DE69433015T2

DE69433015T2 - Neue Enzyme und Prodrugs für ADEPT

Info

Publication number: DE69433015T2
Application number: DE69433015T
Authority: DE
Inventors: Keith Gary SMITH; Andrew Todd BLUMENKOPF; Michael Cory
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1993-11-12
Filing date: 1994-11-11
Publication date: 2004-06-09
Anticipated expiration: 2014-11-12
Also published as: CA2176024A1; ES2204935T3; AU8148894A; ZA948987B; ATE246516T1; IL111601A0; AU688412B2; MY114140A; WO1995013095A3; DK0728018T3; EP0728018B1; NZ276137A; EP0728018A1; US6140100A; DE69433015D1; JPH09507834A; GB9323429D0; WO1995013095A2; US6319702B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verbesserungen in der gezielten Enzym-Prodrug-Therapie, einschließlich Antikörper-gerichteter Enzym-Prodrug-Therapie, (ADEPT), insbesondere betrifft sie neue Enzyme und Prodrugs zu Verwendung in ADEPT.
In der Therapie bestimmter Zustände ist es bevorzugt, daß ein Arzneistoff an eine besondere zelluläre Unterpopulation übertragen wird. Z.B. ist die Verwendung von Arzneistoffen in der Behandlung von Krebs durch die Unfähigkeit des cytotoxischen Arzneistoffs beschränkt, zwischen Zellen, die eine normale Zellteilung aufweisen, und denjenigen, die eine neoplastische Teilung aufweisen, zu unterscheiden. Daher ist die Therapie nicht in einem klinisch akzeptablen Ausmaß ausgerichtet, und gesunde Zellen werden dem Cytotoxin ausgesetzt. Die Konjugation eines Arzneistoffs an einen Antikörper, bevorzugt einen monoklonalen Antikörper (mAb), erlaubt die Ausrichtung des Arzneistoffs auf eine besondere zelluläre Unterpopulation, die die antigene Determinante exprimiert, an die der Targeting-Antikörper. Jedoch haben Faktoren wie die Unfähigkeit des Konjugats, das relevante Gewebe zu durchdingen, eine schlechte Freisetzung des Arzneistoffs aus dem Antigen-gebundenen Konjugat und die der Arzneistoffmenge, die durch die Anzahl der verfügbaren Antikörper-Bindungsstellen übertragen werden kann, auferlegte Beschränkung die Wirksamkeit dieses Ansatzes eingeschränkt.
Die Vermeidung solcher Beschränkungen führte zum Konzept des Ausrichtens ("Targeting") von Konjugaten aus Antikörpern und Enzymen, die relativ nicht-cytototoxische "Prodrugs" zu Cytotoxinen mit geringem Molekulargewicht an der Antikörper-Bindungsstelle umwandeln können. Dieses allgemeine Konzept wurde von Rose in der europäischen Patentanmeldung 84302218.7 offenbart. Bagshawe und Mitarbeiter haben auf das Konzept als ADEPT, Antibody Directed Enzyme Prodrug Therapy, verwiesen (K.D. Bagshawe et al., Br. J. Cancer [1987] 56, 531-532, K.D. Bagshawe et al., Br. J. Cancer [1988] 50, 700–703 und WO 90/10140). Auf diese Weise konnte ein Konjugat eine proportional größere Arzneistoffmenge am Zielort durch wiederholte Durchläufe der enzymatischen Katalyse der Prodrug-Aktivierung erzeugen.
EP 382 411 beschreibt ADEPT, worin ein Prodrug zu einem cytotoxischen Mittel durch Enzyme umgewandelt werden kann, die beta-Lactamasen, isoliert aus verschiedenen Mikroorganismen, L-Pyroglutamataminopeptidase, beta-Galactosidase, D-Aminosäurepeptidase, Isoenzyme der alkalischen Phosphatase und verschiedene Carboxypeptidasen einschließen.
WO 91/11201 beschreibt ADEPT, worin ein Arzneistoff enzymatisch zur Erzeugung von Cyanid durch β-Glycosidasen oder β-Glucosidasen, allgemein pflanzlichen Ursprungs, gespalten werden kann.
EP 302 473 beschreibt ADEPT, worin das Enzym alkalische Phosphatase verwendet werden kann, um neue Prodrugs von Mitomycin zu spalten, Penicillin-V-Amidase verwendet werden kann, um neue Prodrugs von Adriamycin zu spalten, oder Cytosindesaminase mit dem Prodrug 5-Fluorocytosin verwendet werden kann.
EP 484 870 beschreibt ADEPT, worin β-Lactamase verwendet werden kann, um einen Cephalosporin-Prodrug zu aktivieren, um ein cytotoxisches Stickstofflost zu liefern.
WO 88/07378 beschreibt ADEPT, worin Benzoesäure-Stickstofflost-Glutamide zum Stickstofflost unter der Wirkung von Carboxypeptidasen umgewandelt werden können.
K.S. Vitols et al., Pteridines 3, [1992], 125–126, offenbart eine Anzahl von MTX-Aminosäure-Prodrugs, die durch Carboxypeptidase-mAb-Konjugate als Teil von ADEPT aktiviert werden können.
WO 91/09134 offenbart bispezifische Hybrid-mAbs zur Verwendung in ADEPT, worin der mAb Spezifitäten gegen sowohl menschliche Krebszell-Antigene als auch ein Prodrug-aktivierendes Enzym hat.
Weitere zu berücksichtigende Dokumente sind EP-A-0 423 818 und EP-A-0 633 029 (wobei letzteres nur gemäß Artikel 54(3) EPÜ relevant ist).
Alle zuvor offenbarten Methoden von ADEPT können in zwei Kategorien unterteilt werden: Diejenigen, die menschliche Enzyme einsetzen, und diejenigen, die nicht-menschliche (z.B. bakterielle) Enzyme einsetzen, um den relevanten Prodrug zu aktivieren. Beide Strategien behalten inhärente Probleme, die ihr Potential zur Bereitstellung einer wirksamen Therapie beschränken. Die Verwendung eines menschlichen Enzyms führt zur Instabilität des assoziierten Prodrugs in vivo, da es an Stellen aktiviert werden kann, die entfernt vom Zielort sind, wo die endogene menschliche enzymatische Aktivität natürlicherweise auftreten kann. Offensichtlich wird dies ebenfalls die höchst unerwünschte Wirkung der Erzeugung potentiell cytotoxischer Verbindungen in nicht-abgezielten Gebieten des Körpers mit möglicherweise tödlichen Folgen haben. Die Verwendung eines nichtmenschlichen Enzyms erlaubt es dem assoziierten Prodrug, der nur durch die nicht-menschliche enzymatische Aktivität aktiviert wird, die Aktivierung durch endogene Enzyme zu vermeiden und somit stabil in vivo zu verbleiben, bis er zum Arzneistoff am Zielort umgewandelt wird. Jedoch kann ein solches nicht-menschliches Enzym eine Immunreaktion hervorrufen, wenn es in vivo eingeführt wird, und gegen das Enzym erzeugte Antikörper werden seine Fähigkeit einschränken oder zerstören, den Prodrug zu aktivieren.
WO 90/07929 identifiziert das Desideratum einer nicht-endogenen katalytischen Aktivität, die durch ein nicht-immunogenes Enzym bereitgestellt wird, aber lehrt nur, daß dies durch die Verwendung von "genetisch konservativen" Enzymen oder denjenigen aus einer "genetisch ähnlichen Art" erreicht werden kann. Jedoch wird nicht gelehrt, wie dies erreicht werden könnte.
Es wurde jetzt gefunden, daß der scheinbare Konflikt, der aus dem Bedarf entsteht, einen Prodrug bereitzustellen, der stabil in vivo ist und dennoch durch ein nicht-immunogenes Enzym aktiviert wird, durch die Erzeugung eines mutierten Säugetierenzyms gelöst werden kann, das die katalytische Aktivität beibehält, aber eine neue Substratspezifität besitzt. Der assoziierte Prodrug kann durch die katalytische Aktivität des mutierten Enzyms aktiviert werden, aber da die Substratspezifität des mutierten Enzyms nicht eine natürlich auftretende ist, verbleibt der Prodrug in vivo stabil, bis er am Zielort zum Arzneistoff umgewandelt wird. Die Fähigkeit, ein nicht-immunogenes Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwenden, stellt den weiteren Vorteil bereit, daß wiederholte Durchläufe der Therapie verabreicht werden können. Dies ist im Gegensatz zu bekannten Verfahren für ADEPT, in denen die anfängliche Einführung des Enzyms in das System eine Immunreaktion hervorruft, die wirksam die weitere Behandlung mit dem gleichen Enzym ausschließt, da dieses aus dem Körper durch eine Immunreaktion entfernt werden wird, die während des ersten Durchlaufs der Therapie "vorbereitet" wurde.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft das Ausrichten eines Chemotherapeutikums auf einen spezifischen Zelltyp eines Säugetiers aus (i) einer wirksamen Menge eines Konjugats aus einem Zelltyp-spezifischen Targeting-Molekül mit einem mutierten Säugetierenzym, das eine funktionell inaktive Vorstufe eines Chemotherapeutikums zu seiner aktiven Form katalysieren kann, und (ii) einer wirksamen Menge der funktionell inaktiven Vorstufe des Chemotherapeutikums, das refraktär für endogene Katalyse zum Chemotherapeutikum ist.
Endogene Katalyse impliziert die Umwandlung einer funktionell inaktiven Vorstufe eine Chemotherapeutikums zum Chemotherapeutikum durch Enzyme, die in vivo natürlich vorhanden sind. Offensichtlich wird die am Zielort auftretende Umwandlung, die durch das zielgerichtete mutierte Säugetierenzym katalysiert wird, nicht als endogene Katalyse betrachtet.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung berücksichtigt ein Säugetier, das einer Therapie für einen der nachfolgend beschriebenen Zustände bedarf, die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Verabreichung an das Säugetier einer wirksamen Menge eines Zelltyp-spezifischen Targeting-Moleküls, das mit einem mutierten Säugetierenzym konjugiert ist, das eine funktionell inaktive Vorstufe eines Arzneistoffs zu seiner aktiven Form katalysieren kann, in Kombination mit einer wirksamen Menge einer funktionell inaktiven Vorstufe des Arzneistoffs, der refraktär für endogene Katalyse ist.
Ein mutiertes humanes (menschliches) Enzym wie hier verwendet soll als jedes humane Enzym mit einer Sequenz aufgefaßt werden, die sich um wenigstens eine Aminosäure von der Aminosäuresequenz oder den Aminosäuresequenzen des Enzyms in dem Patienten unterscheidet, auf den die Therapie angewendet wird.
Wie hier verwendet, bezeichnet der Begriff "Zelltyp" jede lokalisierte oder verteilte Population von Zellen, die eine gemeinsame Determinante besitzen, die im wesentlichen selektiv für einen pathologischen Zustand ist, z.B. Krebszellen, die karzinoembryonales Antigen, Tag-72, Mucin oder die durch die Antikörper Ing-1, 17-1A, 323/A3, NR-LU-10, cl74, PR.lA3, MOV18, G250, U36, E48, NR-CO-02 erkannten Antigene oder jedes der anderen in Tabelle 3 gezeigten Antigene exprimieren.
Das Zelltyp-spezifische Targeting-Molekül kann jedes Molekül sein, das nicht-kovalent oder kovalent mit dem mutierten Enzym gebunden oder konjugiert werden kann, und das eine Selektivität in seiner Bindungsaffinität für Zelloberflächenmarker zeigen kann. Solche Moleküle schließen polyklonale und monoklonale Antikörper ein, einschließlich bispezifischer Antikörper, in denen ein Antikörperarm nicht-kovalent das mutierte Enzym bindet und der andere die Zelltyp-spezifische Ausrichtung durchführt (U. Sahin et al., Cancer Research 50, 6944, 1990).
Alternative Targeting-Moleküle, die an mutierte Säugetierenzyme zur Bildung von Konjugaten gebunden werden können, schließen Hormone, Liganden, Cytokine, Antigene, Oligonukleotide und Peptidomimetika ein.
Die Wahl des Targeting-Moleküls wird von der Natur der abzuzielenden Zellen abhängen, aber es wird am wahrscheinlichsten ein Antikörper und bevorzugt ein monoklonaler Antikörper sein, da mAbs die größte Selektivität erzeugen.
Ein "Chemotherapeutikum", das hier ebenfalls als "Arzneistoff" bezeichnet werden kann, schließt jedes Molekül ein, das Aktivität in der Humantherapie aufweist. Solche Chemotherapeutika schließen ein, aber sind nicht beschräkt auf cytostatische oder cytotoxische Verbindungen, die in der Therapie von Krebs oder Virusinfektionen verwendet werden. Eine "funktionell inaktive Vorstufe", die ebenfalls hier als ein "Prodrug" bezeichnet werden kann, schließt jede Verbindung ein, die zu einem Chemotherapeutikum unter der Wirkung eines Enzym umgewandelt werden kann. Solche funktionell inaktiven Vorstufen können typischerweise zu einem Chemotherapeutikum durch enzymatische Spaltung der funktionell inaktiven Vorstufe umgewandelt werden, um ein Chemotherapeutikum und eine "Prodrug-Einheit" zu liefern. Eine solche Umwandlung aus funktionell inaktiver Vorstufe zu Chemotherapeutikum kann ebenfalls durch enzymatisch vermittelte Isomerisierung auftreten.
Eine funktionell inaktive Vorstufe wird allgemein keine klinisch signifikanten Stärken der therapeutischen Aktivität aufweisen, die das Chemotherapeutikum besitzt, in das sie enzymatisch umgewandelt werden kann, wenn sie chemisch derivatisiert wurde, um ihre normale pharmakologische Aktivität zu verringern. Die funktionell inaktive Vorstufe eines cytotoxischen Chemotherapeutikums wird nicht selbst klinisch signifikante Cytotoxizität aufweisen und wird in vivo ausreichend stabil sein, so daß während der Therapie klinisch signifikante Stärken von Cytotoxizität weitgehend nur am Ort der Umwandlung von funktionell inaktiver Vorstufe zu Chemotherapeutikum erzeugt werden, d.h. an der Stelle, auf die das mutierte Enzym ausgerichtet wurde.
Das mutierte Säugetierenzym ist bevorzugt ein Säugetierenzym von Wildtyp mit einer oder mehreren Mutationen, die neue Substratspezifitäten erzeugen, ohne eine signifikante immunologische Reaktion bei Verabreichung während der Humantherapie zu erzeugen. Eine signifikante immunologische Reaktion kann als eine solche betrachtet werden, die die klinische Verwendung eines solchen Enzyms in der Humantherapie ausschließen würde.
Die wesentliche Eigenschaft eines mutierten Säugetierenzyms der vorliegenden Erfindung ist die Gegenwart einer mutierten Substratbindungsstelle, unabhängig von den Aminosäuresequenzen, die diese mutierte Substratbindungsstelle flankieren. Daher ist ein chimäres Enzym, das eine mutierte Substratbindungsstelle und flankierende Sequenzen umfaßt, die aus einem oder mehreren unterschiedlichen Enzymen stammen, in den Definitionen eines mutierten Säugetierenzyms der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Ein solches chimäres Enzym kann durch rekombinante Gentechnik und/oder Protein-Engineering erzeugt werden.
Zur gerichteten Mutagenese geeignete Enzyme schließen beliebige Enzyme ein, die eine katalytische Aktivität besitzen, die einen Prodrug zu einem Arzneistoff umwandeln kann. Solche katalytischen Aktivitäten schließen Transferase, Hydrolase, Oxidoreduktase, Isomerase, Lyase oder Ligase ein. Die gerichtete Mutagenese wird eine neue Substratspezifität erzeugen, aber die beteiligte Klasse der katalytischen Aktivität aufrechterhalten. Z.B. wird eine mutierte Isomerase der vorliegenden Erfindung eine neue Isomeraseaktivität besitzen, die ausreichend unterschiedlich von der Isomerase ist, aus der sie abgeleitet wurde, um sicherzustellen, daß Prodrugs, die für Aktivierung durch die mutierte Isomerase empfänglich sind, im wesentlichen stabil in Gegenwart der Isomerase verbleiben, aus der das mutierte Enzym abgeleitet wurde. Wie gezeigt werden wird, kann diese dramatische Verschiebung der Aktivität durch die Veränderung von nur einem Rest an der katalytischen Stelle erreicht werden. Die Veränderung der minimalen Anzahl von Resten, die zum Erhalt der erforderlichen Verschiebung der Aktivität erforderlich ist, stellt die Kontinuität der Enzymstruktur sicher und vermeidet dadurch negative immunologische Wirkungen, wenn das mutierte Enzym in den Körper eingeführt wird.
Ein bevorzugtes Enzym der vorliegenden ist mutierte Säugetier-Carboxypeptidase A (CPA). Dieses Enzym hat die allgemeine Aktivität der Spaltung von carboxyterminalen aromatischen und aliphatischen Aminosäureresten und wurde in einer Vielfalt von Arten und gewebespezifischen Varianten charakterisiert. Besonders bevorzugte mutierte Carboxypeptidasen schließen Mutanten ein, die aus humaner Pankreas-Carboxypeptidase A1 (L. Catasus et al., Biochem. J. 287, 299–303, 1992), humaner Mastzell-Carboxypeptidase A (D.S. Reynolds et al., J. Clin. Invest. 89, 273–282, 1992) und humaner Pankreas-Carboxypeptidase A2 (9 nachfolgend) stammen. Man wird einsehen, daß die gemeinsame Eigenschaft dieser Carboxypeptidasen die Gegenwart einer CPA-artigen Substrat bindungstasche und einer damit verbundenen enzymatischen Aktivität ist, unabhängig von der Gesamtsequenz oder -struktur des Enzyms, und daß jedes Enzym, das diese CPA-artige Substratbindungstasche besitzt, zugänglich für eine Mutation zu einer mutierten Carboxypeptidase der vorliegenden Erfindung ist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das mutierte Enzym mutierte humane Pankreas-Carboxypeptidase A1 oder A2 (CPA1 oder CPA2) und noch mehr bevorzugt CPA1 oder CPA2, worin Aminosäuresubstitutionen an einem oder mehreren der Reste 203, 210, 242, 244, 250,253, 255, 267, 268, 269 und 305 der in Tabelle 4 gezeigten Aminosäuresequenzen erzeugt werden, die die Wildtyp-(WT)-Sequenzen von CPA1 bzw. CPA2 darstellen. Besonders bevorzugte Kombinationen der Restesubstitution schließen Gly an den Resten 250 und 268 ein, wenn 253 und 255 WT sind; Gly bei 253 und 268, wenn 250 und 255 WT sind; Gly bei 250 und His bei 268, wenn 253 und 255 WT sind; Gly bei 250, wenn 253, 255 und 268 WT sind; Ala bei 255 und His bei 268, wenn 250 und 253 WT sind, und His bei 268, wenn 253, 253 und 255 WT sind. Die am meisten bevorzugten Mutanten sind Carboxypeptidase A1- oder A2-Mutanten, die eine einzelne Substitution umfassen; Gly bei 268.
Das am meisten bevorzugte Konjugat der vorliegenden Erfindung umfaßt alle oder einen Teil eines der mAbs CAMPATH-1H^®, 323/A3 oder ING-1 und wenigstens die substratbindende Domäne eines der mutierten Säugetierenzyme CPA1 oder CPA2 mit Glycin an Aminosäureposition 268 wie in Tabelle 5 beschrieben.
Die menschliche Pankreas-Carboxypeptidase A wird als Präproenzym exprimiert (2), das zu einem Proenzym und anschließend zum reifen Enzym gereift wird. Mutierte Carboxypeptidasen der vorliegenden Erfindung können Mutanten des Präproenzyms, des Proenzyms oder des reifen Enzyms sein, aber sind bevorzugt Mutanten des reifen Enzyms. Diese Mutanten können entweder aus dem Präproenzym, dem Proenzym oder dem reifen Protein stammen, aber stammen bevorzugt aus dem Proenzym. Das mutierte Proenzym (oder Präproenzym) kann dann zum entsprechenden mutierten reifen Enzym durch Standardverfahren wie die Trypsinisierung umgewandelt werden.
Ein mutiertes Enzym der vorliegenden Erfindung kann aus der DNA- oder RNA-Quelle jedes Enzyms, das die zuvor erörterten Aktivitäten besitzt, durch allgemein auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannte Verfahren und insbesondere durch die nachfolgend in den Beispielen beschriebenen Verfahren erzeugt werden.
Die Auswahl der enzymatischen Aktivität und der Primärsequenz eines mutierten Enzyms der vorliegenden Erfindung werden ersichtlich von der Natur des relevanten Prodrugs und, für den Fall eines Prodrugs des Typs, der durch die Entfernung einer Prodrug-Einheit aktiviert wird, von der präzisen Struktur dieser Einheit abhängen.
Die substratbindende oder aktive Stelle des mutierten Enzyms muß, anders als das entsprechende nicht-mutierte Enzym, mit dem Prodrug in einer solchen Weise Wechselwirken können, daß die enzymatische Katalyse erleichtert wird. Die Fähigkeit des mutierten Enzyms, diese Aktivität aufzuweisen, wird von einfachen Veränderungen in der dreidimensionalen Struktur der aktiven Stelle abhängen, was wiederum abhängig von der primären Aminosäuresequenz dieser Region des Proteins ist. Änderungen der Primärsequenz eines Enzym durch Standardtechniken des Protein-Engineering werden die Erzeugung eines entsprechenden mutierten Enzyms zur Verwendung gemäß der Erfindung mit einem entsprechenden Prodrug erlauben.
Neue Prodrugs umfassen diejenigen der Formel (II)
worin
X NH oder O darstellt und
R² CO₂H, SO₃H, SO₂H, OSO₃H, PO₃H₂, OPO₃H₂, C_1-6-Alkyl-verestertes CO₂H, C_1-6-verestertes PO₃H₂, C_4-12-Alkyl, C_4-12-Alkenyl, C_4-12-Alkinyl, verzweigtes C_4-12-Alkyl, C_1-8-Alkyl oder verzweigtes C_3-8-Alkyl; substituiert mit CO₂H, SO₃H, SO₂H, OSO₃H, PO₃H₂, OPO₃H₂, C_1-6-Alkyl-verestertem CO₂H, C_1-6-Alkyl-verestertem PO₃H₂, Hydroxyl, Alkoxy, Halogen, Halogenalkyl, Cyano oder Carboxamid; C_3-8-Cycloalkyl, Aryl oder Heteroaryl darstellt, gegebenenfalls substituiert mit C_1-8-Alkyl, verzweigtem C_3-8-Alkyl, C_3-8-Cycloalkyl, C_3-8-Alkenyl, C_2-6-Alkinyl, C_4-6-Cycloalkenyl, trisubstituiertem Silyl, d.h. (R¹³)(R¹⁴)(R¹⁵)Si, worin R¹³, R¹⁴ und R¹⁵ C_1-6-Alkyl, verzweigtes C_3-6-Alkyl, C_3-6-Cycloalkyl, C_3-6-Alkenyl, C_2-6-Alkinyl, C_4-6-Cycloalkenyl, Aryl oder Heteroaryl sind, und worin R¹³, R¹⁴ und R¹⁵ jeweils die gleiche Gruppe oder unterschiedliche Gruppen sind (z.B. Trimethylsilyl, tert-Butyldimethylsilyl, Cyclohexyldimethylsilyl oder Phenyldimethylsilyl), Aryl, CO₂H, SO₃H, SO₂H, OSO₃H, PO₃H₂, OPO₃H₂, C_1-6-Alkyl-verestertem CO₂H, C_1-6-Alkyl-verestertem PO₃H₂, Carboxamid, Hydroxyl, C_1-6-Alkoxy, C_1-6-Alkylthio, Mercapto, Halogen, Halogenalkyl, Nitro oder Cyano, R^2a und R^2b H, Hydroxy, Mercapto, Alkoxy, Alkylthio, Halogen, Cyano, CO₂H, SO₃H, SO₂H, OSO₃H, PO₃H₂, OPO₃H₂, C_1-6-Alkylverestertes CO₂H, Carboxamid, C_1-6-Alkyl-verestertes PO₃H₂, cyclisches C_2-6 [d.h. R2a und R2b stellen zusammen (CH₂)_2-6 dar], trisubstituiertes Silyl, d.h. (R¹³)(R¹⁴)(R¹⁵)Si, worin R¹³, R¹⁴ und R¹⁵ C_1-6-Alkyl, verzweigtes C_3-6-Alkyl; C_3-6-Cycloalkyl, C_3-6-Alkenyl, C_2-6-Alkinyl, C_4-6-Cycloalkenyl, Aryl oder Heteroaryl sind und worin R¹³, R¹⁴ und R¹⁵ die gleiche Gruppe oder unterschiedliche Gruppen sein könnten, z.B. Trimethylsilyl, tert-Butyldimethylsilyl, Cyclohexyldimethylsilyl oder Phenyldimethylsilyl; oder C_1-6-Alkyl oder verzweigtes C_1-6-Alkyl oder C_1-6-Cycloalkyl oder Aryl oder Heteroaryl darstellen, gegebenenfalls substituiert mit Hydroxy, Mercapto, C_1-6-Alkoxy, C_1-6-Alkylthio, Halogen, Cyano, CO₂H, SO₃H, SO₂H, OSO₃H, Nitro, PO₃H₂, OPO₃H₂, C_1-6-Alkyl-verestertem CO₂H, Carboxamid, C_1-6-Alkylverestertem PO₃H₂, C_1-6-Alkyl, verzweigtem C_1-6-Alkyl, C_1-6-Cycloalkyl, trisubstituiertem Silyl, d.h. (R¹³)(R¹⁴)(R¹⁵)Si, worin R¹³, R¹⁴ und R¹⁵ C_1-6-Alkyl, verzweigtes C_3-6-Alkyl, C_3-6-Cycloalkyl, Aryl oder Heteroaryl sind, und worin R¹³, R¹⁴ und R¹⁵ die gleiche Gruppe oder unterschiedliche Gruppen sein könnten, z.B. Trimethylsilyl, tert-Butyldimethylsilyl oder Phenyldimethylsilyl; mit der Maßgabe, daß R^2a und R^2b nicht beide Hydroxy oder Mercapto sind;
F eine Einheit der Formel (IV) umfaßt:
worin R¹ eine Gruppe darstellt, die der Seitenkette einer beliebigen α-Aminosäure entspricht, z.B. H, C_1-6-Alkyl, C_1-6-Alkenyl, C_1-6-Alkinyl, gegebenenfalls substituiert mit CO₂H, C_1-6-Alkyl-verestertes CO₂H, OPO₃, PO₃H₂, C_1-6-Alkyl-verestertes PO₃H₂, Halogen, Hydroxy, Carboxamid, Amino, gegebenenfalls substituiert mit C_1-6-Alkyl, Cyano oder Nitro,
E
worin n = 3-6 ist, oder
darstellt, von denen jedes gegebenenfalls mit einem oder mehreren aus Hydroxy, einem oder mehreren aus Alkoxyl, Halogen oder C_1-6-Alkyl substituiert sein kann, gegebenenfalls substituiert mit einem oder mehreren aus Hydroxy, C_1-6-Alkoxy oder Halogen;
D -CH₂-CH(R³)-, -CH₂-NR³-, -NR³-CH₂-, -CH₂S- oder -CH₂O- darstellt, worin R³ H, C_1-6-Alkyl, Allyl oder Propargyl ist, gegebenenfalls substituiert mit einem oder mehreren aus C_1-6-Alkoxy, Halogen, Hydroxy oder Cyano; und
B
darstellt, worin
R⁴ H, verzweigtes C_3-6-Alkyl, C_3-6-Cycloalkyl oder C_1-6-Alkyl darstellt;
R⁵ C_1-6-Alkyl, verzweigtes C_3-6-Alkyl, C_3-6-Cycloalkyl oder Amino darstellt (gegebenenfalls substituiert mit C_1-6-Alkyl, C_1-6-Alkanoyl oder Benzyl);
R⁶ H, C_1-6-Alkyl, verzweigtes C_3-6-Alkyl, C_3-6-Cycloalkyl, Amino (gegebenenfalls substituiert mit C_1-6-Alkyl, C_1-6-Alkanoyl oder Benzyl), C_1-6-Alkoxyl oder C_1-6-Alkylthio darstellt; und
R⁷ H, C_1-6-Alkyl, verzweigtes C_3-6-Alkyl, C_3-6-Cycloalkyl, Halogen-C_1-6-alkyl oder Halogen darstellt;
und Salze, N-Oxide, Solvate und physiologisch funktionelle Derivate davon; mit der Maßgabe, daß die folgenden Verbindungen nicht in der Definition neuer Prodrugs eingeschlossen sind, obwohl die Verwendung dieser Verbindungen in der Therapie eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bildet:
N-(N-(4-(((2-Amino-3,4-dihydro-4-oxo-6-chinazolinyl)methyl)(2-propinyl)amino)benzoyl)-L-glutam-1-yl)-L-glutaminsäure,
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-L-glutaminsäure,
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-L-asparaginsäure,
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-L-phenylalanin,
4-Bis(2-chlorethyl)amino)phenylalanylphenylalanin und
4-Bis(2-chlorethyl)amino)phenylalanyl-3,5-dimethyl-4-methoxyphenylalanin.
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Prodrugs ist X NH;
R² ist C_3-8-Cycloalkyl oder Aryl, substituiert mit C_1-8-Alkyl, C_3-8-Cycloalkyl, verzweigtem C_3-9-Alkyl oder trisubstituiertem Silyl, d.h. (R¹³)(R¹⁴)(R¹⁵)Si, worin R¹³, R¹⁴ und R¹⁵ C_1-6-Alkyl, verzweigtes C_3-6-Alkyl, C_3-6-Cycloalkyl, Aryl oder Heteroaryl sind, und worin R¹³, R¹⁴ und R¹⁵ jeweils die gleiche Gruppe oder unterschiedliche Gruppen sind (z.B. Trimethylsilyl, tert-Butyldimethylsilyl, Cyclohexyldimethylsilyl oder Phenyldimethylsilyl);
R^2a und R^2b sind nicht beide H;
R¹ ist H, C_1-6-Alkyl, CH₂CO₂H, CH₂CH₂CO₂H oder CH₂CH₂CH₂NH₂;
E ist
D ist -CH₂NH-, -CH₂N(CH₃)-, -CH₂N(CH₂C≡CH)-, -CH₂CH₂- oder -CH₂-CH(C₂H₅)-; und
B ist
und Salze, N-Oxode, Solvate und physiologisch funktionelle Derivate davon.
In der am meisten bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäße Prodrugs ist X NH;
R² ist Phenyl oder para-Hydroxyphenyl, substituiert mit Cyclopentyl, Cyclobutyl oder tert-Butyl. Die Cyclopentyl-, Cyclobutyl- und tert-Butyl-Gruppen können beide entweder ortho- oder meta- sein, aber sind bevorzugt meta-,
R^2a und R^2b sind H;
R¹ ist CH₂CH₂CO₂H;
E ist
D ist -CH₂N(CH₃)-; und
B ist
und Salze, N-Oxide, Solvate und physiologisch funktionelle Derivate davon.
Wenn chirale Zentren der Prodrugs wie oben definiert vorhanden sind, können sie unabhängig jeweils entweder in der S- oder R-Konfiguration sein oder können eine Mischung der S- und R-Konfiguration sein. Bevorzugt sind sie in der S-Konfiguration für "F" und für das zu X benachbarte chirale Kohlenstoffatom der Formel (II).
Ein bevorzugter Prodrug zur erfindungsgemäßen Verwendung ist ein Prodrug des cytotoxischen Mittels Melphalan (GB 750 155), das kommerziell erhältlich unter der Bezeichnung Alkeran (T.M. The Wellcome Foundation Limited) ist und die chemische Bezeichnung 4-[Bis(2-chlorethyl)amino]-1-phenylalanin hat. Erfindungsgemäße Prodrugs von Melphalan haben die allgemeine Formel
worin R², R^2a, R^2b und X wie hier definiert sind.
Die folgenden sind besonders bevorzugte neue erfindungsgemäße Prodrugs:
N-((S)-4-Carboxy-2-(5-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(F)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-1-oxo-2-isoindolinyl)butanoyl)-L-phenylalanin,
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-2-cyclopentyl-L-phenylalanin,
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalanin,
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyljmethylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclobutyl-L-phenylalanin,
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-trimethylsilyl-L-phenylalanin,
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-tert-butyl-L-phenylalanin,
N-(4-((3-(2,4-Diamino-1,6-dihydro-6-oxo-5-pyrimidinyl)propyl)amino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalanin,
N-(4-(((1,2-Dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(F)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalanin,
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)-methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-tyrosin,
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3,5-diiod-L-tyrosin,
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-2-cyclopentyl-L-tyrosin,
(S)-3-(3-Cyclopentyl-4-hydroxyphenyl)-2-((N-4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl)oxy)propionsäure,
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-tert-butyl-L-tyrosin
und Salze, N-Oxide, Solvate und physiologisch funktionelle Derivate davon.
Der am meisten bevorzugte erfindungsgemäße Prodrug ist:
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-tyrosin.
Alle chiralen Zentren jeder der der chemischen Strukturen von hier beschriebenen Verbindungen können in der R- und S-Konfiguration sein. Obwohl diese chiralen Zentren der nachfolgend dargestellten chemischen Strukturen in der bevorzugten S-Konfiguration wiedergegeben sind, ist es selbstverständlich, daß die entsprechenden chemischen Strukturen mit den chiralen Zentren in der R-Konfiguration sowie Enantiomere und diastereomere Mischungen dieser Verbindungen ebenfalls als Teil der Erfindung betrachtet werden.
Ein Prodrug der Formel (V), worin B, D und E wie in Formel (III) definiert sind und X, R¹ und R² wie in den Formeln (IV) und (II) definiert
kann hergestellt werden durch Hydrolyse eines Esters der Formel (VI);
worin R⁸ Alkyl, verzweigtes Alkyl oder eine Cycloalkyl-Gruppe ist, wie Methyl, Ethyl, tert-Butyl oder Cyclohexyl; oder eine Aryl-Gruppe, wie Phenyl, 2,6-Dimethylphenyl; Benzyl (gegebenenfalls substituiert mit Halogen, Alkoxy oder Alkyl-Gruppen wie Methyl oder tert-Butyl); oder 9-Fluorenylmethyl (Fm); normalerweise in Gegenwart einer Base, wie NaOH, LiOH; oder für den Fall, daß R8 Fm ist, Diethylamin oder Piperidin; oder in Gegenwart einer Säure wie HCl oder Trifluoressigsäure; in einem Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch wie THF, Nitromethan oder THF:H₂O; bei einer Temperatur von z.B. 0°C bis zur Rückflußtemperatur, zweckmäßig bei Raumtemperatur; oder in Gegenwart einer Säure wie HCl oder Trifluoressigsäure
in einem Lösungsmittel wie THF oder Nitromethan; bei einer Temperatur von z.B. 0°C bis zur Rückflußtemperatur, zweckmäßig bei Raumtemperatur; oder durch Hydrogenolyse, wenn R⁸ 9-Fluorenylmethyl (Fm) oder Benzyl ist, gegebenenfalls substituiert mit Alkyl-Gruppen wie Methyl oder tert-Butyl, unter Verwendung von Wasserstoff bei Umgebungs- oder erhöhtem Druck, z.B. zwischen 1,75 kg/cm² und 7,0 kg/cm², zweckmäßig bei 3,5 kg/cm², in Gegenwart eines Katalysators wie Palladium-auf-Kohlenstoff, in einem polaren Lösungsmittel, z.B. Methanol oder Ethanol, oder einer Mischung aus Methanol Dichlormethan, bei Umgebungstemperatur, oder durch Verfahren, die jedem Fachmann bekannt sind, wie durch diejenigen Verfahren, die beschrieben werden in P.N. Rylander, Catalytic Hydrogenation in Organic Syntheses, Academic Press, New ,York, 1979, oder in P.N. Rylander, Hydrogenation Methods, Academic Press, London, 1985, oder in M. Bodanszky et al., The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag: Berlin, 1984, die hier durch Verweis eingeführt werden; oder durch Oxidation, wenn R⁸ Phenyl oder Benzyl ist, substituiert mit Alkoxy (bevorzugt in der 2-, 4- oder 6-Position des Phenylrings), gegebenenfalls substituiert mit geeigneten Alkyl-Gruppen wie Methyl oder tert-Butyl, in Gegenwart eines geeigneten Oxidationsmittels wie Cer(IV)-ammoniumnitrat oder Dichlordicyanochinon (DDQ) in einem geeigneten Lösungsmittel wie Methanol, Wasser, Dichlormethan oder Kombinationen daraus, durch Verfahren, die jedem Fachmann bekannt sind, wie durch diejenigen Verfahren, die beschrieben werden in C.H.
Heathcock et al., Tetrahedron 1981, 37, 4087; oder durch diejenigen Verfahren, die beschrieben werden in T. W. Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, zweite Auflage, John Wiley & Sons, New York, 1991, die hier durch Verweis angeführt werden; oder wenn R⁸ 2-(Trimethylsilyl)-ethyl ist, durch Reaktion mit einer Quelle eines geeigneten Nukleophils wie Kaliumfluorid oder Tetrabutylammoniumfluorid, wofür Verfahren jedem Fachmann bekannt sind, wie durch diejenigen Verfahren, die beschrieben werden in T.W. Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, zweite Auflage, John Wiley & Sons: New York, 1991, oder in M. Dodanszky et al., The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag: Berlin, 1984, oder in J. Jones, The Chemical Synthesis of Peptides, Clarendon Press: Oxford, England, 1991, die hier durch Verweis eingeführt werden; oder wenn R⁸ eine photoentfernbare Gruppe ist, wie Orthonitrophenyl, durch photolytische Verfahren, die jedem Fachmann bekannt sind, wie durch diejenigen, die beschrieben werden in L.D. Cama et al., J. Am. Chem. Soc., 1978, 100, 8006 oder in V.N.R. Pillai, Synthesis, 1980, 1 oder in V.N.R. Pillai, Org. Photochem. 1987, 9, 225, die hier durch Verweis eingeführt werden. An den Seitenketteen R¹ oder R² vorhandene Ester können in der gleichen Reaktionsmischung hydrolysiert werden oder nicht, die zum Hydrolysieren von R⁸ verwendet wird, abhängig von der Wahl der Ester-Gruppe und den Reaktionsbedingungen.
Ester (VI) können durch Reaktion eines Amins der Formel (VII), worin R¹ wie in Formel (IV) definiert ist, R² und X wie in Formel (II) definiert sind und R⁸ wie in Formel (VI) definiert ist; mit einer Carbonsäure der Formel (VIII) hergestellt werden,
B-D-G-CO₂H (VIII)worin B und D wie hier zuvor definiert sind und G eine Gruppe (IX) -(CH₂)_n- (IX)
worin n 3 bis 7 ist, oder 1,4-Cyclohexyl (X), worin die 1- oder 4-Substituenten entweder in der cis- oder trans-Konfiguration sein können oder Mischungen der zwei Konfigurationen, oder eine aromatische Gruppe darstellt, die aus den folgenden ausgewählt ist:
Die Reaktion der Amine der Formel (VII) mit Carbonsäuren der Formel (VIII) wird in Gegenwart eines Kupplungsmittels durchgeführt; einschließlich, aber nicht beschränkt auf Diethylcyanophosphonat (XI), 1-Ethyl-3-(dimethylaminopropyl)carbodiimid (XII) oder Dicyclohexylcarbodiimid (XIIa), gegebenenfalls in Gegenwart einer aktivierenden Gruppe wie 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT), in einem polaren aprotischen Lösungsmittel, zweckmäßig N,N-Dimethylformamid (DMF) oder N,N-Dimethylpropylenharnstoff (DMPU) bei einer Temperatur von z.B. 0 bis 80°C,
Me₂N-(CH₂)₃-N=C=N-Et (XII)
zweckmäßig bei Raumtemperatur. Alternativ kann ein Ester der Formel (V2) hergestellt werden durch Behandeln einer Mischung aus Carbonsäure (VIII) und einer tertiären Aminbase; wie Triethylamin, Diisopropylethylamin oder N-Methylmorpholin; in einem aprotischen Lösungsmittel wie DMF oder DMPU; bei einer Temperatur von 0 bis 25°C; mit einem Acylierungsmittel wie Isobutylchlorformiat oder Ethylchlorformiat; gefolgt von Zugabe von Amin (VII).
Mehrere der bevorzugten Carbonsäuren (VIII) können von kommerziellen Lieferanten erworben werden, z.B. kann (XIII) von Aldrich Chemical Co. erworben werden; oder können über Literaturverfahren hergestellt werden, z.B. (XIV): J.I. De Graw et al., J. Med. Chem., 1982, 25, 1227; loc. cit. 1986, 29, 1056. (XV): T.R. Jones et al., J. Med. Chem., 1986, 29, 1114; M.G. Nair et al.: loc. cit. 1986, 29, 1754; M. Ghazola et al.: loc. cit. 1986, 29, 1263; S.P. Acharya et al., J. Heterocyclic Chem. 1975, 12, 1283. (XVI): C.J. Barnett et al., Tetrahedron Lett. 1989, 30, 6291. (XVII): V.L. Styles et al., J. Med. Chem., 1990, 33, 561; E.C. Taylor et al., J. Med. Chem. 1992, 32, 1517; und (XV11a) G.M.F. Bisset et al., J. Med. Chem. 1922, 35, 859.
Carbonsäuren der Formel (VIII) können hergestellt werden durch Hydrolyse von Estern der Formel (XVIII), worin B und D wie in Formel (III) definiert sind, G wie in Formel (VIII) definiert ist und R⁹ eine geeignete Gruppe wie Methyl, Ethyl oder tert-Butyl ist; normalerweise in Gegenwart einer geeigneten Base wie NaOH oder LiOH; oder einer geeigneten Säure wie HCl oder Trifluoressigsäure; in einem geeigneten Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch wie THF, Nitromethan oder THF:H₂O; bei einer Temperatur von z.B. 0°C bis zur Rückflußtemperatur, zweckmäßig bei Raumtemperatur. B-D-G-CO₂-R⁹ (XVIII)
Für Prodrugs, worin D in Formel (III) oder in Formel (XVIII) -CH₂-NR³- darstellt, können Ester der Formel (XVIII) hergestellt werden durch:
(a) Reaktion einer Verbindung der Formel (XIX), worin G wie in Formel (VIII) definiert ist, R⁹ wie in Formel (XVIII) definiert ist und R¹⁰ NHR³ darstellt, worin R³ wie in Formel (III) definiert ist: R¹⁰-G-CO₂R⁹ (XIX)und einer Verbindung der Formel (XX) K-R¹¹ (XX)worin R¹¹ eine Aldehyd-Gruppe oder Cyano-Gruppe ist und K eine heterocyclische Gruppe ist, wie diejenigen, die als B in Formel (III) definiert sind, oder eine Gruppe wie (XXI), worin Z=O ist, oder eine Gruppe wie als B in Formel (III) definiert oder eine Gruppe wie in (XXI), worin Z=O ist, substituiert mit einer geeigneten Schutzgruppe, um einen geeigneteren Reaktanden bereitzustellen, wobei geeignete Gruppen einschließen, aber nicht beschränkt sind auf N-Pivaloyl, N-Benzoyl, N-Carbobenzyloxy (N-cbz), oder N-tert-Butoxycarbonyl (N-t-BOC). Solche Schutzgruppen können in einer späteren Stufe in der Synthese nach Bedarf unter Verwendung von Standardverfahren entfernt werden, die jedem Fachmann bekannt sind, wie durch diejenigen Verfahren, die beschrieben werden in T.W. Green et al., Protective Groups in Organic Synthesis, zweite Auflage, John Wiley & Sons: New York, 1991, das hier durch Verweis eingeführt wird.
Ester der Formel (XVIII) werden durch Reaktion von (XVI) und (XX) in einem Lösungsmittel wie THF, DMPU, DMF, Ethanol oder Essigsäure bei einer Temperatur zwischen 25 und 100°C hergestellt, gegebenenfalls unter Entfernung von Wasser während des Reaktionsverlaufes, gefolgt von Reduktion mit Natriumcyanoborhydrid oder Wasserstoffgas in Gegenwart eines geeigneten Katalysators wie Raney-Nickel unter Verwendung von Standardreaktionsbedingungen, die jedem Fachmann bekannt sind.
(b) Reaktion einer Verbindung der Formel (XIX) wie in (a) definiert mit einer Verbindung der Formel (XX), worin K wie in (a) definiert ist, aber R¹¹ als CH₂Y definiert ist, worin Y als Abgangsgruppe wie Chlor, Brom, Iod, Mesyl oder Tosyl definiert ist, in einem geeigneten Lösungsmittel wie THF, in Gegenwart einer Base wie NaHCO₃, Na₂CO₃, K₂CO₃, Triethylamin oder Diiopropylethylamin, bei einer erhöhten Temperatur, z.B. 50 bis 150°C und zweckmäßig 80 bis 120°C.
Für Prodrugs, in denen D in Formel (III) und in Formel (XVIII) -NR³-CH₂- darstellt, können Ester der Formel (XVIII) hergestellt werden durch Reaktion einer Verbindung der Formel (XIX), worin R¹⁰ eine Aldehyd-Gruppe darstellt und G wie in Formel (VIII) definiert ist, und einer Verbindung der Formel (XX), worin K wie in Formel (XX) definiert ist und R¹¹ als HNR³ definiert ist, worin R³ wie in Formel (III) definiert ist, in einem Lösungsmittel wie THF, DMF, DMPU oder Essigsäure bei einer Temperatur zwischen 25 und 100°C, gegebenenfalls unter Entfernung von Wasser während des Reaktionsverlaufes, gefolgt von Reduktion mit Natriumcyanoborhydrid oder Wasserstoffgas in Gegenwart eines geeigneten Katalysators, wie Raney-Nickel.
Für Prodrugs, in denen D in Formel (III) und in Formel (XVIII) -CH₂-O- oder -CH₂S- darstellt, werden Ester der Formel (XVIII) hergestellt durch Reaktion einer Verbindung der Formel (XIX), worin R⁹ wie in Formel (XVIII) definiert ist, G wie in Formel (VIII) definiert ist und R¹⁰ OH oder SH ist; mit einer Verbindung der Formel (XX), worin K wie in Formel (XX) definiert ist und R¹¹ CH₂Y ist, worin Y als Abgangsgruppe wie Chlor, Brom, Iod, Mesyl oder Tosyl definiert ist; in einem geeigneten Lösungsmittel wie DMF, DMPU oder Aceton; in Gegenwart einer Base wie Triethylamin, Düsopropylethylamin, Cäsiumcarbonat, Cäsiumbicarbonat, Natriumcarbonat oder Natriumbicarbonat, bei einer Temperatur von 25 bis 80°C.
Für Prodrugs, in denen D in Formel (III) und in Formel (XVIII) -CH₂CH₂- darstellt, werden Ester der Formel (XVIII) hergestellt durch:

(a) Reaktion einer Verbindung der Formel (XX), worin K wie in Formel (XX) definiert ist und worin R¹¹ CH₂Br ist, mit Triphenylphosphin in einem polaren Lösungsmittel, z.B. einem C_1-4-Alkanol oder Glykol, zweckmäßig Methanol oder Ethanol, normalerweise in Gegenwart einer Base, z.B. mit einem Metallalkoxid, das zweckmäßig aus dem Metall und dem Lösungsmittel gebildet wird, d.h. Natriummethoxid oder Natriumethoxid, bei einer Temperatur von 0°C bis zur Rückflußtemperatur; gefolgt von Zugabe einer Verbindung der Formel (XIX), worin R⁹ wie in Formel (XVIII) definiert ist, G wie in Formel (VIII) definiert ist und R¹⁰ eine Aldehyd-Gruppe ist; gefolgt von Reduktion mit Wasserstoff bei erhöhtem Druck, z.B. zwischen 1,75 kg/cm² und 7,0 kg/cm², zweckmäßig bei 3,5 kg/cm², in Gegenwart eines geeigneten Katalysators wie Palladium-auf-Kohlenstoff, in einem polaren Lösungsmittel, z.B. Methanol oder Ethanol oder einer Mischung aus Methanol und Dichlormethan, bei Umgebungstemperatur.
(b) Reaktion einer Verbindung der Formel (XIX), worin R⁹ wie in Formel (XVIII) definiert ist und G wie in Formel (VIII) definiert ist und R¹⁰ CH₂Br ist, mit Triphenylphosphin in einem polaren Lösungsmittel, z.B. einem C_1-4-Alkanol oder Glykol, zweckmäßig Methanol oder Ethanol, normalerweise in Gegenwart einer Base, z.B. mit einem Metallalkoxid, das zweckmäßig aus dem Metall und dem Lösungsmittel gebildet wird, d.h. Natriummethoxid und Natriumethoxid, bei einer Temperatur von 0°C bis zur Rückflußtemperatur; gefolgt von der Zugabe einer Verbindung der Formel (XX), worin K wie in Formel (XX) definiert ist und R¹¹ eine Aldehyd-Gruppe ist; gefolgt von Reduktion mit Wasserstoff bei erhöhtem Druck, z.B. zwischen 1,75 kg/cm² und 7,0 kg/cm², zweckmäßig bei 3,5 kg/cm², in Gegenwart eines geeigneten Katalysators wie Palladium-auf-Kohlenstoff, in einem polaren Lösungsmittel, z.B. Methanol oder Ethanol oder einer Mischung aus Methanol und Dichlormethan, bei Umgebungstemperatur.
(c) Reaktion einer Verbindung der Formel (XX), worin K wie in Formel (XX) definiert ist und R¹¹ Chlor, Brom oder Iod ist; mit einer Verbindung der Formel (XIX), worin R⁹ wie in Formel (XVIII) definiert ist, G wie in Formel (VIII) definiert ist und R¹⁰ eine Acetylen-Gruppe C=CH ist.

