样蛋白-相关疾病包括上述的那些，例如：家族性淀粉样蛋白多发性神经病(FAP)、老年的全身性淀粉样变性、腱鞘炎、家族性淀粉样变性、Ostertag-型非神经病性淀粉样变性、颅神经病、遗传性脑出血、家族性痴呆、慢性透析、家族性克雅氏病、杰茨曼-斯脱司勒-史茵克综合征(Gerstmann-Strussler-Scheinker综合征)、遗传性海绵体脑病、朊病毒疾病、家族性地中海热、默-韦氏综合征(Muckle-Well氏综合征)、肾病、耳聋、风疹、肢痛、心肌症、侵犯皮肤的沉积物(cutaneous deposits)、多发性骨髓瘤、良性单克隆性丙种球蛋白病、巨球蛋白血症(maccoglobulinaemia)、骨髓瘤相关的淀粉样变性、甲状腺的髓质癌、孤立的前房淀粉样变性和糖尿病。
不管临床环境如何，可给予本发明化合物治疗性地或预防性地治疗与淀粉样蛋白原纤维形成、聚集或沉积有关的疾病。本发明化合物可采用以下任何机理以改善淀粉样蛋白-相关疾病的过程，例如，但不限于：减慢淀粉样蛋白原纤维形成或沉积的速率；减轻淀粉样蛋白沉积的程度；抑制、减少或预防淀粉样蛋白原纤维形成；抑制淀粉样蛋白引发的炎症；增强从例如脑中对淀粉样蛋白的清除；或保护细胞免受淀粉样蛋白引起的(低聚物或原纤维状)毒性。
在一实施方案中，可给予本发明化合物治疗性地或预防性地治疗与淀粉样蛋白-β原纤维形成、聚集或沉积有关的疾病。本发明化合物可采用以下任何机理以改善淀粉样蛋白-β相关疾病的过程(以下所列仅供说明并不做限定)：减慢淀粉样蛋白-β原纤维形成或沉积的速率；减轻淀粉样蛋白-β沉积的程度；抑制、减少或预防淀粉样蛋白-β原纤维形成；抑制由淀粉样蛋白-β诱发的神经变性或细胞毒性；抑制淀粉样蛋白-β引发的炎症；增强从脑中对淀粉样蛋白-β的清除；或促进Aβ更好地分解代谢。
本发明化合物在进入脑部后(在穿透血脑屏障后)或从外周血管系统，可有效控制淀粉样蛋白-β沉积。当从外周作用时，化合物可改变脑和血浆间Aβ的平衡，从而促进Aβ从脑部排出。Aβ从脑部排出的增加可导致Aβ脑浓度的降低，因此促进Aβ沉积的减少。另外，渗透入脑的化合物可通过直接作用于脑部Aβ而控制沉积，例如：通过保持其处于非原纤维形式或促进其从脑中清除。本化合物可减慢APP过程；可通过巨噬细胞或神经元细胞增加Aβ原纤维的降解；或可通过活化的微神经胶质降低Aβ生成。这些化合物还可防止脑中的Aβ与细胞表面的相互作用，因此预防神经毒性、神经变性或炎症。
在优选实施方案中，该方法用于治疗阿尔茨海默氏病(如散发性或家族性AD)。该方法也可用于预防性或治疗性治疗其它淀粉样蛋白-β沉积的临床疾病，如在唐氏综合征患者和在大脑淀粉样蛋白血管病(“CAA”)、遗传性脑出血或早期阿尔茨海默氏病患者中。
在另一个实施方案中，该方法用于治疗轻度认知损伤。轻度认知损伤(“MCI”)是以思考能力处于轻度但可测定的缺陷状态为特征的疾病，其不一定与出现痴呆有关。MCI通常(但不一定)在阿尔茨海默氏病之前。
另外，APP和淀粉样蛋白-β蛋白质在肌原纤维中的异常沉积与散发性的包涵体肌炎(IBM)的病理学有关(Askanas，V.等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：1314-1319；Askanas，V.等(1995)CurrentOpinion in Rheumatology 7：486-496)。因此，本发明化合物可用于预防性地或治疗性地治疗其中淀粉样蛋白-β蛋白质在非神经区域不正常沉积的疾病，例如通过将本化合物传递到肌原纤维中治疗IBM。
另外，已表明Aβ与异常的细胞外沉积有关，即称之为脉络膜小疣，在患有与年龄相关的斑点变性(ARMD)的患者中，它沿着视网膜色素化的上皮的基表面沉积。在老年患者中，ARMD是视力不可逆丧失的原因。现认为Aβ沉积是局部炎症的一个重要原因，促使视网膜的色素上皮萎缩、脉络膜小疣生物合成和ARMD发病(Johnson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(18)，11830-5(2002))。因此，本发明还涉及治疗或预防年龄相关性黄斑变性。
在一个实施方案中，本发明也涉及治疗或预防患者(优选是人)淀粉样蛋白-相关疾病的方法，该方法包括给予该患者治疗有效量的本文所述的下列化学式或其它的化合物，以降低或抑制淀粉样蛋白原纤维形成或沉积、神经变性或细胞毒性。在另一个实施方案中，本发明涉及治疗或预防患者(优选是人)淀粉样蛋白-相关疾病的方法，该方法包括给予该患者治疗量的本文所述的下列化学式或其它的化合物，以改善或稳定认知功能或者预防、减慢，或中止患有脑淀粉样变性诸如阿尔茨海默氏病、唐氏综合征或脑淀粉样蛋白血管病的患者中认知功能的进一步的退化。这些化合物也可以改善这些患者的日常生活的质量。
本发明治疗性的化合物可通过诸如以下途径治疗与II型糖尿病有关的淀粉样变性，例如：稳定血糖、预防或减少β细胞量的损失、降低或预防由于β细胞量的损失所致的高血糖症以及调节(例如增加或稳定)胰岛素的生成。本发明化合物还可稳定前-IAPP/IAPP浓度的比率。
本发明的治疗化合物可以下途径治疗AA(继发性)淀粉样变性和/或AL型(原发性)淀粉样变性，通过稳定肾功能、降低蛋白尿、增加肌酐清除率(如增加至少50％或更大或增加至少100％或更大)，通过减轻慢性腹泻或体重增加(如10％或更大)，或者通过减少血清肌酐。还可减少如通过SAP闪烁法测定的内脏淀粉样蛋白含量。
神经保护
业已显示几组Aβ肽对神经元有高度毒性。淀粉样蛋白蚀斑与反应性神经胶质增生、营养不良性神经炎和凋亡细胞直接相关，提示该蚀斑诱发神经变性。神经毒性最终可使神经元破裂或甚至杀灭神经元。在体外，业已显示Aβ在许多不同的神经元细胞类型中诱发凋亡，如大鼠PC-12细胞、原代大鼠海马和皮质培养细胞以及预分化的人神经型SH-SY5Y细胞系(Dickson DW(2004)J Clin Invest 114：23-7；Canu等(2003)Cerebellum 2：270-278；Li等(1996)Brain Research738：196-204)。大量报道已显示Aβ原纤维可诱发神经变性，显示在体外暴露于Aβ的神经元细胞可逐渐凋亡(Morgan等(2004)Prog.Neurobiol.74：323-349；Stefani等(2003)J.Mol.Med.81：678-99；La Ferla等(1997)J.Clin.Invest.100(2)：310-320)。在阿尔茨海默氏病中，进行性神经元细胞丢失伴随Aβ淀粉样蛋白原纤维沉积在老年斑中。
在还有另一方面，本发明涉及通过给予有效量的本发明化合物抑制Aβ-诱发的神经元细胞死亡的方法。
本发明的另一方面涉及为患Aβ-淀粉样蛋白相关疾病(如阿尔茨海默氏病)的患者提供神经保护作用的方法，它包括给予患者有效量的本发明化合物，以提供神经保护作用。
在另一方面，提供抑制Aβ-诱发的神经元细胞死亡的方法，它包括给予患者有效量的本发明化合物，以便抑制神经元细胞死亡。
在另一方面，例如通过给予有效量的本发明化合物，提供在患者中治疗以Aβ-诱发的神经元细胞死亡为特征的疾病的方法。此类疾病的非限制性实例包括阿尔茨海默氏病和Aβ-淀粉样蛋白相关疾病。
术语“神经保护”包括保护患者的神经元细胞避免出现Aβ-诱发的细胞死亡，如由Aβ肽直接或间接诱发的细胞死亡。Aβ-诱发的细胞死亡可启动以下过程，如：细胞骨架失去稳定性；DNA断裂；激活水解酶，如磷脂酶A2；激活胱天蛋白酶、钙活化的蛋白酶和/或钙活化的核酸内切酶；巨噬细胞介导的炎症；钙内流入细胞；细胞的膜电位改变；细胞连接断裂，导致细胞-细胞通信降低或缺乏；激活涉及细胞死亡的基因，如早期快反应基因的表达。
τ蛋白装配或聚集
在再一个方面，将本发明的化合物和方法给予患者，以抑制、预防或减少τ装配或聚集。不希望受到任何特殊理论的束缚，相信Aβ积聚会引发级联，所述级联包括导致神经原纤维缠结形成并最终引起细胞死亡的τ超磷酸化。Oddo等，Neuron 43(2)：321-332，327(2004)；Hardy and Selko Science 297：353-356(2002)。有效减少、抑制或防止Aβ聚集的化合物也可有效减少、抑制或防止τ蛋白聚集。因此，本发明的化合物和方法不仅用于治疗淀粉样蛋白相关疾病(如Aβ-相关疾病如阿尔茨海默氏病，成人-糖尿病发作和与年龄相关的黄斑变性)，而且还用于或者备选用于治疗患者的τ蛋白病(tauopathies)(如进行性核上麻痹(PSP)、皮质基底核(Corticobasal)变性(CBD)和伴有帕金森氏综合征的额颞叶痴呆(FTDP)。
因此，在一个实施方案中，本发明提供治疗或预防患者的τ蛋白病的方法，该方法包括给予治疗有效量的本发明化合物，以使τ蛋白病得到治疗或预防。
可以治疗性地或预防性地给予本发明化合物以治疗与τ蛋白形成、聚集或沉积相关的疾病。所述化合物可提通过一种或多种以下的机理用于抑制、预防和/或逆转τ蛋白聚集：减缓Aβ原纤维形成或沉积的速率或防止其形成或沉积；减轻Aβ沉积的程度；抑制、减轻或预防淀粉样蛋白-β原纤维形成；抑制淀粉样蛋白-β或τ蛋白聚集诱发的神经变性或细胞毒性；抑制与Aβ或τ蛋白存在有关的炎症；促进Aβ或τ蛋白从脑或其它器官内清除；帮助淀粉样蛋白-β蛋白在其组成原纤维之前降解；减缓τ蛋白形成或聚集的速率；抑制或逆转τ蛋白聚集；抑制神经元细胞死亡；抑制、减轻或预防神经原纤维缠结、神经炎蚀斑、神经炎线性、球形缠结或匹克小体的形成；和抑制、减轻或预防多刺星形胶质细胞、簇状星形胶质细胞、星形胶质细胞蚀斑、螺旋状体、神经胶质线和小神经胶质细胞的形成或存在。
“τ蛋白”或“τ蛋白质”指τ蛋白，其与神经细胞中微管的稳定化和广泛范围的τ蛋白聚集，如神经原纤维缠结的成分有关。除非本文另外指明，该术语指伴有修饰或不伴有修饰(包括磷酸化、截短和构象)的所有其同工型的τ蛋白。
“τ蛋白病”指τ蛋白-相关疾病，如τ蛋白-相关神经变性疾病，如阿尔茨海默氏病，进行性核上麻痹(PSP)，皮质基底核变性(CBD)，匹克氏病、额颞叶痴呆和与染色体17有关的帕金森氏综合征(FTDP-17)。
“τ蛋白聚集”或“τ蛋白质聚集”指τ蛋白聚集或与τ蛋白聚集相关的各种疾病，主要为神经变性疾病。τ蛋白聚集以多种形成存在，包括但不限于神经原纤维缠结(锥体细胞，或在神经元变性后此类细胞的细胞外残留，这包括螺旋状和直线状丝对的聚集的τ蛋白)、神经炎蚀斑(营养不良的轴突，其包含至少部分被通常为直线状丝形式的τ蛋白聚集围绕的淀粉样蛋白核)、神经炎线(与营养不良的轴突有关，但不组成蚀斑)、球状缠结(与进行性核上麻痹相关的τ蛋白在神经元胞浆中的积聚)和匹克氏体(与匹克氏病有关的杂乱的τ蛋白原纤维，通常包括作为主要成分且发现于神经元中的τ蛋白)。τ蛋白聚集也包括在细胞中的聚集，包括：多刺星形胶质细胞(通常以发现于PSP患者的核周胞浆中及周围的τ蛋白聚集为特征)，簇状星形胶质细胞(通常以通过灰质细胞τ蛋白聚集为特征且与PSP和AD有关)、星形胶质细胞蚀斑(发现于灰质中的蚀斑且与CBD有关)、螺旋状体(通常以逗点状或螺旋状结构为特征，包括τ蛋白丝缠绕于少突神经胶质细胞核周围且发现于FTDP-17，PSP和CBD患者中)、神经胶质线(通常以PSP患者中发现的少突神经胶质细胞的髓磷脂鞘的τ蛋白包涵物为特征)和与小神经胶质细胞有关的τ蛋白聚集。
“抑制”τ蛋白聚集包括防止或制止τ蛋白形成，清除τ蛋白，抑制或减慢τ蛋白病患者的τ蛋白沉积，以及减少或逆转患者的神经原纤维缠结或τ蛋白沉积。相对于未经治疗的患者，或相对于在治疗前已治疗的患者，测定对τ蛋白聚集的抑制作用，或例如通过临床可测的改善的指标，例如或在患有脑淀粉样变性的患者的情况下测定，例如阿尔茨海默氏病或脑淀粉样蛋白血管病患者，稳定认知功能或预防认知功能的进一步退化(即预防、减慢或终止疾病进展)，或改善诸如CSF中Aβ或τ的浓度的参数进行测定。
血脑屏障
无论所述化合物通过何种特殊的机理发挥其生物学作用，该化合物预防或治疗淀粉样蛋白相关疾病，如阿尔茨海默氏病、CAA、MCI、淀粉样变性相关的糖尿病、AL淀粉样变性、唐氏综合征或β2M淀粉样变性。所述化合物可逆转或减缓淀粉样蛋白沉积或该化合物可有利于蚀斑的清除或减慢沉积。例如，与未治疗的患者相比，所述化合物可以降低患者大脑中淀粉样蛋白的浓度。所述化合物通过跨越血脑屏障(“BBB”)渗入脑中发挥作用。所述化合物可保持非原纤维状形式的可溶性淀粉样蛋白，或者另外，与未治疗的患者相比，所述化合物可增加可溶性淀粉样蛋白从患者脑中的清除率。本发明化合物还可增加脑中Aβ在形成原纤维前的降解速率。化合物还可作用于外周，引起在两部分(即系统与中枢)中淀粉样蛋白浓度平衡的变化，其中化合物可不必渗入到脑中以降低Aβ在脑中的浓度(“沉降”效应)。
在脑中发挥其体内的药理作用的本发明药物如果能靶向作用于脑内的细胞，其用途将会更大。脑细胞的非限定实例为神经元、神经胶质细胞(星形胶质细胞、少突细胞、小胶质细胞)、脑血管的细胞(肌细胞、上皮细胞)、包括脑膜的细胞。血脑屏障(BBB)一般通过将大脑软组织与系统循环分离开来的物理性和功能性阻塞物的作用，限制进入脑细胞(参见，例如，Pardridge等，J.Neurovirol.5(6)，556-69(1999)；Rubin等，Rev.Neurosci.22，11-28(1999)。循环分子一般能通过以下两个过程之一到达脑细胞中：经自由扩散性脂质介导的转运进入BBB或者活性(或催化性)转运。
为改善体内分布，可将本发明药物制成制剂，例如供口服给药的粉末化的或液体片剂或溶液剂，或者经管或导管给药的鼻腔喷雾剂、滴鼻剂、凝胶或软膏剂、通过注射器、通过包装带、通过纱布或者通过粘膜下输注的制剂。例如，血脑屏障(BBB)排除很多高度亲水性的药物。为保证本发明的亲水性高的治疗药物通过BBB，可将它们制成例如脂质体。制备脂质体的方法参见美国专利Nos.4,522,811；5,374,548；和5,399,331。所述脂质体可包括一或多种能选择性进入特定细胞或器官(“靶向部位”或“靶向基团”或“转运载体”)，从而提供靶向药物传递的基团(参见，例如V.V.Ranade J.Clin.Pharmacol.29，685(1989))。同样地，可将所述药物与能渗入血脑屏障的靶向基团相连。在一实施方案中，本发明方法应用一种天然存在的与一种药物相连的聚胺，所述药物本身为小分子并用于抑制例如Aβ沉积。
为促进本发明药物转运通过BBB，可将本发明药物与BBB转运载体偶合(有关BBB转运载体和机理的综述，参见例如Bickel等，Adv.Drug Delivery Reviews 46，247-79(2001))。转运载体的实例包括阳离子化的铝或运铁蛋白受体的OX26单克隆抗体；这些蛋白分别经吸附介导和受体介导的胞吞转运作用通过BBB。可用作靶向基团的天然细胞代谢物包括特别是腐胺、亚精胺、精胺或DHA。其它靶向基团的实例包括叶酸或生物素(参见，例如美国专利号5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等，Biochem.Biophys.Res.Commun.153，1038(1998))；抗体(P.G.Bloeman等，FEBS Lett.357，140(1995)；M.Owais等，Antimicrob.Agents Chemother.39，180(1995))；表面蛋白A受体(Briscoe等，Am.J.Physiol.1233，134(1995))；gp120(Schreier等，J.Biol.Chem.269，9090(1994))；还可参见K.Keinanen和M.L.Laukkanen，FEBS Lett.346，123(1994)；J.J.Killion和I.J.Fidler，Immunomethods 4，273(1994)。
靶向作用于受体介导的传递系统进入大脑的其它BBB转运载体实例包括诸如胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF-I和IGF-II)、血管紧张素II、心脏和脑的促尿钠排泄肽(ANP和BNP)、白细胞介素I(IL-1)和运铁蛋白的因子。还可使用结合这些因子的受体的单克隆抗体作为BBB转运载体。具有吸附介导的胞吞转运的靶向机理的BBB转运载体实例包括阳离子基团，如阳离子化的LDL、白蛋白或与多熔素偶合的辣根过氧化酶、阳离子化白蛋白或阳离子化免疫球蛋白。诸如强腓肽同系物E-2078和ACTH同系物依比拉肽的小的碱性寡肽也可通过吸附介导的胞吞转运通过大脑，并且是潜在的转运载体。
其它BBB转运载体靶向作用于将营养物质转运至大脑的系统。这类BBB转运载体的实例包括己糖部分(如葡萄糖)、单羧酸(如乳酸)和中性氨基酸(如苯丙氨酸)、胺(如胆碱)、碱性氨基酸(如精氨酸)、核苷(如腺苷)、嘌呤碱(如腺嘌呤)和胸腺激素(如triiodothyridine)。营养转运的细胞外区域的抗体也可用作转运载体。其它可能的载体包括血管紧张素II和ANP，它们可能与调节BBB渗透性有关。
在某些情况下，可在传递进入大脑之后，将连接所述治疗药物和传递载体的键断裂，以释放该生理活性药物。连接键或“连接基团”的实例包括二硫键、醚键、硫醚键、亚烷基或亚烯基键、氨基或肼基(hydrozino)键、酯键、硫醚键、酰胺键、酸性不稳定键以及Schiff碱键。还可用抗生物素蛋白/生物素连接，其中抗生物素蛋白与BBB药物传递载体共价结合。抗生物素蛋白本身可作为药物传递载体。
包括将组合物受体介导性传递通过血脑屏障的胞吞传递也可适于本发明药物。运铁蛋白受体介导的传递公开于美国专利号5,672,683；5,383,988；5,527,527；5,977,307；和6,015,555。运铁蛋白介导的传递也是已知的。P.M.Friden等，Pharmacol.Exp.Ther.278，1491-98(1996)；H.J.Lee，J.Pharmacol.Exp.Ther.292，1048-52(2000)。EGF受体介导的传递公开于Y.Deguchi等，Bioconjug.Chem.10，32-37(1999)，胞吞传递公开于A.Cerletti等，J.Drug Target.8，435-46(2000)。还可将胰岛素片断用作传递通过血脑屏障的载体。M.Fukuta等，Pharm.Res.11，1681-88(1994)。通过中性抗生物素蛋白与阳离子化人血白蛋白的轭合传递药物也已有说明。Y.S.Kang等，Pharm.Res.1，1257-64(1994)。
一氧化氮是体内正常组织中外周脉管系统的血管舒张剂。通过一氧化氮合成酶增加一氧化氮的产生能在不使血压降低的情况下引起血管舒张。通过脑组织的血流的血压非依赖性增加可增加血液中组合物的脑内的生物利用度。这种一氧化氮的增加可通过给与L-精氨酸刺激进行。由于一氧化氮增加，从而使脑血流量增加，血流中的药物随增加的血流流入脑组织。因此，可将药用组合物引入基本上同时增加L-精氨酸量的血流的患者的血流中之前、之后或期间，L-精氨酸可用于在本发明药用组合物中增强药物向脑组织中的传递，如WO 00/56328中所述。
为促进本发明药物渗透通过血脑屏障的其它修改方法可采用本领域已知的方法和衍生物实现。
BBB氨基酸转运系统
中枢神经系统和外周循环间的主要界面之一就是血脑屏障(BBB)。BBB由单层脑毛细管内皮细胞组成，所述内皮细胞通过紧密连接结合在一起。BBB的内皮细胞包含膜转运系统，如涉及化合物流入/流出的氨基酸转运系统。已鉴定九种这样的氨基酸转运系统，它们存在于血脑屏障的内皮中。这些系统包括系统y+，其转运带有正电荷侧链及其类似物的氨基酸(即，碱性氨基酸及其类似物，如精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸)；系统L1，其转运中性氨基酸及其类似物(如苯丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸，色氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、组氨酸、缬氨酸、苏氨酸、脯氨酸、天门冬酰胺和谷酰胺)和系统X-，其转运的氨基酸为带有负电荷的氨基酸及其类似物(即，酸性氨基酸及其类似物，如谷氨酸和天门冬氨酸)。血脑屏障转运介质(如氨基酸)无需目前描述的系统的范围内机能。本领域技术人员将能理解，运送转运介质的特殊转运系统可用于设计本发明的化合物，但不限制本发明的范围。
大的中性氨基酸(LNAAs)如苯丙氨酸可通过存在于两种内皮细胞的膜中的转运蛋白而到达脑。对于LNAAs，通过BBB的净吸收可由它们在血浆中的比率和它们对立体特异性L-型AA载体系统的不同亲合力来确定。系统L介导对具有大的中性侧链的氨基酸的不依赖钠的高亲合力的吸收。BBB的系统L与其它组织的L系统转运蛋白分享许多特性，因此认为BBB系统代表一种称为L1的不同同工型。
在一方面，本发明涉及双功能的化合物，其包括BBB转运介质和治疗CNS疾病或淀粉样蛋白相关疾病的部分，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，BBB转运介质为氨基酸或氨基酸类似物。
在一些实施方案中，BBB转运介质为碱性氨基酸或碱性氨基酸类似物，例如，精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和/或其类似物。在其它实施方案中，BBB转运介质为酸性氨基酸或酸性酸类似物，例如，天门冬氨酸、谷氨酸，和/或其类似物。在另外的其它实施方案中，BBB转运介质为小的中性氨基酸或小的中性氨基酸类似物，例如，甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸和/或其类似物。在还有一些其它的实施方案中，BBB转运介质为大的中性氨基酸或大的中性氨基酸类似物。示例性大的中性氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、组氨酸、缬氨酸、苏氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷酰胺和/或其类似物。
在一个实施方案中，所述氨基酸或氨基酸类似物在氮上被治疗CNS疾病或淀粉样蛋白相关疾病的部分取代。在一些实施方案中，当所述氨基酸包括芳族侧链时，氨基酸或氨基酸类似物在芳族侧链上被取代。在另一个实施方案中，氨基酸或氨基酸类似物在氮和芳族侧链二者上被取代。在更进一步的实施方案中，氨基酸或氨基酸类似物在氧上被取代。
在一些实施方案中，取代包括结合于氨基酸或氨基酸类似物的直接共价键。在其它实施方案中，取代包括连接基团，其将治疗CNS疾病或淀粉样蛋白相关疾病的部分连接于氨基酸或氨基酸类似物。在一些实施方案中，连接基团为二硫键、醚键、硫醚键、亚烷基或亚烯基键、氨基或肼基键、酯基键、硫代酸酯键、酰胺键、酸-不稳定键或席夫碱键。
本发明的化合物
本发明涉及(至少部分涉及)某些化学化合物(及其药用制剂)在预防或治疗CNS疾病和/或淀粉样蛋白相关疾病，，包括尤其以下疾病中的用途：阿尔茨海默氏病、脑淀粉样蛋白血管病、包涵体肌炎、唐氏综合征、糖尿病相关的淀粉样变性、血液透析相关的淀粉样变性(β2M)、原发性淀粉样变性(如λ或κ链相关的)、家族性淀粉样蛋白多精神病(FAP)、老年性全身淀粉样变性、家族性淀粉样变性、Ostertag-型、非神经病性淀粉样变性、头颅神经病、遗传性脑出血、家族性痴呆、慢性透析、家族性克雅氏病、杰茨曼-斯脱司勒-史茵克综合征、遗传性海绵体脑病、朊病毒病、家族性地中海发热、默-韦氏综合征、肾病、耳聋、风疹、四肢痛、心肌症、侵犯皮肤的沉积物、多发性骨髓瘤、良性单克隆性丙种球蛋白病(gammopathy)、巨球蛋白血症、骨髓瘤相关的淀粉样变性、甲状腺的髓质癌以及相关的前房淀粉样变性、癫痫发作、神经病性疼痛、阿伯克龙比氏变性、获得性癫痫样失语症、兰-克综合征、急性播散性脑脊髓炎、肾上腺白质营养不良、脑白质营养不良、认识不能、亚历山大病、大脑灰质营养不良、进行性致硬化神经灰质营养不良、交替性偏瘫、肌萎缩性侧索硬化、Lou Gehrig′s病、安格尔曼综合征、毛细管扩张性运动失调、共济失调和小脑/脊髓小脑变性、注意力缺乏症、Binswanger′s病、皮质下痴呆、Canavan病、脑低氧症、脑-眼-面-骨胳综合征、Pena ShokeirII型综合征、Charcot-Marie-牙、慢性炎性脱髓鞘多神经病(CIDP)、基于皮质的变性、退化性膝关节炎、糖尿病性神经病、早期婴幼儿癫痫性脑病、Ohtahara综合征、癫痫症、弗里德希氏共济失调、格-巴二氏综合征(GBS)、急性特发性多神经炎、哈-斯二氏病、伴有脑铁积聚的神经变性、杭廷顿氏舞蹈病、克腊伯氏病、Kugelberg-Welander病、脊柱肌萎缩(SMA)、I型SMA、II型SMA、III型SMA、肯尼迪氏综合征、进行性脊髓延髓肌萎缩、伴有关节弯曲的先天性SMA、成人SMA、莱内氏病、伦-加综合征、马-约病、3型脊髓小脑共济失调、单肢肌萎缩、多发性硬化、神经棘红细胞增多症、尼-皮病、橄榄体脑桥小脑萎缩、瘤外综合征、神经瘤外综合征、Lambert-Eaton肌无力综合征、僵人综合征、脑脊髓炎、重症肌无力、小脑退化、缘和/或脑干脑炎、神经肌强直、斜视眼阵挛和感觉神经病、帕金森氏病、佩-梅病、Pick′s病、原发性侧索硬化、进行性运动共济失调、梅毒性脊柱硬化、背侧脊髓痨、进行性核上麻痹、Rasmussen′s脑炎、Rett综合征、图雷特氏综合征、厄舍综合征、韦斯特综合征、婴儿抽搐、威尔逊氏病和/或肝豆状核变性。
本发明中的化学结构根据本领域已知的常规标准绘制。因此，当所绘制的原子(如碳原子)表示具有不满足的化合价时，则推定该化合价由氢原子满足，即使不必要明确绘出该氢原子。本发明某些化合物的结构包括产生立体化学的碳原子。应清楚除另有说明之外，由这些不对称产生的异构体(如所有的对映体和非对映体)包括在本发明的范围之内。即，除另有指明，任何手性碳中心可以具有(R)-或(S)-立体化学。可通过经典的分离技术以及通过立体化学控制的反应，获得基本上纯的这些异构体。另外，适当时，链烯可包括E-或Z-几何异构体。此外，本发明化合物可以以非溶剂化物形式以及具有可接受的溶剂(如水、THF、乙醇等)的溶剂化物形式存在。通常认为，对于本发明的目的来讲，所述溶剂化物形式等同于非溶剂化形式。
“小分子”指本身不是基因转录或翻译的产物的化合物(如蛋白质、RNA或DNA)，优选具有低的分子量，例如不大于约2500amu。
本文所用的术语“部分”和“基团”可互换使用，其从广义上说指化合物的一部分，如有机化合物的取代基或分子的原子团，其与另一部分连接。作为一种非限制性实例，氨基酸部分可以是如本文所定义的任何自然的或合成的氨基酸，其为共价键，如通过氮连接于另一有机部分。本领域技术人员已知所述部分的实例并打算包括在该术语的含义范围内，只要它们落入本文所定义的化合物的范围内。
