DE69434970T2 - Verbesserungen in der bereitung von prodrogen - Google Patents

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Description

  • Die Verwendung von Prodrugs ist ein klinisch sehr wertvolles Konzept in der Krebstherapie, da, besonders wenn das Prodrug unter Einfluss eines Enzyms, das an einen monoklonalen Antikörper gebunden werden kann, der sich an ein tumorassoziiertes Antigen bindet, in ein Antitumormittel überführt werden soll, die Kombination eines solchen Prodrugs mit einem Konjugat aus Enzym und monoklonalem Antikörper ein sehr starkes klinisches Mittel darstellt. Dieser Ansatz zur Krebstherapie, der oft als „antikörpergerichtete Enzym/Prodrug-Therapie" (ADEPT) bezeichnet wird, ist in WO 88/07378 offenbart.
  • Vor kurzem ist ein ähnlicher Ansatz vorgeschlagen worden („VDEPT"), wo mit einem Virusvektor, der ein Gen trägt, das für ein Enzym kodiert, das in der Lage ist, ein Prodrug zu aktivieren, statt mit einem Antikörper/Enzymkonjugat auf Tumorzellen abgezielt wird. Das Gen kann durch tumorspezifische Promotor- oder Enhancersequenzen in seiner Transkription reguliert werden. Der Virusvektor tritt in Tumorzellen ein und exprimiert das Enzym, sodass ein Prodrug nur in der Nachbarschaft der Tumorzellen in ein aktives Arzneimittel überführt wird (Huber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8039 (1991)). Alternativ dazu sind nicht-virale Verfahren zur Verabreichung von Genen verwendet worden. Solche Verfahren umfassen Kalziumphosphatcopräzipitation, Mikroinjektion, Liposomen, direkte DNA-Aufnahme und rezeptorvermittelten DNA-Transfer. Diese sind in Morgan & French Anderson, Annu. Rev. Biochem. 62, 191 (1993), besprochen. Der Begriff „GDEPT” (gengerichtete Enzym/Prodrugtherapie) wird dazu verwendet, sowohl ein virales als auch nicht-virales Verabreichungssystem zu umfassen. Das Enzym kann auf besondere subzelluläre Stellen abzielen oder an der Zelloberfläche exprimiert werden.
  • Obwohl GDEPT- und ADEPT-Systeme die Konzentrationen von Antitumormitteln erhöhen, die an die Stelle eines Tumors verabreicht werden können, besteht noch immer ein Bedarf, die Spezifität der Arzneimittelverabreichung zu erhöhen. In beiden Systemen kann das aktive Arzneimittel in die Umgebung normaler Zellen freigesetzt werden und Schäden verursachen. Im Fall von ADEPT kann dies durch die Aktivierung von Prodrugs durch Konjugate erreicht werden, die bei der Lokalisierung an die Tumorstelle versagt haben. Bei GDEPT kann die Transformation von normalem Ge webe zu verbleibenden Expressionsgraden des Enzyms fern vom Tumor führen, oder es können aktive Arzneimittel aus Tumorzellen freigesetzt werden. Obwohl Wege zur Erhöhung der Spezifität von ADEPT-Systemen in WO 89/10140 offenbart sind, bleibt ein kontinuierlicher Bedarf, das Ausmaß von ADEPT- und GDEPT-Spezifität zu verbessern.
  • Ras steht oft mit der Transformation von Zellen in Verbindung. Onkogenes ras ist in einer Reihe von menschlichen Tumoren überexprimiert, z.B. in über 50 % von Colonkarzinomen und 90 % von Pankreaskarzinomen (Marsters et al., Science 260, 1937–1942 (1993)), auch in Lungentumoren.
  • Es ist gezeigt worden, dass die Hemmung von onkogenem ras in Zellkultur zur Umkehr des transformierten Phänotyps führt. Deshalb kann die Fähigkeit, spezifische Inhibitoren von ras zu entwickeln, große therapeutische Anwendung finden.
  • Jedoch ist ein potenzielles Problem beim Abzielen auf ras die Gegenwart von normalem nichtmutiertem ras in allen normalen Zellen. In normalen Zellen ist die Rolle von ras entscheidend. Es ist daher essentiell, nur aktiviertes ras in transformierten Zellen selektiv zu hemmen.
  • Kürzlich sind Inhibitoren von ras-Farnesyltransferase, die selektiv Farnesylierung von onkogenem Ras hemmen, beschrieben worden (Kohl, Science 260 (1993); James, ebenda, 1937).
  • Solche Probleme können durch die Verwendung einer neuen Klasse von Prodrugs behandelt werden, die Prodrugs von ras-Inhibitioren, wie z.B. Inhibitoren von Farnesyltransferase, sind. Dieses Enzym ist für die Farnesylierung von ras essentiell, was für die Transformationsfunktion von onkogenem ras ein absolutes Erfordernis ist (Gibbs, Seminars in Cancer biol. 3, 383 (1992)).
  • Die Verwendung von ras-Inhibitoren, wie z.B. Farnesyltransferaseinhibitoren, in ADEPT oder GDEPT stellt daher ein erhöhtes Ausmaß an Spezifität für die Behand lung von Tumorzellen bereit. Prodrugs, die auf Farnesyltransferaseinhibitoren basieren, werden primär an der Stelle eines Tumors in Farnesyltransferaseinhibitoren überführt, aber zur selben Zeit verursacht die Freisetzung von Farnesyltransferaseinhibitoren an anderen Stellen oder aus dem Tumor keine Zytotoxizität, die mit der Freisetzung von nicht-spezifischen zytotoxischen Arzneimitteln vergleichbar ist.
  • Saperstein et al. (Biochemistry Band 28, Nr. 123, 5694–5701 (1989)) beschreiben (Hydroxy-2-naphthalinylmethyl)phosphonsäure, einen Inhibitor von Insulinrezeptortyrosinkinase (IRTK). Der Inhibitor wurde in verschiedene (Acyloxy)methyl-Prodrugs überführt, um Durchlässigkeit durch Zellmembranen zu erreichen, und diese Prodrugs hemmten offensichtlich insulinstimulierte Autophosphorylierung und Glucoseoxidierung.
  • Hierin sind Prodrugs der folgenden allgemeinen Formeln beschrieben: FTLi-(PRT)m wo FTLi eine ras-Inhibitorverbindung, wie z.B. eine Farnesyltransferaseinhibitorverbindung, ist und PRT m Schutzgruppen repräsentiert, die in der Lage sind, durch die Wirkung eines Enzyms aus dem ras-Inhibitor gespalten zu werden, wo m eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist.
  • Geeignete FTLis umfassen jene, die von James et al. (ebenda) und Kohle et al. (ebenda) beschrieben sind, und insbesondere FTLis der allgemeinen Formeln (Ia)
    Figure 00030001
    worin Cys Cystein ist; A eine Gruppe -NH.CH(R1).COOR2 ist, worin R1 eine natürlich auftretende Aminosäureseitenkette ist und R2 Wasserstoff, Methyl oder Amino ist. Verbindungen der Formel Ia, in welchen A eine Leucin-Gruppe [-NH.CH(CH2CH(CH3)2).COOH], eine Serin-Gruppe [-NH.CH(CH2OH).COOH], eine Methionin-Gruppe [-NH.CH(CH2CH2SCH3).COOH] oder eine amidierte Methionin-Gruppe [-NH.CH(CH2CH2SCH3).CONH2] ist, sind bevorzugt. Verbindungen der Formel Ia können als racemische Gemische verwendet werden, oder die Isomere können isoliert werden.
  • Andere geeignete FLTis umfassen jene der Formel (Ib) oder (Ic):
    Figure 00040001
    R3 und R4 sind
    die Seitenketten von natürlich auftretenden Aminosäuren (zum Beispiel -CH3, -CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2CH3, -CH2OH, -CH2CH2SCH3, -CH(OH)CH3), einschließlich ihrer oxidierten Formen (zum Beispiel Methioninsulfoxid oder Methioninsulfon), oder sind substituierte oder nicht substituierte aliphatische, aromatische oder heteroaromatische Gruppen, vorzugsweise Cyclohexyl, Phenyl, Pyridyl, Imidazolyl oder gesättigte oder nicht gesättigte verzweigte oder unverzweigte Ketten von 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, die gegebenenfalls mit einem aromatischen oder heteroaromatischen Ring substituiert sind;
    X1 ist CH2CH2, trans-CH=CH oder CH2NH, und
    X2 ist (CH2)n, worin n = 0, 1 oder 2 ist. Vorzugsweise repräsentieren R3 und R4 beide CH(CH3)CH2CH3.
  • Verbindungen der Formel (Ib) oder (Ic), worin X1 -CH2NH- ist, können durch das folgende allgemeine Verfahren erhalten werden. Eine Verbindung der Formel (IX):
    Figure 00050001
    worin Y1 eine geeignete Schutzgruppe ist, zum Beispiel t-Butoxycarbonyl, und worin R3 so ist wie zuvor definiert, die aus der entsprechenden geschützten Aminosäure durch Bildung von Weinreb-Amid hergestellt wird, gefolgt von Reduktion, vorzugsweise durch LiAlH4 in Ether unter –35 °C, wird mit dem Trifluoracetatsalz einer Verbindung der Formel (X):
    Figure 00050002
    worin R4 wie oben definiert ist, in wasserfreiem DMF, gefolgt von Natiumtriacetoxyborhydrid umgesetzt, um eine Verbindung der Formel (XI) zu erhalten:
    Figure 00050003
    worin Y1, R3 und R4 wie oben definiert vorliegen. Die Verbindung der Formel (XI) wird dann in Gegenwart von Triethylamin mit einer Verbindung der Formel (XII) umgesetzt:
    Figure 00050004
    worin X2 wie oben definiert vorliegt, um eine Verbindung der Formel (XIII) zu erhalten:
    Figure 00060001
    worin Y1, R3, R4 und X2 wie oben definiert vorliegen. Dieses Produkt wird dann von der Schutzgruppe befreit, zum Beispiel durch Behandlung mit einer Lösung von wasserfreiem Chlorwasserstoff in Ethylacetat bei –25 °C, und wird dann mit einer Verbindung der Formel (XIV) umgesetzt:
    Figure 00060002
    worin Y2 und Y3 geeignete Schutzgruppen sind, zum Beispiel ist Y2 t-Butoxycarbonyl und Y3 Trityl (Verbindungen der Formel (XIV) können aus dem entsprechenden geschützten Cystein durch Bildung von Weinreb-Amid, gefolgt von Reduktion, vorzugsweise durch LiAlH4 in Ether bei unter –35 °C, erhalten werden), um nach Entfernung der Schutzgruppen eine Verbindung der Formel (Ib) zu erhalten, die dann gegebenenfalls hydrolysiert werden kann, um eine Verbindung der Formel (Ic) zu erhalten.
