FR3096259A1 - conjugués anticorps-médicament et leur utilisation en thérapie - Google Patents

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Abstract

Conjugués anticorps-médicament et leur utilisation en thérapie L’invention concerne des conjugués cytotoxiques et des conjugués anticorps-médicament, et leur utilisation en thérapie, notamment pour traiter les cancers HER2+.

Description

Description Titre de l'invention : conjugués anticorps-médicament et leur utilisation en thérapie Domaine technique
[0001] La présente invention concerne des conjugués cytotoxiques utiles comprenant une tête d'accroche, un bras de liaison, un espaceur et un agent cytotoxique.
[0002] La présente invention concerne également des nouveaux conjugués anticorps- médicaments comprenant un anticorps dirigé contre l'antigène HER2 (human epidennal growth factor receptor 2) couplé à un médicament cytotoxique et leur utilisation comme médicament, notamment en thérapie anti-cancéreuse.
Technique antérieure
[0003] Un conjugué anticorps-médicament (en anglais « Antibody Drug Conjugate » ou « ADC ») constitue un moyen de délivrance sélective d'un médicament cytotoxique.
Le conjugué anticorps-médicament permet donc de combiner la spécificité du ciblage palles anticorps avec de nouvelles fonctions effectrices puissantes par les agents qui leur sont conjugués.
[0004] La structure générale d'un conjugué anticorps-médicament est celle de la formule (H).
La partie liant l'anticorps et le médicament est appelé bras de liaison ou linker.
II peut être greffé sur l'anticorps via l'une au moins des huit cystéines formant les 4 ponts disulfure inter-chaînes.
Le nombre de molécules de médicaments cytotoxiques greffées sur l'anticorps détermine un ratio appelé Drug-to-Antibody Ratio (DAR).
[0005] Après fixation sur son antigène cible, l'anticorps est internalisé dans la cellule par en- docytose médiée par des récepteurs.
Les vésicules fusionnent avec des lysosomes où le médicament cytotoxique est libéré de l'anticorps via différents mécanismes.
Le médicament cytotoxique actif agit ensuite directement sur la cellule en induisant sa mort et parfois sur les cellules cancéreuses voisines par transport ou diffusion dans l'environnement.
L'anticorps est donc principalement utilisé comme vecteur et apporte le médicament cytotoxique dans la cellule.
[0006] Les anticorps anti-HER2 ont. déjà été conjugués à des médicaments cytotoxiques, dont la la Monomethyl auristatin E (MMAE).
Un conjugué cytotoxique portant la MMAE a été développé sous le nom de « vedotin ».
Ce médicament cytotoxique a été utilisé avec divers anticorps monoclonaux pour la préparation de conjugués anticorps-médicament.
On peut par exemple citer le brentuximab-vedotin ou le Glembatumumab-vedotin.
[0007] La MMAE a été conjuguée au Trastuzumab comme décrit dans le document Bryant et al., Mol.
Pharmaceutics, 2015, 12 (6), pp 1872-1879).
Néanmoins, l'efficacité du 2 Trastuzumab-MMAE décrit clans ce document n'est pas satisfaisante, notamment pour espérer traiter efficacement les cancers HER2+.
Ceci peut être dû au faible DAR.
[0008] Il existe donc un besoin de développer des conjugués anti-HER2-médicament cy- totoxique plus efficaces et plus stables.
Résumé de l'invention
[0009] Un premier objet de l'invention concerne un conjugué cytotoxique de formule (I) suivante : [Chem.
1] Tète d Espaceur Médicament cyt nt d'accroche tans laquelle : la tête d'accroche est représentée par la formule suivante : I Chem. 2] le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes : 'Chem. 3] ou [Chem. 4] 3 l'espaceur est représenté par b formule suivante : [Chem.
5] X est Br, Cl, I ou F; ni est un entier allant de 1 à 10.
[0010] Un second objet dc l'invention concerne un conjugué anticorps-médicament dc formule Ob suivante : [Chem. 6] dans laquelle : A est un anticorps ou un fragment d'anticorps anti-HER2 ; la tête d'accroche est représenté par la formule suivante : [Chem. 7] o le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes : [Chem.
3] OU HN NH2 [Chem. 4] l'espaceur est représenté par la formule suivante : [Chem.
5] X est Br, Cl, I ou F; ni est un entier allant de 1 à 10 ; n est un entier allant de 1 à 4.