本文所用的术语″化合物″意指由分子组成的物质，该分子进一步由原子构成。化合物可以是任何自然的或非-天然的物质，例如肽或多肽序列、有机或无机物分子或其组合、核酸分子、碳水化合物、脂质或其组合。化合物通常指一种化学实体，无论其是固相、液相或气相，以及无论其是粗制的混合物或纯化的和分离的。化合物包括化学化合物本身以及(当应用时)无定形的和结晶形式的化合物，包括多晶型，所述形式为混合物或为分离的；游离酸和游离碱形式的化合物；化合物的异构体，包括几何异构体、光学异构体和互变异构体，所述光学异构体包括旋光对映体和非对映体，手性异构体和非-手性异构体，所述光学异构体包括分离的光学异构体或光学异构体的混合物包括外消旋的和非-外消旋混合物；所述几何异构体包括反式(transoid)和顺式(cisoid)形式，其中异构体可以是分离的形式或为一种或多种其它异构体的混合物；化合物的同位素，包括含氘-和氚-化合物，以及包括含放射性同位素的化合物，包括治疗学上-和诊断学上-有效的放射性同位；多聚体形式的化合物，包括二聚物，三聚物等形式；所述化合物的盐，包括酸加成盐和碱加成盐，包括有机抗衡离子和无机抗衡离子，以及包括两性离子形式，其中如果化合物涉及两种或更多种抗衡离子，则两种或更多种抗衡离子可相同或不同；以及化合物的溶剂合物，包括半溶剂合物(hemisolvates)、单溶剂合物、二溶剂合物等，包括有机溶剂合物和无机溶剂合物，所述无机溶剂合物包括水合物；其中如果化合物涉及两种或更多种溶剂分子，两种或更多种溶剂分子可相同或不同。
此处所用术语“烷基”包括具有一或多个碳原子的饱和烃，包括直链烷基(如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等)、环状烷基(或者“环烷基”或“脂环”或“碳环”基团)(如环丙基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基等)、支链烷基(异丙基、叔丁基、仲丁基、异丁基等)以及烷基取代的烷基(如烷基取代的环烷基和环烷基取代的烷基)。术语“脂族基团”包括直链或支链特征的有机基团，一般具有1-22个碳原子。在复杂的结构中，所述链可以支链、桥连或交联。脂族基团包括烷基、链烯基和炔基。
在某些实施方案中，直链或支链烷基在其骨架上可具有30个或更少的碳原子，如C1-C30的直链或者C3-C30的支链。在某些实施方案中，直链或支链烷基在其骨架上可具有20个或更少的碳原子，如C1-C20的直链或者C3-C20的支链，更优选18或更少的碳原子。同样地，优选的环烷基在其环结构上具有4-10个碳原子，更优选在环结构上具有4-7个碳原子。术语“低级烷基”指在链中具有1-6个碳原子的烷基，以及在环结构中具有3-6个碳原子的环烷基。
除特别指明碳原子数外，此处所用的“低级脂族”、“低级烷基”、“低级链烯基”中的“低级”指该部分具有至少一个且至多约8个碳原子。在某些实施方案中，直链或支链低级烷基在其骨架上具有6个或更少的碳原子(如C1-C6的直链、C3-C6的支链)，更优选4个或更少的碳原子。同样地，优选的环烷基在其环结构上具有3-8个碳原子，更优选在环结构上具有5或6个碳原子。“C1-C6烷基”中的术语“C1-C6”指具有1-6个碳原子的烷基。
另外，除另有指明外，术语烷基包括“未取代的烷基”和“取代的烷基”，后者指在所述烃骨架的一或多个碳上具有代替一或多个氢原子的取代基的烷基。这些取代基可包括例如：链烯基、炔基、卤代、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基、芳氧基羰基氧基、羧酸酯基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷硫基羰基、烷氧基、磷酸根、膦酸根、亚膦酸根、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、亚氨基、巯基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸根、硫酸根、烷基亚磺酰基、磺酸根、氨基磺酰基、磺酰胺基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基或者芳基(包括杂芳基)。
“芳基烷基”是由芳基取代的烷基(如苯甲基(即苄基))。“烷基芳基”是由烷基取代的芳基(如对甲基苯基(即对甲苯基))。术语“正烷基”指直链(即非支链)未取代的烷基。“亚烷基”是相应的烷基的二价同系物。术语“链烯基”和“炔基”指不饱和的类似于烷基的脂族基团，但分别含有至少一个碳-碳双键或三键。适宜的链烯基和炔基包括具有2至约12个碳原子的基团，优选具有2至约6个碳原子的基团。
术语“芳族基团”或“芳基”包括含有一或多个环的不饱和的和芳族环状烃以及不饱和的和芳族杂环。芳基也可与非芳族的脂环或杂环稠合或桥连而形成多环(如1，2，3，4-四氢化萘)。“亚芳基”是芳基的二价同系物。芳基也可与非芳族的脂环或杂环稠合或桥连而形成多环(如1，2，3，4-四氢化萘)。
术语“杂环基”包括类似于碳环的闭合环结构，其中环中的一或多个碳原子不是碳元素，例如氮、硫或氧。杂环基可以是饱和的或不饱和的。另外，杂环基(例如吡咯基、吡啶基、异喹啉基、喹啉基、嘌呤基和呋喃基)可具有芳族特征，在此种情况下，它们可被称之为“杂芳基”或“杂芳族”基团。
除非另有说明，芳基或杂环基(包括杂芳基)也可在一或多个组成原子上被取代。杂芳族和杂脂族基团的实例可具有1-3个分离的或稠合的环，其每个环中具有3至约8个成员及一或多个N、O或S杂原子。术语“杂原子”通常包括除碳或氢外的任何元素，优选元素的实例包括氮、氧、硫和磷。杂环基可以是饱和的或不饱和的或者芳族的。
杂环的实例包括，但不限于吖啶基；吖辛因基；苯并咪唑基；苯并呋喃基；苯并硫代呋喃基；苯并噻吩基；苯并唑基；苯并噻唑基；苯并三唑基；苯并四唑基；苯并异唑基；苯并异噻唑基；苯并咪唑啉基；咔唑基；4aH-咔唑基；咔啉基；苯并二氢吡喃基；苯并吡喃基；肉啉基；十氢喹啉基；2H，6H-1，5，2-二噻嗪基；二氢呋喃并[2，3-b]四氢呋喃；呋喃基；呋咱基；咪唑烷基；咪唑啉基；咪唑基；1H-吲唑基；indolenyl；二氢吲哚基；中氮茚基；吲哚基；3H-吲哚基；异苯并呋喃基；异苯并二氢吡喃基；异吲唑基；异二氢吲哚基；异吲哚基；异喹啉基；异噻唑基；异唑基；亚甲二氧基苯基；吗啉基；萘啶基；八氢异喹啉基；二唑基；1，2，3-二唑基；1，2，4-二唑基；1，2，5-二唑基；1，3，4-二唑基；唑啉基；唑基；唑烷基；嘧啶基；菲啶基；菲咯啉基；吩嗪基；吩噻嗪基；phenoxathiinyl；吩嗪基；2，3-二氮杂萘基；哌嗪基；哌啶基；哌啶酮基；4-哌啶酮基；胡椒基；喋啶基；嘌呤基；吡喃基；吡嗪基；吡唑烷基；吡唑啉基；吡唑基；哒嗪基；吡啶并唑；吡啶并咪唑；吡啶并噻唑；吡啶基；吡啶基；嘧啶基；吡咯烷基；吡咯啉基、2H-吡咯基；吡咯基；喹唑啉基；喹啉基；4H-喹啉嗪基；喹喔啉基、奎宁环基；四氢呋喃基；四氢异喹啉基；四氢喹啉基；四唑基；6H-1，2，5-噻二嗪基；1，2，3-噻二唑基；1，2，4-噻二唑基；1，2，5-噻二唑基；1，3，4-噻二唑基；噻蒽基；噻唑基；噻吩基；噻吩并噻唑基；噻吩并唑基；噻吩并咪唑基；噻吩基；三嗪基；1，2，3-三唑基；1，2，4-三唑基；1，2，5-三唑基；1，3，4-三唑基；和呫吨基。优选的杂环包括，但不限于，吡啶基；呋喃基；噻吩基；吡咯基；吡唑基；吡咯烷基；咪唑基；吲哚基；苯并咪唑基；1H-吲唑基；唑烷基；苯并三唑基；苯并异唑基；羟吲哚基；苯并唑啉基；和邻氨苯基乙酰基(isatinoyl)。还包括含有诸如上述杂环的稠环和螺环化合物。
通常的烃芳基为具有一个环的苯基。两个环的烃芳基包括萘基、茚基、苯并环辛烯基、苯并环庚烯基、并环戊二烯基和甘菊环基，以及其部分氢化的类似物，如二氢化茚基和四氢化萘基。三个环的烃芳基的实例包括acephthylenyl、芴基、phenalenyl、菲基和蒽基。
芳基还包括杂单环芳基，即单环杂芳基，如噻吩基、呋喃基、吡喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基和哒嗪基；及其氧化的同系物，如吡啶酮基、唑酮基、吡唑酮基、异唑酮基和噻唑酮基。对应的氢化(即非芳族)的杂单环基团包括吡咯烷基、吡咯啉基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌啶基和哌啶子基、哌嗪基以及吗啉子基和吗啉基。
芳基还包括稠合的双环杂芳基，如吲哚基、异吲哚基、中氮茚基、吲唑基、喹啉基、异喹啉基、2，3-二氮杂萘基、喹喔啉基、喹唑啉基、肉啉基、苯并吡喃基、异苯并吡喃基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、嘌呤基、喹嗪基、异喹诺酮基、喹诺酮基、萘啶基和喋啶基，以及部分氢化的类似物，如苯并二氢吡喃基、异苯并二氢吡喃基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基和四氢吲哚基。芳基还包括稠合的三环基团，如phenoxathiinyl、咔唑基、菲啶基、吖啶基、萘嵌间二氮杂苯基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩嗪基和二苯并呋喃基。
某些典型的芳基包括取代的或未取代的5-和6-元单环基团。在另一方面，各Ar基团可选自取代的或未取代的苯基、吡咯基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、异噻唑基、咪唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、唑基、异唑基、吡啶基、吡嗪基、哒嗪基和嘧啶基。进一步的实例包括取代的或未取代的苯基、1-萘基、2-萘基、联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-唑基、4-唑基、5-唑基、3-异唑基、4-异唑基、5-异唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。
此处所用的术语“胺”或“氨基”是指式-NRaRb的未取代的或取代的基团，其中Ra和Rb各自独立是氢、烷基、芳基或杂环基，或者Ra和Rb与其相连的氮原子一起形成在环中具有3-8个原子的环基团。因此，除另有说明，术语氨基包括环氨基，如哌啶基或吡咯烷基。因此，此处所用的术语“烷基氨基”指具有与其相连的氨基的烷基。适合的烷基氨基包括具有1至约12个碳原子的基团，优选1至约6个碳原子。术语氨基包括其中氮原子与至少一个碳或杂原子共价结合的化合物或基团。术语“二烷基氨基”包括其中氮原子结合至少两个烷基的基团。术语“芳基氨基”和“二芳基氨基”包括其中氮原子分别结合至少一或两个芳基的基团。术语“烷基芳基氨基”指结合至少一个烷基和至少一个芳基的氨基。术语“烷基氨基烷基”指被烷基氨基取代的烷基、链烯基或炔基。术语“酰胺”或“氨基羰基”包括包含结合羰基或硫代羰基的碳的氮原子的化合物或基团。
术语“烷硫基”是指具有与其相连的巯基的烷基。适合的烷硫基包括具有1至约12个碳原子的基团，优选1至约6个碳原子。
此处所用的术语“烷基羧基”是指具有与其相连的羧基的烷基。
此处所用的术语“烷氧基”是指具有与其相连的氧原子的烷基。代表性的烷氧基包括具有1至约12个碳原子的基团，优选1至约6个碳原子，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等。烷氧基的实例包括甲氧基、乙氧基、异丙氧基、丙氧基、丁氧基和戊氧基。所述烷氧基可被诸如下列的基团取代：链烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳基氧基羰基氧基、羧酸酯、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷硫基羰基、烷氧基、磷酸根、膦酸根、亚膦酸根、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、亚氨基、巯基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸根、硫酸根、烷基亚磺酰基、磺酸根、氨基磺酰基、磺酰胺基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基或者芳基或杂芳基基团。卤素取代的烷氧基的实例包括，但不限于，氟代甲氧基、二氟代甲氧基、三氟甲氧基、氯代甲氧基、二氯代甲氧基、三氯甲氧基等，以及全卤代烷氧基。
术语“酰基氨基”是指其中氨基与酰基相连的基团。例如，所述酰基氨基包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基。
术语“烷氧基烷基”、“烷基氨基烷基”和“硫代烷氧基烷基”包括以上所述的烷基，还包括取代所述烃骨架的一或多个碳的氧、氮或硫原子。
术语“羰基”或“羧基”包括含有一个通过双键与氧原子连接的碳原子的化合物或基团。含有羰基基团的实例包括醛、酮、羧酸、酰胺、酯、酸酐等。
术语“醚”或“醚性的”包括含有一个与两个碳原子键合的氧原子的化合物或基团。例如，醚或醚性基团包括所指的被烷氧基取代的烷基、链烯基或炔基的“烷氧基烷基”。
“磺酸酯”基是与碳原子键合的-SO3H或-SO3 -X+，其中X+是阳性相反离子基团。类似地，“磺酸”化合物具有与碳原子键合的-SO3H或-SO3 -X+基团，其中X+是阳离子。此处所用术语“硫酸根”是与碳原子键合的-OSO3H或-OSO3 -X+基团，及“硫酸”化合物具有与碳原子键合的-SO3H或-OSO3 -X+基团，其中X+是阳离子基团。在本发明中，适合的阳离子基团可以是氢原子。在某些情况下，所述阳离子基团实际上可以是所述治疗性化合物上的另一个基团，其在生理pH下带有正电荷，例如氨基。
要求“相反离子”保持亲电性。阴性相反离子的实例包括卤化物、三氟甲磺酸盐、硫酸盐、硝酸盐、氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐、磷酸盐、草酸盐、氰化物、烷基羧酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基苯并三唑、醇盐、硫醇盐、烷基磺酰氧基、卤代烷基磺酰氧基、芳基磺酰氧基、硫酸氢盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘甲酸盐、甲磺酸盐、葡糖庚酸盐或乳糖酸盐。含有与阴离子基团共价键合的阳离子基团的化合物可被称为“内盐”。
术语“硝基”指-NO2；术语“卤素”或“卤代基”或“卤代”表示-F、-Cl、-Br或-I；术语“硫醇”、“硫代”或“巯基”指-SH；术语“羟基”指-OH。
术语“酰基”是指通过其碳原子连接于氢(如甲酰基)、脂肪烃基(如乙酰基)、芳基(如苯甲酰基)等的羰基。即是说，酰基指由具有以下通式：R-C(O)-的羧酸(RC(O)OH)衍生的基团，其中R为如上定义的烷基或芳基。当R为烷基时，“酰基”相当于“烷基羰基”；当R为芳基时，“酰基”相当于“芳基羰基”。术语“取代的酰基”包括其中一或多个碳原子上的一或多个氢原子被诸如下列基团取代的酰基：烷基、炔基、卤素、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧酸酯基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷硫基羰基、烷氧基、磷酸根、膦酸根、亚膦酸根、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、亚氨基、巯基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸根、硫酸根、烷基亚磺酰基、磺酸根、氨基磺酰基、磺酰胺基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基或者芳基或杂芳基基团。
如在说明书和附图所用的，任选的单键/双键由实线与虚线一起表示，并指两个碳原子之间的共价键，该共价键可以是单键或双键。例如，下面的结构：
Figure A20058004670400541
可代表环己烷或环己烯。
除非另外指明，本发明化合物的化学基团，包括上述讨论的基团，可以是“取代的或未取代的”。在某些实施方案中，术语“取代的”指所述基团在所述基团上而非氢上有取代基(在多数情况下，取代氢)，从而使该分子具有所要求的功能。取代基的实例包括选自下列的基团：直或支链烷基(优选C1-C5)、环烷基(优选C3-C8)、烷氧基(优选C1-C6)、硫代烷基(优选C1-C6)、链烯基(优选C2-C6)、炔基(优选C2-C6)、杂环基、碳环基、芳基(如苯基)、芳氧基(如苯氧基)、芳烷基(如苄基)、芳氧基烷基(如苯氧基烷基)、芳基乙酰胺基、烷基芳基、杂芳基烷基、烷基羰基和芳基羰基或者其它此类酰基、杂芳基羰基和杂芳基，以及(CR’R”)0-3NR’R”(如-NH2)、(CR’R”)0-3CN(如-CN)、-NO2、卤素(如-F、-Cl、-Br或-I)、(CR’R”)0-3C(卤素)3(如-CF3)、(CR’R”)0-3CH(卤素)2、(CR’R”)0-3CH2(卤素)、(CR’R”)0-3CONR’R”、(CR’R”)0-3(CNH)NR’R”、(CR’R”)0-3S(O)1-2NR’R”、(CR’R”)0-3CHO、(CR’R”)0-3O(CR’R”)0-3H、(CR’R”)0-3S(O)0-3R’(如-SO3H)、(CR’R”)0-3O(CR’R”)0-3H(如-CH2OCH3和-OCH3)、(CR’R”)0-3S(CR’R”)0-3H(如-SH和-SCH3)、(CR’R”)0-3OH(如-OH)、(CR’R”)0-3COR’、(CR’R”)0-3(取代的或未取代的苯基)、(CR’R”)0-3(C3-C8环烷基)、(CR’R”)0-3CO2R’(如-CO2H)和(CR’R”)0-3OR’，其中R’和R”各自独立为氢、C1-C5烷基、C2-C5链烯基、C2-C5炔基或芳基；或者任何天然存在的氨基酸的侧链。
在另一实施方案中，取代基可选自下列的基团：直或支链烷基(优选C1-C5)、环烷基(优选C3-C8)、烷氧基(优选C1-C6)、硫代烷基(优选C1-C6)、链烯基(优选C2-C6)、炔基(优选C2-C6)、杂环基、碳环基、芳基(如苯基)、芳氧基(如苯氧基)、芳烷基(如苄基)、芳氧基烷基(如苯氧基烷基)、芳基乙酰胺基、烷基芳基、杂芳基烷基、烷基羰基和芳基羰基或者其它此类酰基、杂芳基羰基或杂芳基，(CR’R”)0-10NR’R”(如-NH2)、(CR’R”)0-10CN(如-CN)、-NO2、卤素(如F、Cl、Br或I)、(CR’R”)0-10C(卤素)3(如-CF3)、(CR’R”)0-10CH(卤素)2、(CR’R”)0-10CH2(卤素)、(CR’R”)0-10CONR’R”、(CR’R”)0-10(CNH)NR’R”、(CR’R”)0-10S(O)1-2NR’R”、(CR’R”)0-10CHO、(CR’R”)0-10O(CR’R”)0-10H、(CR’R”)0-10S(O)0-3R’(如-SO3H)、(CR’R”)0-10O(CR’R”)0-10H(如-CH2OCH3和-OCH3)、(CR’R”)0-10S(CR’R”)0-3H(如-SH和-SCH3)、(CR’R”)0-10OH(如-OH)、(CR’R”)0-10COR’、(CR’R”)0-10(取代的或未取代的苯基)、(CR’R”)0-10(C3-C8环烷基)、(CR’R”)0-10CO2R’(如-CO2H)和(CR’R”)0-10OR’，或者任何天然存在的氨基酸的侧链；其中R’和R”各自独立为氢、C1-C5烷基、C2-C5链烯基、C2-C5炔基或芳基；或者R’和R”一起构成亚苄基或-(CH2)2O(CH2)2-基团。
应清楚“取代”或“由...取代”包括暗示的条件是：这些取代合乎被取代的原子和取代基的可允许的化合价，并且所述取代产生稳定的化合物，例如，不自发进行转化，如重排、环合、消除等。此处所用的术语“取代的”意指包括所有允许的有机化合物的取代基。广义地讲，可允许的取代基包括有机化合物的非环状和环状、支链和非支链、碳环和杂环、芳族和非芳族的取代基。所述可允许的取代基可以是一个或多个。
在某些实施方案中，“取代基”可选自：例如卤代基、三氟甲基、硝基、氰基、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、C1-C6烷氧基羰基氧基、芳基氧基羰基氧基、C1-C6烷基羰基、C1-C6烷氧基羰基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷硫基、芳硫基、杂环基、芳基烷基以及芳基(包括杂芳基)。
还应该理解，术语“类似物”指在结构上与母体化合物相关并保留至少可测量量的活性的化学化合物。即是说，类似物可以是由原始的或最初的化合物改变而成的化合物或组成，或者是存在一个或多个化学添加、删除、取代基或如上所述的取代物的化合物或组成，这些化学添加、删除、取代基或如上所述的取代物并不存在于原始化合物或组成的结构中。本文所用的类似物通常可具有原始化合物或组成的至少10％、20％、30％、40％或50％活性，且更优选高达和超过原始化合物或组成的活性的100％。类似物可具有不同于原始化合物或组成的物理或功能特性，例如，不同的或增强的溶解度、膜渗透性或生物半衰期，同时保留抗-病毒或抗-肿瘤活性。术语″类似物″也指给定化合物的不同的对映体形式，如用给定成分的一种或多种对映体形式制得的分子或化合物的右旋或左旋形式。类似物可具有，例如，一个或多个环的修饰和/或一个或多个取代基(单独或组合)。类似物包括任何上述分子的双键异构体、还原产物、侧链修饰和立体异构体。术语类似物指具有基本类似的组成和/或功能特性的任何物质，优选具有基本类似的组成和功能特性，因此具有基本类似的组成和/或功能特性的物质即为类似物。类似物可以是天然存在的或经合成产生的。此外，术语类似物可包括这样的化合物，其中一个或多个原子被不同的，优选等电子原子取代
术语″氨基酸″指包含氨基和羧酸基团的任何化合物。虽然氨基最常出现于邻近羧基官能团的位置，但氨基可定位于分子内的任何位置。氨基酸也可以包含另外的官能团，如氨基、硫代、羧基、酰胺、咪唑等。氨基酸可以是合成的或天然存在的，且可以以其外消旋的或光学活性(D-或L-)形式使用，包括不同比例的立体异构体。
在一个实施方案中，本发明涉及式I化合物：
A——Y——Q
其中：
Q是BBB转运介质；
Y为直接键或连接基团；
A是氢、烷基、烷氧基、链烯基、链烯基氧基、炔基、炔基氧基、碳环基、杂环基、二环基、芳基、杂芳基、稠环芳基或杂芳基、芳氧基、芳基烷基、芳基烷氧基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、噻唑基、三唑基、咪唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、
R4-S-CH2-、
Figure A20058004670400571
R4-O-CH2-，或
Figure A20058004670400572
其各自可任选被取代；和
R4和R5与氮原子一起形成5或6元杂环，或各自独立选自氢、烷基、烷氧基、链烯基、链烯基氧基、炔基、炔基氧基、环烷基、芳基、芳氧基、芳基烷基、芳基烷氧基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、噻唑基、三唑基、咪唑基、苯并噻唑基和苯并咪唑基，其各自可任选被取代；
或其药学上可接受的盐、酯或前药。
在一些实施方案中，Q为5或6元芳族或杂芳族部分，其可被进一步取代。在其它实施方案中，Q为氨基酸部分或其类似物。Q可以是碱性氨基酸部分或其类似物，如精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸，和/或其类似物。Q还可以是酸性氨基酸部分或其类似物，如天门冬氨酸、谷氨酸，和/或其类似物。而且，Q可以是小的中性氨基酸部分或其类似物，如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸和/或其类似物。Q也可以是大的中性氨基酸部分或其类似物，如苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、组氨酸、缬氨酸、苏氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷酰胺，和/或其类似物。在其它实施方案中，连接基团为二硫键、醚键、硫醚键、亚烷基或亚烯基键、氨基或肼基键、酯基键、硫代酸酯键、酰胺键、酸-不稳定键或席夫碱键。
在另一个实施方案中，本发明涉及式II化合物：
Figure A20058004670400581
其中：
X为氧、氮或硫；
Y为直接键或连接基团；
Z1、Z2、Z3各自独立为C、CH、CH2、P、N、NH、S或不存在；
R1和R2各自独立不存在，或为氢、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳基、芳烷基或酰基，其各自可任选被取代；
R3选自氢、烷基、芳基、酰氨基、芳基酰氨基、烷基羰基、芳基羰基、芳基氨基羰基、烷氧基羰基、烷磺酰基、芳烃磺酰基、环烷基磺酰基和杂芳烃磺酰基，其各自可任选被取代；
A是氢、烷基、烷氧基、链烯基、链烯基氧基、炔基、炔基氧基、碳环基、杂环基、二环基、芳基、杂芳基、稠环芳基或杂芳基、芳氧基、芳基烷基、芳基烷氧基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、噻唑基、三唑基、咪唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、
R4-S-CH2-、
Figure A20058004670400582
R4-O-CH2-，或
Figure A20058004670400583
其各自可任选被取代；和
R4和R5与氮原子一起形成5或6元杂环，或各自独立为氢、烷基、烷氧基、链烯基、链烯基氧基、炔基、炔基氧基、环烷基、芳基、芳氧基、芳基烷基、芳基烷氧基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、噻唑基、三唑基、咪唑基、苯并噻唑基或苯并咪唑基，其各自可任选被取代；
或其药学上可接受的盐、酯或前药。
在一个实施方案中，X为氧或氮。在另一个实施方案中，Y为直接键。在再一个实施方案中，Z1、Z2和Z3为N、C或CH。在又一个实施方案中，R1和R2各自独立不存在或为氢。在另一个实施方案中，R3为氢、芳基氨基、芳基氨基羰基或芳烃磺酰基，其各自可任选被取代。在再一个实施方案中，A是以下基团之一：
R4-S-CH2-、
Figure A20058004670400591
R4-O-CH2-，或其各自可任选被取代。
在又一个实施方案中，R4和R5各自独立为环烷基、芳基、芳氧基、芳基烷基、芳基烷氧基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、噻唑基、三唑基、咪唑基、苯并噻唑基或苯并咪唑基，其各自可任选被取代。在一些实施方案中，R4和R5各自独立为吡啶、嘧啶、嘧啶酮、四氢吡啶、哌啶、哌嗪、咪唑、苯并咪唑、唑、二唑、苯并唑、三唑、噻唑、苯并噻唑、四唑、噻二唑、吡唑并嘧啶、异喹啉或四氢异喹啉，其各自可任选被取代。在另一个实施方案中，R4和R5与氮原子一起形成6元环，该环被一个或多个另外的杂原子任选间隔。在一些实施方案中，所生成的6元环是非稠合环。在其它实施方案中，连接基团为二硫键、醚键、硫醚键、亚烷基或亚烯基键、氨基或肼基键、酯基键、硫代酸酯键、酰胺键、酸-不稳定键或席夫碱键。
在进一步的实施方案中，所述化合物为选自表1的化合物的至少一个化合物及其药学上可接受的盐、酯和前药。
表1-示例性的本发明化合物.