  • Die obigen Verbindungen der Formel (Ib) oder (Ic), worin X -CH2NH- ist, können auch unter Verweis auf Kohl et al. und James et al. erhalten werden.
  • Verbindungen der Formeln (Ib) oder (Ic), worin X CH2CH2 oder trans-CH=CH ist, können durch das in WO 94/09766 beschriebene Verfahren erhalten werden.
  • FTLis können an eine beliebige geeignete Schutzgruppe gebunden werden, die durch ein Enzym entfernt werden kann. Beispiele für solche Gruppen umfassen jene, die in WO 88/07378 oder in WO 93/08288 beschrieben sind. Zum Beispiel beschreibt WO 93/08288 „selbst-vernichtende" Prodrugs, die durch die Wirkung eines Nitroreductaseenzyms aktiviert werden können. Diese Prodrugs sind Derivate von p-Nitrobenzyloxycarbonylverbindungen.
  • Die exakte Struktur der Schutzgruppe hängt vom Wesen des ADEPT- oder GDEPT-Systems ab, mit welchem ein ras-Inhibitor-Prodrug verwendet wird. Es kann eine geeignete Gruppe sein, die durch ein Enzym entfernt werden kann oder durch das Enzym auf solche Art und Weise modifiziert werden kann, dass die Gruppe nicht stabil ist und einer „Selbstvernichtung" unterworfen wird, um das aktive ras-Inhibitor-Arzneimittel bereitzustellen.
  • Die Zahl der Schutzgruppen, die an jedes FTLi gebunden sind, hängt zum Teil von der genauen Struktur der Inhibitorverbindung ab. Sie hängt auch von der relativen Aktivität des ungeschützten FTLis zum FTLi ab, wenn eine verschiedene Anzahl von Schutzgruppen hinzugefügt wird, da, wenn zusätzliche Schutzgruppen eine Reduktion der Wirksamkeit des Prodrugs erreichen, dies das Verhältnis der Aktivität von FTLi zu FTLi-(PRT)m erhöht.
  • Wünschenswerterweise können eine oder zwei Schutzgruppen an jedes FTLi-Molekül gebunden werden, obwohl mehrere, z.B. 3, 4 oder 5, Gruppen hinzugefügt werden können, wenn FTLi von einer Struktur ist, die dieser Zahl ermöglicht, gebunden zu werden.
  • Dementsprechend umfassen Prodrugs Verbindungen mit einer Schutzgruppe der Formel (II): FTL-(X-CO.O-CH2-PH-NO2)m (II) wo X NH, O oder S ist, m eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist (z.B. 1, 2 oder 3), Ph ein gegebenenfalls substituierter Phenylenring und FTL eine Gruppe ist, sodass FTL-(XH)m ein FTLi ist, das m -XH-Gruppen enthält. Die Nitrogruppe kann an der Position 2 liegen, obwohl es bevorzugt an der Position 4 des Rings in Bezug auf den Ph-Ring liegt.
  • Innerhalb jeder Verbindung der Formel (II), wo m 2 bis 5 ist, kann jede Gruppe X und Ph gleich oder unterschiedlich sein. Vorzugsweise sind sie gleich.
  • FTL-Inhibitoren in Formel (III) umfassen jene der obigen Formel (Ia), (Ib) oder (Ic).
  • Geeignete Substituenten des Phenylenrings umfassen 1 bis 4 Gruppen, die gleich oder unterschiedlich sein können, die aus Fluor, Chlor, Brom, Iod, Hydroxy, Mercapto, Amino, Nitro, C1-4-Alkyl, C1-4-Halogenalkyl, C1-4-Alkoxy, C1-4-Halogenalkoxy, C2-4-Alkenyl, C2-4-Alkinyl und C2-4 Halogenalkenyl ausgewählt sind. Vorzugsweise sind die Substituenten 1 bis 4 Fluoratome an den Positionen 2, 3, 5 und 6 des Rings.
  • Bevorzugte Prodrugs sind jene der folgenden Formel (IIIa): FTL-(NH-CO.O-CH2-PH-NO2)m (IIIa)wo m und Ph wie oben definiert sind und FTL eine Gruppe ist, sodass FTL-(NH2)m eine FTLi-Verbindung ist, die m Aminogruppen enthält. Solche Prodrugs umfassen jene der obigen Formeln (Ib) oder (Ic), die zumindest eine Aminogruppe umfassen. Die Nitrogruppe kann an der Position 2 liegen, obwohl es bevorzugt an der Position 4 des Rings in Bezug zum Ph-Ring liegt.
  • Weitere bevorzugte Prodrugs sind jene der Formel (IIIb): FTL-(S-CO.O-CH2-Ph-NO2)m (IIIb) wo m und Ph wie oben definiert sind und FTL eine Gruppe ist, sodass FTL-(SHm) eine FTLi-Verbindung ist, die m Mercapto-Gruppen enthält. Solche Prodrugs umfassen jene der Formeln (Ib) oder (Ic) oben, die zumindest eine Mercapto-Gruppe enthalten. Die Nitro-Gruppe kann an Position 2 liegen, obwohl es bevorzugt an Position 4 des Rings in Bezug zum Ph-Ring liegt.
  • Bevorzugte Prodrugs sind jene der Formeln (IIIc): (O2N-Ph-CH2-O.OC-S)-FTL-(NH-CO.O-CH2-Ph-NO2) (IIIc)worin Ph gleich oder verschieden ist, wie oben definiert. FTL ist eine Gruppe, sodass (HS)-FTL-(NH2) eine FTLi-Verbindung ist. Solche Prodrugs umfassen jene der obigen Formeln (Ib) oder (Ic). Die Nitro-Gruppe kann an Position 2 liegen, obwohl es bevorzugt an Position 4 des Rings in Bezug zum Ph-Ring liegt.
  • Verbindungen der Formeln (II) und (IIIa, b & c) können als Prodrugs in einem ADEPT- oder GDEPT-System in Verbindung mit einem Nitroreductase-Enzym verwendet werden, einschließlich E.-coli-Nitroreductase, die in WO 93/08288 beschrieben ist. Während die vorliegende Erfindung aufgrund ihrer Definition nicht vom exakten Modus der Wirkung von Nitroreductase auf die Verbindung der Formel II (oder lila, b oder c) abhängig ist, wird davon ausgegangen, dass die Nitrogruppe des p-Nitrophenylbenzyloxycarbonylrests in die entsprechende Amino- oder Hydroxylamin-Gruppe überfüht wird und dass die resultierende p-Aminobenzyloxycarbonyl- oder p-Hydroxylaminobenzyloxycarbonylverbindung automatisch unter jenen Reaktionsbedingungen abgebaut wird, die für die enzymatische Reduktion verwendet werden, um die zytotoxische Verbindung freizusetzen und gemäß dem folgenden Reaktionsschema p-Aminobenzylalkohol oder p-Hydroxylaminobenzylalkohol und Kohlendioxid als Nebenprodukte zu bilden:
    FT-NH-CO.O.CH2-Ph-NO2 Nitroreductase
    FT-NH-CO.O.CH2-Ph-NH2 _______________
    FT-NH2 + CO2 + HO.CH2-Ph-NH2
  • Die p-Nitrobenzyloxycarbonylverbindungen werden in geeigneter Weise mithilfe von per se bekannten Verfahren der chemischen Synthese hergestellt. Zum Beispiel können geeignete geschützte Amin- oder Hydroxy-ras-Inhibitorverbindungen mit 4-Nitrobenzylchlorformiat unter wasserfreien Bedingungen in Gegenwart eines Chlorwasserstoffakzeptors, insbesondere eines Alkylamins, wie z.B. Triethylamin, umgesetzt werden. Diese Reaktion kann in einem trockenen organischen Lösungsmittel, wie z.B. Chloroform, durchgeführt werden, und die resultierende Verbindung der Formel II oder Formel IIIa, b oder c kann aus dem organischen Lösungsmittel mithilfe herkömmlicher Verfahren wie z.B. Chromatographie isoliert werden. Zur Verwendung in ADEPT soll das Prodrug unfähig sein, in die Zellen einzutreten, bzw. eine eingeschränkte Fähigkeit haben, dies zu tun, während in GDEPT das Prodrug in Zellen eintreten muss. Dementsprechend können Modifikationen an dem Prodrug vorgenommen werden, z.B. im Benzolring, um das Prodrug mehr oder weniger lipophil zu machen. Die Gammasäure der Glutaminsäure kann geändert werden, um Verbindungen lipophiler zu machen, z.B. mit einer Estergruppe.
  • Ähnliche Prodrugs, die durch ein Carboxypeptidaseenzym, wie z.B. Carboxypeptidase G2 (CPG2), aktiviert werden, können unter Einsatz von Derivaten der Formel (IV) hergestellt werden: Q-CO.O.CH2-Ph-Z-NH-glu( IV)wo Q Wasserstoff oder Fluor, Chlor oder Brom oder -O-(N-Succinimid) ist, Ph wie oben definiert ist, Z -O.CO- oder -NH.CO- ist und glu der Rest von Glutaminsäure ist, d.h. eine Gruppe: -CH(CO2H)(CH2CH2CO2H) oder ein Di-C1-6-alkylester (z.B. ein Ethyl- oder t-Butyl-ester) davon, um Prodrugs der Formel (V): FTL-(X-CO.O.CH2-Ph-Z-NH-glu)m (V) worin X wie oben definiert ist, und der Formel (VI) bereitzustellen: FTL-(NH-CO.O.CH2-Ph-Z-NH-glu)m (VI)wo FTL der Rest einer FTLi-Verbindung ist, sodass FTL-(XH)m und FTL-(NH2)m wie oben definiert sind, und wo m, Ph, Z und glu ebenfalls wie oben definiert sind. Wie oben für die Prodrugs der Formel (II) und Formel (IIIa, b oder c) erwähnt, sollte das Prodrug für ADEPT eine eingeschränkte Fähigkeit aufweisen, in Zellen einzutreten, während das Prodrug für GDEPT modifiziert werden kann, wenn es erforderlich ist, es lipophiler zu machen, sodass es in Zellen eintritt. Die Gamma-Carboxylgruppe der Glutaminsäure kann verändert werden, um Verbindungen herzustellen, die lipophiler sind, z.B. mit einem aromatischen oder heterozyklischen Amid.
  • Innerhalb jeder Verbindung der Formel (V), wo m von 2 bis 5 ist, kann jede Gruppe X und Ph gleich oder unterschiedlich sein. Bevorzugt sind sie gleich.
  • In Verbindungen der Formeln (IV), (V) und (VI) befindet sich die Gruppe -Z- an Position 4 des Rings in Bezug zum FTL enthaltenden Substituenten.