Die Reaktion wird in Gegenwart eines Pd(0)-Katalysators, zweckmäßig Tetrakis(triphenylphosphin)palladium; und einer Base wie Triethylamin oder Düsopropylethylamin; in einem polaren aprotischen Lösungsmittel wie DMF oder DMPU; bei einer Temperatur von 25 bis 50°C; gefolgt von Reduktion mit Wasserstoff bei erhöhtem Druck, z.B. zwischen 1,75 kg/cm² und 7,0 kg/cm², zweckmäßig bei 3,5 kg/cm², in Gegenwart eines geeigneten Katalysators wie Palladium-auf-Kohlenstoff, in einem polaren Lösungsmittel, z.B. Methanol oder Ethanol oder eine Mischung aus Methanol und Dichlormethan, bei Umgebungstemperatur durchgeführt.
Für Prodrugs, in denen D in Formel (III) und in Formel (XVIII) -CH₂-CH(R³)- darstellt, worin R³ wie in Formel (III) definiert ist, werden Ester der Formel (XVIII) hergestellt durch Reaktion einer Verbindung der Formel (XX), worin K wie in Formel (XX) definiert ist und worin R¹¹ CH₂Br ist, mit Tributylphosphin oder Triphenylphosphin in einem molaren Lösungsmittel, z.B. einem C_1-4-Alkanol oder Glykol, zweckmäßig Methanol oder Ethanol, normalerweise in Gegenwart einer Base, z.B. mit einem Metallalkoxid, das zweckmäßig aus dem Metall und dem Lösungsmittel gebildet wird, d.h. Natriummethoxid oder Natriumethoxid, oder in einer Lösungsmittel aus Dimethylsulfoxid und einer Base wie Natriumhydrid, bei einer Temperatur von 25 bis 80°C; gefolgt von Zugabe einer Verbindung der Formel (XIX), worin R⁹ wie in Formel (XVIII) definiert ist, G wie in Formel (VIII) definiert ist und R¹⁰ eine Keto-Gruppe -(CO)-R₃ ist, worin R³ wie in Formel (III) definiert ist; anschließendes Rühren der Reaktionsmischung bei einer Temperatur von 25°C bis zur Rückflußtemperatur für einen verlängerten Zeitraum von 4 bis 96 Stunden, zweckmäßig 24 bis 48 Stunden; gefolgt von Reduktion mit Wasserstoff bei erhöhtem Druck z.B. zwischen 1,75 kg/cm² und 7,0 kg/cm², zweckmäßig bei 3,5 kg/cm², in Gegenwart eines geeigneten Katalysators, wie Palladium-auf-Kohlenstoff oder Platinoxid, in einem polaren Lösungsmittel, z.B. Methanol, Ethanol oder Essigsäure.
Verbindungen der Formel (XX), worin K wie oben definiert ist und R11 CH₂Br ist, können unter Verwendung der Methodik hergestellt werden, die den Fachleuten zur Verfügung steht (J.R. Piper et al., J. Org. Chem. 1977, 42, 208; J.R. Piper et al., J. Med. Chem. 1986, 29, 1080; V. Oakes et al., J. Chem. Soc. 1956, 4433; S.P. Acharya et al., J. Heterocyclic Chem. 1975, 12, 1283; O.D. Bird et al., in Pteridine Chemistry, W. Pfleiderer & E.C. Taylor, Hrsg. Pergamon Press, Oxford, 1964, S. 417; J.R. Piper et al., J. Heterocyclic Chem. 1974, 279).
Verbindungen der Formel (XX), worin K wie oben definiert ist und R11 eine Aldehyd-Gruppe ist, können unter Verwendung der Methodik hergestellt werden, die den Fachleuten zur Verfügung steht (E.C. Taylor et al., J. Org. Chem. 1983, 48, 4852; A. Arnold et al., Collect Czech Chem. Commun., 1960, 25, 1318; G.P. Beardsley et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 1986, 1027).
Verbindungen der Formel (XX), worin K wie oben definiert ist und R11 eine Cyano-Gruppe ist, können unter Verwendung der Methodik hergestellt werden, die den Fachleuten zur Verfügung steht (E.F. Elsager et al., Lect. Heterocyclic Chem , 1974, 2, 5–97; J. Davoll et al., J. Chem. Soc. (C), 1970, 997; T.R. Jones, Eur. J. Cancer, 1981, 17, 11; T. Kondo et al., Chem. Lett., 1980, 559).
Verbindungen der Formel (XX), worin K wie oben definiert ist und R11 eine Amino-Gruppe ist, können unter Verwendung der Methodik hergestellt werden, die den Fachleuten zur Verfügung steht (J.B. Hynes et al., J. Med. Chem. 1975, 18, 632, 1191; J. Davoll et al., J. Med. Chem , 1972, 15, 837; R. Bernetti et al., J. Org. Chem , 1962, 27, 2863).
Verbindungen der Formel (XX), worin K wie oben definiert ist und R11 eine Brom-, Chlor- oder Iod-Gruppe ist, können unter Verwendung der Methodik hergestellt werden, die den Fachleuten zur Verfügung steht (E.C. Taylor et al., J. Med. Chem. 1992, 35, 4450; E.C. Taylor et al., J. Org. Chem. 1989, 54, 3618; J.H. Jones et al., J. Med. Chem , 1968, 11, 322).
Carbonsäuren der Formel (VIII), worin A eine Gruppe der Formel (XXI) ist, worin Z=S ist, können aus Carbonsäuren der Formel (VIII), worin C eine Gruppe der Formel (XXI) ist, worin Z=O ist, durch Reaktion mit einem Sulfurierungsmittel wie P₂S₅ in einem Lösungsmittel wie Pyridin bei einer Temperatur zwischen 25°C und der Rückflußtemperatur hergestellt werden.
Verbindungen der Formel (XIX), worin G wie in Formel (VIII) definiert ist, R⁹ wie in Formel (XVIII) definiert ist und R¹⁰ NHR³ ist, worin R³ wie in Formel (III) definiert ist, können aus Verbindungen der Formel (XIX), worin G und R⁹ wie oben definiert sind und R¹⁰ NH₂ ist, durch Reaktion mit einer Verbindung R³-Y, worin Y als Abgangsgruppe wie Chlor, Brom, Iod, Mesyl oder Tosyl definiert ist; in Gegenwart einer geeigneten Base wie 2,6-Lutidin in einem polaren aprotischen Lösungsmittel wie DMF oder Dimethylacetamid bei einer erhöhten Temperatur zwischen 50 und 100°C hergestellt werden.
Verbindungen der Formel (XIX), worin G eine Phenyl- oder Furyl-Gruppe ist, R¹⁰ NH₂ ist und R⁹ wie in Formel (XVIII) definiert ist, können von kommerziellen Lieferanten erhalten werden oder können leicht aus solchen Verbindungen, die von kommerziellen Lieferanten erhältlich sind, unter Verwendung von Verfahren hergestellt werden, die jedem Fachmann bekannt sind. Eine solche bevorzugte Verbindung der Formel (XXII)
kann durch Verfahren hergestellt werden, die von N. Soundararajan und M.S. Platz beschrieben werden (N. Soundararajan et al., J. Org. Chem. 1990, 55, 2034). Eine solche bevorzugte Verbindung hat die Formel (XXIIa) und kann durch Verfahren hergestellt werden, die beschrieben werden in D. Mackay, Can. J. Chem. 1966, 44, 2881; oder H. Paul et al., Arch. Pharm. 1978, 52, 538.
Verbindungen der Formel (XIX), worin G eine Cyclohexyl-Gruppe ist, R¹⁰ NH₂ ist und R⁹ wie in Formel (XVIII) definiert ist, können von kommerziellen Lieferanten erhalten werden oder können unter Verwendung von Standardverfahren, die jedem Fachmann zur Verfügung stehen, leicht hergestellt werden (A. Banfi et al., Synth. Commun. 1989, 19, 1787; R. Krieg et al., J. Prakt. Chem , 1987, 329, 1123; T.P. Johnston et al., J. Med. Chem. 1977, 20, 279).
Verbindungen der Formel (XIX), worin G eine Thienyl-Gruppe ist, R¹⁰ NH₂ ist und R⁹ wie in Formel (XVIII) definiert ist, können durch Methodik hergestellt werden, die jedem Fachmann zur Verfügung steht (C.J. Goddard, J. Heterocyclic Chem , 1991, 28, 17; B. Decroix et al., J. Chem. Res. (S), 1978, 134; H. Paul et al., Arch. Pharm. 1978, 311, 679; D. Mackay, Can. J. Chem. 1966, 44, 2881).
Verbindungen der Formel (XIX), worin G eine Thiazol-Gruppe ist, R¹⁰ NH₂ ist und R⁹ wie in Formel (XVIII) definiert ist, können aus 5-Nitrothiazol-2-carbonsäure (P. Strehlke, Chem. Ber. 1973, 106, 721) unter Verwendung von jedem Fachmann bekannten Veresterungs- und Reduktionsverfahren hergestellt werden.
Verbindungen der Formel (XIX), worin G eine Pyridyl-Gruppe ist, R¹⁰ NH₂ ist und R⁹ wie in Formel (XVIII) definiert ist, können unter Verwendung von Methodik hergestellt werden, die jedem Fachmann zur Verfügung steht (M.I. Dawson et al., J. Med. Chem., 1983, 26, 1282; N. Finch et al., J. Med. Chem. 1978, 21, 1269; G.H. Cooper et al., J. Chem. Soc.(C), 1971, 3257; L.W. Deady et al., Aust. J. Chem , 1971, 24, 385).
Verbindungen der Formel (XIX), worin G eine Pyrimidyl-Gruppe ist, R¹⁰ NH₂ ist und R⁹ wie in Formel (XVIII) definiert ist, können unter Verwendung von Verfahren hergestellt werden, die analog zu denjenigen sind, die beschrieben werden von P.R. Marsham et al. (P.R. Marsham et al., J. Med. Chem , 1991, 34, 1594).
Allgemeine Verfahren zur Synthese von Verbindungen der Formel (VIII) werden in zwei neueren Übersichtsartikeln beschrieben (D.C. Palmer et al., Prog. Med. Chem , 1988, 25, 85; A. Rosowsky, Prog. Med. Chem. 1989, 26, 1). Ester der Formel (VI), worin E als
definiert ist, können durch Reaktion einer Verbindung der Formel (XX), worin R¹¹ CH₂Br ist; und einer Verbindung der Formel (XXIII), worin R¹ wie in Formel (IV) definiert ist, R² und X wie in Formel (II) definiert sind und R⁸ wie in Formel (VI) definiert ist;
in einem polaren Lösungsmittel wie DMF oder DMPU; in Gegenwart einer Base wie Natriumbicarbonat, Cäsiumbicarbonat, Natriumcarbonat oder Cäsiumcarbonat; bei einer erhöhten Temperatur, z.B. 50 bis 100°C, zweckmäßig bei 100°C hergestellt werden. Verbindungen der Formel (XXIII) können aus Verbindungen der Formel (VII) und einer Verbindung der Formel (XXIV) durch Verfahren hergestellt werden, die analog zu denjenigen sind, die beschrieben werden von W. Pendergast et al. (W. Pendergast et al., J. Med. Chem. [1994], 37, S. 838) oder in WO 01/19700, das hier in seiner Gesamtheit durch Verweis eingeführt wird.
Verbindungen der Formel (VII) können aus Verbindungen der Formel (XXV) hergestellt werden, worin R¹ wie in Formel (IV) definiert ist, R² und X wie in Formel (II) definiert sind, R⁸ wie in Formel (VI) definiert ist und R¹² eine geeignete Schutzgruppe wie N-tert-Butoxycarbonyl (N-t-Boc) oder N-Carbobenzyloxy (N-Cbz) darstellt, wofür Verfahren jedem Fachmann bekannt sind, wie durch diejenigen Verfahren, die beschrieben werden in T.W. Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, zweite Auflage, John Wiley & Sons: New York, 1991, das hier durch Verweis eingeführt wird. Verbindungen der Formel (XXV)
können durch eine Reaktion von Carbonsäure der Formel (XXVI) und einer Verbindung der Formel (XXVII), worin X wie in Formel (II) definiert ist, hergestellt werden; für Verbindungen, in denen X NH ist, können Verbindungen der Formel (XXV) durch Reaktion einer Carbonsäure der Formel (XXVI) und eines Amins der Formel (XXVII), worin X NH ist, in Gegenwart eines geeigneten Kupplungsmittels wie 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethyl-carbodiimid oder Dicyclohexylcarbodiimid in Gegenwart einer geeigneten Base wie N-Methylmorpholin, in einem aprotischen Lösungsmittel wie Dichlormethan oder DMF bei 0 bis 50°C oder durch Verfahren hergestellt werden, die jedem Fachmann bekannt sind, wie durch diejenigen Verfahren, die beschrieben werden in M. Bodanszky et al., The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag: Berlin, 1984, oder in J. Jones, The Chemical Synthesis of Peptides, Clarendon Press: Oxford, England, 1991, die hier durch Verweis eingeführt werden.
Dichlormethan oder DMF bei 0 bis 50°C, wofür Verfahren jedem Fachmann bekannt sind, wie durch diejenigen Verfahren, die beschrieben werden in T.W. Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, zweite Auflage, John Wiley & Sons: New York, 1991, die hier durch Verweis eingeführt werden.
Für Verbindungen der Formel (XXV), worin X O ist, können Verbindungen der Formel (XXV) hergestellt werden durch Reaktion einer Carbonsäure der Formel (XXVI) mit einem geeigneten Aktivierungsmittel wie para-Toluol-sulfonylchlorid oder Benzolsulfonylchlorid in einem geeigneten Lösungsmittel wie Pyridin oder Lutidin bei einer Temperatur zwischen 0 und 25°C; gefolgt von Zugabe eines Alkohols der Formel (XXVII), worin X O ist.
Ester der Formel (XXVII), worin X wie in Formel (II) definiert ist, können aus Carbonsäuren der Formel (XXVIII) unter Verwendung von Standardverfahren hergestellt werden, die jedem Fachmann bekannt sind, wie durch diejenigen Verfahren, die beschrieben werden in T.W. Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, zweite Auflage, John Wiley & Sons: New York, 1991, die hier durch Verweis eingeführt werden.
Carbonsäuren der Formel (XXVIII), worin X O ist, können aus Carbonsäuren der Formel (XXVIII), worin X NH ist, durch Verfahren hergestellt werden, die analog zu denjenigen sind, die beschrieben werden von C. Morin et al. (C. Morin et al., Synthesis 1987, 479) und K. Mori et al. (K. Mori et al., Tetrahedron, 1982, 38, 3805).
Carbonsäuren der Formel (XXVIII), worin X NH ist, können aus Verbindungen der Formel (XXIX); worin W eine Abgangsgruppe wie Chlor, Brom, Iod, Mesyl oder Tosyl ist und R² wie in Formel (II) definiert ist; durch Verfahren hergestellt werden, die analog zu denjenigen sind, die beschrieben werden von R.M. Williams (R.M. Williams, Aldrichimica Acta, 1992, 25, 11 und Zitate darin) oder von M.J. O'Donnell et al. (M.J.O'Donnell et al., J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 2353). WCH₂R² (XXIX)
Verbindungen der Formel (XXIX), worin W eine Abgangsgruppe wie Chlor, Brom, Iod, Mesyl oder Tosyl ist, können aus Verbindungen der Formel (XXIX) hergestellt werden, worin W eine Hydroxyl-Gruppe ist, wofür Verfahren jedem Fachmann bekannt sind, wie durch diejenigen Verfahren, die beschrieben werden in J. March, Advanced Organic Chemistry, vierte Auflage, John Wiley & Sons: New York, 1992, die hier durch Verweis eingeführt werden.
Einige der bevorzugten Verbindungen der Formel (XXIX), worin R² eine Phenyl-Gruppe ist, die mit C_1-8-Alkyl, verzweigtem C_3-8-Alkyl oder C_3-8-Cycloalkyl substituiert ist, können hergestellt werden durch Reaktion einer Verbindung der Formel (XXIX), worin W eine Hydroxyl-Gruppe oder eine Hydroxyl-Gruppe mit einer geeigneten Schutzgruppe ist, die durch jedem Fachmann bekannte Standardverfahren angebracht und später nach Bedarf in der Synthese entfernt werden kann, und worin R² eine Phenyl-Gruppe ist, die mit einer Iod-Gruppe oder Brom-Gruppe substituiert ist; die Reaktion kann durch Zugabe einer geeigneten olefinischen Verbindung in Gegenwart eines Pd-Katalysators durch Verfahren fortgeführt werden, die analog zu denjenigen sind, die beschrieben werden von H.A. Dieck et al. (H.A. Dieck et al., J. Am. Chem. Soc., 1974, 96, 1133), gefolgt von Reduktion mit Wasserstoffgas in Gegenwart eines geeigneten Katalysators unter Verwendung von Standardbedingungen, die jedem Fachmann bekannt sind, wofür Verfahren jedem Fachmann bekannt sind, wie diejenigen Verfahren, die beschrieben werden in P.N. Rylander, Catalytic Hydrogenation in Organic Syntheses, Academic Press: New York, 1979 oder in Rylander, P.N., Hydrogenation Methods, Academic Press: London, 1985; die hier durch Verweis eingeführt werden; oder die Reaktion kann durch Reaktion mit einem geeigneten Alkyllithium-Reagens wie n-Butyllithium in einem etherischen Lösungsmittel wie THF bei reduzierter Temperatur, z.B. –100 bis –20°C, zweckmäßig bei -78°C, fortgeführt werden, gefolgt von Addition der resultierenden benzylischen Alkohol-Gruppe durch Verfahren, die analog zu denjenigen sind, die beschrieben werden von C.T. West et al. (C.T. West et al., J. Org. Chem., 1973, 38, 2675).
Einige der bevorzugten Verbindungen der Formel (XXIX), worin R² eine Phenyl-Gruppe ist, die mit einer Carboxyl- oder veresterten Carboxyl-Gruppe substituiert ist, können hergestellt werden durch Reaktion einer Verbindung der Formel (XXIX), worin W eine Hydroxyl-Gruppe ist und R2 eine Phenyl-Gruppe ist, die mit einer Brom- oder Iod-Gruppe substituiert ist, mit Kohlenmonoxid in einem geeigneten Alkanol-Lösungsmittel durch Verfahren, die analog zu denjenigen sind, die beschrieben werden von A. Schoenber et al. (A. Schoenber et al., J. Org. Chem., 1974, 39, 3318), gefolgt von Hydrolyse des resultierenden Esters nach Wunsch, wofür Verfahren jedem Fachmann bekannt sind, wie diejenigen Verfahren, die beschrieben werden in T.W. Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, zweite Auflage, John Wiley & Sons: New York, 1991, die hier durch Verweis eingeführt werden.
Einige der bevorzugten Carbonsäuren der Formel (XXVIII), worin X NH ist und R² eine para-Hydroxyphenyl-Gruppe ist, die mit C_1-8-Alkyl, verzweigtem C_3-8-Alkyl oder C_3-8-Cycloalkyl substituiert ist, können hergestellt werden durch Reaktion von Tyrosin, das am Phenyl-Ring mit einer Brom- oder Iod-Gruppe substituiert ist; worin die Amino- und/oder Carboxyl-Gruppen gegebenenfalls mit einer geeigneten Schutzgruppe substituiert sein können, die angebracht und später nach Bedarf in der Synthese entfernt werden kann, wofür Verfahren jedem Fachmann bekannt sind, wie diejenigen Verfahren, die beschrieben werden in T.W. Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, zweite Auflage, John Wiley & Sons: New York, 1991, die hier durch Beweis eingeführt werden, mit einer geeigneten olefinischen Verbindung in Gegenwart eines Pd-Katalysators durch Verfahren, die analog zu denjenigen sind, die beschrieben werden von H.A. Dieck et al. (H.A. Dieck et al., J. Am. Chem. Soc. 1974, 96, 1133), gefolgt von Reduktion mit Wasserstoffgas in Gegenwart eines geeigneten Katalysators unter Verwendung von Standardbedingungen, die jedem Fachmann bekannt sind.
Einige der bevorzugten Carbonsäuren der Formel (XXVIII), worin X NH ist und R² eine para-Hydroxyphenyl-Gruppe ist, die mit Carboxyl oder verestertem Carboxyl substituiert ist, können hergestellt werden durch Reaktion von Tyrosin, das am Phenyl-Ring mit einer Brom- oder Iod-Gruppe substituiert ist; worin die Amino- und/oder Carboxyl-Gruppen gegebenenfalls mit einer geeigneten Schutzgruppe substituiert sein können, die angebracht und später nach Bedarf in der Synthese entfernt werden kann, wofür Verfahren jedem Fachmann bekannt sind, wie diejenigen Verfahren, die beschrieben werden in T.W. Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, zweite Auflage, John Wiley & Sons: New York, 1991, die hier durch Verweis eingeführt werden; mit Kohlenmonoxid in einem geeigneten Alkanol-Lösungsmittel durch Verfahren, die analog zu denjenigen sind, die beschrieben werden von A. Schoenberg et al., J. Org. Chem., 1974, 39, 3318, gefolgt von Hydrolyse des resultierenden Esters nach Wunsch unter Verwendung von jedem Fachmann bekannten Standardverfahren.
Ein alternatives Verfahren zur Synthese von Verbindungen der Formel (VI) beinhaltet die Reaktion einer Verbindung der Formel (XX), worin K wie in Formel (XX) definiert ist und R11 eine Aldehyd-Gruppe, eine Cyano-Gruppe, NHR³, worin R³ wie in Formel (III) definiert ist, oder eine Gruppe CH₂Y ist, worin Y als Abgangsgruppe wie Chlor, Brom, Iod, Mesyl oder Tosyl definiert ist; mit einer Verbindung der Formel (XXX), worin R¹ wie in Formel (VI) definiert ist, R² und X wie in Formel (II) definiert sind, R⁸ wie in Formel (VI) definiert ist, G wie in Formel (VIII) definiert ist und R¹⁰ als OH, SH, NHR³, worin R³ wie in Formel (III) definiert ist, eine Aldehyd-Gruppe, eine Keto-Gruppe -(CO)-R³, worin R³ wie in Formel (III) definiert ist, oder eine Gruppe CH₂Y definiert ist, worin Y eine Abgangsgruppe wie Chlor, Brom, Iod, Mesyl oder Tosyl ist; durch Verfahren, die analog zu denjenigen sind, die für die Herstellung von Verbindungen der Formel (XVIII) durch Reaktion von Verbindungen der Formel (XX) mit Verbindungen der Formel (XIX) beschrieben wurden.
Verbindungen der Formel (XXX), worin R¹ wie in Formel (IV) definiert ist, R² und X wie in Formel (II) definiert sind, R⁸ wie in Formel (VI) definiert ist, G wie in Formel (VIII) definiert ist und R¹⁰ CH₂Y ist, worin Y eine Abgangsgruppe wie Chlor, Brom, Iod, Mesyl oder Tosyl ist, können aus Verbindungen der Formel (XXX) hergestellt werden, worin R¹, R², R⁸, X und G wie oben definiert sind, und worin R¹⁰ CH₂OH ist, wofür Verfahren jedem Fachmann bekannt sind, wie diejenigen Verfahren, die beschrieben werden in J. March, Advanced Organic Chemistry, vierte Auflage, John Wiley & Sons: New York, 1992, die hier durch Verweis eingeführt werden.
Verbindungen der Formel (XXX), worin R¹ wie in Formel (IV) definiert ist, R² und X wie in Formel (II) definiert sind, R⁸ wie in Formel (VI) definiert ist, G wie in Formel (VIII) definiert ist und R¹⁰ als OH, SH, CH₂OH; NHR³, worin R³ wie in Formel (III) definiert ist, eine Aldehyd-Gruppe, oder eine Keto-Gruppe -(CO)-R³ definiert ist, können aus Verbindungen der Formel (VII), worin R¹, R², R⁸ und x wie oben definiert sind, mit einer Verbindung der Formel (XIX), worin R⁹ Wasserstoff ist und R¹⁰ wie oben definiert ist, durch Verfahren hergestellt werden, die analog zu denjenigen sind, die für die Herstellung von Verbindungen der Formel (VI) durch Reaktion von Verbindungen der Formel (VII) mit Verbindungen der Formel (VIII) beschrieben wurden. In den Fällen, in denen R¹⁰ OH, SH, CH₂OH oder NHR³ ist, kann es bevorzugt sein, eine Schutzgruppe für R¹⁰ vor der Reaktion mit einer Verbindung der Formel (VII) anzufügen. Solche Schutzgruppen können angefügt und in einer späteren Stufe in der Synthese entfernt werden, wofür Verfahren jedem Fachmann bekannt sind, wie diejenigen Verfahren, die beschrieben werden in T.W. Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, zweite Auflage, John Wiley & Sons: New York, 1991, die hier durch Verweis eingeführt werden.
Verbindungen der Formel (XIX), worin R⁹ Wasserstoff ist und R¹⁰ als OH, SH, CH₂OH, NHR³, worin R³ wie in Formel (III) definiert ist, eine Aldehyd-Gruppe oder eine Keto-Gruppe -(CO)-R³ wie oben definiert ist, können aus Verbindungen der Formel (XIX), worin R⁹ wie in Formel (XVIII) definiert ist und R¹⁰ wie oben definiert ist, hergestellt werden, wofür Verfahren jedem Fachmann bekannt sind, wie diejenigen Verfahren, die beschrieben werden in T.W. Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, zweite Auflage, John Wiley & Sons: New York, 1991, die hier durch Verweis eingeführt werden.
Prodrugs der allgemeinen Struktur (XXXI), worin X und R² wie in Formel (II) definiert sind, können aus Verbindungen der Formel (XXXII) hergestellt werden
worin R¹² wie in Formel (XXV) definiert ist, R² wie in Formel (II) definiert ist und R⁸ wie in Formel (VI) definiert ist, wofür Verfahren jedem Fachmann bekannt sind, wie diejenigen Verfahren, die beschrieben werden in T.W. Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, zweite Auflage, John Wiley & Sons: New York, 1991, die hier durch Verweis eingeführt werden.
Verbindungen der Formel (XXXII) können durch Reaktion von Verbindungen der Formel (XXXIII), worin R¹² wie in Formel (XXV) definiert ist;
mit Verbindungen der Formel (XXVII), worin X NH oder O ist, R² wie in Formel (II) definiert ist und R8 wie in Formel (VI) definiert ist; unter Verwendung von Verfahren hergestellt werden, die analog zu denjenigen sind, die für die Herstellung von Verbindungen der Formel (XXV) aus Verbindungen der Formeln (XXVI) und (XXVII) beschrieben wurden.
Verbindungen der Formel (XXXIII), worin R¹² eine geeignete Schutzgruppe wir in Formel (XXV) definiert ist, können hergestellt werden, wofür Verfahren jedem Fachmann bekannt sind, wie diejenigen Verfahren, die beschrieben werden in T.W. Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, zweite Auflage, John Wiley & Sons: New York, 1991, die hier durch Verweis eingeführt werden; aus Melphalan (GB 750 155), das kommerziell unter der Bezeichnung Alkeran erhältlich ist (T.M. The Wellcome Foundation Limited) und die chemische Bezeichnung 4-[Bis(2-chlorethyl)amino]-1-phenylalanin hat.
Der Begriff Protein-Engineering bezeichnet heutzutage die strukturell gerichtete Modifikation eines Proteins zum Erhalt eines spezifischen, gewünschten neuen Satzes von Proteineigenschaften oder, in diesem Zusammenhang, einer genauer enzymatischen Aktivität. Zwei Ansätze zur Modifikation von Proteinspezifität und -reaktivität können verwendet werden. Die Unterschiede in diesen Ansätzen hängen von der für ein spezifisches Enzym verfügbaren chemischen und strukturellen Information ab. Falls keine chemisch-strukturelle Information über ein Protein bekannt ist, können zufällige Mutationen einzeln oder in Gruppen eingeführt werden, um die Bedeutung von spezifischen Aminosäureresten unter Verwendung von Techniken zu bestimmen, die allgemein auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannt sind. Jedoch kann ein stärker gerichteter Ansatz unter Verwendung der ortsgerichteten Mutagenese durchgeführt werden, falls ausführliche chemische und strukturelle Information über ein Protein verfügbar ist. Dies beinhaltet nur spezifische Veränderungen an Aminosäureresten, über die die chemischen und strukturellen Daten vermuten lassen, daß sie kritisch für die Bestimmung der gewünschten enzymatischen Aktivität sind. Falls dreidimensionale Strukturdaten verfügbar sind, kann die Methodik weitergeführt werden, um molekulare Modelle für vorgeschlagene Mutationen bereitzustellen. Diese Modelle können Abschätzungen der relativen Stabilität oder Reaktivität einer spezifischen ortsgerichteten Mutation liefern.
Typischerweise werden im computergestützten Ansatz des Protein-Engineering Computermodelle auf Basis von Röntgenkristallographiestrukturen oder Modelle verwendet, die durch Homologiemodellaufbau aus Röntgenstruk turen homologer Proteine aufgebaut wurden. In vielen Fällen können die Ausgangskristallographiestrukturen aus der öffentlich zugänglichen Brookhaven Protein Database erhalten werden.
Umfangreiche Untersuchungen der Proteinstruktur und der Funktion individueller Aminosäuren haben die Klassifikation von Resten in bezug auf ihre Bedeutung für Struktur, Stabilität, Reaktivität oder Katalyse erlaubt. Viele Aminosäurereste der aktiven Zentren in Proteinen zeigen eine ungewöhnliche chemische Reaktivität, und diese chemischen Reaktivitäten kennzeichnen die katalytischen Eigenschaften der Proteine. Diese chemische Reaktivität unterstützt die Identifizierung des aktiven Zentrums und der nicht-reaktiven assoziierten Reste im aktiven Zentrum. Kristallographieuntersuchungen zusammen mit Information über die chemische Reaktivität kann genau die Orte der aktiven Zentren anzeigen. Zusätzlich werden einige Proteine mit Substraten oder Inhibitoren im aktiven Zentrum kristallisieren. All diese Strukturinformationsstücke können kombiniert werden, um den Brennpunkt der Konstruktionsanstrengungen auf spezifische Reste als Kandidaten für die ortsgerichtete Mutagenese zu verstärken.
Die spezifische gewünschte Änderung der Proteinreaktivität kann durch spezifische Änderungen der Aminosäure an einer gegebenen interessierenden Stelle erhalten werden. Aminosäurerest können inseriert werden, wodurch funktionelle Gruppen räumlich getrennt werden, oder bestehende Reste können deletiert werden, was funktionelle Gruppen enger aneinanderbringt.
Zusätzlich können Änderungen in der Proteinstruktur durch Veränderung der Drehwinkel der Seitenkette oder Hauptkette und der funktionellen Gruppen an den Aminosäureresten bewirkt werden. Diese Drehwinkel können durch Austausch, Deletion oder Insertion von Aminosäureresten verändert werden. Falls Strukturdaten verfügbar sind, können all diese Änderungen unter Verwendung von computergestützten Techniken der molekularen Modellierung modelliert werden. Kräfte, die an Proteinstrukturen Wechselwirken, können im Computer unter Verwendung der Molekularmechanik oder Kraftfeld-Molekulardynamik modelliert werden.
Der für die Ligandenbindung innerhalb eines Proteins verfügbare Raum kann durch Änderungen des Volumens der Aminosäure-Seitenketten modifiziert werden. Die Mutation voluminöser Reste wie Isoleucin oder Leucin zu Alanin oder Glycin kann Taschen innerhalb einer Ligandenbindungsstelle ohne merkliche Veränderung der Hydrophobizität der Stelle bereitstellen. Die entgegengesetzte Mutation kann voluminöse Substrate von der Bindung an ein spezifisches Protein ausschließen.
Mutationen, die Änderungen in den funktionellen Gruppen der Aminosäuren beinhalten, die ein aktives Zentrum bilden, können drastischere Änderungen als die Volumentoleranz oder sterische Veränderungen bereitstellen. Beispiele für viele dieser Typen von Änderungen sind in der Literatur erhältlich (siehe z.B.: A. Recktenwald et al., J. Biotech., 1993, 28, 1-23, und Literaturzitate darin; und A. Lesk et al., "Antibody Engineering: A Practical Guide", Hrsg. C.A.K. Borrebaeck et al., 1991, 1–75). In Systemen mit hochqualitativen Strukturdaten können spezifische Wasserstoffbindungsgruppen eingefügt werden, um die Wechselwirkung polarer Substrate zu verbessern. Der Austausch ungeladener Reste gegen Arginin, Lysin oder Histidin fügt Gruppen ein, die mit negativ geladenen Substraten Wechselwirken könnten. Der Austausch von Resten gegen Glutaminsäure oder Asparaginsäure kann Wechselwirkungen mit positiv geladenen Substraten bereitstellen und somit die Spezifität einer Enzym-Substrat-Wechselwirkung verändern.
In einem weiteren Aspekt der. vorliegenden Erfindung wird ein rekombinantes Konjugat bereitgestellt, das einen Targeting-Antikörper wie hier zuvor beschrieben und ein mutiertes Enzym der vorliegenden Erfindung umfaßt; wobei ein solches rekombinantes Konjugat aus einem einzelnen DNA-Konstrukt exprimiert oder aus einem einzelnen RNA-Transkript translatiert wurde. Ebenfalls eingeschlossen im Umfang der vorliegenden Erfindung sind die entsprechenden DNA- und RNA-Moleküle, die ein solches Konjugat codieren. Bevorzugte Ausführungsformen eines solchen Konjugats spiegeln eine Kombination der bevorzugten Ausführungsformen für ihre zwei Teilaktivitäten wie hier zuvor ausgedrückt wider.
Solche rekombinanten Konjugate können durch Expression von Fusionskonstrukten hergestellt werden, die durch in vitro-Vereinigen von Fragmenten von DNA erzeugt werden, die separat das Enzym und einen gesamten oder einen Teil eines mAb codieren, der Antigen-Spezifität verleiht (I. Pastan et al. (1986), Cell, 47, 641–648). Solche Fusionen können durch Standardtechniken der rekombinanten Molekularbiologie auf Wegen konstruiert werden, die die substratbindende Stelle oder das aktive Zentrum des Polypeptids an den Amino-Terminus oder den Carboxy-Terminus, bevorzugt an den Amino-Terminus, plazieren. Der mAb-Teil des Konstrukts kann so geschaffen werden, daß ein Einzelkettentyp des Antikörpers mit dem Enzymteil entweder mit der variablen leichten oder variablen schweren Domäne am 5'-Ende verbunden ist. In jedem Fall werden die variablen leichten und variablen schweren Genregionen mit einem synthetischen DNA-Fragment verbunden sein, das einen Peptidlinker codiert, der die richtige räumliche Anordnung der variablen Regionen des Antikörpers erreicht. Eine solche synthetische DNA-Region, die den Antikörperteil des Fusionskonstrukts mit dem Enzymteil verbindet, kann ebenfalls wünschenswert sein. In anderen Formen kann das Gen, das das Enzym codiert, an das 5'-Ende der variablen Region des Gens der schweren oder leichten Kette fusioniert sein, das sich zur Bildung einer Fab- oder F(ab')₂-Spezies ausdehnt. Andere Variationen des Gens der schweren Kette können verwendet werden, um das rekombinante Enzym/Antikörper-Konjugat zu bilden. Solche Variationen können natürliche Isotypen der schweren Kette, modifizierte Gene voller Länge der schweren Kette für alle Antikörperisotypen und schwere Ketten mit verschiedenen Deletionen einschließen, spezifisch kann eine Deletion der C_H2-Domäne wünschenswerte pharmakokinetische Eigenschaften verleihen. Alternativ kann die Fusion ein kovalentes bispezifisches Antikörper:Enzym-Konjugat erzeugen, in dem ein Arm des Antikörpers durch das Enzym in einer ähnlichen Weise (aber nicht darauf beschränkt) wie in K. De Sutter und W. Fiers beschrieben ersetzt ist, Mol. Immunol. 31, 261 (1994). Der Begriff "Konjugat" wie hier verwendet schließt solche rekombinanten Konjugate ein.
Antikörper, die geschaffen sind, damit sie besondere zelluläre Spezifitäten besitzen, können auf jede allgemein auf diesem Gebiet bekannte Weise erzeugt werden. Fragmente von Antikörpern, die durch rekombinante Gentechnik erzeugt werden, können ebenfalls als Targeting-Moleküle verwendet werden.
Obwohl die bevorzugten Antikörper zur Verwendung diejenigen sein werden, die aus natürlichen oder rekombinanten, aus dem Menschen stammenden Zellinien exprimiert werden, ist es ebenfalls möglich, Antikörper aus anderen Antikörper erzeugenden Tierzellinien auszunutzen, vorausgesetzt, daß solche Antikörper nicht in einem Ausmaß immunogen sind, daß sie signifikant zur Beeinträchtigung der Therapie neigen, oder vorausgesetzt, daß die Antikörper so "humanisiert" wurden, daß sie nicht länger eine Immunreaktion in vivo auslösen. Ein solcher humanisierter Antikörper kann ein chimärer Antikörper sein (Morrison et al. P.N.A.S. (1984), 81, 6851-6855; Boulianne et al., Nature, 1985, 314, 268–270 und Neuberger et al., Nature, 1985, 314, 268–70) oder ein CDR-gepfropfter Antikörper (James et al., Nature 1986, 321, 522-525; Riechmann et al., Nature, 1988, 332, 323-327).
Ein Antikörper zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung ist bevorzugt ein monoklonaler Antikörper oder ein Fragment davon. Der Antikörper kann daher einen vollständigen Antikörper, ein (Fab')₂-Fragment, ein Fab'-Fragment, ein Fab-Fragment, ein Dimer der leichten Kette oder ein Dimer der schweren Kette oder einen Einzelkettentyp umfassen, der die variablen Regionen aus schweren und leichten Ketten umfaßt. Der Antikörper kann ein IgG wie Igel, IgG2, IgG3 oder IgG4 sein; oder IgM, IgA, IgE oder IgD. Die konstante Domäne der schweren Kette des Antikörpers kann entsprechend ausgewählt werden. Die konstante Domäne der leichten Kette kann eine konstante kappa- oder lambda-Domäne sein.
Der Antikörper kann ein chimärer Antikörper des in WO 86/01533 beschriebenen Typs sein. Ein chimärer Antikörper gemäß WO 86/01533 umfaßt eine Antigen-bindende Region und eine Nicht-Immunglobulin-Region. Die Antigen-bindende Region ist eine variable Domäne der leichten Kette und/oder variable Domäne der schweren Kette des Antikörpers. Typischerweise umfaßt der chimäre Antikörper sowohl variable Domänen der leichten als auch schweren Kette. Die Nicht-Immunglobulin-Region ist an den C-Terminus der Antigen-bindenden Region fusioniert. Die Nicht-Immunglobulin-Region ist typischerweise ein Nicht-Immunglobulin-Protein und ist bevorzugt eine Enzymregion. Die zwei Regionen des chimären Antikörpers können über eine spaltbare Linkersequenz verbunden sein.
Antikörper jeder der oben bezeichneten Klassen können gegen jedes Antigen gerichtet werden, das charakteristisch für und im wesentlichen auf ein besonderes Ziel beschränkt ist. Solche Ziele schließen alle Typen von menschlichen Pathogenen, Zellen, die Antigene als Ergebnis einer Transformation oder Virusinfektion exprimieren, Zellen, die besondere Histokompatibilitätsantigene exprimieren, Zellen, die an entzündlichen Reaktionen beteiligt sind, Blutgerinnsel, die durch Antikörper gegen Fibrin gerichtet werden können, etc. ein.
Bevorzugte Antikörper zur Verwendung gemäß der Erfindung, die Antigene, auf die sie gerichtet sind, und die damit verbundene Indikation sind in 8 ausführlich angegeben.
Besonders bevorzugte Antikörper zur Verwendung gemäß der Erfindung schließen CAMPATH 1H^®, ING-1, cl74, PR1.A3, 323/A3, G250, MOV18, 17-1A, NR-LU-10, U36, NR-CO-O2 sowie Antikörper, die auf Mucine oder karzinoembryonales Antigen gerichtet sind, ein.
Zur Behandlung von Menschen, wenn die Targeting-Einheit ein Antikörper ist, ist es bevorzugt, einen Antikörper zu verwenden, der nicht mit sich das Risiko der Entwicklung einer Immunreaktion gegen den Antikörper selbst trägt. Obwohl es möglich ist, monoklonale Antikörper von Maus oder Ratte zu verwenden, ist es entsprechend bevorzugt, Antikörper zu verwenden, die durch rekombinante Gentechnik erzeugt wurden und die konstruiert wurden, um das Risiko des Hervorrufens einer Immunreaktion zu reduzieren. So ist es möglich, einen chimären Antikörper zu verwenden, in dem die konstanten Domänen eines Maus- oder Ratte-Antikörpers durch die konstanten Domänen eines humanen Antikörpers ersetzt wurden. Es ist jedoch bevorzugt, einen humanisierten oder CDR-gepfropften Antikörper zur Behandlung von Menschen zu verwenden, d.h. einen Antikörper, in dem die Komplementarität bestimmenden Regionen aus einem Maus- oder Ratte-Antikörper mit Gerüstregionen und konstanten Domänen aus einem oder mehreren humanen Antikörpern kombiniert sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die erfindungsgemäße Verwendung unter Verwendung des CDR-gepfropften Antikörpers CAMPATH-1H durchgeführt (siehe Riechmann et al., Nature 322, 323-327 (1988)). Wie oben angemerkt wurde, kann der Antikörper CAMPATH-1H in Ratten-Myelomzellen erzeugt werden, wie ursprünglich beschrieben, oder er kann in jedem anderen Expressionssystem erzeugt werden, insbesondere in einem Expressionssystem, das zur Erzeugung eines korrekt gefalteten, glycosylierten Säugetierproteins geeignet ist. Hohe Ausbeuten von CAMPATH-1H wurden durch Expression in einer genetisch manipulierten CHO-Zellinie erhalten (Page und Sydenham, Biotechnology 9, 64–68 (1991)).
Die Konjugation des Targeting-Moleküls an das Enzym kann auf jede geeignete Weise durchgeführt werden, die weder mit der Bindungsspezifität und -fähigkeit des Targeting-Moleküls wechselwirkt noch die die katalytische Aktivität des Enzyms hemmt. Im Falle von proteinartigen Targeting-Molekülen kann die Konjugation entweder durch direkte kovalente Bindung im Anschluß an die Erzeugung reaktiver Gruppen durch Behandlung mit Proteinmodifizierenden Mitteln oder durch die Verwendung von homo- oder heterobifunktionellen Vernetzermolekülen durchgeführt werden.
Handelsübliche Linker mit Amino- oder Hydrazid-Gruppen können mit Aldehyden umgesetzt werden, die durch Oxidation der Zuckereinheiten von Glykoproteinen und Kohlehydraten zur Bildung einer Schiffschen Base erzeugt wurden (M. Sela et al., Conjugates of Antibodies with Cytotoxic Drugs. Immunoconjugates. Antibody Conjugates in Radioimaging and Therapy of Cancer (C.-W. Vogel, Hrsg.) 189-126 (1987)). Alternativ können Linker mit Amino-, Carboxyl- oder Sulfhydryl-Gruppen des Antikörpers oder Enzyms umgesetzt werden (P.E. Wawrzynczak et al., Methods for Preparing Immunotoxins: Effect of the Linkage on Activity & Stability in: Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimaging and Therapie of Cancer (C.-W. Vogel Hrsg.) 78–85 (1987)).
Die kovalente Bindung kann erhalten werden durch die Erzeugung von Sulfhydryl-Gruppen und, insbesondere im Fall von Antikörpern, durch Reduktion von Disulfid-Bindungen. Solche freien Sulfhydryl-Gruppen können mit Halogenalkyl-Gruppen, p-Mercuribenzoat-Gruppen und Gruppen, die für Additionsreaktionen vom Michael-Typ fähig sind, wie Maleimide oder Gruppen gemäß (Mitra et al., J. Amer. Chem. Soc., 101, 3097–3110, 1979), umgesetzt werden.
Ein anderes Verfahren zum Binden von Enzym an Antikörper umfaßt die Verwendung der epsilon-Amino-Gruppen von Lysin. Reaktive Succinimidester, cyclische Thioester oder Anhydride können verwendet werden, um Carbonylfunktionen einzuführen, die mit der Lysin-Aminogruppe reagieren können, oder um eine Thiol-reaktive Gruppe einzuführen, wie die hier erörterten. Alternativ können Carbonylfunktionen mit Carbodiimiden zur Bildung von Carboxamid-Bindungen aktiviert werden, oder die Lysin-Aminogruppe kann mit Methylamidatestern umgesetzt werden, um eine Amidiniumbindung zu bilden.
Eine besondere Verwendung der vorliegenden Erfindung ist ihre Anwendung auf in-vitro- oder in-vivo-Diagnostika. Z.B. kann die Detektion eines besonderen Antigens in vitro erreicht werden durch Inkontaktbringen einer diagnostischen Probe mit einem Konjugat der vorliegenden Erfindung, das eine Targeting-Einheit umfaßt, wie einen Antikörper, der zur Bindung an das Antigen fähig ist, und anschließendes Inkontaktbringen mit einem Prodrug, wie mit einem Methotrexat-Prodrug der vorliegenden Erfindung, der durch das Enzym des Konjugats zu Methotrexat katalysiert werden kann, falls Antigen vorhanden ist und Konjugat an das Antigen gebunden wird. Prodrug sollte hinzugegeben werden, nachdem ungebundenes Konjugat entfernt wurde. Katalysierter Prodrug wie MTX kann durch Standard-HPLC-Analyse oder durch den hier beschriebenen gekoppelten spektrophotometrischen Test nachgewiesen werden.
In vivo diagnostische Anwendungen der vorliegenden Erfindung schließen ihre Fähigkeit ein, bei der Tumorbildgebung verwendet zu werden. Besonders bevorzugte Konjugate zur Verwendung in dieser Anwendung schließen diejenigen ein, die einen Antikörper für ein mit einem Tumor assoziiertes Antigen und ein mutiertes Enzym umfassen, das zur Katalyse zu Methotrexat fähig ist, einen MTX-Prodrug, der im Benzol-Ring mit 1312 markiert ist. Ein solcher Prodrug sollte einer sein, der ansonsten refraktär für endogene Katalyse ist. Konjugat und Prodrug können in einer zur therapeutischen Anwendung der Erfindung analogen Weise verabreicht werden, und die Detektion des Aufenthaltsortes das katalysierten Prodrugs, d.h. ¹³¹I MTX, kann unter Verwendung von Standardausrüstung zum Nachweis von Radioisotopzerfall erreicht werden.
Salze von Prodrugs der vorliegenden Erfindung schließen pharmazeutisch akzeptable Basensalze ein, die aus einer entsprechenden Base stammen, wie Alkalimetall- (z.B. Natrium), Erdalkalimetall- (z.B. Magnesium), Ammonium- und NX⁴⁺-Salze (worin X C_1-4-Alkyl ist). Geeignete pharmazeutisch akzeptable Salze schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf diejenigen, die aus den folgenden Säuren hergestellt werden: Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Maleinsäure, Salicylsäure, p-Toluolsulfonsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Methansulfonsäure, Ameisensäure, Bernsteinsäure, Naphthalin-2-sulfonsäure, Isethionsäure, Lactobionsäure und Benzolsulfonsäure. Die pharmazeutisch akzeptablen Prodrugsalze können in herkömmlicher Weise hergestellt werden, z.B. durch Behandlung mit der entsprechenden Base oder Säure.
In der erfindungsgemäßen Verwendung wird das Mittel der Verabreichung von Konjugat und von Prodrug von der Krankheit und ihrer Schwere abhängen und wird in der Verantwortung des behandelnden Arztes liegen. Sowohl das Konjugat als auch der Prodrug können durch die den Fachleuten allgemein bekannten herkömmlichen Verfahren verabreicht werden, einschließlich intravenös, intraperitoneal, intralymphatisch, subkutan, intradermal, intramuskulär, oral oder, im Falle eines Tumors, durch Direktinjektion in den Tumor. Sowohl der Prodrug als auch das Konjugat werden bevorzugt intravenös als Bolus oder durch kontinuierliche Infusion verabreicht werden. Bevorzugt ist die Dosis des verabreichten Konjugats im Bereich von 0,1 bis 100 mg pro kg Körpergewicht pro Tag und am meisten bevorzugt zwischen 1,0 und 40 mg pro kg Körpergewicht pro Tag. Die bevorzugte Dosis des verabreichten Prodrugs ist im Bereich von 0,01 bis 100 mg pro kg Körpergewicht pro Tag und bevorzugt zwischen 1,0 und 50 mg pro kg Körpergewicht pro Tag.
Es ist bevorzugt, daß das Konjugat aus Targeting-Molekül und mutiertem Enzym an den Patienten vor der Verabreichung des Prodrugs verabreicht wird. Der Zeitraum zwischen der Verabreichung von Konjugat und Prodrug muß ausreichend sein, um eine Ausrichtung des Konjugats auf die beabsichtigten Zellen und eine wirksame Entfernung von überschüssigem Konjugat, das nicht an die beabsichtigten Zellen gebunden hat, zu erlauben. Ungebundenes Konjugat muß wirksam entfernt werden, um die Aktivierung des anschließend verabreichten Prodrugs durch ungebundenes Konjugat zu verhindern, das an Stellen entfernt von den Zielzellen vorhanden ist. Der Zeitraum zwischen der Verabreichung von Konjugat und Prodrug beträgt bevorzugt zwischen 0,5 und 7 Tagen, aber kann durch die Verwendung einer beliebigen bekannten Technik zur beschleunigten Klärung solcher Konjugate aus dem System reduziert werden; insbesondere durch Übertragung einer wirksamen Menge von Anti-Enzym-Antikörper, der an das mutierte Enzym bindet und wiederum die Eliminierung beschleunigt, oder durch extrakorporale Zirkulation (I.M. Nilsson et al., Plasma Ther. Transfus. Technol. 1984, 5, 127; A. Wallmark et al., Artifical Organs. 1984, 8, 72), die die Entfernung des ungebundenen Konjugats durch Verfahren wie die Passage durch eine Säule aus einer entsprechenden Affinitätsmatrix beinhaltet. Es kann ebenfalls wünschenswert sein, Galactosyl-Reste an das Konjugat zu koppeln, um die Klärung von ungebundenem Konjugat über Leberzell-Lectine zu erleichtern.
Zustände, die für die Therapie empfänglich sind, werden ersichtlich diejenigen einschließen, für die ein bekanntes Chemotherapeutikum und ein entsprechender Prodrug davon wie hier zuvor definiert existieren, und die ein Pathologie-spezifisches Merkmal darstellen, das die Bindung eines Konjugats der vorliegenden Erfindung erlaubt. Solche Zustände schließen neoplastische und nicht-neoplastische zelluläre Transformation, Autoimmunerkrankung, Entzündungserkrankung und virale, bakterielle, pilzliche, mycoplasmatische oder parasitäre Infektion ein.
Die vorliegende Erfindung kann ferner die Co-Verabreichung einer Anzahl von Mitteln umfassen, die die Wirksamkeit der Therapie erhöhen können. Z.B. sind Interferone dafür bekannt, die Stärke der Expression bestimmter potentieller ADEPT-Ziel-Antigene zu erhöhen, und daher kann die Verabreichung eines entsprechenden Interferons vor der Verabreichung von Konjugat das Maß der Konjugatbindung an Zielzellen erhöhen.
Es ist weiter bevorzugt, daß eine Kombination aus einem Prodrug eines Purin-Syntheseinhibitors, wie ein Inhibitor von Glycinamidribonukleotidtransformylase (GAR TFase), oder einem Prodrug eines Pyrimidin-Syntheseinhibitors, wie ein Inhibitor von Thymidinsynthase (TS), in Kombination mit einem Prodrug eines Dihydrofolat-(DHFR)-Inhibitors als Teil einer solchen Therapie verabreicht wird (J. Galivan et al., Biol. Chem. 264, 10685, 1989, K. Ferguson et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 23, 173, 1989). Es ist weiter bevorzugt, daß eine Kombination aus einem Prodrug eines Purin-Syntheseinhibitors, wie ein Inhibitor von GAR TFase, oder eines Prodrugs eines Pyrimidin-Syntheseinhibitors, wie ein Inhibitor von TS, in Kombination mit DHFR-Inhibitor verabreicht wird, oder daß eine Kombination aus einem Purin-Syntheseinhibitor, wie ein Inhibitor von GAR TFase, oder aus einem Pyrimidin-Syntheseinhibitor, wie ein Inhibitor von TS, in Kombination mit einem Prodrug eines DHFR-Inhibitors als Teil einer solchen Therapie verabreicht wird.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt die Potenzierung jeder antiviralen Verbindung, deren Wirksamkeit durch Erhöhung der intrazellulären Kinaseaktivität verstärkt werden kann.
Erfindungsgemäß soll ein Konjugat der vorliegenden Erfindung, das ein Targeting-Molekül, das das Konjugat auf eine viral infizierte Zelle richten kann, und einen Prodrug eines Folat-Antagonisten umfaßt, der einer oder mehrere aus einem Thymidylatsynthese-(TS)-Inhibitor, Dihydrofolatreduktase(DFHR)-Inhibitor oder GAR-Transformylase-Inhibitor sein kann, verwendet werden, um hohen Dosen von Folat-Antagonist direkt auf die viral infizierten Zellen eines Patienten übertragen, der sich einer Therapie unterzieht. Da eine Virusinfektion mit erhöhten Stärken der DNA-Synthese verbunden ist, wird vorgeschlagen, daß die Übertragung eines Inhibitors der DNA-Synthese in Kombination mit einem solchen antiviralen Mittel sich als therapeutisch erweisen kann, da die Hemmung der DNA-Synthese den Spiegel von intrazellulären Kinasen erhöhen wird, die zur Phosphorylierung der antiviralen Verbindung verfügbar sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses weiteren Aspekts der Erfindung ist das antivirale Mittel eine Antiherpes-Verbindung, ausgewählt aus Acyclovier (GB 1523865), Valacyclovir ( EP 308065 ), Famciclovir ( EP 182024 ), Penciclovier ( EP 141927 ), Ganciclovir ( EP 0072027 ), Foscarnet ( GB 1585615 ), Ioddesoxyuridin, 5-Bromvinyl-2'-desoxyuridin ( GB 1601020 ), Arabinofuranosyl-5-bromvinyl-2'-desoxyuridin ( EP 0031128 ), Benzimidazolnukleosiden, 1-(β-D-Arabinofuranosyl)-5-(1-propinyl)uracil ( EP 272065 ) und 2'-Desoxy-5-ethyl-β-4'-thiouridin ( EP 409575 ), oder es ist eine Anti-HIV-Verbindung, ausgewählt aus 2',3'-Didesoxyinosin ( EP 206497 ), 2',3'-Didesoxycytidin (J. Org. Chem. 32(3), 817–818 (1967)), (2R,5S)-S-Fluor-1-(2-(hydroxymethyl)-1,3-oxathiolan-5-yl)cytosin ( US 5210085 ), (2R,5S)-1-(2-(Hydroxymethyl)-1,3-oxathiolan-5-yl)cytosin ( EP 0382526 ), 5-Chlor-2',3'-didesoxy-3'-fluoruridin ( EP 0305117 ) und (1S,4R)-4-(2-Amino-6-(cyclopropylamino)-9H-purin-9-yl)-2-cyclopenten-1-methanol ( EP 0434450 ), oder es ist die Antigrippeverbindung 9-(2-Desoxy-2-fluor-β-D-ribofuranosyl)guanin ( EP 0417999 ).
In der am meisten bevorzugten Ausführungsform dieses weiteren Aspekts der Erfindung ist die antivirale Verbindung eine Anti-HIV-Verbindung wie Zidovudin ( EP 196185 ) (Retrovir: eingetragene Marke von The Wellcome Foundation Limited), das Konjugat umfaßt einen Antikörper gegen ein HIV-bezogenes Antigen wie GP120, und der Prodrug ist ein Prodrug für einen TS-Inhibitor.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines neuen Prodrugs der vorliegenden Erfindung wie hier zuvor definiert oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes, Solvats, N-Oxids oder physiologisch funktionellen Derivats von in der Herstellung eines Medikament zur Verwendung in der Behandlung jedes der hier zuvor beschriebenen Zustände.
Ebenfalls bereitgestellt wird die Verwendung eines mutierten Enzyms der vorliegenden Erfindung oder eines Konjugats davon wie hier zuvor beschrieben in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Behandlung jedes der hier zuvor beschriebenen Zustände.
Pharmazeutische Formulierungen für mutiertes Enzym, Antikörper und Prodrug können jeweils einschließen, aber sind nicht beschränkt auf Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pulver und andere Formulierungen, die den Fachleuten bekannt sind. Die Formulierungen können pharmazeutisch akzeptable Stabilisatoren und Träger enthalten, einschließlich Humanserumalbumin oder andere Proteine, pH-Puffer und physiologische oder andere nicht-toxische Salze sowie nicht-toxische Solubilisatoren, die den Fachleuten bekannt sind. Bevorzugt wird eine pharmazeutische Formulierung aus mutiertem Enzym und Antikörper ein Konjugat in einer sterilen Lösung umfassen. Eine pharmazeutische Formulierung von Prodrug wird bevorzugt eine sterile Lösung oder einen Feststoff umfassen.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt eine Kit, das eine pharmazeutische Formulierung von Konjugat und eine pharmazeutische Formulierung von Prodrug umfaßt, der zum Arzneistoff durch das Konjugat umgewandelt werden kann.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt die Kombination aus einem Prodrug und einem Konjugat der vorliegenden Erfindung wie hier zuvor definiert.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt die Verwendung eines neuen Prodrugs wie hier zuvor definiert, aber ausschließlich des zuvor angegebenen Vorbehalts, zur Verwendung in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Behandlung jedes der hier zuvor beschriebenen Zustände.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt die Verwendung eines Prodrugs in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Behandlung eines Patienten, dem zuvor ein Konjugat der vorliegenden Erfindung wie hier zuvor definiert verabreicht wurde.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfaßt die hier beschriebene klonierte Version von humaner Carboxypeptidase A2 sowie die DNA, die Carboxypeptidase A2 codiert.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfaßt jede DNA-Sequenz, die ein mutiertes Enzym zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung codiert, und Plasmide, Expressionsvektoren und Zellinien, die solche DNA enthalten. Bevorzugt codiert solche DNA mutierte Carboxypeptidase A1- oder A2-Mutanten wie hier beschrieben und am meisten bevorzugt mutierte Carboxypeptidase A1 oder A2, worin Position 268 Glycin ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfaßt DNA-Sequenz, die ein erfindungsgemäßes Konjugat codiert, und Plasmide, Expressionsvektoren und Zellinien, die solche DNA enthalten.
Noch ein weiterer einmütiger Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Umwandeln eines Prodrugs zu einem Arzneistoff, der cytotoxisch für Zellen ist.
Alle Verweise auf Alternativen, wie alternative Muster chemischer Substitution, sollen hier als einschließlich und nicht als ausschließlich aufgefaßt werden.
Wie hier verwendet bezeichnet der Begriff "Halogen" Fluor, Chlor, Brom oder Iod.
Der Begriff "Aryl" bezeichnet Phenyl, Naphthyl oder Anthracenyl, gegebenenfalls substituiert mit einem oder mehreren aus Halogen, Hydroxy, Nitro, Cyano, Trifluormethyl, C_1-6-Alkyl, C_1-6-Alkoxy oder Amino, das gegebenenfalls mit C_1-6-Alkyl substituiert ist.
Der Begriff "Heteroaryl" bezeichnet ein aromatisches monocyclisches oder bicyclisches kondensiertes Ringsystem, das 5 bis 10 Kohlenstoffatome umfaßt, worin ein oder mehrere Ringatome unabhängig aus Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel ausgewählt sind.
"Carboxamid"-Gruppen können unsubstituiert oder mit C_1-6-Alkyl substituiert sein.
Ein mutiertes Säugetierenzym wie hier verwendet soll als jedes Enzym mit einer Sequenz aufgefaßt werden, die sich um wenigstens eine Aminosäure von der Aminosäuresequenz oder den Aminosäuresequenzen des Enzyms im Säugetier unterscheidet, auf das die Therapie angewendet wird. Bevorzugt ist das Säugetier, auf das die Therapie angewendet wird, ein menschlicher Patient, und bevorzugt unterscheidet sich die Aminosäuresequenz des mutierten Säugetierenzyms um nicht mehr als 15% von der Aminosäuresequenz oder den Aminosäuresequenzen des Enzyms im Säugetier, auf das die Therapie angewendet wird.
Alle zuvor genannten Verweise und in den nachfolgenden Patentansprüchen auf Restenummern der Aminosäuren betreffen die Restenummer, die in den hier enthaltenen Tabellen angegeben wird, und nicht die Restenummern, die hier im Sequenzprotokoll angegeben werden, das einer unterschiedlichen Numerierungskonvention folgt.
Experimentelle Verfahren
Allgemeine Bemerkungen
Alle Lösung waren von analysenreiner Qualität und wurden ohne weitere Reinigung verwendet. Wasserfreie Lösungsmittel wurden aus "Aldrich Sure Seal"-Flaschen unter Verwendung einer trockenen Spritze entnommen. Chemikalien sind analysenrein und wurden ohne weitere Reinigung verwendet. Der vollständige Name und die Adresse der Lieferanten werden beim ersten Verweis angegeben. Danach wird ein abgekürzter Name verwendet.
¹H-NMR-Spektren wurden unter Verwendung von Spektrometern Varian XL-200 oder XL-300 bei 200 bzw. 300 MHz erhalten. Chemische Verschiebungen werden in ppm feldabwärts von Tetramethylsilan ausgedrückt. Spektraldaten werden tabuliert in der Reihenfolge: Multiplizität (s, Singulett; d, Dublett; t, Triplett; q, Quartett; m, Multiplett; br, breit), Anzahl der Wasserstoffe, Kopplungskonstante(n) in Hertz, Beschreibung. Massenspektren mit chemischer Ionisierung (CI) wurden durchgeführt von Oneida Research Services, Inc., Whitesboro, NY 13492. Massenspektren mit chemischer Ionisierung bei Atmosphärendruck (APCI) wurden erhalten unter Verwendung eines Massenspektrometers mit Fisons-Plattform. Fast-Atom-Bombardment-(FAB)-Massenspektren wurden erhalten unter Verwendung eines Spektrometers VG Analytical 70SQ. Ionenspray-Massenspektren wurden erhalten unter Verwendung eines Spektrometers Sciex API III. Elementaranalysen wurden durchgeführt von Atlantic Microlabs, Inc., Atlanta, GA 30366. Analytische Umkehrphasen-HPLCs wurden an C18-Analysensäulen unter Verwendung eines Waters HPLC-Systems vorgenommen, das aus einem 600E System Controller, einem 715 Ultra Wisp-Probenverarbeiter und einem 991 Photodiode Array Detector bestand. Halbpräparative HPLCs wurden an einer Regis-Säule (C18, Prep-100-60-ODS-FEC, 10 mm-Packung, 25 cm × 21,1 mm Innendurchmesser) unter Verwendung eines ähnlichen Systems, das mit einem manuellen Injektor ausgerüstet war, vorgenommen.
Die verwendeten Abkürzungen sind: Gramm (g), Milliliter (ml), Liter (1), Stunden (h), Minuten (min), Raumtemperatur (RT), berechnet (ber.), Zersetzung (Zers.), Molekulargewicht (MG), Tetrahydrofuran (THF), Dimethylformamid (DMF), Dimethylsulfoxid (DMSO), 1,3-Dimethyl-3,4,5,6-tetrahydro-2(1H)-pyrimidinon (DMPU), 1-Ethyl-3-(dimethylaminopropyl)-carbodiimidhydrochlorid (EDC), Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Diethylcyanophosphonat (DECP), (Benzyloxy)carbonyl (Cbz) und Trifluoressigsäure (TFA).
Einige hergestellte Beispiele waren sehr anhänglich für Wasser und/oder andere hydroxylische Lösungsmittel (z.B. DMF) und/oder wurden als ganze oder partielle Salze organischer oder anorganischer Säuren (z.B. Trifluoressigsäure, Chlorwasserstoffsäure) erhalten. Solche Zusätze sind in den analytischen Daten für die entsprechenden Beispiele angegeben; obwohl diese Zusätze nicht als Teil der Verbindungsnamen angegeben sein mögen, wird ihre Gegenwart in den isolierten Produkten durch den Einschluß von Salz- und Hydratisierungsdaten in den molekularen Formeln und analytischen Daten in den entsprechenden Beispielen festgestellt.
Beispiel 1
2-Fluor-4-nitrobenzoesäure
Ein mit einem Magnetrührer ausgerüsteter 3 l-Dreihalskolben wurde mit 25,00 g 2-Fluor-4-nitrotoluol (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, 53233), 1,65 1 1N NaOH und 25,00 g KMnO₄ gefüllt. Die resultierende Mischung wurde unter Rühren auf 95°C erwärmt. Zusätzliche 25,00 g-Portionen von KMnO₄ wurden nach 1 h und 2 h hinzugegeben. Nach Rühren bei 95°C für eine weitere Stunde wurde die Reaktionsmischung auf RT abgekühlt und durch Celite filtriert, um MnO₂ zu entfernen. Das Filtrat wurde im Vakuum auf 500 ml aufkonzentriert und durch Zugabe von konzentriertem H₂SO₄ auf pH 2 angesäuert. Es bildete sich ein gelb-orangefarbener Niederschlag, der durch Vakuumfiltration aufgefangen wurde. Der rohe Feststoff wurde in 300 ml 1N wäßrigem NaOH gelöst, auf pH 2 angesäuert und die Mischung mit CH₂Cl₂ (4 × 150 ml) extrahiert. Die kombinierten CH₂Cl₂-Extrakte wurden mit 0,1N wäßrigem HCl (2 × 100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert, um 12,44 g (42%) 2-Fluor-4-nitrobenzoesäure als gelben kristallinen Feststoff zu liefern, Smp. 165-167°C.
Beispiel 2
Ethyl-2-fluor-4-nitrobenzoat
In einen mit einem Magnetrührer und Stickstoffeinlaß ausgerüsteten trockenen 100 ml-Dreihalskolben wurden 3,00 g 2-Fluor-4-nitrobenzoesäure, 3,00 g NaHCO₃ und 20 ml wasserfreies Dimethylacetamid gegeben. Die Suspension wurde mit 3,50 ml Ethyliodid behandelt und unter N₂ für 18 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde filtriert, um die Feststoffe zu entfernen, und das Filtrat im Vakuum auf konzentriert, um einen orangefarbenen Rückstand zu ergeben, der in 100 ml CH₂Cl₂ gelöst wurde. Die Lösung wurde mit gesättigtem wäßrigem NaHCO₃ (3 × 50 ml) und Wasser (1 × 60 ml) gewaschen und über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet. Entfernung der Trocknungsmittel durch Filtration und Leiten durch einen Stopfen aus Kieselgel (3 × 5 cm) ergab eine hellgelbe Lösung, die im Vakuum auf konzentriert wurde, um 3,10 g (90%) Ethyl-2-fluor-4-nitrobenzoat als hellgelben kristallinen Feststoff zu liefern, Smp. 70–73°C.
Beispiel 3
Ethyl-4-amino-2-fluorbenzoat
In einen mit einem Magnetrührer ausgerüsteten 250 ml-Rundkolben wurden 3,00 g Ethyl-2-fluor-4-nitrobenzoat und 100 ml MeOH gegeben. Die Lösung wurde durch Durchblasen von Stickstoff für 10 Minuten desoxygeniert und dann mit 2,00 g Raney-Nickel (Raney 3200, Davison Chemical, Chattanooga, TN 37406), das mit Wasser und EtOH gewaschen worden war, behandelt. Die Lösung wurde bei 1 atm unter Rühren für 40 min hydriert. Der Kolben wurde mit Stickstoff gespült, und der Katalysator wurde durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde im Vakuum auf konzentriert, um 2,40 g (93%) Ethyl-4-amino-2-fluorbenzoat als braunen kristallinen Feststoff zu liefern, Smp. 110–112°C.
Beispiel 4
9-Brommethyl-3-methylbenzo(f)chinazolin-1(2H)-on
In einen mit einem Magnetrührer, Stickstoffeinlaß und Rückflußkühler ausgerüsteten 3 l-Dreihalskolben wurden 1,4 l 1,2-Dichlorethan gegeben. Das Lösungsmittel wurde zum Rückfluß erwärmt, und 10,00 g 3,9-Dimethylbenzo(f)-chinazolin-1(2H)-on (hergestellt gemäß dem in WO 91/19700 beschriebenen Verfahren) wurden langsam hinzugegeben. Diesem folgte die Zugabe von 8,73 g N-Bromsuccinimid (Aldrich) und 1,00 g Benzoylperoxid (Aldrich). Nach Erwärmen für 2 h zum Rückfluß wurde die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur abgekühlt und im Vakuum auf konzentriert. Der Rückstand wurde mit 60 ml EtOH aufgeschlämmt, und der Feststoff wurde durch Vakuumfiltration aufgefangen. Das Produkt wurde mit 50 ml EtOH gewaschen und im Vakuum getrocknet, um 12,39 g eines hellbraunen Feststoffs zu liefern, Smp. >200°C. Analyse durch ¹H-NMR zeigte eine Mischung an, die aus 80% 9-Brommethyl-3-methylbenzo(f)chinazolin-1(2H)-on und 20% Ausgangsstoff bestand. Das Material wurde in den nächsten Schritt ohne weitere Reinigung überführt.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 9,86 (s, 1H, aromatisches CH), 8,28 (d, 1G, J=9,0, aromatisches CH), 8,06 (d, 1H, J=8,4, aromatisches CH), 7,72 (d, 1H, J=8,2, aromatisches CH), 7,65 (d, 1H, J=8,8, aromatisches CH), 4,94 (s, 2H, ArCH₂Br), 2,49 (s, 3H, CH₃).

Beispiel 5
Ethyl-4-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoat
In einen mit einem Magnetrührer, Stickstoffeinlaß und Rückflußkühler ausgerüsteten 500 ml-Dreihalskolben wurden 5,00 g 9-Brommethyl-3-methylbenzo(f)chinazolin-1(2H)-on, 3,02 g Ethyl-4-amino-2-fluorbenzoat, 4,17 g NaHCO₃ und 42 ml wasserfreies DMF gegeben. Die Reaktionsmischung wurde unter Rühren und unter Stickstoff für 1,5 h auf 100°C erwärmt. Nach Abkühlen auf RT wurde die Mischung filtriert, um Feststoffe zu entfernen, und das Rohprodukt wurde auf 30 g Kieselgel durch Aufkonzentrieren des Filtrats im Vakuum in Gegenwart von Kieselgel abgeschieden. Die Produkt/Kieselgelmischung wurde auf eine Säule (360 g SiO₂) aufgetragen und durch Flash-Chromatographie unter Verwendung von McOH-EtOAc-Gradientenelution (EtOAc → 2% McOH-EtOAc) gereinigt. Dies lieferte 3,50 g (65%) Ethyl-4-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino-2-fluorbenzoat als weißes Pulver, Smp. >200°C.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 12,54 (s, 1H, NH), 9,85 (s, 1H, aromatisches CH), 8,23 (d, 1H, J=8,7, aromatisches CH), 8,01 (d, 1H, J=8,2, aromatisches CH), 7,69–7,50 (m, 3H, aromatisches CH), 6,52 (dd, 1H, J=1,8, 8,9, aromatisches CH), 6,40 (dd, 1H, J=1,7, 14,7; aromatisches CH), 4,58 (d, 2H, J=5,6, ArCH₂N), 4,19 (q, 2H, J=7,0, Ethyl-CH₂), 2,44 (s, 3H, CH₃), 1,24 (t, 3H, J=7,0 Ethyl-CH₃).

Beispiel 6
4-(((1,2-Dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoesäure
Ein mit einem Magnetrührer ausgerüsteter 100 ml-Dreihalskolben wurde mit 0,200 g Ethyl-4-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoat, 18 ml 1N NaOH und 20 ml EtOH gefüllt. Nach Rühren über Nacht bei RT wurde die Lösung auf 20 1 im Vakuum aufkonzentriert und durch Zugabe von konzentriertem HCl auf pH 2,5 angesäuert. Der resultierende Niederschlag wurde durch Vakuumfiltration aufgefangen, mit 15 ml Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet, um 0,15 g (77%) 4-(((1,2-Dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoesäure als weißes Pulver zu liefern, Smp. >250°C.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 13,20 (br s, 1H, COOH), 9,83 (s, 1H, aromatisches CH), 8,24 (d, 1H, J=8,6, aromatisches CH), 8,06 (d, 1H, J=8,4, aromatisches CH), 7,80–7,40 (m, 4H, aromatisches CH), 6,51 (d, 1H, J=7,9, aromatisches CH), 6,37 (d, 1H, J=14,2, aromatisches CH), 4,60 (s, 2H, ArCH₂N), 2,48 (s, 3H, CH3).

Beispiel 7
N-((Benzyloxy)carbonyl)-5-O-ethyl-L-glutaminsäure
Ein mit einem Magnetrührer und einem Thermometer ausgerüsteter 2 l-Dreihalskolben wurde mit 25,0 g Glutaminsäure-γ-ethylether (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, 63178) und 1 1 destilliertem Wasser gefüllt. Die Lösung wurde unter Rühren auf 60°C erwärmt und mit 30 g NaHCO₃, gefolgt von 25 ml Benzylchlorformiat (Aldrich) behandelt. Der Kolben wurde auf RT abkühlen gelassen, und das Rühren wurde für 2 h fortgesetzt. Die Mischung wurde mit Ethylether (5 × 100 ml) extrahiert, und die Ether-Extrakte wurden verworfen. Die wäßrige Phase wurde durch Zugabe von konzentriertem wäßrigem HCl auf einen Kongorot-Endpunkt angesäuert, und die resultierende Emulsion wurde mit CH₂Cl₂ (5 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten CH₂Cl₂-Extrakte wurden mit 0,05 N wäßrigem HCl (2 × 100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum auf ein Volumen von 50 ml auf konzentriert. Die Lösung wurde in einem Eis-Wasser-Bad gekühlt und unter Zugabe von 200 1 Pentan verrieben. Der resultierende Feststoff wurde durch Vakuumfiltration aufgefangen und im Vakuum getrocknet, um 37,0 g (83%) N-((Benzyloxy)-carbonyl-5-O-ethyl-L-glutaminsäure als weißes Pulver zu liefern. Smp. 82–84°C.
Beispiel 8
Ethyl-3-(1-naphthyl)-L-alaninat
In einen mit einem Magnetrührer und Rückflußkühler ausgerüsteten 250 ml-Dreihalskolben wurden 3,00 g 3-(1'-Naphthyl)-L-alanin (Schweizerhall, Inc., Piscataway, NJ, 08854) und 75 ml absolutes EtOH gegeben. Die Suspension wurde durch Hindurchblasen von HCl-Gas angesäuert, bis eine klare Lösung erhalten wurde, und die Lösung wurde unter Rühren für 5 h im Rückfluß erwärmt. Die Lösung wurde auf RT abgekühlt und im Vakuum auf konzentriert, um einen weißen Feststoff zu ergeben, der in 100 ml 5%igem wäßrigem NaHCO₃ suspendiert und mit EtOAc (3 × 60 ml) extrahiert wurde. Die vereinigten EtOAc-Extrakte wurden mit 5%igem wäßrigem NaHCO₃ (3 × 50 ml) und Wasser (1 × 50 ml) gewaschen und über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet. Das Trocknungsmittel wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat im Vakuum auf konzentriert, um ein Öl zu ergeben, das in 40 ml Ethylether gelöst wurde. Die Ether-Lösung wurde mit 13,9 ml 1N etherischem HCl behandelt, und der resultierende Niederschlag wurde durch Vakuumfiltration aufgefangen und im Vakuum getrocknet, um 3,70 g (95%) Ethyl-3-(1-naphthyl)-L-alaninat.HCl als weißes Pulver zu liefern, Smp. 182-184°C.
Beispiel 9
Ethyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-3-(1-naphthyl)-L-alaninat
Ein mit einem Magnetrührer und Stickstoffeinlaß ausgerüsteter 250 ml-Dreihalskolben wurde mit 3,70 g Ethyl-3-(1-naphthyl)-L-alaninat·HCl, 4,09 g N-((Benzyloxy)carbonyl)-5-O-ethyl-L-glutaminsäure, 60 ml CH₂Cl₂ und 1,45 ml N-Methylmorpholin gefüllt. Die Mischung wurde in einem Eisbad auf 0°C gekühlt, mit 2,66 g EDC (Aldrich) behandelt und unter Stickstoff gerührt. Nach 1 h bei 0°C ließ man die Lösung auf RT erwärmen, und das Rühren wurde für weitere 3 h fortgesetzt. Die Lösung wurde im Vakuum auf konzentriert, und der Rückstand wurde in 100 ml EtOAc gelöst. Die EtOAc-Lösung wurde mit 10%iger wäßriger Zitronensäure (3 × 50 ml), gefolgt von 5%igem wäßrigem NaHCO₃ (3 × 50 ml) gewaschen. Die Lösung wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet, im Vakuum auf 20 ml auf konzentriert und unter Zugabe von 50 ml Pentan verrieben. Der resultierende Feststoff wurde durch Vakuumfiltration aufgefangen und im Vakuum getrocknet, um 5,80 g (80%) Ethyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-3-(1-naphthyl)-L-alaninat als weißes Pulver zu liefern, Smp. 124-126°C.
Beispiel 10
Ethyl-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-3-(1-naphthyl)-L-alaninat
Eine 500 ml Parr-Flasche wurde mit 0,19 g 10% Pd(C) und 60 ml absolutem EtOH unter Stickstoff gefüllt. Die Katalysator-Lösungsmittel-Mischung wurde durch Hindurchblasen von Stickstoff für 5 Minuten desoxygeniert und dann mit 0,14 ml Acetylchlorid, gefolgt von 1,02 g Ethyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-O-ethyl-L-glutam-1-yl-3-(1-naphthyl)-L-alaninat behandelt. Die Mischung wurde bei 45 psi für 18 h hydriert. Die Flasche wurde mit Stickstoff gespült, und der Katalysator wurde durch Filtration durch Celite entfernt. Das Filtrat wurde im Vakuum aufkonzentriert, um 0,81 g (97%) Ethyl-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-3-(1-naphthyl)-L-alaninat·HCl als hellgelben Schaum zu liefern, Smp. 85–90°C (Zers.).
Beispiel 11
Ethyl-N-(N-(4-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl)-3-(1-naphthyl)-L-alaninat
Ein mit einem Stickstoffeinlaß und einem Magnetrührer ausgerüsteter 100 ml-Dreihalskolben wurden mit 0,50 g 4-(((1,2-Dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoesäure und 10 ml DMPU (Aldrich) gefüllt. Die Mischung wurde abwechselnd erwärmt und ultraschallbehandelt, um den Feststoff aufzulösen, und die resultierende Lösung wurde unter Stickstoff in Gegenwart von 0,50 g 3 Å-Molekularsieben für 18 h gerührt. Die Mischung wurde auf 0°C in einem Eisbad abgekühlt und mit 0,15 ml N-Methylmorpholin, gefolgt von 0,17 ml Isobutylchlorformiat behandelt. Nach Rühren bei 0°C für 15 min wurde die Reaktionsmischung mit einer Lösung aus 0,69 g Ethyl-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-3-(1-naphthyl)-L-alaninat·HCl und 0,17 ml N-Methylmorpholin in 4 ml wasserfreiem DMF behandelt. Die Reaktion wurde für 1 h bei 0°C gehalten und wurde dann auf RT erwärmen gelassen und für weitere 4 h gerührt. Die Mischung wurde filtriert, um die Feststoffe zu entfernen, und das Filtrat wurde mit 150 ml Wasser vermischt. Der resultierende rohe Feststoff wurde durch Filtration aufgefangen, im Vakuum getrocknet und an 200 g Kieselgel flashchromatographiert (1% McOH/EtOAc → 5% MeOH/EtOAc), um 0,40 g (40%) Ethyl-N-(N-(4-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl)-3-(1-naphthyl)-L-alaninat als weißes Pulver zu liefern, Smp. 225°C (Zers.).

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 12,55 (s, 1H, Benzochinazolin-NH), 9,87 (s, 1H, aromatisches CH), 8,63 (d, 1H, J=7,5, Amid-NH, 8,24 (d, 1H, J=8,3, aromatisches CH), 8,09 (d, 1H, J=7,7, aromatisches CH), 8,03 (d, 1H, J=8,0, aromatisches CH), 7,92 (d, 1H, J=7,1, aromatisches CH), 7,79 (t, 1H, J=5,6, 4-Aminobenzoyl-NH), 7,68–7,30 (m, 9H, aromatisches CH, Amid-NH), 6,56 (d, 1H, J=7,9, aromatisches CH), 6,42 (d, 1H, J=14,4, aromatisches CH), 4,68-4,43 (m, 4H, Benzochinazolin-9-CH₂, Glu-Methin, Naphthylala-Methin), 4,10-3,92 (m, 4H, Ethyl-CH₂), 3,63–3,30 (m, 2H, Naphthyl-CH₂), 2,45 (Benzochinazolin-CH₃), 2,29 (m, 2H, Glu-4-CH₂), 2,07–1,74 (m, 2H, Glu-3-CH₂), 1,14 (t, 3H, J=7,1, Ethyl-CH₃), 1,03 (t, 3H, J=7,1, Ethyl-CH₃).