[0011] Un troisième objet de l'invention concerne une composition comprenant un ou o plusieurs conjugué(s) anticorps-médicament selon l'invention.
[0012] Un quatrième objet de l'invention concerne un conjugué anticorps-médicament selon l'invention ou une composition selon l'invention, pour utilisation comme médicament.
[0013] Un cinquième objet de l'invention concerne un conjugué anticorps-médicament selon l'invention ou une composition selon l'invention, pour utilisation dans le traitement d'un cancer HER2+.
Description détaillée
[0014] Définitions
[0015] Le terme « conjugué cytotoxique » désigne un conjugué qui comprend un mé- dicament cytotoxique.
[0016] Le terme « médicament cytotoxique » désigne toute molécule naturelle ou de synthèse, capable d'inhiber ou d'empêcher la fonction des cellules.
On entend par « cytotoxique », la propriété pour un agent chimique ou biologique, d'altérer des cellules, éventuellement jusqu'à les détruire.
[0017] Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le médicament cytotoxique est choisi parmi tout composé ayant obtenu une AMM et qui est utilisé en thérapie anticancéreuse ou anti-inflammatoire, toute molécule en cours d'évaluation clinique en thérapie anti-cancéreuse ou anti-inflammatoire.
Le médicament cytotoxique sera choisi par exemple parmi le paclitaxcl (Taxo10) ou le docetaxcl (Taxotère0) ou l'un de ses dérivés, le topotccan, le hortezomib, la daunoruhicinc, les analogues de daunorubicinc, la vincristinc, la mitomycinc C. l'acide rétinoïque, le méthotrexatc.
Pilomédinc, l'aspirine, un IMIDs, le lénalidomide, le potnalidomide.
[0018] Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le médicament cy- totoxique est sélectionné dans le groupe constitué de la duocartnycine et ses analogues, les dolastatincs, la combretastatine et ses analogues, la calichéamicinc, la Nacétyl-y-calichéamycine (CMC), un dérivé de calichéamycine, la maytansinc et ses analogues, tel qu'un dérivé de type maytansinoïde, par exemple le DM1 et le DM4, les auristatincs et leurs dérivés, tels que l'auristatinc E, l'auristatinc EB (AEB), l'auristatinc EFP (AEFP), la monométhyle d'auristatinc E (MM AE), la monométhyle d'auristatinc F (MMAF), la tubulysine, le disorazolc, les epothilones, l'echinornycine, l'estramustine, la cemadotine, l'eleutherobine, la methopterine, l'actinomycine, la mitomycin A, la camptothécine, un dérivé de la camptothécme, le SN38' le TK1, l'amanitine, une pyrrolobenzodiazépine, un dimère de pyrrolobenzodiazépine, une pyn-olopyridodiazépine, un dimère de pyrrolopyridodiazépine, un intercalant de l'ADN, un inhibiteur d'histone deacetylase, ou un inhibiteur de tyrosine kinase.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le médicament M est sélectionné parmi l'exotoxine de pseudomonas (PE), la deBouganin, la Bouganin, la toxine diphtérique (DT) et la ricine. 6
[0019] Dans un mode de réalisation particulier, le médicament cytotoxique est choisi parmi méthotrexate, TMIDs, duocarmycin, combrctastatinc, calichcamicinc, monométhylauristatine E (MMAE), monométhylauristatine F (MMAF), rnaytansinc, DM1, DM4, SN38, amanitinc, pyrrolobenzodiazepine, dimère de pyrrolobenzodiazepine, pyrrolopyridodiazepine, dimère de pyrrolopyridodiazepine, un inhibiteur de l'histone &acetylase, un inhibiteur de tyorsinc kinase, et ricinc, de préférence MMAE, représenté par la formule suivante : [Chem. 8]
[0020] Le terme « anticorps », également appelé « immunoglobuline » désigne un hétéro- tétramère constitué de deux chaînes lourdes d'environ 50-70 kDa chacune (dites les chaînes H pour Heavy) et de deux chaînes légères d'environ 25 kDa chacune (dites les chaînes L pour Light), liées entre elles par des ponts disultures intra et intercaténaires.
Chaque chaîne est constituée, en position N-terminale, d'une région ou domaine variable, dit VL pour la chaîne légère, VH pour la chaîne lourde, et en position C-terminale, d'une région constante, constitué d'un seul domaine dit CL pour la chaîne légère et de trois ou quatre domaines nommés CHI, CH2, CH3, CH4, pour la chaîne lourde.