  • Verbindungen der Formel (V) und (VI), in welchen der FTL der Formel (Ib) oder (Ic) ist, sind bevorzugt.
  • Die Benzylchlorformiatderivate der Formel (IV), in welchen Z -NH.CO- ist, können aus 4-(Chlormethyl)phenylisocyanat durch Reaktion von Glutaminsäure oder einem geschützten Derivat davon hergestellt werden, z.B. in welchem beide Carboxylgruppen des Glutaminsäurerests mit Ethyl- oder t-Butylgruppen geschützt sind. Passenderweise wird die Reaktion in einem Lösungsmittel, wie z.B. CH2Cl2, etwa bei Raumtemperatur durchgeführt. Das resultierende Zwischenprodukt [4-Chlormethyl]phenyluridogiutamatdi-tert-butylester wird in wässrigem Ethanol unter Rückfluss behandelt, um die entsprechende 4-Hydroxymethylverbindung bereitzustellen, und diese wird mit Triphosgen ((CCl3O)2CO) in einem inerten Lösungsmittel, z.B. THF, bei Raumtemperatur umgesetzt, um eine gegebenenfalls geschützte Verbindung der Formel (IV) bereitzustellen. Die Verbindung kann, wenn sie geschützt ist, durch Behandlung mit Trifluoressigsäure oder Ameisensäure entschützt werden.
  • Die Benzylchlorformiatderivate der Formel (IV), in welchen Z -O.CO- ist, können ausgehend vom 4-Hydroxybenzaldehyd gemäß dem Reaktionsschema in Schema 1 hergestellt werden. Kurz gesagt wird der Aldehyd 5 mit 1,2-Ethandithiol in Borantrifluoretherat plus CH2Cl2 bei 25 °C etwa 12 Stunden lang behandelt, um das Zwischenprodukt 1,3-Dithiolan zu bilden, das mit Triphosgen wie oben beschrieben behandelt wird, um das 4-[1,3-Dithiolan]phenylchlorformiat zu bilden. Dies wird an Di-tert-butylglutamathydrochlorid in trockenem THF in Gegenwart von Triethylamin bei Raumtemperatur etwa 5 Stunden lang gebunden, um 4-[1,3-Dithiolan]phenylcarbamatglutamatdi-t-butyl bereitzustellen. Das Dithiolan wird mit Quecksilberperchlorat in Methanol und Chloroform bei etwa 25 °C etwa 5 Minuten lang entschützt. Der Aldehyd wird durch milde Reduktion mit Natriumborhydrid bei Raumtemperatur in Ether in den entsprechenden Benzylalkohol überführt und dann wie oben beschrieben mit Triphosgen in das entsprechende Chlorformiat überführt.
  • Bevorzugte Verbindungen der Formel (IV), wo Q -O-(N-Succinimid) ist, sind die neuen Verbindungen der Formel (XVI):
    Figure 00120001
    worin R5 C1-6-Alkyl repräsentiert, vorzugsweise Ethyl oder t-Butyl.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verbindungen der folgenden Formel:
    Figure 00130001
    worin
    R5 C1-6-Alkyl ist und
    der Phenylenring nicht substituiert ist oder
    der Phenylenring mit 1 bis 4 Gruppen substituiert ist, die gleich oder unterschiedlich sein können und die aus Folgenden ausgewählt sind: Fluor, Chlor, Brom, Iod, Hydroxy, Mercapto, Amino, Nitro, C1-4-Alkyl, C1-4-Halogenalkyl, C1-4-Alkoxy, C1-4-Halogenalkoxy, C2-4-Alkenyl, C2-4-Alkinyl und C2-4-Halogenalkenyl.
  • In einer Ausführungsform ist der Phenylenring an einer oder mehreren Positionen der Positionen 2, 3, 5 und/oder 6 mit Fluor substituiert.
  • In einer Ausführungsform ist die Verbindung eine Verbindung der folgenden Formel, worin R5 C1-6-Alkyl ist:
    Figure 00130002
  • In einer Ausführungsform ist R5 Ethyl oder tert-Butyl.
  • In einer Ausführungsform ist die Verbindung N1-(4'-Succinimidyloxycarbonyloxybenzyl)-N3-(di-tert-butylglutamyl)harnstoff.
  • Diese Verbindungen können gemäß dem in Beispiel 2 Verfahren oder analogen Verfahren hergestellt werden.
  • SCHEMA 1
    Figure 00140001
  • Verbindungen der Formel (V) und (VI) können aus ras-Inhibitoren, die eine Amino- oder Hydroxygruppe enthalten, durch die Verfahren, die zu den oben zur Herstellung von Verbindungen der Formeln (II) und (III) beschriebenen Verfahren analog sind, hergestellt werden.
  • Ras-Inhibitor-Prodrugs der Formeln (V) oder (VI) werden durch Carboxypeptidasen wie z.B. CPG2 durch die Wirkung des Enzyms aktiviert, um den Glutaminsäurerest zu entfernen, gefolgt von „Selbstvernichtung" des restlichen Prodrugs, auf eine Art und Weise analog zu jener, die oben für Nitroreductasen beschrieben wurde.
  • Prodrugs der Formel (V), wo Z -NH.CO- ist, können ebenfalls unter Einsatz von Linkern der folgenden Formel (VII) hergestellt werden: HOH2C-Ph-NH-CO-NH-glu (VII)wo Ph und glu wie oben definiert sind. Die gegebenenfalls substituierte Phenylengruppe ist an Position 4 mit der glu-enthaltenden Gruppierung in Bezug auf die Hydroxymethylgruppe substituiert.
  • Die Linker der Formel (VIII) können aus gegebenenfalls substituiertem 4-Nitrobenzylalkohol hergestellt werden, wo die optionalen Substituenten so sind wie sie für die Gruppe -Ph- oben definiert sind. Die Hydroxylgruppe des 4-Nitrobenzylalkohols wird zum Beispiel durch Reaktion mit tert-Butyldiphenylchlorsilan bei Raumtemperatur in einem organischen Lösungsmittel geschützt, um einen gegebenenfalls substituierten (4-Nitrobenzyl)-tert-butyldiphenylsilylether bereitzustellen. Die 4-Nitrogruppe wird dann durch katalytische Hydrierung oder katalytischen Wasserstofftransfer, zum Beispiel mit Ammoniumformiat in Gegenwart eines Katalysators, wie z.B. Pd/C, in einem erotischen Lösungsmittel, wie z.B. einem Alkohol, z.B. Methanol oder Ethanol, zu einer Amingruppe reduziert.
  • Die Amingruppe kann dann in eine Isocyanatgruppe überführt werden, zum Beispiel durch Reaktion mit Phosgen, Diphosgen oder Triphosgen in Gegenwart eines tertiä ren organischen Amins, wie z.B. Triethylamin, und eines aprotischen organischen Lösungsmittels mit einem Siedepunkt, der höher als 50 °C ist, wie z. B. Toluol. Die Isocyanatverbindung wird dann mit Di-C1-6-alkylglutaminsäure oder einem Derivat davon, z.B. Di-C1-6-alkylglutamathydrochlorid, umgesetzt. Dies kann bei Raumtemperatur in Gegenwart von Triethylamin in einem aprotischen organischen Lösungsmittel, wie z.B. Toluol, THF oder Dichlormethan, durchgeführt werden.
  • Alternativ dazu kann die Aminverbindung direkt in einer Eintopfsynthese mit der Di-C1-6-alkylglutaminsäure oder einem Derivat davon in Gegenwart von Triphosgen und Triethylamin in einem aprotischen Lösungsmittel, wie z.B. THF oder Dichlormethan, umgesetzt werden.
  • In jedem der Fälle wird die resultierende Verbindung behandelt, um die Hydroxy-Schutzgruppe zu entfernen, zum Beispiel durch die Verwendung von Tetrabutylammoniumfluorid in THF bei Raumtemperatur.
  • Die resultierende Verbindung der Formel (VII), wo glu in der Form eines Di-C1-6-alkylesters vorliegt, kann entschützt werden, um die Estergruppen zu entfernen, zum Beispiel durch die Verwendung einer Säure, wie z.B. Ameisen- oder Trifluoressigsäure. Verbindungen der Formeln (VII) oder (XVI) können durch Reaktion mit dem FTLi oder einem aktivierten Derivat davon in aprotischen Lösungsmitteln, wie z.B. Dichlormethan und/oder THF, in Gegenwart einer tertiären organischen Base, wie z.B. Triethylamin, bei Raumtemperatur an ein FTLi gebunden werden, der eine Gruppe -OH, -NH2 oder -SH enthält, um eine Verbindung der Formel (V) bereitzustellen. Die Di-C1-6-alkylestergruppen der Verbindung können, wenn vorhanden, wie oben beschrieben entfernt werden.
  • Um ein FTLi mit einer Gruppe -XH an den Linker der Formel (VII) zu binden, kann die Gruppe -XH durch die Verwendung von Phosgen, Diphosgen oder Triphosgen in Gegenwart eines Phasentransferkatalysators wie z.B. Tetrabutylammoniumhydrogensulfat in ein reaktives Chlorformyl-, Chlorthioformyl- oder Isocyanatderivat überführt werden. Die Reaktion kann in Gegenwart einer Base, wie z.B. NaOH, in einem organischen Lösungsmittel, wie z.B. Toluol, THF oder Dichlormethan, durchgeführt werden.
  • Prodrugs der Formel (V), in welchen Z -O.CO- ist, können unter Einsatz von Linkern der Formel (VIII) hergestellt werden. HOH2C-Ph-O-CO-NH-glu (VIII)wo Ph und glu wie oben definiert sind. Die gegebenenfalls substituierte Phenylengruppe ist an der Position 4 mit der glu-enthaltenden Gruppierung in Bezug auf die Hydroxymethylgruppe substituiert.
  • Um eine Verbindung der Formel (VIII) herzustellen, wurde gegebenenfalls substituierter 4-Hydroxybenzaldehyd als 1,3-Dithian oder -Dithiolanein in einem aprotischen Lösungsmittel wie z.B. CH2Cl2 in Gegenwart von BF3.ET2O bei Raumtemperatur durch Reaktion mit 1,3-Propandithiol oder 1,2-Ethandithiol geschützt, um das entsprechende 4-(1',3'-Dithianyl)phenol bzw. 4-(1',3'-Dithidanyl)phenol zu ergeben. Diese Verbindung ist an Di-C1-6-alkylglutamylisocyanat in einem aprotischen Lösungsmittel wie z.B. Toluol in Gegenwart eines tertiären organischen Amins, wie z.B. Triethylamin, an das entsprechende O-[4-(1',3'-Dithianyl)phenyl]-N-(di-C1-6-alkylglutamyl)carbamat gebunden. Die Entschützung des Carbamats zum entsprechenden Aldehyd kann mit Hg(ClO4)2 oder Tl(NO3)3 in THF oder Dichlormethan bei Raumtemperatur erfolgen. Die Reduktion des Aldehyds ergibt das gewünschte O-(4-Benzyloxy)-N-(di-C1-6-alkylglutamyl)carbamat. Dieses Carbamat kann durch Behandlung mit einer Säure, wie z.B. Trifluoressigsäure oder Ameisensäure, entschützt werden, um die Alkylester-Schutzgruppen zu entfernen, um ein Prodrug der Formel (V) bereitzustellen.