Beispiel 12
N-(N-(4-(((1,2-Dihydro-3-methyl-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-L-glutam-1-yl)-3-(1-naphthyl)-L-alanin
In einen mit einem Magnetrührer und Stickstoffeinlaß ausgerüsteten 50 ml-Dreihalskolben wurden 0,15 g N-(N-(4-(((1,2-Dihydro-3-methyl-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl)-3-(1-naphthyl)-L-alaninat, 8 ml von 1:1 THF:H₂O und 20 mg LiOH·H₂O gegeben. Die Mischung wurde bei RT unter Stickstoff gerührt. Nach 1 h zeigte eine Analyse der Lösung durch DC (SiO₂, 3% McOH/CH₂Cl₂) keinen verbleibenden Ausgangsstoff und eine neue Komponente bei R_f = 0,0. Die Lösung wurde durch Zugabe von 1N wäßrigem HCl auf pH 5 angesäuert, und die resultierende weiße Suspension wurde im Vakuum zur Trockene aufkonzentriert. Analyse des Rückstands durch Umkehrphasen-HPLC (C18, 65:35:0,1 H₂O:MeCN:TFA) zeigte eine Hauptkomponente (95%) bei k' = 3,17 und eine Nebenkomponente (5%) bei k' = 4,90 an. Das Rohprodukt wurde durch halbpräparative Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung von Gradientenelution (C18, 70:30:0,1 → 65:35:0,1 H₂O:MeCN:TFA über 10 min) gereinigt. Reine Fraktionen (gemäß Bestimmung durch analytische HPLC) wurden vereinigt, auf 20 ml im Vakuum auf konzentriert und lyophilisiert, um 76 mg (50%) N-(N-(4-(((1,2-Dihydro-3-methyl-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-L-glutam-1-yl)-3-(1-naphthyl)-L-alanin als cremefarbenes Pulver zu liefern. Smp. 180°C (Zers.).

HPLC: ein Peak auf C18, k' = 3,53, 62:35:0,1 H₂O:MeCN:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min.
¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 13,30–12,20 (br m, COOH), 9,82 (s, 1H, aromatisches CH), 8,44 (d, 1H, J=8,1, Amid-NH), 8,26 (d, 1H, J=8,9, aromatisches CH), 8,11 (d, 1H, J=8,3, aromatisches CH), 8,03 (d, 1H, J=8,3, aromatisches CH), 7,84 (d, 1H, J=8,2, aromatisches CH), 7,73 (d, 1H, J=7,8, aromatisches CH), 7,67–7,27 (m, 9H, aromatisches CH, Amid-NH), 6,53 (d, 1H, J=8,5, aromatisches CH), 6,38 (d, 1H, J=14,7, aromatisches CH), 4,63-4,38 (m, 4H, Benzochinazolin-9-CH₂, Glu-Methin, Naphthylala-Methin), 3,55 (m, 1H, Naphthyl-CH₂), 3,27 (m, 1H, Naphthyl-CH₂), 2,43 (s, 3H, Benzochinazolin-CH₃), 2,18 (m, 2H, Glu-4-CH₂), 2,00–1,70 (m, 2H, Glu-3-CH₂).

Elementaranalyse

Berechnet für C₃₉H₃₄N₅O₇F·1,5 H₂O-0,5 TFA (MG 787,76): C, 60,99; H, 4,80; N 8,89; Gefunden: C, 60,93; H, 4,82; N 8,98. Massenspektrum: (FAB) 704 (M+H)⁺, 613, 489, 371, 309. UV-Spektrum: (Puffer pH 7) λ_max (ε) 223,4 (82600), 266,4 (53100), 348,6 (5500). λ_min (ε) 243,2 (23500), 340,2 (3430).

Beispiel 13
Ethyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-3-(1-naphthyl)-L-alaninat
Zu einer Lösung aus 0,24 ml DECP (Aldrich) und 0,22 ml Et₃N in 20 ml wasserfreiem DMF in einem 100 ml-Dreihalskolben wurden 0,20 g Ethyl-N-(4-(2,4-diamino-6-pteridinylmethyl)-N-methylamino)benzoesäurehemihydrochloriddihydrat (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, 53233) und 0,04 ml Et₃N, gelöst in 3 ml DMPU, gegeben. Die Lösung wurde bei RT unter Stickstoff für 3 h gerührt und mit einer Lösung aus 0,23 g Ethyl-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-3-(1-naphthyl)-L-alaninat·HCl und 0,15 ml Et₃N in 2 ml wasserfreiem DMF behandelt. Nach Rühren für 70 h wurde die Reaktionsmischung im Vakuum auf 3 ml aufkonzentriert und mit 60 ml Ethylether behandelt, um das Rohprodukt als klebrigen orangefarbenen Feststoff auszufällen. Der Ether wurde ab dekantiert und das Produkt in 60 ml CHCl₃ gelöst. Die Lösung wurde mit 1%igem wäßrigem NH₄OH extrahiert, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum zur Trockene auf konzentriert. Der gelb-orangefarbene Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie an 150 g Kieselgel gereinigt (7:7:1 CH₂Cl₂:Aceton:MeOH), um 0,26 g (70%) Ethyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-3-(1-naphthyl)-L-alaninat als gelbes Pulver zu liefern, Smp. 135°C (Zers.).

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,59 (s, 1H, Pteridinyl-7-CH), 8,45 (d, 1H, J=7,2, Amid-NH), 8,10 (d, 1H, J=8,0, aromatisches CH), 8,04 (d, 1H, J=8,2 aromatisches CH), 7,92 (d, 1H, J=6,8, aromatisches CH), 7,83–7,45 (m, 6H, aromatisches CH, NH₂), 7,41–7,23 (m, 2H, aromatisches CH), 6,84 (d, 2H, J=8,8, aromatisches CH), 6,65 (br s, 2H, NH₂), 4,81 (s, 2H, Pteridinyl-CH₂), 4,63–4,39 (m, 2H, Glu-Methin, Naphthylala-Methin), 4,13–3,91 (m, 4H, Ethyl-CH₂), 3,63–3,32 (m, 2H, Naphthyl-CH₂), 3,24 (s, 3H, N-CH₃), 2,34 (t, 2H, J=7,6, Glu-4-CH₂), 2,10–1,80 (m, 2H, Glu-3-CH₂), 1,17 (t, 3H, J=7,1, Ethyl-CH₃), 1,03 (t, 3H, J=7,1, Ethyl-CH₃).

Beispiel 14
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)-benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-(1-naphthyl)-L-alanin
In einen mit einem Magnetrührer und Stickstoffeinlaß ausgerüsteten 50 ml-Dreihalskolben wurden 0,13 g Ethyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-3-(1-naphthyl)-L-alaninat, 10 ml EtOH und 15 ml 0,2 N NaOH gegeben. Die resultierende Lösung wurde bei RT unter N₂ für 2,5 h gerührt, durch Zugabe von 1N wäßrigem HCl auf pH 5 angesäuert und im Vakuum zur Trockene aufkonzentriert. Analyse des gelben Feststoffs durch Umkehrphasen-HPLC (C18, 70:30:0,1 H₂O:MeCN:TFA) zeigte eine Hauptkomponente (93%) bei k' = 4,3 und vier Nebenkomponenten bei k' = 6,8, 3,5, 2,9 und 1,9 an. Eine 70 mg-Portion des Rohprodukts wurde durch halbpräparative Umkehrphasen-HPLC (C18, 70:30:0,1 H₂O:MeCN:TFA) gereinigt. Reine Fraktionen (gemäß Bestimmung durch analytische HPLC) wurden vereinigt, im Vakuum auf 20 ml aufkonzentriert und lyophilisiert, um 36 mg (53%) N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)-methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-(1-naphthyl)-L-alanin als gelbes Pulver zu liefern, Smp. 175°C (Zers.).
HPLC: ein Peak an C18; k' = 3,23, 70:30:0,1 H₂O:MeCN:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 13,00–11,95 (br m, 2H, COOH), 8,65 (s, 1H, Pteridinyl-7-CH), 8,45 (br, 1H, NH₂), 8,36–8,18 (br, 1H, NH₂), 8,25 (d, 1H, J=7,5, Amid-NH), 8,10 (d, 1H, J=8,6, aromatisches CH), 7,96 (d, 1H, J=7,8, aromatisches CH), 7,90 (d, 1H, J=7,7, aromatisches CH), 7,70 (m, 3H, aromatisches CH), 7,60–7,45 (m, 3H, aromatisches CH, NH₂), 7,39-7,15 (m, 3H, aromatisches CH, Amid-NH, NH₂), 6,81 (d, 2H, J = 8,6, aromatisches CH), 4,84 (s, 2H, Pteridinyl-CH₂), 4,51 (m, 1H, Naphthylala-Methin), 4,42 (m, 1H, Glu-Methin), 3,57 (m, 1H, Naphthylala-CH₂), 3,28 (m, überlappender H₂O-Peak, Naphthylala-CH₂), 3,25 (s, 3H, N-CH₃), 2,23 (t, 2H, J=7,5, Glu-4-CH₂), 2,02–1,72 (m, 2H, Glu-3-CH₂).

Elementaranalyse

Berechnet für C₃₃H₃₃N₉O₆·1,5 H₂O·0,5 TFA (MG 735,72): C, 55,51; H, 5,00; N 17,13; Gefunden: C, 55,65; H, 5,09; N 16,92. Massenspektrum: (FAB) 652 (M+H)⁺, 581, 461, 371, 309. UV-Spektrum: (Puffer pH 7) λ_max (ε) 224,3 (74700), 260,3 (24900), 295,9 (24100), 372,5 (7150). λ_min (ε) 242,3 (15200), 271,0 (20500), 345,2 (5550).

Beispiel 15
N-((Benzyloxy)carbonyl)-5-O-methyl-L-glutaminsäure
In einen mit einem Thermometer und Magnetrührer ausgerüsteten 1 l-Dreihalskolben wurden 4,90 g L-Glutaminsäure-γ-methylester (Sigma) und 200 ml Wasser gegeben. Die Lösung wurde auf 60°C erwärmt, mit 6,40 g NaHCO₃, gefolgt von 5,20 ml Benzylchlorformiat (Aldrich) behandelt und auf RT unter kräftigem Rühren abkühlen gelassen. Nach 4 h wurde die Reaktionsmischung mit Ethylether (4 × 100 ml) extrahiert, und die Ether-Extrakt wurden verworfen. Die wäßrige Lösung wurde durch Zugabe von konzentriertem HCl auf einen Kongorot-Endpunkt angesäuert. Eine ölige Emulsion resultierte, die mit CH₂Cl₂ (4 × 60 ml) extrahiert wurde. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit 0,05 N wäßrigem HCl (2 × 60 ml) gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum auf konzentriert, um 8,32 g (92%) N-((Benzyloxy)carbonyl)-5-O-methyl-L-glutaminsäure als weißen kristallinen Feststoff zu liefern, Smp. 61-63°C.
Beispiel 16
Glycin-tert-butylester-benzophenonimin
Ein mit einem Magnetrührer und Stickstoffeinlaß ausgerüsteter 500 ml-Dreihalskolben wurde mit 10,00 g Glycin-tert-butylester·HCl (Sigma) und 200 ml wasserfreiem CH₂Cl₂ gefüllt. Die Lösung wurde mit 10,80 g Benzophenonimin (Aldrich) behandelt und bei RT unter Stickstoff für 24 h gerührt. Ein feiner weißer Niederschlag aus NH₄Cl bildete sich während der Reaktion. Die Mischung wurde im Vakuum zur Trockene aufkonzentriert, um einen weißen Feststoff zu ergeben, der in 250 ml Ethylether suspendiert und mit Wasser (3 × 200 ml) gewaschen wurde, um NH₄Cl zu entfernen. Die Ether- Lösung wurde über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert, um einen weißen Feststoff zu liefern. Das Material wurde in 30 ml CH₂Cl₂ gelöst und unter Zugabe von 150 ml Pentan verrieben. Ein weißer kristalliner Feststoff resultierte, der durch Filtration aufgefangen, im Vakuum getrocknet und als Glycin-tert-butylester-benzophenonimin durch ¹H-NMR identifiziert wurde. Ausbeute = 15,0 g (85%), Smp. 110–112°C.
Beispiel 17
2-Iodbenzoylbromid
In einen mit einem Stickstoffeinlaß und einem Magnetrührer ausgerüsteten trockenen 100 ml-Dreihalskolben wurden 5,00 g 2-Iodbenzylalkohol (Aldrich) und 20 ml wasserfreies CH₂Cl₂ gegeben. Die resultierende Suspension wurde auf 0°C abgekühlt und mit 0,71 ml PBr₃ (Aldrich) durch Zutropfen über einen Zeitraum von 2 Minuten behandelt. Der Feststoff löste sich langsam unter Erhalt einer hellgelben Lösung, die unter Stickstoff bei 0°C für 2 h gerührt und dann auf RT unter fortgesetztem Rühren für 18 h erwärmen gelassen wurde. Die Lösung wurde im Vakuum zur Trockene aufkonzentriert, und der Rückstand wurde in 60 ml Ethylether gelöst. Die Ether-Lösung wurde mit eiskaltem 5%igem wäßrigem NaHCO₃ (3 × 50 ml) gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert, um 5,65 g (89%) 2-Iodbenzylbromid als weißen kristallinen Feststoff zu liefern, Smp. 52–54°C.
Beispiel 18
2-Iod-L-phenylalanin-tert-butylester-benzophenonimin
Ein mit einem Stickstoffeinlaß und Magnetrührer ausgerüsteter 500 ml-Dreihalskolben wurde mit 20,00 g Glycin-tert-butylester-benzophenonimin, 24,13 g 2-Iodbenzylbromid, 2,85 g N-Benzylcinchonidiniumchlorid (Fluka Chemical Corp., Ronkonkoma, NY, 11779) und 105 ml CH₂Cl₂ gefüllt. Die resultierende Lösung wurde mit 110 ml 50%igem (G/G) wäßrigem NaOH behandelt, und die Mischung wurde kräftig bei RT unter Stickstoff gerührt. Nach 24 h zeigt DC (Kieselgel, 7:1 Hexan:EtOAc) eine neue Hauptkomponente bei R_f = 0,65, nicht-umgesetztes Ausgangsmaterial bei R_f = 0,85 und drei Nebenkomponenten bei R_f = 0,20–0,45 an. Die CH₂Cl₂-Phase wurde abgetrennt, mit Wasser (3 × 70 ml) gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert, um ein dickes rosafarbenes Öl zu liefern. Das Rohprodukt wurde an 550 g Kieselgel unter Elution mit 7:1 Hexan:EtOAc flash-chromatographiert (die Säule wurde durch Hindurchleiten von Säulenvolumina 0,5% Et₃N in 7:1 Hexan:EtOAc vorbehandelt), um 26,4 g (76%) der gewünschten Enantiomermischung gemäß Identifizierung durch 1H-NMR zu ergeben. Das Produkt wurde durch chirale HPLC als Mischung aus zwei Enantiomeren bestimmt (Pirkle-Phenylglycin, 99:1 Hexan:Isopropanol, Fließ geschwindigkeit = 1 ml/min): k' = 3,66 (76%), k' = 3,28 (24%). Die Mischung wurde in 160 ml Hexan gelöst und bei 4°C für 2 Tage kristallisieren gelassen. Der Feststoff wurde durch Filtration abgetrennt und im Vakuum getrocknet, um 10,72 g (31%) racemisches Material zu liefern. Das Filtrat wurde im Vakuum aufkonzentriert, um 15,72 g (45%) enantiomerisch angereichertes Material (2-Iod-L-phenylalanin-tert-butylester-benzophenonimin, ee = 86%) als transparentes viskoses Öl zu ergeben. Das Produkt wurde in den nachfolgenden Schritten ohne weitere Reinigung verwendet.

¹H-NMR: (200 MHz, CDCl₃) δ: 7,72 (d, 1H, J=7,8, aromatisches CH), 7,60 (m, 2H, aromatisches CH), 7,41–7,21 (m, 6H, aromatisches CH), 7,19 (m, 2H, aromatisches CH), 6,86 (m, 1H, aromatisches CH), 6,55 (d, 2H, J=6,6 aromatisches CH), 4,34 (dd, 1H, J=3,9, 9,6, Methin), 3,48–3,21 (m, 2H, Ar-CH₂), 1,47 (s, 9H, t-Bu).
Massenspektrum (CI, CH₄), 512 (M+H)⁺, 484, 456, 410, 384, 217.

Beispiel 19
2-Iod-L-phenylalanin
Ein mit einem Rückflußkühler und einem Magnetrührer ausgerüsteter 500 ml-Rundkolben wurde mit 15,72 g 2-Iod-L-phenylalanin-tert-butylester-benzophenonimin (86% ee) und 165 ml 6N wäßrigem HCl gefüllt. Die Mischung wurde unter Rühren für 4 h zum Rückfluß erwärmt und auf RT abgekühlt, um eine Mischung aus weißem kristallinem Feststoff und einer unmischbaren organischen Phase (Benzophenon) zu liefern. Die Mischung wurde zwischen Wasser (100 ml) und Ethylether (70 ml) aufgetrennt. Die wäßrige Phase wurde abgetrennt, mit vier zusätzlichen 70 ml-Portionen Ether gewaschen und im Vakuum zur Trockene aufkonzentriert, um 9,5 g (94%) 2-Iod-L-phenyl-alanin·HCl als flockigen weißen Feststoff zu ergeben, Smp. 240°C (Zers.).

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,90–8,23 (br s, 3H, -NH₃ ⁺), 7,88 (d, 1H, J=8,1, aromatisches CH), 7,39 (m, 2H, aromatisches CH), 7,04 (m, 1H, aromatisches CH), 4,06 (t, 1H, J=7,4, Methin), 3,23 (m, 2H, Ar-CH₂).

Beispiel 20
Methyl-2-iod-L-phenylalaninat
In einen mit einem Magnetrührer und Rückflußkühler ausgerüsteten 500 ml-Dreihalskolben wurden 5,00 g 2-Iod-L-phenylalanin·HCl und 100 ml wasserfreies McOH gegeben. Die Mischung wurde gerührt und durch Hindurchblasen von HCl-Gas für 3 min angesäuert. Es resultierte eine klare Lösung, die für 5 h zum Rückfluß erwärmt wurde. Die Lösung wurde auf RT abgekühlt und im Vakuum zur Trockene aufkonzentriert, um einen weißen Feststoff zu ergeben. Das Material wurde in 120 ml CH₂Cl₂ suspendiert und mit 5%igem wäßrigem NaHCO₃ (4 × 80 ml) gewaschen. Die CH₂Cl₂-Lösung wurde auf ein Volumen von 20 ml aufkonzentriert, mit Ethylether auf 60 ml verdünnt und mit 16 ml 1M etherischen HCl behandelt. Ein weißer Feststoff fiel aus, der durch Vakuumfiltration aufgefangen und im Vakuum getrocknet wurde, um 4,90 g (94%) Methyl-2-iod-L-phenylalaninat·HCl zu liefern, Smp. 194–196°C.
Beispiel 21
Methyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-methyl-L-glutam-1-yl-2-iod-L-phenylalaninat
Ein mit einem Stickstoffeinlaß und einem Magnetrührer ausgerüsteter trockener 500 ml-Dreihalskolben wurde mit 3,00 g Methyl-2-iod-L-phenylalaninat·HCl, 2,59 g N-((Benzyloxy)carbonyl)-5-O-methyl-L-glutaminsäure und 80 ml CH₂Cl₂ gefüllt. Die Mischung wurde auf 0°C in einem Eis-Wasser-Bad abgekühlt und mit 0,97 ml N-Methylmorpholin, gefolgt von 1,77 g EDC (Aldrich) behandelt. Die Reaktionsmischung wurde bei 0°C für 1 h gerührt und auf RT unter fortgesetztem Rühren für weitere 3 h erwärmen gelassen. Die Lösung wurde mit 100 ml CH₂Cl₂ verdünnt, mit 5%iger wäßriger Zitronensäure (3 × 70 ml) und 5%igem wäßrigem NaHCO₃ (3 × 70 ml) gewaschen und über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet. Entfernung des Trocknungsmittels durch Filtration, gefolgt von Aufkonzentrieren des Filtrats im Vakuum lieferte 4,30 g (84%) eines cremefarbenen kristallinen Feststoffs, Smp. 110–112°C. Untersuchung durch ¹H-NMR zeigte Methyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-methyl-L-glutam-1-yl-2-iod-L-phenylalaninat an, das mit ca. 4% des (S,R)-Diastereomers verunreinigt war. Das Rohprodukt wurde zweimal aus 1:1 EtOH-H₂O umkristallisiert, um 3,47 g (68%) reines (S,S)-Diastereomer als weißen kristallinen Feststoff zu ergeben, Smp. 114-116°C.
Beispiel 22
Methyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-methyl-L-glutam-1-yl-2-(methoxycarbonyl)-L-phenylalaninat
In einen mit einem Thermometer, Magnetrührer und Rückflußkühler ausgerüsteten trockenen 100 ml-Dreihalskolben wurden 1,50 g Methyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-methyl-L-glutam-1-yl-2-iod-L-phenylalaninat, 0,149 g Pd(Ph₃P)₄ (Aldrich) und 35 ml 1:1 McOH:THF unter einer Stickstoffspülung gegeben. Die Lösung wurde durch Hindurchblasen von Stickstoff für 10 min desoxygeniert und wurde dann mit CO durch Hindurchblasen von CO für 10 min gesättigt. Die Lösung veränderte ihre Farbe von Gelb hin zu Hellorange während diese Zeitraums. Das Reaktionsgefäß wurde unter einen CO-Ballondruck gesetzt, indem ein CO-gefüllter Ballon an den Kühler über einen Gaseinlaßadapter angebracht wurde. Die Reaktionsmischung wurde unter Rühren auf 60°C erwärmt. Nach 3 h zeigte eine Analyse durch DC (SiO₂, 1:1 Hexan:EtOAc) keinen verbleibenden Ausgangsstoff, eine neue Komponente bei R_f = 0,40 und zwei Nebenkomponenten bei R_f = 0,90–0,95 an. Die Lösung wurde auf RT abgekühlt und im Vakuum aufkonzentriert, um einen gelben Feststoff zu ergeben. Dieses Material wurde durch Flash-Chromatographie an 85 g Kieselgel (1:1 Hexan:EtOAc) gereinigt, um 1,23 g (93%) Methyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-methyl-L-glutam-1-yl-2-(methoxycarbonyl)-L-phenylalaninat als weißen kristallinen Feststoff zu liefern, Smp.: 128–130°C.
Beispiel 23
Methyl-5-O-methyl-L-glutam-1-yl-2-(methoxycarbonyl)-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 10 wurden 1,10 g Methyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-methyl-L-glutam-1-yl-2-(methoxycarbonyl)-L-phenylalaninat in Gegenwart von 0,214 g 10% Pd(C) und 0,18 ml Acetylchlorid hydrogenolysiert, um 0,86 g (97%) Methyl-5-O-methyl-L-glutam-1-yl-2-(methoxycarbonyl)-L-phenylalaninat·HCl als hellgelben Schaum zu liefern, Smp. 77-80°C.
Beispiel 24
Methyl-N-(N-(4-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxo-benzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-5-0-methyl-L-glutam-1-yl)-2-(methoxycarbonyl)-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 11 wurden 0,50 g 4-(((1,2-Dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoesäure mit 0,55 g Methyl-S-O-methyl-L-glutam-1-yl-2-(methoxycarbonyl)-L-phenylalaninat·HCl unter Verwendung von 0,17 ml Isobutylchlorformiat und 0,14 ml (2×) N-Methylmorpholin gekuppelt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an 250 g Kieselgel (97:3 → 95:5 CH₂Cl₂:MeOH) gereinigt, um 0,29 g (30%) Methyl-N-(N-(4-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxo-benzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-5-O-methyl-L-glutam-1-yl)-2-(methoxy-carbonyl)-L-phenylalaninat als weißes Pulver zu liefern, Smp. 180°C (Zers.).

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 12,52 (s, 1H, Benzochinazolin-H), 9,86 (s, 1H, aromatisches CH), 8,52 (d, 1H, J=7,6, Amid-NH), 8,23 (d, 1H, J=8,8, aromatisches CH), 8,03 (d, 1H, J=8,4, aromatisches CH), 7,80 (d, 1H, J=7,2, aromatisches CH), 7,59 (m, 2H, aromatisches CH, 4-Amino-benzoyl-NH), 7,50 (t, 1H, J=7,6, aromatisches CH), 7,44–7,21 (m, 5H, aromatisches CH), Amid-NH), 6,53 (d, 1H, J=8,0, aromatisches CH), 6,40 (d, 1H, J=14,5, aromatisches CH), 4,58 (m, 3H, Benzochinazolin-9-CH₂, Methin), 4,45 (m, 1H, Methin), 3,82 (s, 3H, ArCO₂CH₃), 3,57 (s, 3H, CO₂CH₃), 3,55 (s, 2H, CO₂CH₃), 3,48 (m, 1H, phe-Ar-CH₂), 3,10 (m, 1H, phe-Ar-CH₂), 2,45 (s, 3H, CH₃), 2,27 (t, 2H, J=7,5, Glu-4-CH₂), 2,01–1,73 (m, 2H, Glu-3-CH₂).

Beispiel 25
N-(N-(4-(((1,2-Dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-L-glutam-1-yl)-2-carboxy-L-phenylalanin
Ein mit einem Stickstoffeinlaß und Magnetrührer ausgerüsteter 50 ml-Dreihalskolben wurde mit 0,11 g Methyl-N-(N-(4-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxo-benzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-S-O-methyl-L-glutam-1-yl)-2-(methoxycarbonyl)-L-phenylalaninat und 15 ml 1:1 THF:H₂O gefüllt. Die Lösung wurde mit 62 mg LiOH (Fisher Scientific Co., Fair Lawn, NJ) behandelt und unter Stickstoff bei RT gerührt. Nach 18 h zeigte eine Analyse durch HPLC (C18, 70:30:0,1 H₂O:MeCN:TFA) keinen verbleibenden Ausgangsstoff (k' = 4,89), eine neue Komponente bei k' = 2,29 (92%) und drei Nebenkomponenten zwischen k' = 0,72 und 1,13. Die Lösung wurde im Vakuum auf 7 ml auf konzentriert und einer halbpräparativen HPLC unterworfen (C18, 80:20:0,1 → 70:30:0,1 H₂O:MeCN:TFA über 25 min). Reine Fraktionen (gemäß Bestimmung durch analytische HPLC) wurden vereinigt und im Vakuum zur Trockene aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in 20 ml 0,17 M wäßrigem LiOH gelöst, filtriert und durch Zugabe von 1N wäßrigem HCl auf pH 3,5 angesäuert. Ein weißer Feststoff resultierte, der durch Zentrifugieren abgetrennt und mit vier Durchläufen von wäßrigem Suspendieren-Zentrifugieren-Abdekantieren gewaschen wurde. Das Produkt wurde in 10 ml Wasser suspendiert, eingefroren und lyophilisiert, um 60 mg (56%) N-(N-(4-(((1,2-Dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-L-glutam-1-yl)-2-carboxy-L-phenylalanin als flockigen weißen Feststoff zu liefern, Smp. 245°C (Zers.).

HPLC: ein Peak an C18, k' = 1,86, 70:30:0,1 H₂O:MeCN:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min.
¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 13,00–11,70 (br s, COOH), 12,54 (s, 1H, Benzochinazolin-NH), 9,84 (s, 1H, aromatisches CH), 8,35 (d, 1H, J=7,9, Amid-NH), 8,22 (d, 1H, J=9,1, aromatisches CH), 8,01 (d, 1H, J=8,2, aromatisches CH), 7,78 (d, 1H, J=7,8, aromatisches CH), 7,60 (m, 2H, aromatisches CH, 4-Aminobenzoyl-NH), 7,50 (t, 1H, J=7,8, aromatisches CH), 7,45–7,18 (m, 5H, aromatisches CH, Amid-NH), 6,53 (d, 1H, J=8,5, aromatisches CH), 6,39 (d, 1H, J=14,7, aromatisches CH), 4,67–4,46 (m, 3H, Benzochinazolin-9-CH₂, Methin), 4,41 (m, 1H, Methin), 3,55 (dd, 1H, J=4,0, 12,3; Phe-Ar-CH₂); 3,06 (dd, 1H, J=10,2, 12,9; Phe-Ar-CH₂), 2,42 (s, 3H, CH3), 2,16 (t, 2H, J=7,3, Glu-4-CH₂), 1,98–1,64 (m, 2H, Glu-3-CH₂).

Elementaranalyse

Berechnet für C₃₆H₃₂N₅O₉F·H₂O·(MG 715,69): C, 60,42; H, 4,79; N 9,79; Gefunden: C, 60,49; H, 4,83; N 9,76. Massenspektrum: (Ionen-Spray) 698 (M+H)⁺, 489, 361. UV-Spektrum: (Puffer pH 7) λ_max (ε) 265,2 (43700), 298,4 (25600), 347,9 (5320), λ_min (ε) 241,5 (20300), 284,9 (24600), 340,0 (3140).

Beispiel 26
Methyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methyl-amino)benzoyl)-5-O-methyl-L-glutam-1-yl-2-(methoxycarbonyl)-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 13 wurden 0,26 g 4-(N-(2,4-Diamino-6-pteridinylmethyl)-N-methylamino)benzoesäure-hemihydrochloriddihydrat (Aldrich) mit 0,32 g Methyl-5-O-methyl-L-glutam-1-yl-2-(methoxycarbonyl)-L-phenylalaninat·HCl unter Verwendung 0,35 ml DECP (Aldrich) und 0,58 ml Et₃N umgesetzt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an 100 g Kieselgel (7:7:1 CH₂Cl₂:Aceton:MeOH) gereinigt, um 0,27 g (51%) Methyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-methyl-L-glutam-1-yl-2-(methoxycarbonyl)-L-phenylalaninat als gelbes Pulver zu liefern, Smp. 125–130°C.
Beispiel 27
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)-benzoyl)-L-glutam-1-yl-2-carboxy-L-phenylalanin
In einen mit einem Magnetrührer und Stickstoffeinlaß ausgerüsteten 50 ml-Dreihalskolben wurden 0,12 g Methyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-methyl-glutam-1-yl-2-(methoxycarbonyl)-L-phenylalaninat und 10 ml 1:1 H₂O:THF gegeben. Die Mischung wurde mit 29 mg LiOH·H₂O (J.T. Bakcer Chemicals Co., Phillipsburg, NJ) behandelt und bei RT unter Stickstoff gerührt. Nach 48 h zeigte eine Analyse durch HPLC (C18, 72:25:0,1 H₂O:MeCN:TFA) eine neue Hauptkomponente bei k' = 1,70 (ca. 90%) und drei Nebenkomponenten bei k' = 0,60, 1,03 und 2,58 an. Die Lösung wurde durch Zutropfen von 1N wäßrigem HCl neutralisiert und im Vakuum zur Trockene auf konzentriert. Der Rückstand wurde in 10 ml McOH gelöst, filtriert und mit 20 ml Wasser verdünnt, um das Produkt auszufällen. Das McOH wurde durch Rotationsverdampfen entfernt, und die verbleibende Suspension wurde eingefroren und lyophilisiert, um 65 mg (45%) N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-2-carboxy-L-phenylalanin als gelbes Pulver zu liefern, Smp. 160°C (Zers.).

HPLC: zwei Peaks an C18; k' = 2,49 (98%), k' = 5,65 (2%), 78:22:0,1 H₂O:MeCN:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min.
¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 13,10–11,90 (br5, COOH), 8,64 (s, 1H, Pteridinyl-7-CH), 8,62 (br s, 1H, NH₂), 8,18 (d, 1H, J=8,0, Amid-NH), 7,92 (d, 1H, J=8,0, Amid-NH), 7,80–7,20 (br m, 2H, NH₂), 7,77 (d, 1H, J=7,3 aromatisches CH), 7,70 (d, 2H, J=8,9, aromatisches CH), 7,25 (m, 3H, aromatisches CH), 6,81 (d, 2H, J=9,0, aromatisches CH), 4,84 (s, 2H, Pteridinyl-CH₂), 4,49 (m, 1H, Methin), 4,39 (m, 1H, Methin), 3,51 (m, 1H, Phe-Ar-CH₂), 3,24 (s, 3H, N-CH₃), 3,08 (m, 1H, Phe-Ar-CH₂), 2,19 (t, 2H, J=7,6, Glu-4-CH₂), 1,97–1,72 (m, 2H, Glu-3-CH₂).

Elementaranalyse

Berechnet für C₃₀H₃₁N₉O₈·2,7 H₂O·1,2 TFA (MG 831,10): C, 46,82; H, 4,56; N 15,17; Gefunden: C, 46,76; H, 4,48; N 15,15. Massenspektrum: (Ionen-Spray) 646 (M+H)⁺, 410, 369, 185 UV-Spektrum: (Puffer pH 7) λ_max (ε) 258,8 (23400), 307,0 (24200), 372,8 (7540). λ_min (ε) 242,0 (16000), 273,2 (16200), 344,3 (5900).

Beispiel 28
Dimethyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-0-methyl-L-glutam-1-yl-L-aspartat
Gemäß Beispiel 9 wurden 2,01 g L-Asparaginsäuredimethylester·HCl (Sigma) mit 3,00 g N-((Benzyloxy)carbonyl)-5-O-methyl-L-glutaminsäure unter Verwendung von 2,05 g EDC (Aldrich) und 1,12 ml N-Methylmorpholin gekuppelt. Dies ergab 3,93 g (88%) Dimethyl-N-((benzyloxy)carbonyl-5-O-methyl-L-glutam-1-yl-L-aspartat als kristallinen weißen Feststoff, Smp. 86–88°C.
Beispiel 29
Dimethyl-5-O-methyl-L-glutam-1-yl-L-aspartat
Gemäß Beispiel 10 wurden 2,00 g Dimethyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-methyl-L-glutam-1-yl-L-aspartat in Gegenwart von 0,45 g 10% Pd(C) und 0,39 ml Acetylchlorid hydrogenolysiert, um 1,56 g (100%) Dimethyl-5-O-methyl-L-glutam-1-yl-L-aspartat·HCl als hellgelben Schaum zu liefern.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 9,14 (d, 1H, J=7,4, NH), 8,40 (br s, 3H, NH₃ ⁺), 4,72 (m, 1H, Glu-Methin), 3,89 (m, 1H, Asp-Methin), 3,66 (s, 3H, CO₂CH₃), 3,65 (s, 2H, CO₂CH₃), 3,64 (s, 3H, CO₂CH₃), 2,85 (d, 2H, J=6,2, Asp-CH₂), 2,49 (m, 2H, Glu-4-CH₂), 2,04 (m, 2H, Glu-3-CH₂).

Beispiel 30
Dimethyl-N-(N-(4-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxo-benzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-5-O-methyl-L-glutam-1-yl)-L-aspartat
Gemäß Beispiel 11 wurden 0,50 g 4-(((1,2-Dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoesäure mit 0,45 g Dimethyl-5-O-methyl-L-glutam-1-yl-L-aspartat·HCl unter Verwendung von 0,17 ml Isobutylchlorformiat und 0,14 ml (2×) N-Methylmorpholin gekuppelt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an 250 g Kieselgel (95:5 CH₂Cl₂:MeOH) gereinigt, um 0,33 g (38%) Dimethyl-N-(N-(4-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxo-benzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-5-O-methyl-L-glutam-1-yl)-L-aspartat als weißes Pulver zu liefern, Smp. 198–200°C.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 12,54 (s, 1H, Benzochinazolin-NH), 9,85 (s, 1H, aromatisches CH), 8,55 (d, 1H, J=7,7, Amid-NH), 8,23 (d, 1H, J=8,8, aromatisches CH), 8,02 (d, 1H, J=8,4, aromatisches CH), 7,70–7,45 (m, 4H, aromatisches CH, Amid-NH), 7,33 (m, 1H, 4-Amino-benzoyl-NH), 6,55 (dd, 1H, J=8,8, 1,9, aromatisches CH), 6,42 (dd, 1H, J=15,3, 1,7, aromatisches CH), 4,72–4,41 (m, 4H, Benzochinazolin-9-CH₂, Glu- und Asp-Methine), 3,62 (s, 3H, CO₂CH₃), 3,60 (s, 3H, CO₂CH₃), 3,55 (s, 3H, CO₂CH₃), 2,91–2,66 (m, 2H, Asp-CH₂), 2,42 (s, 3H, CH₃), 2,34 (t, 2H, J=7,7, Glu-4-CH₂), 2,13–1,80 (m, 2H, Glu-3-CH₂).

Beispiel 31
N-(N-(4-((1,2-Dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-L-glutam-1-yl-L-asparaginsäure
Gemäß Beispiel 12 wurden 0,12 g Dimethyl-N-(N-(4-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxo-benzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-5-O-methyl-L-glutam-1-yl)-L-aspartat in 8 ml 1:1 THF:H₂O unter Verwendung von 45 mg LiOH·H₂O (Baker) verseift. Die Analyse des Rohprodukts durch Umkehrphasen-HPLC (C18, 80:20:0,1 H₂O:MeCN:TFA) zeigte eine Hauptkomponente bei k' = 1,73 (90%) und eine Nebenkomponente bei k' = 1,28 an. Das Material wurde durch halbpräparative HPLC unter Verwendung einer Gradientenelution (C18, 80:20:0,1 → 75:25:0,1 H₂O:MeCN:TFA über 20 min) gereinigt. Reine Fraktionen (gemäß Bestimmung durch analytische HPLC) wurden vereinigt und im Vakuum aufkonzentriert. Der Rest wurde mit 20 ml Wasser vermischt und mit genügend LiOH·H₂O behandelt, um den Feststoff aufzulösen. Die Lösung wurde filtriert und durch Zugabe von 1N HCl auf pH 3,0 angesäuert. Ein weißer Feststoff fiel aus, der durch Zentrifugieren abgetrennt, mit vier Durchläufen von wäßrigem Suspendieren-Zentrifugieren-Dekantieren gewaschen und lyophilisiert wurde, um 57 mg (48%) N-(N-(4-((1,2-Dihydro-3-methyl-1- oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-L-glutam-1-yl-L-asparaginsäure als cremefarbenen Feststoff zu liefern, Smp. 185°C (Zers.).

HPLC: ein Peak an C18; k' = 1,42, 75:25:0,1 H₂O:MeCN:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min.
¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 12,85–12,00 (br s, COOH), 12,53 (s, 1H, Benzochinazolin-NH), 9,84 (s, 1H, aromatisches CH), 8,36 (d, 1H, J=7,9, Amid-NH), 8,21 (d, 1H, J=8,8, aromatisches CH), 8,01 (d, 1H, J=8,3, aromatisches CH), 7,67–7,46 (m, 4H, aromatisches CH, Amid-NH), 7,32 (m, 1H, 4-Aminobenzoyl-NH), 6,53 (d, 1H, J=8,5, aromatisches CH), 6,40 (d, 1H, J=14,8, aromatisches CH), 4,64–4,44 (m, 4H, Benzochinazolin-9-CH₂, Glu-Methin, Asp-Methin), 2,75–2,53 (m, 2H, Asp-CH₂), 2,42 (s, 3H, CH3), 2,25 (t, 2H, J=7,3, Glu-4-CH₂), 1,98 (m, 1H, Glu-3-CH₂), 1,83 (m, 1H, Glu-3-CH₂).

Elementaranalyse

Berechnet für C₃₀H₂₈N₅O₉F·1,8 H₂O·(MG 654,01): C, 55,10; H, 4,87; N 10,71; Gefunden: C, 55,04; H, 4,82; N 10,61. Massenspektrum: (Ionen-Spray) 622 (M+H)⁺, 316, 213, 156. UV-Spektrum: (Puffer pH 7) λ_max (ε) 264,8 (46200), 298,4 (28500), 347,8 (6180). λ_min (ε) 237,9 (19500), 285,7 (27900), 340,0 (3820).

Beispiel 32
Dimethyl-N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)-methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-methyl-L-glutam-1-yl)-L-aspartat
Gemäß Beispiel 13 wurden 0,200 g 4-(N-(2,4-Diamino-6-pteridinylmethyl)-N-methylamino)benzoesäure-hemihydrochloriddihydrat (Aldrich) mit 0,18 g Dimethyl-5-O-methyl-L-glutam-1-yl-L-aspartat·HCl unter Verwendung von 0,24 ml DECP (Aldrich) und 0,4 ml Et₃N gekuppelt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an 100 g Kieselgel (7:7:1 CH₂Cl₂:Aceton:MeOH) gereinigt, um 0,17 g (53%) Dimethyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)-methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-methyl-L-glutam-1-yl)-L-aspartat als gelbes Pulver zu liefern, Smp. 130–135°C.
Beispiel 33
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)-benzoyl)-L-glutam-1-yl-L-asparaginsäure (Verfahren A)
Für Verfahren B zur Herstellung dieser Verbindung siehe Beispiel 125. Ein mit einem Magnetrührer und einem Stickstoffeinlaß ausgerüsteter 50 ml-Dreihalskolben wurde mit 0,16 g Dimethyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-methyl-L-glutam-1-yl)-L-aspartat und 10 ml 1:1 THF:H₂O gefüllt. Die Lösung wurde mit 44 mg LiOH·H₂O (Baker) behandelt und bei RT unter N₂ gerührt. Nach 3 h zeigte DC (SiO₂, 7:7:1 CH₂Cl₂:Aceton:MeOH) keinen verbleibenden Ausgangsstoff bei R_r = 0,30 und einen einzelnen Fleck bei R_f bei 0,0 an. Analyse durch Umkehrphasen-HPLC (C18, 85:15:0,1 H₂O:MeCN:TFA) zeigte eine Hauptkomponente bei k' = 2,65 (90%) und eine Nebenkomponente bei k' = 1,94 an. Die Lösung wurde durch Zugabe von 1N HCl neutralisiert und im Vakuum zur Trockene auf konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch halbpräparative HPLC (C18, 87:13:0,1 H₂O:MeCN:TFA) gereinigt. Reine Fraktionen (gemäß Bestimmung durch analytische HPLC) wurden vereinigten und im Vakuum zur Trockene auf konzentriert. Der Rückstand wurde in 20 ml H₂O gelöst und lyophilisiert, um 65 mg (32%) N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-L-asparaginsäure als gelborangefarbenes Pulver zu liefern, Smp. 165–180°C (Zers.).

HPLC: ein Peak an C18; k' = 2,45, 85:15:0,1 H₂O:MeCN:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min.
¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 13,00–11,85 (br s, COOH), 9,17 (br s, 1H, NH₂), 8,96 (br s, 1H, NH₂), 8,71 (s, 1H, Pteridinyl-7-CH), 8,60–8,30 (br s, 1H, NH₂), 8,21 (d, 1H, J=8,0 Amid-NH), 8,06 (d, 1H, J=7,8, Amid-NH), 7,85–7,43 (br s, 1H, NH₂), 7,75 (d, 2H, J=8,7 aromatisches CH), 6,82 (d, 2H, J=8,8, aromatisches CH), 4,87 (s, 2H, Pteridinyl-CH₂), 4,59–4,38 (m, 2H, 2 Methine), 3,25 (s, 3H, N-CH₃), 2,75–2,53 (m, 2H, Asp-CH₂), 2,28 (t, 2H, J=7,5 Glu-4-CH₂), 2,01 (m, 1H, Glu-3-CH₂), 1,88 (m, 1H, Glu-3-CH₂).

Elementaranalyse

Berechnet für C₂₄H₂₇N₉O₈·1,9 H₂O·1,6 TFA·(MG 786,20): C, 41,55; H, 4,15; N 16,03; Gefunden: C, 41,53; H, 4,19; N 16,00. Massenspektrum: (Ionen-Spray) 570 (M+H)⁺, 223. UV-Spektrum: (Puffer pH 7) λ_max (ε) 258,7 (24400), 307,3 (26800), 372,9 (8080). λ_min (ε) 240,0 (14800), 272,9 (17000), 345,0 (6420).

Beispiel 34
Diethyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-glutamat
Gemäß Beispiel 9 wurden 3,17 g L-Glutaminsäurediethylester·HCl (Sigma) mit 4,09 g N-((Benzyloxy)carbonyl)-5-O-ethyl-L-glutaminsäure unter Verwendung von 2,66 g EDC (Aldrich) und 1,45 ml N-Methylmorpholin gekuppelt. Dies ergab 4,80 g (74%) Diethyl-N-((benzyloxy)carbonyl-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-L-glutamat als weißen kristallinen Feststoff, Smp. 104°C.
Beispiel 35
Diethyl-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-L-glutamat
In eine 500 ml Parr-Flasche wurden 0,75 g Diethyl-N-((benzyloxy)-carbonyl)-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-L-glutamat, 0,14 g 10% Pd (C) und 60 ml EtOH unter einer N₂-Spülung gegeben. Die Mischung wurde durch Hindurchblasen von N₂ für 7 min desoxygeniert, mit 1,52 ml 1M etherischem HCl behandelt und bei 45 psi für 18 h hydriert. Die Flasche wurde mit N₂ gespült, der Katalysator wurde durch Filtration durch Celite entfernt, und das Filtrat wurde im Vakuum zur Trockene aufkonzentriert, um 0,60 g (99%) Diethyl-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-L-glutamat·HCl als hellgelben Schaum zu liefern.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 9,11 (d, 1H, J=7,5, NH), 8,41 (br s, 3H, NH₃ ⁺), 4,32 (m, 1H, Methin), 4,06 (m, 6H, Ethyl-CH₂), 3,92 (m, 1H, Methin), 2,47 (m, 4H, Glu-4-CH₂), 2,12–1,79 (m, 4H, Glu-3-CH₂), 1,19 (t, 9H, J=7,1, Ethyl-CH₃).

Beispiel 36
Diethyl-N-(N-(4-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)-chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl)-Lglutamat
Gemäß Beispiel 11 wurden 0,57 g 4-(((-1,2-Dihydro-3-methyl-1-oxo-benzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoesäure mit 0,60 g Diethyl-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-L-glutamat·HCl unter Verwendung von 0,20 ml Isobutylchlorformiat und 0,17 ml (2×) N-Methylmorpholin gekuppelt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an 350 g Kieselgel (EtOAc → 98:2 EtOAc:MeOH) gereinigt, um 0,27 g (25%) Diethyl-N-(N-(4-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl)-L-glutamat als weißes Pulver zu liefern, Smp. 185–187°C.
Beispiel 37
N-(N-(4-(((1,2-Dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-L-glutam-1-yl)-L-glutaminsäure
Ein mit einem Magnetrührer und einem Stickstoffeinlaß ausgerüsteter 250 ml-Dreihalskolben wurde mit 0,217 g Diethyl-N-(N-(4-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl)-L-glutamat, 40 ml 0,2 N wäßrigem NaOH und 15 ml EtOH gefüllt. Die Mischung wurde bei RT unter N₂ gerührt. Der feste Ausgangsstoff löste sich langsam auf, um eine klare Lösung zu ergeben. Nach 2 h zeigte DC (SiO₂, EtOAc) kein verbleibendes Ausgangsmaterial bei R5 = 0,15 und einen neuen Fleck bei Rr = 0,0 an. Die Lösung wurde durch Zugabe von 1N HCl auf pH 3,00 angesäuert. Ein weißer Feststoff fiel aus, der durch Zentrifugieren abgetrennt, mit vier Durchläufen von wäßrigem Suspendieren- Zentrifugieren-Dekantieren gewaschen und lyophilisiert wurde, um 0,17 g (84%) N-(N-(4-(((1,2-Dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-L-glutam-1-yl)-L-glutaminsäure als weißes Pulver zu liefern, Smp. 180°C (Zers.). Das Produkt wurde durch HPLC als rein bestimmt.

HPLC: ein Peak an C18; k' = 1,66, 75:25:0,1 H₂O:MeCN:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min.
¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 12,65–11,90 (br s, COOH), 12,53 (s, 1H, Benzochinazolin-NH), 9,84 (s, 1H, aromatisches CH), 8,29 (d, 1H, J=7,5, Amid-NH), 8,22 (d, 1H, J=8,9, aromatisches CH), 8,01 (d, 1H, J=8,0, aromatisches CH), 7,60 (m, 3H, aromatisches CH, Amid-NH), 7,51 (t, 1H, J=9,0, aromatisches CH), 7,33 (m, 1H, 4-Aminobenzoyl-NH), 6,54 (dd, 1H, J=8,5, 1,9, aromatisches CH), 6,41 (dd, 1H, J=13,9, 1,4, aromatisches CH), 4,57 (d, 2H, J=5,2, Benzochinazolin-9-CH₂), 4,49 (m, 1H, Methin), 4,22 (m, 1H, Methin), 2,43 (s, 3H, CH₃), 2,28 (m, 4H, Glu-4-CH₂), 2,10–1,70 (m, 4H, Glu-3-CH₂).

Elementaranalyse

Berechnet für C₃₁H₃₀N₅O₉F·2 H₂O·(MG 671,64): C, 55,44; H, 5,10; N 10,43; Gefunden: C, 55,38; H, 5,12; N 10,26. Massenspektrum: (FAB) 636 (M+H)⁺, 613, 581, 549. UV-Spektrum: (Puffer pH 7) λ_max (ε) 264,9 (45100), 296,1 (28000), 331,4 (7280), 348,1 (5990). λ_min (ε) 285,6 (27200), 329,3 (7040), 339,8 (3700) λ_sh (ε) 271,5 (41900).

Beispiel 38
Diethyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methyl-amino)benzoyl)-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-L-glutamat
Gemäß Beispiel 13 wurden 0,142 g 4-(N-(2,4-Diamino-6-pteridinylmethyl)-N-methylamino)benzoesäure-hemihydrochloriddihydrat (Aldrich) mit 0,15 g Diethyl-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-L-glutamat·HCl unter Verwendung von 0,18 ml DECP (Aldrich) und 0,31 ml Et₃N gekuppelt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an 120 g Kieselgel (7:7:1 CH₂Cl₂:Aceton:MeOH) gereinigt, um 0,14 g (56%) Diethyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)-methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-L-glutamat als gelbes Pulver zu liefern, Smp. 105–109°C.
Beispiel 39
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methyl-amino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-L-glutaminsäure (Verfahren A)
Für Verfahren B zur Herstellung dieser Verbindung siehe Beispiel 129.
Gemäß Beispiel 33 wurden 0,125 g Diethyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-L-glutamat in 10 ml 1:1 THF:H₂O unter Verwendung von 23 mg LiOH (Fisher) verseift. Nach Rühren bei RT unter N₂ für 18 h wurde die Lösung durch Zugabe von 1N HCl auf pH 2,0 angesäuert und dann im Vakuum zur Trockene auf konzentriert. Analyse des Rückstands durch HPLC (C18, 85:15:0,1 H₂O:MeCN:TFA) zeigte eine Hauptkomponente bei k' = 2,89 (90%) und zwei Nebenkomponenten bei k' = 2,46 und 1,17 an. Das Rohprodukt wurde durch halbpräparative HPLC (C18, 87:13:0,5 H₂O:MeCN:TFA) gereinigt und lyophilisiert, um 37 mg (24%) N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-glutaminsäure als gelbes Pulver zu liefern, Smp. 178°C.

HPLC: ein Peak an C18; k' = 2,90, 85:15:0,1 H₂O:MeCN:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min.
¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 13,20–12,00 (br s, COOH), 9,30 (br s, 1H, NH₂), 9,10 (br s, 1H, NH₂), 8,74 (s, 1H, Pteridinyl-7-CH), 8,72–8,42 (br s, 1H, NH₂), 8,20 (d, 1H, J=7,5, Amid-NH), 8,07 (d, 1H, J=7,5, Amid-NH), 7,76 (d, 2H, J=8,8, aromatisches CH), 7,61–7,40 (br s, 1H, NH₂), 6,83 (d, 2H, J=8,8, aromatisches CH), 4,90 (s, 2H, Pteridinyl-CH₂), 4,43 (m, 1H, Methin), 4,20 (m, 1H, Methin), 3,27 (s, 3H, N-CH₃), 2,30 (m, 4H, Glu-4-CH₂), 2,08–1,77 (m, 4H, Glu-3-CH₂).

Elementaranalyse

Berechnet für C₂₅H₂₉N₉O₈·2,3 H₂O·1,7 TFA·(MG 818,84): C, 41,66; H, 4,35; N 15,40; Gefunden: C, 41,61; H, 4,25; N 15,44. Massenspektrum: (FAB) 584 (M+H)⁺, 309, 275, 176, 155, 119. UV-Spektrum: (Puffer pH 7) λ_max (ε) 220,9 (20500), 258,5 (21500), 306,7 (23200), 372,5 (7180). λ_min (ε) 240,1 (13400), 272,5 (15100), 344,8 (5730).

Beispiel 40
3-Cyano-L-tyrosin
Eine Lösung aus 5,70 g 3-Amino-L-tyrosin (Aldrich) in 35 ml 2,15 N wäßrigem HCl wurde auf 0°C abgekühlt und mit einer Lösung aus 1,41 g NaNO₂ (Aldrich) in 5 ml Wasser, gefolgt von 2,97 g Na₂CO₃ behandelt. Nach Rühren bei 0°C für 7 min wurde die Lösung langsam (über einen Zugabetrichter) zu einer gerührten Mischung aus 3,58 g CuCN (Aldrich), 5,88 g NaCN (Aldrich) und 5,72 g Na₂CO₃ in 40 ml Wasser, gehalten auf 75°C in einem mit einem Kühler ausgerüsteten 250 ml-Dreihalskolben, gegeben. Während der Zugabe erfolgte eine kräftige Entwicklung von Stickstoff, und die Reaktionsmischung veränderte die Farbe zu dunkelrot-orange. Die Reaktionsmischung wurde bei 75°C für 2 h gerührt, auf 95°C erwärmt und für eine weitere Stunde gerührt. Nach Abkühlen auf RT wurde die Reaktionsmischung auf pH 2,0 durch Zugabe von konzentriertem HCl über den Zugabetrichter angesäuert. Das entwickelte Gas wurde durch eine Falle mit 20% wäßrigem NaOH, gefolgt von einer Falle mit 5% NaOCl (Chlorox) gewaschen. Die Mischung wurde filtriert und der pH des Filtrats mit konzentriertem NH₄OH auf 6,0 eingestellt. Die braune Lösung wurde mit 300 ml Wasser vermischt und mit 300 g DOWEX 50WX-8 Ionenaustauscherharz (Säureform) gerührt. Das Harz wurde abfiltriert, mit 1 1 Wasser gewaschen, mit 500 ml Wasser vermischt und die Mischung durch Zugabe von konzentriertem NH₄OH auf pH 11 basisch gemacht. Die Mischung wurde filtriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockene auf konzentriert. Der dunkelbraune Rückstand wurde in 20 ml Wasser suspendiert und mit genügend 1 N NaOH behandelt, um den Feststoff aufzulösen. Der pH wurde dann durch Zugabe von 1N wäßrigem HCl auf 6,0 eingestellt. Ein Niederschlag bildete sich, der durch Filtration aufgefangen und im Vakuum getrocknet wurde, um 1,45 g (35%) 3-Cyano-L-tyrosin als schokoladenbraunen Feststoff zu liefern, Smp. >250°C.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 9,60–7,20 (br s, NH₂), 7,39 (s, 1H, aromatisches CH), 7,30 (m, 1H, aromatisches CH), 6,98 (m, 1H, aromatisches CH), 3,52 (m, 1H, Methin), 2,92 (m, 2H, ArCH₂).

Beispiel 41
Methyl-3-(methoxycarbonyl)-L-tyrosinat
Ein mit einem Rückflußkühler und einem Magnetrührer ausgerüsteter 250 ml-Dreihalskolben wurde mit 1,45 g 3-Cyano-L-tyrosin, 50 ml konzentriertem HCl und 50 ml Wasser gefüllt. Die Lösung wurde unter Rühren zum Rückfluß erwärmt. Nach 2 Tagen zeigte die Analyse der Reaktionsmischung durch HPLC (C18, 90:10:0,1 H₂O:MeCN:TFA) eine Hauptkomponente bei k' = 2,23 (75%) und eine Nebenkomponente bei k' = 1,59 (25%) an. Nach 4 Tagen zeigte HPLC nur das Material mit k' = 2,23 an. Die Reaktionsmischung wurde auf RT abgekühlt, filtriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockene aufkonzentriert, um 1,2 g 3-Carboxy-L-tyrosin als dunkelbraunen Feststoff zu ergeben. IR-Analyse (Nujol) zeigte den Verlust der Nitril-Streckschwingung von 3-Cyano-L-tyrosin bei 2223 cm^-1 an. Der rohe Feststoff wurde zu 60 ml wasserfreiem McOH in einem mit einem Kühler und einem Magnetrührer ausgerüsteten 250 ml-Dreihalskolben gegeben. Die Mischung wurde durch Hindurchblasen von HCl-Gas für 5 min angesäuert und unter Rühren zum Rückfluß erwärmt. Nach 6 h wurde die Reaktionsmischung auf RT abgekühlt und mit festem NaHCO₃ neutralisiert. Die Mischung wurde im Vakuum zur Trockene aufkonzentriert, mit 100 ml Wasser vermischt und mit CH₂Cl₂ (4 × 50 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit 5%igem wäßrigem NaHCO₃ (2 × 50 ml) gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum zu 10 ml auf konzentriert. Die Lösung wurde mit 35 ml Ether verdünnt und mit 5,5 ml 1M etherischem HCl behandelt. Ein Feststoff fiel aus, der durch Filtration aufgefangen, mit Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet wurde, um 0,90 g (50%) Methyl-3-(methoxycarbonyl)-L-tyrosinat·HCl als cremefarbenes Pulver zu liefern, Smp. 211-213°C.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 10,45 (s, 1H, OH), 8,59 (br s, 3H, NH₃ ⁺), 7,66 (s, 1H, aromatisches CH), 7,38 (dd, 1H, J=7,9, 1,1, aromatisches CH), 6,97 (d, 1H, J=7,9, aromatisches CH), 4,26 (m, 1H, Methin), 3,89 (s, 3H, CO₂CH₃), 3,68 (s, 3H, CO₂CH₃), 3,09 (m, 2H, ArCH₂).

Beispiel 42
Methyl-N-((benzyloxy)carbonyl-5-O-methyl-L-glutam-1-yl-3-(methoxycarbonyl)-L-tyrosinat
Gemäß Beispiel 9 wurden 0,80 g Methyl-3-(methoxycarbonyl)-L-tyrosinat·HCl mit 0,82 g N-((Benzyloxy)carbonyl)-5-O-methyl-L-glutaminsäure unter Verwendung von 0,56 g EDC (Aldrich) und 0,30 ml N-Methylmorpholin gekuppelt. Dies ergab 1,24 g (85%) Methyl-N-((benzyloxy)carbonyl-5-O-methyl-L-glutam-1-yl-3-(methoxycarbonyl)-L-tyrosinat als weißen Feststoff, Smp. 142-144°C.
Beispiel 43
Methyl-5-O-methyl-L-glutam-1-yl-3-(methoxycarbonyl)-L-tyrosinat
Gemäß Beispiel 10 wurden 0,99 g Methyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-methyl-L-glutam-1-yl-3-(methoxycarbonyl)-L-tyrosinat unter Verwendung von 0,19 g 10% Pd(C) und 0,15 ml Acetylchlorid in 90 ml 2:1 EtOH:EtOAc hydrogenolysiert, um 0,75 g (93%) Methyl-5-O-methyl-L-glutam-1-yl-3-(methoxycarbonyl)-L-tyrosinat·HCl als hellgelben Schaum zu liefern, Smp. 95–97°C (Zers.).
Beispiel 44
Methyl-N-(N-(4-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-5-O-methyl-L-glutam-1-yl)-3-(methoxycarbonyl)-L-tyrosinat
Gemäß Beispiel 11 wurden 0,65 g 4-(((1,2-Dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoesäure mit 0,75 g Methyl-5-O-methyl-L-glutam-1-yl-3-(methoxycarbonyl)-L-tyrosinat·HCl unter Verwendung von 0,22 ml Isobutylchlorformiat und 0,19 ml (2×) N-Methylmorpholin gekuppelt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an 300 g Kieselgel (99:1 → 94:6 EtOAc:MeOH) gereinigt, um 0,53 g (40%) Methyl-N-(N-(4-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-5-O-methyl-L-glutam-1-yl)-3- (methoxycarbonyl)-L-tyrosinat als weißes Pulver zu liefern, Smp. 195–203°C (Zers.).

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 12,52 (Benzochinazolin-NH), 10,38 (s, 1H, OH), 9,83 (s, 1H, aromatisches CH), 8,45 (d, 1H, J=7,5, Amid-NH), 8,21 (d, 1H, J=8,9, aromatisches CH), 8,00 (d, 1H, J=8,3, aromatisches CH), 7,60 (m, 3H, aromatisches CH, 4-Aminobenzoyl-NH), 7,48 (m, 2H, aromatisches CH), 7,36 (m, 2H, aromatisches CH, Amid-NH), 6,86 (d, 1H, J=8,6, aromatisches CH), 6,52 (dd, 1H, J=8,5, 1,9, aromatisches CH), 6,39 (dd, 1H, J=13,9, 1,5, aromatisches CH), 4,57 (d, 2H, J=5,6, Benzochinazolin-9-CH₂), 4,45 (m, 2H, Methine), 3,84 (s, 3H, CO₂CH₃), 3,58 (s, 3H, CO₂CH₃), 3,52 (s, 3H, CO₂CH₃), 3,05–2,80 (m, 2H, ArCH₂), 2,42 (s, 3H, CH₃), 2,25 (t, 2H, J=7,8, Glu-4-CH₂), 2,00–1,77 (m, 2H, Glu-3-CH₂).

Beispiel 45
3-Carboxy-N-(N-(4-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-L-glutam-1-yl)-L-tyrosin
Eine Lösung aus 0,15 g Methyl-N-(N-(4-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-5-O-methyl-L-glutam-1-yl)-3-(methoxycarbonyl)-L-tyrosinat in 20 ml 0,2 N wäßrigem NaOH wurde unter N₂ für 18 h bei RT gerührt. Analyse der Lösung durch HPLC (C18, 70:30:0,1 H₂O:MeCN:TFA) zeigte eine Hauptkomponente bei k' = 1,9 (90%) und zwei Nebenkomponenten bei k' = 1,0 und 2,6 an. Die Lösung wurde durch Zugabe von 1N HCl auf pH 2,5 angesäuert. Ein weißer Niederschlag resultierte, der durch Zentrifugieren abgetrennt und durch halbpräparative HPLC (C18, 72:25:0,1 H₂O:MeCN:TFA) gereinigt wurde. Reine Fraktionen (gemäß Bestimmung durch analytische HPLC) wurden vereinigt und im Vakuum zur Trockene auf konzentriert. Der Rückstand wurde in 20 ml 0,15 N wäßrigem NaOH gelöst und die Lösung durch Zugabe von 1N HCl auf pH 3,0 angesäuert. Der resultierende weiße Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt, mit vier Durchläufen von wäßrigem Suspendieren-Zentrifugieren-Dekantieren gewaschen und lyophilisiert, um 39 mg (26%) 3-Carboxy-N-(N-(4-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-L-glutam-1-yl)-L-tyrosin als weißes Pulver zu liefern, Smp. 198–205°C (Zers.).

HPLC: ein Peak an C18; k' = 1,86, 70:30:0,1 H₂O:MeCN:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min.
¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 13,00–11,00 (br m, COOH, Benzochinazolin-NH), 9,86 (s, 1H, aromatisches CH), 8,28 (d, 1H, J=7,5, Amid-NH), 8,24 (d, 1H, J=8,9, aromatisches CH), 8,03 (d, 1H, J=8,4, aromatisches CH), 7,70–7,42 (m, 5H, aromatisches CH, 4-Aminobenzoyl-NH), 7,40–7,24 (m, 2H, aromatisches CH, Amid-NH), 6,78 (d, 1H, J=8,6, aromatisches CH), 6,55 (dd, 1H, J=8,5, 1,9, aromatisches CH), 6,42 (dd, 1H, J=13,9, 1,5, aromatisches CH), 4,58 (d, 2H, J=5,8, Benzochinazolin-9-CH₂), 4,55–4,31 (m, 2H, Methine), 3,06–2,75 (m, 2H, ArCH₂), 2,24 (s, 3H, CH₃), 2,21 (t, 2H, J=7,6, Glu-4-CH₂), 2,08–1,70 (m, 2H, Glu-3-CH₂).

Elementaranalyse

Berechnet für C₃₆H₃₂N₅O₁₀F·2,2 H₂O·(MG 753,31): C, 57,40; H, 4,87; N 9,30; Gefunden: C, 57,37; H, 4,97; N 9,28. Massenspektrum: (FAB) 714 (M+H)⁺, 613, 549, 461, 360, 309. UV-Spektrum: (Puffer pH 7) λ_max (ε) 265,9 (44700), 300,2 (28200), 348,3 (5270). λ_min (ε) 246,3 (23400), 285,2 (25500), 340,8 (3630).

Beispiel 46
tert-Butyl-3-(tert-butoxycarbonyl)-L-tyrosinat
Ein mit einem Magnetrührer und einem Kühler ausgerüsteter 250 ml-Dreihalskolben wurde mit 4,1 g 3-Cyano-L-tyrosin und 100 ml 6N wäßrigem HCl gefüllt. Die Mischung wurde unter Rühren zum Rückfluß erwärmt. Nach 36 h zeigte HPLC (C18, 90:10:0,1 H₂O:MeCN:TFA) kein verbleibendes Ausgangsmaterial bei k' = 1,33 und eine neue Hauptkomponente bei k' = 1,69 an. Die Reaktion wurde auf RT abgekühlt, zur Entfernung der Feststoffe filtriert und im Vakuum zur Trockene auf konzentriert. Der Rückstand wurde in 100 ml 8:2 H₂O:MeOH gelöst und die Lösung durch zwei C18-Kissen (3,5 × 4,5 cm, EM-Trennungen LiChroprep RP-18) unter Spülen mit 8:2 H₂O:MeOH geleitet. Das Filtrat wurde im Vakuum zur Trockene auf konzentriert, um 4,5 g 3-Carboxytyrosin als braunen Feststoff zu liefern. Ein Teil dieses Material (1,30 g) wurde in 40 ml 1,4-Dioxan mit 2 ml konzentriertem H₂SO₄ gelöst, und die Lösung wurde zu 30 ml Isobutylen (kondensiert bei -78°C) in einer mit einem Magnetrührer ausgerüsteten 300 ml-Druckflasche gegeben. Das Gefäß wurde verschlossen, auf RT erwärmt und gerührt. Nach 48 h wurde die Flasche auf 0°C in einem Eis-Wasser-Bad abgekühlt, geöffnet und die Mischung mit 20 g NaHCO₃ behandelt. Nach Verdampfen des Isobutylens wurde die Mischung in 300 ml Wasser suspendiert und mit CH₂Cl₂ (4 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten CH₂Cl₂-Extrakte wurden mit 5%igem wäßrigem NaHCO₃ (2 × 50 ml) gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und im Vakuum unter Erhalt eines gelbbraunen Öls aufkonzentriert. Analyse durch DC (SiO₂ 97:3, CH₂Cl₂:MeOH) zeigte eine Hauptkomponente bei R_f = 0,41 und drei Nebenkomponenten bei R_f = 0,30, 0,25 und 0,0 an. Das Rohmaterial wurde durch Flash-Chromatographie an 75 g Kieselgel (94:6 CH₂Cl₂:MeOH) gereinigt, um 1,2 g eines hellgelben Öls zu ergeben. Das Öl wurde in 40 ml Ether gelöst und mit 3,9 ml 1M etherischem HCl behandelt. Ein Niederschlag bildete sich, der durch Filtration aufgefangen und im Vakuum getrocknet wurde, um 1,14 g (53%) tert-Butyl-3-(tert-butoxycarbonyl)-L-tyrosinat·HCl als flockigen weißen Feststoff zu liefern. Eine Analysenprobe (26 mg) wurde durch Umkristallisation aus McOH-Ether hergestellt, Smp. 205°C (Zers.).