100211 Par « anticorps chimérique », on entend un anticorps dont les séquences des régions variables des chaînes légères et des chaînes lourdes appartiennent à une espèce différente de celle des séquences de régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes.
Aux fins de l'invention, les séquences des régions variables des chaînes lourdes et légères sont préférentiellement d'origine murine tandis que les séquences des régions constantes des chaînes lourdes et légères appartiennent à une espèce non-murine.
A cet égard, pour les régions constantes, toutes les espèces de mammifères non-murins sont susceptibles d'être utilisées, et en particulier l'homme, le singe, les suidés, les bovidés, les équidés, les félidés, les canidés ou encore les oiseaux, cette liste n'étant pas exhaustive.
De façon préférée, les anticorps chimériques selon 7 l'invention contiennent des séquences de régions constantes des chaînes lourdes et légères d'origine humaine et les séquences de régions variables des chaînes lourdes et légères d'origine murine.
[0022] Par « anticorps humanisé », on entend un anticorps dont tout ou partie des séquences des régions impliquées dans la reconnaissance de l'antigène (les régions hypervariables ou CDR : Complementarity Detcrmining Région) et parfois certains acides aminés des régions FR (régions Framework) sont d'origine non-humaine tandis que les séquences des régions constantes et des régions variables non-impliquées dans la reconnaissance de l'antigène sont d'origine humaine.
[0023] Par « anticorps humain », on entend un anticorps contenant uniquement des séquences humaines, aussi bien pour les régions variables et constantes des chaînes légères que pour les régions variables et constantes des chaînes lourdes.
[0024] On entend par « fragment d'anticorps », toute partie d'une immunoglobuline obtenue par digestion enzymatique ou obtenue par bioproduction comprenant au moins un pont disulfurc, par exemple Fab, Fab', F(ab)(2, Fabs-SH, scFv-Fc ou Fc.
[0025] La digestion enzymatique des immunoglobulines par la papaïne génère deux fragments identiques, qu'on appelle les fragments Fab (Fragment antigcn binding), et un fragment Fc (Fragment cristallisable).
La digestion enzymatique des immunoglobulines par la pepsine génère un fragment F(ab')2 et un fragment Fc scindé en plusieurs peptides.
F(ab1)2 est formé de deux fragments Fab' liés par des ponts di-sulfures intercaténaires.
Les parties Fab sont constituées des régions variables et des domaines CHI et CL.
Le fragment Fab' est constitué de la région Fab et d'une région charnière.
Fab'-SH fait référence à un fragment Fab' dans lequel le résidu cystéine de la région charnière porte un groupe thiol libreLe fragment scFv peut être lié à un fragment Fc pour donner un scFv-Fc.
[0026] Le terme « HER2 » désigne le « Human Epidermal growth factor Receptor 2 », qui est une protéine membranaire de la famille des récepteurs du facteur de croissance épidermique humain. « HER2 » est aussi appelé fréquemment « ErbB2 ».
[0027] Le terme « cancer HER2+ » ou « cancer HER2 positif » désigne un cancer im- pliquant une activation exacerbée de HER2.
En particulier, le terme « cancer HER2+ » désigne tout cas de cancer pour lequel des cellules cancéreuses présentent une dérégulation du gène HER2.
De préférence, dans le cadre de la présente invention, le cancer HER2+ est choisi parmi le cancer du sein, le cancer du tractus génital féminin, tel que le cancer de l'endomètre, le cancer de l'utérus ou le cancer de l'ovaire, le cancer de la vessie, le cancer de l'anus, le cancer colorectalen particulier le carcinome séreux papillaire utérin, le cancer du poumon, en particulier le cancer du poumon qui n'est pas à petites cellules, le cancer du foie, le cancer du rein, le cancer gastro-oesophagien, le cancer de l'estomac, le cancer du pancréas et le cancer gastrique.
Dans un mode de réa- 8 lisation préféré, le cancer HER2+ est choisi parmi le cancer du sein HER2 +, le cancer de l'ovaire HER2 -F, le cancer de la vessie HER2 -F, le cancer colorectal HER2 +, le carcinome séreux papillaire utérin HER2 + et un cancer gastrique HER2 -F, de préférence le cancer du sein HER2 -F.