  • Die Linker der Formel (VIII) können an FTLi-Verbindungen gebunden werden, die eine freie Hydroxy-, Amino- oder Mercaptogruppe enthalten, auf dieselbe Weise wie oben für die Linker der Formel (VII) oder (XVI) beschrieben ist.
  • Andere geeignete FTLi-Prodrugs umfassen jene, die mit einem Zucker oder einem β-Lactamderivat derivatisiert sind. Zum Beispiel sind geeignete Linker, die an die oben beschriebenen FTL-Inhibitoren vom Typ FTL-NH2 oder FTL-OH oder FTL-SH gebunden sind, Folgende:
    Figure 00180001
    wo R Wasserstoff oder Acetyl ist und Y Aryl, wie z.B. Phenyl, Benzyl oder Tolulyl, ist, und diese können analog zu anderen oben beschriebenen Prodrugs hergestellt werden.
  • Jede beliebige Hydroxy-, Amino- oder Mercaptogruppe eines FTLi kann auf die oben beschriebene Art und Weise gebunden werden, um ein Prodrug bereitzustellen. Wenn gewünscht kann mehr als eine solche Gruppe derivatisiert werden, um ein Prodrug herzustellen. Wenn jedoch nur eine einzelne Hydroxy-, Mercapto- oder Aminogruppe umgesetzt werden soll, um ein Prodrug zu bilden, können beliebige verbleibende Gruppen von FTL mit zum Beispiel t-Butyl- oder Adamantyl-Gruppen (im Fall von Hydroxyl-) oder Butyloxycarbonylgruppen im Fall von Amino geschützt werden. Solche Schutzguppen können unter Einsatz von fachbekannten chemischen Verfahren gebunden werden. Die Gruppen des FTLi, der mit dem Linker umgesetzt werden soll, können zu dem entsprechenden Halogenformiat oder Isocyanat derivatisiert werden und dann an die Linker wie z.B. jene der Formeln (VII) oder (VIII) gebunden werden. Nachdem das FTLi-Prodrug hergestellt worden ist, können die Schutzgruppen durch herkömmliche Mittel entfernt werden, z.B. durch Behandlung mit Trifluoressigsäure.
  • Physiologisch annehmbare Derivate des Prodrugs umfassen Salze, Amide, Ester und Salze von Estern. Ester umfassen Carbonsäureester, in welchen die Nicht-Carbonyl-Gruppierung der Estergruppierung aus unverzweigtem oder verzweigtem C1-6-Alkyl (Methyl, n-Propyl, n-butyl oder t-Butyl) oder zyklischem C3-6-Alkyl (z.B. Cyclohexyl) ausgewählt ist. Salze umfassen physiologisch annehmbare Basensalze, z.B. jene, die von einer geeigneten Base abstammen, wie z.B. Alkalimetall-(z.B. Natrium-), Erdalkalimetall-(z.B. Magnesium-)Salze, Ammonium- und NR4- (worin R C1-4-Alkyl ist) Salze. Andere Salze umfassen Säureadditionssalze, einschließlich Hydrochlorid und Acetatsalze. Amide umfassen nicht-substituierte und mono- und disubstituierte Derivate.
  • Hierin sind auch pharmazeutische Formulierungen beschrieben. Solche Formulierungen umfassen ein Prodrug gemeinsam mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln.
  • Pharmazeutisch annehmbare Träger oder Verdünnungsmittel umfassen jene, die in Formulierungen verwendet werden, die für orale oder parenterale (z.B. intramuskuläre oder intravenöse) Verabreichung geeignet sind. Die Formulierungen können in geeigneter Weise in Einheitsdosisformen präsentiert werden und durch beliebige Verfahren, die auf dem Gebiet der Pharmazie bekannt sind, hergestellt werden. Solche Verfahren umfassen den Schritt des Kontaktierens des aktiven Inhaltsstoffes mit dem Träger, der eine oder mehrere zusätzliche Inhaltsstoffe darstellt. Im Allgemeinen werden die Formulierungen hergestellt, indem der aktive Inhaltsstoff gleichförmig und innig mit flüssigen Trägern oder fein verteilten festen Trägern oder beiden in Verbindung gebracht wird und dann wenn nötig das Produkt geformt wird.
  • Zum Beispiel umfassen Formulierungen, die für die parenterale Verabreichung geeignet sind, wässrige und nicht-wässrige sterile Injektionslösungen, die Antioxidanzien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Stoffe enthalten können, welche die Formu lierung mit dem Blut des beabsichtigten Empfängers isotonisch machen, und wässrige und nicht-wässrige sterile Suspensionen, die Suspensionsmittel und Verdickungsmittel enthalten können, und Liposomen oder andere Mikropartikel, die dazu entworfen sind, das Polypeptid auf Blutkomponenten oder eines oder mehrere Organe abzuzielen.
  • Geeignete Liposomen umfassen zum Beispiel jene, die das positiv geladene Lipid N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-triethylammonium (DOTMA) umfassen, jene, die Dileoylphosphatidylethanolamin (DOPE) umfassen, und jene, die 3β[N-(n',N'-Dimethylaminoethan)carbamoyl]cholesterin (DC-Chol) umfassen.
  • Die ras-Inhibitor-Prodrugs und das Antikörper/Enzymkonjugat für ADEPT können gleichzeitig verabreicht werden, aber in der klinischen Praxis ist es oft bevorzugt, das Enzym/Mittelkonjugat vor dem Prodrug zu verabreichen, z.B. bis zu 72 Stunden oder sogar 1 Woche davor, um dem Enzym/Mittelkonjugat eine Möglichkeit zu geben, in der Region des Tumortargets zu lokalisieren. Durch diese Wirkweise bei Verabreichung des Prodrugs scheint die Überführung des Prodrugs in das zytotoxische Mittel auf die Regionen beschränkt zu sein, in denen das Enzym/Mittelkonjugat lokalisiert ist, d.h. die Region des Targettumors und die frühzeitige Freisetzung des ras-Inhibitormittels minimiert ist.
  • Bei GDEPT wird das Prodrug üblicherweise nach Verabreichung des modifizierten Virus, das für ein Enzym kodiert, verabreicht. Typischerweise wird das Virus an den Patienten verabreicht und dann die Aufnahme des Virus durch infizierte Zellen überwacht, zum Beispiel durch Gewinnung und Analyse einer Biopsieprobe von Gewebe, auf das abgezielt wird. Alternativ dazu kann das Prodrug nach der Verabreichung eines Verabreichungssystems, welches das Gen enthält, das für das Enzym kodiert, verabreicht werden.
  • Bei ADEPT kann der Grad der Lokalisierung des Enzym/Mittelkonjugats (was das Verhältnis von ortsgebundenem zu frei zirkulierendem aktivem Konjugat betrifft) unter Einsatz von Clearance und/oder Inaktivierungssystemen, die in WO 89/10140 be schrieben sind, weiter verbessert werden. Dies umfasst üblicherweise nach Verabreichung des Konjugats und vor Verabreichung des Prodrugs die Verabreichung einer Komponente (einer „zweiten Komponente"), die in der Lage ist, sich an einen solchen Teil des Konjugats zu binden, um das Enzym zu inaktivieren und/oder die Clearance des Konjugats aus dem Blut zu beschleunigen. Eine solche Komponente kann einen Antikörper zu der Enzymkomponente des Systems umfassen, der in der Lage ist, das Enzym zu inaktivieren.
  • Die zweite Komponente kann an ein Makromolekül gebunden sein, wie z.B. Dextran, ein Liposom, Albumin, Makroglobulin oder einen Blutgruppe-O-Erythrocyten, sodass die zweite Komponente davon abgehalten wird, das Gefäßkompartiment zu verlassen. Zusätzlich oder alternativ dazu kann die zweite Komponente eine ausreichende Zahl an kovalent gebundenen Galactoseresten oder Resten anderer Zucker, wie z.B. Lactose oder Mannose, umfassen, sodass sie das Konjugat im Plasma binden kann, aber gemeinsam mit dem Konjugat durch Rezeptoren für Galactose oder andere Zucker in der Leber aus dem Plasma entfernt werden. Die zweite Komponente sollte so verabreicht und zur Verwendung entworfen sein, dass sie nicht in einem beliebigen merklichen Ausmaß in den extravaskulären Raum des Tumors eintreten kann, wo sie ortsgebundenes Konjugat vor und während der Verabreichung des Prodrugs inaktivieren kann.
  • Der exakte Dosisplan sowohl für GDEPT als auch ADEPT wird selbstverständlich von einzelnen Klinikern für einzelne Patienten bestimmt werden müssen, und das wird wiederum vom exakten Wesen des Prodrugs und des zytotoxischen Mittels, das vom Prodrug freigesetzt werden soll, kontrolliert, aber es kann eine gewisse allgemeine Steuerung bereitgestellt werden. Chemotherapie dieser Art umfasst normalerweise die parenterale Verabreichung sowohl des Prodrugs als auch entweder des Enzym/Mittelkonjugats oder modifizierten Virus, und intravenöse Verabreichung wird oft als am praktischsten identifiziert. In ADEPT-Systemen liegt die Dosis des Prodrugs und des Konjugats letztendlich im Ermessen des Arztes, der solche Faktoren wie Alter, Gewicht und Zustand des Patienten berücksichtigen wird. Geeignete Dosen des Prodrugs und des Konjugats sind in Bagshawe et al., Antibody, Immuno conjugates and Radiopharmaceuticals 4, 915–922 (1991), gegeben. Eine geeignete Konjugatsdosis kann von 500 bis 200.000. Enzymeinheiten/m2 (z.B. 20.000 Enzymeinheiten/m2) umfassen, und eine geeignete Dosis des Prodrugs kann von 5 bis 2000 mg/m2 (z.B. 200 mg/m2) umfassen.
  • Um die maximale Konzentration des Konjugats an der Stelle der gewünschten Behandlung zu sichern, ist es normalerweise wünschenswert, die Verabreichung von zwei Komponenten durch zumindest 4 Stunden voneinander zu trennen. Der exakte Plan wird durch verschiedene Faktoren beeinflusst, einschließlich der Natur des Tumors, auf den abgezielt werden soll, und der Natur des Prodrugs, aber für gewöhnlich gibt es eine adäquate Konzentration des Konjugats an der Stelle der gewünschten Behandlung innerhalb von 48 Stunden.