Figure A20058004670400601
Figure A20058004670400621
Figure A20058004670400631
Figure A20058004670400641
Figure A20058004670400651
Figure A20058004670400661
在再一个实施方案中，所述化合物为选自表2的化合物的至少一个化合物及其药学上可接受的盐、酯和前药。
表2-示例性的本发明化合物.
Figure A20058004670400691
Figure A20058004670400692
在一些实施方案中，本发明化合物不是表3的化合物及其药学上可接受的盐。
表3-示例性的化合物.
Figure A20058004670400701
Figure A20058004670400711
在一些实施方案中，本发明化合物包括表3的化合物及其药学上可接受的盐。
应该理解，本文所述的化合物的任何用途均在本发明范围内且意欲被本发明所覆盖。
库
在另一方面，本发明提供式I化合物和/或式II化合物的库(libraries)，以及制备这样的化合物库的方法。组成库(combinatoriallibraries)的合成是本领域熟知的且已有论述(见，如E.M.Gordon等，J.Med.Chem. 37：1385-1401(1994))。因此，本发明构思合成式I化合物和/或式II化合物的组成库的方法。
在一些实施方案中，本发明的化合物库包含至少30个化合物，至少100个化合物或至少500个化合物。在一些实施方案中，本发明的化合物库包含少于109个化合物、少于108个化合物或少于107个化合物。
化合物库可以是基本纯的，即，基本不含不是所需产物的化合物，如化合物库的成员。在一些实施方案中，根据本发明的方法制备的化合物库的纯度为至少约50％、至少约70％、至少约90％或至少约95％.
本发明的化合物库根据本发明的方法制备。一般来说，用于合成本发明的化合物库的至少一种起始原料作为富于变化的群提供。本文所用的术语″富于变化的群″指包含至少两种不同化学实体(例如不同化学结构)的群。例如，式II化合物的″富于变化的群″应包括至少两种不同的式II化合物。利用使化合物固定于固体载体的连接键的富于变化的群种可通过将所述连接键解离来制备各种化合物。
本发明的化合物库可用于例如开发药物。例如，可筛选本发明的化合物库(如根据本文所述方法)，以确定本化合物库包含的化合物是否具有预先选择的活性(如用于治疗CNS疾病或淀粉样蛋白相关疾病)。
大鼠原代脑血管内皮细胞的分离
靶向中枢神经系统(CNS)药物的开发的重点是它们渗透进脑的能力。本发明提供体外试验以预测给定药物通过特殊的载体-介导的转运系统越过血脑屏障(BBB)的可能性。先前已报道繁复的过程的大鼠原代脑内皮细胞(RBEC)的分离和培养。收率的高度变化和细胞品质是阻碍其用于开发测试化合物的筛选测定的介质的所有因素。在某些方面，本发明涉及从微血管分离和培养富含RBEC的可再生方法，以使它们用于例如筛选具有结合于大的中性氨基酸载体(L1-系统载体)的能力的化合物。与前述方案比较，本方法具有几个优点。培养仅5天后，内皮细胞可被特征鉴定并立即用于筛选。本方法提供高的得率，例如得自36个脑的RBEC提供足够的细胞以便同时筛选每板7个化合物(2-3块96-孔板)。在短期培养物中，原代RBEC保留它们的形态以及它们的内皮特性如表达von Willebrand因子(因子VIII-相关抗原)、特异性凝集素结合，和乙酰化低密度脂蛋白(Ac-LDL)的摄取。这种新的分离步骤的创新特征为1)最优化的两阶段酶促消化，以产生排除了大部分非-内皮细胞的部分消化的微血管，2)通过短的初始粘附期改进RBEC的选择性生长，和3)省略这些先前步骤产生的克隆过程。
因此，在一方面，本发明涉及分离大鼠初级脑血管内皮细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括一个或多个以下步骤：从大鼠中取出皮质；消化皮质；分离微血管(microcapillaries)；消化微血管；再次分离微血管；和孵育微血管直至内皮细胞自我建立。在一个实施方案中，所述方法产生富含脑内皮细胞的培养物。在其它实施方案中，用于分离和培养富含原代内皮细胞的方法保留RBEC及其内源性转运蛋白如L1-系统载体的官能团的特性。
在再一个方面，按本方法所述分离的大鼠原代脑血管内皮细胞用于测试本发明的试验化合物。例如，它们可用于测定使用主动转运蛋白系统如L1-系统，使特定化合物越过BBB的间接能力。在一些实施方案中，在筛选药物的快速、可靠和可再现的竞争结合试验中，使用保留其内皮转运蛋白系统功能的RBEC培养物。在一些实施方案中，这种竞争结合试验可用于鉴定与L1-系统载体结合的化合物并提供选择CNS药物候选物的参数，以设计可使用特殊的主动转运蛋白而渗透进脑的药物。
患者和患者群体
术语“患者”包括其中发生淀粉样变性，或者对淀粉样蛋白疾病敏感的活体，所述疾病有例如如阿尔茨海默氏病、唐氏综合征、CAA、透析-相关性(β2M)淀粉样变性、继发性(AA)淀粉样变性、原发性(AL)淀粉样变性、遗传性淀粉样变性、糖尿病等。患者的实例包括人、鸡、鸭、北京鸭、鹅、猴、鹿、牛、兔、羊、山羊、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。可采用已知的方法，以有效调节患者淀粉样蛋白聚集或淀粉样蛋白诱导的毒性的剂量及给药时间，可对患者给予本发明的组合物，这将在本文中进一步说明。必须达到治疗效果的治疗化合物的有效量可根据诸如以下因素变化：患者临床部位已沉积的淀粉样蛋白的量、患者的年龄、性别和体重以及治疗化合物调节患者淀粉样蛋白聚集的能力。可调节剂量方案以提供最佳的治疗响应。例如，可以每日以数个分剂量给药，或者可按治疗情况的紧急所示，按比例降低该剂量。
在本发明的某些实施方案中，患者需要用本发明的方法治疗，根据这种需要选择治疗。需要治疗的患者是根据诊断(如医学诊断)专业公认的，包括已被确认患有与淀粉样蛋白-沉积或淀粉样变性有关的疾病或病症、出现此类疾病或病症的症状或者面临此类疾病或病症的危险的患者，期望受益于这种治疗(如消除、治愈、预防、减轻、缓解、改变、矫正、改良、改善或影响疾病或病症、疾病或病症的症状或者疾病或病症的危险)。
在本发明的一示例中，患者为人。例如，所述患者为30岁以上的人、40岁以上的人、50岁以上的人、60岁以上的人、70岁以上的人、80岁以上的人、85岁以上的人、90岁以上的人或95岁以上的人。所述患者可以是女人，包括绝经后的女人，她可正在进行激素(雌激素)替代治疗。所述患者可以是男人。在另一实施方案中，所述患者年龄在40岁以下。
患者可以是有患阿尔茨海默氏病风险的人，例如年龄40岁以上或者有易患阿尔茨海默氏病体质的人。在科学文献中确定的或提出的易患阿尔茨海默氏病的因素包括其中基因型易患阿尔茨海默氏病的人；易使人患有阿尔茨海默氏病的环境因素；易使人患有阿尔茨海默氏病的由病毒或细菌物感染的既往史；以及易使人患有阿尔茨海默氏病的血管因素。患者还具有一或多种以下风险因素：心血管疾病(如冠状动脉的动脉粥样硬化、心绞痛和心肌梗塞)或脑血管疾病(如颅骨内或颅骨外动脉的动脉粥样硬化、中风、昏厥以及瞬间缺血性休克)，如高胆固醇血症、高血压、糖尿病、吸烟、家族性冠心病或有冠心病既往史、脑血管病以及心血管病。一般将高胆固醇血症定义为血浆总胆固醇浓度大于约5.2mmol/L(约200mg/dL)。
现认为几种基因类型易使人患有阿尔茨海默氏病。它们包括与家族性阿尔茨海默氏病相关的基因类型，如早老素-1、早老素-2以及淀粉样前体蛋白(APP)错义突变体，以及现在认为能增加获得散发性(迟发型)阿尔茨海默氏病的风险的α-2-巨球蛋白和LRP-1基因型。E.van Uden等，J.Neurosci.22(21)，9298-304(2002)；J.J.Goto等，J.Mol.Neurosci.19(1-2)，37-41(2002)。另一种产生阿尔茨海默氏病的基因风险因素为ApoE的突变体，ApoE是编码载脂蛋白(尤其是apoE4基因型)的基因，它是低密度脂蛋白颗粒的成分。WJ Strittmatter等，Annu.Rev.Neurosci.19，53-77(1996)。各种ApoE等位基因改变发生阿尔茨海默氏病的可能性的分子机理尚未清楚，但是ApoE在胆固醇代谢中的作用与将胆固醇代谢与阿尔茨海默氏病关联的事实的增长一致。例如，最近发现长期使用降低胆固醇的药物(如他丁类)与降低阿尔茨海默氏病的发生有关，并且现已表明降低胆固醇药物能降低APP转基因小鼠的病理学。这些和其它研究提示胆固醇可影响APP过程。现已认为ApoE4能改变Aβ运输(进出大脑)，并促进Aβ在大脑中的保留。还认为ApoE4促进APP形成Aβ。现已提出环境因素是作为易使患者患有阿尔茨海默氏病的因素，其包括接触铝，尽管流行学迹象并不明确。另外，某些病毒或细菌物的预先感染可以使患者患有阿尔茨海默氏病，包括单纯疱疹病毒和衣原体肺炎。最后，其它易患阿尔茨海默氏病的因素可包括心血管或脑血管疾病的风险因素，包括吸烟、高血压和糖尿病。“阿尔茨海默氏病的风险”还包括任何其它的以上未列的或尚未确定的易患病因素，包括由脑损伤、药物、饮食或生活方式引起的增加阿尔茨海默氏病风险的因素。
本发明方法可用于以下一或多种用途：预防阿尔茨海默氏病、治疗阿尔茨海默氏病，或缓解阿尔茨海默氏病的症状或者调节淀粉样β(Aβ)肽的产生或水平。在一实施方案中，所述人在编码β-淀粉样前体蛋白、早老素-1或早老素-2的基因中携带一种或多种突变体。在另一实施方案中，所述人携带载脂蛋白ε4基因。在另一实施方案中，所述人具有阿尔茨海默氏病或痴呆病的家族史。在另一实施方案中，所述人具有三(染色)体细胞21(唐氏综合征)。在另一实施方案中，所述患者具有正常或较低的血浆总血胆固醇水平。在另一实施方案中，血浆总血胆固醇水平低于约200mg/dL，或低于约180mg/dL，及它可在约150-约200mg/dL范围内。在另一实施方案中，总LDL胆固醇水平低于约100mg/dL，或低于约90mg/dL，其范围可在约30至约100mg/dL。对本领域技术熟练人员来讲，测量血浆总血胆固醇和总LDL胆固醇的方法是熟知的方法，所述方法例如包括于通过引用结合到本发明中的WO 99/38498的第11页中公开的那些方法。测量血浆中其它固醇水平的方法公开于H.Gylling等，“Serum SterolsDuring Stanol Ester Feeding in a Mildly HypercholesterolemicPopulation”，J.Lipid Res.40：593-600(1999)。
在另一实施方案中，所述患者具有升高的血浆总血胆固醇水平。在另一实施方案中，血浆总胆固醇水平至少约200mg/dL，或者至少约220mg/dL，其范围可在约200至约1000mg/dL。在另一实施方案中，所述患者具有升高的总LDL胆固醇水平。在另一实施方案中，总LDL胆固醇水平大于约100mg/dL，或者更大于约110mg/dL，其范围可在约100至约1000mg/dL。
在另一实施方案中，人的年龄至少约40岁。在另一实施方案中，人的年龄至少约60岁。在另一实施方案中，人的年龄至少约70岁。在另一实施方案中，人的年龄至少约80岁。在另一实施方案中，人的年龄至少约85岁。在另一实施方案中，人的年龄在约60-100岁之间。
在另一进一步的实施方案中，通过诊断大脑成像技术，例如测量大脑活性、噬斑沉积或大脑萎缩，显示所述患者处于患病风险中。
在另一进一步的实施方案中，通过认知测试，例如临床痴呆等级(“CDR”)、阿尔茨海默氏病评价的认知-等级(“ADAS-Cog”)或者轻微-精神状态检查(“MMSE”)，显示所述患者处于患病风险中。在认知测试中，与类似年龄或教育背景的先前的对照组比较，患者可呈现出低于平均分的分数。与相同或类似认知测试中患者的前期分数相比，他们还可能呈现出降低的分数。
在测定CDR中，评估和评价患者一般在以下六个种类的认知和行为中的每一项进行：记忆、方向感、判断和解决问题、公共事务、家庭和嗜好以及个人护理。该评估可包括由患者(优选非常了解患者的确证者)提供的历史信息。在各自这些方面评估和评价患者，并测定鉴定等级(0、0.5、1.0、2.0或3.0)。0等级被认定为正常。1.0等级被认定对应于中等痴呆。CDR 0.5的患者被定性为中度健忘症、部分记忆事件和“良性”健忘症。在一实施方案中，所评估的患者CDR等级在0以上、约0.5以上、约1.0以上、约1.5以上、约2.0以上、约2.5以上或约3.0以上。
另一测试是轻微-精神状态检查(MMSE)，见Folstein“Mini-mentalstate.A practical method for grading the cognitive state of patients for theclinician”，J.Psychiatr.Res.12：189-198，1975中所述。MMSE评估全球智力退化的出现。还可参见Folstein“Differential diagnosis ofdementia.The clinical process”，Psychiatr Clin North Am.20：45-57，1997。MMSE是指评估痴呆症的发生以及全球智力退化的出现，如阿尔茨海默氏病和多样痴呆症。MMSE的得分为1-30。MMSE不评估基本认知潜能，如所谓的IQ试验。代替地是，它检测智力技巧。在MMSE目标测试中，人“正常”的智力能力得分为“30”(但是，在IQ试验中，MMSE得分30的人得分比“正常值”低得多)。参见，例如：Kaufer，J.Neuropsychiatry.Clin.Neurosci.10：55-63，1998；Becke，Alzheimer Dis Assoc Disord.12：54-57，1998；Ellis，Arch.Neurol.55：360-365，1998；Magni，Int.Psychogeriatr.8：127-134，1996；Monsch，Acta Neurol.Scand.92：145-150，1995。在一实施方案中，患者的得分在至少一次MMSE中低于30分。在另一实施方案中，患者得分低于约28，低于约26，低于约24，低于约22，低于约20，低于约18，低于约16，低于约14，低于约12，低于约10，低于约8，低于约6，低于约4，低于约2或低于约1。
另一种评估认知能力(尤其是阿尔茨海默氏病)的方法是阿尔茨海默氏病评估等级(ADAS-Cog)或者一种称之为标准化的阿尔茨海默氏病评估等级(SADAS)的修订方法。它是在阿尔茨海默氏病及以认知缺损为特征的相关疾病的临床药物实验中常用的有效方法。未将SADAS和ADAS-Cog设计为诊断阿尔茨海默氏病的方法；他们用于定性痴呆病的症状，并且是痴呆病发展的相对敏感的指标(参见，例如，Doraiswamy，Neurology 48：1511-1517，1997；和Standish，J.Am.Geriatr.Soc.44：712-716，1996)。每年未治愈阿尔茨海默氏病患者的年度恶化大为约8个点(参见，例如，Raskind，M Prim.Care Companion J ClinPsychiatry 2000Aug；2(4)：134-138)。
ADAS-Cog指使用调查表以70-点的规模测量如在AD中所见的认知力降低的发展和严重程度。ADAS-cog等级将错误答案的数量定量。因此，在该等级中高分表示认知降低的更严重的情况。在一实施方案中，患者的分数大于0、大于约5、大于约10、大于约15、大于约20、大于约25、大于约30、大于约35、大于约40、大于约45、大于约50、大于约55、大于约60、大于约65、大于约68或约70。
在另一实施方案中，患者未呈现阿尔茨海默氏病的症状。在另一实施方案中，患者为年龄是至少40岁的人，并且未呈现阿尔茨海默氏病的症状。在另一实施方案中，患者为年龄是至少40岁的人，并且呈现一或多种阿尔茨海默氏病的症状。
在另一实施方案中，患者患有中度认知损伤。在另一实施方案中，患者的CDR等级为约0.5。在另一实施方案中，患者具有前驱性的阿尔茨海默氏病。在另一实施方案中，患者具有脑淀粉样蛋白血管病。
通过应用本发明方法，可将患者血浆或脑脊髓液(CSF)中的淀粉样β肽的水平从治疗前水平降低约10至约100％，甚至约50至约100％。
在另一实施方案中，根据本发明的方法治疗前，患者血和CSF中淀粉样Aβ40和Aβ42肽水平升高，大于约10pg/mL，或大于约20pg/mL，或大于约35pg/mL或甚至大于约40pg/mL。在另一实施方案中，淀粉样Aβ42肽升高的水平范围为约30pg/mL至约200pg/mL。甚至至约500pg/mL。本领域技术人员将清楚：随着阿尔茨海默氏病发展，可测定到的CSF中的淀粉样蛋白β肽水平可从发病前的高水平降低。这种作用归因于增加了Aβ肽在脑中的沉积，而不是正常的从脑中清除到CSF中。
在另一实施方案中，根据本发明的方法治疗前，患者血和CSF中淀粉样Aβ40肽水平升高，大于约5pg Aβ42/mL，或大于约50pgAβ40/mL，或大于约400pg/mL。在另一实施方案中，淀粉样Aβ40肽升高的水平范围为约200pg/mL至约800pg/mL，甚至至约1000pg/mL。
在另一实施方案中，根据本发明的方法治疗前，患者的CSF中淀粉样Aβ42肽水平升高，大于约5pg/mL，或大于约10pg/mL，或大于约200pg/mL，或大于约500pg/mL。在另一实施方案中，淀粉样β肽的水平范围可为约10pg/mL至约1000pg/mL。甚至为约100pg/mL至约1000pg/mL。
在另一实施方案中，根据本发明的方法治疗前，患者CSF中淀粉样Aβ40肽水平升高，大于约10pg/mL，或大于约50pg/mL、甚至大于约100pg/mL。在另一实施方案中，淀粉样β肽的水平范围为约10pg/mL至约1000pg/mL。
患者脑、CSF、血或血浆中淀粉样β肽的量可通过本领域技术人员熟知的酶联免疫吸附试验(“ELISA”)或定量免疫印迹实验方法或者定量SELDI-TOF评估，例如Zhang等，J.Biol.Chem.274，8966-72(1999)和Zhang等，Biochemistry.40，5049-55(2001)中公开的方法。还可参见A.K.Vehmas等，DNA Cell Biol.20(11)，713-21(2001)，P.Lewczuk等，RapidCommun.Mass Spectrom，17(12)，1291-96(2003)；B.M.Austen等，J.Peptide Sci.6，459-69(2000)；以及H.Davies等，BioTechniques 27，1258-62(1999)。用按本领域技术人员熟知的方式制备的脑或血液样本进行这些试验。测量淀粉样β肽水平的另一有用的方法的实例为铕免疫试验(EIA)。参见WO 99/38498第11页。
可将本发明的方法用作治疗患有阿尔茨海默氏病或痴呆症的患者的疗法，或者可将本发明的方法用作预防带有诸如在患者中带有例如APP基因、ApoE基因或者早老素基因中基因突变的倾向的患者的阿尔茨海默氏病或痴呆症。患者可能患有(或者可能有产生倾向或者可能易于感染)血管性痴呆或老年性痴呆、中度认知损伤，或早期阿尔茨海默氏病。除阿尔茨海默氏病外，患者可能患有其它淀粉样蛋白相关疾病，如脑淀粉样蛋白血管病，或者患者可能有淀粉样蛋白沉积，尤其是脑中的淀粉样蛋白β淀粉样沉积。
治疗中枢神经系统紊乱和/或淀粉样蛋白相关疾病
本发明还涉及应用本发明化合物及其药用组合物治疗和预防中枢神经系统紊乱和/或淀粉样蛋白相关疾病的方法。可以给予本发明的药用组合物治疗性地或预防性地治疗与淀粉样蛋白(如：AL淀粉样蛋白(λ或κ-链相关的，如：淀粉样蛋白λ、淀粉样蛋白κ、淀粉样蛋白κ IV、淀粉样蛋白λVI、淀粉样蛋白γ、淀粉样蛋白γ1)、Aβ、IAPP、β2M、AA或AH淀粉样蛋白)原纤维形成、聚集或沉积有关的疾病。
本发明药用组合物可采用任何下列机理缓解淀粉样蛋白相关疾病的过程(以下所列仅为说明并不做限定)：减慢淀粉样蛋白原纤维形成或沉积的速率；减轻淀粉样蛋白沉积的程度；抑制、降低或阻止淀粉样蛋白原纤维形成；抑制由淀粉样蛋白诱发的神经变性或细胞毒性；抑制淀粉样蛋白诱发的炎症；增强从脑中清除淀粉样蛋白：增强脑中Aβ的降解，或促进在原纤维中构成淀粉样蛋白之前淀粉样蛋白的清除。
“淀粉样蛋白沉积的“调节”不仅包括如上所定义的抑制，而且包括促进淀粉样蛋白沉积或原纤维形成。因此，术语“调节”意欲涵盖预防或停止淀粉样蛋白形成或积聚，在已有淀粉样变性(如已经有淀粉样蛋白沉积)的患者中抑制或减缓更多淀粉样蛋白形成或积聚，在已有淀粉样变性的患者中减少或逆转淀粉样蛋白形成或积聚；促进淀粉样蛋白沉积，如增加体内或体外淀粉样蛋白沉积的速率或量。增强淀粉样蛋白的化合物可用于淀粉样变性的动物模型，例如：使在短期内在动物体内出现淀粉样蛋白的沉积成为可能，或在一段所选的时间段内增加淀粉样蛋白沉积成为可能。促进淀粉样蛋白的化合物可用于对在体内抑制淀粉样变性的化合物的筛选分析测试中，例如：在动物模型、细胞分析测试以及对淀粉样变性的体外分析测试中。可利用这种化合物例如为化合物提供更快或更灵敏的分析测试。相对于未经治疗的患者或相对于在治疗前的已治疗患者，测定淀粉样蛋白沉积的调节。
淀粉样蛋白沉积的“抑制”包括预防或终止淀粉样蛋白的形成，例如：原纤维形成，淀粉样蛋白的清除(例如脑中的可溶性Aβ)，抑制或减慢患有淀粉样变性患者(如：已有淀粉样蛋白沉积)的进一步的淀粉样蛋白沉积，以及减少或逆转有淀粉样变性发生迹象的患者的淀粉样原纤维生成或沉积。相对于未经治疗的患者，或相对于在治疗前已治疗的患者，测定对淀粉样蛋白沉积的抑制作用，或例如通过临床可测的改善的指标，例如或在患有脑淀粉样变性的患者的情况下测定，例如阿尔茨海默氏病或脑淀粉样蛋白血管病患者，稳定认知功能或预防认知功能的进一步退化(即预防、减慢或终止疾病进展)，或改善诸如CSF中Aβ或τ的浓度的参数进行测定。
此处所用的患者的“治疗”包括给予患者应用或服用本发明组合物，或应用或给予来自患者的细胞或组织本发明组合物，所述患者患有淀粉样蛋白-相关疾病或病症、具有这种疾病或病症的征状，或具有患这种疾病或病症的危险(或易感染性)，其目的是治愈、治疗、减轻、缓解、改变、补救、改进、改善或影响所述疾病或病症、所述疾病或病症的征状，或患这种疾病或病症的危险性(或易感染性)。术语“治疗”指在治疗或缓解损伤、病状或症状中的任何成功迹象，包括任何客观或主观的参数，例如消除、减轻、削弱症状，或使损伤、病状或症状更能为患者所忍受；减慢退化或衰退的速率；使退化的终点衰弱降低；改善患者的身体上或精神上的安宁；或在某些情况下预防痴呆的发生。症状的治疗或缓解可基于客观或主观的参数，包括身体检查的结果、精神病的评价，或认知的测试，如CDR、MMSE、ADAS-Cog或本领域已知的其它测试法。例如，本发明的方法通过减慢认知衰退的速率或减轻其程度，成功地治疗患者的痴呆症。
在一实施方案中，术语“治疗”包括保持患者的CDR等级在其基线等级或在0。在另一实施方案中，术语治疗包括降低患者CDR等级约0.25或以上、约0.5或以上、约1.0或以上、约1.5或以上、约2.0或以上、约2.5或以上或约3.0或以上。在另一实施方案中，术语“治疗”还包括与先前的对照组相比，降低患者CDR等级的增加率。在另一实施方案中，该术语包括降低患者CDR等级的增加率为相对于先前的或未治疗的对照组增加为约5％或以上、约10％或以上、约20％或以上、约25％或以上、约30％或以上、约40％或以上、约50％或以上、约60％或以上、约70％或以上、约80％或以上、约90％或以上或约100％。
在另一实施方案中，术语“治疗”还包括在MMSE中保持患者的得分。术语“治疗”包括增加患者的MMSE得分约1分、约2分、约3分、约4分、约5分、约7.5分、约10分、约12.5分、约15分、约17.5分、约20分或约25分。该术语还包括与先前的对照组相比，减小患者MMSE得分的降低率。在另一实施方案中，该术语包括减小患者MMSE得分的降低率为先前的或未治疗的对照组的降低的约5％或以下、约10％或以下、约20％或以下、约25％或以下、约30％或以下、约40％或以下、约50％或以下、约60％或以下、约70％或以下、约80％或以下、约90％或以下或约100％或以下。
在另一实施方案中，术语“治疗”还包括在ADAS-Cog中保持患者的得分。术语“治疗”包括降低患者的ADAS-Cog得分约1分或以上、约2分或以上、约3分或以上、约4分或以上、约5分或以上、约7.5分或以上、约10分或以上、约12.5分或以上、约15分或以上、约17.5分或以上、约20分或以上、约25分或以上。该术语还包括与先前的对照组相比，减小患者ADAS-Cog得分的增加率。在另一实施方案中，该术语包括减小患者ADAS-Cog得分的增加率为先前的或未治疗的对照组的增加的约5％或以上、约10％或以上、约20％或以上、约25％或以上、约30％或以上、约40％或以上、约50％或以上、约60％或以上、约70％或以上、约80％或以上、约90％或以上或约100％。
在另一实施方案中，术语“治疗”，例如治疗AA或AL淀粉样变性，包括血清肌氨酸酐清除的增加，例如，增加肌氨酸酐的清除率10％或以上、20％或以上、50％或以上、80％或以上、90％或以上、100％或以上、150％或以上、200％或以上。术语“治疗”还可包括缓解神经病综合征(NS)。也可包括缓解慢性腹泻和/或体重的增加，例如，10％或以上、15％或以上，或20％或以上。
不希望被理论束缚，在某些方面本发明的药用组合物包含预防或抑制在脑中或其它影响的器官(局部作用)内的或遍及全身(全身作用)的淀粉样蛋白原纤维形成的化合物。本发明的药用组合物在进入脑部后(在穿透血脑屏障后)或来自外周时，可有效控制淀粉样蛋白沉积。当在外围作用时，药用组合物的化合物可改变脑和血浆之间的淀粉样生成的肽的平衡，促进淀粉样生成的肽离开脑部。它还可以促进淀粉样蛋白(可溶性)的清除(或分解代谢)，而后由于减少淀粉样蛋白在诸如肝、脾、胰腺、肾、关节、脑等特定器官中的聚集，从而预防淀粉样蛋白原纤维的形成和沉积。淀粉样生成的肽从脑部离开的增加可导致淀粉样生成的肽在脑中浓度的降低，因此有助于减少淀粉样生成肽的沉积。具体地讲，药物可降低淀粉样β肽的水平，例如在CSF和血浆中的Aβ40和Aβ42的水平，或者该药物可降低淀粉样β肽的水平，例如在CSF中的Aβ40和Aβ42的水平，并能增加其在血浆中的水平。或者，穿透脑部的化合物可通过直接作用于脑部淀粉样生成的肽而控制沉积，例如通过保持其处于非原纤维的形式或促使它从脑中的清除、通过增加它在脑中的降解，或保护脑细胞免受淀粉样生成的肽的有害影响而进行。药物也可导致淀粉样蛋白浓度的降低(即在特定的器官内，从而达不到激发淀粉样蛋白原纤维形成或沉积所需要的临界浓度)。此外，本文所述的化合物可抑制或降低淀粉样蛋白和细胞表面组分(例如，基膜的糖胺聚糖或蛋白多糖的成分)之间的相互作用，由此抑制或降低该相互作用可产生可观察到的神经保护性和细胞保护性的效果。例如，所述化合物还可阻止淀粉样肽与细胞表面的结合或粘附，已知该结合或粘附过程可导致细胞损伤或毒性。类似地，所述化合物可阻止淀粉样蛋白-诱发的细胞毒性或小神经胶质的活化作用或淀粉样蛋白-诱发的神经毒性，或者抑制淀粉样蛋白诱发的炎症。所述化合物还可降低淀粉样蛋白聚集、原纤维形成或沉积的速率或量，或者所述化合物降低淀粉样蛋白沉积的程度。前述作用机理不应构成对本发明范围的限定，原因是无须这些信息亦可进行本发明。