[0028] Par « purifié » et « isolé », on entend, en se référant à un anticorps selon l'invention, que l'anticorps est présent en l'absence substantielle d'autres macromolécules biologiques du même type.
Le terme "purifié" tel qu'utilisé ici signifie de préférence au moins 75% en poids, plus préférablement au moins 85% en poids, encore plus préférablement au moins 95% en poids, et le plus préférablement au moins 98% en poids d'anticorps, par rapport à l'ensemble des macromolécules présentes.
[0029] Le terme « pharmacentiquement acceptable » signifie approuvé par une agence règle- mentairc fédérale ou d'État ou énuméré dans la pharmacopée américaine ou européenne, ou dans une autre pharmacopée généralement reconnue, destiné à être utilisé chez les animaux et chez l'homme.
Une « composition pharmaceutique » désigne une composition comprenant un véhicule phannaceutiquement acceptable.
Par exemple, un véhicule pharmaccutiquement acceptable peut être un diluant, un adjuvant, un excipient ou un véhicule avec lequel l'agent thérapeutique est administré.
Ces véhicules peuvent être des liquides stériles, tels que l'eau et des huiles, y compris ceux d'origine pétrolière, animale, végétale ou synthétique, tels que l'huile d'arachide, l'huile de soja, l'huile minérale, l'huile de sésame, etc.
L'eau est un véhicule préféré lorsque la composition pharmaceutique est administrée par voie intraveineuse.
Des solutions salines et des solutions aqueuses de dextrose et de glycérol peuvent également être utilisées comme véhicules liquides, en particulier pour les solutions injectables.
Les excipients phannaceutiquement acceptables comprennent l'amidon, le glucose, le lactose, le saccharose, le stéarate de sodium, le monostéarate de glycérol, le talc, le chlorure de sodium, le lait écrémé en poudre, le glycérol, le propylène glycol, l'eau, l'éthanol et similaires.
Lorsque la composition pharmaceutique est adaptée à une administration orale, les comprimés ou les gélules peuvent être préparés par des moyens classiques avec des excipients pharmaceutiquement acceptables tels que des agents liants (par exemple de l'amidon de maïs prégélatinisé, de la polyvinylpyrrolidone ou de l'hydroxypropyl méthykellulose); des charges (par exemple du lactose, de la cellulose microcristalline ou de l'hydrogénophosphate de calcium); des lubrifiants (par exemple, stéarate de magnésium, talc ou silice); des délitants (par exemple l'amidon de pomme de terre ou le glycolate d'amidon sodique); ou des agents mouillants (par exemple, le laurylsulfate de sodium).
Les comprimés peuvent être enrobés par des procédés bien connus dans l'état de la technique.
Les préparations liquides pour administration orale peuvent prendre la forme, par exemple, de solutions, de sirops ou de suspensions, ou peuvent être présentées sous forme de produit sec à reconstituer avec de l'eau ou un 9 autre véhicule approprié avant utilisation.
De telles préparations liquides peuvent être préparées par des moyens classiques avec des véhicules pharmaccutiquernent acceptables tels que des agents de suspension (par exemple un sirop de sorbitol, des dérivés de la cellulose ou des graisses comestibles hydrogénées); des agents émulsifiants (par exemple, la lécithine ou l'acacia); véhicules non aqueux (par exemple huile d'amande, esters huileux, alcool éthylique ou huiles végétales fractionnées); et des conservateurs (par exemple des p-hydroxybenzoates de méthyle ou de propyle ou de l'acide sorbique).
Les compositions pharmaceutiques peuvent également contenir des sels tampons, des aromatisants, des colorants et des édulcorants, selon le cas.
La composition selon l'invention est de préférence une composition pharmaceutique.
[0030] Le terme « traiter » ou « traitement » englobe tout effet bénéfique ou souhaitable sur les symptômes d'une pathologie ou d'un état pathologique, et peut même inclure une réduction minimale d'un ou plusieurs marqueurs mesurables de la pathologie ou de l'état pathologique.
Le traitement peut par exemple impliquer soit la réduction ou l'amélioration des symptômes de la pathologie ou de l'état pathologique, soit le retardement de la progression de la maladie ou de l'état pathologique.
Le terme « traitement » ne signifie pas nécessairement l'éradication complète ou la guérison de la pathologie, ni des symptômes associés.