  • In GDEPT-Systemen ist die Menge des Virus oder eines anderen verabreichten Vektors eine Menge, die eine ähnliche Zellkonzentration von Enzym wie im obigen ADEPT-System bereitstellt. Dies kann durch klinische Verfahren bestimmt werden, welche die Verabreichung einer Reihe von Versuchsdosen an einen Patienten und das Messen des Grads der Infektion oder Transfektion einer Targetzelle oder eines Tumors umfassen. Die Menge des erforderlichen Prodrugs kann jener für ADEPT-Systeme ähnlich sein oder größer sein.
  • Hierin ist auch ein System zur Verwendung bei der Kontrolle von Neoplasie bei einem Menschen oder einem Tier beschrieben, das ein Enzym umfasst, das in der Lage ist, ein ras-Inhibitor-Prodrug in einen aktiven ras-Inhibitor zu überführen, bevorzugt konjugiert mit einem Targetingmittel, wie z.B. einem monoklonalen Antikörper, der sich an ein tumorassoziiertes Antigen bindet, in Verbindung mit einem wie oben definierten ras-Inhibitor-Prodrug. Wenn das Enzym eine Nitroreductase ist, kann das System vorzugsweise einen geeigneten Cofaktor für das Enzym umfassen. Geeignete Cofaktoren umfassen ein Ribosid oder Ribotid von Nicotinsäure oder Nicotinamid.
  • Hierin ist auch ein Verfahren zur Behandlung von Neoplasie bei einem Menschen oder einem Tier beschrieben, das eine solche Behandlung benötigt, welche die Ver abreichung einer wirksamen Menge eines Ras-Inhibitor-Prodrugs wie hierin beschrieben und eines Enzyms, vorzugsweise konjugiert an ein Targetingmittel wie z.B. einen monoklonalen Antikörper, der sich an ein tumor-assoziiertes Antigen bindet, an den Wirt umfasst. Tumor-assoziierte Antigene umfassen tumor-assoziierte Rezeptoren, die auf der Zelloberfläche vorhanden sind.
  • Hierin ist auch ein System zur Verwendung bei der Kontrolle von Neoplasie bei einem Menschen oder einem Tier beschrieben, das ein modifiziertes Virus umfasst, das in der Lage ist, Tumorzellen in dem Subjekt selektiv zu infizieren, wobei das Virus eine DNA- oder RNA-Sequenz umfasst, die für ein Enzym kodiert, in Verbindung mit einem ras-Inhibitor-Prodrug, das in der Lage ist, durch die Wirkung des Enzyms in einen ras-Inhibitor überführt zu werden.
  • Hierin ist auch ein Verfahren zur Behandlung von Neoplasie bei einem Menschen oder einem Tier beschrieben, das eine solche Behandlung benötigt, welche die Verabreichung einer wirksamen Menge eines ras-Inhibitor-Prodrugs wie hierin beschrieben und eines modifizierten Virus an einen Wirt umfasst, wobei das modifizierte Virus in der Lage ist, Tumorzellen in dieser Person selektiv zu infizieren, wobei das Virus eine DNA- oder RNA-Sequenz umfasst, die für ein Enzym kodiert, das in der Lage ist, das ras-Inhibitor-Prodrug in einen ras-Inhibitor zu überführen.
  • Hierin ist auch ein Verfahren zur Behandlung von Neoplasie bei einem Menschen oder einem Tier beschrieben, die eine solche Behandlung benötigen, welche die Verabreichung einer wirksamen Menge eines ras-Inhibitor-Prodrugs wie hierin beschrieben und eines nicht-viralen Vektorsystems an den Wirt umfasst, wobei das nicht-virale Vektorsystem in der Lage ist, selektiv in Tumorzellen in dem Subjekt eingeführt zu werden, wobei das Vektorsystem eine DNA- oder RNA-Sequenz umfasst, die für ein Enzym kodiert, das in der Lage ist, das ras-Inhibitor-Prodrug in einen aktiven ras-Inhibitor zu überführen, der operabel an einen Promotor gebunden ist, der zur Expression des Enzyms in den Zellen wirksam ist.
  • Die verschiedenen Systeme zur Verwendung in der Behandlung von Neoplasie durch ADEPT, das oben beschrieben ist, umfassen gegebenenfalls „die zweite Komponente" für die beschleunigte Clearance, wie oben beschrieben. Auf ähnliche Weise umfassen die oben beschriebenen Verfahren zur Behandlung von Neoplasie gegebenenfalls als Teil dieses Verfahrens die Verwendung der zweiten Komponente, eine wirksamen Menge davon wird nach Verabreichung des Enzyms verabreicht, um das Verhältnis von ortsgebundenem zu frei zirkulierendem Enzym zu erhöhen. Es kann auf WO 89/10140 für weitere besondere Details der zweiten Komponente verwiesen werden.
  • Modifizierte Viren, die in der Lage sind, Tumorzellen selektiv zu infizieren, sind fachbekannt. Unter „selektivem Infizieren" versteht man, dass das Virus primär Tumorzellen infiziert und dass der Anteil von infizierten Nicht-Tumorzellen ein solcher ist, dass der Schaden an Nicht-Tumorzellen durch Verabreichung des ras-Inhibitor-Prodrugs angesichts des Wesens der behandelten Erkrankung annehmbar gering ist. Letztlich wird dies vom Arzt bestimmt.
  • Es versteht sich auch, dass die DNA- oder RNA-Sequenz, die für ein Enzym kodiert, die vom Virus getragen wird, an geeignete Expressionskontrollsignale gebunden wird, sodass die Expression des Enzyms in den Tumorzellen auftritt, auf die abgezielt wird.
  • Das nicht-virale Vektorsystem ist in der Lage, selektiv in Tumorzellen eingeführt zu werden, wobei Verfahren wie die oben genannten verwendet werden, z.B. Kalziumphosphatcopräzipitation, Mikroinjektion, Liposomen, direkte DNA-Aufnahme, und rezeptorvermittelter DNA-Transfer (Morgan & French Anderson, Annu. Rev. Biochem. 62, 191 (1993)).
  • Geeignete monoklonale Antikörper umfassen Antikörper zu cerbB2, wie z.B. ICR12, (M.A. Bakir et al., J. Nucl. Med. 33, 2154–2160 (1992)) und Antikörper zu Epidermiswachstumsfaktorrezeptor, wie z.B. ICR16 (C.J. Dean et al., Int. J. Cancer Suppl. 8, 103 (1994)). Beweise, dass cerbB2 ras zur Transformation benötigt, sind in Ben-Levy et al., Embo J. 13, 3302 (1994), angegeben.
  • Wie hierin verwendet wird der Begriff „monoklonaler Antikörper" von Fachleuten nicht einfach dazu verwendet, Antikörper zu beschreiben, die durch traditionelle Hybridomverfahren produziert werden, aber auch dazu, Antikörper und Varianten davon abzudecken, die durch Rekombinationsmittel produziert wurden. Diese umfassen zum Beispiel humanisierte Antikörper, wie z.B. jene mit einer konstanten Region aus einem menschlichen Antikörper, die auf eine nicht-menschliche variable Antikörperregion aufgepfropft wurde (siehe zum Beispiel EP-A-0 120 694 ), chimäre Antikörper, wie z.B. jene mit nichtmenschlichen komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs), die auf ein menschliches Gerüst einer variablen Region (siehe zum Beispiel EP-A-0 239 400 ) aufgepfropft wurden, und Einzelkettenantikörper. Fragmente solcher monoklonaler Antikörper, die ihre Targetbindungsaktivität beibehalten, sind durch den allgemeinen Begriff „monoklonaler Antikörper" ebenfalls abgedeckt. Diese umfassen Fv-, Fab'- und F(ab')2-Fragmente. Dies umfasst auch rekombinante oder synthetische Proteine, basierend auf den CDRs solcher Antikörper, z.B. Abzyme (ein Polypeptid sowohl mit antikörperähnlicher Bindungsaktivität als auch Enzymaktivität) und Diakörper.
  • Prodrugs können wie hierin beschrieben als Reagenzien in In-vitro-Systemen verwendet werden, um die Aktivität von Kandidatenenzymen oder Antikörpern zu testen, die in ADEPT- oder GDEPT-Systeme inkorporiert werden können.
  • Zum Beispiel kann eine Tumorzelllinie, die einen Marker trägt, auf welchen ein Antikörper ausgerichtet ist, in vitro gezüchtet werden und dann ein Antikörper/Enzym-Konjugat zur Kultur zugegeben werden. Das Enzym ist eines, das in der Lage ist oder von dem vermutet wird, dass es in der Lage ist, ein hierin beschriebenes Prodrug in ein aktives Arzneimittel zu überführen. Das Prodrug wird dann zur Kultur zugegeben, und es wird das Ausmaß der Zelltötung oder Inhibition von Zellwachstum gemessen (zum Beispiel durch Verwendung eines Lebendfarbstoffs, um die Zahl von lebensfähigen Zellen aufzuzeichnen, oder indem eine Probe der Kultur wieder ausplattiert wird, um die Anzahl der lebensfähigen Zellen zu zählen).
  • BEISPIELE
  • Die folgenden Beispiele 1 und 2 veranschaulichen weiters die Erfindung und damit verwandte Themen. Das Herstellungsbeispiel 1 ist eine Veranschaulichung der Herstellung einer Verbindung der Formel (Ib). Die folgenden Reaktionsschemen veranschaulichen außerdem die Beispiele.
  • Alle Ausgangsmaterialien, Reagenzien und wasserfreie Lösungsmittel (THF unter N2) wurden wenn nicht anders angegeben von Aldrich erworben. DC wurde auf vorbeschichteten Schichten von Kieselgel 60 F254 (Art. 5735, Merck) durchgeführt. Es wurde präparative DC auf Kieselgelplatten (20 × 20 cm) von Analtech durchgeführt. NMR-Spektren wurden wenn nicht anders angegeben in Me2SO-d6 auf einem Bruker-AC250-Spektrometer (250 MHz) bei 30 °C (303K) durchgeführt. Die Kopplungskonstanten (J) sind in Hz angegeben.