术语“淀粉样蛋白-β疾病”(“淀粉样蛋白-β相关疾病”，在此使用的两术语是同义的)可用于轻度的认知损伤；血管性痴呆；早期阿尔茨海默氏病；阿尔茨海默氏病，包括散发性(非遗传性)阿尔茨海默氏病和家族性(遗传性)阿尔茨海默氏病；与老年有关的认知下降；脑部淀粉样蛋白血管病(“CAA”)；遗传性脑出血；老年性痴呆症；唐氏综合征状；包涵体肌炎(“IBM”)；与老年有关的黄斑变性(“ARMD”)。根据本发明的某些方面，淀粉样蛋白-β是一种具有39-43个氨基酸的肽，或者淀粉样蛋白-β是一种由βAPP产生的淀粉样蛋白产生的肽。
轻度的认知性损伤(“MCI”)是一种以病态轻微但在思考技巧中出现可测定的损坏为特征的症状，其与痴呆的存在没有必要的关联。MCI通常(但不一定)在阿尔茨海默氏病之前出现。这是一种最常与轻度的记忆问题有关的诊断，但它的特征还在于其它思考技巧(例如语言或计划能力)中的轻度的损伤。然而，患有MCI的个人通常失忆比对他们这样的年龄或教育背景的人所预期的更显著。随着病症的发展，医生可将诊断改为本领域熟知的“轻度-至-中度脑损伤”。
脑部淀粉样蛋白血管病(“CAA”)指在leptomingeal和大脑皮层动脉、细动脉的壁中以及毛细血管和静脉中淀粉样原纤维的特定沉积。它通常与阿尔茨海默氏病、唐氏综合病症和正常老化有关，也与各种涉及中风或痴呆的家族病有关(参见Frangione等，Amyloid：J.Protein Folding Disord.8，Suppl.1，36-42(2001))。CAA可散发性或遗传性地发生。在Aβ或APP基因中多重突变部位已被确定，它们临床上与痴呆或脑出血有关。CAA疾病的实例包括，但不限于伴有冰岛型淀粉样变性的遗传性脑出血(HCHWA-I)；HCHWA的Dutch变型(HCHWA-D；一种Aβ中的突变)；Aβ的佛兰德突变；Aβ的北极区突变；Aβ的意大利突变；Aβ的爱荷华州突变；家族性英国痴呆；和家族性丹麦痴呆。现已知脑淀粉样蛋白血管病与脑出血(或出血性中风)有关。
本发明还涉及预防或抑制患者淀粉样蛋白沉积的方法。例如，该方法包括给予患者治疗有效量的能够降低淀粉样蛋白(例如AL淀粉样蛋白(λ或κ-链相关的，如淀粉样蛋白λ、淀粉样蛋白κ、淀粉样蛋白κ IV、淀粉样蛋白λVI、淀粉样蛋白γ、淀粉样蛋白γ1)、Aβ、IAPP、β2M、AA、AH淀粉样蛋白或其它淀粉样蛋白)浓度的化合物，由此预防或抑制淀粉样蛋白聚集或沉积。
在另一方面，本发明涉及预防、降低或抑制患者淀粉样蛋白沉积的方法。例如，该方法包括给予患者治疗有效量的能够抑制淀粉样蛋白(例如AL淀粉样蛋白(λ或κ-链相关的，如淀粉样蛋白λ、淀粉样蛋白κ、淀粉样蛋白κIV、淀粉样蛋白λVI、淀粉样蛋白γ、淀粉样蛋白γ1)、Aβ、IAPP、β2M、AA、AH淀粉样蛋白或其它淀粉样蛋白)的化合物，由此预防、降低或抑制淀粉样蛋白沉积。
本发明还涉及调节(如最小化)与淀粉样蛋白-相关的对细胞损伤的方法，该方法包括给予能够降低淀粉样蛋白(例如AL淀粉样蛋白(λ或κ-链相关的，如淀粉样蛋白λ、淀粉样蛋白κ、淀粉样蛋白κIV、淀粉样蛋白λVI、淀粉样蛋白γ、淀粉样蛋白γ1)、Aβ、IAPP、β2M、AA、AH淀粉样蛋白或其它淀粉样蛋白)的浓度的化合物的步骤，由此调节与淀粉样蛋白-相关的对细胞损伤。在本发明的某些方面，调节与淀粉样蛋白-相关的对细胞损伤的方法包括给予能够降低淀粉样蛋白浓度或降低淀粉样蛋白和细胞表面的相互作用的化合物的步骤。
本发明还包括一种直接或间接预防患者细胞死亡的方法，该方法包括给予患者治疗有效量的化合物的步骤，该化合物能够预防直接或间接地导致细胞死亡的淀粉样蛋白(例如AL淀粉样蛋白(λ或κ-链相关的，如淀粉样蛋白λ、淀粉样蛋白κ、淀粉样蛋白κIV、淀粉样蛋白λVI、淀粉样蛋白γ、淀粉样蛋白γ1)、Aβ、IAPP、β2M、AA、AH淀粉样蛋白或其它淀粉样蛋白)介导的事件。
在一实施方案中，该方法用于治疗阿尔茨海默氏病(例如，散发性或家族性AD)。该方法还可用于预防性地或治疗性地治疗其它临床出现的淀粉样蛋白-β沉积，如唐氏综合征状患者和患有脑淀粉样蛋白血管病(“CAA”)或遗传性脑出血的患者
本发明也包括治疗惊厥病，包括癫痫的方法
在一个实施方案中，本发明提供抑制患者的癫痫发生的方法。该方法包括给予有需要的患者治疗有效量的药物的步骤，所述药物调节与癫痫发生相关的途径中的过程，以便抑制患者的癫痫发生。
如上所述，神经元之间的兴奋性偶合的上调节(由N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体介导)，和神经元之间的抑制性偶合的下调节(由γ-氨基-丁酸(GABA)受体介导)，两者均与癫痫发生有关。与癫痫发生有关的途径中的其它过程包括涉及癫痫发生的一氧化氮(NO)、神经递质的释放；当过量释放可介导神经元破坏的钙(Ca2+)的释放；由于过量锌(Zn2+)造成的神经毒性；由于过量铁(Fe2+)造成的神经毒性；以及由于氧化细胞破坏造成的神经毒性。因此，在某些实施方案中，给予患者抑制癫痫发生的药物能够抑制至少一种与癫痫发生有关的路径中的一或多个过程。例如，用于抑制癫痫发生的药物可降低脑组织中NO的释放或者削弱脑组织中NO的癫痫发生作用；对抗NMDA受体；增加内源性GABA抑制作用；阻断电压门控离子通道；降低阳离子(包括Ca2+、Zn2+或Fe2+)的释放、游离浓度(如通过鳌合)，或其它降低癫痫发生作用；抑制氧化细胞损害等。在某些实施方案中，给予患者抑制癫痫发生的药物能够抑制能够抑制至少一种与癫痫发生有关的路径中的至少两个过程。
在又一个实施方案中，本发明提供抑制惊厥病的方法。所述方法包括给予有需要的患者有效量的β-氨基阴离子化合物的步骤，以便抑制惊厥病；前提是β-氨基阴离子化合物不是β-丙氨酸或牛磺酸。
在另一实施方案中，本发明提供同时抑制患者惊厥症和癫痫发生的方法。所述方法包括给予需要的患者有效量的药物的步骤，所述药物(a)阻断钠或钙离子通道，或者打开钾或氯离子通道；及(b)具有至少一种选自下列的活性：NMDA受体拮抗作用；增加内源性GABA抑制作用；结合钙；结合铁；结合锌；NO合酶抑制作用；以及抗氧化活性；由此抑制患者的癫痫发生。
本发明化合物可用于预防性地或治疗性地治疗淀粉样-β肽在非神经学部位上的异常沉积的疾病，如通过将所述化合物转运到肌肉原纤维中治疗IBM，或通过将本发明化合物转运到视网膜色素化的上皮的基础表面上治疗黄斑变性。
本发明还提供一种调节与淀粉样蛋白有关的对细胞的损伤的方法，该方法包括给予能降低Aβ浓度或能将Aβ(可溶性低聚物的或原纤维状的)与细胞表面的相互作用降低至最小的化合物，由此调节与淀粉样蛋白有关的对细胞的损伤。在本发明的某些方面，调节对细胞的与淀粉样有关的损伤的方法包括给予能降低Aβ浓度或减少Aβ和细胞表面的相互作用的化合物的步骤。
本发明进一步提供预防患者中细胞死亡的方法，该方法包括给予患者治疗有效量的化合物的步骤，该化合物能够预防直接或间接地导致细胞死亡的Aβ-介导的事件。
本发明还提供一种调节与淀粉样蛋白有关的对细胞的损伤的方法，该方法包括给予能降低IAPP浓度或能将IAPP(可溶性低聚物的或原纤维状的)与细胞表面的相互作用降低至最小的化合物，由此调节与淀粉样蛋白有关的对细胞的损伤。在本发明的某些方面，调节与淀粉样蛋白有关的对细胞的损伤的方法包括给予能降低IAPP浓度或减少IAPP和细胞表面的相互作用的化合物的步骤。
本发明进一步提供预防患者中细胞死亡的方法，该方法包括给予患者治疗有效量的化合物的步骤，该化合物能够预防直接或间接地导致细胞死亡的IAPP-介导的事件。
本发明还提供用于治疗淀粉样变性的方法和组合物。本发明的方法包括给予患者抑制淀粉样蛋白沉积的治疗性化合物。因此，本发明的组合物和方法用于抑制其中出现淀粉样蛋白沉积的疾病中的淀粉样变性。本发明的方法可治疗性地治疗淀粉样变性或预防性地用于易患(遗传性)淀粉样变性或证实正面临出现淀粉样变性的危险的患者，例如遗传性淀粉样变性或证实正面临出现淀粉样变性的危险。在某些实施方案中，本发明包括抑制淀粉样生成的蛋白质和基膜的成分之间的相互作用，从而抑制淀粉样蛋白沉积的方法。基膜的成分是醣蛋白或蛋白多糖，更优为硫酸乙酰肝素蛋白多糖。本方法中所用的治疗性化合物可干扰基膜成分结合到淀粉样生成蛋白质上的目标结合位点上，从而抑制淀粉样蛋白沉积。
在某些方面，本发明的方法包括给予患者抑制淀粉样蛋白沉积的治疗性化合物。“抑制淀粉样蛋白沉积”包括预防淀粉样蛋白形成、抑制正患有淀粉样变性的患者的进一步淀粉样蛋白沉积，以及减少正患有淀粉样变性的患者的淀粉样蛋白沉积。相对于未经治疗的患者或相对于治疗前已治疗的患者，测定淀粉样蛋白沉积的抑制。在一实施方案中，通过抑制淀粉样生成的蛋白质和基膜成分之间的相互作用，抑制淀粉样蛋白沉积。“基膜”指包含醣蛋白和蛋白多糖的细胞外基质，包括层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、原纤维结合素、基底膜蛋白聚糖、agrin、硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)。在一实施方案中，通过干扰淀粉样生成的蛋白质和硫酸糖胺聚糖(诸如HSPG、硫酸皮肤素、基底膜蛋白聚糖或agrin硫酸酯)之间的相互作用，抑制淀粉样蛋白沉积。已知硫酸糖胺聚糖存在于所有类型的淀粉样蛋白中(参见Snow等，Lab.Invest.56，120-23(1987))，并且淀粉样蛋白沉积和HSPG沉积同时出现在淀粉样变性的动物模型中(参见Snow等，Lab.Invest.56，665-75(1987)和Gervais，F等，Curr.Med.Chem.，3，361-370(2003))。已报道淀粉样生成蛋白质中与HSPG结合位点基序的一致图形(参见Cardin andWeintraub Arteriosclerosis 9，21-32(1989))。
化合物预防或阻断淀粉样蛋白形成或沉积的能力在于其结合非-原纤维状的、可溶性淀粉样蛋白并能保持其可溶性的能力。
本发明的治疗性化合物抑制淀粉样生成的蛋白质和基膜的醣蛋白或蛋白多糖成分之间的相互作用的能力可以通过体外结合测试评估，例如在US 5,164,295中描述的方法，其内容通过引用结合到本发明中。或者，化合物结合淀粉样生成的蛋白质的能力或抑制基膜成分(例如HSPG)和淀粉样生成的蛋白质(例如Aβ)结合的能力可以通过质谱分析测定，其中将可溶性蛋白质(例如Aβ、IAPP、β2M)与所述化合物一起孵育。与如Aβ结合的化合物可引发蛋白质的质谱的变化。使用Aβ和IAPP进行质谱测定的示例性方案可在实施例中发现，其结果提供于表5。很容易改变该实验方案以调节数据的灵敏度，例如：通过调节蛋白质和/或所使用的化合物的量。因此，可检测使用低灵敏度的实验方案检测不出结合力的化合物的结合。
还存在筛选化合物的其它方法，技术熟练的专业人员能很容易地应用它们以提供试验化合物结合如原纤维Aβ的能力的指标。一种这类筛选测试法是紫外吸收测试法。在一个示例性的方案中，在37℃下，在Tris缓冲盐水(20mM Tris、150mM NaCl，pH7.4，含0.01％叠氮化钠)中，将试验化合物(20μM)与50μM Aβ(1-40)原纤维培养1小时。培养后，在21,000g下，将该溶液离心20分钟，使Aβ(1-40)原纤维与任何结合的试验化合物一起沉淀。然后通过读取吸收值，测定上清液中保留的试验化合物的量。然后通过比较保留在含有Aβ的培养基上清液中的量与保留在不含Aβ原纤维的对照培养基中的量，计算结合试验化合物的部分。硫磺素T和刚果红都是已知的能结合Aβ原纤维的物质，在各分析试验中用作阳性对照。分析前，将试验化合物稀释至40μM，该浓度是终试验浓度的两倍，然后采用Hewlett Packard 8453 UV/VIS分光光度计扫描，如果吸收度能够测定，测定吸收度。
在另一实施方案中，本发明涉及改善患有淀粉样蛋白-相关疾病的患者的认知功能的方法。该方法包括给予有效量的本发明的治疗化合物，以改善患者的认知功能。患者的认知功能可通过本领域已知的方法测试，例如：临床痴呆评估(“CDR”)、轻微-精神状态检查(“MMSE”)阿尔茨海默氏病评价的认知-等级(“ADAS-Cog”)。
在另一实施方案中，本发明涉及治疗患者淀粉样蛋白-相关疾病的方法。该方法包括在给予本发明化合物之前对患者进行一个认知能力的测试，给予患者治疗有效量的本发明化合物，然后在给予所述化合物后对患者进行一个认知能力的测试，这样治疗该患者的淀粉样蛋白-相关疾病，其中该患者在所述认知能力的测试中的得分得到改善。
如果在正态范围内，使用本发明方法治疗的患者的结果与安慰剂组、先前的对照组的成员之间相比，或在给予相同的患者的随后的测试之间相比，存在统计学上显著的差异，则本发明的内容之中，存在着认知能力的“改善”。
在一实施方案中，患者的CDR保持在0。在另一实施方案中，患者的CDR降低(如改善了)约0.25或以上、约0.5或以上、约1.0或以上、约1.5或以上、约2.0或以上、约2.5或以上或约3.0或以上。在另一实施方案中，患者的CDR等级的增长率降低先前的或未治疗的对照组的增长的约5％或以上、约10％或以上、约20％或以上、约25％或以上、约30％或以上、约40％或以上、约50％或以上、约60％或以上、约70％或以上、约80％或以上、约90％或以上，或约100％或以上。
在一实施方案中，保持患者的MMSE得分。另外，可增加患者的MMSE得分约1分、约2分、约3分、约4分、约5分、约7.5分、约10分、约12.5分、约15分、约17.5分、约20分或约25分。另外，与先前的对照组相比，患者MMSE得分的降低率降低。例如：患者的MMSE得分的降低率可降低相对于先前的或未治疗的对照组的降低的约5％或以上、约10％或以上、约20％或以上、约25％或以上、约30％或以上、约40％或以上、约50％或以上、约60％或以上、约70％或以上、约80％或以上、约90％或以上或约100％或以上。
在一个实施方案中，本发明涉及通过给予患者有效量的治疗性的本发明化合物，治疗、减慢或终止与认知损伤有关的淀粉样蛋白-相关疾病的方法，其中通过ADAS-Cog测定的患者认知能力的年度退化每年少于8分、每年少于6分、每年少于5分、每年少于4分或每年少于3分。在一个进一步的实施方案中，本发明涉及通过给予有效量的治疗性的本发明化合物使得通过ADAS-Cog测定的患者认知能力一年内保持恒定，从而治疗、减慢或终止与认知损伤有关的淀粉样蛋白-相关疾病的方法。“恒定”包括不超过2分的波动。保持恒定包括在某一方向是在两点或两点以内的波动。在一个进一步的实施方案中，通过ADAS-Cog测定，患者的认知能力改善每年2点或以上、每年3点或以上、每年4点或以上、每年5点或以上、每年6点或以上、每年7点或以上、每年8点或以上等。另外，与先前的对照组相比，患者的ADAS-Cog得分的增长率降低。例如：患者的ADAS-Cog得分的增长率可降低先前的或未治疗的对照组的增加的约5％或以上、约10％或以上、约20％或以上、约25％或以上、约30％或以上、约40％或以上、约50％或以上、约60％或以上、约70％或以上、约80％或以上、约90％或以上或约100％。
在另一实施方案中，患者CSF或血浆中Aβ42∶Aβ40的比率降低约15％或以上、约20％或以上、约25％或以上、约30％或以上、约35％或以上、约40％或以上、约45％或以上或约50％或以上。在另一实施方案中，患者脑脊髓流质中的Aβ水平降低约15％或以上、约25％或以上、约35％或以上、约45％或以上、约55％或以上、约75％或以上，或约90％或以上。
应当理解无论在本文的何处提供数值和范围，如在患者群体的年龄、剂量和血浓度中提供，这些数值和范围包括的所有数值和范围都打算包括在本发明的范围之内。而且，在这些数值和范围中的所有数值还可以是范围的上限或下限。
而且，本发明涉及任何本文描述的新的化学化合物。也就是说，本发明涉及如本文描述的新化合物和使用它们的新方法，这些都在本文公开的结构式范围之内，并且它们在引用的专利和专利申请中没有公开。
本发明化合物在成像法中的用途
还发现本发明化合物的结合特性与氟部分的成像特性结合，得到的化合物不仅用于治疗疾病(即，淀粉样蛋白-相关疾病和CNS疾病)，还可以用作NMR可检测的试剂，以用于大量诊断和治疗用途(如检测淀粉样蛋白、诊断疾病和/或诊断疾病状态)。
因此，本发明提供可检测的试剂(如造影剂、成像探针或诊断试剂)，它与患者或样品或组织或细胞中感兴趣的部分(如Aβ、IAPP和β2M)结合或者联合，从而检测到化合物和相关部分。使用此类化合物可提供诸如相关部位(如淀粉样蛋白)的存在、定位和密度或量的信息。此类信息可诊断疾病或疾病状态或对此类疾病或疾病状态的易感因素。因此，本发明提供用本发明化合物检测、诊断和监测疾病或对疾病或疾病状态的易感因素的方法。这些方法可用于本文描述的任何患者群体，检测本文描述的任何淀粉样蛋白和/或治疗本文描述的任何淀粉样蛋白相关疾病。这些方法可包括使用本文描述的任何含氟部分的化合物。
本发明的含氟部分的化合物可用作造影剂、成像探针和/或诊断试剂。例如，本发明的含氟部分的化合物可根据本发明的方法用于检测或定位淀粉样蛋白和/或淀粉样蛋白沉积物。本发明的含氟部分的化合物可用于增强成像，如淀粉样蛋白原纤维形成和/或淀粉样蛋白周围环境的成像。
术语“成像探针”指可与成像技术联合使用的探针。示例性探针可包括含19F同位素(和/或另一种同位素，其具有可被成像技术检测的特征)的本发明化合物，它可与成像技术如磁共振成像(MRI)、磁共振波谱(MRS)。成像探针可用于成像或探查生物学结构或其它结构。
术语“诊断试剂”指可用于诊断或帮助诊断疾病或病症(如淀粉样蛋白-相关疾病或病症)的试剂。例如，诊断试剂可用于提供关于疾病或病症的阶段、进展或退化的信息，和/或用于鉴定疾病或病症相关部分的具体定位或局部化(如淀粉样蛋白的定位或局部化)。
术语“造影剂”指可增强细胞、器官及其它结构成像的试剂。在萤光镜透视检查时，用造影剂增强其它射线可透过的组织的成像。一般而言，荧光透视造影剂通过X线吸收工作。用于NMR或MRI成像增强时，造影剂通常缩短T1或T2质子驰豫时间，在适当加权像中使密度增强。
本发明的氟代化合物在一个或多个取代基上可包括一个、多个或甚至最大量化学当量的氟，所述取代基只在一个或仅几个频率上共振，如来自三氟甲基功能。氟代化合物的光谱方面通常是已知的并描述于文献中。参见如Sotak，C.H.等，MAGN.RESON.MED.29：188-195(1993)。
在一个实施方案中，本发明的含氟部分的化合物是水溶性的。这可增强本发明化合物在多种生物医学设备中的功能性，如它可避免需要乳化剂。
在本发明的一个实施方案中，将有效量的制剂或组合物给予患者或患者的部分以便成像，所述制剂或组合物包含在药学上可接受的载体中的本发明的氟代化合物。术语“有效提供可检测的NMR信号的量”指足够检测或增强或改变NMR图象的化合物的非毒性量。可给予的化合物量使化合物或相关结构(如淀粉样蛋白或淀粉样蛋白蚀斑)能够被检测和/或使这些化合物或结构以及周围器官和组织的检测和显影能够被增强。在一个实施方案中，患者是哺乳动物，如人或人以外的哺乳动物。在另一个实施方案中，将有效量的化合物给予或引入组织，或者一个或多个细胞，或者一种样品，如包括诸如淀粉样蛋白的相关部分的样品。
以上方法可包括给予附加药物或疗法，包括不是本发明化合物的抑制淀粉样蛋白沉积的药物。给药可与本发明氟代化合物的给药错开或同时进行。因此，该方法可用于，如通过在给予附加化合物之后使患者成像，评估此类附加化合物的有效性。
本发明化合物可通过本文描述的任何适当途径给药，包括例如，胃肠外(包括皮下、肌内、静脉内、真皮内和肺)，使内部器官、组织、肿瘤等成像。应理解选择的途径取决于成像的器官或组织。
在一个实施方案中，单独给予所述化合物。在另一个实施方案中，它作为药用制剂给药，该制剂包含至少一种本发明化合物和一种或多种本文描述的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。制剂可任选包括递药系统如乳剂、脂质体和微粒。药用制剂可任选包括其它诊断或治疗剂，包括其它造影剂、探针和/或诊断试剂。本发明化合物还可采用兽医制剂的形式使用，例如可通过本领域的常规方法制备兽医制剂。
本发明的氟代化合物的剂量可取决于本发明化合物的自旋密度、流量(弥散和灌注)、敏感度和驰豫度(T1和T2)。本发明化合物的剂量可常规计算为每患者公斤体重毫克19F(缩写为mg19F/kg)。例如，在胃肠外给药时，常用剂量可从约50至约1000mg19F/kg，更优选从约100至约500mg19F/kg。其它氟代化合物在给药方案中可考虑使用该剂量。
对于连续给药(如静脉内)的方法，合适的给药速率已为本领域所知。常用给药速率是约每秒0.5-5mL制剂，更优选约1-3mL/s。成像可在开始给药之前或之后开始，在给药时继续，可在给药后继续。
应理解剂量、剂量体积、制剂浓度、给药速率和成像方案将随具体患者和所做检查而个体化，可由有经验的执业医师决定。选择此类参数的指南已为本领域所知。The Contrast Media Manual，(1992，R.W.Katzberg，Williams and Wilkins，Baltimore，Md.)。
应该理解，本发明也涉及在磁共振波谱学(MRS)中使用本发明化合物和方法。MRS可用于鉴定在紧靠着本发明化合物附近的结构和/或化合物。通过分析周围原子的共振频率(因为对每种化合物的电子屏蔽是唯一的，所以在不同化合物中存在轻微差异)，可用MRS鉴别不同化合物。
因此，在本发明的另一方面，使用MRS(包括或不包括其它成像技术)。
本发明化合物的合成
本发明化合物通常可通过诸如以下所述的通用反应流程中说明的方法或者通过其修饰的方法，采用易获得的原料、试剂和常规合成步骤制备。在这些反应中，也可能利用本身已知的变式，但在此并未提及。也包括在此所述的化合物的功能和结构上的等价物，其中制备了取代基的一或多个简单的变式，它们具有所述药物相同的通用性质，对所述化合物的基本性质或用途不产生不良影响。
可根据如在所提供的具体方法中说明的本文所述的合成流程和方案，很容易地制备本发明化合物。然而，本领域技术人员将清楚可使用形成本发明化合物的其它合成途径，以下所提供的仅为实例，并不限定本发明。参见，例如R.Larock编辑“Comprehensive OrganicTransformations”，VCH Publishers(1989)。还应清楚可使用本领域中标准的各种保护和脱保护策略(参见例如Greene和Wuts，“ProtectiveGroups in Organic Synthesis”)。相关领域技术人员将清楚任何具体的保护基团(如：氨和羧基保护基)的选择将根据随后反应的条件依据被保护基团的稳定性而定，并能清楚做出适当的选择。
本领域技术人员有关这些方面的知识通过下列大量的化学文献的样本进一步说明：J.P.Greenstein和M.Winitz的“Chemistry of theAmnino Acids”，John Wiley & Sons，Inc.New York(1961)；R.Larock的“Comprehensive Organic Transformations”，VCH Publishers(1989)；T.D.Ocain等，J.Med.Chem.31，2193-99(1988)；E.M.Gordon等，J.Med.Chem.31，2199-10(1988)；M.Bodansky和A.Bodanszky的“Practice of Peptide Synthesis”，Springer-Verlag，New York(1984)；T.Greene和P.Wuts的“Protective Groups in Organic Synthesis”(1991)；G.M.Coppola和H.F.Schuster的“Asymmetric Synthesis：Construction of Chiral Molecules Using Amino Acids”，John Wiley &Sons，Inc.New York(1987)；J.Johns的“The Chemical Synthesis ofPeptides”Oxford University Press，New York(1991)；以及P.D.Bailey的“Introduction of Peptide Chemistry”John Wiley & Sons，Inc.，NewYork(1992)。
本发明化合物的合成可在溶剂中进行。适合的溶剂为在室温条件及常压下的液体，或者在反应所用的温度和压力条件下保持液体状态。可使用的溶剂并不特别严格，前提是它们不干扰反应本身(即，它们优选为惰性溶剂)并且它们可溶解适量的反应物即可。根据环境要求，可将溶剂蒸馏或脱气。溶剂可以是例如脂肪烃(如，己烷、庚烷、轻石油醚、石油醚、环己烷或甲基环己烷)和卤代烃(如，二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、氯苯或二氯苯)；芳烃(如，苯、甲苯、四氢化萘、乙基苯或二甲苯)；醚(如，二甘醇二甲醚、甲基叔丁基醚、甲基叔戊基醚、乙基叔丁基醚、乙醚、二异丙基醚、四氢呋喃或甲基四氢呋喃、二氧六环、二甲氧基乙烷或二亚乙基乙二醇二甲醚)；腈(如，乙腈)；酮(如，丙酮)；酯(如，乙酸甲酯或乙酸乙酯)；及其混合物。
反应完成后，一般根据标准技术，将产物从反应混合物中分离出来。例如，如果产物为固体，任选在减压下，通过蒸发或过滤除去溶剂。反应完成后，可将水加入到残留物中，使水层呈酸性或碱性，过滤沉淀的化合物，当处理水敏感化合物时，应小心进行。类似地，可将水加入到反应混合物中，用疏水性溶剂提取目标化合物。可将有机层用水洗涤，经无水硫酸镁或硫酸钠干燥，蒸发溶剂，得到目标化合物。如果必要，可将得到的目标化合物经例如重结晶、再沉淀、层析或者通过加入酸或碱将其转化为盐而进行纯化。
本发明化合物可以以用适合溶剂制成的溶液形式或无溶剂(例如，冷冻干燥)的形式提供。在本发明另一方面，可将进行本发明方法必需的化合物和缓冲剂包装成药剂盒，任选包括容器。根据本发明的方法，该药剂盒可在商业上用于治疗或预防淀粉样蛋白相关疾病和/或CNS疾病，所述药剂盒可包括用于本发明方法的使用说明书。其它药剂盒组分可包括酸、碱、缓冲剂、无机盐、溶剂、抗氧剂、防腐剂或金属螯合剂。其它药剂盒组分为纯组合物形式或者为加入一或多种其它药剂盒组分的水性溶液或有机溶液的形式。任何或所有药剂盒组分也任选包含缓冲剂。
术语“容器”包括盛装所述治疗性化合物的任何容器。例如，在一实施方案中，所述容器为包含所述化合物的包装。在其它实施方案中，所述容器不是包含所述化合物的包装，即所述容器是诸如包含已包装的化合物或未包装的化合物以及所述化合物的使用说明书的盒子或小瓶。而且，包装技术在本领域是熟知的。应清楚的是可将所述治疗药物的使用说明书包装在包含所述治疗化合物的包装内，这样该说明书形成一种对该包装产品增加的功能性关系。
药物制剂
在另一实施方案中，本发明涉及一种包含用于治疗淀粉样蛋白相关疾病和/或CNS紊乱的本发明所述任何化学式的药物的药用组合物，以及制备这样的药用组合物的方法。
本发明的药物一般可通过通用的反应流程(如本发明参考的专利和专利申请中的流程)说明的方法或者通过其修改的方法，采用易获得的原料、试剂和常规的合成步骤制备。在这些反应中，也可能利用本身已知的各种不同的变量，但在此不再提及。本发明也包括在此所述的药物的官能和结构的等价物，其中制备了取代基的一或多个简单的变式，它们具有所述药物相同的通用性质，对所述药物的基本性质或用途不产生不良影响。
可将本发明的药物以用适当溶剂制成的溶液形式或者以无溶剂形式(例如，冷冻干燥)提供。在本发明的另一方面，可将进行本发明方法所必需的药物和缓冲剂包装成药剂盒。可根据本发明所述的方法商品化使用所述药剂盒，所述药剂盒可包括用于本发明方法的使用说明书。其它的药剂盒组分可包括酸、碱、缓冲剂、无机盐、溶剂、抗氧化剂、防腐剂或金属螯合剂。所述其它的药剂盒组分可以是纯组合物，或者可以是加入一或多种其它药剂盒组分的水溶液或有机溶液。任何或所有药剂盒组分还任选包含缓冲剂。