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 10,69 (s, 1H, OH), 8,39 (br s, 3H, NH₃ ⁺), 7,57 (d, 1H, J=2,2, aromatisches CH), 7,43 (dd, 1H, J=8,6, 2,2, aromatisches CH), 6,96 (d, 1H, J=8,4, aromatisches CH), 4,12 (m, 1H, Methin), 3,11 (dd, 1H, J=14,3, 5,3, ArCH₂), 2,97 (dd, 1H, J=14,7, 8,1, ArCH₂), 1,57 (s, 9H, t-Bu), 1,36 (s, 9H, t-Bu).

Beispiel 47
tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-(tert-butoxycarbonyl)-L-tyrosinat
Gemäß Beispiel 9 wurden 0,323 g tert-Butyl-3-(tert-butoxycarbonyl)-L-tyrosinat·HCl mit 0,292 g N-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminsäure-γ-t-butylester (Sigma) unter Verwendung von 0,174 g EDC (Aldrich) und 0,095 ml N-Methylmorpholin gekuppelt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an 85 g Kieselgel (75:25 Hexan:EtOAc) gereinigt, um 0,49 g (89%) tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-(tert-butoxycarbonyl)-L-tyrosinat als klebrigen weißen Schaum zu liefern.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 10,67 (s, 1H, OH), 8,21 (d, 1H, J=7,4, NH), 7,56 (s, 1H, aromatisches CH), 7,46–7,26 (m, 7H, aromatisches CH, NH), 6,86 (d, 1H, J=8,5, aromatisches CH), 5,00 (m, 2H, PhCH₂O), 4,31 (m, 1H, Methin), 4,06 (m, 1H, Methin), 2,89 (d, 2H, J=6,9, ArCH₂), 2,21 (t, 2H, J=7,7, Glu-4-CH₂), 1,92–1,64 (m, 2H, Glu-3-CH₂), 1,57 (s, 9H, t-Bu), 1,38 (s, 9H, t-Bu), 1,33 (s, 9H, t-Bu).

Beispiel 48
tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-(tert-butoxycarbonyl)-L-tyrosinat
In eine 300 ml-Parr-Flasche wurden 0,076 g 10% Pd(C) und 20 ml McOH unter einem Stickstoffstrom gegeben. Dazu wurde eine Lösung aus 0,49 g tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-(tert-butoxycarbonyl)-L-tyrosinat in 50 ml McOH gegeben. Die Mischung wurde durch Hindurchblasen von Stickstoff für 7 min desoxygeniert und bei 50 psi für 3 h hydriert. Das Gefäß wurde mit Stickstoff gespült, der Katalysator durch Filtration durch Celite entfernt und das Filtrat im Vakuum unter Erhalt eines dicken Öls auf konzentriert. Dieses Material wurde durch Flash-Chromatographie an 70 g Kieselgel (98:2 CH₂Cl₂:MeOH) gereinigt, um 0,31 g (82%) tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-(tert-butoxycarbonyl)-L- tyrosinat als dickes transparentes Öl zu liefern. Eine kleine Probe des entsprechenden HCl-Salzes zur ¹H-NMR-Analyse wurde hergestellt durch Behandeln von 5 mg des Produkts mit überschüssigem 1N etherischem HCl und Aufkonzentrieren zur Trockene.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 10,68 (s, 1H, OH), 8,99 (d, 1H, J=7,1, NH), 8,33 (br s, NH₃ ⁺), 7,60 (d, 1H, J=2,0, aromatisches CH), 7,47 (dd, 1H, J=8,6, 2,2, aromatisches CH), 6,92 (d, 1H, J=8,4, aromatisches CH), 4,38 (m, 1H, Methin), 3,87 (m, 1H, Methin), 2,92 (d, 2H, J=7,1, ArCH₂), 2,34 (m, 2H, Glu-4-CH₂), 2,00 (m, 2H, Glu-3-CH₂), 1,59 (5, 9H, t-Bu), 1,41 (s, 9H, t-Bu), 1,35 (s, 9H, t-Bu).

Beispiel 49
tert-Butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)-methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-(tert-butoxycarbonyl)-L-tyrosinat
Ein mit einem Stickstoffeinlaß und einem Magnetrührer ausgerüsteter trockener 100 ml-Dreihalskolben wurde mit 25 ml wasserfreiem DMF, 0,26 ml DECP (Aldrich) und 0,28 ml Et₃N gefüllt. Zu dieser Lösung wurden 0,217 g 4-(N-(2,4-Diamino-6-pteridinylmethyl)-N-methylamino)benzoesäure-hemihydrochloriddihydrat (Aldrich) gegeben. Der feste Ausgangsstoff löste sich langsam unter Erhalt einer hellgelben Lösung auf. Nach Rühren für 3 h unter N₂ wurde die Lösung mit 0,29 g tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-(tert-butoxycarbonyl)-L-tyrosinat in 5 ml DMF behandelt. Die Lösung wurde für 18 H bei RT gerührt und dann im Vakuum zur Trockene auf konzentriert.
Der Rückstand wurde in 85 ml CHCl₃ gelöst. Die resultierende Lösung wurde mit 1% wäßrigem NH₄OH (3 × 60 ml) gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und unter Erhalt eines dicken gelb-orangefarbenen Öls auf konzentriert. Dieses Material wurde durch Flash-Chromatographie an 150 g Kieselgel (7:7:1 CH₂Cl₂:Aceton:MeOH) gereinigt, um 0,245 g (52%) tert-Butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-(tert-butoxycarbonyl)-L-tyrosinat als hellgelbes Pulver zu liefern, Smp. 140–143°C.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 10,64 (s, 1H, OH), 8,57 (s, 1H, Pteridinyl-7-CH), 8,15 (d, 1H, J=7,4, Amid-NH), 7,99 (d, 1H, J=7,9, Amid-NH), 7,71 (d, 2H, J=8,8, aromatisches CH), 7,67 (br s, 1H, NH₂), 7,53 (d, 1H, J=2,0, aromatisches CH), 7,43 (br s, 1H, NH₂), 7,37 (dd, 1H, J=8,6, 2,1, aromatisches CH), 6,81 (m, 3H, aromatisches CH), 6,59 (br s, 2H, NH₂), 4,79 (s, 2H, Pteridinyl-CH₂), 4,43 (m, 1H, Methin), 4,32 (m, 1H, Methin), 3,21 (s, 3H, N-CH₃), 2,90 (d, 2H, J=7,1, ArCH₂), 2,24 (t, 2H, J=7,9, Glu-4- CH₂), 2,03–1,78 (m, 2H, Glu-3-CH₂), 1,54 (5, 9H, t-Bu), 1,36 (s, 9H, t-Bu), 1,30 (s, 9H, t-Bu).

Beispiel 50
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)-benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-carboxy-L-tyrosin
Ein mit einem Magnetrührer und einem Stickstoffeinlaß ausgerüsteter 100 ml-Dreihalskolben wurde mit 0,20 g tert-Butyl-N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-(tert-butoxycarbonyl)-L-tyrosinat und 20 ml CH₃NO₂ gefüllt. Die gelbe Lösung wurde bei RT gerührt und durch Hindurchblasen von gasförmigem HCl für 10 min angesäuert. Bei der HCl-Behandlung begann sich die Farbe schnell von Gelb über Orange zu einem helleren Gelb zu verändern, und ein Feststoff begann auszufallen. Die Mischung wurde bei RT unter N₂ für 1,5 h gerührt und dann im Vakuum zur Trockene aufkonzentriert. Der resultierende gelbe Feststoff wurde in 15 ml Wasser suspendiert und mit ausreichend 1N wäßrigem NaOH behandelt, um eine vollständige Lösung zu ergeben. Die Lösung wurde filtriert und durch Zugabe von 1N wäßrigem HCl neutralisiert. Ein gelber Niederschlag resultierte, der durch Zentrifugieren abgetrennt, mit vier Durchläufen von wäßrigem Suspendieren-Zentrifugieren-Dekantieren gewaschen und lyophilisiert wurde, um 140 mg (88%) N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-carboxy-L-tyrosin als gelb-orangefarbenes Pulver zu liefern, Smp. 195°C (Zers.).

HPLC: zwei Peaks an C18; k' = 3,16 (98%), k' = 6,07 (2%), 80:20:0,1 H₂O:MeCN:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min.
¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 13,15–11,80 (br s, COOH), 8,62 (s, 1H, Pteridinyl-7-CH), 8,19 (br s, 1H, NH₂), 8,00 (m, 3H, Amid-NH (2), NH₂), 7,72 (d, 2H, J=8,7, aromatisches CH), 7,61 (d, 1H, J=2,1, aromatisches CH), 7,22 (m, 3H, NH₂(2), aromatisches CH), 6,81 (d, 2H, J=8,7, aromatisches CH), 6,66 (d, 1H, J=7,8, aromatisches CH), 4,81 (s, 2H, Pteridinyl-CH₂), 3,39 (m, 2H, Methine), 3,21 (s, 3H, N-CH3), 2,94 (m, 1H, ArCH₂), 2,86 (m, 1H, ArCH₂), 2,27 (t, 2H, J=7,9, Glu-4-CH₂), 2,05–1,72 (m, 2H, Glu-3-CH₂).

Elementaranalyse

Berechnet für C₃₀H₃₁N₉O₉·1,8 H₂0 (MG 694,06): C, 51,92; H, 5,02; N 18,16; Gefunden: C, 51,84; H, 5,02; N 18,19. Massenspektrum: (Ionen-Spray) 622 (M+H)⁺, 385, 306, 235, 157. UV-Spektrum: (Puffer pH 7) λ_max (ε) 258,6 (19900), 306,3 (23500), 372,6 (5490). λ_min (ε) 245,4 (14800), 272,8 (12600), 347,0 (4040).

Beispiel 51
(2R,3S,5S)-Benzyl-3-(3-iodbenzyl)-2-oxo-2,3-diphenyl-4-morpholincarboxylat
Ein mit einem Magnetrührer und einem Stickstoffeinlaß ausgerüsteter trockener 500 ml-Dreihalskolben wurde mit 3,0 g Benzyl(2R,3S)-6-oxo-2,3-diphenyl-4-morpholincarboxylat (Aldrich) und 180 ml wasserfreiem THF gefüllt. Nach vorsichtigem Erwärmen der Mischung zur Auflösung des festen Ausgangsmaterials wurde die Lösung auf -78°C gekühlt und mit 8,13 ml 1M Natriumbis(trimethylsilyl)amid in THF (Aldrich) durch langsame Zugabe über eine Spritze durch eine Gummimembran behandelt. Die Lösung wurde bei –78°C unter N₂ für 40 min gerührt und dann mit einer Lösung aus 2,41 g 3-Iodbenzylbromid (Lancaster, Windham, NH 03087) in 5 ml wasserfreiem THF behandelt. Die Reaktionsmischung wurde bei -78°C für 2,5 h gerührt, mit 100 ml Wasser vermischt und die resultierende Mischung im Vakuum zur Trockene aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in 100 ml EtOAc gelöst, mit Wasser (3 × 100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum zur Trockene aufkonzentriert, um einen braunen Feststoff zu ergeben. Analyse durch DC (SiO₂, 8:2 Hexan:EtOAc) zeigte kein verbleibendes Ausgangsmaterial bei R_f = 0,35, eine neue Hauptkomponente bei R_f = 0,50 und etwas nicht-umgesetztes 3-Iodbenzylbromid bei R_f = 0,80 an. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an 150 g Kieselgel (8:2 Hexan:EtOAc) gereinigt, um 2,8 g (60%) (2R,3S,5S)-Benzyl-3-(3-iodbenzyl)-2-oxo-2,3-diphenyl-4-morpholincarboxylat als weißen kristallinen Feststoff zu liefern, Smp. 167–168°C.
Beispiel 52
(2R,3S,5S)-Benzyl-3-(3-methoxycarbonyl)-2-oxo-2,3-diphenyl-4-morpholincarboxylat
Ein mit einem Magnetrührer, einem Rückflußkühler und einem Thermometer ausgerüsteter trockener 100 ml-Dreihalskolben wurde mit 2,56 g (2R,3S,5S)-Benzyl-3-(3-iodbenzyl)-2-oxo-5,6-diphenyl-4-morpholincarboxylat und 50 ml 1:1 THF:MeOH gefüllt. Die Mischung wurde durch Hindurchblasen von N₂ für 10 min desoxygeniert und mit 1,0 ml Et₃N, gefolgt von 0,24 g Pd(Ph₃P)₄ (Aldrich) behandelt. Die Mischung wurde mit CO gesättigt und unter Rühren zum Rückfluß (65°C) erwärmt. Ein schwacher CO-Überdruck wurde aufrechterhalten durch Anlegen eines mit einem Mineralöl-Blasenzählers ausgerüsteten CO-Gaseinlaßadapters an den Kühler. Nach 4 h im Rückfluß zeigte DC (SiO₂ 8:2 Hexan:EtOAc) kein verbleibendes Ausgangsmaterial bei R_f = 0,50 und eine neue Komponente bei R_f = 0,30 an. Die Reaktionsmischung wurde auf RT abgekühlt, worauf ein voluminöser weißer Feststoff ausfiel. Die Suspension wurde mit 100 ml CH₂Cl₂ vermischt, und die resultierende Lösung wurde durch einen Kieselgelstopfen (2,5 × 3 cm) filtriert und im Vakuum unter Erhalt eines hellgelben Feststoffs auf konzentriert. Dieses Material wurde durch Flash-Chromatographie an 150 g Kieselgel (8:2 Hexan:EtOAc) gereinigt, um 2,0 g (88%) (2R,3S,5S)-Benzyl-3-(3-methoxycarbonyl)-2-oxo-5,6-diphenyl-4-morpholincarboxylat als cremefarbenen kristallinen Feststoff zu liefern, Smp. 180–182°C.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,05–7,80 (m, 2H, aromatisches CH), 7,72–6,97 (m, 14H, aromatisches CH), 6,73 (m, 1H, aromatisches CH), 6,58 (m, 2H, aromatisches CH), 6,25, 6,16 (d, J=2,2, d, J=2,6, 1H gesamt, 2 Resonanzen für Morpholin-2-H aufgrund von Carbamat-Konformeren), 5,36, 5,31 (d, J=2,6, d, J=2,6, 1H gesamt, 2 Resonanzen für Morpholin-3-H aufgrund von Carbamat-Konformen), 5,16–4,88 (m, 3H, Morpholin-5-H, PhCH₂O), 3,88, 3,85 (5, 5, 3H gesamt, CO₂CH₃, Konformere), 3,71–3,40 (m, 2H, ArCH₂).

Beispiel 53
3-Methoxycarbonyl-L-phenylalanin
In eine 500 ml-Parr-Flasche wurden 2,0 g (2R,3S,5S)-Benzyl-3-(3-methoxycarbonyl)-2-oxo-5,6-diphenyl-4-morpholincarboxylat, 0,46 g PdCl₂ (Aldrich) und 60 ml 1:1 THF:MeOH gegeben. Die Mischung wurde durch Hindurchblasen von N₂ für 10 min desoxygeniert und dann bei 45 psi für 18 h hydrogenolysiert. Die Flasche wurde mit N₂ gespült und die Mischung filtriert, um den Katalysator zu entfernen. Das Filtrat wurde im Vakuum auf 5 ml auf konzentriert und unter Zugabe von 50 ml Ether verrieben. Ein weißer Feststoff fiel aus, der durch Vakuumfiltration aufgefangen, mit 30 ml Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet wurde, um 0,88 g (91%) 3-Methoxy-carbonyl-L-phenylalanin·HCl zu liefern, Smp. >200°C.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,50 (br s, 3H, NH₃ ⁺), 7,89 (m, 2H, aromatisches CH), 7,67–7,43 (m, 2H, aromatisches CH), 4,21 (m, 1H, Methin), 3,87 (s, 3H, CO₂CH₃), 3,22 (d, 2H, J=6,5, ArCH₂).

Beispiel 54
tert-Butyl-3-methoxycarbonyl-L-phenylalaninat
Eine Lösung aus 0,88 g 3-Methoxycarbonyl-L-phenylalanin·HCl und 1,5 ml konz. H₂SO₄ in 20 ml 1,4-Dioxan wurde zu 25 ml flüssigem Isobutylen (kondensiert bei –78°C) in einer mit einem Magnetrührer ausgerüsteten Druckflasche gegeben. Die Flasche wurde versiegelt und die Mischung unter Rühren auf RT erwärmen gelassen. Die zunächst heterogene Mischung lieferte eine schwach trübe Lösung nach Rühren für 18 h bei RT. Nach 48 h wurde das Gefäß in einem Eis-Wasser-Bad abgekühlt, geöffnet und der Inhalt mit 13 g festen NaHCO₃ behandelt. Das Isobutylen ließ man verdampfen, und die verbleibende Mischung wurde im Vakuum zur Trockene auf konzentriert. Der Rückstand wurde in 100 ml Wasser suspendiert und mit EtOAc (4 × 40 ml) extrahiert. Die vereinigten EtOAc-Extrakte wurden mit 5%igem wäßrigem NaHCO₃ (3 × 50 ml) gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und im Vakuum auf konzentriert, um ein Öl zu ergeben. Dieses Material wurde in 30 ml Ether gelöst, und die Lösung wurde mit 3,4 ml 1M etherischem HCl behandelt. Ein weißer Feststoff fiel aus, der durch Filtration aufgefangen und im Vakuum getrocknet wurde, um 0,79 g (74%) tert-Butyl-3-methoxy-carbonyl-L-phenylalaninat·HCl zu liefern, Smp. 165°C (Zers.).
Beispiel 55
tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-L-glutam-1-yl-3-methoxycarbonyl-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 9 wurden 0,79 g tert-Butyl-3-methoxycarbonyl-L-phenylalaninat·HCl mit 0,84 g N-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminsäure-γ-tert-butylester (Sigma) unter Verwendung von 0,50 g EDC (Aldrich) und 0,27 ml N-Methylmorpholin gekuppelt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an 85 g Kieselgel (70:30 Hexan:EtOAc) gereinigt, um 1,38 g (93%) tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-L-glutam-1-yl-3-methoxy-carbonyl-L-phenylalaninat als transparentes Glas zu liefern.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,26 (d, 1H, J=7,5, NH), 7,80 (m, 2H, NH, aromatisches CH), 7,43 (d, 1H, J=7,7, aromatisches CH), 7,44–7,23 (m, 7H, aromatisches CH), 4,99 (m, 2H, PhCH₂O), 4,38 (m, 1H, Methin), 4,01 (m, 1H, Methin), 3,83 (s, 3H, CO₂CH₃), 3,02 (m, 2H, ArCH₂), 2,19 (t, 2H, J=7,7, Glu-4-CH₂), 1,90–1,61 (m, 2H, Glu-3-CH₂), 1,38 (s, 9H, t-Bu), 1,32 (s, 9H, t-Bu).

Beispiel 56
tert-Butyl-5-O-tert-L-glutam-1-yl-3-methoxycarbonyl-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 48 wurden 1,38 g tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-L-glutam-1-yl-3-methoxycarbonyl-L-phenylalaninat unter Verwendung von 0,23 g 10% Pd(C) in 60 ml McOH hydrogenolysiert. Dies lieferte 1,0 g (94%) tert-Butyl-5-O-tert-L-glutam-1-yl-3-methoxycarbonyl-L-phenylalaninat als dickes transparentes Öl. Das Produkt wurde in den nächsten Schritt ohne Reinigung überführt. Eine Probe des entsprechenden HCl-Salzes zur ¹H-NMR-Analyse wurde hergestellt durch Behandeln von 7 mg des Produkts mit überschüssigem 1M etherischem HCl und Aufkonzentrieren zur Trockene.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 9,12 (d, 1H, J=7,6, NH), 8,39 (br s, 3H, NH₃ ⁺), 7,82 (m, 2H, aromatisches CH), 7,60 (d, 1H, J=7,5, aromatisches CH), 7,46 (t, 1H, J=6,9, aromatisches CH), 4,40 (m, 1H, Methin), 3,85 (m, 1H, Methin), 3,83 (s, 3H, CO₂CH₃), 3,05 (d, 2H, J=8,4, ArCH₂), 2,33 (t, 2H, J=7,7, Glu-4-CH₂), 1,97 (m, 2H, Glu-3-CH₂), 1,37 (s, 9H, t-Bu), 1,31 (s, 9H, t-Bu).

Beispiel 57
tert-Butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)-methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-(methoxycarbonyl)-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 49 wurden 0,200 g 4-(N-(2,4-Diamino-6-pteridinylmethyl)-N-methylamino)benzoesäure-hemihydrochloriddihydrat (Aldrich) mit 0,245 g tert-Butyl-5-O-tert-L-glutam-1-yl-3-methoxycarbonyl-L-phenylalaninat unter Verwendung von 0,24 ml DECP (Aldrich) und 0,26 ml Et₃N in 20 ml DMF gekuppelt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an 130 g Kieselgel (12:12:1 CH₂Cl₂:Aceton:MeOH) gereinigt, um 0,297 g (73%) tert-Butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-(methoxycarbonyl)-L-phenylalaninat als gelbes Pulver zu liefern, Smp. 130°C (Zers.).
Beispiel 58
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)-methylamiono)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-carboxy-L-phenylalanin
Gemäß Beispiel 50 wurden 0,15 g tert-Butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-(methoxycarbonyl)-L-phenylalaninat mit gasförmigen HCl in 20 ml CH₃NO₂ behandelt. Nach Rühren der Mischung bei RT für 1 h wurde die Mischung im Vakuum zur Trockene unter Erhalt eines gelb-orangefarbenen Feststoffs aufkonzentriert. Analyse dieses Materials durch ¹H-NMR zeigte den vollständigen Verlust der tert-Butyl-Gruppen des Ausgangsmaterials an. HPLC (C18, 75:25:0,1 H₂O:MeCN:TFA) zeigte eine einzelne Komponente bei k' = 3,50 an. Der intermediäre Methylester wurde in 25 ml 1:1 THF:H₂O gelöst, mit 49 mg LiOH·H₂O (Baker) behandelt und die Lösung unter N₂ für 18 h bei RT gerührt. Analyse durch HPLC zeigte kein verbleibendes Material bei k' _ 3,50 und eine einzelne neue Komponente bei k' = 1,58 an. Die Lösung wurde durch Zugabe von 1N wäßrigem HCl neutralisiert. Eine gelbe Aufschlämmung resultierte, die im Vakuum zu 2 ml aufkonzentriert und mit 20 ml Wasser verdünnt wurde. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt, mit vier Durchläufen von wäßrigem Suspendieren-Zentrifugieren-Dekantieren gewaschen und lyophilisiert, um 0,109 g (84%) N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-carboxy-L-phenylalanin als gelb-orangefarbenes Pulver zu liefern, Smp. 195°C (Zers.).

HPLC: ein Peak an C18, k' = 1,93, 78:22:0,1 H₂O:MeCN:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min.
¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 13,00–12,10 (br s, COOH), 8,58 (s, 1H, Pteridinyl-7-CH), 8,08 (d, 1H, J=7,8, Amid-NH), 7,98 (d, 1H, M=8,0, Amid-NH), 7,80 (s, 1H, aromatisches CH), 7,79–7,60 (m, 4H, NH₂(1), aromatisches CH), 7,49 (br s, 1H, NH₂), 7,44 (d, 1H, J=7,7, aromatisches CH), 7,30 (t, 1H, J=7,6, aromatisches CH), 6,81 (d, 2H, J=9,0, aromatisches CH), 6,63 (br s, 2H, NH₂), 4,79 (s, 2H, Pteridinyl-CH₂), 4,41 (m, 2H, Methine), 3,20 (s, 3H, N-CH₃), 3,10 (m, 1H, ArCHz), 2,97 (m, 1H, ArCH₂), 2,23 (t, 2H, J=7,8, Glu-4-CH₂), 2,00–1,73 (m, 2H, Glu-3-CH₂).

Elementaranalyse

Berechnet für C₃₀H₃₁N₉O₈·1,5 H₂0 (MG 672,65): C, 53,57; H, 5,09; N 18,74; Gefunden: C, 53,58; H, 5,11; N 18,72. Massenspektrum: (Ionen-Spray) 646 (M+H)⁺, 437, 340, 308, 175. UV-Spektrum: (Puffer pH 7) λ_max (ε) 258,7 (24300), 307,5 (25000), 372,7 (7880). λ_min (ε) 244,0 (17900), 272,7 (16900), 346,2 (6440).

Beispiel 59
tert-Butyl-N-(4-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-(methoxycarbonyl)-L-phenylalaninat
Ein mit einem Magnetrührer und einem Stickstoffeinlaß ausgerüsteter 100 ml-Dreihalskolben wurde mit 0,150 g 4-(((1,2-Dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoesäure, 0,221 g tert-Butyl-5-O-tert-L-glutam-1-yl-3-methoxycarbonyl-L-phenylalaninat, 65 mg 3-Hydroxy-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-on (Aldrich) und 24 ml wasserfreiem DMF gefüllt. Die resultierende hellgelbe Lösung wurde mit 84 mg EDC (Aldrich) behandelt und bei RT unter N₂ für 48 h gerührt. Das DMF wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand durch Flash-Chromatographie an 150 g Kieselgel (98:2 → 96:4 CH₂Cl₂:MeOH) gereinigt, um 0,255 g (78%) tert-Butyl-N-(4-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-(methoxycarbonyl)-L-phenylalaninat als weißes Pulver zu liefern, Smp. 155–157°C.
Beispiel 60
N-(4-(((1,2-Dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-L-glutam-1-yl-3-carboxy-L-phenylalanin
Gemäß Beispiel 50 wurden 0,219 g tert-Butyl-N-(4-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-(methoxycarbonyl)-L-phenylalaninat mit gasförmigem HCl in 20 ml CH₃NO₂ behandelt. Nach Entfernung des CH₃NO₂ im Vakuum wurde der Rückstand mit 66 mg LiOH·H₂O (Baker) in 20 ml 1:1 THF:H₂O für 18 h verseift. Die Lösung wurde durch Zugabe von 1N HCl auf pH 2,5 angesäuert und der resultierende Niederschlag isoliert und in der gewöhnlichen Weise lyophilisiert, um 0,162 g (84%) N-(4-(((1,2-Dihydro-3-methyl-1- oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-L-glutam-1-yl-3-carboxy-L-phenylalanin als weißes Pulver zu liefern, Smp. 187°C (Zers.).

HPLC: ein Peak an C18, k' = 4,29, 75:25:0,1 H₂O:MeCN:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min.
¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 13,00–12,25 (br m, COOH, Benzochinazolin NH), 9,83 (s, 1H, aromatisches CH), 8,32 (d, 1H, J=7,4, Amid-NH), 8,22 (d, 1H, J=9,0, aromatisches CH), 8,00 (d, 1H, J=8,5, aromatisches CH), 7,81 (s, 1H, aromatisches CH), 7,75 (d, 1H, J=8,0, aromatisches CH), 7,60 (m, 2H, aromatisches CH), 7,49 (m, 3H, aromatisches CH, 4-Aminobenzoyl-NH), 7,35 (m, 2H, aromatisches CH, Amid-NH), 6,52 (d, 1H, J=8,8, aromatisches CH), 6,39 (d, 1H, J=15,2, aromatisches CH), 4,57 (br s, 2H, Benzochinazolin-9-CH₂), 4,45 (m, 2H, Methine), 3,12 (m, 1H, ArCH₂), 2,96 (m, 1H, ArCH₂), 2,42 (s, 3H, CH₃), 2,19 (m, 2H, Glu-4-CH₂), 2,01-1,70 (m, 2H, Glu-3-CH₂).

Elementaranalyse

Berechnet für C₃₆H₃₂N₅O₉F·1,7 H₂O (MG 728,30): C, 59,37; H, 4,90; N 9,62; Gefunden: C, 59,45; H, 4,93; N 9,42. Massenspektrum: (Ionen-Spray) 698 (M+H)⁺. UV-Spektrum: (Puffer pH 7) λ_max (ε) 265,3 (45500), 296,5 (26100), 348,0 (5530). λ_min (ε) 244,4 (22600), 287,0 (25500), 340,1 (3540).

Beispiel 61
2-Cyclopentylbenzylalkohol
Eine 300 ml-Parr-Bombe wurde mit 10,0 g 2-Iodbenzylalkohol (Aldrich), 80 ml Toluol, 30 ml Cyclopenten (Aldrich), 2,60 g Tri-ortho-tolylphosphin (Aldrich) und 6,6 ml Et₃N gefüllt. Die Mischung wurde durch Hindurchblasen von N₂ für 10 min desoxygeniert und dann mit 0,96 g Pd(OAc)₂ (Aldrich) behandelt. Die Bombe wurde mit N₂ gespült, versiegelt und für 18 h auf 100°C erwärmt. Das Gefäß wurde auf RT abgekühlt, mit N₂ gespült und geöffnet. Die dunkelrote Reaktionsmischung wurde im Vakuum unter Erhalt eines rotbraunen Sirups auf konzentriert. Dieses Material wurde in 200 ml CH₂Cl₂ gelöst, mit Wasser (4 × 100 ml) gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und im Vakuum auf konzentriert, um ein braunes Öl zu liefern. Analyse durch DC (SiO₂, 8:2 Hexan:EtOAc) zeigte zwei neue Hauptkomponenten bei R_f = 0,45 und 0,50, Tri-o-tolylphosphin bei R_f = 0,90 und 4 Nebenkomponenten bei R_f = 0,60, 0,70, 0,85 und 0,0 an. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie (zweimal) an 200 g Kieselgel (9:1 Hexan:EtOAc) gereinigt, um 6,1 g (82%) einer Mischung aus den Materialien mit R_f = 0,45 und 0,50 zu liefern. Dieses Material wurde als Mischung der Doppelbindungsisomere gemäß ¹H-NMR bestimmt. Das Produkt (6,0 g) wurde dann bei 40 psi in 40 ml McOH in Gegenwart von 0,60 g 5% Pt(C) (Aldrich) für 4 h hydriert. Der Katalysator wurde durch Filtration durch Celite entfernt, und das Filtrat wurde im Vakuum auf konzentriert, um 5,47 g (74% aus 2-Iodbenzylalkohol) 2-Cyclopentylbenzylalkohol als hellgelb-braune Flüssigkeit zu liefern.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ 7,40–7,07 (m, 4H, aromatisches CH), 5,06 (t, 1H, J=5,4, OH), 4,58 (d, 2H, J=5,4, ArCH₂O), 3,24 (m, 1H, Cyclopentylmethin), 1,97 (m, 2H, Cyclopentyl-CH₂), 1,89–1,42 (m, 6H, Cyclopentyl-CH₂).

Beispiel 62
2-Cyclopentylbenzylbromid
Gemäß Beispiel 17 wurden 5,47 g 2-Cyclopentylbenzylalkohol mit 1,03 ml PBr₃ in 25 ml wasserfreiem CH₂Cl₂ behandelt, um 6,9 g (93%) 2-Cyclopentylbenzylbromid als klare Flüssigkeit zu liefern.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆): 7,40–7,24 (m, 3H, aromatisches CH), 7,14 (m, 1H, aromatisches CH), 4,78 (s, 2H, ArCH₂Br), 3,31 (m, 1H, Cyclopentylmethin), 2,05 (m, 2H, Cyclopentyl-CH₂), 1,88–1,47 (m, 6H, Cyclopentyl-CH₂).

Beispiel 63
(2R,3S,5S)-Benzyl-3-(3-cyclopentylbenzyl)-2-oxo-2,3-diphenyl-4-morpholincarboxylat
Gemäß Beispiel 51 wurden 1,47 g Benzyl-(2R,3S)-6-oxo-2,3-diphenyl-4-morpholincarboxylat (Aldrich) mit 1,00 g 2-Cyclopentylbenzylbromid unter Verwendung von 3,99 ml 1M Natriumbis(trimethylsilyl)amid in THF (Aldrich) alkyliert. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an 125 g Kieselgel (8:2 Hexan:EtOAc) gereinigt, um 1,07 g (52%) (2R,3S,5S)-Benzyl-3-(3-cyclopentylbenzyl)-2-oxo-2,3-diphenyl-4-morpholincarboxylat als weißen Feststoff zu liefern, Smp. 161–163°C.
Beispiel 64
2-Cyclopentyl-L-phenylalanin
Gemäß Beispiel 53 wurden 1,0 g (2R,3S,5S)-Benzyl-3-(3-cyclopentyl-benzyl)-2-oxo-5,6-diphenyl-4-morpholincarboxylat in 40 ml 1:1 THF:MeOH unter Verwendung von 0,23 g PdCl₂ hydrogenolysiert, um 0,373 g (76%) 2-Cyclopentyl-L-phenylalanin·HCl als cremefarbenes Pulver zu liefern, Smp. 175°C (Zers.).

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,49 (br s, 3H, NH₃ ⁺), 7,38–7,07 (m, 4H, aromatisches CH), 3,92 (m, 1H, Methin), 3,18 (m, 1H, Cyclopentylmethin), 1,98 (m, 2H, Cyclopentyl-CH₂), 1,90–1,41 (m, 6H, Cyclopentyl-CH₂).

Beispiel 65
tert-Butyl-2-cyclopentyl-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 54 wurden 0,23 g 2-Cyclopentyl-L-phenylalanin·HCl mit 25 ml Isobutylen in 20 ml 1,4-Dioxan in Gegenwart von 0,13 ml konz. H₂SO₄ behandelt. Aufarbeitung lieferte ein klares Öl, das in 20 ml Ether gelöst wurde. Die Lösung wurde mit 1 ml 1M etherischem HCl behandelt und im Vakuum zur Trockene auf konzentriert, um 0,28 g (100%) tert-Butyl-2-cyclopentyl-L-phenylalaninat·HCl als hellgelbes Glas zu liefern.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,59 (br s, 3H, NH₃ ⁺), 7,28 (m, 2H, aromatisches CH), 7,10 (m, 2H, aromatisches CH), 3,91 (m, 1H, Methin), 3,30 (m, 1H, ArCH₂), 3,18 (m, 1H, Cyclopentylmethin), 2,99 (dd, 1H, J=10,1, 12,4, ArCH₂), 1,98 (m, 2H, Cyclopentyl-CH₂), 1,89–1,46 (m, 6H, Cyclopentyl-CH₂), 1,19 (2, 9H, t-Bu).

Beispiel 66
tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-2-cyclopentyl-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 9 wurden 0,25 g tert-Butyl-2-cyclopentyl-L-phenylalaninat·HCl mit 0,26 g N-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminsäure-γ-tert-butylester (Sigma) unter Verwendung von 0,16 g EDC (Aldrich) und 0,084 ml N-Methylmorpholin gekuppelt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an 85 g Kieselgel (8:2 Hexan:EtOAc) gereinigt, um 0,355 g (76%) tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-2-cyclopentyl-L-phenylalaninat als weißen Feststoff zu liefern, Smp. 95–96°C.
Beispiel 67
tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-2-cyclopentyl-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 48 wurden 0,355 g tert-Butyl-N-((Benzyloxy)carbonyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-2-cyclopentyl-L-phenylalaninat unter Verwendung von 60 mg 10% Pd(C) in 45 ml McOH hydrogenolysiert. Dies lieferte 0,236 g (85%) tert-Butyl-5-O-tert-Butyl-L-glutam-1-yl-2-cyclopentyl-L-phenylalaninat als dickes transparentes Öl.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,23 (m, 1H, NH), 7,34–7,00 (m, 4H, aromatisches CH), 4,37 (m, 1H, Methin), 3,36–2,85 (m, 5H, ArCH₂, Cyclopentylmethin, NH₂), 2,27–1,92 (m, 4H, Glu-4-CH2, Glu-3-CH₂), 1,90–1,46 (m, 8H, Cyclopentyl-CH₂), 1,39 (s, 9H, t-Bu), 1,32 (s, 1H, t-Bu).

Beispiel 68
tert-Butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)-methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-2-cyclopentyl-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 49 wurden 0,189 g 4-(N-(2,4-Diamino-6-pteridinylmethyl)-N-methylamino)benzoesäure-hemihydrochloriddihydrat (Aldrich) mit 0,236 g tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-2-cyclopentyl-L-phenyl alaninat unter Verwendung von 0,23 ml DECP (Aldrich) und 0,24 ml Et₃N in 20 ml DMF gekuppelt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an 85 g Kieselgel (12:12:1 CH₂Cl₂:Aceton:MeOH) gereinigt, um 0,195 g (50%) tert-Butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-2-cyclopentyl-L-phenylalaninat als gelbes Pulver zu liefern, Smp. 130–140°C.
Beispiel 69
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)-methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-2-cyclopentyl-L-phenylalanin
Gemäß Beispiel 50 wurden 0,167 g tert-Butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-2-cyclopentyl-L-phenalalaninat mit gasförmigem HCl in 15 ml CH₃NO₂ für 1 h behandelt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum zur Trockene aufkonzentriert, um einen gelben Feststoff zu ergeben. Dieses Material wurde in Ether suspendiert, durch Vakuumfiltration aufgefangen und im Vakuum getrocknet, um 0,15 g (91%) N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)-methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-2-cyclopentyl-L-phenylalanin als hellgelbes Pulver zu liefern, Smp. 155°C (Zers.).

HPLC: ein Peak an C18, k' = 3,25, 65:35:0,1 H₂O:MeCN:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min.
¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 13,25–12,95 (br s, COOH), 9,31 (s, 1H, NH₂), 9,09 (s, 1H, NH₂), 8,80–8,58 (br s, 1N, NH₂), 8,72 (s, 1H, Pteridinyl-7-CH), 8,24 (d, 1H, J=8,0, Amid-NH), 8,01 (d, 1H, J=8,0, Amid-NH), 7,74 (m, 3H, NH₂(1), aromatisches CH), 7,22 (d, 1H, J=8,1, aromatisches CH), 7,12 (m, 2H, aromatisches CH), 6,93 (t, 1H, J=7,4, aromatisches CH), 6,82 (d, 2H, J=9,0, aromatisches CH), 4,88 (s, 2H, Pteridinyl-CH₂), 4,45 (m, 1H, Methin), 4,34 (m, 1H, Methin), 3,26–3,10 (m, 2H, ArCH₂, Cyclopentylmethin), 2,88 (m, 1H, ArCH₂), 2,23 (t, 2H, J=7,6, Glu-4-CH₂), 2,06–1,40 (m, 10H, Glu-3-CH₂, Cyclopentyl-CH₂).

Elementaranalyse

Berechnet für C₃₄H₃₉N₉O₆·1,7 HCl·2,2 H₂O (MG 771,36): C, 52,94; H, 5,98; N 16,34; Cl, 7,81; Gefunden: C, 52,57; H, 5,74; N 16,13; Cl, 7,52. Massenspektrum: (Ionen-Spray) 670 (M+H)⁺; 613, 459, 391, 309, 275 UV-Spektrum: (Puffer pH 7) λ_max (ε) 259,5 (24000), 308,5 (24000), 373,0 (7450). λ_min (ε) 241,0 (14400), 274,2 (16200), 346,5 (5840).

Beispiel 70
3-Cyclopentylbenzylalkohol
Gemäß Beispiel 61 wurden 10,0 g 3-Iodbenzylalkohol (Aldrich) mit 30 ml Cyclopenten unter Verwendung von 0,96 g Pd(OAc)2, 2,60 g Tri-orthotolylphosphin und 6,6 ml Et₃N behandelt. Die resultierende Olefin-Mischung wurde für 2,5 h unter Verwendung von 0,62 g 5% Pt(C) in McOH hydriert, um 5,77 g (76%) 3-Cyclopentylbenzylalkohol als hellgelbe Flüssigkeit zu liefern.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 7,32–7,17 (m, 2H, aromatisches CH), 7,15 (m, 2H, aromatisches CH), 5,14 (t, 1H, J=5,5, OH), 4,48 (d, 2H, J=5,6, ArCH₂O), 2,96 (m, 1H, Cyclopentylmethin), 2,01 (m, 2H, Cyclopentyl-CH₂), 1,88–1,42 (m, 6H, Cyclopentyl-CH₂).

Beispiel 71
3-Cyclopentylbenzylbromid
Gemäß Beispiel 17 wurden 5,77 g 3-Cyclopentylbenzylalkohol mit 1,09 ml PBr₃ in 25 ml wasserfreiem CH₂Cl₂ behandelt, um 7,85 g (100%) 3-Cyclopentylbenzylbromid als hellgelbe Flüssigkeit zu liefern.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 7,37–7,14 (m, 4H, aromatisches CH), 4,68 (s, 2H, ArCH₂Br), 2,96 (m, 1H, Cyclopentylmethin), 2,00 (m, 2H, Cyclopentyl-CH₂), 1,84–1,42 (m, 6H, Cyclopentyl-CH₂).

Beispiel 72
(2R,3S,5S)-Benzyl-3-(3-cyclopentylbenzyl)-2-oxo-2,3-diphenyl-4-morpholincarboxylat
Ein mit einem Stickstoffeinlaß und einem Magnetrührer ausgerüsteter trockener 500 ml-Dreihalskolben wurde mit 1,47 g Benzyl-(2R,3S)-6-oxo-2,3-diphenyl-4-morpholincarboxylat (Aldrich), 1,00 g 3-Cyclopentylbenzylbromid und 80 ml wasserfreiem THF gefüllt. Die Mischung wurde vorsichtig unter Rühren erwärmt, um das feste Ausgangsmaterial zu lösen, und die resultierende Lösung wurde auf –78°C gekühlt. Die Lösung wurde mit 4,0 ml 1M Natriumbis(trimethylsilyl)amid in THF (Aldrich) durch langsame Zugabe über eine Spritze durch eine Gummimembran behandelt. Nach Rühren bei –78°C für 4 h wurde die Lösung mit 80 ml Wasser vermischt und gemäß Beispiel 51 aufgearbeitet. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an 85 g Kieselgel (85:15 Hexan:EtOAc) gereinigt, um 1,44 g (70%) (2R,3S,5S)-Benzyl-3-(3-cyclopentylbenzyl)-2-oxo-2,3-diphenyl-4-morpholincarboxylat als weißes Pulver zu liefern, Smp. 82–84°C.
Beispiel 73
3-Cyclopentyl-L-phenylalanin
Gemäß Beispiel 53 wurden 1,37 g (2R,3S,5S)-Benzyl-3-(3-cyclopentylbenzyl)-2-oxo-5,6-diphenyl-4-morpholincarboxylat in 80 ml 1:1 THF:MeOH unter Verwendung von 0,31 g PdCl2 hydrogenolysiert, um 0,63 g (93%) 3-Cyclopentyl-L-phenylalanin·HCl als weißes Pulver zu liefern, Smp. >200°C.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,39 (br s, 3H, NH₃ ⁺), 7,31–7,12 (m, 3H, aromatisches CH), 7,08 (d, 1H, J=7,3, aromatisches CH), 4,17 (m, 1H, Methin), 3,11 (d, 2H, J=6,1, ArCH₂), 2,96 (m, 1H, Cyclopentylmethin), 1,99 (m, 2H, Cyclopentyl-CH₂), 1,88–1,45 (m, 6H, Cyclopentyl-CH₂).

Beispiel 74
tert-Butyl-3-cyclopentyl-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 54 wurden 0,50 g 3-Cyclopentyl-L-phenylalanin·HCl mit 25 ml Isobutylen in 20 ml 1,4-Dioxan in Gegenwart von 0,3 ml konz. H₂SO₄ behandelt. Aufarbeiten gefolgt von Ansäuern des freien Amins mit etherischem HCl lieferte 0,49 g (82%) tert-Butyl-3-cyclopentyl-L-phenyl-alaninat·HCl als weißes Pulver, Smp. 154–156°C.
Beispiel 75
tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 9 wurden 0,49 g tert-Butyl-3-cyclopentyl-L-phenyl-alaninat·HCl mit 0,51 g N-Cbz-L-Glutaminsäure-γ-tert-butylester (Sigma) unter Verwendung von 0,30 g EDC (Aldrich) und 0,16 ml N-Methylmorpholin gekuppelt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an 80 g Kieselgel (8:2 Hexan:EtOAc) gereinigt, um 0,75 g (82%) tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalaninat als dickes transparentes Öl zu liefern.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,22 (d, 1H, J=7,3, NH), 7,33 (m, 6H, aromatisches CH), 7,20–6,97 (m, 3H, aromatisches CH, NH), 5,01 (m, 2H, PhCH₂O), 4,33 (m, 1H, Methin), 4,05 (m, 1H, Methin), 2,91 (m, 3H, ArCH₂, Cyclopentylmethin), 2,20 (t, 2H, J=7,7, Glu-4-CH₂), 1,97 (m, 2H, Glu-3-CH₂), 1,88–1,43 (m, 8H, Cyclopentyl-CH₂), 1,38 (s, 9H, t-Bu), 1,31 (s, 9H, t-Bu).

Beispiel 76
tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 48 wurden 0,75 g tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalaninat unter Verwendung von 0,12 g 10% Pd(C) in 60 ml McOH hydrogenolysiert. Dies lieferte 0,58 g (99%) tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalaninat als transparentes Öl. Eine Probe des entsprechenden HCl-Salzes wurde zur 1H-NMR-Analyse hergestellt durch Behandeln von 10 mg des Produkts mit überschüssigem 1N etherischem HCl und Auf konzentrieren zur Trockene.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,99 (d, 1H, J=7,0, NH), 8,32 (br s, 3H, NH₃ ⁺), 7,24–7,01 (m, 4H, aromatisches CH), 4,38 (m, 1H, Methin), 3,85 (m, 1H, Methin), 2,93 (m, 3H, ArCH₂, Cyclopentylmethin), 2,34 (t, 2H, J=7,7, Glu-4-CH₂), 1,96 (m, 4H, Glu-3-CH₂, Cyclopentyl-CH₂), 1,82–1,44 (m, 6H, Cyclopentyl-CH₂), 1,40 (s, 9H, t-Bu), 1,31 (s, 9H, t-Bu).

Beispiel 77
tert-Butyl-5-O-tert-butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 49 wurden 0,200 g 4-(N-(2,4-Diamino-6-pteridinylmethyl)-N-methylamino)benzoesäure-hemihydrochloriddihydrat (Aldrich) mit 0,25 g tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalaninat unter Verwendung von 0,24 ml DECP (Aldrich) und 0,26 ml Et₃N in 20 ml DMF gekuppelt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an 150 g Kieselgel (7:7:1 CH₂Cl₂:Aceton:MeOH) gereinigt, um 0,195 g (47%) tert-Butyl-5-O-tert-butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)-methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalaninat als gelbes Pulver zu liefern, Smp. 115–120°C.
Beispiel 78
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)-benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalanin
Gemäß Beispiel 50 wurden 0,18 g tert-Butyl-5-O-tert-butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalaninat mit gasförmigem HCl in 20 ml CH₃NO₂ für 1,25 h behandelt. Aufarbeiten und Isolieren in der gewöhnlichen Weise lieferten 0,135 g (84%) N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)-benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalanin als gelb-orangefarbenes Pulver, Smp. 170°C (Zers.).

HPLC: ein Peak an C18, k' = 2,86, 65:35:0,1 H₂O:MeCN:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min.
¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 12,90–11,85 (br m, COOH), 8,58 (s, 1H, Pteridinyl-7-CH), 8,04 (d, 1H, J=7,7, Amid-NH), 8,00 (d, 1H, J=8,1, Amid-NH), 7,72 (br s, 1H, NH₂), 7,71 (d, 2H, J=8,8 aromatisches CH), 7,53 (br s, 1H, NH₂), 7,08–6,93 (m, 4H, aromatisches CH), 6,81 (d, 2H, J=8,9, aromatisches CH), 6,69 (br s, 2N, NH₂), 4,79 (s, 2H, Pteridinyl-CH₂), 4,40 (m, 2H, Methine), 3,22 (s, 3H, N-CH3), 3,01 (m, 1H, ArCH₂), 2,94–2,75 (m, 2H, ArCH₂, Cyclopentylmethin), 2,24 (t, 2H, J=7,7, Glu-4-CH₂), 2,03–1,76 (m, 4H, Glu-3-CH₂, Cyclopentyl-CH₂), 1,73–1,35 (m, 6H, Cyclopentyl-CH₂).

Elementaranalyse

Berechnet für C₃₄H₃₉N₉O₆·1,6 H₂0 (MG 698,56): C, 58,46; H, 6,09; N 18,05; Gefunden: C, 58,50; H, 6,08; N 18,10. Massenspektrum: (FAB) 670 (M+H)⁺, 613, 437, 309, 275. UV-Spektrum: (Puffer pH 7) λ_max (ε) 259,7 (23300), 308,3 (23500), 371,7 (7030). λ_min (ε) 241,0 (13500), 274,8 (15300), 346,1 (5260).

Beispiel 79
2-Cyclohexylbenzylalkohol
Gemäß Beispiel 61 wurden 10,0 g 2-Iodbenzylalkohol mit 25 ml Cyclohexen (Aldrich) unter Verwendung 0,96 g Pd(OAc)₂, 2,60 g Tri-orthotolylphosphin und 6,6 ml Et₃N bei 110°C für 48 h behandelt. Die resultierende Olefin-Mischung wurde für 6,5 h unter Verwendung von 0,36 g 5% Pt(C) in McOH hydriert, um 3,37 g (42%) 2-Cyclohexylbenzylalkohol als hellgelbe Flüssigkeit zu liefern.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 7,33 (d, 1H, J=7,4, aromatisches CH), 7,27–7,08 (m, 3H, aromatisches CH), 5,03 (t, 1H, J=5,4, OH), 4,34 (d, 2H, J=5,4, ArCH₂O), 2,76 (m, 1H, Cyclohexylmethin), 1,85–1,61 (m, 5H, Cyclohexyl-CH₂), 1,48–1,22 (m, 5H, Cyclohexyl-CH₂).

Beispiel 80
2-Cyclohexylbenzylbromid
Gemäß Beispiel 17 wurden 3,36 g 2-Cyclohexylbenzylalkohol mit 0,59 ml PBr₃ in 25 ml wasserfreiem CH₂Cl₂ behandelt, um 3,90 g Rohprodukt zu liefern (90% rein gemäß ¹H-NMR). Dieses Material wurde im Kurzweg ("short path") destilliert (1,0 mmHg, 117-120°C), um 3,54 g (79%) 2-Cyclohexylbenzylbromid als klare Flüssigkeit zu liefern.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 7,39 (d, 1H, J=5,7, aromatisches CH), 7,29 (m, 2H, aromatisches CH), 7,13 (m, 1H, aromatisches CH), 4,76 (s, 2H, ArCH₂Br), 2,86 (m, 1H, Cyclohexylmethin), 1,83–1,63 (m, 5H, Cyclohexyl-CH₂), 1,53–1,20 (m, 5H, Cyclohexyl-CH₂).

Beispiel 81
(2R,3S,5S)-tert-Butyl-3-(2-cyclohexylbenzyl)-2-oxo-2,3-diphenyl-4-morpholincarboxylat
In einen mit einem Magnetrührer und einem Stickstoffeinlaß ausgerüsteten trockenen 250 ml-Dreihalskolben wurden eine Lösung aus 1,47 g tert-Butyl-(2R,3S)-(–)-6-oxo-2,3-diphenyl-4-morpholincarboxylat (Aldrich) in 30 ml THF und eine Lösung aus 1,00 g 2-Cyclohexylbenzylbromid in 8 ml THF gegeben. Beide Lösungen waren über 3 Å-Molekularsieben für 24 h getrocknet worden. Wasserfreies THF wurden zum Spülen (30 ml) verwendet, um ein Gesamtvolumen von 68 ml zu ergeben. Die resultierende Lösung wurde auf –78°C abgekühlt und mit 4,15 ml 1M Natriumbis(trimethylsilyl)amid in THF (Aldrich) durch langsame Zugabe über eine Spritze durch eine Gummimembran behandelt. Nach Rühren bei -78°C für 3,5 h wurde die Reaktionsmischung mit 80 ml Wasser vermischt und rotationsverdampft, um das THF zu entfernen. Die resultierende Mischung wurde mit EtOAc (4 × 50 ml) extrahiert. Die vereinigten EtOAc-Extrakte wurden mit gesättigtem wäßrigem NaCl (2 × 70 ml) gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und im Vakuum auf konzentriert, um einen weißen Feststoff zu liefern. Reinigung dieses Materials durch Flash-Chromatographie an 200 g Kieselgel (8:2 Hexan:EtOAc) lieferte 1,2 g (58%) (2R,3S,5S)-tert-Butyl-3-(2-cyclohexylbenzyl)-2-oxo-2,3-diphenyl-4-morpholincarboxylat als weißen kristallinen Feststoff, Smp. 195–198°C.
Beispiel 82
(2R,3S,5S)-6-Oxo-2,3-Diphenyl-(2-cyclohexylbenzyl)-morpholin
Ein mit einem Stickstoffeinlaß und einem Magnetrührer ausgerüsteter trockener 50 ml-Dreihalskolben wurde mit 2,10 g (2R,3S,5S)-tert-Butyl-3-(2-cyclohexylbenzyl)-2-oxo-5,6-diphenyl-4-morpholincarboxylat und 33 ml wasserfreiem CH₂Cl₂ gefüllt. Die Lösung wurde bei RT gerührt und mit 3,3 ml TFA behandelt. Nach 3,5 h zeigte DC (SiO₂, 85:15, Hexan:EtOAc) kein verbleibendes Ausgangsmaterial, eine neue Hauptkomponente bei R_f = 0,45 und zwei Nebenkomponenten bei R_f = 0,68 und 0,70 an. Die Lösung wurde durch Zugabe von 9 ml Et₃N neutralisiert und im Vakuum unter Erhalt eines dicken Öls auf konzentriert. Dieses Material wurde in 80 ml CH₂Cl₂ gelöst, mit Wasser (3 × 60 ml), gefolgt von 5% wäßrigem NaHCO₃ (3 × 60 ml) gewaschen und über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet. Das Trocknungsmittel wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat im Vakuum auf konzentriert, um einen weißen Feststoff zu liefern. Reinigung des Rohprodukts durch Flash-Chromatographie an 150 g Kieselgel (8:2 Hexan:EtOAc) gefolgt von Umkristallisation aus EtOH-H₂O lieferte 1,27 g (75%) (2R,3S,5S)-6-Oxo-2,3-Diphenyl-(2-cyclohexylbenzyl)morpholin als weißen kristallinen Feststoff, Smp. 159–160°C.
Beispiel 83
2-Cyclohexyl-L-phenylalanin
Gemäß Beispiel 53 wurden 1,17 g (2R,3S,5S)-6-Oxo-2,3-Diphenyl-5-(2-cyclohexylbenzyl)morpholin in 60 ml 1:1 THF:EtOH unter Verwendung von 0,34 g PdCl₂ hydrogenolysiert, um 0,83 g 2-Cyclohexyl-L-phenylalanin·HCl als flockigen weißen Feststoff zu liefern, Smp. 140°C (Zers.).
Beispiel 84
tert-Butyl-2-cyclohexyl-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 54 wurden 0,73 g 2-Cyclohexyl-L-phenylalanin·HCl mit 25 ml Isobutylen in 25 ml 1,4-Dioxan in Gegenwart von 0,4 ml konz. H₂SO₄ behandelt. Aufarbeiten gefolgt an Ansäuern des freien Amins mit etherischem HCl lieferte 0,70 g (80%) tert-Butyl-2-cyclohexyl-L-phenylalaninat·HCl als gelben Schaum.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,53 (br s, 3H, NH₃ ⁺), 7,27 (m, 2H, aromatisches CH), 7,10 (m, 2H, aromatisches CH), 3,86 (m, 1H, Methin), 3,24 (m, 1H, ArCH₂), 2,97 (m, 1H, ArCH₂), 2,72 (m, 1H, Cyclohexylmethin), 1,86-1,60 (m, 5H, Cyclohexyl-CH₂), 1,56–1,30 (m, 5H, Cyclohexyl-CH₂), 1,19 (s, 9H, t-Bu).

Beispiel 85
tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-2-cyclohexyl-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 9 wurden 0,70 g tert-Butyl-2-cyclohexyl-L-phenylalaninat·HCl mit 0,70 g N-Cbz-L-Glutaminsäure-γ-tert-butylester (Sigma) unter Verwendung von 0,42 g EDC (Aldrich) und 0,23 ml N-Methylmorpholin gekuppelt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an 150 g Kieselgel (8:2, Hexan-EtOAc) gereinigt, um 0,97 g (76%) tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-2-cyclohexyl-L-phenylalaninat als weißen Schaum zu liefern.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,32 (d, 1H, J=7,6, NH), 7,40–6,97 (m, 10H, aromatisches CH, NH), 5,00 (m, 2H, PhCH₂O), 4,26 (m, 1H, Methin), 4,04 (m, 1H, Methin), 3,07 (m, 1H, ArCH₂), 2,93–2,70 (m, 2H, ArCH₂, Cyclohexylmethin), 2,19 (t, 2H, J=7,7, Glu-4-CH₂), 1,90–1,62 (m, 7H, Glu-3-CH₂, Cyclohexyl-CH₂), 1,56–1,33 (m, 5H, Cyclohexyl-CH₂), 1,38 (s, 9H, t-Bu), 1,32 (s, 9H, t-Bu).
Massenspektrum: (CI, CH₄), 623 (M+H)⁺, 567, 539, 511, 489, 433, 193.

Beispiel 86
tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-2-cyclohexyl-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 48 wurden 0,97 g tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-2-cyclohexyl-L-phenylalaninat unter Verwendung von 0,16 g 10% Pd(C) in 50 ml McOH hydrogenolysiert. Dies lieferte 0,76 g (100%) tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-2-cyclohexyl-L-phenylalaninat als dickes transparentes Öl. Eine Probe des entsprechenden HCl-Salzes zur 1H-NMR-Analyse wurde hergestellt durch Behandeln von 10 mg des Produkts mit überschüssigem 1M etherischem HCl und Aufkonzentrieren zur Trockene.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 9,05 (d, 1H, J=7,5, NH), 8,24 (br s, 3H, NH₃ ⁺), 7,20 (m, 3H, aromatisches CH), 7,07 (t, 1H, J=7,1 aromatisches CH), 4,28 (m, 1H, Methin), 3,83 (m, 1H, Methin), 3,08 (m, 1H, ArCH₂), 2,91 (m, 1H, ArCH₂), 1,78 (m, 1H, Cyclohexylmethin), 2,34 (m, 2H, Glu-4-CH₂), 2,00 (m, 2H, Glu-3-CH₂), 1,89–1,60 (m, 5H, Cyclohexyl-CH₂), 1,57–1,20 (m, 5H, Cyclohexyl-CH₂), 1,40 (s, 9H, t-Bu), 1,33 (s, 9H, t-Bu).

Beispiel 87
tert-Butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)-methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-2-cyclohexyl-L-phenyl-alaninat
Gemäß Beispiel 49 wurden 0,247 g 4-(N-(2,4-Diamino-6-pteridinyl-methyl)-N-methylamino)benzoesäure-hemihydrochloriddihydrat (Aldrich) mit 0,35 g tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-2-cyclohexyl-L-phenylalaninat unter Verwendung von 0,30 ml DECP (Aldrich) und 0,32 ml Et₃N in 25 ml DMF gekuppelt. Das Rohprodukt wurde zweimal flashchromatographiert (150 g SiO₂, 7:7:1 CH₂Cl₂:Aceton:MeOH; 150 SiO₂, 95:5 CH₂Cl₂:MeOH), um 0,297 g (57 ) tert-Butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-2-cyclohexyl-L-phenylalaninat als gelbes Pulver zu liefern, Smp. 135–140°C.
Beispiel 88
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)-methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-2-cyclohexyl-L-phenylalanin
Gemäß Beispiel 50 wurden 0,271 g tert-Butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-2-cyclohexyl-L-phenylalaninat mit gasförmigem HCl in 20 ml CH₃NO₂ für 1,5 h behandelt. Aufarbeiten und Isolieren in der gewöhnlichen Weise lieferte 0,191 g (79%) N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)-benzoyl)-L-glutam-1-yl-2-cyclohexyl-L-phenylalanin als gelb-orangefarbenes Pulver, Smp. 175°C (Zers.).

HPLC: ein Peak an C18, k' = 4,05, 65:35:0,1 H₂O:MeCN:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min.
¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 12,75–11,90 (br s, COOH), 8,58 (s, 1H, Pteridinyl-7-CH), 8,20 (d, 1H, J=7,9, Amid-NH), 7,98 (d, 1H, J=8,1, Amid-NH), 7,79 (br s, 1H, NH₂), 7,72 (d, 2H, J=8,9, aromatisches CH), 7,59 (br s, 1H, NH₂), 7,19 (m, 1H, aromatisches CH), 7,08 (m, 2H, aromatisches CH), 6,92 (m, 1H, aromatisches CH), 6,83 (d, 2H, J=8,9, aromatisches CH), 6,75 (br s, 2H, NH₂), 4,80 (s, 2H, Pteridinyl-CH₂), 4,43 (m, 1H, Methin), 4,31 (m, 1H, Methin), 3,21 (s, 3H, N-CH₃), 3,12 (m, 1H, ArCH₂), 3,92–3,70 (m, 2H, ArCH₂, Cyclohexylmethin), 2,23 (t, 2H, J=7,7, Glu-4-CH₂), 2,05–1,60 (m, 7H, Glu-3-CH₂, Cyclohexyl-CH₂), 1,50–1,16 (m, 5H, Cyclohexyl-CH₂).

Elementaranalyse

Berechnet für C₃₅H₄₁N₉O₆·1,5 H₂O (MG 710,79): C, 59,14; H, 6,24; N 17,74; Gefunden: C, 59,11; H, 6,20; N 17,73. Massenspektrum: (FAB) 684 (M+H)⁺, 613, 510, 385, 309. UV-Spektrum: (Puffer pH 7) λ_max (ε)) 259,7 (22300), 308,8 (22700), 374,0 (6850). λ_min (ε) 241,7 (12800), 275,2 (14700), 346,3 (5170).

Beispiel 89
3-tert-Butylbenzylbromid
Ein mit einem Stickstoffeinlaß, einem Kondensator, einem Thermometer und einem Magnetrührer ausgerüsteter trockener 100 ml-Dreihalskolben wurde mit 2,0 g 3-tert-Butyltoluol (Wiley Organics, Coshocton, OH 43812), 2,40 g N-Bromsuccinimid (Aldrich) und 30 ml CCl₄ gefüllt. Die Mischung wurde mit 0,16 g Benzoylperoxid (Aldrich) behandelt und unter N₂ auf 60°C erwärmt. Sorgfältige Temperaturkontrolle ist wichtig, um die Bildung von Nebenprodukt zu minimieren. Nach 1 h bei 60°C wurde die Reaktionsmischung auf 0°C abgekühlt, zur Entfernung von Succinimid filtriert und das Filtrat im Vakuum auf konzentriert, um eine hellgelbe Flüssigkeit zu liefern. Die Analyse dieses Material durch DC (SiO₂, Hexan) zeigte eine neue Hauptkomponente bei R_f = 0,50, eine Nebenkomponente bei R_f = 0,55 und eine Spur 3-tert-Butyltoluol bei R_f = 0,75 an. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an 100 g Kieselgel (Hexan) gereinigt, um 1,06 g (35%) 3-tert-Butylbenzylbromid als klare Flüssigkeit zu liefern.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 7,47 (s, 1H, aromatisches CH), 7,39-7,21 (m, 3H, aromatisches CH), 4,69 (s, 2H, ArCH₂Br), 1,27 (s, 9H, t-Bu).