[0031] Conjugué cytotoxique
[0032] L'invention concerne un conjugué cytotoxique de formule (1) suivante : [Chem. 1] dans laquelle : la tête d'accroche est représentée par la formule suivante : [Chem. 2] le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes : [Chem. 3] ou [Chem. 4] l'espaceur est représenté par la formule suivante : [Chem.
5] X est Br, Cl, I ou F, avantageusement Br; m est un entier allant de 1 à 10, avantageusement allant de 2 à 7, de 3 à 6, avantageusement égal à 5.
[0033] Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le conjugué cytotoxique répond à la formule (la) suivante : [Chem.
9] 100341 Conjugué anticorps-médicament 11
[0035] L'invention concerne également un conjugué anticorps-médicament de formule (II) suivante : [Chem. 6] dans laquelle : A est un anticorps ou un fragment d'anticorps anti-HER2 ; la tête d'accroche est représenté par la formule suivante : [Chem. 7] o le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes : [Chem.
3] OU 'Chem. 4] 12 l'espaceur est représenté par la formule suivante : [Chem.
5] X est Br, Cl, I ou F. avantageusement Br; ni est un entier allant dc 1 à 10, avantageusement allant de 2 à 7, de 3 à 6, avantageusement égal à 5 ; n est un entier allant de 1 à 4.
[0036] L'anticorps ou le fragment d'anticorps anti-HER2 selon l'invention peut être d'origine mammifère (ex. humain ou de souris), humanisé ou chimérique.
Il s'agit de préférence d'un anticorps monoclonal produit de manière recombinante par des cellules génétiquement modifiées selon des techniques largement décrites dans l'art antérieur.
[0037] Lorsque A est un anticorps anti-HER2, il s'agit de préférence d'une IgG humaine, par exemple IgGl, Ig02, Ig03 ou Ig04.
Dans un mode de réalisation particulier, A est le trastuzumab.
[0038] Trastuzumab est un anticorps anti-HER2 humanisé de type IgG1 de séquence SEQ ID NO : 1 pour la chaine légère et SEQ ID NO : 2 pour la chaine lourde.
Trastuzumab est notamment commercialisé par la société Roche sous le nom Herceptin®.
[0039] Dans un mode de réalisation particulier, le conjugué anticorps-médicament de l'invention a la formule suivante : [Chem. 10]
[0040] Dans un mode de réalisation particulier, le conjugué anticorps-médicament de l'invention a la formule (Ha) suivante : [Chem. 11] 13
[0041] Le conjugué anticorps-médicament de formule (11a) est identifié dans les exemples sous la référence « McSAF-pyridine ».
[0042] Avantageusement, le conjugué anticorps-médicament selon l'invention est purifié (ou isolé) en mettant en oeuvre des techniques de purification connues, telle que la purification sur colonne de chromatographie et / ou d'affinité.
[0043] Lorsque n est égal à I, le conjugué anticorps-médicament est communément appelé « DARI ».
Lorsque n est égal à 2, le conjugué anticorps-médicament est communément appelé « DAR2 Lorsque n est égal à 3, le conjugué anticorps-médicament est communément appelé « DAR3 ».
Lorsque n est égal à 4, le conjugué anticorps-médicament est communément appelé « DAR4
[0044] Composition
[0045] L'invention concerne également une composition comprenant un ou plusieurs conjugué(s) anticorps-médicament de formule (II) tel que défini ci-dessus.
Il peut s'agir d'une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs conjugué(s) anticorps-médicament de foimule (II) tel que défini ci-dessus et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
[0046] La composition selon l'invention a la caractéristique d'être particulièrement homogène, ce qui peut se traduire par une meilleure stabilité et / ou efficacité de la composition, par rapport à une composition qui n'est pas homogène.
[0047] Avantageusement, lorsque A est un anticorps, par exemple trastuzumab, la com- position selon l'invention se caractérise par les caractéristiques suivantes : a) au moins 50%, de préférence au moins 55%, au moins 60%, au moins 65%, par exemple au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4 ; b) le Drug-to-Antibody Ratio moyen (DAR moyen) est compris entre 3,5 et 4,5, de préférence compris entre 3,8 et 4,2, entre 3,9 et 4,1, entre 3,9 et 4, par exemple égal à 4 ± 0,1, par exemple égal à 3,92 ; c) au moins 95% des conjugués anticorps-médicament sont présents sous forme de monomère ; d) les ratios de n définis ci-après ; ou 14 e) une combinaison de deux, trois ou quatre caractéristiques choisies parmi a), h, c) et d).