所述治疗性药物也可经胃肠外、腹膜内、脊髓内或脑内给药。可在甘油、液态聚乙二醇及其混合物中以及在油中制备分散液。在普通的储存和使用条件下，这些制剂可含有为防止微生物生长的防腐剂。
为不经胃肠外途径给予所述治疗药物，可能必须将所述药物用预防其失活材料包衣或者与该药物共同给予。例如，可给予患者在适当的载体(例如，脂质体或稀释剂)中的所述治疗药物。药学上可接受的稀释剂包括盐水和水溶性缓冲溶液。脂质体包括水包油包水(water-in-oil-in-water)CGF乳剂以及常规的脂质体(Strejan等，J.Neuroimmunol.7，27(1984))。
适用于注射使用的药用组合物包括无菌水溶液(可溶于水)或者用于临时配制的无菌注射溶液或分散液的分散剂和无菌粉末。在所有情况下，所述组合物必须无菌，并且必须是存在易于注射能力的程度的流体。在制备和储存条件下必须稳定，必须能够防护微生物(如细菌和真菌)的污染作用。
适合的药学上可接受的溶媒包括但不限于任何不产生免疫性的适用于口服、胃肠外、鼻腔、粘膜、经皮、静脉内(IV)、动脉内(IA)、肌内(IM)和皮下(SC)给药途径的药用辅助剂，如磷酸盐缓冲液(PBS)。
所述溶媒可以是包含诸如水、乙醇、聚醇(例如甘油、乙二醇和液体聚乙二醇等)、其适合的混合物以及植物油的溶剂或分散介质。可例如通过使用包衣料(如卵磷脂)、通过在分散情况下保持所要求的粒子体积以及通过使用表面活性剂，保持适当的流动性。预防微生物作用可通过各种抗细菌和抗真菌剂实现，例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、乙基汞硫代水杨酸钠等。在许多情况下，在组合物中包括诸如糖、氯化钠或聚醇(如甘露糖醇和山梨醇)的等渗剂。通过在组合物中包含延长吸收的物质(单如硬脂酸铝或明胶)能延长注射用组合物的吸收。
无菌注射溶液可通过将在适当溶剂中的所要求量的所述治疗药物与按要求的以上所列的一种或多种成分组分混合，然后无菌过滤制备。通常分散液可通过将所述治疗药物加入到含有例如基本分散介质以及所要求的以上所列的其它成分的无菌媒介中制备。在制备用于制备无菌注射溶液的无菌粉末时，所述制备方法为真空干燥和冷冻干燥法，得到一种所述活性成分(即所述治疗药物)加上以上无菌过滤溶液中任何其它所要求的成分的粉末。
例如，所述治疗药物可与惰性稀释剂或可吸收的食用载体经口服给药。也可将所述治疗药物和其它成分封入硬或软壳明胶胶囊中、压制成片剂或者直接掺入患者的饮食中。为口服给药，可将所述治疗药物与赋形剂混合，以可消化片剂、颊内片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、水剂等形式使用。当然，所述组合物和制剂中该治疗药物的百分比可以变化。在这些治疗用组合物中所述治疗药物的量为能获得适宜剂量的量。
为易于给药和剂量均匀性，制备计量单位形式的胃肠外组合物特别有利。本发明中所用的计量单位形式指适合作为给予所治疗的患者单位剂量的物理性的分立单位。各单位含有计算能产生所要求治疗效果的预先测定量的治疗药物以及所需的药用媒介物。本发明单位剂量形式的具体要求通过并直接依赖于以下内容(a)所述治疗药物的独特特征以及达到的具体治疗效果，以及(b)在合成这类治疗患者淀粉样蛋白沉积的治疗药物的领域中的固有的限制。
因此，本发明包括供气雾、口服和胃肠外给药的药物制剂，所述制剂包含在药学上可接受的媒介物中的本发明所述的各化学式的药物(包括其药学上可接受的盐)。本发明还包括被冷冻干燥并可配制成药学上可接受的给药剂型(如通过静脉内、肌内或皮下给药)的这类药物或其盐类。还可透皮或经皮给药。
根据本发明，本发明所述的化学式的药物及其药学上可接受的盐可以以固体形式经口服或吸入给药，或者以溶液剂、悬浮液或乳剂形式经肌内或静脉内给药。或者，所述药物或其盐还可以以脂质体混悬液形式经吸入、静脉内或肌内给药。
还可提供适于通过吸入给药的气雾剂形式的药用制剂。这些制剂包含本发明任何化学式的所要求药物或其盐或所述药物或其盐的多数固体颗粒的溶液剂或混悬剂。可将所要求的剂型置于小盒子中并使成雾状。通过压缩空气或通过超声能形成包含所述药物或盐的液滴或固体颗粒完成喷雾给药。所述液滴或固体颗粒应具有的颗粒体积的范围为大约0.5-5微米。固体颗粒可通过按本领域任何适当的方法(例如，通过微粉化)处理本发明所述的任何化学式的固体药物或其盐而获得。所述固体颗粒或液滴的体积为例如大约1-2微米。在这个方面，可获得达到此目的的商品化气雾剂。
适用于气雾剂给药的药用制剂可以为液体形式，所述制剂包含在包含水的载体中的本发明所述的任何化学式的水溶性药物或其盐。可以加入表面活性剂，所述表面活性剂能将所述制剂的表面张力降低至足以形成当进行气雾剂给药时所要求的体积范围的液滴。
经口给药的组合物还包括液体溶液剂、乳剂、混悬剂等。适用于制备这些组合物的药学上可接受的媒介物是本领域熟知的。用于糖浆剂、酏剂、乳剂和混悬剂的载体的一般成分包括乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、液体糖、山梨醇和水。对于混悬剂，一般的悬浮剂包括甲基原纤维素、羧甲基原纤维素钠、黄耆胶和藻酸钠；一般的湿润剂包括卵磷脂和聚山梨醇酯80；一般的防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯和苯甲酸钠。经口给药的液体组合物还可包括一或多种诸如以上公开的甜味剂、矫味剂和着色剂的组分。
还可通过常规方法，将药用组合物包衣，一般用pH或时间依赖性包衣材料，这样所述目标药物可在所要求的局部应用附近的胃肠道中或者在延长所要求的作用的不同时间处释放。这类剂型一般包括，但不限于一或多种乙酸原纤维素邻苯二甲酸酯、乙酸聚乙烯邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基原纤维素邻苯二甲酸酯、乙基原纤维素、蜡类及虫胶。
其它用于达到全身性传递所述目标药物的组合物包括舌下、颊内和鼻腔内剂量形式。这些组合物一般包含一或多种可溶性的填充物，如糖、山梨糖醇和甘露糖醇；以及粘合剂，如阿拉伯树胶、微晶原纤维素、羧甲基原纤维素和羟丙基甲基原纤维素。还可包括以上公开的助流剂、润滑剂、甜味剂、着色剂、抗氧剂和矫味剂。
还可将本发明组合物局部给予患者，例如通过将所述组合物直接放置于或喷洒在患者的表皮或表皮组织上，或者通过“贴剂”经皮给药。这类组合物包括例如洗剂、霜剂、溶液剂、凝胶剂和固体。这些局部组合物可包含有效量的，通常至少约0.1％，甚至约1％-5％的本发明药物。局部给药的适合的载体一般以一种连续薄膜的形式留在皮肤处，并能抵抗通过排汗或水的浸润的除去。载体通常为天然的有机物，其具有在其中分散或溶解所述治疗药物的能力。所述载体可包括药学上可接受的软化剂、乳化剂、增稠剂、溶剂等。
在一个实施方案中，以足以抑制患者淀粉样蛋白沉积的治疗有效剂量给予活性药物。相对于未治疗的患者，“治疗有效”剂量抑制例如至少约20％，或至少约40％，或者甚至至少约60％，或者至少约80％的淀粉样蛋白沉积。在阿尔茨海默氏病患者中，“治疗有效”剂量能稳定认知功能或预防认知功能的进一步退化(即预防、减慢或阻止疾病的发展)。因此本发明提供治疗性药物。“治疗性”或“药物”是指具有对活着的人或非人类的动物的特殊疾病或病症产生有益的缓解或预防作用的药物。
在AA或AL淀粉样变性中，所述药物可改善或稳定特殊器官的功能。例如，肾功能可稳定或改善10％或10％以上、20％或20％以上、30％或30％以上、40％或40％以上、50％或50％以上、60％或60％以上、70％或70％以上、80％或80％以上，或者超过90％。
在IAPP中，所述药物可保持或增加β-胰岛细胞功能，其可通过胰岛素浓度或该前-IAPP/IAPP比率测定。在另一实施方案中，该前-IAPP/IAPP比率可增加约10％或10％以上、约20％或20％以上、约30％或30％以上、约40％或40％以上，或者约50％。在另一实施方案中，所述比率增加最高达50％。此外，治疗有效量的所述药物可有效地改善血糖过多或胰岛素水平。
在另一实施方案中，通过稳定肾功能、降低蛋白尿、增加肌酸酐清除率(如至少50％或以上或者至少100％或以上)、减轻慢性腹泻或者通过增加体重(如10％或以上)，可给予有效治疗量的所述活性药物以治疗AA(继发性)淀粉样变性和/或AL(原发性)淀粉样变性。
另外，可给予足以降低患者淀粉样蛋白(如Aβ40或Aβ42)沉积的治疗有效量的活性药物。例如，与未治疗的患者相比，治疗有效剂量降低淀粉样蛋白沉积的至少约15％，或至少约40％，或者甚至至少60％，或者至少约80％。
在另一实施方案中，可给予足以增加患者血、CSF或血浆中的淀粉样蛋白(如Aβ40或Aβ42)的治疗有效量的活性药物。例如，与未治疗的患者相比，治疗有效剂量增加的浓度至少约15％，或至少约40％，或者甚至至少60％，或者至少约80％。
在另一实施方案中，给予足以保持患者CDR等级在基线等级或在0处的治疗有效量的活性药物。在另一实施方案中，给予足以降低患者CDR等级约0.25或以上、约0.5或以上、约1.0或以上、约1.5或以上、约2.0或以上、约2.5或以上或约3.0或以上的治疗有效量的活性药物。在另一实施方案中，给予与先前的或未治疗的对照组相比足以降低患者CDR等级的增加率的治疗有效量的活性药物。在另一实施方案中，所述治疗的有效剂量足以降低患者CDR等级的增加率(相对于未治疗的对照组)的约5％或以上、约10％或以上、约20％或以上、约25％或以上、约30％或以上、约40％或以上、约50％或以上、约60％或以上、约70％或以上、约80％或以上、约90％或以上或约100％或以上。
在另一实施方案中，给予足以在MMSE中保持患者得分的治疗有效量的活性药物。在另一实施方案中，给予足以增加患者的MMSE得分约1分、约2分、约3分、约4分、约5分、约7.5分、约10分、约12.5分、约15分、约17.5分、约20分或约25分的治疗有效量的活性药物。在另一实施方案中，给予与先前的对照组相比足以降低患者的MMSE得分的降低率的治疗有效量的活性药物。在另一实施方案中，所述治疗的有效剂量足以降低患者的MMSE得分的降低率可为先前的或未治疗对照组降低的约5％或以下、约10％或以下、约20％或以下、约25％或以下、约30％或以下、约40％或以下、约50％或以下、约60％或以下、约70％或以下、约80％或以下、约90％或以下或约100％或以下。
在另一实施方案中，给予足以在ADAS-Cog中保持患者得分的治疗有效量的活性药物。在另一实施方案中，给予足以降低患者ADAS-Cog得分约2分或以上、约3分或以上、约4分或以上、约5分或以上、约7.5分或以上、约10分或以上、约12.5分或以上、约15分或以上、约17.5分或以上、约20分或以上、约25分或以上的治疗有效量的活性药物。在另一实施方案中，给予与先前的或未治疗的对照组相比足以降低患者ADAS-Cog得分的增加率的治疗有效量的活性药物。在另一实施方案中，所述治疗的有效剂量足以降低患者ADAS-Cog得分的增加率(相对于未治疗的患者)的约5％或以上、约10％或以上、约20％或以上、约25％或以上、约30％或以上、约40％或以上、约50％或以上、约60％或以上、约70％或以上、约80％或以上、约90％或以上或约100％或以上。
在另一实施方案中，给予足以降低患者CSF或血浆中Aβ42:Aβ40的比率约15％或以上、约20％或以上、约25％或以上、约30％或以上、约35％或以上、约40％或以上、约45％或以上或约50％或以上的治疗有效量的活性药物。
在另一实施方案中，给予足以降低患者CSF或血浆中Aβ水平约15％或以上、约25％或以上、约35％或以上、约45％或以上、约55％或以上、约75％或以上或约95％或以上的治疗有效量的活性药物。
这些药物的毒性和治疗效果可通过标准药学方法，用细胞培养或实验动物测定，如测定LD50(半数致死量)和ED50(半数有效量)。毒性和治疗效果之间的剂量比率是治疗指数，可用LD50/ED50的比率表示，通常治疗指数越大，效果越强。虽然可以使用呈现毒副作用的药物，但应小心设计一条使这类药物靶向作用于受影响组织的传递系统，以使对未受影响的细胞的潜在损害最小，从而降低副作用。
应清楚适合的剂量依赖于普通临床医生、兽医或研究者知识领域内的很多因素。小分子的剂量将随例如患者的身份、体重和疾病或者所治疗的样本而定，还依赖于所述组合物的给药途径，如果有效，还依赖于医生要求的所述小分子在患者中产生的效果。示例性的剂量包括每kg患者或样本重量的所述小分子的毫克或微克量(例如每kg约1微克至500毫克、每kg约100微克至5毫克或约每kg约1微克至50微克)。应进一步清楚适合的剂量依赖于效力。这些适合的剂量可采用本发明所述的方法测定。当将一或多个这些化合物给予动物(如，人)时，医生、兽医或研究者可例如首先开具相对的低剂量，接着增加该剂量直至获得适合的反应。此外，应清楚任何具体动物患者的明确剂量水平将根据诸如以下的多种因素变化：所使用的具体药物的活性、患者的年龄、体重、健康状况、性别和饮食、给药次数、给药途径、排泄率和任何联用的药物。
所述药物抑制淀粉样蛋白沉积的能力可采用可在人疾病中预测抑制淀粉样蛋白沉积的效能的动物模型系统，例如表达人APP的转基因小鼠或者其它相关的其中可见Aβ沉积的动物模型或者例如淀粉样变性的动物模型评估。同样地，药物在模型系统中抑制或降低认知性损伤的能力可以是在病人中效果的一个指标。或者，药物的效力可通过检测药物体外抑制淀粉样原纤维形成的能力评估，例如采用诸如本文中所述的原纤维生成测试法，包括ThT、CD或EM测试法。还可采用本发明所述的MS测试法测定药物与淀粉样原纤维的结合。药物防止细胞淀粉样蛋白引发的毒性的能力，采用测定由淀粉样蛋白诱导的细胞死亡百分率的生化测试法在体外测定。采用适合的动物模型系统，还可评估药物调节肾功能的能力。
也可体外给予本发明的治疗性药物以抑制淀粉样蛋白沉积或治疗某些淀粉样蛋白相关疾病，如β2M淀粉样变性和其它与透析相关的淀粉样变性。本发明治疗性药物的体外给药可通过将体液(如血液、血浆等)与本发明的治疗性化合物接触，这样所述治疗性化合物能够进行其预期的功能并给予患者的体液中。本发明治疗性化合物可在体外(如透析过滤器)、体内(如与体液给予)或两者中发挥其功能。例如可用本发明的治疗性化合物在体外、体内或两者中降低血浆β2M水平和/或保持溶液形式的β2M。
前药
本发明还涉及本文所公开的所述化学式药物的前药。前药是在体内转化为活性形式的药物(参见，例如Silverman，1992，“The OrganicChemistry of Drug Design and Drug Action，”Academic Press，Chp.8)。前药用于改变具体药物的生物学分布(例如使药物进入一般不能进入的蛋白酶的活性部位)或药动学。例如，可将羧酸基团酯化，例如用甲基或乙基，生成酯。当将酯给予患者时，该酯经酶促性或非酶促性、还原性、氧化性或水解性裂解，除去阴离子基团。可用能裂解显示出中间体药物，接着分解得到活性药物的部分，将阴离子基团酯化(如酰氧基甲基酯)。可通过酯酶或其它机理，将前药部分体内代谢为羧酸。
前药的实例及其用途在本领域是熟知的(参见，例如Berge等，“Pharmaceutical Salts”，J.Pharm.Sci.66，1-19(1997))。前药可在所述药物的最后的分离和纯化过程中原位制备，或者通过使个别的游离酸形式的纯化的药物与适当的衍生化试剂反应制备。通过在催化剂存在下，用醇处理，可将羧酸转化为酯。
可断裂的羧酸前药部分的实例包括取代的和未取代的、支链或非支链低级烷基酯部分(如乙酯、丙酯、丁酯、戊酯、环戊酯、己酯、环己酯)、低级链烯基酯、二低级烷基氨基低级烷基酯(如二甲基氨基乙基酯)、酰基氨基低级烷基酯、酰氧基低级烷基酯(如新戊酰基氧基甲基酯)、芳基酯(苯基酯)、芳基低级烷基酯(如苄基酯)、取代的(例如：甲基、卤代或甲氧基取代基取代的)芳基和芳基低级烷基酯、酰胺、低级烷基酰胺、二低级烷基酰胺和羟基酰胺。
药学上可接受的盐
本发明药物的某些实施方案可包含碱性官能团，如氨基或烷基氨基，因此能够与药学上可接受的酸形成药学上可接受的盐。本发明中术语“药学上可接受的盐”指本发明药物的相对无毒性的、无机和有机酸加成盐。这些盐可在本发明药物的最后的分离和纯化过程中原位制备，或者通过使个别的本发明游离碱形式的纯化药物与适当的有机或无机酸反应，然后分离形成的盐制备。
代表性的盐包括氢卤酸盐(包括氢溴酸盐和氢氯酸盐)、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘甲酸盐、甲磺酸盐、葡庚酸盐、乳糖酸盐、2-羟基乙磺酸盐和十二烷基磺酸盐等。参见，例如Berge等，“Pharmaceutical Salts”，J.Pharm.Sci.66，1-19(1997)。
在其它情况下，本发明的药物可含有一或多个酸性官能团，因此，能够与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。在这些情况下的术语“药学上可接受的盐”指本发明药物的相对无毒性的、无机和有机碱加成盐。
同样地，这些盐可在所述药物的最后的分离和纯化过程中原位制备，或者通过使个别的本发明游离酸形式的纯化药物与适当的碱(例如药学上可接受的金属阳离子氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)、与氨或与药学上可接受的有机伯、仲或叔胺反应制备。代表性的碱金属和碱土金属盐包括锂、钠、钾、钙、镁和铝盐等。用于形成碱加成盐的代表性有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等。
“药学上可接受的盐”还包括例如经用其酸或碱式盐处理修饰的药物的衍生物，如本申请以下或别处进一步说明。药学上可接受的盐的实例包括碱性残基(如胺)的无机或有机酸盐；酸性残基(如羧酸)的碱或有机碱盐。药学上可接受的盐包括常规的无毒性盐或由例如无毒性无机或有机酸形成的母体药物的季铵盐。这些常规的无毒性盐包括那些衍生如下无机酸的盐，例如氢氯酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸；和由如下有机酸制备的盐，如乙酸、丙酸、琥珀酸、羟基乙酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙二磺酸、草酸和羟乙磺酸。可通过常规化学方法，用含有碱性或酸性部分的母体药物合成药学上可接受的盐。通常可在水或有机溶剂中或者在这两种溶剂的混合溶剂中，使这些药物的游离酸或碱的形式与化学计量的适当的碱或酸反应制备这些盐。
所述化合物的所有酸、碱和其它离子和非离子形式都包括在本发明的化合物之内。例如，如果化合物是此处所示的酸的形式，所述化合物的盐的形式也包括在内。同样地，如果化合物是此处所示的盐的形式，其酸和/碱的形式也包括在内。
本领域技术人员将清楚或能够清楚除采用常规的实验方法外，本发明所述的具体流程、实施方案、权力要求以及实施例尚有众多的等同替换。这些等同替换也被认定在本发明范围之内，并涵盖于其后所附的权力要求书中。本申请全文引用的所有的参考文献、授权的专利以及公开的专利申请均通过引用全文结合到本文中。本发明通过下列并不构成任何限定的实施例进一步说明。
实施例
实施例1：示例性的化合物库的合成
化合物库根据下面的示例性流程合成：
化合物库的合成(路线1)：
步骤1(去保护)：将Fmoc-Gly-Wang树脂(5g，5mmol)的溶液在玻璃质洗涤器(fritted syringe)中用DMF(30mL)洗涤4次。为解离Fmoc基团，将35mL 30％哌啶/N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液加入到树脂中，并将悬浮液震摇30分钟。过滤试剂和溶剂，将树脂用NMP(35mL)洗涤4次。经Kaiser试验观察到深蓝色出现，指示为游离的胺。
步骤2(活化)：
Figure A20058004670401091
制备二苯酮亚胺(2.54mL，15mmol)和冰醋酸(840μL，15mmol)的NMP(35mL)溶液，并将该溶液引入含游离氨基树脂(步骤1，～5g，～5mmol)的玻璃质洗涤器中。于室温下将该悬浮液震摇过夜。然后经过滤除去试剂和溶剂。将树脂用DMF(30mL)洗涤4次，用甲醇(35mL)洗涤4次，和用DIEA洗涤1次(1N在甲醇中，20mL)持续30分钟。过滤树脂并用DMF(30mL)洗涤4次，和用CH2Cl2(30mL)洗涤4次，随后真空干燥过夜。
步骤3(结构单元A的引入)：
Figure A20058004670401101
将得自步骤2的二苯酮亚胺树脂(2.3g，～2.3mmol)、如下定义的结构单元A(如α，α-二溴-间二甲苯，3.1g，11.7mmol)和O-烯丙基-N-(9-蒽甲基)辛可尼定溴化物(1.4g，2.3mmol)悬浮于二氯甲烷(30mL)中。将该悬浮液震摇5分钟，然后用干冰在2-丙醇中的浆液使冷却至-78℃。将Dewar烧瓶固定于带有泡沫材料盖的滴定板震动器上，以维持低温。于-78℃，将反应混合物轻轻地震摇20分钟。通过注射器加入2-叔丁基亚氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氢化-1，3，2-磷杂环己烯(diazaphosphorine)(BEMP，3.3mL，11.4mmol)。于-78℃，将反应混合物震摇5小时，然后逐渐地升温至室温5-7小时。然后经过滤除去试剂和溶剂。将树脂用DMF(30mL)洗涤4次，用CH2Cl2(30mL)洗涤4次，和用甲醇(35mL)洗涤4次，随后真空干燥过夜。
Figure A20058004670401102
Figure A20058004670401111
步骤4(结构单元C的偶合)：
将得自步骤3的每一种树脂(各50mg，～50μmol)分配到32个玻璃质洗涤器(Torvig，各50mg，～50)，共64洗涤器，并在NMP(1mL)中溶胀30分钟。经过滤从每个洗涤器除去溶剂。制备下列16种结构单元中的每一种(10mmol each)和DIEA(3.5mL，20mmol)的NMP(10mL)溶液。将3mL C1-C8溶液加入到包含结合结构单元A1的产物的洗涤器中，将3mL C9-C16溶液加入到包含结合结构单元A2的产物的洗涤器中。然后将该悬浮液在滴定板震动器(Titer Plate Shaker)中震摇20小时。分别过滤反应混合物，并用二氯甲烷(5mL)洗涤5次，用THF(5mL)洗涤3次，用THF/H2O洗涤3次(3/1v/v，5mL)，用THF(5mL)洗涤3次，将该树脂真空干燥过夜。
Figure A20058004670401121
Figure A20058004670401131
步骤5(去除保护基团)：
将得自步骤4的树脂(在它们的64个原始玻璃质洗涤器中)悬浮于1N NH2OH·HCl/THF(1/2v/v，3mL)的水溶液中，并于室温下震摇5小时。经过滤从各个玻璃质洗涤器中除去试剂和溶剂。树脂用THF(2mL)洗涤4次，用DMF(2mL)洗涤4次，和用DIEA洗涤1次(1N在DMF中，2mL)，持续30分钟。然后过滤树脂，用DMF(2mL)洗涤4次，和用CH2Cl2(2mL)洗涤4次，随后真空干燥。Kaiser试验显示树脂为深蓝色，表明为游离胺的产物。
步骤6，结构单元D的偶合：
部分A：
Figure A20058004670401142
向Fmoc-D-Phe-OH(1.24g，3.2mmol)、PyBop(1.6g，3.08mmol)和HOBt(490mg，3.2mmol)的DMA(无水的，20mL)溶液中加入DIEA(1.12mL，6.4mmol)。将该溶液加入到在洗涤器中的预先溶胀的得自步骤-5-03、07、11、15、35、39、43和47的树脂中。于室温下震摇该悬浮液2小时。过滤除去试剂和溶剂，并将8份树脂中的每一份用DMF(3mL)洗涤4次，并用二氯甲烷(3mL)洗涤4次，使用如上文步骤1中的相同步骤除去Fmoc。
部分B：
Figure A20058004670401151
在Torvig洗涤器中，将得自步骤-5-04、08、12、16、36、40、44和48的树脂悬浮于二氯甲烷(1mL，无水的)中5分钟，向每份悬浮液中加入4-联苯基(biphenylryl)异氰酸酯(200mg，～1mmol)的DMF(无水的，1mL)溶液。于室温下，将各悬浮液震摇过夜。然后经过滤除去试剂和溶剂，用MeOH和二氯甲烷轮流洗涤树脂(每次洗涤3mL，4周期)。
部分C：
Figure A20058004670401161
在它们的最初的玻璃质洗涤器中，将得自步骤-5-19、23、27、31、51、55、59、63的树脂在DMF(3mL)中溶胀30分钟。过滤除去大部分溶剂。向每个洗涤器中加入2.4mL 4-氟苯磺酰氯(620mg、3.2mmol)和N-甲基吗啉(700μl，6.4mmol)的CH2Cl2(20mL)溶液。于室温下将各混合物震摇过夜。试剂和溶剂经过滤除去。树脂用DMF(3mL)洗涤4次，用CH2Cl2(3mL)洗涤4次，随后真空干燥。
部分D：
Figure A20058004670401162
将得自步骤-5-20、24、28、32、52、56、60和64的树脂悬浮于在Torvig洗涤器中的二氯甲烷(1mL，无水的)中5分钟。向各悬浮液加入4-二苯基甲基异氰酸酯(210mg，～1mmol)的DMF(无水的，1mL)溶液。于室温下将悬浮液震摇过夜。试剂和溶剂经过滤除去，用MeOH和二氯甲烷轮流洗涤树脂(每次洗涤3mL，4周期)。
步骤7a(酸解离)：
Figure A20058004670401171
用TFA/苯甲醚/H2O(95％/2.5％/2.5％，各1mL)将上面所示树脂各处理5分钟，过滤收集滤液。再用TFA/苯甲醚/H2O(95％/2.5％/2.5％，各1mL)处理树脂30分钟。合并来自相同洗涤器的滤液。向该滤液中加入冷乙醚(10mL)，将沉淀以4000rpm离心5分钟，倾析上清液。洗涤沉淀物，再离心三次以除去可能的不纯物。ES-MASS指示所需化合物的正确的分子量。
步骤7b(氨解离)：
    起始原料     产物
    步骤-5-02     步骤-7-02
    步骤-5-06     步骤-7-06
    步骤-5-10     步骤-7-10
    起始原料     产物
    步骤-5-14     步骤-7-14
    步骤-5-18     步骤-7-18
    步骤-5-22     步骤-7-22
    步骤-5-26     步骤-7-26
    步骤-5-30     步骤-7-30
    步骤-5-34     步骤-7-34
    步骤-5-38     步骤-7-38
    步骤-5-42     步骤-7-42
    步骤-5-46     步骤-7-46
    步骤-5-50     步骤-7-50
    步骤-5-54     步骤-7-54
    步骤-5-58     步骤-7-58
    步骤-5-62     步骤-7-62
用氨在甲醇(2N溶液，2mL)中将上面所示树脂各处理30min，过滤收集滤液。用氨在甲醇(2N溶液，2mL)中再处理树脂2小时。合并来自相同洗涤器的滤液。向该滤液中加入冷乙醚(10mL)，将沉淀以4000rpm离心5分钟，倾析上清液。向这些没有沉淀物的洗涤器中加入己烷。洗涤沉淀物并再离心另外3次，以除去可能的不纯物。