  • HERSTELLUNGSBEISPIEL 1
  • N-Methoxy-N-methylamid von N-t-Butoxycarbonylisoleucin (I)
  • O,N-Dimethylhydroxylaminhydrochlorid (976 mg, 10 mmol) wurde in Dichlormethan (10 ml) suspendiert und auf –10 °C abgekühlt. 1-Methylpiperidin (992 mg, 1,22 ml, 10 mmol) wurde dann langsam zugegeben, wobei die Temperatur unter –2 °C gehalten wurde. Diese Lösung wurde bei –10 °C aufbewahrt. In einem separaten Kolben wurde N-Boc-isoleucin (2,290 g, 9,9 mmol) in Dichlormethan (40 ml) gelöst und auf –20 °C abgekühlt. 1-Methylpiperidin (992 mg, 1,22 ml, 10 mmol) und Isobutylchlorformiat (1,336 g, 1,30 ml, 10 mmol) wurden dann zugegeben, wobei die Temperatur unter –20 °C gehalten wurde. Nach 15 min wurde die zuvor hergestellte Hydroxylaminlösung in einer einzelnen Portion zugegeben und die Lösung bei Umgebungstemperatur über Nacht gerührt. Die Lösung wurde dann mit gesättigter Ammoniumchloridlö sung (2 × 30 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt, um ein gelbes Öl zu ergeben, das dann durch Säulenchromatographie (Silica – 10–30 % Ethylacetat in Hexan) gereinigt wurde, um N-Methoxy-N-methylamid (2,28 g, 84 %) als farbloses Öl zu erhalten.
  • Die Ausbeuten für die folgenden Herstellungen dieser Verbindung variierten zwischen 60 und 84 %.
  • N-t-Butoxycarbonylisoleucinal (2)
  • Das Weinreb-Amid von N-t-Butoxycarbonylisoleucin, das wie oben hergestellt wird (1,98 g, 7,2 mmol), wurde in wasserfreiem Ether (10 ml) gelöst und auf –45 °C abgekühlt. Lithiumaluminiumhydrid (10 ml einer 1 N Lösung in Ether, 10 mmol) wurde dann hinzugefügt, wobei die Temperatur unter –35 °C gehalten wurde, nach dem Hinzufügen wurde die Lösung auf 5 °C erwärmt. Die Lösung wurde dann auf –45 °C gekühlt, und Natriumsulfat-Decahydrat (5,00 g) wurde hinzugefügt und das Kühlbad entfernt. Nach 1 Stunde wurde die Lösung durch Celite filtriert und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt, um den Aldehyd (1,47 g, 95 %) als farbloses Öl zu entfernen, das sofort in der nächsten Reaktion verwendet wurde, da es bei Raumtemperatur racemisiert.
  • Die Ausbeuten für die folgenden Herstellungen dieser Verbindung variierten zwischen 89 und 97 %.
  • N-[2(S)-[t-Butoxycarbonylamino]-3-methylpentyl]isoleucin (3)
  • Isoleucin (1,31 g, 9,95 mmol) wurde in wasserfreiem Methanol (10 ml) und Trifluoressigsäure (1,133 g, 0,77 ml, 9,95 mmol) hinzugefügt. Das Gemisch wurde gerührt, bis sich das gesamte Isoleucin aufgelöst hatte, und das Lösungsmittel wurde dann unter reduziertem Druck entfernt. Wasserfreies DMF (10 ml) wurde zum resultierenden Isoleucintrifluoracetatsalz zugegeben, gefolgt von 3-Å-Molekularsieben und einer Lösung von 2 (1,47 g, 4,9 mmol) in wasserfreiem DMF (5 ml). Nach 15 Minuten wur de die Lösung mit Natriumtriacetoxyborhydrid (1,58 g, 7,45 mmol) behandelt und über Nacht gerührt. Die resultierende Suspension wurde durch Celite filtriert, mit Ethylacetat (50 ml) verdünnt und mit gesättigter Kochsalzlösung (2 × 35 ml) gewaschen. Die organischen Extrakte wurden über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt, um die Säure in Form eines gelben Öls zu ergeben (1,36 g, 84 %).
  • Die Ausbeuten für die folgenden Formulierungen dieser Verbindung variierten zwischen 67 und 88 %.
  • N-2(S)-[t-Butoxycarbonylamino-3-methylpentyl]isoleucylhomoserinlacton (4)
  • Verbindung 3 (331 mg, 1 mmol), gelöst in wasserfreiem DMF (2 ml), wurde mit Hydroxybenzotriazolhydrat (135 mg, 1 mmol), 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (260 mg, 1,36 mmol) und Homoserinlactonhydrochlorid (125 mg, 1 mmol) behandelt. Triethylamin (174 mg, 0,24 ml, 1,72 mmol) wurde hinzugefügt und das Gemisch über Nacht gerührt. Die Lösung wurde mit Ethylacetat (25 ml) verdünnt und mit gesättigter Natriumchloridlösung (2 × 10 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt, um ein gelbes Öl zu ergeben. Dieses wurde dann durch Säulenchromatographie (5 % Methanol in Dichlormethan) und durch Präzipitation aus Ether durch die tröpfchenweise Zugabe von Hexan gereinigt, um das Produkt in Form eines weißen Pulvers zu ergeben (147 mg, 47 %).
  • Die Ausbeuten für die folgenden Herstellungen dieser Verbindung variierten zwischen 41 und 54 %; m/z: [M+H]+ = 414, Mikroanalysedaten:
    erwartete % festgestellte %
    C 60,99 60,7
    H 9,51 9,8
    N 10,16 9,9
  • N-[2(S)-Amino-3-methylpentyl]isoleucylhomoserinlactonhydrochlorid (5)
  • Verbindung 4 (147 mg, 0,35 mmol) wurde in Ethylacetat (10 ml) gelöst und auf –25 °C abgekühlt. Wasserfreies Chlorwasserstoffgas wurde dann durch die Lösung geleitet, bis DC (5 % Methanol in Dichlormethan) eine vollständige Reaktion zeigte. Stickstoff wurde dann durch die Lösung geleitet, um überschüssigen Chlorwasserstoff zu entfernen. Das Lösungsmittel wurde dann unter reduziertem Druck entfernt, um das Produkt als blassgelben Feststoff zu ergeben (125 mg, 91 %).
  • Die Ausbeuten für die folgenden Herstellungen dieser Verbindung variierten zwischen 62 und 92 %.
  • N-Methoxy-N-methylamid von N-t-Butoxycarbonyl-S-tritylcystein (6)
  • O,N-Dimethylhydroxylaminhydrochlorid (108 mg, 1,1 mmol) wurde in Dichlormethan (10 ml) suspendiert und auf –10 °C abgekühlt. 1-Methylpiperidin (110 mg, 0,13 ml, 1,1 mmol) wurde dann langsam zugegeben, wobei die Temperatur unter –2 °C gehalten wurde. Diese Lösung wurde bei –10 °C aufbewahrt. In einem separaten Kolben wurde N-Boc-S-tritylcystein (464 mg, 1 mmol) in Dichlormethan (20 ml) gelöst und auf –20 °C abgekühlt. 1-Methylpiperidin (110 mg, 0,13 ml, 1,1 mmol) und Isobutylchlorformiat (144 mg, 0,14 ml, 1,1 mmol) wurden dann hinzugefügt, wobei die Temperatur unter –20 °C gehalten wurde. Nach 15 min wurde die zuvor hergestellte Hydroxylaminlösung in einer einzelnen Dosis hinzugefügt und die Lösung bei Umgebungstemperatur über Nacht gerührt. Die Lösung wurde dann mit gesättigter Ammoniumchloridlösung (2 × 15 cm3) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt, um einen weißen Schaum zu ergeben, der durch Säulenchromatographie (Silica 10–30 % Ethylacetat in Hexan) gereinigt wurde, um das N-Methoxy-N-methylamid (406 mg, 81 %) als weißen Schaum zu ergeben.
  • Die Ausbeuten für die folgenden Herstellungen dieser Verbindung variierten zwischen 81 und 92 %.
  • N-t-Butoxycarbonyl-S-tritylcysteinal (7)
  • Das Weinreb-Amid von N-t-Butoxycarbonyl-S-tritylcystein, das zuvor hergestellt wurde (406 mg, 0,8 mmol), wurde in wasserfreiem Ether (5 ml) gelöst und auf –45 °C abgekühlt. Lithiumaluminiumhydrid (1 ml einer 1 N Lösung in Ether, 1 mmol) wurde dann hinzugefügt, wobei die Temperatur unter –35 °C gehalten wurde, nach der Addition wurde die Lösung dann auf 5 °C aufgewärmt. Die Lösung wurde dann auf –45 °C abgekühlt, und Natriumsulfat-Decahydrat (1,25 g) wurde zugegeben und das Kühlbad entfernt. Nach 1 Stunde wurde die Lösung durch Celite filtriert und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt, um den Aldehyd (332 mg, 93 %) als weißen Schaum zu ergeben.
  • Die Ausbeuten für die folgenden Herstellungen dieser Verbindung variierten zwischen 84 und 93 %.
  • N-[2(S)-2-{(t-Butoxycarbonyl)amino}-3-[(triphenylmethyl)thio]propyl]amino[-3-methylpentyl]isoleucylhomoserinlacton (8)
  • Verbindung 5 (125 mg, 0,32 mmol) wurde in wasserfreiem Methanol (10 ml) gelöst und mit 3-Å-Molekularsieb, Kaliumacetat (64 mg, 0,64 mmol), N-t-Butoxycarbonyl-S-tritylcysteinal (289 mg, 0,64 mmol) und Natriumcyanoborhydrid (31 mg, 0,48 mmol) behandelt. Das Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur 24 Stunden lang gerührt, durch Celite filtriert und das Methanol unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in Ethylacetat (25 ml) gelöst, mit gesättigter Ammoniumchloridlösung (15 ml) und gesättigter Kochsalzlösung (15 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert, und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, um einen weißen Schaum zu ergeben. Dieser wurde dann durch Säulenchromatographie (Silica, 1–3 % Methanol in Dichlormethan) gereinigt, um die gewünschte Verbindung (107 mg, 45 %) in Form eines weißen Schaums zu ergeben.
  • Die Ausbeuten für die folgenden Formulierungen dieser Verbindung waren 32 und 43 %, m/z: [m+H]+ = 745.
  • BEISPIEL 1
  • ZUSAMMENFASSUNG
  • Es wurden zwei ras-Inhibitor-Prodrugs, die durch Nitroreductase aktiviert werden können, hergestellt. Diese sind N-[2(R)-[[2-(4'-Nitrobenzyloxycarbonyl)amino-3-mercaptopropyl]amino]-3-methylpentyl]isoleucylhomoserinlacton 10 und N-[2(R)-[[2-(4'-Nitrobenzyloxycarbonyl)amino]-3-[(4'-nitrobenzyloxycarbonyl)thio]propyl]amino]-3-methylpentyl]isoleucylhomoserinlacton 11 (siehe Schema 2). Das Ausgangsmaterial war N-{2(S)-2-[(tert-butoxycarbonyl)amino-3-[(triphenylmethyl)thio]propyl]amino]-3-methylpentyl]isoleucylhomoserinlacton 8, welches das Produkt des Herstellungsbeispiels 1 war. Dieses wurde durch Verwendung von Triethylsilan und TFA in CH2Cl2 entschützt (gemäß Graham et al., J. Med. Chem. 37(6), 725–732 (1994)), mit dem einzigen Unterschied, dass die Reaktion bei 4 °C durchgeführt wurde. Nach der Aufarbeitung (aber keiner endgültigen Reinigung durch HPLC) wurde die so erhaltene Verbindung 9 mit 4-Nitrobenzylchlorformiat umgesetzt, um ein Gemisch der Verbindungen 10 und 11 zu ergeben, die getrennt wurden und durch präparative DC gereinigt wurden. Das Verschwinden des Protons, das zur Mercaptogruppe gehört (Bereich 1,0–2,0 ppm), von Verbindung 11 im 1H-NMR-Spektrum unterstützte den Ort der zweiten Nitrobenzylgruppierung.