[0048] Lorsque A est un anticorps, la composition selon l'invention peut comprendre des DARO, c'est-à-dire des anticorps sans conjugué cytotoxique.
De préférence, moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1% de DARO.
La composition selon l'invention peut également comprendre des DAR5, c'est-à-dire des conjugués anticorps-médicament ayant 5 conjugués cytotoxiques, La présence de DAR5 dans des compositions de conjugués anticorps-médicament est largement décrite dans la littérature, néanmoins la structure exacte des DAR5 est peu étudiée.
Ainsi, le DAR moyen est calculé en tenant compte de rensemhle des DARs présents dans la composition, c'est-à-dire les DARO, les DARI (i.e. n=1), les DAR2 (i.e. n=2), les DAR3 (i.e. n=3), les DAR4 (i.e. n=4), les DAR5, etc.
De préférence, lorsque A est un anticorps, la composition selon l'invention ne comprend pas de DAR supérieur à DAR5, par exemple DAR6, DAR7, etc.
[0049] Lorsque A est un anticorps, par exemple trastuzumab, la composition selon l'invention peut se caractériser par des ratios de n ci-après : - moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1%, moins de 0,75%, moins de 0,5%, moins de 0,25%, par exemple environ 0,1% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 1, - moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1%, moins de 0,75%, par exemple environ 0,5%, des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 2, - moins de 20%, moins de 15%, moins de 10%, moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1%, par exemple environ 10% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 3, et - au moins 50%, au moins 55%, au moins 60%, au moins 65%, par exemple au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4.
[0050] Lorsque A est un anticorps, par exemple trastuzumab, la composition selon l'invention peut également se caractériser par des ratios de n ci-après : - entre 0% et 5%, entre 0% et 2%, entre 0% et 1%, entre 0% et 0,75%, entre 0% et 0,5%, entre 0% et 0,25% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 1, - entre 0% et 5%, entre 0% et 2%, entre 0% et 1%, entre 0% et 0,75%, des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 2, - entre 0% et 5%, entre 5% et 15%, entre 8% et 12%, entre 9% et 11% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 3, et - entre 50 et 75%, entre 65% et 70%, par exemple au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4.
[0051] Dans un mode de réalisation très particulier, la composition selon l'invention présente le profil HIC de la Figure 1.
[0052] Utilisation thérapeutique
[0053] L'invention concerne également un conjugué anticorps-médicament de formule (II) selon l'invention ou une composition comprenant un conjugué anticorps-médicament de formule (II) selon l'invention pour utilisation comme médicament, par exemple pour utilisation dans le traitement d'un cancer HER2+, tel que le cancer du sein HER2+.
[0054] Le conjugué anticorps-médicament ou la composition selon l'invention est de préférence formulé pour une administration parentérale, par exemple une administration intravasculairc (intraveineuse ou intra-artérielle), intraperitoneale ou intramusculaire.
Le terme « administré par voie parentérale». tel qu'utilisé ici, désigne des modes d'administration autres que l'administration entende et topique, généralement par injection, et comprend, sans limitation, l'administration intravasculairc, intraveineuse, intramusculaire, intra-artérielle, intrathapsalc, intracapsulaire, intraorbitairc, intratumoralc, intracardiaque, intradermique, intra-péritonéale, par injection, perfusion transtrachéale, sous-cutanée, sous-cutanée, intra-articulaire, sous-capsulaire, sous-arachnoïdienne, intraspinale et intrasternale.
L'administration par voie intraveineuse est préférée dans le cadre de la présente invention, par exemple par perfusion intraveineuse.
[0055] La dose de conjugué anticorps-médicament administrée a un sujet qui en a besoin variera en fonction de plusieurs facteurs, y compris, sans limitation, la voie d'administration, le type et la gravité de la pathologie traitée, l'état du patient, la corpulence du patient, l'âge du patient, etc.
L'Homme du métier peut facilement déterminer, sur la base de ses connaissances dans ce domaine, la plage posologique requise en fonction de ces facteurs et d'autres.
La dose appropriée peut également être déterminée avec des modèles animaux ou avec des essais cliniques.
Par exemple, les doses typiques de conjugué anticorps-médicament peuvent être de 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg. 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg ou plus.
L'administration peut se faire en une seule fois ou, plus généralement, en plusieurs fois.
Le schéma d'administration peut comprendre une dose de charge initiale puis des doses d'entretien, par exemple hebdomadaires, toutes les 2 semaines, toutes les trois semaines, tous les mois, ou plus.