得自路线1的产物的结构列于下表中：
Figure A20058004670401191
Figure A20058004670401201
Figure A20058004670401211
Figure A20058004670401221
化合物库(路线2)：
根据上面的路线1进行步骤1和2，但用6g(6mmol)Fmoc-Gly-Wang树脂代替5g。
步骤3(结构单元A的引入)：
Figure A20058004670401231
将得自步骤2的二苯酮亚胺树脂(1.5g，～1.5mmol)、如下定义的结构单元A(如2.0g，7.6mmolα，α-二溴-间二甲苯)和O-烯丙基-N-(9-蒽甲基)辛可尼定溴化物(910mg，1.5mmol)悬浮于二氯甲烷(20mL)中。将该悬浮液震摇5分钟，然后用干冰在2-丙醇中的浆液使冷却至-78℃。将Dewar烧瓶固定于带有泡沫材料盖的滴定板震动器上，以维持低温。于-78℃，将反应混合物轻轻地震摇20分钟。通过注射器加入2.3mL(7.5mmol)叔丁基亚氨基-三(吡咯烷子基)磷杂环己烯(BTPP，膦腈(phosphazene)碱)。于-78℃，将反应混合物震摇5小时，然后逐渐地升温至室温5-7小时。然后经过滤除去试剂和溶剂。树脂用DMF(20mL)洗涤4次，用CH2Cl2(20mL)洗涤4次和用甲醇(20mL)洗涤4次，随后真空干燥过夜。
步骤4(结构单元B的偶合)：
Figure A20058004670401242
将得自步骤3的各树脂分配到24个玻璃质洗涤器(Torvig，各50mg，～50μmol)中，共96个洗涤器，并在NMP(1mL)中溶胀30分钟。过滤除去溶剂。制备下列结构单元(各10mmol)和DIEA(3.5mL，20mmol)在NMP(10mL)中的24份溶液。将24份溶液各3mL加入到装有得自步骤3的各树脂的24个相应的洗涤器中。然后将该悬浮液在Titer Plate Shaker上震摇20小时。过滤反应混合物，用二氯甲烷(5mL)洗涤5次，用THF(5mL)洗涤3次，用THF/H2O(3/1v/v，5mL)洗涤3次，和用THF(5mL)洗涤3次。然后真空干燥该树脂过夜。
Figure A20058004670401261
Figure A20058004670401271
步骤5(保护基团的去除)：
将得自步骤4的树脂各自在它们的96个最初的玻璃质洗涤器中悬浮于1N NH2OH·HCl/THF(v/v，1/2，3mL)水溶液中，于室温下震摇5小时。然后经过滤从玻璃质洗涤器除去试剂和溶剂。树脂用THF(2mL)洗涤4次，用DMF(2mL)洗涤4次，和用DIEA洗涤1次(1N在DMF中，2mL)，持续30分钟。然后过滤树脂，用THF(2mL)洗涤4次，和用CH2Cl2(2mL)洗涤4次，随后真空干燥。Kaiser试验表明，树脂为深蓝色，表明为游离胺的产物。
步骤6(获得产物的解离)：
Figure A20058004670401281
将得自步骤-5的产物(96个洗涤器，各～50mg，～50μmol)用TFA/苯甲醚/H2O(95/2.5/2.5％，各1mL)处理5min，过滤收集滤液。用TFA/苯甲醚/H2O(95/2.5/2.5％，各1mL)再次处理树脂30分钟。合并来自相同洗涤器的滤液。向每份滤液中加入冷乙醚(10mL)，将沉淀以4000rpm离心5分钟，倾析上清液。洗涤沉淀物并再离心3次，以除去可能的杂质。ES-MASS指示所需化合物的正确的分子量。
得自路线2的产物的结构列于下表中：
Figure A20058004670401301
Figure A20058004670401311
Figure A20058004670401321
Figure A20058004670401331
Figure A20058004670401341
Figure A20058004670401351
Figure A20058004670401361
Figure A20058004670401381
制备160个示例性化合物的1mM 1％DMSO/H2O溶液。简言之，在样品溶于250μLDMSO后，将100μL溶解的每一化合物加入到10mL水中。于37℃将该溶液边震摇边在温育期温育过夜。离心后，样品是可溶的或部分可溶的。对所有样品进行MS分析，并将样品于-20℃贮存。如果仅仅是部分可溶的，将所述化合物的上清液(而不是整个溶液)于-20℃贮存。
对于细胞测定，将最初在1％DMSO/H2O中制备的稀释液改变为适合的生理缓冲液。将0.5mL体积无菌浓缩的10X PBS(无Ca+2，Mg+2)-葡萄糖-HEPES-DMSO溶液加入到4.5mL水溶液。溶解度可经目测证实，并测定pH以确保该溶液的pH为中性。在相同的试验条件下，评估在中性pH范围内的某些化合物。然后将化合物溶液通过0.22-μm滤器装置过滤，将250μL等分试样置于聚丙烯试管中并于-20℃贮存。
实施例2：示例性化合物对脑L1转运系统的结合
用于竞争结合测定的化合物库的稀释
将在PBS(无Ca+2，Mg+2)-葡萄糖30mM-HEPES 10mM-DMSO 1％中如实施例1制备的化合物样品解冻，并在制备下列用于竞争结合测定的亚稀释液(sub-dilutions)之前于20-23℃放置至少30分钟：
将200μL储备液加入到800μLPBS(无Ca+2，Mg+2)-葡萄糖-HEPES-1％DMSO(PBSD-1)[按1∶5稀释，最终为1∶5稀释物]将100μL(上述1/5稀释物)加入到900μLPBSD-1[按1∶10稀释，
最终为1∶50稀释物]
将100μL(上述1/50稀释物)加入到900μL PBSD-1[稀释1∶10，最终为1∶500稀释物]
将这些亚稀释液立即使用或在竞争结合测定之前于4℃贮存过夜。将在在PBSD-1中的45μL的各化合物稀释物(1∶5，1∶50，1∶500)加入到稀释板的合适的各孔中。
大鼠原代脑血管内皮细胞的分离
将取自60只24-天龄大鼠的脑在用冰冷的Hanks’平衡盐溶液(Gibco BRL，Grand Island，New York)浸湿的无菌外科用布上分别切碎，该平衡盐溶液包含补充有0.1％BSA的10mM HEPES(培养基1)。除去小脑、纹状体、视神经和脑干(白质)。在脑中矢状切开后，用无菌干燥棉拭子在皮质中转动，以除去脑膜和软脑脊膜碎片。(IchikawaN，Naora K，Hirano H，Hashimoto M，Masumura S，and Iwamoto K(1996).Isolation and primary culture of rat cerebral microvascularendothelial cells for studying drug transport in vitro.J Pharmacol ToxicolMeth 36：45-52.)。在15mL冰冷却的培养基1-0.1％BSA中，将干净的皮质切碎成≈2mm3的碎片。将该制备物分成4份放入预先称重的无菌试管中并以330Xg在20-25℃离心5分钟。将试管称重并预热(37℃)，并将含0.5％BSA(包含0.3％胶原酶和10μg/mL脱氧核糖核酸酶(DNAse1))(Roche，Laval，Quebec，Cahada)的培养基1加入到各试管中(1mL/g组织)。
将脑-胶原酶混合物于37℃水浴中剧烈搅拌90分钟。在消化结束前15分钟，使用10-mL移液管匀化组织，直至获得奶油色混合物(≈20aspirations)。通过将含0.1％BSA的培养基1加入到匀浆(26mL/管)洗涤细胞，并于20-25℃以100Xg离心7分钟。重复洗涤步骤3次以上，1次5分钟和两次各3分钟。将各沉淀物再悬浮于25mL 15％右旋糖酐溶液(在含0.1％BSA的培养基1中制备)中，并于4℃以3200Xg离心25分钟，以从神经组织和右旋糖酐层分离血管。于20-25℃，将血管沉淀再悬浮于5mL不含Ca++-Mg++-的含0.1％BSA的培养基1(培养基2)中，并转移入50-mL试管。经漂洗该试管收集剩余的血管并合并漂洗的悬浮液。(Rupnick MA，Carey A，and Williams SK(1988).Phenotypic diversity in cultured cerebral microvascular endothelial cellsin vitro.Cell Develop Biol 24：435-444)。
过滤血管制备物并通过无菌355-μm筛漂洗(20mL培养基2)。随后将355-μm滤液通过无菌112-μm筛过滤两次(20mL培养基2)并漂洗(Stanimirovic DB，Wong J，Ball R，和Durkin JP(1995)。Freeradical-induced endothelial membrane dysfunction at the site of the blood-brain barrier：relationship between lipid peroxidation，Na，K-ATPaseactivity，and51Cr release.Neurochem Res 20：1417-1427.)，并过滤后一滤液，通过无菌20-μm筛漂洗。通过双层20-μm筛重复最终的过滤和漂洗步骤。然后将保留微血管的所有20-μm筛转移入50-mL管中，该管包含在培养基2中的20mL 0.1％胶原酶/分散酶(Roche)，该培养基补充有10μg/mL DNAse 1和0.147μg/mL甲苯磺酰基-赖氨酸-氯代甲基-酮(Sigma Chemical Co.，Oakville，Ontario，Canada)(培养基3)。(Abbott NJ，Hughes CCW，Revest PA，and Greenwood J(1992).Development和characterisation of a rat brain capillary endothelial culture：towards an in vitro blood-brain barrier.J Cell Sci103：23-37)。剧烈震摇该管以使筛中的毛细管脱出，然后将其从管中脱出。在消化过程中，，将微毛细管制备物于37℃水浴中温和震摇60分钟。再次过滤该制备物并通过双层20-μm筛漂洗(20mL培养基2)。将筛浸泡在20mL培养基2中，震摇，并移出。然后将微毛细管制备物于20-25℃以330Xg离心5分钟。使该沉淀物再次悬浮于500μL培养基中，该培养基由补充有氨基酸(1X)(Sigma Chemical Co.)、维生素(1X)(GibcoBRL)、抗生素/抗真菌剂混合物(1X)(Gibco BRL)、20％FBS(Hyclone，Logan，Utah)、500μg/mL蛋白胨(Sigma Chemical Co.)，100μg/mL内皮细胞生长补充物(Sigma Chemical Co.)和50μg/mL肝素(Gibco BRL)的高葡萄糖Dulbecco’s最小极限培养基(Wisent，Herndon，Virginia)组成。
将微毛细管制备物接种于matrigel-包被(薄涂层)的12-孔板(≈45μL/孔)(Becton Dickinson，Mississauga，Ontario，Canada)中并于37℃在潮湿的5％CO2气氛下温育16小时。然后使用1-mL移液管，通过吸液管抽吸10-15次，将培养基吸到孔表面而使非-粘附细胞脱出。当细胞碎片附着于孔时，使用PBS(800μL/well)重复该程序。加入新鲜培养基后，每日监测细胞生长。在培养的第二天，用无Ca++-Mg++-的PBS洗涤细胞，经胰蛋白酶作用，计数，并以1×105个细胞/mL的密度平铺于用matrigel-包被的平底96-孔板和48-孔板中的培养基中，用于常规的内皮特性的特征鉴定。
大鼠原代脑血管内皮细胞的特征鉴定
根据厂商的使用说明书，对如上所述的在48孔板中的内皮细胞进行用荧光探针1，1’-dioctoadecyl-3，3，3’，3’-四甲基-indocarbocyamine高氯酸盐(Dil-Ac-LDL)标记的Ac-LDL的吸收测定(BiomedicalTechnologies Inc.，Stoughton，Maine)，用于von Willebrand因子表达(Dako Corporation，Carpinteria，California)和TRITC-标记的ConA吸收(Sigma Chemical Co.)测定。细胞制备物的特征鉴定表明导致富含脑内皮细胞培养物的分离程序可用于有效测定特异性化合物使用主动转运蛋白系统如L1-系统越过BBB的间接能力。在常规基础上，RBEC的特征鉴定以平行与所述化合物结合于靶向L1-系统载体的方式进行。
这些结果表明，用于分离和培养富含原代内皮细胞的这种方法保留RBEC及其内源性转运蛋白如L1-系统载体的官能度的特性。保留它们的内皮转运蛋白系统官能度的富含RBEC培养物的使用，促使了筛选药物的快速、可靠和可再现竞争结合试验的开发。这种培养基的生产能力试验可用于鉴定结合于例如L1-系统载体的化合物并提供选择CNS药物候选物的参数，以便设计出使用特异性主动转运蛋白渗透过脑的药物。
L-苯丙氨酸和α-甲基氨基异丁酸对照品的制备
制备2X10-2M的L-苯丙氨酸(Sigma)和α-(甲基氨基)异丁酸(MeAIB)(Sigma)，方法是通过使每10mL生理缓冲液分别溶解0.033g和0.023g来制备。两种溶液用5-ml注射器和0.22-μm滤膜过滤和，等分于250μL中并于-20℃贮存。
将L-苯丙氨酸和MeAIB的等分试样于20-23℃解冻并静置30-分钟的温育期。然后将这些对照品在96孔板装置中稀释以达到所需的稀释度，在将完全混合物加入细胞之前再加入放射性同位素。
通过用50μL储备液(新解冻的)进行45μL PBSD-1的10-倍系列稀释，将L-苯丙氨酸和α-(甲基氨基)异丁酸对照品在孔中稀释
放射性苯丙氨酸的制备
将原始包装的L-[U-14C]苯丙氨酸(Amersham Pharmacia BiotechUK Limited)保持于4℃。如下进行放射化学批分析：
公司：    Amersham Pharmacia
代号：    CFB.70
批号：    133
包装规格：250μCi
包装体积：5mL
比活性：  17.4GBq/mmol，469mCi/mmol
          96.4MBq/mg，2.61mCi/mg
分子量：  165(未标记的)
          180(在高比活性下)
放射性浓度：1.85MBq/mL，50μCi/mL
用于该试验的L-[U-14C]苯丙氨酸浓度先前已测定为在50％最大结合于内皮细胞受体的浓度。使用Sigma绘图程序，通过使S形(sigmoidal)曲线拟合几次实验的原始数据。可估测由L-[U-14C]苯丙氨酸的最大半数饱和L1转运系统受体所需的浓度为7×10-9M/3.17μCi/mL。
将放射标记的苯丙氨酸加入细胞中，随后2-倍稀释，制备14×10-9M/6.34μCi/mL的双倍浓度的L-[U-14C]苯丙氨酸溶液。用7.89的系数在生理缓冲液(含Ca+2，Mg+2-HEPES(最终10mM)-葡萄糖(最终30mM)的PBS)稀释原始的L-[U-14C]苯丙氨酸溶液(50μCi/mL储备液浓度除以6.34μCi/mL)。
将45μL体积L-[U-14C]苯丙氨酸(2X)加入到45μL体积的各化合物稀释液(1∶5，1∶50，1∶500)的PBSD-1溶液中，其先前已被分配于96-孔稀释板中。
竞争结合试验方案
如上所述将大鼠原代内皮细胞和培养基平铺于96-孔板后，将细胞培养6天，并且每隔3-4天替换1次培养基。然后用温热的生理缓冲液洗涤大鼠内皮细胞两次。将35μL体积的放射标记的L-[U-14C]苯丙氨酸和所述化合物/对照混合物加入到细胞中，于20-23℃温育培养板5分钟。用冷的生理缓冲液洗涤细胞两次，加入25μLNaOH 1N并于20-23℃培养10分钟。轻叩培养板的侧面以确保所有的细胞分离。然后加入25μLHCl 1N中和细胞溶胞产物。将50μL混合物转移至Wallac弹性培养板(专门用于放射性计数)中，每孔加入200μL闪烁液(Opti-Phase Supermix，Wallac，UK)。密封培养板，涡流，在Wallac β-计数器上读数。
放射性计数的程序
将包含放射性混合物的培养板转移至Wallac β-计数器平板支架上。Wallac1450 Microbeta(Wallac)Protocol#96是用于96-孔板的合适的方案。简言之，Protocol#96包括在Wallac β-计数器上检测特异性放射性同位素所需的所有说明书中。液体闪烁计数为其中在样品中由放射性同位素(在这种情况下为14C)发射的β衰变电子激发溶剂分子，再依次将能量转移到溶质或氟(fluor)的过程。溶质的能量发射(光量子)经光电倍增管被转化为电信号(CPM或每分钟计数)。每孔经3个光电倍增管同时计数2分钟。收集原始数据，将CCPM或每分钟的校正计数调整为本底并用于汇集结果。
数据处理
对于放射性计数获得的原始数据，每分钟的校正计数(CCPM)表明L-[U-14C]苯丙氨酸放射性的量与细胞和对本底的校正相关。
数据分析和计算
计算对各样品浓度的每次平行测定的均值和标准误。特异性结合于细胞上的L1转运系统的百分率也如下计算：
然后将特异性结合的百分率与L-苯丙氨酸参比对照品进行比较，差异性通过任意评分系统评估。
结果
为了客观地区别160个苯丙氨酸-衍生的化合物结合于脑L1转运系统的能力，一种评分等级系统被用于对所述化合物与苯丙氨酸对照品的结合进行比较。对于每种测试浓度，各化合物的特异性结合与苯丙氨酸对照品的百分率差异如下计算：
对于每种测试浓度(10-6、10-5、10-4M)：
Figure A20058004670401442
如果
X＜0     等级0
0＜X＜10 等级1
10＜X＜20 等级2
X＞20 等级3
对于给定的浓度，与苯丙氨酸比较，差异大于20％的化合物意谓该化合物结合于L1-系统受体的能力比苯丙氨酸本身更高。对于部分可溶的化合物，实际的浓度是未知的和低估的，因此它们结合于受体的能力可能是低估的。下表4描述127个所述化合物在3种测试浓度下的结果。剩余的33个(ID号2、19、23、28、40、56、58、5965、77、78、80、83、84、85、90、100、106、107、108、128、129130、132、133、139、140、142、143、145、150、152和157)在3个测试浓度下全部分级为0。虽然这种特殊的试验证实12个化合物为高活性的(即，在3个测试浓度下有两个等级为3或3以上)，有理由相信稍稍修改试验条件或浓度将表明160个经测试的化合物中绝大多数也是有活性的。
表4：127个试验化合物的结合亲合力与苯丙氨酸的比较
I.D.#    Conc.(M) 与苯丙氨酸结合的比较 I.D.#   Conc.(M) 与苯丙氨酸结合的比较 I.D.# Conc.(M) 与苯丙氨酸结合的比较
  3.     10-610-510-4     333   15.     10-610-510-4     230   34.     10-610-510-4     100
  5.     10-610-510-4     333   51.     10-610-510-4     230   42.     10-610-510-4     100
  8.     10-610-510-4     333   103.     10-610-510-4     222   52.     10-610-510-4     100
  13.     10-610-510-4     333   105.     10-610-510-4     222   63.     10-610-510-4     100
  27.     10-610-510-4     333   116.     10-610-510-4     221   71.     10-610-510-4     100
  33.     10-610-510-4     333   47.     10-610-510-4     220   75.     10-610-510-4     100
  57.     10-610-510-4     333   50.     10-610-510-4     220   76.     10-610-510-4     100
  118.     10-610-510-4     333   53.     10-610-510-4     220   92.     10-610-510-4     100
  4.     10-610-510-4     332   123.     10-610-510-4     220   93.     10-610-510-4     100
  18.     10-610-510-4     332   17.     10-610-510-4     211   99.     10-610-510-4     100
  38.     10-610-510-4     332   156.     10-610-510-4     211   115.     10-610-510-4     100
  49.     10-610-510-4     332   11.     10-610-510-4     210   117.     10-610-510-4     100
  87.     10-610-510-4     332   125.     10-610-510-4     210   121.     10-610-510-4     100
  101.     10-610-510-4     332   61.     10-610-510-4     202   122.     10-610-510-4     100
I.D.# Conc.(M) 与苯丙氨酸结合的比较 I.D.#   Conc.(M) 与苯丙氨酸结合的比较 I.D.# Conc.(M) 与苯丙氨酸结合的比较
  104.   10-610-510-4     332   7.   10-610-510-4     200  134.   10-610-510-4     100
  109.   10-610-510-4     332   12.   10-610-510-4     200  138.   10-610-510-4     100
  111.   10-610-510-4     332   31.   10-610-510-4     200  141.   10-610-510-4     100
  112.   10-610-510-4     332   113.   10-610-510-4     200  144.   10-610-510-4     100
  131.   10-610-510-4     332   114.   10-610-510-4     200  147.   10-610-510-4     100
  146.   10-610-510-4     332   137.   10-610-510-4     200  158.   10-610-510-4     100
  20.   10-610-510-4     331   148.   10-610-510-4     200  159.   10-610-510-4     100
  30.   10-610-510-4     321   151.   10-610-510-4     200  160.   10-610-510-4     100
  39.   10-610-510-4     320   153.   10-610-510-4     200  66.   10-610-510-4     032
  10.   10-610-510-4     310   155.   10-610-510-4     200  79.   10-610-510-4     032
  29.   10-610-510-4     310   67.   10-610-510-4     133  81.   10-610-510-4     032
  32.   10-610-510-4     310   82.   10-610-510-4     132  69.   10-610-510-4     030
  60.   10-610-510-4     301   119.   10-610-510-4     132  127.   10-610-510-4     021
  6.   10-610-510-4     300   73.   10-610-510-4     131  43.   10-610-510-4     020
  24.   10-610-510-4     300   72.   10-610-510-4     121  45.   10-610-510-4     020
I.D.#   Conc.(M)   与苯丙氨酸结合的比较 L.D.#   Conc.(M) 与苯丙氨酸结合的比较 I.D.#   Conc.(M) 与苯丙氨酸结合的比较
  35.     10-610-510-4     300   86.     10-610-510-4     121   46.     10-610-510-4     020
  36.     10-610-510-4     300   21.     10-610-510-4     120   91.     10-610-510-4     011
  62.     10-610-510-4     300   88.     10-610-510-4     111   102.     10-610-510-4     011
  136.     10-610-510-4     300   89.     10-610-510-4     111   9.     10-610-510-4     010
  149.     10-610-510-4     233   94.     10-610-510-4     111   16.     10-610-510-4     010
  1.     10-610-510-4     232   110.     10-610-510-4     111   22.     10-610-510-4     010
  37.     10-610-510-4     232   48.     10-610-510-4     110   25.     10-610-510-4     010
  41.     10-610-510-4     232   74.     10-610-510-4     110   44.     10-610-510-4     010
  95.     10-610-510-4     232   96.     10-610-510-4     110   64.     10-610-510-4     010
  97.     10-610-510-4     232   120.     10-610-510-4     110   68.     10-610-510-4     010