Beispiel 90
(2R,3S,5S)-tert-Butyl-3-(3-tert-butylbenzyl)-2-oxo-2,3-diphenyl-4-morpholincarboxylat
Gemäß Beispiel 81 wurden 1,63 g tert-Butyl-(2R,3S)-(–)-6-oxo-2,3-diphenyl-4-morpholincarboxylat (Aldrich) mit 1,0 g 3-tert-Butylbenzylbromid in 70 ml wasserfreiem THF unter Verwendung von 4,62 ml 1M Natriumbis(trimethylsilyl)amid in THF (Aldrich) alkyliert. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an 150 g Kieselgel (9:1 Hexan:EtOAc) gereinigt, um 1,84 g (80%) (2R,3S,5S)-tert-Butyl-3-(3-tert-butylbenzyl)-2-oxo-2,3-diphenyl-4-morpholincarboxylat als weißen Schaum zu liefern, Smp. 65–90°C.
Beispiel 91
(2R,3S,5S)-6-Oxo-2,3-diphenyl-5-(3-tert-butylbenzyl)-morpholin
Gemäß Beispiel 82 wurden 1,79 g (2R,3S,5S)-tert-Butyl-3-(3-tert-butylbenzyl)-2-oxo-5,6-diphenyl-4-morpholincarboxylat mit 3 ml TFA in 30 ml CH₂Cl₂ für 3,4 h behandelt. Neutralisation mit 7,7 ml Et₃N und Aufarbeiten in der gewöhnlichen Weise ergab ein dickes Öl. Reinigung des Rohmaterials durch Flash-Chromatographie an 125 g Kieselgel (75:25 Hexan:EtOAc) lieferte 0,90 g (63%) (2R,3S,5S)-6-Oxo-2,3-diphenyl-5-(3-tert-butylbenzyl)morpholin als weißen kristallinen Feststoff, Smp. 136–137°C.
Beispiel 92
3-tert-Butyl-L-phenylalanin
Gemäß Beispiel 53 wurden 0,89 g (2R,3S,5S)-6-Oxo-2,3-diphenyl-5-(3-tert-butylbenzyl)morpholin in 40 ml 1:1 THF:EtOH unter Verwendung von 0,28 g PdCl₂ hydrogenolysiert, um 0,57 g (99%) 3-tert-Butyl-L-phenylalanin·HCl als weißes Pulver zu liefern, Smp. >250°C.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,42 (br s, 3H, NH₃ ⁺), 7,26 (m, 3H, aromatisches CH), 7,08 (dd, 1H, J=7,0, 1,3, aromatisches CH), 4,12 (m, 1H, Methin), 3,12 (d, 2H, J=6,1, ArCH₂), 1,27 (s, 9H, t-Bu).

Beispiel 93
tert-Butyl-3-tert-butyl-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 94 wurden 0,50 g 3-tert-Butyl-L-phenylalanin·HCl mit 30 ml Isobutylen in 25 ml 1,4-Dioxan in Gegenwart von 0,4 ml konz. H₂SO₄ behandelt. Aufarbeiten in der gewöhnlichen Weise gefolgt von Ansäuern des freien Amins mit etherischem HCl lieferte 0,53 g (87%) tert-Butyl-3-tert-butyl-L-phenylalaninat·HCl als hellgelben Schaum.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,48 (br s, 3H, NH₃ ⁺), 7,36–7,20 (m, 3H, aromatisches CH), 7,08 (d, 1H, J=7,1, aromatisches CH), 4,16 (m, 1H, Methin), 3,19 (dd, 1H, J=13,9, 5,7, ArCH₂), 2,95 (dd, 1H, J=13,9, 8,6, ArCH₂), 1,28 (s, 9H, t-Bu), 1,27 (s, 9H, t-Bu).

Beispiel 94
tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-tert-butyl-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 9 wurden 0,52 g tert-Butyl-3-tert-butyl-L-phenyl-alaninat·HCl mit 0,56 g N-Cbz-L-Glutaminsäure-γ-tert-butylester (Sigma) unter Verwendung von 0,33 g EDC (Aldrich) und 0,18 ml N-Methylmorpholin gekuppelt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an 110 g Kieselgel (75:25 Hexan:EtOAc) gereinigt, um 0,77 g (78%) tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-tert-butyl-L-phenylalaninat als dickes transparentes ÖL zu liefern.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,28 (d, 1H, J=7,3, NH), 7,42–7,13 (m, 9H, aromatisches CH, NH), 7,04 (d, 1H, J=6,6, aromatisches CH), 5,02 (s, 2H, PhCH₂O), 4,37 (m, 1H, Methin), 4,07 (m, 1H, Methin), 2,96 (d, 2H, J=7,6, ArCH₂), 2,21 (t, 2N, J=7,7, Glu-4-CH₂), 1,97–1,60 (m, 2H, Glu-3-CH₂), 1,39 (s, 9H, t-Bu), 1,31 (s, 9H, t-Bu), 1,27 (s, 9H, t-Bu).

Beispiel 95
tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-tert-butyl-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 48 wurden 0,76 g tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-tert-butyl-L-phenylalaninat unter Verwendung von 0,13 g 10% Pd(C) in 60 ml McOH hydriert. Dies lieferte 0,58 g (99%) tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-tert-butyl-L-phenylalaninat als dickes transparentes öl. Eine Probe des entsprechenden HCl-Salzes zur 1H-NMR-Analyse wurde hergestellt durch Behandeln von 10 mg des Produkts mit überschüssigem 1N etherischem HCl und Auf konzentrieren zur Trockene.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,97 (d, 1H, J=7,0, NH), 8,27 (br s, 3H, NH₃ ⁺), 7,31–7,15 (m, 3H, aromatisches CH), 7,06 (d, 1H, J=6,8, aromatisches CH), 4,38 (m, 1H, Methin), 3,82 (m, 1H, Methin), 2,96 (d, 2H, J=7,2, ArCH₂), 2,33 (m, 2H, Glu-4-CH₂), 1,98 (m, 2H, Glu-3-CH₂), 1,38 (s, 9H, t-Bu), 1,29 (s, 9H, t-Bu), 1,26 (s, 9H, t-Bu).

Beispiel 96
tert-Butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)-methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-tert-butyl-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 49 wurden 0,223 g 4-(N-(2,4-Diamino-6-pteridinyl-methyl)-N-methylamino)benzoesäure-hemihydrochloriddihydrat (Aldrich) mit 0,30 g tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-tert-butyl-L-phenylalaninat unter Verwendung von 0,27 ml DECP (Aldrich) und 0,29 ml Et₃N in 25 ml DMF gekuppelt. Das Rohprodukt wurde zweimal flash-chromatographiert (180 g SiO₂, 7:7:1 CH₂Cl₂:Aceton:MeOH; 185 g SiO₂, 95:5 CH₂Cl₂:MeOH), um 0,323 g (71%) tert-Butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)-methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-tert-butyl-L-phenylalaninat als gelbes Pulver zu liefern, Smp. 128–135°C.
Beispiel 97
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)-methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-tert-butyl-L-phenylalanin (Verfahren A)
Für Verfahren B zur Herstellung dieser Verbindung siehe Beispiel 130. Gemäß Beispiel 50 wurden 0,303 g tert-Butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-tert-butyl-L-phenylalaninat mit gasförmigem HCl in 40 ml CH₃NO₂ für 1,5 h behandelt. Aufarbeiten und Isolieren in der gewöhnlichen Weise lieferte 0,215 g (79%) N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)- benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-tert-butyl-L-phenylalanin als gelbes Pulver, Smp. 183°C.

HPLC: ein Peak an C18, k' = 2,54, 70:30:0,1 H₂O:MeCN:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min.
¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 12,90–11,80 (br s, COOH), 8,59 (s, 1H, Pteridinyl-7-CH), 8,08 (d, 1H, J=7,6, Amid-NH), 7,98 (d, 1H, J=8,0, Amid-NH), 7,89 (br s, 1H, NH₂), 7,70 (d, 2H, J=8,9, aromatisches CH), 7,69 (br s, 1H, NH₂), 7,21 (s, 1H, aromatisches CH), 7,16 (d, 1H, J=7,7, aromatisches CH), 7,08 (t, 1H, J=7,6, aromatisches CH), 6,99 (d, 1H, J=7,4, aromatisches CH), 6,81 (m, 4H, aromatisches CH, NH2), 4,79 (s, 2H, Pteridinyl-CH₂), 4,43 (m, 2H, Methine), 3,21 (s, 3H, N-CH₃), 3,03 (m, 1H, ArCH₂), 2,91 (m, 1H, ArCH₂), 2,24 (t, 2H, J=7,8, Glu-4-CH₂), 2,04–1,74 (m, 2H, Glu-3-CH₂), 1,20 (s, 9H, t-Bu).

Elementaranalyse
Berechnet für C₃₃H₃₉N₉O₆·1,8 H₂O (MG 690,16):
C, 57,43; H, 6,22; N 18,27;
Gefunden: C, 57,34; H, 6,07; N 18,26.
Massenspektrum: (FAB) 658 (M+H)⁺, 459, 307.
UV-Spektrum: (Puffer pH 7) λ_max (ε) 259,4 (22800), 308,1 (23000), 372,5 (7040).
λ_max (ε) 241,0 (13400), 274,6 (15200), 345,2 (5380).
Beispiel 98
N-((tert-Butoxy)carbonyl)-4-(bis(2-chlorethyl)amino)-L-phenylalanin
Ein mit einem Magnetrührer und einem Stickstoffeinlaß ausgerüsteter trockener 50 ml-Dreihalskolben wurde mit 0,10 g 4'-(Bis(2-chlorethyl)-amino)-L-phenylalanin·H₂O (Sigma), 14 ml 1:1 DMF:CH₃CN und 0,19 ml Et₃N gefüllt. Die Mischung wurde mit 91 mg 2-(tert-Butoxycarbonyloxyimino)-2-phenylacetonitril (BOC-ON, Fluka) behandelt und bei RT unter N₂ gerührt. Nach 18 h hatte sich das feste Ausgangsmaterial unter Erhalt einer gelben Lösung gelöst, die im Vakuum zur Trockene auf konzentriert wurde. Analyse des Rückstands, durch DC (SiO₂, 9:1 CHCl₃:MeOH) zeigte eine neue Hauptkomponente bei R_f = 0,65, aus BOC-ON stammende Komponenten bei R_f= 1,0 und 0,71 und zwei Spuren-Komponenten bei R_f = 0,60 und 0,35 an. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an 60 g Kieselgel (9:1 CHCl₃:MeOH) gereinigt, um 1,0 g (80%) N-((tert-Butoxy)carbonyl)-4-(bis(2-chlorethyl)amino)-L-phenylalanin als hellgelbes Glas zu liefern.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 7,04 (d, 2H, J=8,6, aromatisches CH), 6,62 (d, 2H, J=8,5, aromatisches CH), 6,46 (br s, 1H, NH), 3,87 (m, 1H, Methin), 3,67 (s, 8H, N(CH₂CH₂Cl)₂), 2,90 (m, 1H, ArCH₂), 2,73 (m, 1H, ArCH₂), 1,33 (s, 9H, t-Bu).

Beispiel 99
tert-Butyl-N-((tert-butoxy)carbonyl)-4-(bis(2-chlorethyl)amino)-L-phenylalanyl-(3-cyclopentyl)-L-phenylalaninat
Ein mit einem Magnetrührer ausgerüsteter 50 ml-Rundkolben wurde mit 96 mg N-((tert-Butoxy)carbonyl)-4-(bis(2-chlorethyl)amino)-L-phenylalanin, 77 mg tert-Butyl-3-cyclopentyl-L-phenylalaninat·HCl und 10 ml CH₂Cl₂ gefüllt. Die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt und mit 48 mg EDC (Aldrich) gefolgt von 0,026 ml N-Methylmorpholin behandelt. Die Reaktionsmischung wurde für 20 min bei 0°C gerührt, auf RT erwärmen gelassen und für weitere 2 h gerührt. Analyse der Lösung durch DC (SiO₂, 7:3 Hexan:EtOAc) zeigte eine neue Hauptkomponente bei R_f = 0,54 und vier Nebenkomponenten bei R_f = 0,4, 0,37, 0,16 und 0,0 an. Die Lösung wurde im Vakuum zur Trockene auf konzentriert und der Rückstand an 50 g Kieselgel flashchromatographiert, um 73 mg (46%) tert-Butyl-N-((tert-butoxy)carbonyl)-4-(bis(2-chlorethyl)amino)-L-phenylalanyl-(3-cyclopentyl)-L-phenylalaninat als dicken halbfesten Stoff zu liefern.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,18 (d, 1H, J=7,8, NH), 7,19 (m, 1H, aromatisches CH), 7,13–7,00 (m, 5H, aromatisches CH, NH), 6,77 (d, 1H, J=8,8 aromatisches CH), 6,63 (d, 2H, J=8,9, aromatisches CH), 4,35 (m, 1H, Methin), 4,05 (m, 1H, Methin), 3,68 (s, 8H, N(CH₂CH₂Cl)₂), 2,93 (m, 3H, ArCH₂, Cyclopentylmethin), 2,79 (m, 1H, ArCH₂), 2,58 (m, 1H, ArCH₂), 1,80–1,43 (m, 8H, Cyclopentyl-CH₂), 1,29 (s, 18H, t-Bu).

Beispiel 100
4-(Bis(2-chlorethyl)amino)-L-phenylalanyl-3-cyclopentyl-L-phenylalanin
Ein mit einem Stickstoffeinlaß und einem Magnetrührer ausgerüsteter 25 ml-Dreihalskolben wurde mit 65 mg tert-Butyl-N-((tert-butoxy)carbonyl)-4-(bis(2-chlorethyl)amino)-L-phenylalanyl-(3-cyclopentyl)-L-phenylalaninat und 8 ml CH₃NO₂ gefüllt. Die Lösung wurde durch Hindurchblasen von HCl-Gas für 10 min angesäuert. Nach Rühren bei RT unter N₂ für 30 min wurde die Lösung im Vakuum zur Trockene auf konzentriert. Analyse des resultierenden Feststoffs durch HPLC (C18, 50:50:0,1 H₂O:MeCN:TFA) zeigte eine Hauptkomponente bei k' = 1,14 (96%) und eine Nebenkomponente bei k' = 1,60 (4%) an. Das Rohprodukt wurde durch halbpräparative HPLC gereinigt (C18, 55:45:0,1 → 50:50:0,1 H₂O:MeCN:TFA über 20 min, Fließgeschwindigkeit = 15 ml/min). Fraktionen, die das reine Produkt enthielten (k' = 1,14 gemäß analytischer HPLC), wurden vereinigt und im Vakuum zu 20 ml aufkonzentriert. Die resultierende Suspension wurde eingefroren und lyophilisiert, um 35 mg (55%) 4-(Bis(2-chlorethyl)amino)-L-phenylalanyl-3-cyclopentyl-L-phenylalanin als weißes Pulver zu liefern, Smp. 80–90°C.

HPLC: ein Peak an C18, k' = 1,05, 50:50:0,1 McCN:H₂O:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min.
¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,85 (d, 1H, J=7,8, NH), 8,00 (br s, 3H, NH₃ ⁺), 7,25–7,00 (m, 6H, aromatisches CH), 6,70 (d, 2H, J=8,5, aromatisches CH), 4,50 (m, 1H, Methin), 3,89 (m, 1H, Methin), 3,69 (5, 8H, N(CH₂CH₂Cl)₂), 3,12–2,83 (m, 4H, ArCH₂, Cyclopentylmethin), 2,77 (m, 1H, ArCH₂), 1,97 (m, 2H, Cyclopentyl-CH₂), 1,84–1,43 (m, 6H, Cyclopentyl-CH₂).
¹⁹F-NMR: (282 MHz, DMSO-d6): d 1,26(relativ zu TFA externer Standard).

Elementaranalyse

Berechnet für C₂₇H₃₅N₃O₃Cl₂·TFA·1,6 H₂O (MG 663,35): C, 52,51; H, 5,96; N 6,33; Gefunden: C, 52,16; H, 5,69; N 6,69. Massenspektrum: (FAB) 520 (M+H)⁺, 273. UV-Spektrum: (2,5 × 10^–3 M NaOH) λ_max (ε) 261,5 (18700), 303,9 (2090). λ_min (ε) 232,3 (5270), 288,2 (1760).

Beispiel 101
3-Iod-O-(tert-butyldimethylsilyl)benzylalkohol
Ein mit einem Magnetrührer und Stickstoffeinlaß ausgerüsteter 100 ml-Dreihalskolben wurde mit 5,0 g 3-Iodbenzylalkohol (Aldrich), 3,86 g tert-Butyldimethylsilylchlorid (Aldrich), 3,20 g Imidazol (Aldrich) und 30 ml wasserfreiem DMF gefüllt. Die resultierende Lösung wurde unter Stickstoff für 4 h gerührt und im Vakuum auf konzentriert, um ein klares viskoses Öl zu ergeben. Dieses Material wurde in 150 ml EtOAc gelöst, und die Lösung wurde mit 5%igem wäßrigem NaHCO₃ (3 × 70 ml) gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und im Vakuum auf konzentriert, um eine klare Flüssigkeit zu ergeben. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an 200 g Kieselgel (Hexan) gereinigt, um 7,01 g (94%) 3-Iod-O-(tert-butyldimethylsilyl)-benzylalkohol als klare Flüssigkeit zu liefern.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 7,67 (s, 1H, aromatisches CH), 7,56 (d, 1H, J=7,3, aromatisches CH), 7,27 (d, 1H, J=9,2, aromatisches CH), 7,06 (t, 1H, J=7,6, aromatisches CH), 4,68 (s, 2H, ArCH₂O), 0,94 (s, 9H, t-Bu), 0,10 (s, 6H, SiMe₂).

Beispiel 102
3-(1-Hydroxycyclobutyl)-O-(tert-butyltrimethylsilyl)-benzylalkohol
In einen mit einem Stickstoffeinlaß und einem Magnetrührer ausgerüsteten trockenen 500 ml-Dreihalskolben wurden 7,0 g 3-Iod-O-(tert-butyldimethylsilyl)benzylalkohol und 100 ml wasserfreies THF gegeben. Die Lösung wurde auf -78°C in einem Trockeneis-Isopropanol-Bad gekühlt und mit 9,7 ml 2,5 M n-Butyllithium/Hexan (Aldrich) durch tropfenweise Zugabe über eine Spritze durch eine Gummimembran behandelt. Nach Rühren bei –78°C für 20 min wurde die Lösung mit 1,8 ml Cyclobutanon (Aldrich) durch tropfenweise Zugabe behandelt. Die Reaktionsmischung wurde für 20 min bei –78°C gerührt und dann auf RT erwärmen gelassen. Nach 30 min bei RT wurde die Lösung mit 100 ml Wasser vermischt und einer Rotationsverdampfung unterzogen, um THF zu entfernen. Die resultierende Emulsion wurde mit EtOAc (4 × 60 ml) extrahiert. Die vereinigten EtOAc-Extrakte wurden mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und im Vakuum auf konzentriert, um ein hellgelbes Öl zu ergeben. Dieses Material wurde durch Flash-Chromatographie an 160 g Kieselgel (9:1 Hexan:EtOAc) gereinigt, um 3,98 g (68%) 3-(1-Hydroxycyclobutyl)-O-(tert-butyltrimethylsilyl)-benzylalkohol als klare Flüssigkeit zu liefern.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 7,44 (s, 1H, aromatisches CH), 7,38–7,23 (m, 2H, aromatisches CH), 7,15 (d, 1H, J=7,4, aromatisches CH), 5,45 (s, 1H, OH), 4,72 (s, 2H), ArCH₂O), 2,41–2,18 (m, 4H, Cyclobutyl-CH₂), 1,88 (m, 1H, Cyclobutyl-CH₂), 1,61 (m, 1H, Cyclobutyl-CH₂), 0,90 (s, 9H, t-Bu), 0,08 (s, 6H, SiMe₂)

Beispiel 103
3-Cyclobutylbenzylalkohol
Ein mit einem Stickstoffeinlaß und einem Magnetrührer ausgerüsteter trockener 500 ml-Dreihalskolben wurde mit 3,98 g 3-(1-Hydroxycyclobutyl)-O-(tert-butyltrimethylsilyl)benzylalkohol und 85 ml CH₂Cl₂ gefüllt. Die Lösung wurde auf 0°C unter Stickstoff gekühlt und mit 15,7 ml TFA gefolgt von 4,78 ml Triethylsilan behandelt. Nach Rühren bei 0°C für 1 h wurde die Lösung auf RT erwärmen gelassen. Analyse durch DC (SiO₂, 8:2 Hexan:EtOAc) nach 3,5 h bei RT zeigte nicht-umgesetztes Ausgangsmaterial bei R_f = 0,15 und eine neue Komponente bei R_f = 0,65 an. Die Lösung wurde mit weiteren 3 ml Triethylsilan behandelt und bei RT für 18 h gerührt. Die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt und durch langsame Zugabe von 30 ml Et₃N neutralisiert. Die Mischung wurde im Vakuum aufkonzentriert, um eine hellgelbe Flüssigkeit zu ergeben, die in 100 ml EtOAc gelöst wurde. Die resultierende Lösung wurde mit gesättigter Kochsalzlösung (3 × 80 ml) gewaschen, über wasser freiem MgSO₄ getrocknet und auf konzentriert, um eine klare Flüssigkeit zu ergeben. Dieses Material wurde in 80 ml wasserfreiem THF gelöst und mit 60 ml 1M (n-Bu)₄NF (Aldrich) in einem 500 ml-Dreihalskolben behandelt. Nach Rühren bei RT für 18 h wurde die Lösung im Vakuum auf konzentriert und der Rückstand in 100 ml EtOAc gelöst. Die Lösung wurde mit gesättigter Kochsalzlösung (4 × 80 ml) gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und auf konzentriert, um ein klares Öl zu ergeben. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an 120 g Kieselgel (8:2 Hexan:EtOAc) gereinigt, um 1,29 g (59%) 3-Cyclobutylbenzylalkohol als klare Flüssigkeit zu liefern.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 7,29–7,05 (m, 4H, aromatisches CH), 5,14 (t, J=5,7, OH), 4,48 (d, J=5,8, ArCH₂O), 3,51 (m, 1H, Cyclobutylmethin), 2,30 (m, 2H, Cyclobutyl-CH₂), 2,17–1,88 (m, 3H, Cyclobutyl-CH₂), 1,82 (m, 1H, Cyclobutyl-CH₂).

Beispiel 104
3-Cyclobutylbenzylbromid
Gemäß Beispiel 17 wurden 1,29 g 3-Cyclobutylbenzylalkohol mit 0,26 ml PBr₃ in 15 ml wasserfreiem CH₂Cl₂ behandelt, um 1,69 g Rohprodukt (92% rein gemäß ¹H-NMR) zu liefern. Dieses Material wurde durch Flash-Chromatographie an 65 g Kieselgel (Hexan) gereinigt, um 1,59 g (98%) 3-Cyclobutylbenzylbromid als klare Flüssigkeit zu liefern.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 7,35–7,13 (m, 4H, aromatisches CH), 4,70 (s, 2H, ArCH₂Br), 3,53 (m, 1H, Cyclobutylmethin), 2,39–1,75 (m, 6H, Cyclobutyl-CH₂).

Beispiel 105
tert-Butyl-(2R,3S,5S)-6-oxo-2,3-diphenyl-5-(3-cyclo-butylbenzyl)-4-morpholincarboxylat
Gemäß Beispiel 81 wurden 2,50 g tert-Butyl-(2R,3S)-(–)-6-oxo-2,3-diphenyl-4-morpholincarboxylat (Aldrich) mit 1,59 g 3-Cyclobutylbenzylbromid in 80 ml wasserfreiem THF unter Verwendung von 7,41 ml 1M Natriumbis(trimethylsilyl)amid in THF (Aldrich) alkyliert. Das Rohprodukt wurde einer Flash-Chromatographie an 120 g Kieselgel (8:2 Hexan:EtOAc) unterworfen und dann aus EtOH-Wasser umkristallisiert, um 1,90 g (54%) tert-Butyl-(2R,3S,5S)-6-oxo-2,3-diphenyl-5-(3-cyclobutylbenzyl)-4-morpholincarboxylat als weißes Pulver zu liefern, Smp. 145-147°C.
Beispiel 106
(2R,3S,5S)-6-Oxo-2,3-diphenyl-5-(3-cyclobutylbenzyl)-morpholin
Gemäß Beispiel 82 wurden 1,87 g tert-Butyl-(2R,3S,5S)-6-oxo-2,3-diphenyl-5-(3-cyclobutylbenzyl)-4-morpholincarboxylat mit 3,1 ml in TFA in 30 ml CH₂Cl₂ für 4 h behandelt. Neutralisation mit 8 ml Et₃N und Aufar beitung in der gewöhnlichen Weise ergab einen hellgelben Rückstand. Reinigung des Rohmaterials durch Flash-Chromatographie an 85 g Kieselgel (8:2 Hexan:EtOAc) lieferte 1,35 g (91%) (2R,3S,5S)-6-Oxo-2,3-diphenyl-5-(3-cyclobutylbenzyl)morpholin als dickes transparentes halbfestes Material.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 7,24–7,02 (m, 10H, aromatisches CH), 6,92 (m, 4H, aromatisches CH), 5,71 (s, 1H, Morpholin-2-H), 4,64 (m, 1H, Morpholin-3-H), 4,24 (m, 1H, Morpholin-5-H), 3,42 (m, 1H, Cyclobutylmethin), 3,26 (m, 1H, ArCH₂), 3,10 (m, 1H, ArCH₂), 2,76 (t, 1H, J=5,3, NH), 2,15 (m, 2H, Cyclobutyl-CH₂), 2,02–2,81 (m, 3H, Cyclobutyl-CH₂), 1,71 (m, 1H, Cyclobutyl-CH₂).

Beispiel 107
3-Cyclobutyl-L-phenylalanin
Gemäß Beispiel 53 wurden 1,35 g (2R,3S,5S)-6-Oxo-2,3-diphenyl-5-(3-cyclobutylbenzyl)morpholin in 60 ml 1:1 THF:EtOH unter Verwendung von 0,42 g PdCl₂ hydrogenolysiert, um 0,79 g (91%) 3-Cyclobutyl-L-phenylalanin·HCl als weißes Pulver zu liefern, Smp. >200°C.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,40 (br s, 3H, NH₃ ⁺), 7,26 (m, 1H, aromatisches CH), 7,13 (m, 2H, aromatisches CH), 7,08 (d, 1H, J=7,4, aromatisches CH), 4,13 (m, 1H, Methin), 3,50 (m, 1H, Cyclobutylmethin), 3,11 (d, 2H, J=7,4, ArCH₂), 2,29 (m, 2H, Cyclobutyl-CH₂), 2,18–1,88 (m, 3H, Cyclobutyl-CH₂), 1,83 (m, 1H, Cyclobutyl-CH₂).

Beispiel 108
tert-Butyl-3-cyclobutyl-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 54 wurden 0,65 g 3-Cyclobutyl-L-phenylalanin·HCl mit 25 ml Isobutylen in 25 ml 1,4-Dioxan in Gegenwart von 0,5 ml konz. H₂SO₄ behandelt. Aufarbeiten in der gewöhnlichen Weise, gefolgt von Ansäuern des freien Amins mit etherischem HCl lieferte 0,64 g (81%) tert-Butyl-3-cyclobutyl-L-phenylalaninat·HCl als weißes Pulver, Smp. 173-174°C.
Beispiel 109
tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-cyclobutyl-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 9 wurden 0,64 g tert-Butyl-3-cyclobutyl-L-phenylalaninat·HCl mit 0,69 g N-Cbz-L-Glutaminsäure-γ-tert-butylester (Sigma) unter Verwendung von 0,41 g EDC (Aldrich) und 0,23 ml N-Methylmorpholin gekuppelt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an 85 g Kieselgel (7:3 Hexan:EtOAc) gereinigt, um 0,98 g (80%) tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-cyclobutyl-L-phenylalaninat als dickes transparentes Öl zu liefern.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,21 (d, 1H, J=7,3, NH), 7,33 (m, 6H, aromatisches CH, NH), 7,18 (m, 1H, aromatisches CH), 7,02 (m, 3H, aromatisches CH), 5,00 (m, 2H, PhCH₂O), 4,32 (m, 1H, Methin), 4,05 (m, 1H, Methin), 3,47 (m, 1H, Cyclobutylmethin), 2,92 (d, 2H, J=7,6 ArCH₂), 2,31–2,12 (m, 4H, Glu-4-CH₂, Cyclobutyl-CH₂), 2,11–1,62 (m, 6H, Glu-3-CH₂, Cyclobutyl-CH₂), 1,37 (s, 9H, t-Bu), 1,29 (s, 9H, t-Bu).

Beispiel 110
tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-cyclobutyl-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 48 wurden 0,98 g tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-cyclobutyl-L-phenylalaninat unter Verwendung von 0,17 g 10% Pd(C) in 55 ml McOH hydrogenolysiert. Diese lieferte 0,76 g (100%) tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-cyclobutyl-L-phenylalaninat als dickes transparentes Öl. Eine Probe des entsprechenden HCl-Salzes zur 1H-NMR-Analyse wurde hergestellt durch Behandeln von 10 mg des Produkts mit überschüssigem 1N etherischem HCl und Aufkonzentrieren zur Trockene.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,92 (d, 1H, J=7,0, NH), 8,25 (br s, 3H, NH₃ ⁺), 7,20 (m, 1H, aromatisches CH), 7,08 (m, 3H, aromatisches CH), 4,38 (m, 1H, Methin), 3,83 (m, 1H, Methin), 3,48 (m, 1H, Cyclobutylmethin), 2,94 (d, 2H, J=7,8, ArCH₂), 2,16 (m, 4H, Glu-4-CH₂, Cyclobutyl-CH₂), 2,15–1,86 (m, 5H, Glu-3-CH₂, Cyclobutyl-CH₂), 1,79 (m, 1H, Cyclobutyl-CH₂), 1,38 (s, 9H, t-Bu), 1,31 (s, 9H, t-Bu).

Beispiel 111
tert-Butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)-methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-cyclobutyl-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 49 wurden 0,285 g 4-(N-(2,4-Diamino-6-pteridinylmethyl)-N-methylamino)bezoesäure-hemihydrochloriddihydrat (Aldrich) mit 0,38 g tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-cyclobutyl-L-phenylalaninat unter Verwendung von 0,34 ml DECP (Aldrich) und 0,37 ml Et₃N in 25 ml DMF gekuppelt. Das Rohprodukt wurde einer Flash-Chromatographie an 100 g Kieselgel (7:7:1 CH₂Cl₂:Aceton:MeOH) unterworfen, um 0,45 g (78%) tert-Butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-cyclobutyl-L-phenylalaninat als gelbes Pulver zu liefern, Smp. 120–125°C.
Beispiel 112
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)-methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclobutyl-L-phenylalanin
Gemäß Beispiel 50 wurden 0,40 g tert-Butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-cyclobutyl-L-phenylalaninat mit gasförmigem HCl in 60 ml CH₃NO₂ für 1 h behandelt. Aufarbeiten und Isolierung in der gewöhnlichen Weise lieferte 0,281 g (79%) N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)- benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclobutyl-L-phenylalanin als gelbes Pulver, Smp. 175°C (Zers.).

HPLC: ein Peak an C18, k' = 2,50, 65:35:0,1 H₂O:MeCN:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min.
¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 12,85–11,75 (br m, COOH), 8,58 (s, 1H, Pteridinyl-7-Ch), 8,04 (d, 1H, J=8,1, Amid-NH), 8,00 (d, 1H, J=8,7, Amid-NH), 7,75 (br s, 1H, NH₂), 7,71 (d, 2H, J=8,9, aromatisches CH), 7,55 (br s, 1H, NH₂), 7,10–6,92 (m, 4H, aromatisches CH), 6,82 (d, 2H, J=8,9, aromatisches CH), 6,70 (br s, 2H, NH₂), 4,79 (s, 2H, Pteridinyl-CH₂), 4,39 (m, 2H, Methine), 3,40 (m, 1H, Cyclobutylmethin), 3,21 (s, 3H, N-CH₃), 3,00 (m, 1H, ArCH₂), 2,88 (m, 1H, ArCH₂), 2,29–2,08 (m, 4H, Glu-4-CH₂, Cyclobutyl-CH₂), 2,07–1,65 (m, 6H, Glu-3-CH₂, Cyclobutyl-CH₂).

Elementaranalyse

Berechnet für C₃₃H₃₇N₉O₆·1,6 H₂O (MG 684,54): C, 57,90; H, 5,92; N 18,42; Gefunden: C, 57,88; H, 5,90; N 18,52. Massenspektrum: (Ionen-Spray) 656 (M+H)⁺. UV-Spektrum: (Puffer pH 7) λ_max (ε) 259,5 (22100), 308,0 (22300), 373,7 (6740). λ_min (ε) 241,2 (12900), 274,5 (14600), 345,6 (5130).

Beispiel 113
6-Brommethyl-3,4-dihydro-2-methyl-4-oxochinazolin
Gemäß Beispiel 4 wurden 1,00 g 3,4-Dihydro-2,6-dimethyl-4-oxochinazolin (A.B. Sen; J.K. Gupta, J. Indian Chem. Soc., 1962, 31, 369) einer Bromierung unter Verwendung von 1,05 g N-Bromsuccinimid (Aldrich) und 0,17 g Benzoylperoxid in 50 ml 1,2-Dichlorethan für 30 min unterworfen, um 0,95 g (64%) 6-Brommethyl-3,4-dihydro-2-methyl-4-oxochinazolin als braunen Feststoff zu liefern.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,17 (s, 1H, aromatisches CH), 7,85 (d, 1H, J=8,5, aromatisches CH), 7,58 (d, 1H, J=8,5, aromatisches CH), 4,88 (s, 2H, ArCH₂Br), 2,39 (s, 3H, CH₃).

Beispiel 114
Ethyl-5-N-methylamino-2-thiophencarboxylat
Eine Mischung aus 2,0 g Ethyl-5-amino-2-thiophencarboxylat (D. Mackay, Can. J. Chem. 1966, 44, 2881-2891; H. Paul; H. Mugulla, Arch. Pharm. 1978, 311, 679-691), 2,05 g Methyliodid (Aldrich) und 2,58 g 2,6-Lutidin (Aldrich) in 80 ml DMF wurde bei 70°C unter Stickstoff für 24 h gerührt. Analyse der Reaktionsmischung durch DC (SiO₂, 3:2 Hexan:EtOAc) zeigte Ausgangsmaterial bei R_f = 0,51 und eine neue Komponente bei R_f = 0,60 an. Die Mischung wurde mit zusätzlichen 1,71 g Methyliodid behandelt und bei 70°C für 8 h, bei RT für 72 h und bei 70°C für weitere 8 h gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 75 ml Wasser vermischt und mit EtOAc (3 × 150 ml) extrahiert. Die vereinigten EtOAc-Extrakte wurden mit gesättigter wäßriger Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum zur Trockene auf konzentriert. Der rohe Rückstand wurde einer Flash-Chromatographie an Kieselgel (75:25 Hexan:EtOAc) unterworfen, um 0,67 g (38%) Ethyl-5-N-methylamino-2-thiophencarboxylat als braunen Feststoff zu liefern, Smp. 41–43°C.
Beispiel 115
Ethyl-5-(((3,4-dihydro-2-methyl-4-oxo-6-chinazolinyl)-methyl)methylamino)-2-thiophen-carboxylat
Ein mit einem Kühler und einem Magnetrührer ausgerüsteter 100 ml-Rundkolben wurde mit 0,66 g 6-Brommethyl-3,4-dihydro-2-methyl-4-oxochinazolin, 0,44 g Ethyl-5-N-methylamino-2-thiophencarboxylat, 0,25 g 2,6-Lutidin und 30 ml wasserfreiem DMF gefüllt. Die Mischung wurde bei 80°C für 18 h gerührt. Analyse der Reaktionsmischung durch DC (SiO₂, 95:5 CHCl₂:MeOH) zeigte Ausgangsmaterialien und eine neue Komponente bei R_f = 0,41 an. Die Mischung wurde im Vakuum zur Trockene auf konzentriert, und der Rückstand wurde einer Flash-Chromatographie an 110 g Kieselgel (95:5 CH₂Cl₂:MeOH) unterworfen. Fraktionen, die die Komponente bei R_f = 0,41 enthielten, wurden vereinigt und auf konzentriert, um 0,42 g (49%) Ethyl-5-(((3,4-dihydro-2-methyl-4-oxo-6-chinazolinyl)methyl)methylamino)-2-thiophen-carboxylat als hellbraunes Pulver zu liefern, Smp. >200°C.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 12,22 (br s, 1H, NH), 7,92 (s, 1H, aromatisches CH), 7,65 (d, 1H, J=8,4, aromatisches CH), 7,56 (d, 1H, J=8,5, aromatisches CH), 7,48 (d, 1H, J=4,4, Thienyl-CH), 6,07 (d, 1H, J=4,3, Thienyl-CH), 4,70 (s, 2H, Chinazolinyl-CH₂), 4,16 (q, 2H, J=7,2, Ethyl-CH₂), 3,09 (s, 3H, N-CH₃), 2,33 (s, 3H, Chinazolinyl-2-CH₃), 1,22 (t, 3H, J=7,2, Ethyl-CH₃).

Beispiel 116
5-(((3,4-Dihydro-2-methyl-4-oxo-6-chinazolinyl)-methyl)methylamino)-2-thiophen-carbonsäure
Ein mit einem Kühler, einem Thermometer und einem Magnetrührer ausgerüsteter 25 ml-Dreihalskolben wurde mit 0,20 g Ethyl-5-(((3,4-dihydro-2-methyl-4-oxo-6-chinazolinyl)methyl)methylamino)-2-thiophen-carboxylat, 6 ml EtOH und 6 ml 1N wäßrigem NaOH gefüllt. Die resultierende Lösung wurde unter Stickstoff bei RT für 25 min und dann bei 55°C für 2 h gerührt. Analyse durch DC (SiO₂, 95:5 CH₂Cl₂) zeigte kein verbleibendes Ausgangsmaterial und eine neue Komponente bei R_f = 0,06 an. Die Lösung wurde auf RT abgekühlt und zur Entfernung von EtOH einer Rotationsverdampfung unter worfen. Die verbleibende Lösung wurde mit 10 ml Wasser verdünnt und durch Zugabe von 1N wäßrigem HCl auf pH 3,5 angesäuert. Es bildet sich ein brauner Niederschlag, der durch Zentrifugieren aufgefangen, mit vier Durchläufen von wäßrigem Suspendieren-Zentrifugieren-Dekantieren gewaschen und lyophilisiert wurde, um 0,116 g (63%) 5-(((3,4-Dihydro-2-methyl-4-oxo-6-chinazolinyl)methyl)methylamino)-2-thiophen-carbonsäure als weißes Pulver zu liefern, Smp. 195°C (Zers.).

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 12,40–11,90 (br m, COOH; NH), 7,95 (s, 1H, aromatisches CH), 7,69 (m, 1H, aromatisches CH), 7,58 (d, 1H, J=8,2, aromatisches CH), 7,42 (d, 1H, J=4,2, Thienyl-CH), 6,04 (d, 1H, J=4,2, Thienyl-CH), 4,70 (s, 2H, Chinazolinyl-CH₂), 3,09 (s, 3H, N-CH₃), 2,35 (s, 3H, Chinazolinyl-2-CH₃).

Beispiel 117
tert-Butyl-N-((5-(((3,4-dihydro-2-methyl-4-oxo-6-chinazolinyl)methyl)methylamino)-2-thienyl)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalaninat
Ein mit einem Stickstoffeinlaß und einem Magnetrührer ausgerüsteter trockener 50 ml-Dreihalskolben wurde mit 0,115 g 5-(((3,4-Dihydro-2-methyl-4-oxo-6-chinazolinyl)methyl)methylamino)-2-thiophen-carbonsäure, 0,165 g tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalaninat, 0,06 ml Et₃N und 7 ml wasserfreiem DMF gefüllt. Die gelbe Lösung wurde mit 0,06 ml DECP behandelt und bei RT unter Stickstoff gerührt. Nach 2 h zeigte DC (SiO₂, 95:5, CH₂Cl₂:MeOH) Ausgangsmaterial bei R_f = 0,02, eine neue Hauptkomponente bei R_f = 0,37 und Nebenkomponenten bei R_f = 0,31 und 0,40 an. Die Reaktionsmischung wurde mit weiteren 0,03 ml DECP und 0,03 ml Et₃N behandelt und für eine weitere Stunde bei RT gerührt. DC zeigte wenig zusätzliche Umwandlung an. Die Lösung wurde im Vakuum zur Trockene auf konzentriert und der Rückstand in 60 ml CHCl₃ gelöst. Die Lösung wurde mit 5%igem wäßrigem NaHCO₃ (3 × 50 ml) gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und auf konzentriert, um ein hellgelbes Öl zu ergeben. Das Rohprodukt wurde zweimal einer Flash-Chromatographie unterworfen (SiO₂, 95:5 EtOAc:MeOH; SiO₂, 97:3, CH₂Cl₂:MeOH), um 0,119 g (46%) tert-Butyl-N-((5-(((3,4-dihydro-2-methyl-4-oxo-6-chinazolinyl)methyl)methylamino)-2-thienyl)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-Lphenylalaninat als braunen Schaum zu liefern.

¹H-NMR: (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 12,19 (s, 1H, Chinazolin-NH), 8,18 (d, 1H, J=7,1, Amid-NH), 7,92 (m, 2H, Amid-NH, aromatisches CH), 7,63 (dd, 1H, J=7,9, 1,8, aromatisches CH), 7,57 (d, 1H, J=4,1, Thienyl-CH), 7,54 (d, 1H, J=8,0, aromatisches CH), 7,12–6,94 (m, 4H, aromatisches CH), 5,97 (d, 1H, J=4,1, Thienyl-CH), 4,63 (s, 2H, Chinazolinyl-CH₂), 4,40–4,27 (m, 2H, Methine), 3,02 (s, 3H, N-CH₃), 2,87 (m, 3H, ArCH₂, Cyclopentylmethin), 2,31 (s, 3H, Chinazolinyl-2-CH₃), 2,20 (t, 2H, J=7,7, Glu-4-CH₂), 1,91 (m, 3H, Glu-3-CH₂, Cyclopentyl-CH₂), 1,83–1,40 (m, 7H, Cyclopentyl-CH₂), 1,35 (s, 9H, t-Bu), 1,27 (s, 9H, t-Bu).

Beispiel 118
N-((5-(((3,4-Dihydro-2-methyl-4-oxo-6-chinazolinyl)-methyl)methylamino)-2-thienyl)carbonylj-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalanin
Gemäß Beispiel 50 wurden 0,117 g tert-Butyl-N-((5-(((3,4-dihydro-2-methyl-4-oxo-6-chinazolinyl)methyl)methylamino)-2-thienyl)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalaninat mit gasförmigem HCl in 25 ml CH₃NO₂ für 45 min behandelt. Entfernung des CH₃NO₂ im Vakuum ergab einen braunen Rückstand, der durch halbpräparative Umkehrphasen-HPLC (C18, 70:30:0,1 → 60:40:0,1 H₂O:MeCN:TFA über 25 min) gereinigt wurde. Fraktionen, die die Hauptkomponente (k' = 1,61 bei analytischer HPLC, C18, 60:40:0,1 H₂O:MeCN:TFA) enthielten, wurden vereinigt, auf 25 ml aufkonzentriert und lyophilisiert, um 0,052 g (42%) N-((5-(((3,4-Dihydro-2-methyl-4-oxo-6-chinazolinyl)methyl)methylamino)-2-thienyl)carbonyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalanin als gelbes Pulver zu liefern, Smp. 125°C (Zers.).

HPLC: ein Peak an C18, k' = 1,62, 60:40:0,1 H₂O:MeCN:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min.
¹H-NMR: (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,09 (d, 1H, J=7,5, Amid-NH), 7,93 (m, 2H, Amid-NH, aromatisches CH), 7,69 (d, 1H, J=8,0, aromatisches CH), 7,56 (m, 2H, aromatisches CH, Thienyl-CH), 7,10–6,92 (m, 4H, aromatisches CH), 5,97 (d, 1H, J=4,3, Thienyl-CH), 4,66 (s, 2H, Chinazolinyl-CH₂), 4,33 (m, 2H, Methine), 3,06 (s, 3H, N-CH3), 2,99 (m, 1H, ArCH₂), 2,85 (m, 1H, ArCH₂), 2,38 (s, 3H, Chinazolinyl-2-CH₃), 2,22 (t, 2H, J=7,5, Glu-4-CH₂), 2,02–1,37 (m, 10H, Glu-3-CH₂, Cyclopentyl-CH₂).
¹⁹F-NMR: (376 MHz, DMSO-d₆) δ: 0,57 (relativ zu externem TFA-Standard).

Elementaranalyse

Berechnet für C₃₅H₃₉N₅O₇S·1,2 TFA·1,3 H₂O (MG 834,03): C, 53,86; H, 5,17; N 8,40; S, 3,84; Gefunden: C, 53,85; H, 5,11; N 8,36; S, 3,92. Massenspektrum: (Ionen-Spray) 691 (M+NH₄ ⁺). UV-Spektrum: (Puffer pH 7) λ_max (ε) 225,2 (36600), 265,6 (10300), 353,1 (22200). λ_min (ε) 214,3 (35200), 252,1 (9230), 288,4 (4120).

Beispiel 119
tert-Butyl-5-O-tert-butyl-N-(4-((3-(2,4-diamino-1,6-dihydro-6-oxo-5-pyrimidinyl)propyl)trifluoracetamido)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalaninat
Ein mit einem Magnetrührer und einem Stickstoffeinlaß ausgerüsteter 25 ml-Dreihalskolben wurde mit 0,258 g 4-N-(3-(2,4-Diamino-1,6-dihydro-6-oxo-5-pyrimidinyl)propyl)trifluoracetamido)benzoesäure (V.L. Styles et al., J. Heterocyclic Chem., 1990, 27, 1809), 0,250 g tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalaninat, 0,077 g 1-Hydroxybenzotriazolhydrat (Aldrich), 5 ml wasserfreiem DMF und 0,07 ml Et₃N gefüllt. Die Lösung wurde mit 0,104 g DCC (Fluka) behandelt und bei RT unter Stickstoff für 24 h gerührt. Die Mischung wurde filtriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockene auf konzentriert. Der Rückstand wurde in 70 ml CH₂Cl₂ gelöst, mit 5%igem wäßrigem NaHCO₃ (3 × 50 ml) gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und unter Erhalt eines braunen Öls auf konzentriert. Dieses Material wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel (95:5 → 90:10 CH₂Cl₂:MeOH) gereinigt, um 0,304 g (70%) tert-Butyl-5-O-tert-butyl-N-(4-((3-(2,4-diamino-1,6-dihydro-6-oxo-5-pyrimidinyl)propyl)trifluoracetamido)-benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalaninat als braunes Glas zu liefern, Smp. 124–130°C.
Beispiel 120
tert-Butyl-5-O-tert-butyl-N-(4-((3-(2,4-diamino-1,6-dihydro-6-oxo-5-pyrimidinyl)propyl)amino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalaninat
In einen mit einem Stickstoffeinlaß und einem Magnetrührer ausgerüsteten 100 ml-Rundkolben wurden 0,268 g tert-Butyl-5-O-tert-butyl-N-(4-((3-(2,4-diamino-1,6-dihydro-6-oxo-5-pyrimidinyl)propyl)trifluoracetamido)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalaninat und 7 ml McOH gegeben. Die Lösung wurde mit 0,18 ml 40% (G/G) Dimethylamin/Wasser (Aldrich) gefolgt von 0,45 ml Wasser behandelt und bei RT unter Stickstoff für 24 h gerührt. Die Lösung wurde im Vakuum zur Trockene aufkonzentriert und der Rückstand einer Flash-Chromatographie an 60 g Kieselgel (92:8 CH₂Cl₂:MeOH) unterworfen, um 0,185 g (78%) tert-Butyl-5-O-tert-butyl-N-(4-((3-(2,4-diamino-1,6-dihydro-6-oxo-5-pyrimidinyl)propyl)amino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalaninat als dicken transparenten halbfesten Stoff zu liefern.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 9,80 (br s, 1H, Pyrimidinyl-NH), 8,20 (d, 1H, J=7,2, Amid-NH), 7,90 (d, 1H, J=8,0, Amid-NH), 7,67 (d, 2H, J=8,6, aromatisches CH), 7,20–6,98 (m, 4H, aromatisches CH), 6,55 (d, 2H, J=8,6, aromatisches CH), 6,25 (m, 1H, NH), 5,94 (br s, 2H, NH₂), 5,77 (br s, 2H, NH₂), 4,54–4,29 (m, 2H, Methine), 3,12–2,80 (m, 5H, Cyclopentylmethin, ArCH₂, Pyrimidinyl-CH₂CH₂CH₂N), 2,27 (m, 4H, Glu-4-CH₂, Pyrimidinyl-CH₂CH₂CH₂N), 2,10–1,82 (4H, Glu-3-CH₂, Cyclopentyl-CH₂), 1,80–1,45 (m, 8H, Cyclopentyl-CH₂, Pyrimidinyl-CH₂CH₂CH₂N), 1,39 (s, 9H, t-Bu), 1,32 (s, 9H, t-Bu).

Beispiel 121
N-(4-((3-(2,4-Diamino-1,6-dihydro-6-oxo-5-pyrimidinyl)propyl)amino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalanin
Ein mit einem Magnetrührer ausgerüsteter 100 ml-Rundkolben wurde mit 0,180 g tert-Butyl-5-O-tert-butyl-N-(4-((3-(2,4-diamino-1,6-dihydro-6-oxo-5-pyrimidinyl)propyl)amino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalaninat und 25 ml CH₃NO₂ gefüllt. Die Mischung wurde durch Hindurchblasen von HCl-Gas für 5 min angesäuert, jedoch löste sich das feste Ausgangsmaterial nicht auf. Analyse der Reaktionsmischung durch DC (SiO₂, 92:8 CH₂Cl₂:MeOH) zeigte eine minimale Umwandlung des Ausgangsmaterials an. Die Mischung wurde im Vakuum zur Trockene auf konzentriert. Es resultierte ein gelber Rückstand, der in 20 ml CH₂Cl₂ suspendiert und mit 1 ml Anisol gefolgt von 15 ml TFA behandelt wurde. Der Feststoff loste sich schnell auf, wobei eine gelbe Lösung erhalten wurde, die bei RT unter Stickstoff gerührt wurde. Nach 1 h zeigte DC kein verbleibendes Ausgangsmaterial und einen neuen Fleck bei R_f = 0,0 an. Die Lösung wurde zur Trockene aufkonzentriert und der Rückstand durch halbpräparative Umkehrphasen-HPLC (C18, 70:30:0,1 H₂O:MeCN:TFA) gereinigt. Fraktionen, die reines Material enthielten, wurden vereinigt, zu 30 ml auf konzentriert und lyophilisiert, um 0,098 g (47%) N-(4-((3-(2,4-Diamino-1,6-dihydro-6-oxo-5-pyrimidinyl)-propyl)amino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalanin als flockigen weißen Feststoff zu liefern, Smp. 125°C (Zers.).

HPLC: ein Peak an C18, k' = 1,64, 70:30:0,1 H₂O:MeCN:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min.
¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 12,91–11,10 (br s, COOH, Pyrimidinyl-NH), 8,07 (d, 1H, J=7,6, Amid-NH), 7,88 (d, 1H, J=7,9, Amid-NH), 7,70 (br s, 1H, NH₂), 7,62 (m, 3H, NH₂, aromatisches CH), 7,13–6,70 (m, 6H, NH₂, aromatisches CH), 6,53 (d, 2H, J=8,6, aromatisches CH), 4,40 (m, 2H, Methine), 3,01 (m, 3H, Cyclopentylmethin, Pyrimidinyl-CH₂CH₂CH₂N), 2,86 (m, 2H, ArCH₂), 2,25 (m, 4H, Glu-4-CH₂, Pyrimidinyl-CH₂CH₂CH₂N), 2,01–1,78 (m, 4H, Glu-3-CH₂, Cyclopentyl-CH₂), 1,76–1,37 (m, 8H, Cyclopentyl-CH₂, Pyrimidinyl-CH₂CH₂CH₂N).
¹⁹F-NMR: (282 MHz, DMSO-d₆) δ: 3,92 (relativ zu externem TFA-Standard).

Elementaranalyse

Berechnet für C₃₃H₄₁N₇O₇·1,8 TFA·1,6 H₂O (MG 881,80): C, 49,85; H, 5,26; N 11,12; Gefunden: C, 49,81; H, 5,24; N 11,11. Massenspektrum: (Ionen-Spray) 648 (M+NH₄)⁺. UV-Spektrum: (Puffer pH 7) λ_max (ε) 280,1 (29700). λ_min (ε) 247,4 (7590), sh(e) 302,9 (20400).

Beispiel 122
Di-tert-butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-L-aspartat
Gemäß Beispiel 9 wurden 1,00 g L-Asparaginsäure-di-t-butylesterhydrochlorid (Sigma) mit 1,20 g N-Cbz-L-Glutaminsäure-γ-t-butylester (Sigma) unter Verwendung von 0,72 g EDC (Aldrich) und 0,39 ml N-Methylmorpholin gekuppelt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an 80 g Kieselgel (72:25 Hexan:EtOAc) gereinigt, um 1,10 g (55%) tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-4-O-tert-butyl-L-aspartat als weißen Feststoff zu liefern, Smp. 119–120°C.
Beispiel 123
Di-tert-butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-L-aspartat
Gemäß Beispiel 48 wurden 0,389 g tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-4-O-tert-butyl-L-aspartat unter Verwendung von 0,07 g 10% Pd(C) in 40 ml McOH hydrogenolysiert. Dies lieferte 0,29 g (98%) Di-tert-butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-L-aspartat als dickes transparentes Öl. Eine Probe des entsprechenden HCl-Salzes zur 1H-NMR-Analyse wurde hergestellt durch Behandeln von 10 mg des Produkts mit überschüssigem 1N etherischem HCl und Aufkonzentrieren zur Trockene.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,91 (d, 1H, J=7,8, NH), 8,31 (br s, 3H, NH₃ ⁺), 4,52 (m, 1H, Methin), 3,83 (m, 1H, Methin), 2,63 (d, 2H, J=6,1, Asp-CH₂), 2,36 (m, 2H, Glu-4-CH₂), 1,94 (m, 2H, Glu-3-CH₂), 1,38 (s, 27H, t-Bu).

Beispiel 124
Di-tert-butyl-5-O-tert-butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-L-aspartat
Gemäß Beispiel 49 wurden 0,30 g 4-(N-(2,4-Diamino-6-pteridinylmethyl)-N-methylamino)benzoesäure-hemihydrochloriddihydrat (Aldrich) mit 0,34 g Di-tert-butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-L-aspartat unter Verwendung von 0,36 ml DECP (Aldrich) und 0,39 ml Et₃N in 25 ml DMF gekuppelt. Das Rohprodukt wurde zweimal einer Flash-Chromatographie unterworfen (SiO₂, 7:7:1 CH₂Cl₂:Aceton:MeOH; SiO₂, 96:4 → 95:5 CH₂Cl₂:MeQH), um 0,213 g (37%) Di-tert-butyl-5-O-tert=butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-L-aspartat als gelbes Pulver zu liefern, Smp. 130–135°C.
Beispiel 125
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)-benzoyl)-L-glutam-1-yl-L-asparaginsäure (Verfahren B)
Für Verfahren A zur Herstellung dieser Verbindung siehe Beispiel 33. Gemäß Beispiel 50 wurden 0,307 g Di-tert-butyl-5-O-tert-butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-L-aspartat mit gasförmigem HCl in 40 ml CH₃NO₂ für 1,5 h behandelt. Die Reaktionsmischung wurde auf 5 ml aufkonzentriert und mit 50 ml Ether vermischt. Der resultierende Feststoff wurde durch Filtration aufgefangen und im Vakuum getrocknet. Das Produkt wurde in 20 ml Wasser gelöst, filtriert und lyophilisiert, um 0,246 g (89%) N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-L-asparaginsäure als gelb-orangefarbenes Pulver zu liefern, Smp. 160°C (Zers.).

HPLC: ein Peak an C18, k' = 0,70, 85:15:0,1 H₂O:MeCN:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min.
¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 13,12 (br s, COOH), 9,31 (s, 1H, NH₂), 9,08 (s, 1H, NH₂), 8,72 (s, 1H, Pteridinyl-7-CH), 8,68 (br s, 1H, NH₂), 8,22 (d, 1H, J=8,0, Amid-NH), 8,09 (d, 1H, J=7,9, Amid-NH), 7,79 (br s, 1H, NH₂), 7,75 (d, 2H, J=8,9, aromatisches CH), 6,82 (d, 2H, J=8,9, aromatisches CH), 4,87 (s, 2H, Pteridinyl-CH₂), 4,59–4,40 (m, 2H, Methine), 3,24 (s, 3H, N-CH₃), 2,75–2,52 (m, 2H, Asp-CH₂), 2,27 (t, 2H, J=7,8, Glu-4-CH₂), 2,10–1,78 (m, 2H, Glu-3-CH₂).

Elementaranalyse

Berechnet für C₂₄H₂₇N₉O₈·2 HCl·1,3 H₂O (MG 665,87): C, 43,29; H, 4,78; N 18,93; Cl, 10,65; Gefunden: C, 43,42; H, 4,90; N 18,83; Cl, 10,46. Massenspektrum: (FAB) 570 (M+H)⁺. UV-Spektrum: (Puffer pH 7) λ_max (ε) 258,7 (21900), 306,4 (23800), 372,2 (7250). λ_min (ε) 240,1 (13400), 272,4 (15200), 345,0 (5740).

Beispiel 126
Di-tert-butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-L-glutamat
Gemäß Beispiel 9 wurden 0,88 g L-Glutaminsäure-di-t-butylester-hydrochlorid (Sigma) mit 1,00 g N-Cbz-L-glutaminsäure-γ-t-butylester (Sigma) unter Verwendung von 0,60 g EDC (Aldrich) und 0,33 ml N-Methyl-morpholin gekuppelt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel (75:25 Hexan:EtOAc) gereinigt, um 1,49 g (87%) tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-5-O-tert-butyl-L-glutamat als dickes transparentes Öl zu liefern.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,21 (d, 1H, J=7,6, NH), 7,42 (d, 1H, J=8,2, NH), 7,33 (m, 5H, aromatisches CH), 5,01 (m, 2H, PhCH₂O), 4,17-3,96 (m, 2H, Methine), 2,24 (m, 4H, Glu-4-CH₂), 1,96–1,64 (m, 4H, Glu-3-CH₂), 1,37 (s, 27H, t-Bu).

Beispiel 127
Di-tert-butyl-5-O-tert-butyl-glutam-1-yl-L-glutamat
Gemäß Beispiel 48 wurden 0,60 g tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-0-tert-butyl-L-glutam-1-yl-5-O-tert-butyl-L-glutamat unter Verwendung von 0,10 g 10% Pd(C) in 45 ml McOH hydrogenolysiert. Dies lieferte 0,45 g (98 %) Di-tert-butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-L-glutamat als dickes transparentes Öl. Eine Probe des entsprechenden HCl-Salzes zu ¹H-NMR-Analyse wurde hergestellt durch Behandeln von 10 mg des Produkts mit überschüssigem 1N etherischem HCl und Auf konzentrieren zur Trockene.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,86 (d, 1H, J=7,3, NH), 8,31 (br s, 3H, NH₃ ⁺), 4,21 (m, 1H, Methin), 3,87 (m, 1H, Methin), 2,35 (m, 4H, Glu-4-CH₂), 2,07–1,66 (m, 4H, Glu-3-CH₂), 1,39 (s, 27H, t-Bu).

Beispiel 128
Di-tert-butyl-5-O-tert-butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-L-glutamat
Gemäß Beispiel 49 wurden 0,30 g 4-(N-(2,4-Diamino-6-pteridinylmethyl)-N-methylamino)benzoesäure-hemihydrochloriddihydrat (Aldrich) mit 0,386 g Di-tert-butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-L-glutamat unter Verwendung von 0,36 ml DECP (Aldrich) und 0,39 ml Et₃N in 25 ml DMF gekuppelt. Das Rohprodukt wurde einer Flash-Chromatographie an 150 g Kieselgel (7:7:1 CH₂Cl₂:Aceton:MeOH) unterworfen, um 0,432 g (73%) Di-tert-butyl-5-O-tert-butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)-methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-L-glutamat als gelbes Pulver zu liefern, Smp. 130–145°C.
Beispiel 129
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)-benzoyl)-L-glutam-1-yl-L-glutaminsäure (Verfahren B)
Für Verfahren A zur Herstellung dieser Verbindung siehe Beispiel 39. Gemäß Beispiel 50 wurden 0,382 g Di-tert-butyl-5-O-tert-butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-L-glutamat mit gasförmigem HCl in 50 ml CH₃NO₂ für 1 h behandelt. Die Reaktionsmischung wurde auf 10 ml aufkonzentriert und mit 50 ml Ether vermischt. Der resultierende Feststoff wurde durch Filtration aufgefangen und im Vakuum getrocknet. Das Produkt wurde in 25 ml Wasser gelöst, filtriert und lyophilisiert, um 0,265 g (76%) N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-L-glutaminsäure als gelb-orangefarbenes Pulver zu liefern, Smp. 155°C (Zers.).

HPLC: ein Peak an C18, k' = 0,88, 85:15:0,1 H₂O:MeCN:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min.
¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 13,18 (br s, COOH), 9,29 (s, 1H, NH₂), 9,07 (s, 1H, NH₂), 8,72 (s, 1H, Pteridinyl-7-CH), 8,69 (br s, 1H, NH₂), 8,19 (d, 1H, J=7,7, Amid-NH), 8,09 (d, 1H, J=7,9, Amid-NH), 7,87 (br s, 1H, NH₂), 7,74 (d, 2H, J=8,9, aromatisches CH), 6,81 (d, 2H, J=8,9, aromatisches CH), 4,87 (s, 2H, Pteridinyl-CH₂), 4,42 (m, 1H, Methin), 4,19 (m, 1H, Methin), 3,24 (s, 3H, N-CH₃), 2,28 (m, 4H, Glu-4-CH₂), 2,07–1,71 (m, 4H, Glu-3-CH₂).

Elementaranalyse

Berechnet für C₂₅H₂₉N₉O₈·1,9 HCl·2 H₂O (MG 688,87): C, 43,59; H, 5,11; N 18,30; Cl, 9,78; Gefunden: C, 43,72; H, 5,07; N 18,16; Cl, 9,97. Massenspektrum: (FAB) 584 (M+H)⁺. UV-Spektrum: (Puffer pH 7) λ_max (ε) 258,8 (23700), 306,2 (25600), 371,9 (7830). λ_min (ε) 240,4 (14300), 272,9 (16600), 344,6 (6150).

Beispiel 130
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)-benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-tert-butyl-L-phenylalanin (Verfahren B)
Für Verfahren A zur Herstellung dieser Verbindung siehe Beispiel 97. Gemäß Beispiel 50 wurden 3,51 g tert-Butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-tert-butyl-L-phenylalaninat mit gasförmigem HCl in 150 ml CH₃NO₂ für 1 h behandelt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum zur einer Aufschlämmung auf konzentriert und mit 100 ml Ether vermischt. Der Feststoff wurde durch Vakuumfiltration aufgefangen und in 150 ml 6:4 McCN:H₂O gelöst. Die Lösung wurde einer Rotationsverdampfung unterworfen, um McCN zu entfernen, und die resultierende Suspension wurde eingefroren und lyophilisiert, um 3,167 g (93%) N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-tert-butyl-L-phenylalanin als gelb-orangefarbenes Pulver zu liefern, Smp. 165°C (Zers.).

HPLC: ein Peak an C18, k' = 2,30, 70:30:0,1 H₂O:MeCN:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min.
¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 13,35–12,95 (br s, COOH), 9,30 (s, 1H, NH₂), 9,07 (s, 1H, NH₂), 8,71 (s, 1H, Pteridinyl-7-CH), 8,68 (br s, 1H, NH₂), 8,14 (d, 1H, J=7,6, Amid-NH), 8,02 (d, 1H, J=7,8, Amid-NH), 7,89 (br s, 1H, NH₂), 7,71 (d, 2H, J=8,9, aromatisches CH), 7,21 (s, 1H, aromatisches CH), 7,18–7,05 (m, 2H, aromatisches CH), 6,98 (d, 1H, J=7,4, aromatisches CH), 6,79 (d, 2H, J=8,9, aromatisches CH), 4,85 (s, 2H, Pteridinyl-CH₂), 4,39 (m, 2H, Methine), 3,23 (s, 3H, N-CH₃), 3,03 (m, 1H, ArCH₂), 2,90 (m, 1H, ArCH₂), 2,20 (t, 2H, J=7,6, Glu-4-CH₂), 2,01–1,76 (m, 2H, Glu-3-CH₂), 1,19 (s, 9H, t-Bu).

Elementaranalyse

Berechnet für C₃₃H₃₉N₉O₆·1, HCl·1,8 H₂O (MG 744,85): C, 53,21; H, 5,97; N 16,92; Cl, 7,14; Gefunden: C, 53,20; H, 5,97; N 16,96; Cl, 7,20. Massenspektrum: (Ionen-Spray) 658 (M+H)⁺. UV-Spektrum: (Puffer pH 7) λ_max (ε) 259,5 (24400), 308,0 (24400), 371,5 (7410). λ_min (ε) 214,4 (14600), 274,2 (16200), 345,1 (5680).

Beispiel 131
tert-Butyl-5-O-tert-butyl-N-(4-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalaninat
Ein mit einem Magnetrührer und einem Stickstoffeinlaß ausgerüsteter trockener 50 ml-Dreihalskolben wurde mit 0,150 g 4-(((1,2-Dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoesäure, 0,198 g tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalaninat und 7 ml wasserfreiem DMF gefüllt. Die Mischung wurde auf 0°C gekühlt und mit 0,058 ml Et₃N gefolgt von 0,063 ml DECP behandelt. Der feste Ausgangsstoff löste sich schnell unter Erhalt einer klaren Lösung auf. Die Lösung wurde auf RT erwärmen gelassen und bei RT unter Stickstoff gerührt. Nach 3 h zeigte DC (SiO₂, 95:5 CH₂Cl₂:MeOH) eine neue Hauptkomponente bei R_f = 0,41 und Nebenkomponenten bei R_f = 0,38 und 0,06 an. Die Lösung wurde im Vakuum zur Trockene auf konzentriert und der Rückstand in 70 ml CHCl₃ gelöst. Die CHCl₃-Lösung wurde mit 5%igem wäßrigem NaHCO₃ (3 × 60 ml) gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und unter Erhalt eines gelben Glases auf konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel (95:5 → 93:7 CH₂Cl₂:MeOH) gereinigt, um 0,258 g (80%) tert-Butyl-5-O-tert-butyl-N-(4-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalaninat als transparentes Glas zu liefern.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 12,54 (s, 1H, Benzochinazolin-NH), 9,86 (s, 1H, aromatisches CH), 8,39 (d, 1H, J=7,6, Amid-NH), 8,23 (d, 1H, J=9,0, aromatisches CH), 8,02 (d, 1H, J=8,4, aromatisches CH), 7,68–7,41 (m, 4H, aromatisches CH, Amid-NH), 7,35 (m, 1H, 4-Aminobenzoyl-NH), 7,21–6,97 (m, 4H, aromatisches CH), 6,56 (d, 1H, J=8,8, aromatisches CH), 6,41 (d, 1H, J=15,0, aromatisches CH); 4,67–4,30 (m, 4H, Benzochinazolin-9-CH₂, Methine), 3,06–2,77 (m, 3H, ArCH₂, Cyclopentylmethin), 2,43 (s, 3H, CH₃), 2,19 (m, 2H, Glu-3-CH₂), 2,00–1,38 (m, 10H, Glu-3-CH₂, Cyclopentyl-CH₂), 1,35 (s, 9H, t-Bu), 1,32 (s, 9H, t-Bu).