La durée de traitement peut varier selon la pathologie traitée et le sujet.
[0056] Le conjugué anticorps-médicament ou la composition selon l'invention peut être 16 utilisé en monothérapie ou en association avec des médicaments dont l'intérêt thérapeutique est reconnu dans la pathologie considérée. 11 peut s'agir par exemple du paclitaxel, du docétaxel, de la doxorubicine, du cyclophosphamide, d'un inhibiteur de l'aromatase tel que l'anastrozole, ou d'un anticorps utilisé en immunothérapie anticancéreuse tel qu'un anti-PDI.
[0057] La description concerne également une méthode de traitement d'un cancer HER2+ chez un sujet comprenant l'administration au sujet d'une quantité thérapeutique efficace d'un conjugué anticorps-médicament de formule (II) selon l'invention ou d'une composition comprenant un conjugué anticorps-médicament dc formule (II) selon l'invention.
[0058] Procédé dc préparation
[0059] La description concerne également un procédé de préparation d'un conjugué cy- totoxique selon l'invention.
[0060] La description concerne également un procédé de préparation anticorps-médicament de formule (II) tel que défini ci-dessus, dans lequel on fait réagir un conjugué cytotoxique de formule (I) tel que défini ci-dessus avec un anticorps ou un fragment d'anticorps anti-HER2.
Brève description des figures
[0061] [fig.1] représente le profil I-IIC (Hydrophobie Interaction Chromatography) d'une composition dc conjugué anticorps-médicament selon l'invention.
La figure montre que la composition est enrichie en DAR4, avec environ 68% de DAR4.
[0062] [fig.21 représente une analyse SEC (Size Exclusion Chromatography) d'une com- position de conjugué anticorps-médicament selon l'invention.
La figure montre que la composition est extrêmement homogène, avec plus de 99% de monomère.
[0063] [fig.31 représente la répartition des DAR dc 14 bioconjugaisons indépendantes à l'échelle 1 mg.
Cela démontre la grande reproductibilité dc la bioconjugaison.
[0064] [fig.41 représente la répartition des DAR dc différentes bioconjugaisons à différentes échelles (échelles 1 mg, 2,5 mg et 5 mg).
Cela démontre la grande reproductibilité de la bioconjugaison indépendamment dc l'échelle.
[0065] [fig.51 représente la reconnaissance de l'antigène HER2 par McSAF-pyridine, T- DM1 et trastuzumab.
[0066] [fig.6] représente la cytotoxicité in vitro de McSAF-pyridine sur des cellules exprimant HER2, ou des cellules n'exprimant pas HER2, par rapport à T-DM1 et MMAE seul.
[0067] [fig.7] représente la libération de MMAE dans le plasma humain en comparant McSAF-pyridine avec un ADC préparé avec une chimie de couplage maléimide (McSAF-maléimidel).
Cette figure reflète la stabilité du conjugué anticorps-mé- 17 dicament.
[0068] [fig.8] représente l'évolution du DAR moyen en solution à 37 °C de McSAF- pyridine par rapport à un ADC préparé avec une chimie de couplage maléimide (McSAF-maléimidel).
Cette figure reflète la stabilité du conjugué anticorps-médicament.
[0069] [fig.9] représente l'évolution du DAR moyen en solution en présence de HSA (Human Scrum Albumin) à 37 °C de McSAF-pyridine par rapport à un ADC préparé avec une chimie de couplage tnaléimide (McSAF-maléimidel).
Cette figure reflète la stabilité du conjugué anticorps-médicament.
[0070] [fig.10] représente l'évolution du volume tumoral de souris traitées avec 5 mg/kg de McSAF-pyridine, 5 mg/kg de T-DM1 ou un véhicule sans ADC.
[0071] [fig.1 1] représente la distribution des volumes tumoraux de l'ensemble des souris traitées avec 5 mg/kg de McSAF-pyridine, 5 mg/kg de T-DM1 ou d'un véhicule sans ADC au jour 70.
Cette figure reflète l'homogénéité de la réponse and-tumorale au conjugué anticorps-médicament à 5 mg/kg.
[0072] [fig.12] représente l'évolution du volume tumoral de souris traitées avec 1 mg/kg de McSAF-pyridine, 1 mg/kg de T-DM1 ou un véhicule sans ADC.