  135.     10-610-510-4     232   124.     10-610-510-4     110   70.     10-610-510-4     010
  54.     10-610-510-4     231   126.     10-610-510-4     110   98.     10-610-510-4     010
  55.     10-610-510-4     231   26.     10-610-510-4     100   154.     10-610-510-4     001
  14.     10-610-510-4     230
实施例3：化合物内在毒性的测定
用于毒性研究的化合物库的稀释
如在实施例1中制备的化合物样品在PBS(无Ca+2、Mg+2)-葡萄糖、30mM-HEPES、10mM-DMSO 1％中解冻并在制备用于化合物毒性测定的下列亚稀释液之前，于20-23℃放置至少30分钟：
将100μL化合物储备液加入到900μLPBSD-1中[按1∶10稀释，最终为1∶10稀释物]
将100μL(上述1/10稀释物)加入到900μLPBSD-1中[按1∶10稀释，最终为1∶100稀释物]
HUVEC的培养
得自人脐带的内皮细胞(HUV-EC-C或HUVEC)购自AmericanType Culture Collection(ATCC，CRL-1730)并根据厂商的方案培养。将1-mL冰冷的继代培养细胞的等分试样于37℃水浴中解冻并在加入5mL培养基后离心。在再悬浮于5mL培养基后，将细胞接种于用0.1％明胶预先包被的TC80cm2烧瓶中。每隔3-4天替换培养基，监测细胞直至达到融合。
喜树碱对照品的制备
通过将称量的0.0085g喜树碱溶于在37℃水浴中的50mL双蒸馏水中，制备0.5mM喜树碱的无菌储备液(Sigma)。使该溶液涡流，然后通过0.22-μm滤器装置过滤并保持于4℃以用于毒性测定。
由该储备液，制备在包含1％DMSO的培养基稀释液中的浓度为60、75、80、100、150、200和250nM的喜树碱。
细胞毒性试验方案
将HUVEC在明胶包被的96-孔板上培养4天，然后按40μL/孔接种1×105个细胞/mL的细胞悬浮液。每隔培养3-4天替换1次培养基，直至达到融合。
在毒性测定的当天，从各孔除去条件培养基，将包含1％DMSO的90μL培养基分配于培养板中。将10μL体积的储备液，所述化合物在PBS-葡萄糖-HEPES-DMSO 1％中的1∶10和1∶100稀释液加入到合适的各孔(100-μL总体积/孔)中。将100μL体积的喜树碱稀释液和包含1％DMSO的培养基也分配于培养板中。将细胞于37℃培养24小时，然后将10μL四唑盐WST-1溶液加入到细胞中，并于37℃再培养90分钟。在SpectraFluor Tecan读出仪上，于450nm测定与细胞生存力相关的吸光度，对原始数据进行处理。
结果
测定每一化合物的各种浓度对HUVEC的固有细胞毒性。评价生存力百分比(OD样品/OD对照品)X100％，任何生存力＜75％的值均被认为是有毒的。下表(表5)列出存在至少一个毒性浓度的几个化合物。等级排列为高度有效地结合于L1转运系统的21个化合物均未诱导细胞毒性。
表5：示例性本发明化合物的固有细胞毒性
    ID# Conc.(M)   生存力(％)
30 10-4  110％
10-5  112％
10-6  8％
36 10-4  97％
10-5  66％
10-6  99％
37 10-4  94％
10-5  50％
10-6  87％
65 10-4  107％
10-5  68％
10-6  109％
66 10-4  117％
10-5  114％
10-6  67％
实施例4：示例性化合物的合成
根据下面的示例性流程合成化合物：
示例性化合物的合成(路线1)：
Figure A20058004670401511
步骤1：用DMF(4×25mL)、25％哌啶/DMF(1×25mL，3min和1×25mL 17min)和DMF(4×25mL)洗涤Fmoc-Gly-Wang树脂(5mmol)。为解离Fmoc基团，将25mL 30％哌啶/N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液加入到树脂中，并将悬浮液震摇30分钟。过滤试剂和溶剂，树脂用NMP(4×25mL)洗涤。
步骤2：向树脂中直接加入在25mL NMP中的二苯酮(benzopheneone)亚胺(25mmol)和乙酸(AcOH，25mmol)。将反应物震摇过夜。过滤试剂和溶剂，树脂用DMF(4×25mL)、H2O(4×25mL)、MeOH(4×25mL)、MeOH/N，N-二异丙基乙胺(DIEA)(10/1，3×22mL)和CH2Cl2(4×25mL)洗涤。然后真空干燥树脂。
步骤3：将树脂(5mmol)、α，α-二溴二甲苯或2，6-二(溴代甲基)吡啶(25mmol)和o-烯丙基-N-(9-蒽甲基)辛可尼定溴化物(5mmol)在25mL无水CH2Cl2中混合。于室温下将该悬浮液缓慢搅拌5分钟。然后使其冷却至-78℃并搅拌另外20分钟。加入磷腈(Phospozene)碱t-Bu-三(四亚甲基)(BTPP，25mmol)，并于-78℃将悬浮液震摇4小时，于-15℃震摇1小时。过滤试剂和溶剂，树脂用DMF(4×25mL)、H2O(4×25mL)、DMF/H2O(4×25mL)、CH2Cl2(4×25mL)和Et2O(4×25mL)洗涤。然后真空干燥树脂。
步骤4：将树脂(1mmol)在5mL NMP中溶胀。将该悬浮液震摇30分钟，加入硫醇(5mmol)和DIEA(12mmol)的5mL NMP溶液。于室温下将该悬浮液震摇22小时。过滤试剂和溶剂，树脂用CH2Cl2(4×10mL)、THF(4×10mL)、THF/H2O(4×10mL)和THF(4×10mL)洗涤。
步骤5：然后使该树脂悬浮于10mL 1N NH2OH.HCl的THF/H2O(2/1)溶液中。于室温下将该混合物震摇5小时。过滤试剂和溶剂，树脂用THF(4×10mL)和NMP(4×10mL)洗涤。向该树脂中加入1NDIEA(1.8mL DIEA和8.2mL NMP)。于室温下将该悬浮液震摇30分钟。过滤试剂和溶剂，树脂用NMP(4×10mL)和CH2Cl2(4×10mL)洗涤。
步骤6：使该树脂悬浮于TFA/H2O/苯甲醚的混合物(95％/2.5％/2.5％)中。将该悬浮液震摇30分钟，回收在烧瓶中的溶剂。树脂用TFA(10mL)洗涤。合并滤液，将溶剂的体积减少至最初体积的1/8。将几滴Et2O加入到该溶液中，产物用己烷沉淀。离心悬浮液，分离上清液。残留的溶剂用N2流除去。用上清液重复上述沉淀步骤。合并产物并经制备型HPLC纯化。
路线1合成的示例性化合的NMR结果
3-{-1-[(4-甲氧基苯基)-四唑]-5-基-硫基甲基}-L-苯丙氨酸，三氟乙酸盐，白色固体，22％总收率，[α]D＝-8.5°(在H2O中)。1H NMR(D2O，500MHz)δppm 7.24(d，2H，J＝8.3Hz)，7.10(t，1H，J＝7.6Hz)，7.08(m，3H)，7.00(d，2H，J＝8.3Hz)，4.29(s，2H)，3.83(t，1H，J＝6.1Hz)，3.81(dd，1H，J＝4.9Hz，14.2Hz)，2.95(dd，1H，J＝7.8Hz，14.2Hz)。13C(D2O，125 MHz)δppm 170.00，169.97，161.52，154.50，137.18，135.02，130.19，129.36，128.90，128.46，126.17，125.99，114.82，55.06，36.76，36.01.ES-MS 386(M+1)。
3-[3-(1-苯基-1H-四唑-5-基硫基甲基)]-L-苯丙氨酸，三氟乙酸盐，白色固体，18％总收率，[α]D＝-1.5°(在H2O中)。1H NMR(D2O，500MHz)δppm 7.48(m，3H)，7.32(d，2H，J＝8.3Hz)，7.18(t，1H，J＝7.6Hz)，7.13(d，1H，J＝7.8Hz)，7.08(m，2H)，4.32(s，2H)，4.02(t，1H，J＝6.6Hz)，3.10(dd，1H，J＝5.9Hz，14.6Hz)，2.98(dd，1H，J＝7.6Hz，14.4Hz)。ES-MS356(M+1)。
3-[3-(1H-苯并咪唑-2-基硫基甲基)]-L-苯丙氨酸，三氟乙酸盐，白色固体，16％总收率，[α]D＝-3.9°(在H2O中)。1H NMR(D2O，500MHz)δppm 7.48(dd，2H，J＝3.4Hz，6.1Hz)，7.36(dd，2H，J＝3.2Hz，6.1Hz)，4.37(s，2H)，3.71(t，1H，J＝6.4Hz)，2.89(dd，1H，J＝6.4Hz，14.6Hz)，2.83(dd，1H，J＝7.3Hz，14.6Hz)。ES-MS 328(M+1)。
3-[3-(5-苯基-2H-[1，2，4]三唑-3-基硫基甲基)]-L-苯丙氨酸，三氟乙酸盐，白色固体，39％总收率，[α]D＝-3.2°(在H2O中)。1H NMR(D2O，500MHz)δppm 7.70(m，2H)，7.42(m，3H)，7.16(t，1H，J＝8.1Hz)，7.10(d，2H，J＝6.4Hz)，7.02(m，2H)，4.15(s，2H)，3.97(t，1H，J＝5.6Hz)，3.07(dd，1H，J＝5.9Hz，14.6Hz)，2.94(dd，1H，J＝7.8Hz，14.6Hz)。ES-MS355(M+1)。
2-氨基-3-[6-(1H-苯并咪唑-2-基硫基甲基)-吡啶-2-基]-L-丙酸，三氟乙酸盐，淡黄色固体，6％总收率，[α]D＝+5.7°(在H2O中)。1H NMR(D2O，500MHz)δppm 7.74(t，1H，J＝7.8Hz)，7.66(m，2H)，7.42(m，2H)，7.31(d，1H，J＝7.8Hz)，7.27(d，1H，J＝7.8Hz)，4.57(s，2H)，4.00(t，1H，J＝6.3Hz)，3.22(d，2H，J＝5.9Hz)。13C(D2O，125MHz)δppm 172.81，155.13，153.83，141.06，132.04，126，54，124，68，123，27，113，48，70.01，53.05，38，28，35.92.ES-MS 329(M+1)。
2-氨基-3-[6-(1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基硫基甲基)-吡啶-2-基]-L-丙酸三氟乙酸盐，淡黄色固体，2％总收率，[α]D＝-5.0°(在H2O中)。1HNMR(D2O，500MHz)δppm 8.56(s，1H)，8.20(t，1H，J＝8.1Hz)，8.13(s，1H)，7.89(d，1H，J＝7.8Hz)，7.65(d，1H，J＝7.8Hz)，4.78(s，2H)，4.19(t，1H，J＝7.1Hz)，3.48(m，2H).13C(D2O，125MHz)δppm171.35，164.58，154.09，153.65，151.38，146.07，132.79，126.25，126.06，111.49，52.57，34.173，30.73.ES-MS 331(M+1)。
2-氨基-3-[3-(1H-咪唑-2-基硫基甲基)-苯基]-L-丙酸，三氟乙酸盐，淡黄色固体，7％总收率，[α]D＝-3.6°(在H2O中)。1H NMR(D2O，500MHz)δppm 7.72(m，2H)，7.54(t，1H，J＝7.6Hz)，7.36(m，3H)，6.95(d，1H，J＝7.3Hz)，5.02(m，1H)，4.92(m，1H)，4.78(t，1H，J＝5.1Hz)，3.05(dd，1H，J＝5.9Hz，14.6Hz)，3.01(dd，1H，J＝6.8Hz，14.6Hz)。13C(D2O，125MHz)δppm 172.84，163.34，163.05，137.95，137.08，135.59，129.75，129.69，129.23，128.16，128.57，121.52，117.74，115.43，55.28，39.82，35.96.ES-MS 278(M+1)。
2-氨基-3-[3-(4-羟基嘧啶-2-基硫基甲基)-苯基]-L-丙酸，三氟乙酸盐，白色固体，7％总收率，[α]D＝-4.2°(在H2O中)。1H NMR(D2O，500MHz)δppm 7.70(d，1H，J＝6.8Hz)，7.30(m，1H)，7.24(m，2H)，7.14(d，1H，J＝7.3Hz)，6.10(d，1H，J＝6.8Hz)，4.32(s，2H)，4.06(t，1H，J＝5.6Hz)，3.16(dd，1H，J＝5.9Hz，14.6Hz)，3.05(dd，1H，J＝7.8Hz，14.6Hz)。13C(D2O，125MHz)δppm 172.32，149.29，137.54，135.02，130.02，129.67，128.90，128.55，109.52，54.85，35.85，34.30.ES-MS 306(M+1)。
2-氨基-3-[3-(4-三氟甲基嘧啶-2-基硫基甲基)-苯基]-L-丙酸，三氟乙酸盐，淡黄色固体，3％总收率，[α]D＝+2.2°(在H2O中)。1H NMR(D2O，500MHz)δppm 8.65(d，1H，J＝4.4Hz)，8.18(t，1H，J＝7.8Hz)，7.92(d，1H，J＝7.8Hz)，7.62(d，1H，J＝7.8Hz)，7.40(d，1H，J＝4.4Hz)，4.59(s，2H)，4.15(t，1H，J＝7.1Hz)，3.44(m，2H).13C(D2O，125MHz)δppm170.96，170.36，160.98，155.64，155.35，154.11，150.69，146.51，126.15，126.40，13.92，52.37，33.70，32.16.ES-MS 359(M+1)。
2-氨基-3-[6-(6-氯代苯并噻唑-2-基硫基甲基)-吡啶-2-基]-L-丙酸，三氟乙酸盐，淡黄色固体，7％总收率，[α]D＝-3.1°(在H2O中)。1H NMR(CDCl3，500MHz)δppm 7.95(t，1H，J＝7.8Hz)，7.78(s，1H)，7.74(d，1H，J＝7.8Hz)，7.58(d，1H，J＝7.8Hz)，7.22(d，1H，J＝8.3Hz)，4.78(s，2H)，4.49(m，1H)，3.66(m，2H).13C(CDCl3，125MHz)δppm 167.15，154.65，154.00，153.53，148.80，142.97，133.57，132.57，125.21，124.87，121.96，121.64，53.30，35.29，33.99.ES-MS 380(M+1)。
示例性化合物的合成方案(路线2)：
Figure A20058004670401551
进行如在路线1中描述的步骤1至4。
步骤5：使该树脂(1mmol)悬浮于22.5mL乙酸(AcOH)和2.5mLH2O2(35％wt在水中)的溶液中。将该悬浮液震摇18小时，过滤试剂和溶剂。树脂用EtOH(4×10mL)和THF(4×10mL)洗涤。
进行如在路线1中描述的步骤6。
通过路线2合成的示例性化合物的NMR结果
2-氨基-3-[6-(1H-苯并咪唑-2-磺酰基甲基)-吡啶-2-基]-L-丙酸，三氟乙酸盐，淡黄色固体，6％总收率，[α]D＝+1.0°(在H2O中)。1H NMR(丙酮，500MHz)δppm 7.72(m，2H)，7.54(t，1H，J＝7.6Hz)，7.36(m，3H)，6.95(d，1H，J＝7.3Hz)，5.02(m，1H)，4.92(m，1H)，4.78(t，1H，J＝5.1Hz)，3.67(m，2H).13C(D2O，125MHz)δppm 170.61，154.88，145.28，144.20，138.72，136.64，125.10，124.29，123.89，115.82，55.35，51.16，34.23.ES-MS 361(M+1)。
3-{-1-[(4-甲氧基苯基)-四唑]-5-基-亚磺酰基甲基}-L-苯丙氨酸，三氟乙酸盐，淡黄色固体，7％总收率，[α]D＝-2.7°(在H2O中)。1H NMR(D2O，500MHz)δppm 7.14(m，2H)，7.07(dd，2H，J＝2.2Hz，9.0Hz)，6.94(dd，2H，J＝2.2Hz，9.0Hz)，6.82(m，2H)，5.04(m，2H)，3.95(m，1H)，3.76(s，3H)，3.01(m，1H)，2.88(m，1H)。13C(D2O，125MHz)δppm172.07，161.112，135.56，131.28，130.80，130.10，129.81，129.76，127，42，126.31，124.95，115.14，59.85，55.95，54，62，35.69.ES-MS 402(M+1)。
3-[3-(5-苯基-2H-[1，2，4]三唑-3-基亚磺酰基甲基)]-L-苯丙氨酸，三氟乙酸盐，淡黄色固体，2％总收率，[α]D＝-8.5°(在H2O中)。1H NMR(D2O，500MHz)δppm 7.75(m，2H)，7.47(m，3H)，7.16(m，2H)，6.94(m，2H)，4.48(s，2H)，4.30(m，1H)，3.95(m，1H)，3.36(dd，2H，J＝5.3Hz，14.6Hz)，2.96(m，1H)。13C(D2O，125MHz)δppm 172.06，161.94，157.99，135.11，131.94，131.49，131.418，129.98，129.68，129.61，128.85，126.94，125.42，58.96，54.732，35.72.ES-MS 371(M+1)。
2-氨基-3-[3-(1H-咪唑-2-基亚磺酰基甲基)-苯基]-L-丙酸三氟乙酸盐，白色固体，4％总收率，[α]D＝-2.0°(在H2O中)。1H NMR(D2O，500MHz)δppm 7.22(m，4H)，6.92(d，1H，J＝7.3Hz)，6.89(s，1H)，4.62(s，2H)，4.05(t，1H，J＝6.5Hz)，3.13(dd，1H，J＝5.9Hz，14.6Hz)，3.00(dd，1H，J＝7.6Hz，14.0Hz)。13C(D2O，125MHz)δppm 171.87，139.54，135.23，131.69，130.46，130.36，129，76，127.68，126.46，61.54，54.53，35.61.ES-MS 310(M+1)。
2-氨基-3-[3-(1H-咪唑-2-基亚磺酰基甲基)-苯基]-L-丙酸三氟乙酸盐，白色固体，4％总收率，[α]D＝-2.0°(在H2O中)。1H NMR(D2O，500MHz)δppm 7.22(m，4H)，6.92(d，1H，J＝7.3Hz)，6.89(s，1H)，4.62(s，2H)，4.05(t，1H，J＝6.5Hz)，3.13(dd，1H，J＝5.9Hz，14.6Hz)，3.00(dd，1H，J＝7.6Hz，14.0Hz)。13C(D2O，125MHz)δppm 171.87，139.54，135.23，131.69，130.46，130.36，129，76，127.68，126.46，61.54，54.53，35.61.ES-MS 310(M+1)。
3-[3-(1-苯基-1H-四唑-5-基亚磺酰基甲基)]-L-苯丙氨酸、三氟乙酸盐，白色固体，27％总收率，[α]D＝-2.1°(在H2O中)。1H NMR(D2O，500MHz)δppm 7.44(m，1H)，7.36(m，2H)，7.10(m，4H)，4.58(m，1H)，4.49(m，1H)，3.94(m，1H)，2.96(m，1H)，2.85(m，1H)。13C(D2O，125MHz)δppm 171.72，156.50，135.28，131.75，131.13，131.05，130.56，129.86，129.59，127.31，124.43，59.52，54.28，35.40.ES-MS 372(M+1)。
3-[3-(1H-苯并咪唑-2-基磺酰基甲基)]-L-苯丙氨酸、三氟乙酸盐，白色固体，2％总收率，[α]D＝-2.0°(在H2O中)。1H NMR(D2O，500MHz)δppm 7.57(dd，2H，J＝3.4Hz，6.4Hz)，7.37(dd，2H，J＝3.4Hz，6.1Hz)，7.11(m，2H)，6.96(d，1H，J＝7.7Hz)，6.72(s，1H)，4.72(s，1H)，3.54(t，1H，J＝6.2Hz)，2.85(dd，1H，J＝5.9Hz，14.6Hz)，2.71(dd，1H，J＝7.6Hz，14.4Hz)。13C(D2O，125MHz)δppm 172.22，145.31，137.66，135.53，131.53，130.47，130.24，129.73，127.37，125.97，116.87，61.64，54.878，35.58.ES-MS 360(M+1)。
3-[3-(1-苯基-1H-四唑-5-基亚磺酰基甲基)]-L-苯丙氨酸，三氟乙酸盐，淡黄色固体，6％总收率，[α]D＝-10.1°(在H2O中)。1H NMR(D2O，500MHz)δppm 7.64(t，1H，J＝7.8Hz)，7.55(dd，1H，J＝3.9Hz，7.6Hz)，7.49(t，2H，J＝7.6Hz)，7.36(m，2H)，7.06(dd，1H，J＝7.8Hz，14.2Hz)，4.73(m，2H)，4.09(t，1H，J＝5.4Hz)，3.10(m，2H).13C(D2O，125MHz)δppm 171.94，156.74，155.89，147.30，139.85，131.87，130.35，124.98，124.61，60.79，59.87，52.59，35.68.ES-MS 373(M+1)。
示例性化合物的合成方案(路线3)：
Figure A20058004670401581
步骤1：使Fmoc-Gly-OH(5.3mmol)溶于44mL无水CH2Cl2和6mL DMF中。将该溶液加入到含DIEA(21.2mmol，4eq相对于氨基酸)的6.6mmol 2-氯代三苯甲基氯树脂中。将该悬浮液震摇30分钟。过滤试剂和溶剂。树脂用CH2Cl2/MeOH/DIEA(17/2/1，3×20mL)、CH2Cl2(3×20mL)、DMF(2×20mL)、CH2Cl2(2×20mL)和MeOH(2×20mL)洗涤。经KOH真空干燥树脂。为解离Fmoc基团，使树脂在5％哌啶的DMF/CH2Cl2(20mL，1/1)溶液中溶胀。将该悬浮液震摇10分钟。过滤试剂和溶剂。将在DMF(20mL)中的20％哌啶加入到树脂中。将该悬浮液震摇15分钟。过滤试剂和溶剂。树脂用DMF(3×20mL)和CH2Cl2(3×20mL)洗涤。
步骤2：使树脂(5.3mmol)在50mL NMP中溶胀。将该悬浮液震摇5分钟，过滤溶剂。向该树脂中加入二苯酮亚胺(53.0mmol)和AcOH(50.0mmol)在40mL NMP中的溶液。将反应物震摇过夜。过滤试剂和溶剂，树脂用DMF(4×10mL)、H2O(4×10mL)、MeOH(4×10mL)、MeOH/N，N-二异丙基乙胺(DIEA)(10/1，4×11mL)和CH2Cl2(4×10mL)洗涤。真空干燥树脂。
步骤3：将树脂(4.5mmol)、α，α-二溴二甲苯(22.5mmol)和o-烯丙基-N-(9-蒽甲基)辛可尼定溴化物(4.5mmol)在40mL无水CH2Cl2中混合。于室温下，将该悬浮液震摇5分钟。然后使其冷却至-50℃(乙腈/干冰浴)并搅拌20分钟。加入磷腈(Phospozene)碱t-Bu-三(四亚甲基)(BTPP，22.5mmol)。于-78℃将悬浮液搅拌过夜。过滤试剂和溶剂，树脂用DMF(4×10mL)、DMF/H2O(4×20mL)和CH2Cl2(4×10mL)洗涤。真空干燥树脂。
步骤4：使树脂(1.0mmol)在10mL NMP中溶胀。将该悬浮液震摇5分钟并过滤溶剂。加入硫醇(5.6mmol)和DIEA(13.5mmol)在10mL NMP中的溶液。于室温下，将该悬浮液震摇过夜。过滤试剂和溶剂。树脂用CH2Cl2(4×10mL)、THF(4×10mL)、THF/H2O(4×10mL)和THF(4×10mL)洗涤。
步骤5：使树脂悬浮于TFA/H2O/苯甲醚的混合液(95％/2.5％/2.5％，(10mL)中。将该悬浮液震摇1小时。将溶剂回收于烧瓶中。树脂用TFA(10mL)洗涤。合并滤液并蒸发溶剂。用冷却的Et2O使产物沉淀。离心悬浮液，移出上清液。固体溶剂用N2流除去。用上清液重复相同的步骤两次。合并产物并经制备型HPLC纯化。
由路线3合成的示例性化合物的NMR结果
3-{1-[(4-羟基苯基)-四唑]-5-基-硫基甲基}-L-苯丙氨酸，三氟乙酸盐，白色固体，43％总收率，[α]D＝-1.1°(在H2O中)。1H NMR(D2O，500MHz)δppm 7.12(m，8H)，6.86(d，1H，J＝8.8Hz)，4.28(s，2H)，3.99(t，1H，J＝6.6Hz)，3.09(dd，1H，J＝5.6Hz，14.4Hz)，2.96(dd，1H，J＝5.9Hz，14.6Hz)。13C(D2O，125MHz)δppm 174.08，157.97，136.95，135.13，129.88，129.68，129.18，128.31，126.62，116.43，54.84，37.37，35.86.ES-MS 372(M+1)。
3-[3-(5-吡啶-4-基-[1，3，4]二唑-2-基硫基甲基)]-L-苯丙氨酸，三氟乙酸盐，淡黄色固体，10％总收率，[α]D＝-1.7°(在H2O中)。1H NMR(D2O，500MHz)δppm 8.86(d，2H，J＝6.8Hz)，8.38(d，2H，J＝6.8Hz)，7.37(d，1H，J＝7.3Hz)，7.33(s，1H)，7.27(t，1H，J＝7.8Hz)，7.13(d，1H，J＝7.8Hz)，4.85(s，2H)，4.07(t，1H，J＝5.9Hz)，3.16(dd，1H，J＝5.9Hz，14.2Hz)，3.07(dd，1H，J＝7.1Hz，14.2Hz)。13C(D2O，125MHz)δppm172.23，168.87，162.56，143.30，138.60，136.88，135.22，129.96，129.77，129.31，128.516，123.87，54.79，36.05，35.84.ES-MS 357(M+1)。
3-{1-[2-(二甲基氨基)乙基]-1H-四唑]-5-基-硫基甲基}-L-苯基-丙氨酸三氟乙酸盐，白色固体，38％总收率，[α]D＝-0.8°(在H2O中)。1HNMR(D2O，500MHz)δppm 7.48(m，2H)，7.11(m，2H)，4.51(t，1H，J＝5.9Hz)，7.33(s，1H)，7.27(t，1H，J＝7.8Hz)，7.13(d，1H，J＝7.8Hz)，4.34(s，2H)，4.14(t，1H，J＝6.8Hz)，3.46(t，2H，J＝6.1Hz)，3.14(dd，1H，J＝6.1Hz，14.4Hz)，3.05(dd，1H，J＝7.3Hz，14.6Hz)。13C(D2O，125MHz)δppm 171.41，154.74，137.27，134.96，129.97，129.91，129.39，128.55，54.91，54.19，43.29，42.36，37.72，35.57.ES-MS 351(M+1)。