Beispiel 132
N-(4-(((1,2-Dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalanin
Gemäß Beispiel 50 wurden 0,25 g tert-Butyl-5-O-tert-butyl-N-(4-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalaninat mit gasförmigem HCl in 40 ml CH₃NO₂ für 1 h behandelt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum unter Erhalt eines gelben Rückstands aufkonzentriert. Analyse dieses Materials durch HPLC (C18, 65:35:0,1 H₂O:MeCN:TFA) zeigte eine Hauptkomponente bei k' = 2,82 und Nebenkomponenten bei k' = 3,33, 1,53 und 0,83 an. Das Rohprodukt wurde einer halbpräparativen Umkehrphasen-HPLC unterworfen (C18, 65:35:0,1 H₂O:MeCN:TFA). Fraktionen, die reines Produkt enthielten (gemäß Bestimmung durch analytische HPLC), wurden vereinigt und zur Trockene aufkonzentriert. Der Rückstand wurde mit 20 ml Wasser vermischt und mit ausreichend 1N wäßrigem NaOH behandelt, um eine vollständige Lösung zu ergeben. Die Lösung wurde filtriert und durch Zugabe von 1N wäßrigem HCl auf pH 3,0 angesäuert. Ein weißer Niederschlag resultierte, der durch Zentrifugieren abgetrennt wurde, mit 4 Durchläufen von wäßrigem Suspendieren-Zentrifugieren-Dekantieren gewaschen und lyophilisiert wurde, um 0,141 g (62%) N-(4-(((1,2-Dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalanin als flockiges weißes Pulver zu liefern, Smp. >200°C.

HPLC: ein Peak an C18, k' = 2,77, 65:55:0,1 H₂O:MeCN:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min.
¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 12,90–11,80 (br m, COOH, Benzochinazolin-NH), 9,82 (s, 1H, aromatisches CH), 8,27 (d, 1H, J=7,9, Amid-NH), 8,19 (d, 1H, J=8,7, aromatisches CH), 7,99 (d, 1H, J=8,4, aromatisches CH), 7,58 (m, 2H, aromatisches CH), 7,45 (m, 2H, aromatisches CH, Amid-NH), 7,31 (m, 1H, 4-Aminobenzoyl-NH), 7,05 (m, 2H, aromatisches CH), 6,97 (d, 2H, J=7,9, aromatisches CH), 6,51 (d, 1H, J=8,7, aromatisches CH), 6,37 (d, 1H, J=15,2, aromatisches CH), 4,55 (d, 2H, J=5,2, Benzochinazolin-9-CH₂), 4,43 (m, 2H, Methine), 3,02 (m, 1H, ArCH₂), 2,82 (m, 2H, ArCH₂, Cyclopentylmethin), 2,41 (s, 3H, CH₃), 2,16 (t, 2H, J=7,7, Glu-4-CH₂), 1,98–1,71 (m, 4H, Glu-3-CH₂, Cyclopentyl-CH₂), 1,69–1,31, (m, 6H, Cyclopentyl-CH₂).

Elementaranalyse
Berechnet für C₄₀H₄₀N₅O₇F·0,5 H₂O (MG 730,79):
C, 65,74; H, 5,65; N 9,58;
Gefunden: C, 65,76; H, 5,68; N 9,57.
Massenspektrum: (FAB) 722 (M+H)+.
UV-Spektrum: (Puffer pH 7) λ_max (ε) 265,9 (47900), 299,6 (27300), 348,4 (5710).
λ_min (ε) 240,6 (19900), 284,5 (24900), 340,0 (3450).
sh (e) 332,3 (6780).
Beispiel 133
tert-Butyl-N-(4-(((2-amino-3,4-dihydro-4-oxo-6-chinazolinyl)methyl)(2-propinyl)amino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalaninat
Ein mit einem Magnetrührer und einem Stickstoffeinlaß ausgerüsteter 50 ml-Dreihalskolben wurde mit 0,097 g 4-(((2-Amino-3,4-dihydro-4-oxo-6-chinazolinyl)methyl)(2-propinyl)amino)benzoesäure (T.R. Jones et al., J. Med. Chem. 1986, 29, 1114; M.G. Nair et al., J. Med. Chem. 1986, 29, 1754; M. Ghazala et al., J. Med. Chem. 1986, 29, 1263; S.P. Acharya et al., J. Heterocyclic Chem , 1975, 12, 1283), 0,142 g tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalaninat, 0,044 g 3-Hydroxy-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-on (Aldrich) und 7 ml wasserfreiem DMF gefüllt. Die Mischung wurde mit 0,057 g EDC behandelt und bei RT unter Stickstoff gerührt. Der feste Ausgangsstoff löste sich langsam unter Erhalt einer klaren Lösung auf. Nach 3 Tagen wurde die Lösung im Vakuum zur Trockene auf konzentriert und der Rückstand einer Flash-Chromatographie an Kieselgel (98:2 → 95:5 CH₂Cl₂:MeOH) unterworfen, um 0,142 g (65%) tert-Butyl-N-(4-(((2-amino-3,4-dihydro-4-oxo-6-chinazolinyl)methyl)(2-propinyl)amino)-benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalaninat als weißen Feststoff zu liefern, Smp. 115°C (Zers.).
Beispiel 134
N-(4-(((2-Amino-3,4-dihydro-4-oxo-6-chinazolinyl)-methyl)(2-propinyl)amino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalanin
Gemäß Beispiel 50 wurden 0,114 g tert-Butyl-N-(4-(((2-amino-3,4-dihydro-4-oxo-6-chinazolinyl)methyl)(2-propinyl)amino)benzoyl)-5-O-tertbutyl-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalaninat mit gasförmigem HCl in CH₃NO₂ für 2 h behandelt. Die Reaktionsmischung wurde zur Trockene auf konzentriert und der Rückstand in 50 ml Ether suspendiert. Der resultierende Feststoff wurde durch Filtration aufgefangen und im Vakuum getrocknet. Das Rohprodukt wurde durch halbpräparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt (C18, 68:32:0,1 → 60:40:0,1 H₂O:MeCN:TFA). Fraktionen, die reines Produkt enthielten (gemäß Bestimmung durch analytische HPLC), wurden vereinigt und zur Trockene aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in Wasser suspendiert und lyophilisiert, um 0,053 g (45%) N-(4-(((2-Amino-3,4-dihydro-4-oxo-6-chinazolinyl)methyl)(2-propinyl)amino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalanin als flockigen weißen Feststoff zu liefern, Smp. 158°C (Zers.).

HPLC: zwei Peaks an C18, k' = 1,27 (98,8%), k' = 0,50 (1,2%), 62:38:0,1 H₂O:MeCN:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min.
¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 12,90–11,80 (br m, COOH), 8,07 (d, 1H, J=7,9, Amid-NH), 8,03 (d, 1H, J=7,9, Amid-NH), 7,87 (s, 1H, aromatisches CH), 7,71 (d, 2H, J=8,7, aromatisches CH), 7,62 (d, 1H, J=8,6 aromatisches CH), 7,57–7,24 (br s, 2H, NH₂), 7,31 (d, 1H, J=8,6, aromatisches CH), 7,13–6,95 (m, 4H, aromatisches CH), 6,82 (d, 2H, J=8,8, aromatisches CH), 4,71 (s, 2H, Chinazolinyl-CH₂), 4,41 (m, 2H, Methine), 4,30 (s, 2H, Propargyl-CH₂), 3,19 (s, 1H, Propargyl-CH), 3,10–2,77 (m, 3H, ArCH₂, Cyclopentylmethin), 2,23 (t, 2H, J=7,6, Glu-4-CH₂), 2,02–1,76 (m, 4H, Glu-3-CH₂, Cyclopentyl-CH₂), 1,75–1,38 (m, 6H, Cyclopentyl-CH₂).
¹⁹F-NMR: (282 MHz, DMSO-d₆) δ: 1,53 (relativ zu externem TFA-Standard).

Elementaranalyse
Berechnet für C₃₈H₄₀N₆O7·TFA·2,2 H₂O (MG 846,43):
C, 56,76; H, 5,41; N 9,93;
Gefunden: C, 56,79; H, 5,42; N 9,95.
Massenspektrum: (FAB) 693 (M+H)⁺.
UV-Spektrum: (Puffer pH 7) λ_max (ε) 227,2 (48400), 306,4 (24500). λ_min (ε) 213,5 (40200), 252,2 (11500).
Beispiel 135
Ethyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-L-phenylalaninat
Ein mit einem Magnetrührer und einem Stickstoffeinlaß ausgerüsteter 500 ml-Rundkolben wurde mit 10,0 g N-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminsäure-γ-ethylester, 7,43 g L-Phenylalaninethylesterhydrochlorid (Aldrich), 100 ml CH₂Cl₂ und 4,51 ml Et₃N gefüllt. Die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt und mit einer Lösung aus 6,67 g DCC (Fluka) in 25 ml CH₂Cl₂ behandelt. Die Lösung wurde bei 0°C für 1 h gerührt und dann auf RT erwärmen gelassen. Nach weiteren 3 h wurde die Mischung zur Entfernung von Dicyclohexylharnstoff filtriert. Das Filtrat wurde mit 10%iger wäßriger Zitronensäure (3 × 50 ml), gesättigtem wäßrigem NaHCO₃ (3 × 50 ml), gefolgt von einer 60 ml-Portion Wasser gewaschen. Die Lösung wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet, auf 30 ml auf konzentriert und unter Zugabe von 50 ml Ether gefolgt von 150 ml Pentan verrieben. Die resultierende Ausfällung wurde durch Filtration aufgefangen und im Vakuum getrocknet, um 12,9 g (82%) Ethyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-L-phenylalaninat als weißen kristallinen Feststoff zu liefern, Smp. 85-87°C.
Beispiel 136
Ethyl-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 10 wurden 13,08 g Ethyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-L-phenylalaninat in 300 ml EtOH unter Verwendung von 2,43 g 10% Pd(C) und 2 ml Acetylchlorid hydrogenolysiert, um 9,84 g (94%) Ethyl-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-L-phenylalaninat·HCl als weißen Schaum zu liefern.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 9,08 (d, 1H, J=7,0, NH), 7,90–7,40 (br s, 3H, NH₃ ⁺), 7,29 (m, 5H, aromatisches CH), 4,50 (m, 1H, Methin), 4,07 (m, 4H, Ethyl-CH₂), 3,80 (m, 1H, Methin), 3,04 (m, 2H, ArCH₂), 2,46 (m, 2H, Glu-4-CH₂), 1,99 (m, 2H, Glu-3-CH₂), 1,20 (t, 3H, J=7,1, Ethyl-CH₃), 1,13 (t, 3H, J=7,1, Ethyl-CH₃).

Beispiel 137
Ethyl-N-((S)-4-(ethoxycarbonyl)-2-(4-nitrophthalimido)-butanoyl)-L-phenylalaninat
Ein mit einem Magnetrührer, einem Kühler, einem Stickstoffeinlaß und einer Dean-Stark-Falle ausgerüsteter 1 l-Rundkolben wurde mit 7,28 g Ethyl-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-L-phenylalaninat·HCl, 3,68 g 4-Nitrophthalsäure-anhydrid (American Tokyo Kasei, Portland, OR, 97203), 300 ml Toluol und 2,43 g Düsopropylethylamin (Aldrich) gefüllt. Die Reaktionsmischung wurde für 2 h zum Rückfluß erwärmt, auf RT abkühlen gelassen und bei RT über Nacht unter Stickstoff gerührt. Das Toluol wurde durch Rotationsverdampfung entfernt und der Rückstand in 400 ml CH₂Cl₂ aufgelöst. Die Lösung wurde mit Wasser (2 × 200 ml) und 5%igem wäßrigem NaHCO₃ (2 × 250 ml) gewaschen und über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet. Das Trockungsmittel wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat auf 100 ml auf konzentriert. Das Konzentrat wurde mit überschüssigem Ether zur Auslösung einer Ausfällung vermischt. Die Ausfällung wurde durch Filtration aufgefangen und im Vakuum getrocknet, um 6,72 g (67%) Ethyl-N-((S)-4-(ethoxycarbonyl)-2-(4-nitrophthalimido)butanoyl)-L-phenylalaninat als weißen Feststoff zu liefern.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,65 (m, 2H, aromatisches CH, NH), 8,49 (s, 1H, aromatisches CH), 8,13 (d, 1H, J=8,6, aromatisches CH), 7,27–7,06 (m, 5H, aromatisches CH), 4,70 (m, 1H, Methin), 4,39 (m, 1H, Methin), 4,04 (q, 2H, J=7,1, Ethyl-CH₂), 3,93 (q, 2H, J=7,1, Ethyl-CH₂), 2,94 (dd, 1H, J=13,7, 5,8, ArCH₂), 2,82 (dd, 1H, J=13,6, 9,4, ArCH₂), 2,34 (m, 3H, Glu-4-CH₂, Glu-3-CH₂), 2,18 (m, 1H, Glu-3-CH₂), 1,11 (t, 6H, J=7,1, Ethyl-CH₃).

Beispiel 138
Ethyl-N-((S)-2-(4-aminophthalimido)-4-(ethoxycarbonyl)butanoyl)-L-phenylalaninat
In eine 300 ml-Parr-Flasche wurden 1,17 g 10% Pd(C) und 20 ml EtOAc unter einem Stickstoffstrom gegeben. Zu dieser Mischung wurde eine Lösung aus 6,72 g Ethyl-N-((S)-4-(ethoxycarbonyl)-2-(4-nitrophthalimido)butanoyl)-L-phenylalaninat in 200 ml EtOAc gegeben. Die Mischung wurde durch Hindurchblasen von Stickstoff desoxygeniert und dann bei 45 psi für 1 h hydriert. Die Flasche wurde mit Stickstoff gespült und der Katalysator durch Filtration durch Celite entfernt. Das Filtrat wurde im Vakuum auf konzentriert, um einen Rückstand zu ergeben, der durch Flash-Chromatographie an Kieselgel (1:1 → 3:7 Hexan:EtOAc) gereinigt wurde. Dies lieferte 5,66 g (88%) Ethyl-N-((S)-2-(4-aminophthalimido)-4-(ethoxycarbonyl)butanoyl)-L-phenylalaninat als hellgelben Feststoff.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,50 (d, 1H, J=7,4, NH), 7,48 (d, 1H, J=8,2, aromatisches CH), 7,26–7,08 (m, 5H, aromatisches CH), 6,92 (s, 1H, aromatisches CH), 6,82 (dd, 1H, J=8,3, 1,6, aromatisches CH), 6,47 (s, 2H, NH₂), 4,54 (m, 1H, Methin), 4,35 (q, 1H, J=7,4, Methin), 4,07–3,86 (m, 4H, Ethyl-CH₂), 2,92 (m, 2H, ArCH₂), 2,40–2,13 (m, 4H, Glu-4-CH₂, Glu-3-CH₂), 1,09 (m, 6H, Ethyl-CH₃).

Beispiel 139
Ethyl-N-((S)-2-(5-amino-1-oxo-2-isoindolinyl)-4-(ethoxycarbonyl)butanoyl)-L-phenylalaninat
Ein Zink-Quecksilber-Amalgam wurde hergestellt durch Verrühren von 19,8 g Zinkstaub (Mallinckrodt, Inc., Paris, KY, 40361) in 500 ml 10%igem wäßrigem HCl für 10 min. Die HCl-Lösung wurde abdekantiert und das Zink mit Wasser gewaschen, bis ein neutraler pH erreicht war. Eine warme Lösung aus 0,10 g HgCl₂ in Wasser wurde zum Zink zugegeben und die Mischung für 10 min gerührt. Das Amalgam wurde durch Filtration aufgefangen, nacheinander mit Wasser, EtOH und Ether gewaschen und luftgetrocknet. Das trockene Amalgam wurde zu einer Lösung aus 3,0 g Ethyl-N-((S)-2-(4-aminophthalimido)-4-(ethoxycarbonyl)butanoyl)-L-phenylalaninat und 60 ml 1N etherischem HCl in 250 ml EtOH gegeben, das in einem Eisbad auf 0°C gehalten wurde. Nach Rühren bei 0°C für 25 min zeigte DC (SiO₂, 3:7 Hexan:EtOAc) nur eine Spur des Ausgangsmaterials bei R_f = 0,58 und zwei neue Komponenten bei R_f = 0,52 und 0,63 an. Die Reaktionsmischung wurde zur Entfernung des Amalgams filtriert und das Filtrat im Vakuum auf 200 ml auf konzentriert. Die Lösung wurde bei 50 psi in Gegenwart von 0,54 g 10% Pd(C) für 18 h hydriert. Der Katalysator wurde durch Filtration durch Celite entfernt und das Filtrat durch Zugabe von überschüssigem NaHCO₃ neutralisiert und dann zur Trockene auf konzentriert. Der Rückstand wurde zwischen Wasser und CH₂Cl₂ aufgetrennt und die Schichten getrennt. Die CH₂Cl₂-Lösung wurde mit Wasser (2 × 200 ml) gewaschen und die Wasserschicht mit EtOAc (200 ml) extrahiert. Die CH₂Cl₂- und EtOAc-Lösungen wurden vereinigt, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und unter Erhalt von 2,77 g eines blaßgelben Schaums auf konzentriert. Analyse dieses Materials durch DC (SiO₂, 9:1 CH₂Cl₂:Aceton) zeigte vier Hauptkomponenten bei R_f = 0,50, 0,41, 0,29 und 0,20 an. Diese Materialien wurden durch Flash-Chromatographie an Kieselgel (9:1 CH₂Cl₂:Aceton) getrennt. Vergleichende ¹H-NMR-Analyse zeigte, daß das Material bei R_f = 0,29 Ethyl-N-((S)-2-(5-amino-1-oxo-2-isoindolinyl)-4-(ethoxycarbonyl)-butanoyl)-L-phenylalaninat war. Das Produkt wurde als blaßgelber Schaum erhalten, 0,646 g (22%).

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,48 (d, 1H, J=7,7, NH), 7,32 (d, 1H, J=8,2, aromatisches CH), 7,14 (s, 5H, aromatisches CH), 6,59 (m, 2H, aromatisches CH), 5,78 (s, 2H, NH₂), 4,73 (m, 1H, Methin), 4,43 (m, 1H, Methin), 4,13–3,90 (m, 6H, Ethyl-CH₂, Isoindolinylmethylen), 3,07–2,85 (m, 2H, ArCH₂), 2,26–2,01 (m, 3H, Glu-4-CH₂, Glu-3-CH₂), 1,88 (m, 1H, Glu-3-CH₂), 1,12 (m, 6H, Ethyl-CH₃).

Beispiel 140
Ethyl-N-((S)-2-(5-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-1-oxo-2-isoindolinyl)-4-(ethoxycarbonyl)butanoyl)-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 5 wurden 1,04 g 9-Brommethyl-3-methylbenzo(f)-chinazolin-1(2H)-on mit 1,65 g Ethyl-N-((S)-2-(5-amino-1-oxo-2-isoindolinyl)-4-(ethoxycarbonyl)butanoyl)-L-phenylalaninat unter Verwendung von 0,84 g NaHCO₃ umgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei 100°C für 5 h gerührt, auf RT abgekühlt und bei RT für 18 h gerührt. Analyse durch DC (SiO₂, 4:1 CH₂Cl₂:Aceton) zeigte eine unvollständige Reaktion an. Weitere 0,3 g 9-Brommethyl-3-methylbenzo(f)chinazolin-1(2H)-on wurden hinzugegeben und die Reaktionsmischung bei 100°C für 4 h gerührt. Die Mischung wurde auf RT abgekühlt und zur Entfernung von Feststoffen filtriert. Das Rohprodukt wurde an 25 g Kieselgel adsorbiert, indem Kieselgel zum Filtrat hinzugegeben, zur Trockene auf konzentriert und im Vakuum gelagert wurde. Die Produkt/Kieselgel-Mischung wurde auf eine Säule (1000 g SiO₂) geladen und einer Flash-Chromatographie unterworfen (CH₂Cl₂ → 95:5 CH₂Cl₂:MeOH), um 0,30 g reines Produkt zu ergeben. Unreine Chromatographiefraktionen wurden vereinigten, auf konzentriert und ein zweites Mal einer Flash-Chromatographie unterworfen (98:2 → 95:5 CH₂Cl₂:MeOH), um 0,26 g reines Produkt zu ergeben. Dies lieferte eine Gesamtausbeute von 0,56 g (23%) Ethyl-N-((S)-2-(5-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-1-oxo-2-isoindolinyl)-4-(ethoxycarbonyl)butanoyl)-L-phenylalaninat als weißen Feststoff, Smp. 140°C (Zers.).
Beispiel 141
N-((S)-4-Carboxy-2-(5-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-1-oxo-2-isoindolinyl)butanoyl)-L-phenylalanin
In einen mit einem Magnetrührer und einem Stickstoffeinlaß ausgerüsteten 100 ml-Dreihalskolben wurden 0,90 g Ethyl-N-((S)-2-(5-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-1-oxo-2-isoindolinyl)-4-(ethoxycarbonyl)butanoyl)-L-phenylalaninat, 3 ml EtOH und 10 ml 0,2 N wäßriges NaOH gegeben. Die Lösung wurde bei RT unter Stickstoff für 2 h gerührt und durch Zugabe von 1N HCl auf pH 3,0 angesäuert. Ein weißer Niederschlag resultierte, der durch Zentrifugieren abgetrennt wurde. Analyse dieses Material durch analytische HPLC (C18, 70:30:0,10 H₂O:MeCN·TFA) zeigte eine Hauptkomponente bei k' = 1,93 (90%) und eine Nebenkomponente bei k' = 2,41 an. Das Rohprodukt wurde durch halbpräparative Umkehrphasen-HPLC (C18, 75:25:0,1 H₂O:MeCN:TFA) gereinigt. Fraktionen, die reines Produkt enthielten (k' = 1,93 gemäß analytischer HPLC unter Verwendung der obigen Bedingungen), wurden vereinigt und im Vakuum zur Trockene aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in 15 ml 0,1N wäßrigem NaOH gelöst, und die Lösung wurde durch Zugabe von 1N HCl auf pH 3,0 eingestellt. Der resultierende Niederschlag wurde durch Zentrifugieren aufgefangen, mit vier Durchläufen von wäßrigem Suspendieren-Zentrifugieren-Dekantieren gewaschen und lyophilisiert, um 0,035 g (40%) N-((S)-4-Carboxy-2-(5-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(f)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-1-oxo-2-isoindolinyl)butanoyl)-L-phenylalanin als weißes Pulver zu liefern, Smp. 180°C.

HPLC: ein Peak an C18, k' = 2,3, 70:30:0,10 H₂O:MeCN:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min.
¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 12,83–12,56 (br s, 1H, COOH), 12,53 (s, 1H, Benzochinazolin NH), 12,20–11,90 (br s, 1H, COOH), 9,88 (s, 1H, aromatisches CH), 8,19 (m, 2H, Amid-NH, aromatisches CH), 8,00 (d, 1H, J=8,4, aromatisches CH), 7,66 (d, 1H, J=7,4, aromatisches CH), 7,57 (d, 1H, J=8,7, aromatisches CH), 7,33 (d, 1H, J=8,6, aromatisches CH), 7,17 (m, 1H, Isoindolinyl-5-NH), 7,03 (d, 2H, J=7,2, aromatisches CH), 6,90 (m, 3H, aromatisches CH), 6,72 (d, 1H, J=7,8, aromatisches CH), 6,59 (s, 1H, aromatisches CH), 4,67 (m, 1H, Methin), 4,57 (d, 2H, J=5,9, Benzochinazolin-9-CH₂), 4,38 (m, 1H, Methin), 4,02 (d, 1H, J=16,8, Isoindolinylmethylen), 3,76 (d, 1H, J=16,9, Isoindolinylmethylen), 3,00 (m, 1H, ArCH₂), 2,80 (m, 1H, ArCH₂), 2,41 (s, 3H, CH₃), 2,02 (m, 3H, Glu-4-CH₂, Glu-3-CH₂), 1,76 (m, 1H, Glu-3-CH₂).

Elementaranalyse

Berechnet für C₃₆H₃₃N₅O₇S·2,3 H₂O (MG 689,12): C, 62,75; H, 5,50; N 10,16; Gefunden: C, 62,82; H, 5,50; N 10,18. Massenspektrum: (FAB) 648 (M+H)⁺. UV-Spektrum: (Puffer pH 7) λ_max (ε) 265,6 (38900), 301,7 (21100), 348,4 (4870). λ_min (ε) 245,1 (19700), 284,1 (18300), 341,8 (3420). sh (e) 331,7 (7570).

Beispiel 142
tert-Butyl-(2R,3S,5S)-6-oxo-2,3-diphenyl-5-(3-(trimethylsilyl)benzyl)-4-morpholincarboxylat
Ein mit einem Magnetrührer und einem Stickstoffeinlaß ausgerüsteter trockener 250 ml-Dreihalskolben wurde mit 2,08 g t-Butyl-(2R,3S)-(–)-6-oxo-2,3-diphenyl-4-morpholincarboxylat (Aldrich), 1,43 g 3-(Trimethylsilyl)-benzylbromid (T. Yamakawa et al., J. Med. Chem., 1990, 33, 1430) und 45 ml wasserfreiem THF gefüllt. Die Lösung wurde auf –78°C abgekühlt und mit 6,17 ml 1 M Natriumbis(trimethylsilyl)amid/THF (Aldrich) über eine Spritze durch eine Gummimembran behandelt. Die Lösung wurde bei -78°C für 3,5 h gerührt und dann in 150 ml Wasser gegossen. Die resultierende Mischung wurde mit EtOAc (4 × 50 ml) extrahiert. Die vereinigten EtOAc-Extrakte wurden mit gesättigter Kochsalzlösung (3 × 100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum auf konzentriert, um ein hellgelbes Öl zu ergeben. Das rohe Material wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel (9:1 Hexan:EtOAc) gereinigt, um 2,6 g (88%) tert-Butyl-(2R,3S,5S)-6-oxo-2,3-diphenyl-5-(3-(trimethylsilyl)benzyl)-4-morpholincarboxylat als weißes Pulver zu liefern, Smp. 88-90°C.
Beispiel 143
(2R,3S,5S)-6-Oxo-2,3-diphenyl-5-(3-(trimethylsilyl)benzyl)-4-morpholin
Gemäß Beispiel 82 wurden 2,47 g tert-Butyl-(2R,3S,5S)-6-oxo-2,3-diphenyl-5-(3-(trimethylsilyl)benzyl)-4-morpholincarboxylat mit 4,1 ml TFA in 40 ml CH₂Cl₂ für 3 h behandelt. Neutralisation mit 8 ml Et₃N und Aufarbeitung in der gewöhnlichen Weise ergab ein dickes Öl. Reinigung des Rohmaterials durch Flash-Chromatographie an 80 g Kieselgel (85:15 Hexan:EtOAc) lieferte 1,70 g (83%) (2R,3S,5S)-6-Oxo-2,3-diphenyl-5-(3-(trimethylsilyl)benzyl)-4-morpholin als weißen kristallinen Feststoff, Smp. 94-95°C.
Beispiel 144
tert-Butyl-3-(trimethylsilyl)-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 53 wurde 1,58 g (2R,3S,5S)-6-Oxo-2,3-diphenyl-5-(3-(trimethylsilyl)benzyl)-4-morpholin in 70 ml 1:1 THF:EtOH unter Verwendung von 0,70 g PdCl₂ hydrogenolysiert. Analyse des Produkts durch ¹H-NMR zeigte eine teilweise Desilylierung des Phenyl-Rings an. Die Mischung wurde gemäß Beispiel 54 unter Verwendung von 25 ml Isobutylen und 0,5 ml konz. H₂SO₄ in 25 ml 1,4-Dioxan verestert. Aufarbeitung in der gewöhnlichen Weise lieferte ein hellgelbes Öl, das gemäß DC (SiO₂, EtOAc) aus zwei Komponenten mit R_f = 0,53 und 0,47 bestand. Das Material mit R_f = 0,53 wurde durch zweimalige Flash-Chromatographie an Kieselgel (EtOAc, dann 1:1 Hexan:EtOAc) isoliert. Dies ergab 0,161 g (15%) tert-Butyl-3-(trimethylsilyl)-L-phenylalaninat als klares Öl. Eine Probe des entsprechenden HCl-Salzes wurde hergestellt zur ¹H-NMR durch Behandeln von 5 mg Produkt mit überschüssigem 1N etherischem HCl und Aufkonzentrieren zur Trockene.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,53 (br s, 3H, NH₃ ⁺), 7,50–7,20 (m, 4H, aromatisches CH), 4,14 (m, 1H, Methin), 3,21 (m, 1H, ArCH₂), 2,98 (m, 1H, ArCH₂), 1,26 (s, 9H, t-Bu), 0,23 (s, 9H, Trimethylsilyl).

Beispiel 145
tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-(trimethylsilyl)-L-phenylalaninat
In einen mit einem Magnetrührer und einem Stickstoffeinlaß ausgerüsteten 50 ml-Dreihalskolben wurden 0,161 g tert-Butyl-3-(trimethylsilyl)-L-phenylalaninat, 0,194 g N-Cbz-L-glutaminsäure-γ-tert-butylester (Sigma) und 10 ml CH₂Cl₂ gegeben. Die Lösung auf 0°C abgekühlt und mit 0,110 g EDC behandelt. Die Reaktionsmischung wurde bei 0°C für 1,5 h gerührt und dann auf RT erwärmen gelassen. Nach weiteren 16 h Rühren bei RT wurde die Lösung im Vakuum zur Trockene in Gegenwart von 5 g Kieselgel auf konzentriert. Die resultierende Mischung wurde auf eine Säule aufgetragen und das Produkt durch Flash-Chromatographie isoliert (SiO₂, 75:25 Hexan:EtOAc), um 0,320 g (95%) tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-(trimethylsilyl)-L-phenylalaninat als dickes transparentes Glas zu liefern.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,29 (d, 1H, J=7,0, NH), 7,50–7,18 (m, 10H, aromatisches CH, NH), 5,02 (s, 2H, PhCH₂O), 4,38 (m, 1H, Methin), 4,07 (m, 1H, Methin), 2,97 (d, 2H, J=7,3, ArCH₂), 2,23 (t, 2H, J=7,6, Glu-4-CH₂), 1,96–1,60 (m, 2H, Glu-3-CH₂), 1,40 (s, 9H, t-Bu), 1,31 (s, 9H, t-Bu), 0,24 (s, 9H, Trimethylsilyl).

Beispiel 146
tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-(trimethyl-silyl)-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 48 wurden 0,315 g tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-(trimethylsilyl)-L-phenylalaninat unter Verwendung von 0,051 g 10% Pd(C) in 35 ml McOH hydrogenolysiert. Dies lieferte 0,24 g (98%) tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-(trimethylsilyl)-L-phenylalaninat als dickes transparentes Öl. Eine Probe des entsprechenden HCl-Salzes zur ¹H-NMR-Analyse wurde hergestellt durch Behandeln von 5 mg des Produkts mit überschüssigem 1N etherischem HCl und Auf konzentrieren zur Trockene.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,99 (d, 1H, J=7,2, NH), 8,28 (br s, 3H, NH₃ ⁺), 7,47–7,24 (m, 4H, aromatisches CH), 4,42 (m, 1H, Methin), 3,86 (m, 1H, Methin), 3,01 (d, 2H, J=7,2, ArCH₂), 2,37 (m, 2H, Glu-4-CH₂), 2,01 (m, 2H, Glu-3-CH₂), 1,42 (s, 9H, t-Bu), 1,32 (s, 9H, t-Bu), 0,26 (s, 9H, Trimethylsilyl).

Beispiel 147
tert-Butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)-methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-(trimethylsilyl)-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 49 wurden 0,095 g 4-(N-(2,4-Diamino-6-pteridinylmethyl)-N-methylamino)benzoesäure-hemihydrochloriddihydrat (Aldrich) mit 0,12 g tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-(trimethylsilyl)-L-phenylalaninat unter Verwendung von 0,11 ml DECP (Aldrich) und 0,12 ml Et₃N in 11 ml DMF gekuppelt. Das Rohprodukt wurde der Flash-Chromatographie an Kieselgel (7:7:1 CH₂Cl₂:Aceton:MeOH) unterworfen, um 0,141 g (72%) tert-Butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-(trimethylsilyl)-L-phenylalaninat als gelbes Pulver zu liefern, Smp. 118-125°C.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,58 (s, 1H, Pteridinyl-7-CH), 8,23 (d, 1H, J=7,5, Amid-NH), 8,00 (d, 1H, J=7,8, Amid-NH), 7,74 (d, 2H, J=8,7, aromatisches CH), 7,70 (br s, 1H, NH₂), 7,48 (br s, 1H, NH₂), 7,33 (m, 2H, aromatisches CH), 7,22 (m, 2H, aromatisches CH), 6,83 (d, 2H, J=8,8, aromatisches CH), 6,63 (br s, 2H, NH₂), 4,79 (s, 2H, Pteridinyl-CH₂), 4,53–4,29 (m, 2H, Methine), 3,23 (s, 3H, N-CH₃), 2,96 (d, 2H, J=7,0, ArCH₂), 2,23 (m, 2H, Glu-4-CH₂), 2,04–1,77 (m, 2H, Glu-3-CH₂), 1,38 (s, 9H, t-Bu), 1,28 (s, 9H, t-Bu), 0,21 (s, 9H, Trimethylsilyl).

Beispiel 148
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)-methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-(trimethylsilyl)-L-phenylalanin
Ein mit einem Magnetrührer und einem Stickstoffeinlaß ausgerüsteter 100 ml-Dreihalskolben wurde mit 0,111 g tert-Butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-(trimethylsilyl)-L-phenylalaninat und 25 ml CH₃NO₂ gefüllt. Die resultierende Lösung wurde mit 5 ml TFA behandelt und bei RT gerührt. Nach 1 h wurde die Lösung im Vakuum zur Trockene aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in 3 ml CH₃NO₂ gelöst und die Lösung mit 20 ml Ethylether behandelt. Ein gelber Feststoff fiel aus, der durch Filtration aufgefangen und im Vakuum getrocknet wurde. Das Produkt wurde in 3 ml 1:1 H₂O:CH₃CN gelöst und die Lösung mit 50 ml Wasser vermischt. Es resultierte eine Suspension, die eingefroren und lyophilisiert wurde, um 0,90 g (82%) N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-(trimethylsilyl)-L-phenylalanin als gelbes Pulver zu liefern, Smp. 155°C (Zers.).

HPLC: ein Peak an C18, k' = 1,55, 65:35:0,1 H₂O:MeCN:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min.
¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 13,00–11,75 (br s, COOH), 8,64 (s, 1H, Pteridinyl-7-CH), 8,60 (br s, 1H, NH₂), 8,39 (br s, 1H, NH₂), 8,11 (d, 1H, J=7,7, Amid-NH), 7,97 (d, 1H, J=8,1, Amid-NH), 7,75–7,10 (br m, 2H, NH₂), 7,69 (d, 2H, J=8,9, aromatisches CH), 7,28 (m, 2H, aromatisches CH), 7,14 (m, 2H, aromatisches CH), 6,79 (d, 2H, J=8,9, aromatisches CH), 4,82 (s, 2H, Pteridinyl-CH₂), 4,39 (m, 2H, Methine), 3,21 (s, 3H, N-CH₃), 3,02 (m, 1H, ArCH₂), 2,88 (m, 1H, ArCH₂), 2,20 (t, 2H, J=7,8, Glu-4-CH₂), 2,00-1,72 (m, 2H, Glu-3-CH₂), 0,17 (s, 9H, Trimethylsilyl).

Elementaranalyse
Berechnet für C₃₂H₃₉N₉O₆Si·0,8 TFA·1,2 H₂O (MG 786,64):
C, 51,30; H, 5,41; N 16,03;
Gefunden: C, 51,24; H, 5,39; N 16,07.
Massenspektrum: (FAB) 674 (M+H)⁺.
UV-Spektrum: (Puffer pH 7) λ_max (ε) 259,5 (23500), 308,0 (24300), 373,2 (7210).
λ_min (ε) 240,7 (12700), 273,9 (15500), 345,0 (5210).
Beispiel 149
tert-Butyl-3-iod-L-tyrosinat
Eine Mischung aus 5,0 g 3-Iod-L-tyrosin (Aldrich) und 2,5 ml konz. H₂SO₄ in 85 ml 1,4-Dioxan wurde zu 30 ml flüssigem Isobutylen (kondensiert bei –78°C) in einer 300 ml-Druckflasche gegeben. Das Gefäß wurde geschlossen und der Inhalt bei RT gerührt. Nach 3 Tagen wurde die Flasche in einem Eis-Wasser-Bad gekühlt, geöffnet und die Lösung in eine Mischung aus 10 g NaHCO₃ in 150 ml Wasser gegossen. Die resultierende Mischung wurde zur Entfernung von Isobutylen und Dioxan der Rotationsverdampfung unterworfen. Es resultierte ein weißer Feststoff, durch Filtration aufgefangen und im Vakuum getrocknet wurde. Analyse durch DC (SiO₂, 95:5 CH₂Cl₂:MeOH) zeigte Haupt- und Nebenkomponenten bei R_f = 0,52 bzw. 0,60 an. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel (95:5 CH₂Cl₂:MeOH) gereinigt, um 3,4 g (58%) tert-Butyl-3-iod-L-tyrosinat als weißen kristallinen Feststoff zu liefern, Smp. 158-159°C.
Beispiel 150
tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-4-O-((benzyloxy)-carbonyl)-3-iod-L-tyrosinat
Ein mit einem Magnetrührer und einem Stickstoffeinlaß ausgerüsteter 500 ml-Rundkolben wurde mit 5,15 g tert-Butyl-3-iod-L-tyrosinat, 250 ml 1,4-Dioxan und 4,55 ml Et₃N gefüllt. Die resultierende Lösung wurde mit 4,66 ml Benzylchlorformiat durch langsame Zugabe behandelt. Nach 30 min zeigte DC (SiO₂, 8:2 Hexan:EtOAc) keinen verbleibenden Ausgangsstoff und eine einzelne neue Komponente bei R_f = 0,50 an. Die Lösung wurde im Vakuum auf konzentriert und der Rückstand mit 200 ml Wasser vermischt. Die Mischung wurde mit EtOAc (4 × 50 ml) extrahiert. Die vereinigten EtOAc-Extrakte wurden mit 5%igem wäßrigem NaHCO₃ gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und im Vakuum auf konzentriert. Das Rohprodukt wurde der Flash-Chromatographie an Kieselgel (8:2 Hexan:EtOAc) unterworfen, um 7,49 g (84%) tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-4-O-((benzyloxy)carbonyl)-3-iod-L-tyrosinat als transparenten Schaum zu liefern.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 7,77 (m, 2H, NH, aromatisches CH), 7,53–7,21 (m, 12H, aromatisches H), 5,32 (s, 2H, PhCH₂O), 5,20 (s, 2H, PhCH₂O), 4,12 (m, 1H, Methin), 2,92 (m, 2H, ArCH₂), 1,35 (s, 9H, t-Bu).

Beispiel 151
tert-Butyl-3-cyclopentyl-L-tyrosinat
Eine 300 ml-Parr-Bombe wurde mit 5,13 g tert-Butyl-N-((benzyloxy)-carbonyl)-4-O-((benzyloxy)carbonyl)-3-iod-L-tyrosinat, 120 ml Toluol, 30 ml Cyclopenten und 0,49 g Tri-ortho-tolylphosphin gefüllt. Die Lösung wurde durch Hindurchblasen von Stickstoff für 10 min desoxygeniert und mit 0,182 g Pd(OAc)2 und 1,24 ml Et₃N behandelt. Die Bombe wurde mit Stickstoff gespült, versiegelt und auf 110°C für 48 h erwärmt. Das Gefäß wurde auf RT abgekühlt, mit Stickstoff gespült und geöffnet. Die Reaktionsmischung wurde zur Entfernung von Feststoffen filtriert, und das Filtrat wurde im Vakuum zur Trockene aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in 200 ml EtOAc gelöst, und die Lösung wurde mit Wasser (4 × 100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und aufkonzentriert, um ein dickes braunes Öl zu ergeben. Analyse durch DC (SiO₂, 8:2, Hexan:EtOAc) zeigte zwei Hauptkomponenten bei R_f = 0,50 und 0,40 an. Die rohe Mischung wurde der Flash-Chromatographie an Kieselgel (8:2 Hexan:EtOAc) unterworfen. Dies lieferte 2,0 g (43%) des Materials mit R_f = 0,50, das durch ¹H-NMR als die Bis(benzyloxycarbonyl)-Olefinmischung identifiziert wurde. Zusätzlich wurden 0,90 g (25%) des Materials mit R_f = 0,40 erhalten und als N-Benzyloxycarbonyl-Olefinmischung identifiziert, die aus dem Verlust der O-Benzyloxycarbonyl-Gruppe resultierte. Die Bis(benzyloxycarbonyl)-Olefinmischung (2,00 g) wurde der katalytischen Hydrierung (45 psi) in Gegenwart von 0,35 g 10% Pd(C) in 70 ml McOH für 18 h unterworfen. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie (SiO₂, EtOAc) gereinigt, um 0,99 g (93%) tert-Butyl-3-cyclopentyl-L-tyrosinat als transparentes Glas zu ergeben. Die Benzyloxy-carbonyl-Olefinmischung (0,90 g) wurde in ähnlicher Weise hydriert und gereinigt, um 0,52 g (83%) tert-Butyl-3-cyclopentyl-L-tyrosinat zu liefern.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 9,05 (s, 1H, OH), 6,92 d, 1H, J=1,9, aromatisches CH), 6,80 (dd, 1H, J=8,0, 2,0, aromatisches CH), 6,66 (d, 1H, J=8,0, aromatisches CH), 3,16 (m, 1H, Cyclopentylmethin), 2,67 (d, 2H, J=6,6, ArCH₂), 2,00–1,40 (m, 10H, Cyclopentyl-CH₂, NH₂), 1,33 (s, 9H, t-Bu).

Beispiel 152
tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-tyrosinat
Gemäß Beispiel 145 wurden 0,99 g tert-Butyl-3-cyclopentyl-L-tyrosinat mit 1,09 g N-Cbz-L-glutaminsäure-γ-tert-butylester (Sigma) unter Verwendung von 0,65 g EDC in 20 ml CH₂Cl₂ für 4 h gekuppelt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel (7:3 Hexan:EtOAc) gereinigt, um 1,8 g (89%) tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-tyrosinat als farblosen Schaum zu liefern.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 9,08 (s, 1H, OH), 8,17 (d, 1H, J=7,5, NH), 7,36 (m, 6H, aromatisches CH, NH), 6,96 (s, 1H, aromatisches CH), 6,81 (d, 1H, J=8,1, aromatisches CH), 6,67 (d, 1H, J=8,1, aromatisches CH), 5,01 (m, 2H, PhCH₂O), 4,28 (m, 1H, Methin), 4,08 (m, 1H, Methin), 3,17 (m, 1H, Cyclopentylmethin), 2,82 (d, 2H, J=6,9, ArCH₂), 2,21 (t, 2H, J=7,7, Glu-4-CH₂), 1,99–1,46 (m, 10H, Glu-3-CH₂, Cyclopentyl-CH₂), 1,40 (s, 9H, t-Bu), 1,33 (s, 9H, t-Bu).

Beispiel 153
tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-tyrosinat
Gemäß Beispiel 48 wurden 1,75 g tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-tyrosinat unter Verwendung von 0,28 g 10% Pd(C) in 70 ml McOH für 3 h hydrogenolysiert. Das Rohprodukt wurde der Flash-Chromatographie an Kieselgel (95:5 CH₂Cl₂:MeOH) unterworfen, um 1,26 g (92%) tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-tyrosinat als weißen kristallinen Feststoff zu liefern, Smp. 108-110°C.
Beispiel 154
tert-Butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)-methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-tyrosinat
In einen mit einem Magnetrührer und einem Stickstoffeinlaß ausgerüsteten trockenen 100 ml-Dreihalskolben wurden 35 ml wasserfreies DMF, 1,14 ml Et₃N und 0,99 ml DECP gegeben. Zur resultierenden Lösung wurden 1,24 g 4-(N-(2,4-Diamino-6-pteridinylmethyl)-N-methylamino)benzoesäure-hemihydrochloriddihydrat (Aldrich) gegeben. Das feste Ausgangsmaterial löste sich langsam unter Erhalt einer gelben Lösung auf. Nach 45 min wurde eine Lösung aus 1,60 g tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-tyrosinat in 8 ml DMF hinzugegeben. Die Lösung wurde bei RT für 24 h gerührt und dann im Vakuum zur Trockene auf konzentriert. Der Rückstand wurde in 150 ml CHCl₃ gelöst. Die Lösung wurde mit 5%igem wäßrigem NH₄OH (3 × 70 ml) gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und im Vakuum auf konzentriert. Das Rohprodukt wurde der Flash-Chromatographie an Kieselgel zweimal unterworfen (7:7:1 CH₂Cl₂:Aceton:MeOH, 93:7 CH₂Cl₂:MeOH), um 2,08 g (80%) tert-Butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-tyrosinat als gelbes Pulver zu liefern, Smp. 145–148°C.
Beispiel 155
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)-methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-tyrosin
Gemäß Beispiel 50 wurden 2,04 g tert-Butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-tyrosinat mit gasförmigem HCl in 65 ml CH₃NO₂ für 1 h behandelt. Die gelbe Suspension wurde zu einer Aufschlämmung aufkonzentriert und mit 80 ml Ethylether vermischt. Die resultierende Ausfällung wurde durch Filtration aufgefangen und im Vakuum getrocknet. Das Produkt wurde in 40 ml 8:2 H₂O:MeCN gelöst, und die Lösung wurde filtriert und auf 30 ml auf konzentriert. Eine gelbe Suspension wurde erhalten, die mit 150 ml Wasser verdünnt, eingefroren und lyophilisiert wurde, um 1,71 g (86%) N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-tyrosin als gelb-orangefarbenes Pulver zu ergeben, Smp. 175°C (Zers.).

HPLC: ein Peak an C18, k' = 2,98,75:25:0,1 H₂O:MeCN:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min.
¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 13,12 (br m, COOH), 9,30 (s, 1H, NH₂), 9,09 (s, 1H, NH₂), 8,71 (s, 1H, Pteridinyl-7-CH), 8,67 (br s, 1H, NH₂), 8,02 (m, 2H, Amid-NHs), 7,78 (br s, 1H, NH₂), 7,71 (d, 2H, J=8,7, aromatisches CH), 6,91 (s, 1H, aromatisches CH), 6,79 (m, 3H, aromatisches CH), 6,61 (d, 1H, J=8,1, aromatisches CH), 4,86 (s, 2H, Pteridinyl-CH₂), 4,42 (m, 1H, Methin), 4,29 (m, 1H, Methin), 3,24 (s, 3H, N-CH₃), 3,09 (m, 1H, Cyclopentylmethin), 2,93–2,71 (m, 2H, ArCH₂), 2,23 (t, 2H, J=7,8, Glu-4-CH₂), 2,03–1,74 (m, 4H, Glu-3-CH₂, Cyclopentyl-CH₂), 1,73–1,37 (m, 6H, Cyclopentyl-CH₂).

Elementaranalyse

Berechnet für C₃₄H₃₉N₉O₇·1,6 HCl·1,7 H₂O (MG 774,70): C, 52,71; H, 5,72; N 16,27; Cl, 7,32; Gefunden: C, 52,79; H, 5,71; N 16,16; Cl, 7,35. Massenspektrum: (Ionen-Spray) 686 (M+H)⁺. UV-Spektrum: (Puffer pH 7) λ_max (ε) 259,3 (24700), 307,8 (24800), 372,5 (7780). λ_min (ε) 242,3 (15500), 272,9 (17800), 344,6 (6080). sh (e) 221,3 (28900), 286,4 (21100).

Beispiel 156
3-(3-Hydroxy-3-pentyl)-O-(tert-butyltrimethylsilyl)-benzylalkohol
In einen mit einem Magnetrührer und einem Stickstoffeinlaß ausgerüsteten trockenen 250 ml-Dreihalskolben wurden 5,0 g 3-Iod-O-(tert-butyldimethylsilyl)benzylalkohol und 40 ml wasserfreier Ethylether gegeben. Die Lösung wurde unter Stickstoff auf –78°C gekühlt und mit 23,2 ml 1,3 M sek-Butyllithium/Cyclohexan (Aldrich) über eine Spritze behandelt. Nach 20 min wurde die Lösung mit 3,1 ml 3-Pentanon (Aldrich) behandelt. Die Reaktionsmischung wurde bei –78°C für 1,5 h gerührt und dann auf RT erwärmen gelassen. Nach 3 h bei RT wurde die Lösung durch Zugabe von 5 ml Wasser abgeschreckt, für mehrere Minuten gerührt und dann mit 80 ml Wasser vermischt. Die zwei Phasen wurden getrennt und die wäßrige Lösung mit einer weiteren 50 ml-Portion Ether extrahiert. Der Ether-Extrakt wurde mit der ursprünglichen Ether-Lösung vereinigt. Diese Lösung wurde mit gesättigter wäßriger Kochsalzlösung (3 × 50 ml) gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und aufkonzentriert, um eine klare Flüssigkeit zu liefern. Analyse durch DC (SiO₂, 9:1 Hexan:EtOAc) zeigte eine neue Hauptkomponente bei R_f = 0,47 an. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel (9:1 Hexan:EtOAc) gereinigt, um 3,9 g (88%) 3-(3-Hydroxy-3-pentyl)-O-(tert-butyltrimethylsilyl)benzylalkohol als klare Flüssigkeit zu liefern.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 7,33 (s, 1H, aromatisches CH), 7,26 (m, 2H, aromatisches CH), 7,12 (m, 1H, aromatisches CH), 4,72 (s, 2H, ArCH₂O), 4,48 (s, 1H, OH), 1,72 (m, 4H, Pentyl-CH₂), 0,90 (s, 9H, t-Bu), 0,64 (t, 6H, J=7,5, Pentyl-CH₃), 0,06 (s, 6H, SiMe₂).

Beispiel 157
3-(3-Pentyl)benzylalkohol
Ein mit einem Stickstoffeinlaß und einem Magnetrührer ausgerüsteter
250 ml-Rundkolben wurde mit 3,9 g 3-(3-Hydroxy-3-pentyl)-O-(tert-butyltrimethylsilyl)benzylalkohol und 25 ml CH₂Cl₂ gefüllt. Die Lösung wurde auf 0°C in einem Eisbad gekühlt und mit 15 ml TFA gefolgt von 5 ml Et₃SiH (Aldrich) behandelt. Nach 30 min bei 0°C wurde das Eisbad entfernt und die Lösung für 18 h bei RT gerührt. Die Lösung wurde zu einer viskosen Flüssigkeit aufkonzentriert. Dieses Material wurde in Ether (60 ml) gelöst, mit 5%igem wäßrigem NaHCO₃ (3 × 50 ml) gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert. Die resultierende Flüssigkeit wurde in 10 ml THF gelöst und mit 63 ml 1M Bu₄NF/THF (Aldrich) behandelt. Nach Rühren bei RT für 18 h wurde die Lösung aufkonzentriert und der resultierende Sirup mit 80 ml Wasser vermischt. Die Mischung wurde mit Ether (4 × 30 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit 5%igem wäßrigem NaHCO₃ (3 × 50 ml) gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und aufkonzentriert, um eine hellgelbe Flüssigkeit zu liefern. Analyse durch DC (SiO₂, 9:1 Hexan:EtOAc) zeigte eine neue Hauptkomponente bei R_f = 0,30 an. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel (85:15 Hexan:EtOAc) gereinigt, um 1,84 g (82%) 3-(3-Pentyl)benzylalkohol als klare Flüssigkeit zu ergeben.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 7,21 (t, 1H, J=7,5, aromatisches CH), 7,10 (m, 2H, aromatisches CH), 6,99 (d, 1H, J=7,4, aromatisches CH), 5,12 (t, 1H, J=5,8, OH), 4,46 (d, 2H, J=5,8, ArCH₂O), 2,26 (m, 1H, Pentylmethin), 1,62 (m, 2H, Pentyl-CH₂), 1,49 (m, 2H, Pentyl-CH₂), 0,69 (t, 6H, J=7,4, Pentyl-CH₃).

Beispiel 158
3-(3-Pentyl)benzylbromid
Gemäß Beispiel 17 wurden 1,84 g 3-(3-Pentyl)benzylalkohol mit 0,34 ml PBr₃ in 25 ml wasserfreiem CH₂Cl₂ behandelt, um 2,23 g (90%) 3-(3-Pentyl)benzylbromid als klare Flüssigkeit zu liefern.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 7,26 (m, 3H, aromatisches CH), 7,12 (m, 1H, aromatisches CH), 4,70 (s, 2H, ArCH₂), 2,33 (m, 1H, Pentylmethin), 1,78–1,40 (m, 4H, Pentyl-CH₂), 0,73 (t, 6H, J=7,3, Pentyl-CH₃).

Beispiel 159
tert-Butyl-(2R,3S,5S)-6-oxo-2,3-diphenyl-5-(3-(3-pentyl)benzyl)-4-morpholincarboxylat
Gemäß Beispiel 142 wurden 3,27 g tert-Butyl-(2R,3S)-(–)-6-oxo-2,3-diphenyl-4-morpholincarboxylat mit 2,23 g 3-(3-pentyl)benzylbromid in 70 ml wasserfreiem THF unter Verwendung von 9,71 ml 1 M Natriumbis(trimethylsilyl)amid in THF alkyliert. Das Rohprodukt wurde der Flash-Chromatographie an Kieselgel unterworfen (9:1 Hexan:EtOAc) und dann aus EtOH-Wasser umkristallisiert, um 2,26 g (48%) tert-Butyl-(2R,3S,5S)-6-oxo-2,3-diphenyl-5-(3-(3-pentyl)benzyl)-4-morpholincarboxylat als weißen kristallinen Feststoff zu liefern, Smp. 143-144°C.
Beispiel 160
(2R,3S,5S)-6-Oxo-2,3-diphenyl-5-(3-(3-pentyl)benzyl)-morpholin
In einen mit einem Magnetrührer und einem Stickstoffeinlaß ausgerüsteten 250 ml-Rundkolben wurden 2,19 g tert-Butyl-(2R,3S,5S)-6-oxo-2,3-diphenyl-5-(3-(3-pentyl)benzyl)-4-morpholincarboxylat und 45 ml wasserfreies CH₂Cl₂ gegeben. Die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt und mit 3,5 ml TFA behandelt. Die Lösung wurde auf RT erwärmen gelassen und unter Stickstoff gerührt. Nach 5 h zeigte DC (SiO₂, 9:1 Hexan:EtOAc) eine Spur Ausgangsmaterial und eine neue Hauptkomponente bei R_f = 0,42 an. Die Reaktionsmischung wurde in 150 ml 6%iges wäßriges NaHCO₃ gegossen und für mehrere Minuten gerührt. Die Phasen wurden getrennt und die wäßrige Portion mit drei zusätzlichen 40 ml-Portionen CH₂Cl₂ extrahiert. Die Extrakte wurden mit der ursprünglichen CH₂Cl₂-Lösung vereinigt und mit 5%igem wäßrigem NaHCO₃ (3 × 60 ml) gewaschen. Die Lösung wurde über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und unter Erhalt eines hellbraunen Feststoffs aufkonzentriert. Dieses Material wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel (85:15 Hexan:EtOAc) gereinigt, um 1,47 g (84%) (2R,3S,5S)-6-Oxo-2,3-diphenyl-5-(3-(3-pentyl)benzyl)morpholin als weißen kristallinen Feststoff zu liefern. Eine Analysenprobe wurde hergestellt durch Umkristallisation aus EtOH-H₂O. Schmelzpunkt 96-97°C.
Beispiel 161
3-(3-Pentyl)-L-phenylalanin
In eine 300 ml-Parr-Flasche wurde 0,41 g PdCl₂, 1,36 g (2R,3S,5S)-6-Oxo-2,3-diphenyl-5-(3-(3-pentyl)benzyl)morpholin, 50 ml EtOH und 30 ml THF gegeben. Die Mischung wurde durch Hindurchblasen von Stickstoff für 10 min desoxygeniert und bei 45 psi für 18 h hydriert. Das Gefäß wurde mit Stickstoff gespült, der Katalysator durch Filtration durch Celite entfernt und das Filtrat im Vakuum zu einem Volumen von 15 ml aufkonzentriert. Die Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt und unter Zusatz von 50 ml Hexan verrieben. Es bildete sich langsam ein feiner Niederschlag. Nach Lagern bei 5°C über Nacht wurde der Feststoff durch Filtration aufgefangen und im Vakuum getrocknet, um 0,65 g (72%) 3-(3-Pentyl)-L-phenylalanin·HCl als weißes Pulver zu liefern, Smp. 170°C (Zers.).
Beispiel 162
tert-Butyl-3-(3-pentyl)-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 54 wurden 0,60 g 3-(3-Pentyl)-L-phenylalanin·HCl mit 30 ml Isobutylen in 35 ml 1,4-Dioxan in Gegenwart von 0,5 ml konz. H₂SO₄ behandelt. Aufarbeitung in der gewöhnlichen Weise gefolgt von Ansäuern mit 2 ml 1N etherischem HCl lieferte 0,53 g (74%) tert-Butyl-3-(3-pentyl)-L-phenylalaninat·HCl als hellgelbes Glas.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,63, (br s, 3H, NH₃ ⁺), 7,28 (t, 1H, J=7,45, aromatisches CH), 7,10 (m, 3H, aromatisches CH), 4,12 (m, 1H, Methin), 3,23 (dd, 1H, J=13,9, 5,1, ArCH₂), 2,96 (dd, 1H, J=13,9, 9,1, ArCH₂), 2,32 (m, 1H, Pentylmethin), 1,78–1,40 (m, 4H, Pentyl-CH₂), 1,28 (s, 9H, t-Bu), 0,74 (t, 6H, J=7,3, Pentyl-CH₃).

Beispiel 163
tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-(3-pentyl)-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 145 wurden 0,53 g tert-Butyl-3-(3-pentyl)-L-phenylalaninat·HCl mit 0,55 g N-Cbz-L-glutaminsäure-γ-tert-butylester unter Verwendung von 0,33 g EDC und 0,18 ml N-Methylmorpholin in 15 ml wasserfreiem CH₂Cl₂ gekuppelt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel (8:2 Hexan:EtOAc) gereinigt, um 0,80 g (81%) tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-(3-pentyl)-L-phenylalaninat als weißen kristallinen Feststoff zu liefern, Smp. 50–53°C.
Beispiel 164
tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-(3-pentyl)-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 48 wurden 0,72 g tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-(3-pentyl)-L-phenylalaninat unter Verwendung von 0,12 g 10% Pd(C) in 70 ml McOH hydrogenolysiert. Dies lieferte 0,51 g (91%) tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-(3-pentyl)-L- phenylalaninat als dickes transparentes Öl. Eine Probe des entsprechenden HCl-Salzes zur ¹H-NMR-Analyse wurde hergestellt durch Behandeln von 5 mg des Produkts mit überschüssigem 1N etherischem HCl und Auf konzentrieren zur Trockene.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 9,03 (d, 1H, J=6,9, NH), 8,38 (br s, 3H, NH₃ ⁺), 7,23 (t, 1H, J=7,2, aromatisches CH), 7,06 (m, 3H, aromatisches CH), 4,39 (m, 1H, Methin), 3,87 (m, 1H, Methin), 3,01 (d, 2H,J=7,4, ArCH₂), 2,35 (m, 3H, Pentylmethin, Glu-4-CH₂), 2,01 (m, 2H, Glu-3-CH₂), 1,75–1,48 (m, 4H, Pentyl-CH₂), 1,41 (s, 9H, t-Bu), 1,32 (s, 9H, t-Bu), 0,73 (t, 6H, J=7,3, Pentyl-CH₃).

Beispiel 165
tert-Butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)-methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-(3-pentyl)-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 49 wurden 0,199 g 4-(N-(2,4-Diamino-6-pteridinylmethyl)-N-methylamino)benzoesäure-hemihydrochloriddihydrat mit 0,25 g tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-(3-pentyl)-L-phenylalaninat unter Verwendung von 0,24 ml DECP und 0,26 ml Et₃N in 25 ml DMF gekuppelt. Das Rohprodukt wurde zweimal der Flash-Chromatographie an Kieselgel unterworfen (7:7:1 CH₂Cl₂:Aceton:MeOH; 95:5 CH₂Cl₂:MeOH), um 0,215 g (52%) tert-Butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-(3-pentyl)-L-phenylalaninat als gelbes Pulver zu liefern, Smp. 175°C (Zers.).
Beispiel 166
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)-methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-(3-pentyl)-L-phenylalanin
Gemäß Beispiel 50 wurden 0,184 g tert-Butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-(3-pentyl)-L-phenylalaninat mit gasförmigem HCl in 25 ml CH₃NO₂ für 45 min behandelt. Die gelbe Suspension wurde im Vakuum zur Trockene aufkonzentriert. Analyse des Produkts durch HPLC (C18, 65:35:0,1 H₂O:MeCN:TFA) zeigte eine Hauptkomponente bei k' = 1,61 und eine Nebenkomponente bei k' _ 0,25 an. Das Rohprodukt wurde durch halbpräparative HPLC (C18, 65:35:0,1 H₂O:MeCN:TFA) gereinigt. Fraktionen, die reines Produkt enthielten (analytische HPLC), wurden vereinigt und der Rotationsverdampfung unterworfen, um CH₃CN zu entfernen. Eine gelbe Suspension resultierte, die eingefroren und lyophilisiert wurde, um 0,12 g (58%) N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-(3-pentyl)-L-phenylalanin als gelbes Pulver zu liefern, Smp. 120°C (Zers.).

HPLC: ein Peak an C18, k' = 1,61, 65:35:0,1 H₂O:MeCN:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min.
¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 12,87–11,90 (br m, 2H, COOH), 9,20 (br s, 1H, NH₂), 9,00 (br s, 1H, NH₂), 8,70 (s, 1H, Pteridinyl-7-CH), 8,60–8,23 (br m, 2H, NH₂), 8,11 (d, 1H, J=7,6, Amid-NH), 7,96 (d, 1H, J=7,8, Amid-NH), 7,70 (d, 2H, J=8,7, aromatisches CH), 7,07 (m, 1H, aromatisches CH), 6,98 (d, 2H, J=7,9, aromatisches CH), 6,90 (d, 1H, J=7,6, aromatisches CH), 6,80 (d, 2H, J=8,6, aromatisches CH), 4,86 (s, 2H, Pteridinyl-CH₂), 4,41 (m, 2H, Methine), 3,23 (s, 3H, N-CH₃), 2,92 (m, 2H, ArCH₂), 2,21 (m, 3H, Pentylmethin, Glu-4-CH₂), 2,03–1,77 (m, 2H, Glu-3-CH₂), 1,68–1,37 (m, 4H, Pentyl-CH₂), 0,62 (m, 6H, Pentyl-CH₃).

Elementaranalyse

Berechnet für C₃₄H₄₁N₉O₆·1,5 TFA·1,8 H₂O (MG 875,22): C, 50,78; H, 5,31; N 14,40; Gefunden: C, 50,76; H, 5,40; N 14,34. Massenspektrum: (Ionen-Spray) 672 (M+H)⁺. UV-Spektrum: (Puffer pH 7) λ_max (ε) 259,8 (20000), 308,7 (19800), 373,7 (5890). λ_min (ε) 214,5 (11600), 275,0 (13200), 345,8 (4420).

Beispiel 167
2-Iod-4-nitro-L-phenylalanin
Ein mit einem Magnetrührer ausgerüsteter 250 ml-Rundkolben wurde mit 60 ml rauchender Schwefelsäure (Aldrich) und 12,1 g Iod (Aldrich) gefüllt. Zur resultierenden dunkelroten Lösung wurden 10,0 g 4-Nitro-L-phenylalanin durch langsame Addition hinzugegeben. Der Kolben wurde mit einem CaCl₂-Trockenrohr versehen und die Reaktionsmischung bei RT für 18 h gerührt. Die Mischung wurde dann auf 300 g gestoßenes Eis gegossen. Es resultierte eine gelbbraune Emulsion, die mit 7,4 g Natriumthiosulfat behandelt und gerührt wurde. Die resultierende hellbraune Suspension wurde durch Zugabe von festem NaCO₃ auf pH 9 basisch gemacht. Diesem schloß sich ein Ansäuern auf pH 5,5 durch Zugabe von konz. H₂SO₄ an. Ein brauner Feststoff fiel aus, der durch Filtration aufgefangen und im Vakuum getrocknet wurde. Die lieferte 6,54 g (41%) 2-Iod-4-nitro-L-phenylalanin als braunes Pulver, Smp. >200°C.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,62 (s, 1H, aromatisches CH), 8,46 (br s, 3H, NH₃ ⁺), 8,26 (d, 1H, J=8,5, aromatisches CH), 7,65 (d, 1H, J=8,5, aromatisches CH), 4,22 (m, 1H, Methin), 3,34 (m, 2H, ArCH₂).