  • SCHEMA 2
    Figure 00320001
  • N-{2(R)-[2-(amino-3-mercaptopropyl)amino]-3-methylpentyl]isoleucylhomoserinlacton 9
  • N-{2(S)-2-[tert-butoxycarbonyl)amino-3-[(triphenylmethyl)thio]propyl]amino]-3-methylpentyl]isoleucylhomoserinlacton 8 (0,200 g, 0,148 mmol) wurde mit TFA (1,0 ml) und Triethylsilan (0,18 ml, 0,13 g, 1,1 mmol) bei 4 °C in CH2Cl2 (2,0 ml) gelöst. Das Gemisch wurde bei dieser Temperatur 2 Stunden lang gerührt, dann ließ man es Umgebungstemperatur erreichen, und es wurde bis zur Trockene eingeengt. Der Rüückstand wurde zwischen Hexanfraktion und wässriger 0,1 % TFA (6,0 ml) getrennt. Die wässrige Phase wurde mit Hexanfraktion gewaschen (2 × 2,5 ml), filtriert und bei 20–25 °C bis zur Trockene eingeengt. Ein öliger Rückstand (0,257 g) wurde erhalten, der ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
  • N-{2(R)-[[2-(4'-Nitrobenzyloxycarbonyl)amino-3-mercaptopropyl]aminol-3-methylpentvl]isoleucylhomoserinlacton (10) und N-{2(R)-[[2-(4'-nitrobenzyloxycarbonyl)amino]-3-[(4'-nitrobenzyloxycarbonyl)thio]propyl]amino]-3-methylpentyl]isoleucylhomoserinlacton 11
  • Zu einer gerührten Lösung des vorherigen Lactonprodukts 9 (0,128 g) in THF (trocken) (2 ml) und Triethylamin (0,12 ml 0,081 g, 0,8 mmol) wurde 4-Nitrobenzylchlorformiat (0,047 g, 0,22 mmol) zugegeben. Nach 5 h wurde das Reaktionsgemisch zu einem Öl eingedampft (0,175 g). Das Öl wurde zwischen EtOAc (3 ml) und H2O (2 ml) getrennt. Die organische Phase wurde mit H2O gewaschen (2 × 2 ml), getrocknet (MgSO4) und unter Vakuum verdampft. Es resultierte ein Öl (0,070 g), das ein Gemisch von 10 und 11 enthielt. Die Verbindungen wurden durch präparative DC gereinigt. Eluent: EtOAc:Cyclohexan 3:1. 10 eluierte zuerst: 0,005 g Ausbeute = 33 %. 1H-NMR, dH: 0,73-0,90 (12H, m), 1,00-1,22 (3H, m, 2H+Hs), 1,25 (2H, d, J = 7,44), 1,40-1,52 (3H, m), 2,10-2,18 (1H, m), 2,30-2,82 (5H, m), 2,90-3,10 (1H, m), 4,00-4,10 (1H, m), 4,15-4,27 (1H, m), 4,30-4,42 (1H, m), 4,50-4,65 (1H, m), 5,40 (2H, s, CH2-Benzyl), 7,63 (2H, d, J = 8,70, Harom2+6), 8,24 (2H, d, Harom3+5); C27H43N5O7S. 11 eluierte später: 0,003 g Ausbeute = 15 %. 1H-NMR, dH: 0,70-0,92 (12H, m), 1,03-1,20 (2H, m), 1,25 (2H, d, J = 6,12), 1,40-1,60 (3H, m), 2,16-2,24 (1H, m), 2,25-2,82 (5H, m), 2,82-2,92 (1H, m), 3,64-3,80 (1H, m), 4,12-4,26 (1H, m), 4,27-4,43 (1H, m), 4,50-4,65 (1H, m), 5,16 (2H, s, CH2-S-Benzyl), 5,39 (2H, s, CH2-N-Benzyl), 7,59 (2H, d, J = 8,30, Harom2+6, S-PhNO2), 7,61 (2H, d, J = 8,46, Harom2+6, N-PhNO2), 8,20 (2H, d, Harom3+5, S-PhNO2), 8,21 (2H, d, Harom3+5, N-PhNO2); C35H48N6O11S.
  • BEISPIEL 2
  • ZUSAMMENFASSUNG
  • Für die Synthese eines neuen ras-Prodrugs, das durch das Enzym CPG2 spaltbar ist, wurde ein Ester eines selbstvernichtenden Linkers entworfen, um an funktionelle Mercapto- oder Amino-Gruppen gebunden zu werden. Dieser ist: N1-(4'-Succinimidyloxycarbonyloxybenzyl)-N3-(di-tert-butylglutamyl)harnstoff 20 (siehe Schema 3). Sobald dieser an den ras-Inhibitor gebunden ist, werden die Ester-Schutzgruppen entfernt. Der Weg zum ras-Prodrug wird veranschaulicht.
  • Das Zwischenprodukt N1-(4-Hydroxybenzyl)-N3-(di-tert-butylglutamyl)harnstoff 19 wurde zur Bindung an ras-Inhibitor-Wirkstoffe gemäß Schema 2 synthetisiert. Das Ausgangsmaterial 4-Nitrobenzylalkohol 12 wurde als tert-Butyldiphenylsilylether 13 geschützt, indem er mit tert-Butyldiphenylchlorsilan und Imidazol in DMF (oder THF) bei Raumtemperatur umgesetzt wurde. Das geschützte Nitroderivat 13 wurde durch Wasserstofftransfer mit Ammoniumformiat reduziert (Pd/C 10 % in EtOH). Das Amin 14, das so gebildet wurde, wurde mit Triphosgen in Toluol bei 70 °C umgesetzt, um das entsprechende Isocyanat 15 zu bilden. Der geschützte Linker 18 wurde durch Bindung des Isocyanats 15 mit Di-tert-butylglutamat in THF in Gegenwart von NEt3 bei Raumtemperatur erhalten. Ein alternativer Weg zu 18 erfolgte durch direkte Bindung von Amin 14 an das Di-tert-butylglutamylisocyanat 17 unter denselben Bedingungen wie den oben beschriebenen, wo das Di-tert-butylglutamylisocyanat 17 aus dem Di-tert-butylglutamat durch Behandlung mit Triphosgen und NEt3 in Toluol bei –78 °C erhalten wurde. Unter Einsatz dieses Wegs wurde die Verbindung 18 mit gu ter Ausbeute aus Amin 14 und Di-tert-butylglutamat in einer Eintopfsynthese erhalten.
  • SCHEMA 3 Ras-Linker für CPG-2
    Figure 00350001
  • Die Verbindung 18 wurde durch Bu4NF in THF bei Raumtemperatur entschützt, und der Di-tert-butylester des Linkers 19 wurde durch Säulenchromatographie gereinigt. Die Verbindung 19 wurde mit Disuccinimidylcarbonat in Acetonitril und Triethylamin bei Raumtemperatur umgesetzt, was zum gewünschten Succinimidyllinker 20 führte. Dieser wird dann mit dem ras-Inhibitor 9 verbunden (wird gemäß dem Herstellungsbeispiel 1 und Beispiel 1 hergestellt), was die Verbindung 21 ergibt, welche dann in Ameisensäure bei 4 °C entschützt wird, um das endgültige ras-Prodrug 22 zu ergeben.
  • EXPERIMENTELLER TEIL
  • (4-Nitrobenzyl)-tert-butyldiphenylsilylether (13)
  • Zu einer gerührten Lösung aus 4-Nitrobenzylalkohol 12 (1,00 g, 6,50 mmol) und Imidazol (0,97 g, 14, 1 mmol) in DMF (10,0 ml) wurde tert-Butyldiphenylchlorsilan (1,98 g, 7,20 mmol) über 10 min unter N2 bei Raumtemperatur zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde weitere 5 h gerührt, mit Et2O (75 ml) verdünnt, mit H2O (5 × 15 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und unter Vakuum bis zur Trockene eingedampft. Ein Öl wurde erhalten, das beim Stehen auskristallisierte, und wurde aus EtOH (70 %) zu einem Feststoff umkristallisiert; Ausbeute: 2,36 g (93 %), vmax/cm–1 (Film): 2931, 2857 (CH2, asymm., symm.), 1521, 1345 (NO2), 1H-NMR, dH: 1,06 (9H, s, t-Bu), 4,92 (2H, s, CH2), 7,42-7,46 (5H, m, Ph), 7,63-7,65 (7H, m, Ph+Harom2+6)), 8,23 (2H, d, J = 8,23, Harom3+5); MS, (EI), (391,54), m/z: 334 (M – t-Bu, 100), 288 (M – t-Bu-NO2, 10), 256 (M – t-Bu-Ph, 20), 199 (Ph2SiOH+, 100), C23H25NO3Si.
  • (4-Aminobenzyl)-tert-butyldiphenylsilylether (14)
  • Zu einer gerührten Lösung von 13 (5,00 g, 12,77 mmol) in Ethanol (100 ml) wurde bei Raumtemperatur Pd/C (10 %, 1,50 g) und Ammoniumformiat (4,60 g) zugegeben. Nach 1,5 h wurde der Katalysator abfiltriert, das Filtrat bis zur Trockene unter Vakuum eingeengt und der Rüclstand zwischen EtOAc:H2O getrennt. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO4) und unter Vakuum eingeengt, um 14 als Öl zu er geben; Ausbeute: 4,24 g (92 %), vmax/cm–1 (Film); 3433, 3378 (NH2), 2931, 2857 (CH2, asymm., symm.); 1H-NMR, dH: 1,00 (9H, s, t-Bu), 4,57 (2H, s, CH2), 4,98 (2H, s breit, NH2), 6,52 (2H, d, J = 8,25, Harom3+5), 6,96 (2H, d, Harom2+6), 7,42-7,46 (5H, m, Ph), 7,62-7,65 (5H, m, Ph); MS, (EI), (361,56); m/z: 361 (M+, 8), 304 (M – t-Bu, 100), 199 (Ph2SiOH+, 100); C23H27NOSi.