3-[3-(5-吡啶4-基-4H-[1，2，4]三唑-3-基硫基甲基)]-L-苯丙氨酸、三氟乙酸盐，白色固体，28％总收率，[α]D＝-1.1°(在H2O中)。1H NMR(D2O，500MHz)δppm 8.74(d，2H，J＝6.8Hz)，8.37(d，2H，J＝6.8Hz)，7.11(m，4H)，4.23(s，2H)，3.98(t，1H，J＝5.9Hz)，3.08(dd，1H，J＝5.4Hz，14.4Hz)，2.99(dd，1H，J＝7.3Hz，14.6Hz)。13C(D2O，125MHz)δppm 178.39，172.36，157.70，154.15，146.37，142.16，137.85，135.11，129.78，129.56，128.93，128.38，123.60，54.88，37.85，35.83.ES-MS 356(M+1)。
实施例5：示例性化合物对脑L1转运系统的结合
将如在上面实施例4中合成的化合物稀释并进行也在上文实施例2中描述的结合于脑L1转运系统的试验。
对于每种浓度(10-6、10-5和10-4)，在相同浓度苯丙氨酸(参比竞争)的存在下，由所测得的相应值减去在试验化合物的存在下的14C-标记的苯丙氨酸的结合(表示为在无竞争时结合的％)。其差(in％)，Δ，表示为起始分(primary score)(其表示试验化合物的结合亲合力接近于苯丙氨酸结合曲线)。如下将起始分转化为数字等级量度：
3：Δ＞10％，显著高于苯丙氨酸的结合亲合力
2：10％≥Δ≥-10％，类似于苯丙氨酸的结合亲合力
1：-10＞Δ＞-50％，低于苯丙氨酸的结合亲合力
0：Δ≤-50％，没有结合或极低的结合亲合力
下表6中所示的结果表明5个化合物显示明显高于苯丙氨酸的结合亲合力，4个化合物显示类似于苯丙氨酸的结合亲合力，9个化合物显示低于苯丙氨酸的结合亲合力，但是仍然明显结合于转运蛋白，2个化合物显示没有结合或极低的结合亲合力。
表6：L1转运系统结合研究的结果
Figure A20058004670401611
3：Δ＞10％，显著高于苯丙氨酸的结合亲合力
2：10％≥Δ≥-10％，类似于苯丙氨酸的结合亲合力
1：-10＞Δ＞-50％，低于苯丙氨酸的结合亲合力
0：Δ≤-50％，没有结合或极低的结合亲合力
实施例6：示例性化合物对Aβ40的结合
对实施例4中合成的化合物和Aβ40在水溶液中的结合能力进行测试。结合能力半定量地(semi-quantitatively)归属于(attributed)在电喷雾质谱(Electrospray Mass Spectrum)观察到的肽-化合物复合峰强度。
在对Aβ40的MS试验中，制备样品的水溶液，如果必要，加入20％乙醇以增加在水中的溶解。所述肽的储备液包含50μm Aβ40。在典型的实验中，使用如实施例4制备的100μM示例性化合物和20μM增溶的Aβ40。所述化合物∶肽的比例为5∶1。通过加入0.1％氢氧化钠水溶液溶液，将各样品的pH值调节为7.4(±0.2)。然后使用WatersZQ 4000质谱仪，经电喷雾质谱测定法分析该溶液。在样品制备后2小时内，将样品以25μL/min的流速经直接注入而引入。对于所有的分析，源温度保持于70℃和进样锥电压(cone voltage)为20V。使用Masslynx 3.5软件处理数据。Aβ 1-40(M.W.＝4329)单独在20μM，于pH 7.32被作为对照品进行分析。可观察到钠聚类(Sodium clusters)(其在该系统典型出现于+3和+4，于m/z 1111.0和889.1区)。MS试验给出化合物结合于可溶性Aβ的能力的数据，而ThT、EM和CD测定给出抑制原纤维生成的数据。来自结合于Aβ试验的结果概括于表7。在表7中，空白方框意谓在该试验中未测定该化合物的值。
表7：Aβ1-40结合研究的结果
Figure A20058004670401641
+++＝强(70％和更多的游离肽)；++＝中等(50-70％的游离肽)；+＝弱(25-50％的游离肽)；0＝无
实施例7：示例性化合物对IAPP的结合
对实施例4中合成的化合物和IAPP在水溶液中的结合能力进行了测试。结合能力半定量地归属于在电喷雾质谱观察到的肽-化合物复合峰强度。
在对IAPP的MS试验中，制备样品的两种水溶液和20％乙醇的水溶液，包括如实施例4制备的100μM示例性化合物和20μM增溶的IAPP。储备液包含30μM IAPP，起始pH为3.8。通常，在浓度高于50μM和pH高于～6时，试验化合物与肽混合会即刻从溶液中沉淀出IAPP。因此，通过加入0.1％氢氧化钠水溶液溶液，将各样品的pH值调节为7.4(±0.2)。然后使用Waters ZQ 4000质谱仪，经电喷雾质谱测定法分析该溶液。在样品制备后2小时内，将样品以25μL/min的流速经直接注入而引入。对于所有的分析，源温度保持于70℃和进样锥电压为20V。使用Masslynx 3.5软件处理数据。IAPP(MW3903.4)单独在20μM，于pH 7.32被作为对照品进行分析。可观察到钠聚类(Sodium clusters)(其在该系统典型出现于+3和+4，于m/z1301.9和976.7区)。来自结合于IAPP试验的结果概括于表8在表8中，空白方框意谓在该试验中未测定该化合物的值。
表8：IAPP结合研究的结果
Figure A20058004670401661
Figure A20058004670401671
+++＝强(50％和更多的游离肽)；++＝中等(30-50％的游离肽)；+＝弱(15-30％的游离肽)；0＝无
实施例8：载脂蛋白E-Aβ相互作用测定
对5个本发明化合物测定载脂蛋白E和Aβ之间的相互作用的水平，以确定在本实施例的特定条件下，所述化合物是否抑制这种相互作用。于37°，用1μM HFIP-解离的Aβ的0.1M NaHCO3(pH 9.6)溶液包被Nunc-Immuno Maxisorp96-孔微量滴定板2小时又15分钟，在TBS(100mM Tris-HCl，pH 7.5，150mMNaCl)中洗涤两次，于4°，用在TBS中的1％无脂肪酸的BSA封闭各孔过夜。
在TBS或DMSO中制备终浓度分别为2mM或10mM的试验化合物。在700mM NH4HCO3中制备最终浓度0.44mg/mL的重组ApoE(Fitzgerald Industries Int.)，以防止单体装配并作为等分试样于-20°贮存。在200μM试验化合物的存在下，在96-孔转移板(transfer plate)中，在1％BSA/TBS中将3.41μg/mL纯化的ApoE(全部一式三份)预温育1小时，然后加入到Aβ-包被的孔中，在轻轻震摇下，于37°温育另外2小时，使ApoE/Aβ缔合。将板在TBS中洗涤3次，以除去过量的ApoE，并先与0.125μg/mL小鼠单克隆抗-ApoE抗体(BDBioscience)一起温育1小时，洗涤，然后与0.26μg/mL马-radish过氧化物酶缀合山羊抗-IgG抗体(Pierce)在1％BSA/TBS-T(0.05％Tween-20)中一起温育1小时。洗涤后，使各孔内容物与Sure BlueTM TMB-1过氧化物酶底物(KPL)一起温育30分钟。用1N HCl终止反应。使用TECAN板读出仪，测定于450nm处的吸光度，这反映了在孔中ApoE结合于Aβ的量。数据表示为ApoE/ApoE/Aβ复合物复合物相对于任意设置ApoE/Aβ(单独时为100％)的百分比。所有化合物测试至少两次。
表9：载脂蛋白E-Aβ相互作用研究的结果
结果表明在这些条件下，5个测试的化合物对载脂蛋白E和Aβ之间的相互作用的影响最小。然而，应该理解，这些化合物在其它条件下(例如不同的浓度的化合物、淀粉样蛋白和/或载脂蛋白E)可显示有效性。
实施例9：Hoechst染色和胱天蛋白酶测定
材料
下列项目购自它们各自的公司且无须进一步纯化而使用，除非另外说明：
项目 公司 商品目录#
SH-SY5Y，人成神经细胞瘤细胞系，由subline of SK-N-SH建立 American Type CultureCollection(ATCC)  CRL-2266
胎牛血清(FBS) Gibco  10099-141
Eagle’s极限必需培养基(EMEM) Sigma  4655
含L-谷酰胺的Ham’s F12营养混合物 Gibco  11765-054
MEM非-必需氨基酸 Gibco  1140-050
胰蛋白酶/EDTA(2.5g胰蛋白酶和0.38gEDTA-4Na/L在无Ca++和Mg++的HBSS中) Gibco  25200-056
低聚甲醛(PFA) Electron MicroscopyScience(EMB)  15714
甲醇 Fisher  A452-4
磷酸缓冲盐水(PBS) Gibco  14040-133
Hoechst Dye 33342 Molecular Probes  H-3570(10mg/mL在水中)
水 Sigma  W-3500
延长金色(Prolong Gold)抗-褪色试剂 Molecular Probes  P36930
胱天蛋白酶-Glo 3/7测定 Promega  G8092
FlexStation II 384 Molecular Devises
未分化的人成神经细胞瘤SH-SY5Y的维持
根据ATCC’s的推荐，对SH-SY5Y细胞进行培养和继代培养。使细胞生长于包含10％胎牛血清(FBS)、在Eagle’s极限必需培养基和Ham’s F12培养基的1∶1混合物中的1x非-必需氨基酸的培养基中。
为传代，于37℃，用0.25％(w/vol)胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)使细胞经受胰蛋白酶作用5分钟，然后以300xg(GS-6R BeckmanCentrifuge)离心5分钟。使沉淀物再悬浮于培养基中，调节细胞密度。
制备Aβ1-42
合成的Aβ1-42购自American Peptide Company，Sunnyvale，CA。为排除可在合成的Aβ1-42肽制备物中发现的聚集的物质，采用非聚集的/过滤步骤。简言之，使Aβ1-42粉末以最大浓度200μM溶于在玻璃烧瓶中的HFIP中。超声处理溶液30分钟，然后通过ANOTOP 25(20nM滤器)过滤。通过测量280nM处的光学密度计算溶液的精确浓度。然后蒸发可溶性Aβ1-42溶液以除去HFIP，以终浓度120μM再悬浮于含0.04M Tris-HCl、0.3M NaCl(pH7.4)的缓冲液中。将该溶液冷冻贮存备用。
NRM化合物的制备
Figure A20058004670401711
使上面所列化合物溶于磷酸缓冲盐水(PBS)(不含钙和镁)，1％二甲亚砜(DMSO)，pH7.4，通过0.22μm注射管滤器过滤，等分试样并于-80℃贮存直至使用。
SH-SY5Y处理
为进行Hoechst染色，将SH-SY5Y细胞以3×105个细胞/孔的密度接种于带有盖玻片的24-孔板中。第二天进行处理。在200μM所需化合物(1∶20 Aβ∶药物比)的存在或不存在下，使细胞与自120μM储备液稀释的10μM Aβ1-42(在培养基中)一起培养24小时。
为进行胱天蛋白酶测定，将SH-SY5Y细胞以1×105细胞/孔的密度接种于用胶原I包被的96孔板中。测定前16-17小时，将培养基更换为含1％FBS的EMEM/F12。在不同浓度的所需化合物(1∶20，1∶5和1∶1 Aβ∶药物比)的存在或不存在下，使细胞与自120μM储备液稀释的10μM Aβ1-42(在培养基中)一起培养24小时。
Hoechst染色
将Hoechst 33342的储备液在水中稀释为100μg/ml，并于2-8℃贮存。在培养基中，以2μg/ml的终浓度，使SH-SY5Y成神经细胞瘤与500μl Hoechst溶液一起培养10-60分钟。细胞用PBS洗涤3次并于室温下固定于4％PFA中30分钟。用PBS洗涤3次后，使用延长抗-褪色试剂在载玻片上制备盖玻片标本。
计数方法和数据分析
使用装配有Olympus照相机(20x物镜(objectif)和通带滤光片(Ex/Em：355nm/465nm)的Olympus荧光显微镜IX50观察细胞核形态学。对活细胞和在形态学上认为已凋亡的细胞计数。未分化的SH-SY5Y的已凋亡的细胞核出现凝缩并偶而出现碎片(Hoechst染色的代表性照片在图1A-1B(溶媒)和2A-2B(Aβ)。
以盲法对每种情况随机获取5个视野。通过手工检查对每个视野中的已凋亡的和正常的细胞核进行定量。数据表示为毒性的百分率，相当于凋亡细胞数除以总细胞数(已凋亡的+未凋亡的细胞)。在每种情况下计数的总细胞数的范围在120-550。
用SigmaPlot软件生成图形。采用Student t-检验(Excel软件)在化合物的存在下用Aβ处理的％毒性与用Aβ单独处理进行比较，使用从所有实验获得的平均值。对于t-检验，认为p＜0.05具有显著性意义。
制备的第二种化合物，
Figure A20058004670401731
为对Aβ-介导的细胞在DNA水平的凋亡的神经保护剂(显示22.5％的抑制作用)。其它两个化合物在这种特殊的Hoechst染色测定中，对Aβ-介导的细胞在DNA水平的凋亡没有作用。然而，应该理解，这些化合物在其它情况下，例如不同浓度的化合物，不同的细胞类型，如成神经细胞瘤细胞和/或不同的试验条件，可显示出有效性。
胱天蛋白酶3/7测定
SH-SY5Y处理后，将80μl胱天蛋白酶-GloTM 3/7试剂加入到每孔中并于室温下培养30分钟。在FlexStation上测定每孔的发光。结果表明3个测试的化合物对Aβ-介导的胱天蛋白酶3/7均没有作用。然而，应该理解，在其它条件下，例如不同浓度的化合物，不同的细胞类型，如成神经细胞瘤细胞和/或不同浓度的胱天蛋白酶-GloTM，和/或不同的试剂，这些化合物可显示抑制Aβ-介导的胱天蛋白酶的有效性。
前瞻性实施例：在成人转基因CRND8小鼠过度表达βAPP的短期和长期治疗中的作用
短期
表达人淀粉样蛋白前体蛋白的(hAPP)的APP转基因小鼠，TgCRND8，产生类似于阿尔茨海默氏病的病理学。特别是，在这些8-9周龄动物的血浆和脑中证明存在高水平的Aβ40和Aβ42，随后发现类似于AD患者中观察到的老年蚀斑的淀粉样蛋白蚀斑的早期积聚。这些动物也显示与表象退行性改变平行的进行性认知缺损。见，如(Chishti，等，J.Biol.Chem.276，21562-70(2001)。
将研究本发明化合物的短期治疗效果。这些化合物将给药14或28天，该疗程结束后，测定Aβ肽在TgCRND8动物的血浆和脑中的水平。
方法
每日皮下或口服给予雄性和雌性APP转基因小鼠试验化合物14或28天。9±1周龄的基线动物(baseline animals)将用于测定治疗开始时转基因小鼠的血浆和脑中的Aβ水平。
9周龄(±1周)动物起初每日接受它们各自的治疗14或28天。对照组将仅接受水或甲基纤维素。在治疗期结束后，采集血浆和灌注的脑用于可溶性和不溶性Aβ水平的定量。
样品收集
在9±1周龄基线组动物中，在治疗组的治疗期(14或28天)结束后，在试验化合物给予24小时后，处死动物并收集样品。在全身麻醉下，从眼静脉窦采集约500μl体积的血液，于冰上保存，直至于4℃，以3,000rpm的最低速度离心10分钟。立即冷冻血浆样品，于-80℃贮存以备分析。心内盐水灌注后，取出脑，冷冻，并于-80℃贮存以待分析。
Aβ水平的测量
将冷冻的脑称重，用冰冷却的含蛋白酶抑制剂合剂(4mL缓冲液对1g湿脑)的4体积50mM Tris-Cl pH 8.0缓冲液匀化。样品以15000g旋转20分钟，将上清液转移至新鲜试管中。将取自各上清液的150μl与250μl 8M胍-HCL/50mM Tris-HCL(pH 8.0)混合(比例为0.6vol上清液：1vol 8M胍/Tris-HCL 50mM pH8.0)，加入400μL5 M胍/Tris-HCL 50mM pH8.0。将各试管涡旋30秒并于-80℃冷冻。以平行方式，用7体积5 M胍-HCL/50mM Tris-HCL pH 8.0(7mL胍对1g湿脑)处理沉淀物，涡旋30秒并于-80℃冷冻。样品于室温下解冻，于80℃超声处理15分钟并再次冷冻。重复该周期3次，以确保均匀性，使样品回复到-80℃以待分析。
根据厂商推荐的规程，通过ELISA，使用购自Biosource的人Aβ40和Aβ42荧光ELISA试剂盒(Cat.No.89-344和89-348)，评价血浆和脑样本中的Aβ水平。简言之，将样品于室温下解冻，于80℃超声处理15分钟(用于脑组织匀浆的超声处理；对血浆样品不经超声处理)并于冰上保持。使用100μl稀释的样品，将Aβ肽截留于板上，在不震摇下，于4℃温育过夜。抽吸样品，用得自Biosource ELISA试剂盒的洗涤缓冲液洗涤各孔4次。加入抗-Aβ40或抗-Aβ42兔多克隆抗血清(对Aβ40或Aβ42肽特异性的)(100μl)，于室温、震摇下，将培养板温育2小时。抽吸各孔，洗涤4次后加入100μl碱性磷酸酶标记的抗-兔抗体，于室温、震摇下温育2小时。然后将各板洗涤5次，将荧光底物(100μl)加入培养板中。于室温下将板温育35分钟，于460nm激发波长和560nm的发射波长，使用滴定板读出仪读数。
根据化合物调节血浆和脑中Aβ肽水平以及脑中可溶性/不溶性水平的能力对它们评分。在治疗动物的血浆和脑中观察到的Aβ水平将采用得自对照组的值使之正态化，并根据药理学作用的强度排序。
长期
使如同短期治疗中使用的那些转基因小鼠(TgCRND8)，过度表达带有瑞典和印地安突变的人APP基因，导致高水平的淀粉样蛋白肽产生和脑淀粉样变性的早发性的、进行性发展。与Aβ40相比，高水平的Aβ肽和相对过于丰富的Aβ42被认为是与观察到的严重的、早期退行性病理学相关的。淀粉样蛋白沉积、营养障碍性神经炎的出现，和认知缺损的模式已在转基因小鼠品系中得到充分证实。这些小鼠的脑中Aβ肽水平随着动物的年龄而显著增加。9和17周龄之间的小鼠的总淀粉样蛋白肽水平由～1.6×105pg/g脑增加至～3.8×106。
虽然在该模型中淀粉样蛋白的早期沉积允许在相对短的时间框内快速检测化合物，该模型和高水平的Aβ肽的攻击性使得长期治疗的评估成为更困难的任务。
将研究本发明的化合物对转基因小鼠(TgCRND8，表达人淀粉样蛋白前体蛋白(hAPP))脑淀粉样蛋白沉积和血浆和脑中β-淀粉样蛋白(Aβ)水平的长期治疗效果。这些化合物将给予4、8或16周，疗程结束后，将测定TgCRND8动物血浆和脑中的Aβ肽水平。稳态药动学分布也可使用血浆样品评估。本研究的目标是评价所述化合物调节转基因小鼠的阿尔茨海默氏病(AD)模型中血浆和脑中淀粉样蛋白发生过程进行的功效。
方法
每日皮下或口服给予雄性和雌性转基因小鼠合适的化合物4、8或16周。9±1周龄基线动物将用于在治疗开始时测定幼稚转基因动物的脑淀粉样蛋白沉淀和血浆和脑中Aβ水平。
9周龄(±1周)动物起初每日接受它们各自的治疗4、8或16周。对照组将仅接受水或甲基纤维素。在治疗期结束后，收集血浆和灌注的脑用于Aβ水平的定量。
收集样本，如同在上文短期治疗研究中所述测量Aβ水平。根据化合物调节血浆和脑中Aβ肽水平以及脑中可溶性/不溶性水平的能力对它们评分。在治疗动物的血浆和脑中观察到的Aβ水平将与对照组的水平对比，并根据药理学作用的强度排序。

Claims (39)

1.一种式I化合物或其药学上可接受的盐、酯或前药：
A-Y-Q
其中：
Q为血脑屏障转运介质；
Y为直接键或连接基团；
A选自氢、烷基、烷氧基、链烯基、链烯基氧基、炔基、炔基氧基、碳环基、杂环基、二环基、芳基、杂芳基、稠环芳基或杂芳基、芳氧基、芳基烷基、芳基烷氧基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、噻唑基、三唑基、咪唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、R4-S-CH2-、
Figure A2005800467040002C1
R4-O-CH2-，和
Figure A2005800467040002C2
其各自可任选被取代；和
R4和R5与氮原子一起形成5或6元杂环，或各自独立选自氢、烷基、烷氧基、链烯基、链烯基氧基、炔基、炔基氧基、环烷基、芳基、芳氧基、芳基烷基、芳基烷氧基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、噻唑基、三唑基、咪唑基、苯并噻唑基和苯并咪唑基，其各自可任选被取代。
2.权利要求1的化合物，其中Q为大的中性氨基酸部分或其类似物。
3.权利要求1的化合物，其中所述化合物具有式(II)：
Figure A2005800467040002C3
其中：
X选自氧、氮和硫；
Y为直接键或连接基团；
Z1、Z2、Z3各自独立选自C、CH、CH2、P、N、NH、S和不存在；
R1和R2独立为不存在或选自氢、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳基、芳基烷基和酰基；
R3选自氢、烷基、芳基、酰氨基、芳基酰氨基、烷基羰基、芳基羰基、芳基氨基羰基、烷氧基羰基、烷磺酰基、芳烃磺酰基、环烷基磺酰基和杂芳烃磺酰基，其各自可任选被取代；
A选自氢、烷基、烷氧基、链烯基、链烯基氧基、炔基、炔基氧基、碳环基、杂环基、二环基、芳基、杂芳基、稠环芳基或杂芳基、芳氧基、芳基烷基、芳基烷氧基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、噻唑基、三唑基、咪唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、R4-S-CH2-、
Figure A2005800467040003C1
R4-O-CH2-，和
Figure A2005800467040003C2
其各自可任选被取代；和
R4和R5与氮原子一起形成5或6元杂环或各自独立选自氢、烷基、烷氧基、链烯基、链烯基氧基、炔基、炔基氧基、环烷基、芳基、芳氧基、芳基烷基、芳基烷氧基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、噻唑基、三唑基、咪唑基、苯并噻唑基和苯并咪唑基，其各自可任选被取代；
或其药学上可接受的盐、酯或前药。
4.权利要求3的化合物，其中X选自氧和氮。
5.权利要求3的化合物，其中Z1、Z2和Z3各自独立为N、C或CH。
6.权利要求3的化合物，其中Y为直接键。
7.权利要求3的化合物，其中Y为选自以下的连接基团：二硫键、醚键、硫醚键、亚烷基或亚烯基键、氨基或肼基键、酯基键、硫代酸酯键、酰胺键、酸-不稳定键，和席夫碱键。
8.权利要求3的化合物，其中R1和R2各自独立不存在或为氢。
9.权利要求3的化合物，其中R3选自氢、芳基氨基、芳基氨基羰基和芳烃磺酰基，其各自可任选被取代。
10.权利要求3的化合物，其中每个A独立选自R4-S-CH2-、
Figure A2005800467040004C1
R4-O-CH2，和
Figure A2005800467040004C2
，其各自可任选被取代。
11.权利要求3的化合物，其中R4和R5各自独立选自环烷基、芳基、芳氧基、芳基烷基、芳基烷氧基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、噻唑基、三唑基、咪唑基、苯并噻唑基和苯并咪唑基，其各自可任选被取代。
12.权利要求3的化合物，其中R4和R5与氮原子一起形成被一个或多个另外的杂原子任选间断的6元环。
13.式(II)的化合物，其中所述化合物为选自表1的化合物中的至少一个化合物，及其药学上可接受的盐、酯和前药。
14.式(II)的化合物，其中所述化合物为选自表2的化合物中的至少一个化合物，及其药学上可接受的盐、酯和前药。
15.权利要求1-14中任一项的化合物，其中所述化合物不是表3的化合物。
16.根据权利要求1-15中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、酯或前药在制备治疗或预防CNS疾病或淀粉样蛋白相关疾病的药物中的用途。
17.根据权利要求1-15中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、酯或前药在制备用于治疗或预防阿尔茨海默氏病或淀粉样蛋白相关疾病的药物中的用途。
18.一种用于治疗或预防CNS疾病或淀粉样蛋白相关疾病的药用组合物，它包含根据权利要求1-15中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、酯或前药。
19.一种药用组合物，它包含根据权利要求1-15中任一项的化合物或其药学上可接受的盐、酯或前药。
20.权利要求18-19中任一项的药用组合物，它还包含增加所述化合物的脑生物可利用率的化合物。
21.权利要求20的药用组合物，其中增加所述化合物的脑生物可利用率的化合物为促进渗透血脑屏障的化合物。
22.权利要求21的药用组合物，其中所述促进渗透血脑屏障的的药物为L-精氨酸。
23.一种用于治疗CNS疾病或淀粉样蛋白相关疾病的药剂盒，它包含权利要求1-15中任一项的或在表中描述的化合物，或其药学上可接受的盐、酯或前药，以及用于本发明方法的说明书。
24.一种在患者中治疗或预防CNS疾病或淀粉样蛋白相关疾病的方法，它包括给予有需要的患者有效治疗或预防CNS紊乱或淀粉样蛋白相关疾病的量的权利要求1-15中任一项的或在表中描述的化合物，或其药学上可接受的盐、酯或前药。
25.根据权利要求24的方法，其中淀粉样蛋白原纤维形成或沉积、神经变性或细胞毒性在给予所述化合物后被减轻或抑制。
26.根据权利要求24或25的方法，其中所述患者为人。
27.一种在患者中治疗阿尔茨海默氏病的方法，它包括给予患者有效量的权利要求1-15中任一项的或在表中描述的治疗化合物，或其药学上可接受的盐、酯或前药，以便治疗阿尔茨海默氏病。
28.一种治疗患有淀粉样蛋白沉积的患者的Aβ-相关疾病的方法，它包括给予所述患者有效量的权利要求1-15中任一项的或在表中描述的治疗化合物，或其药学上可接受的盐、酯或前药，以便治疗Aβ-相关疾病。
29.根据权利要求24-28中任一项的方法，其中所述治疗化合物经口服给予。
30.根据权利要求24-29中任一项的方法，其中所述治疗化合物在药学上可接受的溶媒中给予。
31.前述方法权利要求中任一项的方法，其中所述药用组合物治疗性地或预防性地给予患者。
32.前述方法权利要求中任一项的方法，其中所述淀粉样蛋白相关疾病通过减轻或预防炎症来治疗或预防。
33.前述方法权利要求中任一项的方法，其中所述淀粉样蛋白相关疾病通过抑制淀粉样蛋白沉积来治疗或预防。
34.一种预防、减慢，或中止疾病发展的方法，它包括给予患者有效量的权利要求1-15中任一项的或在表中描述的化合物，或其药学上可接受的盐、酯或前药，以便预防、减慢，或中止所述疾病的发展。
35.权利要求24-34中任一项的方法，其中所述患者患有阿尔茨海默氏病、轻度认知损害或脑淀粉样蛋白血管病，以及给药后可稳定认知功能，预防认知功能的进一步减退，或预防、减慢，或中止所述患者中出现的疾病的发展。
36.一种双功能化合物，它包含BBB转运介质和用于治疗CNS紊乱或淀粉样蛋白相关疾病的部分，或其药学上可接受的盐。
37.权利要求36的化合物，其中所述BBB转运蛋白介质为大的中性氨基酸或大的中性氨基酸类似物。
38.一种治疗患者CNS紊乱或淀粉样蛋白相关疾病的方法，它包括：
联合给予权利要求1-15中任一项的或在表中描述的化合物以及促进渗透血脑屏障的药物，以便治疗CNS紊乱或淀粉样蛋白相关疾病。
39.权利要求38的方法，其中所述促进渗透血脑屏障的药物为L-精氨酸。
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