Beispiel 168
Ethyl-2-iod-4-nitro-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 8 wurden 1,40 g 2-Iod-4-nitro-L-phenylalanin durch Refluxieren in 50 ml ethanolischem HCl für 18 h verestert. Aufarbeitung in der gewöhnlichen Weise gefolgt von Flash-Chromatographie an Kieselgel (95:5, CH₂Cl₂:MeOH) lieferte 1,19 g (78%) Ethyl-2-iod-4-nitro-L-phenylalaninat als gelben kristallinen Feststoff Smp. 33-34°C.
Beispiel 169
Ethyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-2-iod-4-nitro-L-phenylalaninat
In einen mit einem Magnetrührer und einem Stickstoffeinlaß ausgerüsteten 250 ml-Rundkolben wurden 4,7 g Ethyl-2-iod-4-nitro-L-phenylalaninat, 125 ml 1,4-Dioxan und 2,2 ml Et₃N gegeben. Die Lösung wurde in einem Eis-Wasser-Bad gekühlt und mit 2,2 ml Benzylchlorformiat durch langsame Zugabe behandelt. Das Eisbad wurde entfernt und die Reaktionsmischung bei RT für 18 h gerührt. Die Mischung wurde filtriert und das Filtrat zur Trockene auf konzentriert. Der braune Rückstand wurde in EtOAc gelöst, mit 5%igem wäßrigem NaHCO₃ (4 × 75 ml) gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und im Vakuum auf konzentriert. Analyse des Rohprodukts durch DC (SiO₂, 75:25 Hexan:EtOAc) zeigte eine neue Hauptkomponente bei R_f = 0,35 und Nebenkomponenten bei R_f = 0,40 und 0,25. Das Produkt mit R_f = 0,35 wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel isoliert (75:25 Hexan:EtOAc). Dies lieferte 2,08 g (32%) Ethyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-2-iod-4-nitro-L-phenylalaninat als weißes Pulver, Smp. 85-87°C.
Beispiel 170
Ethyl-4-amino-2-cyclopentyl-L-phenylalaninat
Gemäß Beispiel 151 wurden 1,65 g Ethyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-2-iod-4-nitro-L-phenylalaninat der Heck-Kupplung mit 20 ml Cyclopenten unter Verwendung von 60 ml Toluol, 0,074 g Pd(OAc)₂, 0,20 g Tri-ortho-tolylphosphin und 0,51 ml Et₃N unterworfen. Die Reaktion wurde bei 110°C für 24 h durchgeführt. Analyse des Rohprodukts durch DC (SiO₂, 8:2 Hexan:EtOAc) zeigte ein Hauptprodukt bei R_f = 0,40 und Nebenkomponenten bei R_f = 0,38, 0,60 und 0,95 an. Das Material mit R_f = 0,40 wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel (8:2 Hexan:EtOAc) isoliert. Dies lieferte 1,03 g (71%) der gewünschten Olefin-Mischung als klare Flüssigkeit. Dieses Material wurde der katalytischen Hydrierung bei 45 psi für 18 h unter Verwendung von 55 ml McOH und 0,25 g 10% Pd(C) unterworfen. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie (SiO₂, 99:1 EtOAc:MeOH) gereinigt, um 0,56 g (61% für beide Schritte) Ethyl-4-amino-2-cyclopentyl-L-phenylalaninat als dickes transparentes Öl zu ergeben.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 6,72 (d, 1H, J=8,2, aromatisches CH), 6,5 (d, 1H, J=2,3, aromatisches CH), 6,29 (dd, 1H, J=8,1, 2,3, aromatisches CH), 4,80 (br s, 2H, aromatisches NH₂), 4,00 (q, 2H,J=7,1, Ethyl-CH₂), 3,12 (m, 1H, Cyclopentylmethin), 2,72 (m, 2H, ArCH₂), 2,03–1,37 (m, 10H, Cyclopentyl-CH₂, NH₂), 1,11 (t, 3H, J=7,1, Ethyl-CH₃).

Beispiel 171
Ethyl-2-cyclopentyl-L-tyrosinat
In einen mit einem Stickstoffeinlaß und einem Magnetrührer ausgerüsteten 500 ml-Dreihalskolben wurde eine Lösung aus 0,56 g Ethyl-4-amino-2-cyclopentyl-L-phenylalaninat in 60 ml 0,1 M wäßrigem H₂SO₄ gegeben. Nach Abkühlen auf 3°C wurde die Lösung mit einer Lösung aus 0,148 g Natriumnitrit (Aldrich) in 10 ml Wasser behandelt. Die Lösung wurde bei 3°C für 10 min gerührt und dann mit 95 ml 1,5 M wäßrigem CuSO₄ gefolgt von 0,25 g Cu₂O (Aldrich) behandelt. Die Mischung wurde für 35 min unter Rühren auf 45°C erwärmt. Eine Gasentwicklung war während dieses Zeitraums sichtbar. Die Mischung wurde auf RT abgekühlt und filtriert. Das blaue Filtrat wurde mit 1N wäßrigem NaOH auf pH = 5,5 behandelt. Die resultierende blaugrüne Suspension wurde in einen Trenntrichter überführt und mit CHCl₃ (5 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten CHCl₃-Extrakte wurden über MgSO₄ getrocknet und aufkonzentriert, um 0,12 g eines grünen Öls zu ergeben. Die blaugrüne Suspension wurde dann mit festem NaHCO₃ behandelt, bis die Gasentwicklung aufhörte, und mit CHCl₃ ein zweites Mal extrahiert (4 × 50 ml). Die vereinigten Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und unter Erhalt von 0,076 g eines Öls aufkonzentriert. Dieses Material wurde mit den ursprünglichen 0,12 g Produkt vereinigt und durch Flash-Chromatographie (SiO₂, 95:5 CH₂Cl₂:MeOH) gereinigt, um 0,168 g (30%) Ethyl-2-cyclopentyl-L-tyrosinat als dickes transparentes Öl zu liefern.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 9,07 (s, 1H, OH), 6,87 (d, 1H, J=8,2, aromatisches CH), 6,66 (d, 1H, J=2,4, aromatisches CH), 6,48 (dd; 1H, J=8,1, 2,4, aromatisches CH), 4,00 (q, 2H, J=7,1, Ethyl-CH₂), 3,16 (m, 1H, Cyclopentylmethin), 2,78 (m, 2H, ArCH₂), 2,05–1,32 (m, 10H, Cyclopentyl-CH₂, NH₂), 1,10 (t, 3H, J=7,1, Ethyl-CH₃).

Beispiel 172
Ethyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-2-cyclopentyl-L-tyrosinat
Gemäß Beispiel 145 wurden 0,153 g Ethyl-2-cyclopentyl-L-tyrosinat mit 0,171 g N-Cbz-L-glutaminsäure-γ-ethylester unter Verwendung 0,111 g EDC in 8 ml CH₂Cl₂ für 4,5 h gekuppelt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie zweimal an Kieselgel gereinigt (1:1 Hexan-EtOAc, 95:5 CH₂Cl₂:MeOH), um 0,245 g (78%) Ethyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-2-cyclopentyl-L-tyrosinat als farblosen Schaum zu liefern.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 9,09 (s, 1H, OH), 8,37 (d, 1H, J=7,3 NH), 7,33 (m, 6H, aromatisches CH, NH), 6,88 (d, 1H, J=8,4, aromatisches CH), 6,63 (s, 1H, aromatisches CH), 6,43 (d, 1H, J=8,3, aromatisches CH), 4,99 (m, 2H, PhCH₂O), 4,28 (m, 1H, Methin), 4,00 (m, 5H, Ethyl-CH₂, Methin), 3,09 (m, 1H, Cyclopentylmethin), 2,96 (m, 1H, ArCH₂), 2,83 (m, 1H, ArCH₂), 2,29 (t, 2H, J=7,9, Glu-4-CH₂), 2,02–1,53 (m, 8H, Glu-3-CH₂, Cyclopentyl-CH₂), 1,46 (m, 2H, Cyclopentyl-CH₂), 1,15 (t, 3H, J=7,1, Ethyl-CH₃), 1,04 (t, 3H, J=7,1, Ethyl-CH₃).

Beispiel 173
Ethyl-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-2-cyclopentyl-L-tyrosinat
Gemäß Beispiel 48 wurden 0,24 g Ethyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-2-cyclopentyl-L-tyrosinat unter Verwendung von 0,042 g 10% Pd(C) in 85 ml McOH hydrogenolysiert. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie gereinigt (SiO₂, 95:5 CH₂Cl₂:MeOH), um 0,154 g (84%) Ethyl-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-2-cyclopentyl-L-tyrosinat als dickes transparentes Öl zu liefern.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 9,08 (s, 1H, OH), 8,23 (d, 1H, J=7,9, NH), 6,87 (d, 1H, J=8,1, aromatisches CH), 6,63 (d, 1H, J=2,1, aromatisches CH), 6,44 (dd, 1H, J=8,1, 2,1, aromatisches CH), 4,31 (m, 1H, Methin), 4,00 (m, 4H, Ethyl-CH₂), 3,12 (m, 2H, Glu-Methin, Cyclopentylmethin), 2,98 (m, 1H, ArCH₂), 2,82 (m, 1H, ArCH₂), 2,27 (t, 2H, J=7,9, Glu-4-CH₂), 2,00-1,35 (m, 12H, Glu-3-CH₂, NH₂, Cyclopentyl-CH₂), 1,07 (t, 3H, J=7,1, Ethyl-CH₃), 1,16 (t, 3H, J=7,1, Ethyl-CH₃).

Beispiel 174
Ethyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methyl-amino)benzoyl)-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-2-cyclopentyl-L-tyrosinat
Gemäß Beispiel 49 wurden 0,131 g 4-(N-(2,4-Diamino-6-pteridinylmethyl)-N-methylamino)benzoesäure-hemihydrochloriddihydrat mit 0,15 g Ethyl-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-2-cyclopentyl-L-tyrosinat unter Verwendung 0,08 ml DECP und 0,10 ml Et₃N in 12 ml DMF gekuppelt. Das Rohprodukt wurde der Flash-Chromatographie zweimal an Kieselgel unterworfen (93:7 CH₂Cl₂:MeOH, 92:8 CH₂Cl₂:MeOH), um 0,134 g (52%) Ethyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-2-cyclopentyl-L-tyrosinat als gelbes Pulver zu liefern, Smp. 135–150°C.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 9,06 (s, 1H, OH), 8,54 (s, 1H, Pteridinyl-7-CH), 8,34 (d, 1H, J=7,4, Amid-NH), 7,96 (d, 1H, J=8,2, Amid-NH), 7,70 (d, 2H, J=8,6, aromatisches CH), 7,63 (br s, 1H, NH₂), 7,43 (br s, 1H, NH₂), 6,86 (d, 1H, J=8,4, aromatisches CH), 6,80 (d, 2H, J=8,9, aromatisches CH), 6,60 (m, 3H, aromatisches CH, NH₂), 6,40 (dd, 1H, J=8,2, 1,9, aromatisches CH), 4,77 (s, 2H, Pteridinyl-CH₂), 4,42 (m, 1H, Methin), 4,25 (m, 1H, Methin), 4,07–3,89 (m, 4H, Ethyl-CH₂), 3,19 (s, 3H, N-CH₃), 3,08 (m, 1H, Cyclopentylmethin), 2,94 (m, 1H, ArCH₂), 2,82 (m, 1H, ArCH₂), 2,31 (t, 2H, J=7,9, Glu-4-CH₂), 2,04–1,32 (m, 10H, Glu-3-CH₂, Cyclopentyl-CH₂), 1,13 (t, 3H, J=7,1, Ethyl-CH₃), 1,02 (t, 3H, J=7,1, Ethyl-CH₃).

Beispiel 175
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methyl-amino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-2-cyclopentyl-L-tyrosin
Eine Lösung aus 0,130 g Ethyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-ethyl-L-glutam-1-yl-2-cyclopentyl-L-tyrosinat in 10 ml 1:1 THF:H₂O wurde mit 17 mg LiOH behandelt und die Lösung bei RT unter Stickstoff gerührt. Die Hydrolyse wurde durch HPLC überwacht (C18, 70:30:0,1 H₂O:MeCN:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min). Eine zusätzliche 10 mg-Portion LiOH wurde nach 3 h hinzugegeben. Analyse durch HPLC (obige Bedingungen) 2 h nach der zweiten LiOH-Zugabe zeigte eine einzelne Komponente bei k'= 0,62 an. Die Lösung wurde durch Zugabe von 1N HCl neutralisiert. Ein gelber Niederschlag resultierte, der durch Zentrifugieren aufgefangen, mit 4 Durchläufen von wäßrigem Suspendieren-Zentrifugieren-Dekantieren gewaschen, eingefroren und lyophilisiert wurde, um 0,106 g (83%) N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methyl-amino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-2-cyclopentyl-L-tyrosin als gelbes Pulver zu liefern, Smp. 185°C (Zers.).

HPLC: ein Peak an C18, k' = 2,10, 75:25:0,1 H₂O:MeCN:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min.
¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 12,75–11,85 (br m, COOH), 9,03 (br s, 1H, OH), 8,56 (s, 1H, Pteridinyl-7-CH), 8,13 (d, 1H, J=7,9, Amid-NH), 7,96 (d, 1H, J=7,8, Amid-NH), 7,72 (br s, 1H, NH₂), 7,70 (d, 2H, J=8,7, aromatisches CH), 7,53 (br s, 1H, NH₂), 6,89 (d, 1H, J=8,4, aromatisches CH), 6,80 (m, 3H, aromatisches CH, NH₂), 6,69 (br s, 1H, NH₂), 6,60 (s, 1H, aromatisches CH), 6,38 (dd, 1H, J=8,3, 2,2, aromatisches CH), 4,78 (s, 2H, Pteridinyl-CH₂), 4,41 (m, 1H, Methin), 4,22 (m, 1H, Methin), 3,21 (s, 3H, N-CH₃), 3,12 (m, 1H, Cyclopentylmethin), 3,00 (dd, 1H, J=14,3, 5,3, ArCH₂), 2,76 (dd, 1H, J=14,3, 8,8, ArCH₂), 2,23 (t, 2H, J=7,9, Glu-4-CH₂), 2,05-1,30 (m, 10H, Glu-3-CH₂, Cyclopentyl-CH₂).

Elementaranalyse

Berechnet für C₃₄H₃₉N₉O₇·2,5 H₂O (MG 730,78): C, 55,88; H, 6,07; N 17,25; Gefunden: C, 55,91; H, 5,94; N 17,10. Massenspektrum: (Ionen-Spray) 686 (M+H)⁺. UV-Spektrum: (Puffer pH 7) λ_max (ε) 259,0 (25000), 308,2 (25500), 371,5 (7960). λ_min (ε) 242,3 (16000), 273,0 (17700), 346,8 (6350). sh (e) 220,9 (30100), 288,1 (21000).

Beispiel 176
tert-Butyl-3,5-diiod-L-tyrosinat
Eine Lösung aus 5,0 g 3,5-Diiod-L-tyrosin und 0,95 ml 70%igem wäßrigem HClO₄ in 155 ml tert-Butylacetat wurde bei RT unter Stickstoff für 4 Tage gerührt. Die Lösung wurde durch Zugabe von 150 ml 5%igem wäßrigem NaHCO₃ neutralisiert, und die Mischung wurde der Rotationsverdampfung zur Entfernung von tert-Butylacetat unterworfen. Ein cremefarbener Niederschlag resultierte, der durch Filtration aufgefangen und im Vakuum getrocknet wurde. Das Rohprodukt wurde der Flash-Chromatographie an Kieselgel unterworfen (97:3, CH₂Cl₂:MeOH), um 4,2 g (75%) tert-Butyl-3,5-diiod-L-tyrosinat als weißes Pulver zu liefern, Smp. 165–168°C.
Beispiel 177
tert-Butyl-N-(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3,5-diiod-L-tyrosinat
Gemäß Beispiel 145 wurden 1,50 g tert-Butyl-3,5-diiod-L-tyrosinat mit 1,31 g N-FMOC-L-Glutaminsäure-γ-tert-butylester unter Verwendung 0,62 g EDC in 45 ml CH₂Cl₂ für 3 h gekuppelt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (7:3, Hexan:EtOAc), um 1,78 g (65%) tert-Butyl-N-(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3,5-diiod-L-tyrosinat als hellbraunen Schaum zu liefern.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 9,41 (s, 1H, OH), 8,27 (d, 1H, J=7,0, NH), 7,91 (d, 2H, J=7,2, aromatisches CH), 7,75 (m, 2H, aromatisches CH), 7,61 (s, 2H, aromatisches CH), 7,57–7,28 (m, 5H, aromatisches CH, NH), 4,26 (m, 4H, Fluorenyl-CH₂O, Fluorenylmethin, α-Methin), 4,08 (m, 1H, α-Methin), 2,83 (d, 2H, J=7,4, ArCH₂), 2,25 (t, 2H, J=7,9, Glu-4-CH₂), 1,83 (br m, 2H, Glu-3-CH₂), 1,41 (s, 9H, t-Bu), 1,33 (s, 9H, t-Bu).

Beispiel 178
tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3,5-diiod-L-tyrosinat
Zu einer Lösung aus 1,66 g tert-Butyl-N-(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3,5-diiod-L-tyrosinat in 7 ml wasserfreiem DMF wurden 1,71 ml Piperidin (Sigma) gegeben. Nach Rühren bei RT unter Stickstoff für 1 h wurde die Lösung mit 75 ml Wasser vermischt und mit CH₂Cl₂ extrahiert. Die vereinigten CH₂Cl₂-Lösungen wurden mit wäßrigem NaCl (4 × 30 ml) gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum unter Erhalt eines weißen Feststoffs auf konzentriert. Analyse des Rohprodukts durch DC (SiO₂, 95:5 CH₂Cl₂:MeOH) zeigte neue Hauptkomponenten bei R_f = 0,4 und 0,5 an. Das Material mit R_f = 0,4 wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel isoliert (95:5 CH₂Cl₂:MeOH), um 1,1 g (87%) tert-Butyl-5-O-tert- butyl-L-glutam-1-yl-3,5-diiod-L-tyrosinat als weißen Schaum zu liefern, Smp. 45-57°C. Eine Probe des entsprechenden HCl-Salzes wurde für das NMR hergestellt durch Behandeln von 10 mg Produkt mit 1N etherischem HCl und Auf konzentrieren zur Trockene.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 9,42 (br s, 1H, OH), 8,98 (d, 1H, J=7,0, NH), 8,33 (br s, 3H, NH₃ ⁺), 7,67 (s, 2H, aromatisches CH), 4,36 (m, 1H, Methin), 3,88 (m, 1H, Methin), 2,86 (d, 2H, J=7,0, ArCH₂), 2,38 (m, 2H, Glu-4-CH₂), 2,01 (m, 2H, Glu-3-CH₂), 1,41 (s, 9H, t-Bu), 1,35 (s, 9H, t-Bu).

Beispiel 179
tert-Butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)-methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3,5-diiod-L-tyrosinat
Gemäß Beispiel 154 wurden 0,25 g tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3,5-diiod-L-tyrosinat mit 0,132 g 4-(N-(2,4-Diamino-6-pteridinylmethyl)-N-methylamino)benzoesäure-hemihydrochloriddihydrat unter Verwendung von 0,06 ml DECP, 0,07 ml Et₃N und 10 ml DMF gekuppelt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (95:5, CH₂Cl₂:MeOH), um 0,18 g (50%) tert-Butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3,5-diiod-L-tyrosinat als gelbes Pulver zu liefern, Smp. 172°C (Zers.).
Beispiel 180
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)-benzoyl)-L-glutam-1-yl-3,5-diiod-L-tyrosin
Gemäß Beispiel 50 wurden 0,119 g tert-Butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3,5-diiod-L-tyrosinat mit gasförmigem HCl in 15 ml CH₃NO₂ für 30 min behandelt. Die gelbe Suspension wurde im Vakuum zur Trockene aufkonzentriert. Analyse des Produkt durch ¹H-NMR und Umkehrphasen-HPLC zeigte das mit geringfügigen Verunreinigungen verunreinigte gewünschte Produkt an. Die Mischung wurde durch halbpräparative HPLC gereinigt (C18, 77:23:0,1 H₂O:MeCN:TFA). Reines Produkt enthaltende Fraktionen wurden vereinigt und der Rotationsverdampfung zum Entfernen von McCN unterworfen. Die resultierende Suspension wurde eingefroren und lyophilisiert, um 0,024 g (18%) N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3,5-diiod-L-tyrosin als gelbes Pulver zu liefern, Smp. 205°C (Zers.).

HPLC: ein Peak an C18, k' = 2,74, 77:23:0,1 H₂O:MeCN:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min.
¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 13,20–11,90 (br m, COOH), 9,35 (s, 1H, OH), 9,21 (br s, 1H, NH₂), 9,02 (br s, 1H, NH₂), 8,70 (s, 1H, Pteridinyl-7-CH), 8,52 (br s, 1H, NH₂), 8,13 (d, 1H, J=7,6, Amid-NH), 7,98 (d, 1H, J=7,9, Amid-NH), 7,72 (d, 2H, J=9,0, aromatisches CH), 7,57 (s, 2H, aromatisches CH), 7,51 (br s, 1H, NH₂), 6,80 (d, 2H, J=8,9, aromatisches CH), 4,86 (s, 2H, Pteridinyl-CH₂), 4,41 (m, 1H, Methin), 4,30 (m, 1H, Methin), 3,23 (s, 3H, N-CH₃), 2,81 (m, 2H, ArCH₂), 2,25 (t, 2H, J=7,6, Glu-4-CH₂), 1,90 (m, 2H, Glu-3-CH₂).

Elementaranalyse

Berechnet für C₂₉H₂₉N₉O₇I₂·1,2 TFA·2,3 H₂O (MG 1104,69): C, 35,23; H, 3,22; N 11,41; Gefunden: C, 35,25; H, 3,24; N 11,44. Massenspektrum: (Ionen-Spray) 870 (M+H)⁺. UV-Spektrum: (Puffer pH 7) λ_max (ε) 219,7 (48900), 258,0 (26500), 306,0 (262000), 373,3 (7780). λ_min (ε) 214,9 (48300), 246,0 (23700), 273,7 (18400), 347,6 (6200).

Beispiel 181
Methyl-4-hydroxy-3-iodbenzoat
In einen mit einem Magnetrührer, einem Thermometer und einem Kondensator ausgerüsteten 500 ml-Dreihalskolben wurden 10,0 g Methyl-4-hydroxybenzoat (Aldrich) und 30 ml Eisessig gegeben. Zu dieses Suspension wurde eine Lösung aus 11,74 g Iodmonochlorid in 30 ml Eisessig über einen Zugabetrichter gegeben. Die Lösung wurde für 1 h auf 80°C, für 18 h auf 45°C und für weitere 4 h auf 90°C erwärmt. Abkühlen auf RT lieferte eine dicke rot-orangefarbene Suspension, die in einen 1 l-Trenntrichter überführt und durch kräftiges Schütteln in 500 ml CHCl₃ gelöst wurde. Die dunkelviolette Lösung wurde mit Wasser (2 × 100 ml), gesättigtem wäßrigem Natriumthiosulfat (2 × 100 ml) und 5%igem wäßrigem NaHCO₃ (2 × 100 ml) gewaschen. Eine hellgelbe Lösung resultierte, die über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum unter Erhalt eines weißen Feststoffs auf konzentriert wurde.
Dieses Material wurde aus Wasser-MeOH umkristallisiert, um 14,92 g (82%) Methyl-4-hydroxy-3-iodbenzoat als weißen kristallinen Feststoff zu liefern, Smp. 145-146°C.
Beispiel 182
Methyl-4-hydroxy-3-cyclopentylbenzoat
Gemäß Beispiel 151 wurden 5,0 g Methyl-4-hydroxy-3-iodbenzoat der Heck-Kupplung mit 25 ml Cyclopenten unter Verwendung von 80 ml Toluol, 0,40 g Pd(OAc)₂, 1,10 g Tri-ortho-tolylphosphin und 2,76 ml Et₃N unterworfen. die Reaktion wurde bei 110°C für 24 h durchgeführt. Analyse des Rohprodukts durch DC (SiO₂, 72:25 Hexan:EtOAc) zeigte eine neue Hauptkomponente bei R_f = 0,50 an. Dieses Material wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel isoliert (75:25 Hexan:EtOAc). Dies ergab 2,97 g (76%) der gewünschten Olefin-Mischung (¹H-NMR) als braunen Feststoff. Dieses Material wurde der katalytischen Hydrierung bei 45 psi für 18 h unter Verwendung von 80 ml McOH und 1,0 g 10% Pd(C) unterworfen. Dies lieferte 2,59 g (65% für beide Schritte) Methyl-4-hydroxy-3-cyclopentylbenzoat als weißen Feststoff, Smp. 114-116°C.
Beispiel 183
Methyl-4-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)-3-cyclopentyl-benzoat
Ein mit einem Magnetrührer und einem Stickstoffeinlaß ausgerüsteter 100 ml-Dreihalskolben wurde mit 1,79 g Methyl-4-hydroxy-3-cyclopentylbenzoat, 1,22 g Imidazol (Aldrich), 30 ml wasserfreiem DMF und 1,47 g tert-Butyldimethylsilylchlorid (Aldrich) gefüllt. Die Lösung wurde bei RT unter Stickstoff für 24 h gerührt und dann im Vakuum unter Erhalt eines dicken Öls aufkonzentriert. Dieses Material wurde der Flash-Chromatographie an Kieselgel unterworfen (95:5, Hexan:EtOAc), um 2,43 g (89%) Methyl-4-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)-3-cyclopentylbenzoat als klare Flüssigkeit zu liefern.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 7,81 (d, 1H, J=2,0, aromatisches CH), 7,72 (dd, 1H, J=8,4, 2,0, aromatisches CH), 6,93 (d, 1H, J=8,4, aromatisches CH), 3,80 (s, 3H, CH₃), 3,30 (m, 1H, Cyclopentylmethin), 2,06–1,37 (m, 8H, Cyclopentyl-CH₂), 0,98 (s, 9H, t-Bu), 0,27 (s, 6H, SiMe2).

Beispiel 184
4-((tert-Butyldimethylsilyl)oxy)-3-cyclopentylbenzylalkohol
In einen mit einem Magnetrührer und einem Stickstoffeinlaß ausgerüsteten 100 ml-Dreihalskolben wurden 2,58 g Methyl-4-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)-3-cyclopentylbenzoat und 15 ml wasserfreies Toluol gegeben. Die Lösung wurde in einem Eis-Wasser-Bad abgekühlt und mit 19,3 ml 1M Diisobutylaluminiumhydrid in Toluol (Aldrich) behandelt. Die Lösung wurde bei 0°C für 30 min gerührt und auf RT erwärmen gelassen. Nach 2 h bei RT wurde die Lösung in 130 ml gesättigtes wäßriges Kaliumnatriumtartrat gegossen und die resultierende Mischung für 20 min gerührt. Die Mischung wurde dann mit Diethylether (3 × 70 ml) extrahiert. Die vereinigten Ether-Extrakte wurden mit Wasser (3 × 70 ml) gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und unter Erhalt eines trüben Öls aufkonzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (8:2, Hexan:EtOAc), um 1,94 g (82%) 4-((tert-Butyldimethylsilyl)oxy)-3-cyclopentylbenzylalkohol als klare Flüssigkeit zu liefern.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 7,18 (d, 1H, J=2,0, aromatisches CH), 7,02 (dd, 1H, J=8,2, 2,2, aromatisches CH), 6,76 (d, 1H, J=8,0, aromatisches CH), 5,02 (t, 1H, J=5,8, OH), 4,40 (d, 2H, J=5,6, ArCH₂O), 3,29 (m, 1H, Cyclopentylmethin), 2,04–1,38 (m, 8H, Cyclopentyl-CH₂), 1,03 (s, 9H, t-Bu), 0,22 (s, 6H, SiMe₂).

Beispiel 185
4-((tert-Butyldimethylsilyl)oxy)-3-cyclopentyl-benzaldehyd
Eine Lösung aus 1,94 g 4-((tert-Butyldimethylsilyl)oxy)-3-cyclopentylbenzylalkohol in 70 ml wasserfreiem CH₂Cl₂ wurde mit 2,05 g Pyrimidiniumchlorchromat (Aldrich) behandelt und bei RT unter Stickstoff gerührt. Nach 30 min zeigte TC (SiO₂, 85:15 Hexan:EtOAc) keinen verbleibenden Ausgangsstoff und eine neue Hauptkomponente bei R_f = 0,80. Die Mischung wurde zur Entfernung von Feststoffen filtriert, und das Filtrat wurde mit 5%iger wäßriger Zitronensäure (4 × 50 ml) gefolgt von 5%igem wäßrigem NaHCO₃ (4 × 50 ml) gewaschen. Die CH₂Cl₂-Lösung wurde über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und im Vakuum unter Erhalt eines braunen Öls aufkonzentriert. Dieses Material wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (9:1 Hexan:EtOAc), um 1,52 g (79%) 4-((tert-Butyldimethylsilyl)oxy)-3-cyclopentylbenzaldehyd als klares Ö1 zu liefern.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 9,88 (s, 1H, Aldehyd-CH), 7,80 (d, 1H, J=2,0, aromatisches CH), 7,69 (dd, 1H, J=8,2, 2,0, aromatisches CH), 7,03 (d, 1H, J=8,3, aromatisches CH), 3,29 (m, 1H, Cyclopentylmethin), 2,08-1,43 (m, 8H, Cyclopentyl-CH₂), 1,01 (s, 9H, t-Bu), 0,30 (s, 6H, SiMe₂).

Beispiel 186
tert-Butyl-trans-4-(((tert-butyldimethylsilyl)oxy)-3-cyclopentylcinnamat
In einen mit einem Magnetrührer, einem Stickstoffeinlaß und einem Rückflußkondensator ausgerüsteten 100 ml-Dreihalskolben wurden 1,57 g tert-Butyldiethylphosphonoacetat (Aldrich) und 20 ml wasserfreier Ethylether gegeben. Diesem folgte die Zugabe von 0,40 g 60%iger NaH-Mineralöl-Dispersion. Die resultierende trübe Lösung wurde für 25 min im Rückfluß erwärmt, auf 0°C abgekühlt und mit einer Lösung aus 1,52 g 4-((tert-Butyldimethylsilyl)oxy)-3-cyclopentylbenzaldehyd in 10 ml Ether behandelt. Ein dickes gelbes Gel resultierte, das mit einem Spatel aufgebrochen wurde. Die Mischung wurde auf RT erwärmen gelassen, und das Rühren wurde für eine weitere Stunde fortgesetzt. Analyse durch DC (SiO₂, 95:5, Hexan:EtOAc) zeigte eine neue Hauptkomponente bei R_f = 0,48 und Nebenkomponenten bei R_f = 0,06, 0,41 und 0,98 an. Die Mischung wurde mit 70 ml Ether verdiinnt, mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen und über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet. Das Trocknungsmittel wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat unter Erhalt eines gelben Öls aufkonzentriert. Dieses Material wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (97:3 Hexan:EtOAc), um 1,53 g (77%) tert-Butyl-trans-4-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)-3-cyclopentylcinnamat als klares Öl zu liefern.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 7,59–7,36 (m, 3H, aromatisches CH, olefinisches CH), 6,83 (d, 1H, J=8,4, aromatisches CH), 6,38 (d, 1H, J=15,8, olefinisches CH), 3,27 (m, 1H, Cyclopentylmethin), 2,02–1,52 (m, 8H, Cyclopentyl-CH₂), 1,49 (s, 9H, t-Bu), 1,00 (s, 9H, Si-t-Bu), 0,25 (s, 6H, SiMe₂).

Beispiel 187
(2R,3S)-tert-Butyl-3-(4-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)-3-cyclopentylphenyl)-2,3-dihydroxypropionat
In einen mit einem Magnetrührer und einem Stickstoffeinlaß ausgerüsteten 250 ml-Dreihalskolben wurden 20 ml tert-Butylalkohol, 20 ml Wasser, 5,32 g AD-Mix-α (K.B. Sharpless et al., J. Org. Chem., 1992, 57, 2768-2771; Reagens erworben von Aldrich) und 0,36 g Methansulfonamid (Aldrich) gegeben. Diesem folgte die Zugabe von 1,53 g tert-Butyl-trans-4-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)-3-cyclopentylcinnamat. Die Reaktionsmischung wurde bei RT unter Stickstoff gerührt. Nach 18 h wurden 5,7 g Natriumsulfit hinzugegeben, und die Mischung wurde für 30 min gerührt. Die Mischung wurde im Vakuum auf 15 ml auf konzentriert, mit 100 ml Wasser verdiinnt und mit EtOAc (4 × 50 ml) extrahiert. Die vereinigten EtOAc-Extrakte wurden mit Wasser gewaschen (3 × 50 ml), über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und unter Erhalt eines trüben Öls auf konzentriert. Dieses Material wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (75:25 Hexan:EtOAc), um 1,44 g (87%) tert-Butyl-(2R,3S)-3-(4-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)-3-cyclopentylphenyl)-2,3-dihydroxypropionat als dickes klares Öl zu liefern.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 7,16 (s, 1H, aromatisches CH), 7,01 (d, 1H, J=8,2, aromatisches CH), 6,73 (d, 1H, J=8,2 aromatisches CH), 5,28 (d, 1H, J=5,4, OH), 5,25 (d, 1H, J=7,1, OH), 4,55 (t, 1H, J=5,6, Propionat-2-methin), 3,93 (t, 1H, J=6,8, Propionat-3-Methin), 3,27 (m, 1H, Cyclopentylmethin), 2,04–1,37 (m, 8H, Cyclopentyl-CH₂), 1,24 (s, 9H, t-Bu), 0,99 (s, 9H, Si-t-Bu), 0,21 (s, 6H, SiMe₂).

Beispiel 188
(R)-tert-Butyl-3-(4-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)-3-cyclopentylphenyl)-2-hydroxypropionat
In eine 300 ml-Parr-Flasche wurden 0,35 g 10% Pd(C) und 20 ml tert-Butylalkohol unter einer Stickstoffspülung gegeben. Zu diesem wurde eine Lösung aus 1,42 g tert-Butyl-(2R,3S)-3-(4-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)-3-cyclopentylphenyl)-2,3-dihydroxypropionat in 40 ml tert-Butylalkohol gegeben. Die Mischung wurde durch Hindurchblasen von Stickstoff für 5 min desoxygeniert, während die Flasche vorsichtig erwärmt wurde, um das Gefrieren von tert-Butylalkohol zu verhindern. Die Mischung wurde mit 4 Tropfen konzentriertem HClO₄ behandelt und bei 45 psi und 40°C 72 h hydriert. Das Gefäß wurde mit Stickstoff gespült, der Katalysator durch Filtration durch Celite entfernt und das Filtrat im Vakuum auf 20 ml auf konzentriert. Die Lösung wurde mit 60 ml 5%igem wäßrigem NaHCO₃ vermischt und die Mischung mit EtOAc extrahiert (4 × 40 ml). Die vereinigten EtOAc-Extrakte wurden mit 5%igem wäßrigem NaHCO₃ (3 × 50 ml) gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und unter Erhalt eines trüben Öls auf konzentriert. Dieses Material wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (9:1 Hexan:EtOAc), um 1,17 g (86%) tert-Butyl-(R)-3-(4-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)-3-cyclopentylphenyl)-2-hydroxypropionat als dickes transparentes Öl zu liefern.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 7,05 (d, 1H, J=2,1, aromatisches CH), 6,92 (dd, 1H, J=8,4, 2,1, aromatisches CH), 6,69 (d, 1H, J=8,2, aromatisches CH), 5,33 (d, 1H, J=5,7, OH), 4,08 (m, 1H, Methin), 3,23 (m, 1H, Cyclopentylmethin), 2,78 (d, 2H, J=6,1, ArCH₂), 2,00–1,38 (m, 8H, Cyclopentyl-CH₂), 1,32 (s, 9H, t-Bu), 0,99 (s, 9H, Si-t-Bu), 0,20 (s, 6H, SiMe₂).

Beispiel 189
(S)-tert-Butyl-2-((N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl)oxy)-3-(4-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)-3-cyclopentyl-phenyl)propionat
In einen mit einem Magnetrührer und Stickstoffeinlaß ausgerüsteten 100 ml-Dreihalskolben wurden 1,14 g tert-Butyl-(R)-3-(4-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)-3-cyclopentylphenyl)-2-hydroxypropionat, 20 ml wasserfreies THF, 1,01 g N-Cbz-1-glutaminsäure-γ-tert-butylester (Sigma) und 0,78 g Triphenylphosphin (Aldrich) gegeben. Die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt und mit 0,47 ml Diethylazodicarboxylat (Aldrich) durch tropfenweise Zugabe behandelt. Die Lösung wurde auf RT erwärmen gelassen und das Rühren unter Stickstoff fortgesetzt. Nach 3,5 h zeigte DC (SiO₂, 82:15 Hexan:EtOAc) eine neue Hauptkomponente bei R_f = 0,46 und etwas verbliebenes Alkohol-Ausgangsmaterial bei R_f = 0,51 an. Die Lösung wurde erneut auf 0°C abgekühlt und mit weiteren 0,18 g N-Cbz-L-glutaminsäure-γ-tert-butylester, 0,14 g Triphenylphosphin und 0,085 ml Diethylazodicarboxylat behandelt. Nach Erwärmen auf RT und Rühren für 18 h zeigte DC nur eine Spur des Ausgangsmaterials an. Die Lösung wurde im Vakuum zur Trockene aufkonzentriert und das Rohprodukt durch Flash-Chromatographie gereinigt (SiO₂, 85:15, Hexan:EtOAc). Dies lieferte 1,86 g (84%) (S)-tert-Butyl-2-((N- ((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl)oxy)-3-(4-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)-3-cyclopentylphenyl)propionat als dickes transparentes Öl.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 7,76 (d, 1H, J=8,0, NH), 7,34 (m, 5H, aromatisches CH), 7,11 (s, 1H, aromatisches CH), 6,96 (d, 1H, J=8,1, aromatisches CH), 6,68 (d, 1H, J=8,1, aromatisches CH), 5,01 (m, 3H, PhCH₂O, Propionatmethin), 4,19 (m, 1H, Glu-Methin), 3,21 (m, 1H, Cyclopentylmethin), 3,01 (d, 2H, J=5,1, ArCH₂), 2,32 (t, 2H, J=7,8, Glu-4-CH₂), 2,12–1,43 (m, 10H, Glu-3-CH₂, Cyclopentyl-CH₂), 1,39 (s, 9H, t-Bu), 1,26 (s, 9H, t-Bu), 0,98 (s, 9H, Si-t-Bu), 0,19 (s, 9H, SiMe₂).

Beispiel 190
(S)-tert-Butyl-2-((N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl)oxy)-3-(3-cyclopentyl-4-hydroxyphenyl)propionat
Eine Lösung aus 1,85 g (S)-tert-Butyl-2-((N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl)oxy)-3-(4-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)-3-cyclopentylphenyl)propionat in 20 ml wasserfreiem THF wurde mit 2,63 ml 1M Tetrabutylammoniumfluorid/THF (Aldrich) behandelt und bei 0°C unter Stickstoff gerührt. Nach 15 min zeigte DC (SiO₂, 75:25 Hexan:EtOAc) kein verbleibendes Ausgangsmaterial und eine neue Komponente bei R_f = 0,41 an. Die Lösung wurde mit 80 ml Wasser vermischt und mit EtOAc (4 × 40 ml) extrahiert. Die vereinigten EtOAc-Extrakte wurden mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen (3 × 60 ml), über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und im Vakuum unter Erhalt eines klaren Öls aufkonzentriert. Dieses Material wurde der Flash-Chromatographie an Kieselgel unterworfen (75:25 Hexan:EtOAc), um 1,5 g (96%) (S)-tert-Butyl-2-((N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl)oxy)-3-(3-cyclopentyl-4-hydroxyphenyl)propionat als weißen Schaum zu liefern.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 9,11 (s, 1H, OH), 7,77 (d, 1H, J=8,2, NH), 7,33 (m, 5H, aromatisches CH), 7,01 (d, 1H,J=1,6 aromatisches CH), 8,85 (dd, 1H, J=8,2, 1,7, aromatisches CH), 6,68 (d, 1H, J=8,2, aromatisches CH), 5,04 (s, 2H, PhCH₂O), 4,97 (m, 1H, Propionatmethin), 4,18 (m, 1H, Glu-Methin), 3,17 (m, 1H, Cyclopentylmethin), 2,96 (d, 2H, J=6,0, ArCH₂), 2,34 (t, 2H, J=7,4, Glu-4-CH₂), 2,13–1,43 (m, 10H, Glu-3-CH₂, Cyclopentyl-CH₂), 1,40 (s, 9H, t-Bu), 1,29 (s, 9H, t-Bu).

Beispiel 191
(S)-tert-Butyl-2-((5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl)oxy)-3-(3-cyclopentyl-4-hydroxyphenyl)propionat
Gemäß Beispiel 48 wurden 1,49 g (S)-tert-Butyl-2-((N-((benzyloxy)-carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl)oxy)-3-(3-cyclopentyl-4-hydroxyphenyl)propionat unter Verwendung von 0,24 g 10% Pd(C) in 70 ml McOH hydrogenolysiert. Analyse des Rohprodukts durch DC (SiO₂, 4:6 Hexan:EtOAc) zeigte eine neue Hauptkomponente bei R_f = 0,47 und Nebenkomponenten bei R_r = 0,60 und 0,15 an. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (4:6 Hexan:EtOAc), um 0,76 g (65%) (S)-tert-Butyl-2-((5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl)oxy)-3-(3-cyclopentyl-4-hydroxyphenyl)-propionat als weißen Schaum zu liefern.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 9,12 (s, 1H, OH), 7,00 (s, 1H, aromatisches CH), 6,86 (d, 2H, J=8,2, aromatisches CH), 6,68 (d, 1H, J=8,2, aromatisches CH), 4,92 (t, 1H, J=6,2, Propionatmethin), 4,04 (q, 1H, J=7,0, Glu-Methin), 3,19 (m, 1H, Cyclopentylmethin), 2,95 (d, 2H, J=6,4, ArCH₂), 2,33 (t, 2H, J=7,4, Glu-4-CH₂), 2,00–1,48 (m, 12H, Glu-3-CH₂, NH₂, Cyclopentyl-CH₂), 1,39 (s, 9H, t-Bu), 1,31 (s, 9H, t-Bu).

Beispiel 192
(S)-tert-Butyl-3-(3-cyclopentyl-4-hydroxyphenyl)-2-((5-O-tert-butyl-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl)oxy)propionat
Gemäß Beispiel 154 wurden 0,414 g (S)-tert-Butyl-2-((5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl)oxy)-3-(3-cyclopentyl-4-hydroxyphenyl)propionat mit 0,32 g 4-(N-(2,4-Diamino-6-pteridinylmethyl)-N-methylamino)benzoesäure-hemihydrochloriddihydrat unter Verwendung 0,19 ml DECP, 0,23 ml Et₃N und 25 ml DMF gekuppelt. Das Rohprodukt wurde der Flash-Chromatographie zweimal an Kieselgel unterworfen (14:14:1 CH₂Cl₂:Aceton:MeOH; 95:5 → 91:9 CH₂Cl₂:MeOH), um 0,46 g (69%) (S)-tert-Butyl-3-(3-cyclopentyl-4-hydroxy-phenyl)-2-((5-O-tert-butyl-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)-methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl)oxy)propionat als gelbes Pulver zu liefern, Smp. 135–137°C.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 9,07 (s, 1H, OH), 8,55 (s, 1H, Pteridinyl-7-CH), 8,30 (d, 1H, J=7,6, Amid-NH), 7,71 (d, 2H, J=8,6, aromatisches CH), 7,64 (br s, 1H, NH₂), 7,42 (br s, 1H, NH₂), 6,97 (d, 1H, J=1,6, aromatisches CH), 6,80 (m, 3H, aromatisches CH), 6,59 (m, 3H, aromatisches CH, NH₂), 4,92 (t, 1H, J=6,1, Propionatmethin), 4,77 (s, 2H, Pteridinyl-CH₂), 4,49 (m, 1H, Glu-Methin), 3,19 (s, 3H, N-CH₃), 3,12 (m, 1H, Cyclopentylmethin), 2,93 (m, 2H, ArCH₂), 2,33 (t, 2H, J=7,2, Glu-4-CH₂), 2,08 (m, 1H, Glu-3-CH₂), 1,87 (m, 3H, Glu-3-CH₂, Cyclopentyl-CH₂), 1,77–1,40 (m, 6H, Cyclopentyl-CH₂), 1,36 (s, 9H, t-Bu), 1,25 (s, 9H, t-Bu).

Beispiel 193
(S)-3-(3-Cyclopentyl-4-hydroxyphenyl)-2-((N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl)oxy)-propionsäure
Gemäß Beispiel 50 wurden 0,43 g (S)-tert-Butyl-3-(3-cyclopentyl-4-hydroxyphenyl)-2-((5-O-tert-butyl-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)-methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl)oxy)propionat mit gasförmigem HCl in 50 ml CH₃NO₂ für 45 min behandelt. Die gelbe Suspension wurde im Vakuum zur Trockene aufkonzentriert. Das Produkt wurde in 25 ml Wasser suspendiert und mit ausreichend 1N wäßrigem NaOH behandelt, um eine vollständige Lösung zu ergeben. Die Lösung wurde filtriert und der pH durch Zugabe von 1N HCl auf 5,5 eingestellt. Ein gelber Niederschlag resultierte, der durch Zentrifigieren abgetrennt, mit vier Durchläufen von wäßrigem Suspendieren-Zentrifugieren-Dekantieren gewaschen, eingefroren und lyophilisiert wurde, um 0,345 g (88%) (S)-3-(3-Cyclopentyl-4-hydroxyphenyl)-2-((N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl)oxy)-propionsäure als gelb-orangefarbenes Pulver zu liefern, Smp. 165°C (Zers.).

HPLC: ein Hauptpeak an C18, k' = 2,02; 3,6% Methotrexat wurde bei k' = 0,09 nachgewiesen; 70:30:0,1 H₂O:MeCN:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min.
¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ:12,40–11,90 (br s, COOH), 9,03 (br s, 1H, OH), 8,57 (s, 1H, Pteridinyl-7-CH), 8,27 (d, 1H, J=7,6, Amid-NH), 7,86 (br s, 1H, NH₂), 7,70 (d, 2H, J=8,9, aromatisches CH), 7,65 (br s, 1H, NH₂), 6,97 (d, 1H, J=1,6, aromatisches CH), 6,80 (m, 5H, NH₂, aromatisches CH), 6,61 (d, 1H, J=8,2, aromatisches CH), 4,96 (t, 1H, J=5,9, Methin), 4,78 (s, 2H, Pteridinyl-CH₂), 4,49 (m, 1H, Methin), 3,19 (s, 3H, N-CH₃), 3,16 (m, 1H, Cyclopentylmethin), 2,94 (d, 2H, J=5,8, ArCH₂), 2,34 (t, 2H, J=7,5, Glu-4-CH₂), 2,10 (m, 1H, Glu-3-CH₂), 1,87 (m, 3H, Glu-3-CH₂, Cyclopentyl-CH₂), 1,78–1,40 (m, 6H, Cyclopentyl-CH₂).

Elementaranalyse

Berechnet für C₃₄H₃₈N₈O₉·2,1 H₂O·(MG 724,56): C, 56,36; H, 5,87; N 15,47; Gefunden: C, 56,13; H, 5,59; N 15,46. Massenspektrum: (Ionen-Spray) 687 (M+H)⁺. UV-Spektrum: (Puffer pH 7) λ_max (ε) 259,2 (23100), 307,3 (23300), 372,4 (7190). λ_min (ε) 242,0 (14300), 272,9 (16900), 343,6 (5460). sh (e) 219,8 (26400), 280,7 (19900).

Beispiel 194
Methyl-3-tert-butyl-4-hydroxybenzoat
In einen mit einem Magnetrührer, einem Stickstoffeinlaß und einem Kondensator ausgerüsteten 500 ml-Dreihalskolben wurden 10,0 g 3-tert-Butyl-4-hydroxybenzoesäure (ICN Biomedicals, Inc., Aurora, Ohio 44202) und 200 ml McOH gegeben. Die Lösung wurde durch Hindurchblasen von HCl-Gas für 5 min angesäuert und dann für 5 h zum Rückfluß erwärmt. Die Lösung wurde auf RT abgekühlt und im Vakuum zur Trockene auf konzentriert. Der resultierende Feststoff wurde in EtOAc gelöst. Die Lösung wurde dreimal mit 5%igem wäßrigem NaHCO₃ gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und zur Trockene auf konzentriert, um 9,65 g (90%) Methyl-3-tert-butyl-4-hydroxybenzoat als weißen kristallinen Feststoff zu liefern, Smp. 144-145°C.
Beispiel 195
Methyl-3-tert-butyl-4-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)-benzoat
Gemäß Beispiel 183 wurden 5,00 g Methyl-3-tert-butyl-4-hydroxybenzoat unter Verwendung von 4,34 g tert-Butyldimethylsilylchlorid, 3,59 g Imidazol und 70 ml wasserfreiem DMF silyliert. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (9:1 Hexan:EtOAc), um 6,1 g (79%) Methyl-3-tert-butyl-4-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)benzoat als klare Flüssigkeit zu liefern.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 7,89 (d, 1H, J=2,3, aromatisches CH), 7,76 (dd, 1H, J=8,5, 2,3, aromatisches CH), 6,98 (d, 1H, J=8,4 aromatisches CH), 3,82 (s, 3H, CO₂CH₃), 1,37 (s, 9H, t-Bu), 1,03 (s, 9H, Si-t-Bu), 0,37 (s, 6H, SiMe₂).

Beispiel 196
3-tert-Butyl-4-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)benzylalkohol
Gemäß Beispiel 184 wurden 5,00 g Methyl-3-tert-butyl-4-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)benzoat unter Verwendung von 31,8 ml 1M Diisobutylaluminiumhydrid/Toluol und 50 ml wasserfreiem Toluol reduziert. Analyse der Reaktionsmischung durch DC nach 30 min zeigte etwas verbliebenes Ausgangsmaterial an. Zur Sicherstellung einer vollständigen Reduktion wurden weitere 5 ml 1M Diisobutylaluminiumhydrid/Toluol hinzugegeben und die Reaktion für weitere 5 min fortschreiten gelassen. Aufarbeitung in der gewöhnlichen Weise lieferte 4,11 g (90%) 3-tert-Butyl-4-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)benzylalkohol als trübes Öl. Das Produkt wurde ohne weitere Reinigung verwendet.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 7,20 (d, 1H, J=2,0, aromatisches CH), 7,04 (dd, 1H, J=8,2, 2,1, aromatisches CH), 6,80 (d, 1H, J=8,0, aromatisches CH), 5,01 (t, 1H, J=5,7, OH), 4,39 (d, 2H, ArCH₂O), 1,36 (s, 9H, t-Bu), 1,02 (s, 9H, Si-t-Bu), 0,32 (s, 6H, SiMe₂).

Beispiel 197
3-tert-Butyl-4-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)benzylbromid
Ein mit einem Magnetrührer ausgerüsteter 500 ml-Rundkolben wurde mit 3,6 g 3-tert-Butyl-4-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)benzylalkohol und 25 ml wasserfreiem CH₂Cl₂ gefüllt. Die Lösung wurde in einem Eisbad abgekühlt und mit 5,68 g Dibromtriphenylpholsphoran (Aldrich) behandelt. Die Reaktionsmischung wurde auf RT erwärmt, für 2,5 h gerührt und dann mit 100 ml CH₂Cl₂ verdünnt. Die resultierende Lösung wurde mit 5%igem wäßrigem NaHCO₃ (4 × 60 ml) gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und unter Erhalt eines weißen Feststoffs aufkonzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (95:5, Hexan:EtOAc), um 3,86 g (88%) 3-tert-Butyl-4-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)benzylbromid als weißen kristallinen Feststoff zu liefern, Smp. 54-55°C.
Beispiel 198
tert-Butyl-(2R,3S,5S)-6-oxo-2,3-diphenyl-5-(3-tert-butyl-4-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)benzyl)-4-morpholincarboxylat
Gemäß Beispiel 142 wurden 3,82 g tert-Butyl-(2R,3S)-(–)-6-oxo-2,3-diphenyl-4-morpholincarboxylat mit 3,86 g 3-tert-Butyl-4-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)benzylbromid in 80 ml wasserfreiem THF unter Verwendung von 11,34 ml 1M Natriumbis(trimethylsilyl)amid in THF alkyliert. Das Rohprodukt wurde der Flash-Chromatographie an Kieselgel unterworfen (85:15 Hexan:EtOAc), um 4,85 g (71%) tert-Butyl-(2R,3S,5S)-6-oxo-2,3-diphenyl-5-(3-tert-butyl-4-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)benzyl)-4-morpholincarboxylat als weißen Schaum zu liefern, Smp. 75-83°C.
Beispiel 199
(2R,3S,5S)-6-Oxo-2,3-diphenyl-5-(3-tert-butyl-4-hydroxybenzyl)morpholin
In einen mit einem Stickstoffeinlaß und einem Magnetrührer ausgerüsteten 250 ml-Dreihalskolben wurden 4,51 g tert-Butyl-(2R,3S,5S)-6-oxo-2,3-diphenyl-5-(3-tert-butyl-4-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)benzyl)-4-morpholincarboxylat und 50 ml wasserfreies THF gegeben. Die Lösung wurde in einem Eis-Wasser-Bad abgekühlt, mit 7,51 ml 1M nBu₄NF/THF (Aldrich) behandelt und dann unter Rühren unter Stickstoff auf RT erwärmen gelassen. Nach 1,5 h zeigte DC (SiO₂, 85:15 Hexan:EtOAc) kein verbliebenes Ausgangsmaterial und eine neue einzelne Komponente bei R_f = 0,52 an. Die Lösung wurde mit 125 ml EtOAc verdünnt, mit Wasser (4 × 100 ml) gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und unter Erhalt eines dicken klaren Öls aufkonzentriert. Massenspektrale Analyse (APCI) zeigte die gewünschte Zwischenstufe mit m/e = 538 (M+H+Na)⁺ an. Das Öl wurde in 50 ml CH₂Cl₂ gelöst und die Lösung mit 15 ml TFA behandelt. Nach Rühren für 40 min zeigte DC (SiO₂, 65:35 Hexan:EtOAc) eine neue einzelne Komponente bei R_f = 0,36 an. Die Lösung wurde durch Zugabe von gesättigtem wäßrigem NaHCO₃ neutralisiert. Die Mischung wurde in einen Trenntrichter überführt und die Schichten getrennt. Die CH₂Cl₂-Lösung wurde mit zusätzlichem gesättigtem NaHCO₃ (3 × 50 ml) gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum unter Erhalt eines klaren Schaums auf konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie gereinigt (SiO₂, 7:3 Hexan-EtOAc), um 2,66 g (89%) (2R,3S,5S)-6-Oxo-2,3-diphenyl-5-(3-tert-butyl-4-hydroxybenzyl)morpholin als weißen Schaum zu liefern, Smp. 76–80°C.
Beispiel 200
3-tert-Butyl-L-tyrosin
In eine 300 ml-Parr-Flasche wurden 0,73 g PdCl₂ und 20 ml 1:1 THF:EtOH gegeben. Zu diesem wurde eine Lösung aus 2,43 g (2R,3S,5S)-6-Oxo-2,3-diphenyl-5-(3-tert-butyl-4-hydroxybenzyl)morpholin in 80 ml 1:1 THF·EtOH gegeben. Die Mischung wurde durch Hindurchblasen von Stickstoff für 10 min desoxygeniert und bei 45 psi für 18 h hydriert. Das Gefäß wurde mit Stickstoff gespült, der Katalysator durch Filtration entfernt und das Filtrat im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde zwischen Wasser und Hexan aufgetrennt. Die wäßrige Lösung wurde mit vier zusätzlichen 50 ml-Portionen Hexan gewaschen, einer kurzen Rotationsverdampfung zur Entfernung von verbliebenem Hexan unterworfen, eingefroren und lyophilisiert, um 1,47 g (92%) 3-tert-Butyl-L-tyrosin·HCl als braunen hygroskopischen Feststoff zu liefern.

¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 9,40 (br s, 1H, OH), 8,36 (br s, 3H, NH₃ ⁺), 7,04 (s, 1H, aromatisches CH), 6,91 (d, 1H, J=8,2, aromatisches CH), 6,78 (d, 1H, J=8,2 aromatisches CH), 4,05 (m, 1H, Methin), 3,02 (d, 2H, J=5,6, ArCH₂), 1,34 (s, 9H, t-Bu).

Beispiel 201
tert-Butyl-3-tert-butyl-L-tyrosinat
In einen mit einem Magnetrührer ausgerüsteten 250 ml-Rundkolben wurden 30 ml Isobutylen (kondensiert bei –78°C), 1,30 g 3-tert-Butyl-L-tyrosin·HCl, 60 ml 1,4-Dioxan und 0,5 ml konzentriertes H₂SO₂ gegeben. Der Kolben wurde mit einer Gummimembran versiegelt und mit Draht verschlossen. Nach Rühren bei RT für 18 h wurde der Kolben belüftet und der Inhalt in eine Lösung aus 10 g NaHCO₃ in 150 ml Wasser gegossen. Die Mischung wurde der Rotationsverdampfung zur Entfernung von Isobutylen unterworfen. Eine Emulsion resultierte, die mit EtOAc extrahiert wurde (4 × 40 ml). Die vereinigten Extrakte wurden mit 5%igem wäßrigem NaHCO₃ (3 × 50 ml) gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und unter Erhalt eines hellgelben Schaums auf konzentriert. Analyse des Produkt durchs DC (SiO₂, 95:5 CH₂Cl₂:MeOH) zeigte Haupt- und Nebenkomponenten bei R_f = 0,45 bzw. 0,49 an. Das Produkt mit R_f = 0,45 wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel isoliert (95:5, CH₂Cl₂:MeOH), um 0,61 g (44%) tert-Butyl-3-tert-butyl-L-tyrosinat als weißen Schaum zu liefern, Smp. 43–52°C.
Beispiel 202
tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-tert-butyl-L-tyrosinat
Gemäß Beispiel 145 wurden 0,57 g tert-Butyl-3-tert-butyl-L-tyrosinat mit 0,66 g N-Cbz-L-Glutaminsäure-γ-tert-butylester (Sigma) unter Verwendung von 0,39 g EDC in 20 ml CH₂Cl₂ für 4 h gekuppelt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (65:35 Hexan:EtOAc), um 0,99 g (83%) tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-tert-butyl-L-tyrosinat als weißen Schaum zu liefern, Smp. 62-66°C.
Beispiel 203
tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-tert-butyl-L-tyrosinat
Gemäß Beispiel 48 wurden 0,93 g tert-Butyl-N-((benzyloxy)carbonyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-tert-butyl-L-tyrosinat unter Verwendung von 0,15 g Pd(C) in 70 ml McOH für 3,5 h hydriert. Das Rohprodukt wurde der Flash-Chromatographie an Kieselgel unterworfen (EtOAc), um 0,63 g (87%) tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-tert-butyl-L-tyrosinat als dickes transparentes Öl zu liefern.

¹H-NMR: (200 MHz, DMSO-d₆) δ: 9,17 (s, 1H, OH), 8,11 (d, 1H, J=7,8, NH), 6,96 (d, 1H, J=1,7, aromatisches CH), 6,84 (dd, 1H, J=8,1, 1,9, aromatisches CH), 6,68 (d, 1H, J=8,0, aromatisches CH), 4,33 (m, 1H, Methin), 3,14 (m, 1H, Methin), 2,84 (d, 2H, J=7,0, ArCH₂), 2,23 (t, 2H, J=7,9, Glu-4-CH₂), 1,88–1,46 (m, 4H, Glu-3-CH₂, NH₂), 1,40 (s, 9H, t-Bu), 1,33 (s, 18H, t-Bu's).

Beispiel 204
tert-Butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)-methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-tert-butyl-L-tyrosinat
Gemäß Beispiel 154 wurden 0,320 g tert-Butyl-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-tert-butyl-L-tyrosinat mit 0,254 g 4-(N-(2,4-Diamino-6-pteridinylmethyl)-N-methylamino)benzoesäure-hemihydrochloriddihydrat unter Verwendung von 0,15 ml DECP, 0,19 ml Et₃N und 20 ml DMF gekuppelt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (7:7:1 CH₂Cl₂:Aceton-McOH), um 0,32 g (61%) tert-Butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-tert-butyl-L-tyrosinat als gelbes Pulver zu liefern, Smp. 125°C (Zers.).
Beispiel 205
N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)-benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-tert-butyl-L-tyrosin
Gemäß Beispiel 50 wurden 0,287 g tert-Butyl-N-(4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-5-O-tert-butyl-L-glutam-1-yl-3-tert-butyl-L-tyrosinat mit gasförmigem HCl in 55 ml CH₃NO₂ für 1 h behandelt. Die Suspension wurde im Vakuum unter Erhalt eines gelben Pulvers aufkonzentriert. Dieses Material wurde in 30 ml Wasser suspendiert und mit ausreichend 1N NaOH behandelt, um eine vollständige Lösung zu ergeben. Die gelbe Lösung wurde filtriert und durch Zugabe von 1N wäßrigem HCl auf pH 5,5 angesäuert. Der resultierende gelbe Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt, mit vier Durchläufen von wäßrigem Suspendieren-Zentrifugieren-Dekantieren gewaschen, eingefroren und lyophilisiert, um 0,178 g (68%) N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)-benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-tert-butyl-L-tyrosin als gelbes Pulver zu liefern, Smp. 185°C (Zers.).

HPLC: ein Peak an C18, k' = 3,14, 75:25:0,1 H₂O:MeCN:TFA, Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min.
¹H-NMR: (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 12,80–11,80 (br m), 9,09 (s, 1H, OH), 8,55 (s, 1H, Pteridinyl-7-CH), 8,01 (d, 1H, J=7,9, Amid-NH), 7,97 (d, 1H, J=8,1, Amid-NH), 7,78 (br s, 1H, NH₂), 7,68 (d, 2H, J=8,9, aromatisches CH), 7,57 (br s, 1H, NH₂), 6,93 (d, 1H, J=1,6, aromatisches CH), 6,85-6,64 (m, 5H, aromatisches CH, NH₂), 6,60 (d, 1H, J=8,2, aromatisches CH), 4,77 (s, 2H, Pteridinyl-CH₂), 4,42 (m, 1H, Methin), 4,29 (m, 1H, Methin), 3,19 (s, 3H, N-CH₃), 2,83 (m, 2H, ArCH₂), 2,23 (t, 2H, J=7,8, Glu-4-CH₂), 1,90 (m, 2H, Glu-3-CH₂), 1,25 (s, 9H, t-Bu).

Elementaranalyse

Berechnet für C₃₃H₃₉N₉O₇·2,3 H₂O (MG 715,16): C, 55,42; H, 6,14; N 17,63; Gefunden: C, 55,58; H, 5,79; N 17,47. Massenspektrum: (Ionen-Spray) 674 (M+H)⁺. UV-Spektrum: (Puffer pH 7) λ_max (ε) 259,4 (23700), 307,4 (23500), 372,5 (7330). λ_min (ε) 242,8 (14900), 273,0 (17000), 344,7 (5660). sh (e) 222,1 (26400), 287,2 (19600).