  • (4-Isocyanatobenzyl)-tert-butyldiphenylsilylether (15)
  • Zu einer gerührten Lösung von 14 (0,63 g, 1,70 mmol) und Triethylamin (0,16 g, 0,60 mmol) in Toluol (10 ml) bei 70 °C wurde Triphosgen (0,18 g, 1,7 mmol) zugegeben. Nach 5 h wurde das Reaktionsgemisch filtriert und das Filtrat unter Vakuum zu einem Öl eingeengt; Ausbeute; 0,65 g (99 %), die ohne weitere Reinigung verwendet wurden; vmax/cm–1 (Film): 2931, 2875 (CH2, asymm., symm.), 2275 (NCO); 1H-NMR, dH: 1,03 (9H, S, t-Bu), 4,76 (2H, s, CH2), 7,23 (2H, d, J = 8,38, Harom3+5), 7,35 (2H, d, Harom2+6), 7,37-7,48 (5H, m, Ph), 7,62-7,71 (5H, m, Ph); MS, (EI), (378,55); m/z: 330 (M – t-Bu, 52), 286 (M – t-Bu, M – t-Bu-NCO, 48), 199 (Ph2SiOH+, 100); C24H25NO2Si.
  • N1-(4-tert-Butyldiphenylsilyl-O-benzyl)-N3-(di-t-butylglutamyl)harnstoff (18)
  • Verfahren A: Zu einer Lösung von Di-tert-butylglutamathydrochlorid (0,46 g, 1,55 mmol) in THF (7 ml) wurde Triethylamin (0,31 g, 3,10 mmol) zugegeben. Das Isocyanat 15 (0,60 g, 1,55 mmol) in trockenem THF (3 ml) wurde bei Raumtemperatur zum Glutamatester zugegeben. Nach 2 h wurde das Reaktionsgemisch filtriert und unter Vakuum bis zur Trockene eingedampft. Das Produkt wurde durch Säulenchromatographie (EtOAc:Cyclohexan 2:1) gereinigt, das in Öl 18 resultierte; Ausbeute 0,53 g (53 %). vmax/cm–1 (Film): 3359 (NH), 2932, 2857 (CH2, asymm., symm.), 1729 (C=O, Ester), 1670 (C=O, Harnstoff), 1154 (C-O, str.); 1H-NMR, dH: 1,03 (9H, s, t-Bu), 1,40 (9H, s, t-Bu-glu), 1,43 (9H, s, t-Bu-glu), 1,68-2,00 (2H, 2m, CH(NH)CH 2), 2,18-2,32 (2H, 2m, CH 2CO2-t-Bu), 4,08-4,12 (1H, m, CH(NH)CH2), 4,68 (2H, s, CH2), 6,38 (1H, d, J = 8,12, NH-glu), 7,19 (2H, d, J = 8,41, Harom3+5), 7,32-7,47 (7H, m, Ph+Harom2+6), 7,62-7,70 (5H, m, Ph), 8,54 (1H, s, NH-Ph); MS, (EI), (646,90); m/z: 540 (M – t-Bu + 1, 2), 534 (M – 2t-Bu + 2, 5), 478 (M – 3 t-Bu + 3, 100), 199 (Ph2SiOH+, 100); C37H50N2O6Si.
  • Verfahren B (Eintopfsynthese von Verbindung 18): Zu einer Lösung von Di-tert-butylglutamathydrochlorid (4,14 g, 14,0 mmol) und Triphosgen (1,39 g, 4,67 mmol) in Toluol bei –78 °C wurde Triethylamin (2,83 g, 28,0 mmol) in Toluol (10 ml) 30 min lang zugetropft. Die Reaktion wurde auf Raumtemperatur aufgewärmt. Nach 50 min wurde eine Lösung, die (4-Aminobenzyl)-tert-butyldiphenylsilylether 14 (5,00 g, 13,8 mmol) und Triethylamin (1,95 ml, 14,0 mmol) enthielt, 5–10 min lang zugegeben. Nach 20 h wurde das Reaktionsgemisch filtriert, nacheinander mit H2O (200 ml), aq HCl (1 %, 200 ml), aq Na2CO3 (1 %, 200 ml), H2O (2 × 200 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und unter Vakuum zu einem Öl eingedampft; Ausbeute: 9,90 g. Dieses Produkt wurde ohne weitere Reinigung entschützt.
  • N1-(4-Hydroxybenzyl)-N3-(di-tert-butylglutamyl)harnstoff (19)
  • Aus Verfahren A: Zu einer Lösung von 18 (0,53 g, 0,80 mmol) in THF (10 ml) wurde bei Raumtemperatur Tetrabutylammoniumfluorid (2,5 ml, 2,5 mmol von 1 M Lösung) in THF zugegeben. Nach 3 h wurde das Reaktionsgemisch unter Vakuum bis zur Trockene eingedampft. Das Produkt wurde in EtOAc (20 ml) gelöst, mit H2O gewaschen (2 × 10 ml), getrocknet (MgSO4) und zu einem Öl eingedampft; Ausbeute 0,40 g.
  • Die entschützte Verbindung 19 (0,38 g) wurde durch Säulenchromatographie (EtO-Ac:Cyclohexan 3:1) gereinigt, was in einem Öl resultierte, das beim Stehen auskristallisierte; Ausbeute 0,093 g (29 %), vmax/cm–1 (Film): 3370 (breit, NH+OH), 2967 (CH3), 2930, 2857 (CH2, asymm., symm.), 1716 (C=O, Ester), 1678 (C=O, Harnstoff), 1153 (C-O, str.); 1H-NMR, dH: 1,40 (9H, s, t-Bu), 1,42 (9H, s, t-Bu), 1,72-2,00 (2H, 2 m; CH(NH)CH 2), 2,20-2,31 (2H, 2m, CH 2CO2-t-Bu), 4,10-4,18 (1H, m, CH(NH)CH2), 4,39 (2H, d, J = 5,36, CH2), 4,99 (1H, t, CH2OH), 6,38 (1H, d, J = 8,11, NH-glu), 7,16 (2H, d, J = 8,35, Harom3+5), 7,31 (2H, d, Harom2+6), 8,50 (1H, s, NH-Ph); MS, (EI), (408,94); m/z: 408 (M+, 10), 352 (M – t-Bu + 1, 4), 296 (M – 2 t-Bu + 2, 14); C21H32N2O6.
  • Aus Verfahren B: Die Eintopfsynthese ergab 18, das dann durch Säulenchromatographie gereinigt wurde; Ausbeute 2,57 g (46 % über drei Schritte), die dann aus aq MeOH (60 %) umkristallisiert wurden.
  • N1-(4'-Succinimidyloxycarbonyloxybenzyl)-N3-(di-tert-butylglutamvl)harnstoff (20)
  • Zu einer Lösung von N1-(4'-Hydroxybenzyl)-N3-(di-tert-butylglutamy)harnstoff 19 (0,200 g, 0,49 mmol) und Disuccinimidylcarbonat (0,128 g, 0,50 mmol) in 5,0 ml Acetonitril wurde bei Raumtemperatur 0,041 ml Pyridin auf einmal zugegeben. Nach 20 h wurde das Reaktionsgemisch unter Vakuum bis zur Trockene eingedampft, der ölige Rückstand in 3,0 ml EtOAc gelöst, mit H2O gewaschen (3 × 3,0 ml), getrocknet (MgSO4) und wieder eingedampft. Es resultierten 0,151 g eines halbfesten Körpers, der dann durch Säulenchromatographie gereinigt wurde (Eluent: EtOAc:Cyclohexan 3:1). Letztendlich resultierten 0,088 g (Ausbeute: 39 %) eines Festkörpers.
    vmax/cm–1 (Film): 3369 (NH), 1783 (C=O, Carbonat), 1726 (C=O, Ester, Keton), 1660 (C=O, Harnstoff), 1207, 1156 (C-O, str.); 1H-NMR, dH: 1,39 (9H, s, t-Bu), 1,42 (9H, s, t-Bu), 1,80-2,00 (2H, 2m, CH(NH)CH 2), 2,22-2,35 (2H, 2m, CH 2CO2-t-Bu), 2,60 (4H, s, CH2-Succinimidyl), 4,10-4,20 (1H, m, CH(NH)CH2), 4,89 (2H, s, CH2), 6,47 (1H, d, J = 8,10, NH-glu), 7,32 (2H, d, J = 8,57, Harom3+5), 7,40 (2H, d, Harom2+6); MS, (549,58); m/z: 506 (M+ – CO2 + 1,50), 450 (M+ – CO2-C4H8 + 1,18), 394 (M+ – CO2-2C4H8 + 1,60), 279 (M+ – CO2-2C4H8-Hydroxysuccinimid + 1,90); C26H35N3O10.
  • N1[-{2(R)-[[2-(4'-Benzyloxycarbonyl)amino-3-mercaptopropyl]amino]-3-methylpentyl]isoleucylhomoserinlacton]-N3-(di-tert-butylglutamyl)harnstoff (21)
  • Zu einer Lösung von 9 in CH2Cl2 wird N1-(4-Succinimidyloxycarbonyloxybenzyl)-N3-(di-t-butylglutamyl)harnstoff 20 in trockenem THF und Triethylamin bei Raumtempe ratur unter N2 zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird verdampft, gewaschen, getrocknet (MgSO4) und wieder zu 21 eingedampft.
  • N1-[(4-Benzylidenmalononitriloxycarbonyl)-4-oxybenzyl)]-N3-glutamylharnstoff (22)
  • Verbindung 21 wird bei 4 °C unter N2 in Ameisensäure (95 %) gelöst. Nach 22 h wird das Lösungsmittel unter Vakuum (Pumpe) verdampft, um 22 zu ergeben.

Claims (5)

  1. Verbindung der Formel:
    Figure 00410001
    worin: R5 C1-6-Alkyl ist; und der Phenylenring unsubstituiert ist oder der Phenylenring mit 1 bis 4 Gruppen substituiert ist, die gleich oder unterschiedlich sein können und ausgewählt sind aus: Fluor, Chlor, Brom, Iod, Hydroxy, Mercapto, Amino, Nitro, C1-4-Alkyl, C1-4-Halogenalkyl, C1-4-Alkoxy, C1-4-Halogenalkoxy, C2-4-Alkenyl, C2-4-Alkinyl und C2-4-Halogenalkenyl.
  2. Verbindung nach Anspruch 1, worin der Phenylenring an einer oder mehreren der Positionen 2, 3, 5 und/oder 6 mit Fluor substituiert ist.
  3. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel:
    Figure 00420001
    worin R5 C1-6-Alkyl ist.
  4. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin R5 Ethyl oder tert-Butyl ist.
  5. Verbindung nach Anspruch 3, die: N1-(4'-Succinimidyloxycarbonyloxybenzyl)-N3-(di-tert-butylglutamyl)harnstoff ist.
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