Beispiel 206
Sequenzierung von humaner Carboxypeptidase-A1-cDNA
Ein HindIII- SalI-cDNA-Fragment, das die Ratten-Präprocarboxypeptidase A1 (CPA1) codiert (Gardell et al., Nature, 317:551-555, 1985), wurde aus pMP36 isoliert, bereitgestellt von Dr. M. Phillips (UCSF). Die 1,2 kb HindIII-SalI-Ratten-CPA1-cDNA wurde mit [³²P]dCTP und dem Prime-it-Kit (Stratagene) radiomarkiert und dann verwendet, um eine lambda-gtll-cDNA-Bibliothek aus menschlicher Bauchspeicheldrüse (Clontech) gemäß dem Verfahren von Grunstein und Hogness zu durchmustern (Proc. Nat. Acad. Sci. 72: 5016–5020, 1975). Gereinigte isolierte Plaques, die mit der Ratten-CPA1-cDNA-Sonde hybridisierten, wurden nach drei Durchmusterungsrungen erhalten.
Lambda-DNA aus gereinigten Plaques wurde aus flüssigen Übernachtkulturen unter Verwendung von Qiagen-Säulen und gemäß dem Herstellerprotokoll (Qiagen) hergestellt. Humane CPA1-cDNA-Inserte wurden aus lambda-DNA durch Verdauung mit EcoRI und Reinigung der cDNA-Inserte durch niedrigschmelzende Agarose-Gelelektrophorese freigesetzt. Die EcoRI-cDNA-Inserte wurden in die EcoRI-Stelle von pGEM 7z(+) (Promega) kloniert und als pHCPA-Plasmide bezeichnet. Im Anschluß an Wachstum über Nacht in flüssiger Kultur wurde Plasmid-pHCPA-DNA unter Verwendung von Quiagen-Säulen hergestellt.
Die DNA-Sequenzzierung von isolierten HCPA1-lambda-Plaques und von Plasmiden, die HCPA1-cDNA enthalten, wurde mit [³⁵S]dATP und dem fmol-Sequenzierungssystem (Promega) durchgeführt. Oligonukleotidprimer, die die Klonierungsstelle von lambda-gt11 oder die multiplen Klonierungsstellen in pGEM 7(+) und den TA-Vektor (Invitrogen) flankierten, wurden anfänglich verwendet, um die cDNA-Sequenz zu bestimmen. Oligonukleotidprimer, die den Regionen der bestimmten Sequenz entsprachen, wurden synthetisiert, die die Bestimmung der gesamten cDNA-Sequenz beider Stränge von HCPA1 erlaubten (SEQ ID NO: 1)
Beispiel 207
Klonieren von humaner Carboxypeptidase A2
Humane Carboxypeptidase A2 (CPA2) wurde aus einer cDNA-Bibliothek aus menschlicher Bauchspeicheldrüse, konstruiert in lambda-gtll (Clontech), kloniert. Die verwendete Sonde war ein Fragment mit 1198 Basen aus Ratten-CPA2. Diese Sonde wurde aus QUICK-Clone Ratten-Bauchspeicheldrüse-cDNA (Clontech) unter Verwendung von PCR amplifiziert. Der Primer stromaufwärts entsprach der Sequenz zwischen den Positionen 12-33 in der codierenden Sequenz der Ratten-cDNA (5'-CCTGTTATTGGCTGCCCTACTT-3'), während der Primer stromabwärts das Komplement zur Sequenz zwischen den Positionen 1888–1209 war (5'-AAGCCAGGTCTCTTCTGCTGTC-3') (S.J. Gardell, J. Biol. Chem. 263, 17828 (1988)). Die Standard-PCR-Bedingungen waren eine Vorinkubation bei 94°C, gefolgt von 30 Durchläufen von einer Minute bei 94°C, 2 min bei 56°C und 3 min bei 72°C. Das 1198 bp-PCR-Produkt wurde mit 100 μl Chloroform extrahiert, und die obere wäßrige Phase, die die DNA enthielt, wurde durch eine Säule CHROMA SPIN-100 (Clontech) geleitet, um die Primer zu entfernen. Die Sequenz des PCR-Produkts aus Ratten-CPA2 wurde durch DNA-Sequenzierung unter Verwendung der PCR-Primer als Sequenzierungsprimer bestätigt. Die Sequenzierung der DNA erfolgte mit [³²P]dATP unter Verwendung des fmol-Sequenzierungskits (Promega).
Die Ratten-CPA2-DNA wurde mit [³²P]dCTP und dem Prime-it II Random Primer Labelling-Kit (Stratagene) radiomarkiert und dann verwendet, um die cDNA-Bibliothek aus menschlicher Bauchspeicheldrüse zu durchmustern. Die Bibliothek wurde unter Verwendung von E. coli-Stamm Y1090r^– auf 150 mm-Platten plattiert (ca. 10 000 Plaques/Platte), und doppelte Nitrocellulose-Abhebungen wurden vorgenommen. Die Filter wurden in Hybridisierungslösung (50% Formamid, 5X SSPE, 50X Denhardt-Lösung, 0,1% SDS und 100 μg/ml ultraschallbehandelte Lachssperma-DNA) für 3 Stunden bei 42°C geblockt. Markiertes Ratten-CPA2-PCR-Produkt wurde hinzugegeben und mit den Filtern über Nacht bei 45°C hybridisiert. Die Filter wurden für 1 Stunde bei 60°C in 0,1X SSC, 0,1% SDS gewaschen und im feuchten Zustand mit Autoradiographiefilm in Kontakt gebracht. Eine doppelte Plaque aus jeder Platte wurde gepickt und einer weiteren Durchmusterungsrunde wie oben beschrieben unterworfen. Positive Plaques nach der zweiten Durchmusterungsrunde wurden gepickt, und die Größe der lambda-gt11-Insert-DNA wurde unter Verwendung von PCR bestimmt. Vorwärts und rückwärts sequenzierende lambda-gt11-Primer (Clontech), die die EcoRI-Klonierungsstelle von lambda-gtll flankierten, wurden als PCR-Primer stromaufwärts bzw. stromabwärts verwendet. Gut isolierte Plaques wurden gepickt, wobei ein Teil in 10 μl Wasser suspendiert und für 5 min auf 95°C erwärmt wurde und der Rest verwendet wurde, um einen Phagenvorrat für zukünftige Durchmusterungen herzustellen. Die 10 μl, die die Plaque-DNA enthielten, wurden direkt als Matrize in der PCR unter Verwendung der oben beschriebenen Bedingungen verwendet.
Amplifizierte Insert-DNA wurde auf Agarosegelen visualisiert und die zwei Plaques, die die größte Insert-DNA ergaben, wurden ein drittes Mal durchmustert. Lambda-DNA aus diesen zwei Plaques wurde isoliert und in beiden Richtungen unter Verwendung des fmol-Kit (Promega) und der Vorwärts- und Rückwärts-lambda-gt11-Primer (Clontech) sequenziert. Ein Klon enthielt Regionen, die hoch homolog mit den 5'- und 3'-Regionen von CPA2 der Ratte waren, und wurde zur weiteren Untersuchung ausgewählt.
Die Insert-cDNA wurde aus der lambda-DNA durch Verdauung mit EcoRI freigesetzt, gelgereinigt und in die EcoRI-Stelle des pGEM-7Zf(+)-Vektors (Promega) kloniert. Die Sequenzierung wurde unter Verwendung von [³²P]dATP und des fmol-Kits (Promega) wie oben beschrieben durchgeführt. Oligonukleotidprimer, die den Regionen der bestimmten Sequenz entsprachen, wurden synthetisiert, die die Bestimmung der gesamten cDNA-Sequenz von hCPA2 erlaubten. Es wurde gefunden, daß die cDNA ein offenes Leseraster enthält, das für ein Protein mit 417 Aminosäuren codiert. Dieses Protein teilt eine 87%ige Identität mit CPA2 der Ratte auf dem Aminosäure-Niveau und eine 85%ige Identität auf dem cDNA-Niveau. Dieses Protein teilt eine 63%ige Identität mit menschlichem CPA1 auf sowohl dem Aminosäure- als auch dem Nukleotidniveau. Daher wurde das Protein als humane Carboxypeptidase A2 klassifiziert. Tabelle 4 zeigt einen Vergleich zwischen den Aminosäuresequenzen von humanem CPA1 und CPA2. Das durchgehend in diesem Dokument verwendete Aminosäure-Numerierungsschema ist das von CPA1. Alle für CPA1 und CPA2 beschriebenen Mutationen beziehen sich auf dieses Numerierungsschema.
Beispiel 208
Expression von HCPA1 in Hefe
Die Größe der cDNA-Inserte innerhalb isolierter HCPA1-lambda-Plaques wurde unter Verwendung von Oligonukleotidprimern, die die EcoRI-Klonierungsstelle von lambda-gt11 flankierten, und Polymerase-Kettenreation (PCR) bestimmt. Einzelne isolierte Plaques wurden gepickt, in 200 μl Wasser suspendiert und für 5 Minuten auf 95°C erwärmt. 10 μl jeder Suspension wurden zur PCR-Amplifizierung unter Verwendung der Herstelleranweisungen (Perkin Elmer/Cetus) verwendet. Die Standard-PCR-Reaktionsbedingungen bestanden aus 1 Minute bei 95°C, 0,5 Minute bei 50°C und 3 Minuten bei 72°C. Die Reaktionsprodukte wurden im Anschluß an Agarose-Gelelektrophorese visualisiert.
Die Expression von HCPA1 in S. Cerevisiae beruhte auf der von Gardell et al. eingesetzten Strategie (Nature, 317, 551–555, 1985). Zwei Oligonukleotidprimer, CPA 11 und 12, wurden verwendet, um ein 200 bp-Fragment aus pHCPA durch PCR wie oben beschrieben zu amplifizieren. Das amplifizierte Fragment enthielt eine neue 5'-HindIII-Stelle, geschaffen durch CPA 11, die die Ligierung im Raster mit der alpha-Faktor-Leit-Sequenz von pMP36 erlauben würde, wie von Phillips et al. beschrieben (J. Biol. Chem. 265; 20692–20698, 1990). Das PCR-Fragment wurde in den TA-Vektor (Invitrogen) ligiert und die gesamte DNA-Sequenz des Fragments wie früher beschrieben bestimmt. Eine Kolonie, die die gewünschte 5'-Veränderung enthielt, wurde zur weiteren Verwendung ausgewählt, TAHCPAexp.
Die Plasmid-pHCPA wurde mit AatII und EcoRI eingeschränkt, um ein 1,1 kb-HCPA1-Fragment freizusetzen. Dieses Fragment wurde im Anschluß an Agarose-Gelelektrophorese mit niedrigem Schmelzpunkt gereinigt und in TAHCPAexp ligiert, das mit AatII und EcoRI eingeschränkt worden war um das Plasmid TAHCPA zu liefern. TAHCPA wurde mit EcoRI verdaut, mit T4-DNA-Polymerase behandelt, und SalI-Linker wurden hinzugegeben und an das 3'-Ende von HCPA1 wie von Maniatis beschrieben ligiert (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989). TAHCPA, das jetzt 5'-HindIII- und 3'-SalI-Stellen enthielt, wurde mit HindIII und SalI beschränkt, um ein 1,2 kb HCPA1-cDNA-Fragment freizusetzen. Dieses Fragment wurde zusammen mit dem großen HindIII-Fragment und dem kleinen HindIII-SalI-Fragment von pMP36 zusammen ligiert, um pMP36HCPA1 zu erzeugen.
Hefeexpression des klonierten menschlichenen Enzyms beruht auf dem Verfahren von M. Phillips et al., J. Biol. Chem. 265, 20692 (1990). Plasmid pMP36, das HCPA1 enthielt, wurde sequenziell mit BamHI, SalI und SSPI mit dazwischenliegenden Reinigungen durch entweder Phenol-Extraktionen oder Verwenden von Promega Magic Mini-Säulen gemäß Herstellerprotokoll beschränkt. Alternativ kann das Puffersystem One-Phor-All (Pharmacia) in einer gleichzeitigen Beschränkung durch alle drei Enzyme verwendet werden.
Im Anschluß an SSP1-Restriktion wurde die Mischung an einem 1%igen niedrigschmelzenden Gel unter Erhalt von 5 getrennten Banden getrennt. Die interessierende Bande bei ca. 2,8 kb (die zweite von oben) wurde aus dem Gel geschnitten unter Verwendung einer Säule Schleicher und Schuell Elutip-D gemäß Herstellerprotokoll gereinigt.
Das Bam/SaL/SSP-Fragment wurde dann in einen pBS24.1-Shuttle-Vektor (erzeugt aus pB524.1-AGC3, freundlicherweise bereitgestellt von Dr. M. Phillips, UCSF mit BamHI/SalI-Restriktion) über Nacht bei 16°C unter Verwendung des T4-Ligase-Systems (Gibco-BRL) ligiert. Der ligierte Vektor wurde mit Ammoniumacetat und Ethanol bei –80°C für 4 h ausgefällt und in 10 μl TE resuspendiert.
4 μl des Vektors wurden in 40 μl DH5alpha E. coli unter Verwendung eines Bio Rad-Gene Pulser mit 2000 Volt mit einer Zeitkonstante von ca. 4 elektroporiert. 1 ml Miller-Hinton-Bouillon wurde hinzugegeben und die Probe bei 37°C für eine Stunde inkubiert. Drei 100 μl-Proben von jedem wurden auf Ampicillin-enthaltende LB-Platten ausplattiert.
Die resultierenden Kolonien wurden auf frische Platten zurückplattiert. 100 ml-Volumina von Miller-Hinton/Ampicillin-Bouillon wurden mit Kolonien geimpft und über Nacht bei 37°C inkubiert. Das Plasmid wurde unter Verwendung des Quiagen-Maxi-Extraktionsverfahrens extrahiert.
Ca. 500 bis 2000 ng der oben extrahierten PBS24.1 Plasmid-DNA wurden in 40 μl kompetente DLM101 alpha-Hefezellen elektroporiert. 1 ml Sorbit wurde direkt nach der Elektroporation zur Rettung der Zellen hinzugegeben. 100 μl-Proben wurden auf Schalen aus YNB (Hefe-Stickstoff-Bouillon) ausplattiert, der Uracil fehlte, und die bei 30°C inkubiert wurden. Positive Klone wurden gepickt. Transformanten wurden in synthetischem Minimalmedium (L.J. Wickersham, U.S. Dept. of Agric. Tech. Bull., Nr. 1029 (1951)), dem Leucin fehlte, für 48 h gezüchtet. Diese Kultur wurde dann verwendet, um einen 350 l-Fermenter zu impfen.
Beispiel 209
Reinigung von HCPA1 oder ihren Mutanten aus Hefe
Eine 350 l-Kultur aus proCPA-produzierender S. cerevisiae (T268G/p2619) wurde in einem New Brunswick 500 l-Fermenter für 65 h bei 30°C mit 175 lpm Luftfluß, 5 psig Kopfdruck und 150 U/min Rühren gezüchtet. Das Medium enthielt 1% Hefeextrakt (Difco), 2% Trypton (Difco), 1% Glucose, 20 mM KPO₄, pH 7,5, 50 μg/ml Ampicillin und 0,007% (V/V) Mazu DF 60P Antischaummittel (Mazei Chemicals, Inc.). Der letztliche OD₆₀₀-Wert betrug 14. Nach Abkühlen auf 15-20°C wurden die Zellen aus dem Medium durch Querflußfiltration an einem System Sartorius Sartocon II, ausgerüstet mit 7 0,6 m²-Polyolefinfiltereinheiten, entfernt. Das Protein im Medium wurde mit 10K MWCO Querflußfiltern auf konzentriert und die Flüssigkeit durch Diafiltration mit 20 mM Tris-HCl, pH 8, 0,1 mM Zn-Acetat (Puffer A) ausgetauscht. Alle anschließenden Puffer enthielten 0,1 mM Zn-Acetat. Ammoniumsulfat (AS) wurde auf 0,5 M zum 10K-Konzentrat hinzugegeben, und dieses wurde auf eine 250 ml-Phenyl-Sepharose-Säule mit radialem Fluß, die in Puffer A mit 0,5 M AS äquilibriert war, geladen. Die proCPA wurde mit einem AS-Gradienten von 1,5 1 0,5–0 M gefolgt von einer Spülung mit Puffer A eluiert. Das Phenyl-Sepharose-Verfahren wurde mit dem Durchbruchmaterial wiederholt, um ungebundene proCPA aus dem ersten Durchlauf zurückzugewinnen. Fraktionen, die proCPA enthielten, wurden gesammelt und auf konzentriert und an einem Sartorius 10K Easy Flow-Filter (0,2 m²) in Puffer A dialysiert. Dieser wurde auf eine Säule Hi Load 25/10 Q-Sepharose High Performance (Pharmacia) (53 ml) aufgetragen und mit einem 1 l-Gradienten von 0–0,5 M NaCl in Puffer A eluiert. Die proCPA eluierte zwischen 120 und 220 mM NaCl mit der Peak-Röhre bei ca. 150 mM. Fraktionen, die proCPA enthielten, wurden vereinigt, und die proCPA wurde zu reifer CPA mit Trypsin (2 μg/ml) bei 37°C für 1 h gespalten. PMSF wurde hinzugegeben (0,5 mM), und das Reservoir wurde in Puffer A dialysiert. Der Q-Sepharose-HP-Schritt wurde wiederholt, und die aktivierte CPA eluierte zwischen 80 und 140 mM mit einem Peakrohr bei 120 mM. Vorhergehende IEF-Experimente haben gezeigt, daß proCPA ein pI von 4,75 besitzt, während die reife CPA ein pI von 6,2 hat. Die CPA-Fraktionen wurden vereinigt und mit 10K Centripreps (Amicon) auf 15 ml aufkonzentriert, und dies wurde durch eine Säule HiLoad 26/60 Superdex 75 (Pharmacia) in 3 Durchläufen (jeweils 5 ml) geleitet. Der Elutionspuffer war Puffer A mit 150 mM NaCl. Die CPA-Fraktionen wurden vereinigt, mit 10K Centripreps aufkonzentriert und mit Sigma-PBS, das 0,1 mM Zn-Acetat enthielt, ausgetauscht. Das Endvolumen (15 ml) wurde durch einen 0,2 μ-Spritzenfilter geleitet und bei 4°C gelagert. Das Protein hatte gemäß Lowry-Test unter Verwendung von BSA-Standards 24,5 mg/ml. Die spezifische Aktivität für eine typische Zubereitung der Mutante mit Gly bei 268 betrug 163 μ/mg. Gesamtprotein = 368 mg.
Beispiel 210
Expression von HCPA2 in Hefe
Für die Expression von HCPA2 in S. cerevisiae wurde die gleiche Strategie wie für HCPA1 beschrieben (Beispiel 208) mit den folgenden Ausnahmen eingesetzt: 1) Die zur Einführung der neuen 5'-HindIII-Stelle verwendeten PCR-Primer waren:
2) eine HincII-Stelle anstelle von AatII wurde verwendet, um das mutagene PCR-Fragment an das 5'-Ende der HCPA2-cDNA zu subklonieren, und 3) das klonierte PCR-Produkt wurde aus dem TA-Vektor geschnitten und in den pGEM-7Zf(+)-Vektor, der die HCPA2-cDNA enthielt, subkloniert. PCR wurde mit den Hefe 1- und 2-Primern wie für HCPA1 beschrieben durchgeführt. Das mutagene PCR-Produkt wurde in den TA-Vektor kloniert und die Sequenz bestätigt. Dieses Fragment wurde aus dem TA-Vektor unter Verwendung von HindIII und HincII geschnitten und in die entsprechenden Stellen von pHCPA2 kloniert und das resultierende Konstrukt als pHCPA2-Y bezeichnet. Die besondere 3'-EcoRI-Stelle von pHCPA2-Y wurde zu einer SalI-Stelle unter Verwendung von Linkern wie oben beschrieben verändert, wobei das resultierende Konstrukt als pHCPA2-YSalI bezeichnet wurde. Das aus pHCPA2-YSalI stammende 1,2 kb HindIII/SalI-HCPA2-Fragment wurde aus dem Vektor geschnitten und zusammen mit dem großen HindIII/SalI-Fragment von pMP36 ligiert (M. Phillips et al., J. Biol. Chem., 265, 20692–20698 (1990)), um pMP36HCPA2 zu erzeugen.
Die Hefeexpression von Klon HCPA2 erfolgte wie oben für HCPA1 beschrieben (Beispiel 144). Humane CPA2 hat zwei interne BamHI-Stellen, die nicht in humaner CPA1 vorhanden sind, so daß eine partielle Verdauung für den letzten Subklonierungsschritt erforderlich war. pMP36HCPA2 wurde vollständig mit SalI und teilweise mit BamHI (wie oben beschrieben) verdaut, um das 2,7 kb-Fragment zu liefern, das den Alkoholdehydrogenase/GADPH-Promotor und die regulatorische Region (A/G-Promotor) enthielt, gebunden an die humane CPA2, verschmolzen im Raster mit der Hefeα-Faktor-Leit-Sequenz. Dieses Fragment wurde in die SalI/HindIII-Stelle von pBS24.1 unter Bildung von pBSHCPA2 ligiert. Das Produkt wurde in DHSα amplifiziert und zum Elektroporieren von Hefe wie oben beschrieben verwendet (Beispiel 208).
Beispiel 211
Reinigung von HCPA2 oder ihren Mutanten aus Hefe
Eine Übernachtkultur (gezüchtet in Leu^--Medium) von S. cerevisiae, die proCPA2 exprimierte, wurde verwendet, um 2 l Kultur in 1% Hefeextrakt (Difco), 2% Trypton (Difco), 1% Glucose, 20 mM KPO₄, pH 7,5 und 50 μg/ml Ampicillin zu beginnen. Die Kultur wurde für 48 Stunden bei 30°C gezüchtet und der Überstand durch Zentrifugieren mit 6000 × g für 10 min bei 4°C geklärt. Das Protein im Überstand wurde an einer Amicon-PM-10-Ultrafiltrationsmembran auf 114 ml aufkonzentriert. Der konzentrierte Überstand wurde auf 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM Zn-Acetat und 0,5 M Ammoniumsulfat eingestellt und auf eine 1,8 × 20 cm Phenyl-Sepharose-Säule (Pharmacia), die in Puffer A mit 0,5 Ammoniumsulfat äquilibriert war, geladen. Das Protein wurde mit einem linearen 120 ml-Gradienten (1 ml/min) aus Puffer B (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mM Zn-Acetat) mit 0,5 M Ammoniumsulfat zu Puffer B mit 20% (V/V) Ethanol eluiert. Carboxypeptidase-Aktivität enthaltende Fraktionen wurden vereinigt und gegen Puffer B dialysiert. Das dialysierte Reservoir wurde auf eine Säule HR 5/5 (1 ml) Mono Q (Pharmacia) geladen und mit einem linearen 30 ml-Gradienten (1 ml/min) von 0–0,5 M NaCl in Puffer B eluiert. Carboxypeptidase-Aktivität enthaltende Fraktionen wurden vereinigt und gegen Puffer B dialysiert. Die vereinigte proCPA2 wurde mit Trpysin (10 μg/ml) bei 37°C für 1 h aktiviert und das Trypsin mit auf 0,5 mM hinzugegebenem PMSF inaktiviert. Die reife CPA2 wurde gegen Puffer B dialysiert und erneut auf die 1 ml Mono Q-Säule (Pharmacia) geladen und wie oben eluiert. Carboxypeptidase-Aktivität enthaltende Fraktionen wurden vereinigt, gegen Puffer B dialysiert und 10-fach in einer Amicon-Ultrafiltrationszelle unter Verwendung einer PM-10-Membran auf konzentriert. Die konzentrierte reife CPA2 wurde auf eine HR 10/30 Superose 12-Säule (25 ml) geladen und isokratisch (0,4 ml/min) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (10 mM Na₂HPO₄, 0,15 M NaCl, pH 7,2) eluiert. Für HCPA2 vom Wildtyp war das Protein 0,65 mg/ml (insgesamt 4,13 mg), und für die Mutation 268 Gly betrug die Konzentration 0,3 mg/ml (insgesamt 4,47 mg) gemäß Bestimmung mit dem Micro BCA-Assay (Pierce Chemical Co.) unter Verwendung von BSA-Standards.
Beispiel 212
Expression von mutierter HCPA2
Die A250G- und T268G-Mutationen von HCPA2 wurden wie oben beschrieben (Beispiel 149) für mutierte Formen von HCPA1 unter Verwendung des T7-Gen In Vitro Mutagenesis Kit (United States Biochemical, Nr. 74500) konstruiert. Die mutagenen Oligonukleotidprimer (Oligos Etc) zur Mutation von A250 (gCC) und T268 (ACC) zu Gly (ggC) sind nachfolgend gezeigt:
Mutagene Codonen sind unterstrichen.
Unter Verwendung dieser Oligonukleotidprimer wurden die folgenden mutierten Formen von HCPA2 erzeugt:

1. A250G
2. T268G

Jede der obigen mutagenierten HCPA2-Kassetten wurde sequenziert, um sicherzustellen, daß nur die gewünschten DNA-Mutationen erzeugt waren. Die mutagenierten Kassetten wurden in pMP36HCPA2 subkloniert, das weiter zur Expression in S. cerevisiae unter Verwendung der in Beispiel 152 beschriebenen Verfahren verarbeitet werden konnte.
Beispiel 213
Synthese eines chemischen Konjugats zwischen Campath-1-H oder ING-1 und humanen Carboxypeptidase-A-Mutanten
2 mg mutierte Carboxypeptidase A wurden mit 0,15 mg Sulfo-SMCC (Pierce Chemical Co.) in 475 μl von Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) kombiniert. Die resultierende Lösung wurde für 45 min bei 25°C gerührt. Das modifizierte Enzym wurde durch eine 1 × 13 cm-Säule mit G-25-Medium, äquilibriert mit PBS, gereinigt. Gereinigtes Produkt kann bei 4°C für 24 h gelagert werden.
Der Maleimid-Gehalt wurde durch Kombinieren von 0,5 ml von 6,3 μM modifiziertem Enzym mit 6 μl 1 mM Mercaptoethanolamin bestimmt. Nach 30 Minuten wurden 20 μl von 4 mg/ml Ellman-Reagens hinzugegeben, und nach weiteren 20 Minuten wurde die Extinktion bei 412 nm bestimmt. Auf Basis einer molaren Absorptivität von 13,6 mM^–1 wurde gefunden, daß das gereinigte Produkt 1 Maleimid pro Enzymmolekül enthielt. Die Modifikation hatte keine Wirkung auf die Enzymaktivität.
Der Antikörper wurde mit 2-Iminothiolan (Pierce Chemical Co.) modifiziert. 0,35 mg Antikörperlösung wurden mit 0,055 mg 2-Iminothiolan in 0,1 M Triethanolamin-HCl, 2 mM EDTA, pH 8,0 unter aneroben Bedingungen kombiniert und unter Rühren für 1 h und 45 min umgesetzt. Der modifizierte Antikörper wurde durch eine 1 × 13 cm Säule mit G-25-Medium gereinigt, äquilibriert mit 0,02 m Natriumacetat, 0,1 M NaCl, pH 5,8, durchgeblasen mit und bewahrt unter einer He-Atmosphäre. Die gereinigte modifizierte Antikörperlösung wurde direkt in der Lösung der modifizierten Carboxypeptidase A aufgefangen. Die resultierende Lösung wurde mit NaOH auf pH 7,4 eingestellt, anaerob gemacht und unter Rühren bei 4°C für 18 h umgesetzt. (Gegebenenfalls freie Maleimid-Gruppen können durch Umsetzen der Lösung mit 0,3 mM Mercaptoethanolamin bei Raumtemperatur für eine Stunde entfernt werden). Die Lösung wurde auf 1 ml auf konzentriert. Das resultierende konzentrierte Konjugat wurde von Aggregaten, nicht-umgesetztem Enzym und kleinen Molekülen durch Chromatographie an Superose 12 HR 10/30 gereinigt. Die spezifische Enzymaktivität des Konjugats wurde als geeignet für ein eins-zu-eins-Konjugat mit Antikörper gefunden. Die prozentuale Antikörper-Immunreaktivität (Campath-IH^® oder ING-1) und Antigen-Bindungsaffinität des Konjugats wurden beide als hoch festgestellt.
Beispiel 214
Das Enzym wurde durch das für Beispiel 4 oben beschriebene Protokoll modifiziert, während der Antikörper mit Dithiothreitol modifiziert wurde. 0,7 mg Antikörperlösung wurden mit 0,035 μmol Dithiothreitol in 350 μl 0,1 M Triethanolamin-HCl, 2 mM EDTA, pH 8,0 unter anaeroben Bedingungen kombiniert und unter Rühren für 1 h umgesetzt. Der modifizierte Antikörper wurde durch eine 1 × 13 cm-Säule mit G-25-Medium, äquilibriert mit 0,02 M Natriumacetat, 0,1 M NaCl, pH 5,8, durchgeblasen mit und aufbewahrt unter unter einer He-Atmosphäre, gereinigt. Die gereinigte Antikörper-Lösung wurde direkt in der Lösung aus modifizierter Carboxypeptidase A aufgefangen. Die resultierende Lösung wurde mit NaOH auf pH 7,4 eingestellt, anaerob gemacht und unter Rühren bei 24°C für 30 min und bei 4°C für 18 Stunden reagieren gelassen. Dann wurde die Lösung auf 1 ml aufkonzentriert. Das resultierende konzentrierte Konjugat wurde von Aggregaten, nicht-umgesetztem Enzym und kleinen Molekülen durch Chromatographie an Superose 12 HR 10/30 gereinigt. Die spezifische Enzymaktivität des Konjugats wurde als angemessen für ein eins-zu-eins-Konjugat mit Antikörper gefunden. Die prozentuale Antikörper-Immunreaktivität und Antigenbindungsaktivität wurden beide als hoch festgestellt.
Beispiel 215
Das Enzym wurde durch das für Beispiel 4 oben beschriebene Protokoll modifiziert, während der Antikörper mit SATA (Pierce Chemical Co.) modifiziert wurde. 0,225 mg Antikörper-Lösung wurden mit 0,003 mg SATA in einem Gesamtvolumen von 150 μl Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) kombiniert und unter Rühren für 45 min reagieren gelassen. Der modifizierte Antikörper wurde durch eine 1 × 13 cm Säule mit G-25-Medium, äquilibriert mit PBS, gereinigt. Die gereinigte modifizierte Antikörperlösung wurde mit dem modifizierten Enzym vermischt und anaerob gemacht, 300 μl anaerobes 0,5 M NH₂OH wurden hinzugegeben und die Lösung unter Rühren bei 25°C für 2 h gefolgt von 4°C für 18 h reagieren gelassen. Freie Maleimid-Gruppen wurden durch Umsetzen der Lösung mit 0,3 mM Mercaptoethanolamin bei Raumtemperatur für 1 Stunde entfernt, und die Lösung wurde dann auf 1 ml aufkonzentriert. Das resultierende konzentrierte Konjugat wurde von Aggregaten, nicht-umgesetztem Enzym und kleinen Molekülen durch Chromatographie an Superose 12 IIR 10/30 gereinigt. Die spezifische Enzymaktivität des Konjugats wurde als angemessen für ein eins-zu-eins-Konjugat mit Antikörper aufgefunden. Die Antikörper-Antigen-Bindungsaffinität wurde als hoch festgestellt.
Beispiel 216
Expression von mutierter HCPA1
pMP36, das Wildtyp-(WT)-proHCPA1-cDNA enthält (als Fusion mit der oben beschriebenen Hefe-alpha-Faktor-Vorsequenz) wurde mit NcoI und SalI beschränkt, um ein 481 bp cDNA-Fragment freizusetzen. Dieses Fragment beginnt bei Nukleotid 893, schreitet zum ganzen 3'-Ende von HCPA1-cDNA fort und codiert die Aminosäuren 186-309 von reifer HCPA1. Das HCPA1 NcoI-SalI- Fragment wurde in die NcoI- und SalI-Klonierungsstellen von pGEM5zf(-) (Promega) ligiert, um pHCPAINS zu erzeugen (3). pHCPAINS wurde dann mit SphI und SalI eingeschränkt, um das HCPA1 NcoI-SalI-Fragment und zusätzliche (9 bp) pGEM5zf(-)-Sequenz freizusetzen. Dieses SphI-SalI-Fragment wurde in M13mp19 (BRL) unter Verwendung seiner SphI- und SalI-Klonierungsstellen kloniert, um M13mp19HCPA1 zu erzeugen (4).
Einsträngige M13mp19HCPA1-DNA wurde als Matrize für die Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese unter Verwendung des T7-GEN In Vitro Mutagenesis-Kits (United States Biochemical, Nr. 74500) verwendet. Die unten aufgeführten mutagenen Oligonukleotidprimer (Oligos Etc) wurden verwendet, um die Reste I255 (ATT) und T268 (ACC) entweder separat oder im Tandem zu mutieren.
Mutagene Codonen sind unterstrichen.
Unter Verwendung dieser Oligonukleotidprimer wurde die folgenden mutierten Formen von HCPA1 erzeugt:

1. I255A
2. T268A
3. T268G
4. I255A/T268A

Jede der obigen mutagenisierten HCPA1-Kassetten wurde sequenziert, um zu verifizieren, daß nur die gewünschten DNA-Mutationen erzeugt wurden.
pMP36 HCPA-1 WT wurde mit NcoI beschränkt, um ein 1,2 kb-Fragment freizusetzen, das in die NcoI-Stelle von M13mp19HCPA1-Mutanten kloniert wurde. Nach der Bestätigung der korrekten Orientierung des NcoI-Fragments innerhalb der M13mp19 proHPCA1-Mutanten (5) wurden die DNAs mit HindIII und SalI beschränkt, was ein 1,2 kb-cDNA-Fragment, das das gesamte mutierte proHCPAl-Enzym codiert, freigesetzt. Dieses Fragment wurde dann in die HindIII- und SalI-Stellen von pMP36 ligiert, was pMPHCPA1-Mutanten lieferte (6), die dann weiter zur Expression in S. cerevisiae unter Verwendung der in den Beispielen 2 und 3 beschriebenen Verfahren verarbeitet werden konnten.
Beispiel 217
Expression von mutierter HCPA1
Alternativ wurden die Mutationen zweckmäßig in hCPA im pMP36-Plasmid (pMP36 HCPA1) durch das Einzelstelleneliminierungsverfahren (USE) von Clontech Laboratories, Inc. unter Verwendung der Reagenzien und Protokolle des Herstellers erzeugt.
Im Protokoll wurde die Eliminierung eines besonderen EcoRI im pMP36 HCPA1-Plasmid zu Selektion mit dem Oligonukleotid XS5 (TCC CCC GGG CTG CAG GAT ATC GAT AGC TGG GCT GTG T) verwendet. Die zur Erzeugung von drei spezifischen Mutationen in hCPA durch dieses Protokoll verwendeten Oligonukleotide folgen:
Die Mutationen wurden unter Verwendung der oben aufgeführten Oligonukleotide und XS5 (TCC CCC GGG CTG CAG GAT ATC GAT AGC TGG GCT GTG T) isoliert, was eine besondere EcoRI-Stelle eliminiert. Plasmide, die die gewünschten Mutatinen enthalten, wurden durch Verdauen des Wiltyp-pMP36(hCPA) mit EcoRI selektiert (ungeschnittene Plasmide transformieren 10- bis 100-mal effizienter als linearisiertes Plasmid). Zusätzlich führt das XS5 Selektions-Oligonukleotid eine EcoRV-Stelle ein, die dann zur Durchmusterung auf mutierte Plasmide verwendet werden kann. In den mutierten Plasmiden ist das EcoRV besonders und kann daher als Selektionsstelle zur Konstruktion von Doppelmutanten mit einem Oligonukleotid verwendet werden, das die EcoRV-Stelle zurück zu einer EcoRI-Stelle umwandelt.
Die so erzeugte mutierte pMP36 HCPA konnte dann weiter zur Expression in S. cerevisae unter Verwendung der in den Beispielen 2 und 3 beschriebenen Verfahren verarbeitet werden.
Beispiel 218
Stabilität und biologische Verteilung von Prodrugs in vivo
Mäuse wurden i.p. oder i.v. als Bolus mit 50 mg/kg Prodrug durch Verabreichung einer 5 mg/ml Lösung in PBS, pH 6-8 dosiert. Die Tiere wurden nach 30 min und 2 h getötet, und das Plasma und Gewebe wurden gesammelt. Plasma wurde bei –70°C eingefroren, und Gewebe wurde in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –70°C gelagert. Doppelte Tiere wurden bei jedem Zeitpunkt getötet. Plasma wurde vorbereitet zur Extraktion durch 4-fache Verdünnung mit eiskaltem 0,1 N HCl. Gewebe wurden vorbereitet zur Extraktion durch Homogenisierung in 5 Volumina eiskaltem 0,1 N HCl mit einem Polytron, ausgerüstet mit einem PTA 7-Generator (Brinkman Instruments, Westbury, NY). Arzneistoffe wurden anschließend durch Zugabe von 500 μl von –20°C Acetonitril zu 200 μl des 0,1 N HCl-Homogenats extrahiert. Nach einer 5-minütigen Inkubation auf Eis wurden die Proben mit 12 400 × g für 15 min zentrifugiert. Überstände wurden aufgefangen und 3,57-fach mit PBS verdünnt, um die Acetonitril-Endkonzentration auf 20% zu reduzieren. Verdünnte Überstände wurden dann durch HPLC wie nachfolgend beschrieben analysiert. Die Arzneistoffgewinnung wurde abgeschätzt durch Spiking von Kontrollgewegehomogenaten mit entweder Arzneistoff oder Prodrug vor dem Acetonitril-Extraktionsschritt. Nach Korrektur für Gewinnung dieser Standards wurden die Spiegel von Arzneistoff und Prodrug in Geweben und die Stabilität des Prodrugs in diesen Geweben unter Verwendung von HPLC berechnet.
Proben wurden an einer 4 μm C18-Nova-Pak 3,9 × 300 mm HPLC-Stahlsäule analysiert, ausgerüstet mit einer C18-Wächtersäule mit UV-Detektion bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min. Proben wurden auf die HPLC-Säule injiziert, äquilibriert mit 2% Essigsäure, pH 3,0, die entweder 5% oder 20% Acetonitril enthielt, abhängig von der zu analysierenden Verbindung. Nach der Probeninjektion wurde ein 25- oder 35-minütiger linearer Gradient begonnen, der die Acetonitril-Konzentration auf 50% Acetonitril erhöhte. Drei Verbindungen (ASP-MTX, o-Cyclopentyl-PHE-MTX und m-Cyclopentyl-PHE-MTX) wurden an einer 10 μm C18-uBondapak-Säule (3,9 × 300 mm), äquilibriert mit 16% Acetonitril in 5 mM Tetrabutylammoniumhydrogensulfat, 10 mM NH₄H₂PO₄, analysiert. Die Säule wurde dann mit einem 30-minütigen linearen Gradienten von bis zu 50% Acetonitril eluiert.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. Die Ergebnisse zeigen, daß eine Verbindung, die ein gutes Substrat für Wildtyp-CPA ist, wie Verbindung #10, in vivo nicht stabil ist. Dieser Typ Verbindung ist nicht nützlich für ADEPT. Jedoch sind Verbindungen, die gute Substrate für ein mutiertes Enzym sind, aber nicht für das Wildtyp-Enzym, wie die Verbindungen 8, 9, 11, 12, 13 und 14 und andere, in vivo stabil und sind als solche nützlich in ADEPT.
Die in Tabelle 1 gezeigten Daten zeigen die Konzentration des untersuchten Prodrugs im Zeitverlauf in Minuten als entweder μM im Falle von Plasma oder nmol/g im Falle von Geweben. Die Zahlen in Klammern geben die Stabilität des Prodrugs an, ausgedrückt als Prozentwert des Materials (Summe von Arzneimittels und Prodrug), das als intakter Prodrug beobachtet wird.
Wenn nichts anderes angegeben ist, wurden alle Experimente an nackten CD-1-Mäusen durchgeführt. Tabelle 1
Tabelle 1 (Fortsetzung)
Die in Tabelle 1 gezeigten Prodrugs 1 bis 14 sind wie folgt:

1. N-(N-(4-(((1,2-Dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(F)chinazolin-9-yl)-methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-L-glutam-1-yl)L-glutaminsäure.
2. N-((S)-4-Carboxy-2-(5-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(F)-chinazolin-9-yl)methyl)amino)-1-oxo-2-isoindolinyl)butanoyl)-L-phenylalanin.
3. N-(N-(2-Fluor-4-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(F)-chinazolin-9-yl)methyl)amino)benzoyl)-L-glutam-1-yl)-3-(1-naphthyl)-L-alanin.
4. N-(N-4-(((1,2-Dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(F)chinazolin-9-yl)-methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-L-glutam-1-yl)-2-carboxy-L-phenylalanin.
5. N-(N-(4-(((1,2-Dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(F)chinazolin-9-yl)-methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-L-glutam-1-yl-2-iod-L-phenylalanin.
6. N-(4-((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-L-asparaginsäure.
7. N-(4-((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-2-carboxy-L-phenylalanin.
8. N-(4-((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-gltuam-1-yl-2-cyclopentyl-L-phenylalanin.
9. N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalanin.
10. N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-L-phenylalanin.
11. N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclobutyl-L-phenylalanin.
12. N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-tert-butyl-L-phenylalanin.
13. N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-tyrosin.
14. N-(4-((3-(2,4-Diamino-1,6-dihydro-6-oxo-5-pyrimidinyl)-propyl)amino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalanin.

Beispiel 219
Molekulares Design von humaner CPA1
Die Brookhaven Protein Database (F.C. Bernstein et al., J. Mol. Biol. 112, 535-542 [1977]) wurde durchsucht und Rinder-CPA als diejenige ausgewählt, die wahrscheinlich die größte Strukturähnlichkeit mit humaner CPA (HCPA) auf Basis der Basensequenzhomologie hat. Der COMPOSER-Algorithmus,der zur Entwicklung des HCPA-Modells verwendet wurde, ist Teil des kommerziell erhältlichen SYBYL-Pakets zum molekularen Design, das von TRIPOS Associates verkauft wird (SYBYL Molecular Modeling Software, Version 5.3, November 1989, TRIPOS Associates Inc. St. Louis, MO 63144). Der COMPOSER-Algorithums wurde verwendet, um die Aminosäurereste der humanen CPA-Sequenz in die 3D-Koordinaten der Kristallstruktur von Rinder-CPA einzupassen, um die beste Anpassung und entsprechend eine projizierte 3D-Struktur für HCPA zu bestimmen.
Beispiel 220
Zellkultur-Targeting und Therapie
Wein-133 B-Zell-Lymphomzellen wurden mit einem Konjugat aus Wildtyp-HCPA 1 und Campath für 30 min inkubiert. Die Zellen wurden dann zur Entfernung von ungebundenem Konjugat gewaschen und zur Zellkultur mit 500 000 Zellen ml^-1 zurückgegeben. Die Zellen wurden in Gegenwart von unterschiedlichen Konzentrationen des Prodrugs MTX-Phe kultiviert und die Stärken der Wachstumshemmung nach 3 Tagen analysiert. Die Ergebnisse sind in 1 erläutert. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn ein Konjugat von Mutante 268 Gly mit Campath gegen das Wildtyp-Konjugat substituiert wurde.
Beispiel 221
Prodrug-Toxizität
Der stabile Prodrug der vorliegenden Erfindung sollte zusätzlich dazu, stabil in vivo zu sein, ebenfalls weniger toxisch im Wirt als der Stammarzneistoff sein, um höhere Dosierungsniveaus des Prodrugs und wiederum die Erzeugung lokaler hoher Konzentrationen des aktiven Mittels zu erlauben. Wir haben gefunden, daß die maximal tolerierte Dosis für Methotrexat in der Maus (weiblich, Stamm CD-1 nu/nu) 4 mg/kg iv einmal täglich für 5 Tage ist. Dosen von N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)-methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-2-cyclopentyl-L-phenylalanin bis zu 20 mg/kg iv einmal täglich für 5 Tage wurden toleriert, und Dosen von bis zu 40 mg/kg von N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)-benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalanin oder N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-tertbutyl-L-phenylalanin iv einmal täglich für 5 Tage erzeugten keine Toxizität; daher sind die maximal tolerierten Dosen der letzteren zwei Verbindungen größer als 40 mg/kg. In schweizer nu/nu-Mäusen beträgt die maximal tolerierte Dosis von Methotrexat 2,5 mg/kg iv täglich für 5 Tage. In diesen Mäusen wurde N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)-methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-tyrosin in Dosen bis zu 50 mg/kg iv täglich für 5 Tage toleriert, während N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclobutyl-L-phenylalanin etwas Toxizität bei Dosen von 30 mg/kg iv täglich für 5 Tage zeigte. Daher wäre bei schweizer nu/nu-Mäusen bei diesem 5-fachen täglichen Schema der MTD-Wert für N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)-methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-tyrosin und N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclobutyl-L-phenylalanin >50 mg/kg bzw. <30 mg/kg. Somit werden die Prodrugs der vorliegenden Erfindung tatsächlich viel besser als die entsprechenden aktiven Mittel toleriert.
Beispiel 222
Aktivität einer mutierten humanen Carboxypeptidase A1 mit einem stabilen Prodrug
Wie hier angegeben wird, sollte der in vivo stabile Prodrug der vorliegenden Erfindung ein besseres Substrat für ein mutiertes Enzym als für das entsprechende Wildtyp-Enzym sein, damit der stabile Prodrug selektiv am Tumor aktiviert wird. Tabelle 2 zeigt die Enzymkinetik für verschiedene Prodrugs von Methotrexat mit humaner Carboxypeptidase A1 vom Wildtyp und Mutanten, in denen Thr 268 zu entweder Ala oder Gly mutiert ist. Die relevanteste kinetische Konstante in der Tabelle ist kcat/Km, das eine Abschätung der Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung für die Enzym-katalysierte Umwandlung von Prodrug zu Methotrexat liefert. So ist das Enzym mit einem besonderen Substrat um so effizienter, je größer kcat/Km ist. Es ist ersichtlich, daß kcat/Km für humanes CPA1 mit einem der besten Substrate für dieses Wiltyp-Enzym, N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-L-phenylalaninat, dem Prodrug von MTX, 0,44/μM/s ist. Die kcat/Km-Werte für N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-2-cyclopentyl-L-phenylalanin, N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalanin, N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-tert-butyl-L-phenylalanin, N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclobutyl-L-phenylalanin und N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-tyrosin für die humane CPA1 sind viel niedriger; tatsächlich waren die durch humane CPA katalysierten Reaktionen mit den letzteren vier Prodrugs nicht meßbar. Jedoch sind die kcat/Km-Werte für diese fünf stabilen Prodrugs mit 268 Gly 0,157, 0,092, 0,38, 1,8 bzw. 0,18/μM/s. So wandelte die einzelne Mutation an 268 von Thr zu Gly sehr schlechte Substrate im Wildtyp-Enzym zu ausgezeichneten Substraten im mutierten Enzym um. Tatsächlich ist die Aktivität von 268 Gly mit dem Prodrug im Fall von N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-tert-butyl-L-phenylalanin nicht anders als die humane CPA1 mit N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-L-phenylalanin, einem ihrer besten Substrate. Ferner ist die Aktivität von 268 Gly im Falle von N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)-methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclobutyl-L-phenylalanin viermal besser als CPA1 mit N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)-methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-L-phenylalanin. Daher sind die Verbindungen viel bessere Substrate für das mutierte Enzym als für das Wildty-Enzym, was eine sehr spezifische tumorgerichtete Aktivierung des nicht-toxischen, stabilen Prodrugs zum aktiven Mittel erlaubt. Tabelle 2
Die Kinetik wurde durch eine Modifikation des gekoppelten Tests von Kuefner et al. bestimmt, (1989) Biochemistry 28, 2288-2297, in dem das Produkt MTX durch überschüssige Carboxypeptidase G zum Pteroat von MTX umgewandelt wird. In diesem Test wird die Reaktion spektrophotometrisch bei 315 nm verfolgt; bei dieser Wellenlänge wurde die Veränderung der molaren Absortivität für die gekoppelte Reaktion zu 9,57 mM^–1 cm^–1 bestimmt. Die Tests wurden bei 25°C in 25 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 7,4 durchgeführt. Prodrugs wurden bei 25°C mit Puffer und 17 mE Sigma #C-9658 Carboxypeptidase G in 1 ml Gesamtvolumen vorinkubiert. Der Test wurde mit Carboxypeptidase A oder der entsprechenden Mutante begonnen. Anfangsgeschwindigkeiten wurden erhalten, und standardmäßige Michaelis-Menten-Berechnungen wurden verwendet, um die kinetischen Konstanten zu bestimmen (in Biochemistry, A.L. Lehninger 1970, Worth Publishers, Inc., NY). Tabelle 3 Antikörper und Antigene
Tabelle 3 (Fortsetzung)
Tabelle 3 (Fortsetzung)
Tabelle 4 Aminosäure-codierende Sequenzen für humane CPA1 und CPA2*
Tabelle 5 Aminosäuresequenzen für die 268Gly-Mutationen von humaner CPA1 und CPA2*
SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE ANGABEN
(i) ANMELDER

(A) NAME: The Wellcome Foundation Limited (B) STRASSE: Unicorn House, 160 Euston Road (C) ORT: London (D) BUNDESLAND: nicht zutreffend (E) LAND: England (F) POSTLEITZAHL: NW1 28P (A) NAME: SMITH, Gary Keith (B) STRASSE: 521 Mills Street (C) ORT: Raleigh (D) BUNDESLAND: North Carolina (E) LAND: Vereinigte Staaten von Amerika (F) POSTLEITZAHL: 27608 (A) NAME: BLUMENKOPF, Todd Andrew (B) STRASSE: 201 Hunter Hill Road (C) ORT: Chapel Hill (D) BUNDESLAND: North Carolina (E) LAND: Vereinigte Staaten von Amerika (F) POSTLEITZAHL: 27516 (A) NAME: CORY, Michael (B) STRASSE: 55 Cedar Street (C) ORT: Chapel Hill (D) BUNDESLAND: North Carolina (E) LAND: Vereinigte Staaten von Amerika (F) POSTLEITZAHL: 27514

(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: THERAPIE
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 22
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG

(A) DATENTRÄGER: Diskette (B) COMPUTER: IBM-PC-kompatibel (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: PatentIn Ausgabe #1.0, Version #1.25 (EPO)

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA

(A) LÄNGE: 1257 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGFORM: Doppelstrang (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA zu mRNA
(ix) MERKMAL

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS (B) LAGE: 1..1257

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ 2D NO: 1
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA

(A) LÄNGE: 419 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA

(A) LÄNGE: 1251 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGFORM: Doppelstrang (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA zu mRNA
(ix) MERKMAL

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS (B) LAGE: 1..1251

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ 2D NO: 3
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA

(A) LÄNGE: 417 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ 2D NO: 4
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA

(A) LÄNGE: 22 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA zu mRNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA

(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA zu mRNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA

(A) LÄNGE: 21 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ 2D NO: 8
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA

(A) LÄNGE: 37 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10
(2) ANGABEN ZU SEQ 2D NO: 11
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA

(A) LÄNGE: 27 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA

(A) LÄNGE: 32 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA

(A) LÄNGE: 33 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14
(2) ANGABEN ZU SEQ 2D NO: 15
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA

(A) LÄNGE: 20 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA

(A) LÄNGE: 419 Aminosäuren (B) AAT: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ 2D NO: 17
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA

(A) LÄNGE: 417 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18
(2) ANGABEN ZU SEQ 2D NO: 19
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA

(A) LÄNGE: 50 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ 2D NO: 19
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 20
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ 2D NO: 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 21
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 22
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22

Claims

Konjugat, das ein Targeting-Molekül, das ein Enzym auf eine besondere Säugetierzelle übertragen kann, und ein Säugetierenzym, das mit dem Targeting-Molekül konjugiert ist und eine funktionell inaktive Vorstufe eines Chemotherapeutikums zu dessen aktiver Form katalysieren kann, umfaßt, worin das Enzym eine Mutante ist und die Vorstufe refraktär für endogene Katalyse durch die Wildtyp-Form des Enzyms ist.
Konjugat gemäß Anspruch 1, worin das Enzym eines aus einer Hydrolase, einer Transferase, einer Oxidoreduktase, einer Isomerase, einer Lyase und einer Ligase ist.
Konjugat gemäß Anspruch 2, worin die Hydrolase eine Peptidase ist.
Konjugat gemäß Anspruch 2, worin die Hydrolase eine Esterase ist.
Konjugat gemäß Anspruch 3, worin die Peptidase eine Exopeptidase ist.
Konjugat gemäß Anspruch 3 oder 4, worin die Peptidase gemäß Anspruch 3 oder die Esterase gemäß Anspruch 4 eine Carboxypeptidase ist.
Konjugat gemäß Anspruch 6, worin die Carboxypeptidase eine humane Carboxypeptidase A ist.
Konjugat gemäß Anspruch 7, worin die humane Carboxypeptidase A HCPA 1 oder HCPA 2 ist, die Aminosäuresubstitutionen an einem oder mehreren der Reste 203, 210, 242, 244, 250, 253, 255, 267, 268, 269 und 305 besitzen.
Konjugat gemäß Anspruch 8, worin die Aminosäuresubstitutionen aus den folgenden ausgewählt sind: Gly bei 250 und 268, Gly bei 253 und 268, Gly bei 250 und His bei 268, Gly bei 250, Ala bei 255 und His bei 268, His bei 268 und Gly bei 268.
Konjugat gemäß Anspruch 9, worin die Substitution Gly bei 268 ist.
Konjugat gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10, worin alle anderen Reste vom Wildtyp sind.
Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, worin das Targeting-Molekül eines aus einem Antikörper, einem Hormon, einem Liganden, einem Cytokin, einem Antigen, einem Oligonukleotid und einem Peptidomimetikum ist.
Konjugat gemäß Anspruch 12, worin der Antikörper ein polyklonaler Antikörper, ein monoklonaler Antikörper oder ein Fragment davon ist.
Konjugat gemäß Anspruch 13, worin der Antikörper oder das Fragment davon humanisiert ist.
Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, worin das Targeting-Molekül mit dem Enzym durch ein Linker-Molekül verbunden ist.
Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, das aus einem einzelnen RNA-Transkript oder multiplen RNA-Transkripten translatiert ist.
DNA- oder RNA-Molekül, das ein Konjugat gemäß Anspruch 16 codiert.
Vektor, der die DNA oder RNA gemäß Anspruch 17 enthält.
Zellinie, die die DNA oder RNA gemäß Anspruch 17 oder einen Vektor gemäß Anspruch 18 enthält.
Verbindung der allgemeinen Formel (II):
worin X NH oder 0 darstellt und R² CO₂H, SO₃H, SO₂H, OSO₃H, PO₃H₂, OPO₃H₂, C_1-6-Alkyl-verestertes CO₂H, C_1-6-verestertes PO₃H₂, C_4-12-Alkyl, C_4-12-Alkenyl, C_4-12-Alkinyl, verzweigtes C_4-12-Alkyl, C_1-8-Alkyl oder verzweigtes C_3-8-Alkyl; substituiert mit CO₂H, SO₃H, SO₂H, OSO₃H, PO₃H₂, OPO₃H₂, C_1-6-Alkyl-verestertem CO₂H, C_1-6-Alkyl-verestertem PO₃H₂, Hydroxyl, Alkoxy, Halogen, Halogenalkyl, Cyano oder Carboxamid; C_3-8-Cycloalkyl, Aryl oder Heteroaryl. darstellt, gegebenenfalls substituiert mit C_1-8-Alkyl, verzweigtem C_3-8- Alkyl, C_3-8-Cycloalkyl, C_3-8-Alkenyl, C_2-6-Alkinyl, C_4-6-Cycloalkenyl, trisubstituiertem Silyl, d.h. (R¹³)(R¹⁴)(R¹⁵)Si, worin R¹³, R¹⁴ und R¹⁵ C_1-6-Alkyl, verzweigtes C_3-6-Alkyl, C_3-6-Cycloalkyl, C_3-6-Alkenyl, C_2-6-Alkinyl, C_4-6-Cycloalkenyl, Aryl oder Heteroaryl sind, und worin R¹³, R¹⁴ und R¹⁵ jeweils die gleiche Gruppe oder unterschiedliche Gruppen sind (z.B. Trimethylsilyl, tert-Butyldimethylsilyl, Cyclohexyldimethylsilyl oder Phenyldimethylsilyl), Aryl, CO₂H, SO₃H, SO₂H, OSO₃H, PO₃H₂, OPO₃H₂, C_1-6-Alkyl-verestertem CO₂H, C_1-6-Alkyl-verestertem PO₃H₂, Carboxamid, Hydroxyl, C_1-6-Alkoxy, C_1-6-Alkylthio, Mercapto, Halogen, Halogenalkyl, Nitro oder Cyano, R^2a und R^2b H, Hydroxy, Mercapto, Alkoxy, Alkylthio, Halogen, Cyano, CO₂H, SO₃H, SO₂H, OSO₃H, PO₃H₂, OPO₃H₂, C_1-6-Alkylverestertes CO₂H, Carboxamid, C_1-6-Alkyl-verestertes PO₃H₂, cyclisches C_2-6 [d.h. R2a und R2b stellen zusammen (CH₂)_2-6 dar], trisubstituiertes Silyl, d.h. (R¹³)(R¹⁴)(R¹⁵)Si, worin R¹³, R¹⁴ und R¹⁵ C_1-6-Alkyl, verzweigtes C_3-6-Alkyl; C_3-6-Cycloalkyl, C_3-6-Alkenyl, C_2-6-Alkinyl, C_4-6-Cycloalkenyl, Aryl oder Heteroaryl sind und worin R¹³, R¹⁴ und R¹⁵ die gleiche Gruppe oder unterschiedliche Gruppen sein könnten, z.B. Trimethylsilyl, tert-Butyldimethylsilyl, Cyclohexyldimethylsilyl oder Phenyldimethylsilyl; oder C_1-6-Alkyl oder verzweigtes C_1-6-Alkyl oder C_1-6-Cycloalkyl oder Aryl oder Heteroaryl darstellen, gegebenenfalls substituiert mit Hydroxy, Mercapto, C_1-6-Alkoxy, C_1-6-Alkylthio, Halogen, Cyano, CO₂H, SO₃H, SO₂H, OSO₃H, Nitro, PO₃H₂, OPO₃H₂, C_1-6-Alkyl-verestertem CO₂H, Carboxamid, C_1-6-Alkylverestertem PO₃H₂, C_1-6-Alkyl, verzweigtem C_1-6-Alkyl, C_1-6-Cycloalkyl, trisubstituiertem Silyl, d.h. (R¹³)(R¹⁴)(R¹⁵)Si, worin R¹³, R¹⁴ und R¹⁵ C_1-6-Alkyl, verzweigtes C_3-6-Alkyl, C_3-6-Cycloalkyl, Aryl oder Heteroaryl sind, und worin R¹³, R¹⁴ und R¹⁵ die gleiche Gruppe oder unterschiedliche Gruppen sein könnten, z.B. Trimethylsilyl, tert-Butyldimethylsilyl oder Phenyldimethylsilyl; mit der Maßgabe, daß R^2a und R^2b nicht beide Hydroxy oder Mercapto sind; F eine Einheit der Formel (IV) umfaßt:
worin R¹ eine Gruppe darstellt, die der Seitenkette einer beliebigen α-Aminosäure entspricht, z.B. H, C_1-6-Alkyl, C_1-6-Alkenyl, C_1-6-Alkinyl, gegebenenfalls substituiert mit CO₂H, C_1-6-Alkyl-verestertes CO₂H, OPO₃, PO₃H₂, C_1-6-Alkyl-verestertes PO₃H₂, Halogen, Hydroxy, Carboxamid, Amino, gegebenenfalls substituiert mit C_1-6-Alkyl, Cyano oder Nitro, E
worin n = 3-6 ist, oder
darstellt, von denen jedes gegebenenfalls mit einem oder mehreren aus Hydroxy, einem oder mehreren aus Alkoxyl, Halogen oder C_1-6-Alkyl substituiert sein kann, gegebenenfalls substituiert mit einem oder mehreren aus Hydroxy, C_1-6-Alkoxy oder Halogen; D -CH₂-CH(R³)-, -CH₂-NR³-, -NR³-CH₂-, -CH₂S- oder -CH₂O- darstellt, worin R³ H, C_1-6-Alkyl, Allyl oder Propargyl ist, gegebenenfalls substituiert mit einem oder mehreren aus C1-6-Alkoxy, Halogen, Hydroxy oder Cyano; und B
darstellt, worin R⁴ H, verzweigtes C_3-6-Alkyl, C_3-6-Cycloalkyl oder C_1-6-Alkyl darstellt; R⁵ C_1-6-Alkyl, verzweigtes C_3-6-Alkyl, C_3-6-Cycloalkyl oder Amino darstellt (gegebenenfalls substituiert mit C_1-6-Alkyl, C_1-6-Alkanoyl oder Benzyl); R⁶ H, C_1-6-Alkyl, verzweigtes C_3-6-Alkyl, C_3-6-Cycloalkyl, Amino (gegebenenfalls substituiert mit C_1-6-Alkyl, C_1-6-Alkanoyl oder Benzyl), C_1-6-Alkoxyl oder C_1-6-Alkylthio darstellt; und R⁷ H, C_1-6-Alkyl, verzweigtes C_3-6-Alkyl, C_3-6-Cycloalkyl, Halogen-C_1-6-alkyl oder Halogen darstellt; und Salze, N-Oxide, Solvate und physiologisch funktionelle Derivate davon; mit der Maßgabe, daß die folgenden Verbindungen nicht in der Formel eingeschlossen sind: N-(N-(4-(((2-Amino-3,4-dihydro-4-oxo-6-chinazolinyl)methyl)(2-propinyl)amino)benzoyl)-L-glutam-1-yl)-L-glutaminsäure, N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-L-glutaminsäure, N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-L-asparaginsäure, N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-L-phenylalanin, 4-Bis(2-chlorethyl)amino)phenylalanylphenylalanin und 4-Bis(2-chlorethyl)amino)phenylalanyl-3,5-dimethyl-4-methoxyphenylalanin.
Verbindung gemäß Anspruch 20 und Salze, N-Oxide, Solvate und physiologisch funktionelle Derivate davon, worin X NH ist; R² C_3-8-Cycloalkyl oder Aryl ist, substituiert mit C_3-8-Alkyl, C_3-8-Cycloalkyl, verzweigtem C_3-8-Alkyl oder trisubstituiertem Silyl, d.h. (R¹³)(R¹⁴(R¹⁵)Si, worin R¹³, R¹⁴ und R¹⁵ C_1-6-Alkyl, verzweigtes C_3-6-Alkyl, C_3-6-Cycloalkyl, Aryl oder Heteroaryl sind, und worin R¹³, R¹⁴ und R¹⁵ jeweils die gleiche Gruppe oder unterschiedliche Gruppen sind (z.B. Trimethylsilyl, tert-Butyldimethylsilyl, Cyclohexyldimethylsilyl oder Phenyldimethylsilyl); R2a und R2b nicht beide H sind; R¹ H, C_1-6-Alkyl, CH₂CO₂H, CH₂CH₂CO₂H oder CH₂CH₂CH₂NH₂ ist; E
ist, D -CH₂NH-, -CH₂N(CH₃)-, -CH₂N(CH₂C=CH)-, -CH₂CH₂- oder -CH₂-CH(C₂H₅)- ist; und B
ist.
Verbindung gemäß Anspruch 20 und Salze, N-Oxide, Solvate und physiologisch funktionelle Derivate davon, worin X NH ist; R² Phenyl oder para-Hydroxyphenyl ist, substituiert mit Cyclopentyl, Cyclobutyl oder tert-Butyl, wobei die Cyclopentyl-, Cyclobutyl- und tert-Butyl-Gruppen beide entweder ortho- oder meta- sein können, aber bevorzugt meta- sind, R^2a und R^2b H sind; R¹ CH₂CH₂CO₂H ist; E
ist; D -CH₂N(CH₃)- ist; und B
ist.
Die folgenden Verbindungen und Salze, N-Oxide, Solvate und physiologisch funktionelle Derivate davon: N-((S)-4-Carboxy-2-(5-(((1,2-dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(F)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-1-oxo-2-isoindolinyl)butanoyl)-L-phenylalanin, N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-2-cyclopentyl-L-phenylalanin, N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalanin, N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclobutyl-L-phenylalanin, N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-trimethylsilyl-L-phenylalanin, N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-tert-butyl-L-phenylalanin, N-(4-((3-(2,4-Diamino-1,6-dihydro-6-oxo-5-pyrimidinyl)propyl)amino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalanin, N-(4-(((1,2-Dihydro-3-methyl-1-oxobenzo(F)chinazolin-9-yl)methyl)amino)-2-fluorbenzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-phenylalanin, N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)-methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-tyrosin, N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3,5-diiod-L-tyrosin, N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-2-cyclopentyl-L-tyrosin, (S)-3-(3-Cyclopentyl-4-hydroxyphenyl)-2-((N-4-(((2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl)oxy)propionsäure, N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-tert-butyl-L-tyrosin. N-(4-(((2,4-Diamino-6-pteridinyl)methyl)methylamino)benzoyl)-L-glutam-1-yl-3-cyclopentyl-L-tyrosin und Salze, N-Oxide, Solvate und physiologisch funktionelle Derivate davon.
Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 20 bis 24 oder eines Konjugats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 oder einer Zellinie gemäß Anspruch 19 oder eines Vektors gemäß Anspruch 18 oder von DNA oder RNA gemäß Anspruch 17 in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der medizinischen Therapie.
Verwendung eines Konjugats, das ein mutiertes Säugetierenzym und ein Zelltyp-spezifisches Targeting-Molekül umfaßt, in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem Verfahren gerichteter Chemotherapie, worin das Enzym die Umwandlung einer funktionell inaktiven Vorstufe eines Chemotherapeutikums zu dessen aktiver Form katalysieren kann, wohingegen die Vorstufe refraktär für eine endogene Katalyse ist.
Verwendung einer Vorstufe eines Chemotherapeutikums in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Behandlung eines Patienten, der der Therapie mit einer besonderen Zellpopulation bedarf, und der ein Konjugat besitzt, das ein Targeting-Molekül und ein Säugetierenzym gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 umfaßt, gebunden an die besondere Zellpopulation, wobei die Vorstufe funktionell inaktiv ist, aber zur ihrer aktiven Form durch das Säugetierenzym im Konjugat umgewandelt werden kann, aber refraktär für eine endogene Katalyse durch die Wildtyp-Form des Enzyms ist.
Mutiertes Säugetierenzym, das eine funktionell inaktive Vorstufe eines Chemotherapeutikums zu dessen aktiver Form katalysieren kann, worin die Vorstufe refraktär für eine endogene Katalyse ist.
Enzym gemäß Anspruch 28, worin das Enzym Carboxypeptidase-Aktivität besitzt.
Enzym gemäß Anspruch 29, worin das Enzym eine humane Carboxypeptidase A ist.
Enzym gemäß Anspruch 30, worin das Enzym HCPA 1 oder HCPA 2 ist, welche Aminosäuresubstitutionen an einem oder mehreren der Reste 203, 210, 242, 244, 250, 253, 255, 267, 268, 269 und 305 besitzen.
Enzym gemäß Anspruch 31, worin die Aminosäuresubstitutionen aus den folgenden ausgewählt sind: Gly bei 250 und 268, Gly bei 253 und 268, Gly bei 250 und His bei 268, Gly bei 250, Ala bei 255 und His bei 268, His bei 268 und Gly bei 268.
Enzym gemäß Anspruch 32, worin die Substitution Gly bei 268 ist.
Enzym gemäß einem der Ansprüche 31 bis 33, worin alle anderen Reste vom Wildtyp sind.
DNA- oder RNA-Molekül, das ein Enzym gemäß einem der Ansprüche 28 bis 34 codiert.
Vektor, der ein DNA- oder RNA-Molekül gemäß Anspruch 35 enthält.
Zellinie, die ein DNA- oder RNA-Molekül gemäß Anspruch 35 oder einen Vektor gemäß Anspruch 36 kombiniert.