[0073] [fig.13] représente la distribution des volumes tumoraux de l'ensemble des souris traitées avec 1 mg/kg de McSAF-pyridine, 1 mg/kg de T-DM1 ou d'un véhicule sans ADC au jour 70.
Cette figure reflète les différentes réponses anti-tumorales au conjugué anticorps-médicament et au T-DM1 à 1 mg/kg.
Exemples
[0074] Exemple I : synthèse d'un conjugué cytotoxique selon l'invention
[0075] Schéma réactionnel général [Chem.12] o
[0076] (a) Bn0H.
SOC12.
DCM. 18 h.
75 C; (b) APS, McOH, H20.
H2SO4. lh. 50°C; (C) H2 18 Pd/C, Me0H, 2h, TA; (d) HATU, 2,6-lutidine, DMF, H2N-(CH2)5-COOMc, 15h, 0°C, puis TA; (e) PBr3, McCN, 2h, 45°C; (f) Li0H, THF, H00, 8,5h, TA; (g) EEDQ, DIPEA, DMF, MeCN, H2N-VCPABC-MMAE, 2h20, 25°C.
[0077] Schéma réactionnel détaillé
[0078] Préparation de l'isonicotinate de benzyle (2)
[0079] [Chem.] 3] (2)
[0080] L'acide isonicotinique (I) (5,00 g ; 40,614 mmol ; 1,0 eg) a été solubilisé dans le chlorure de thionyle (15 mL; 206,77 mmol ; 5,1 eg) et chauffé à reflux pendant la nuit.
Après retour à température ambiante, l'excès de chlorure de thionyle a été éliminé par évaporation sous pression réduite, puis le résidu obtenu a été dissous dans le dichlorométhane anhydre (55 mL).
L'alcool benzyl igue a été additionné (4,2 mL ; 40,614 mmol; 1,0 cg) ct le mélange a été agité à reflux pendant 10 h.
Après retour à température ambiante, le milieu réactionnel a été neutralisé avec une solution saturée d'hydrogénocarbonatc de sodium et extrait avec du dichlorométhanc (3x100 mL) Les phases organiques ont été rassemblées, lavées avec une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite.
Le produit obtenu a été purifié par chromatographie flash (Si02, cyclohexanc/acétate d'éthyle 50:50) pour donner (2) (6,97 g ; 80%) sous la forme d'une huile incolore.
[0081] RMN 'H (300 MHz, DMSO) à 8,80 (dd ; J= 6,1 ; 1,6 Hz ; 2H1,5), 7,86 (dd ; J= 6,1 ; 1,6 Hz, 2H2.4), 7,56 - 7,29 (m 5H914), 5,39 (s 2F17).
[0082] RMNRC (75 MHz, DMSO) ô 165,0 (106) ; 151,3 (2C1,) ; 137,2 (1C ; 136,1 (1C,) ; 129,0 (2C10,12) ; 128,8 (1C11) ; 128,6 (2C9.14) ; 123,0 (2C24) 67,4 (1C7).
[0083] SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour CI7IIIIN02 [M] : 213,0790 ; observée 213,0796.
[0084] Préparation de 2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinate de benzyle (3)
[0085] 19 [Chem.14] (3)
[0086] L'isonicotinate de benzyle (2) (2,48 g ; 11,630 mmol ; 1,0 eq) a été solubilisé dans le méthanol (43 mL), agité à 50 °C et de l'acide sulfurique concentré (320 FIL; 6,016 mmol ; 0,52 eq) a été ajouté.
Une solution de persulfate d'ammonium (26,500 g ; 116,000 mmol ; 10,0 eq) dans l'eau (43 mL) a été ajoutée en deux étapes : un premier ajout rapide de 30 gouttes, une suspension blanche se forme, puis en goutte à goutte rapide pendant 5 min.
La réaction s'emballe jusqu'à 75°C, puis la solution jaune obtenue a été agitée à 50°C pendant 1 h supplémentaire.
Après retour à température ambiante, le méthanol a été évaporé sous pression réduite. 50 mL d'acétate d'éthyle ont été ajoutés et le milieu a été neutralisé par ajout d'une solution saturée d' hydrogénocarbonatc de sodium.
La phase aqueuse a été extraite avec de l'acétate d'éthyle (3x100 mL) et les phases organiques rassemblées ont été lavées par une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium, puis concentrées sous pression réduite.
Le brut a été purifié par chromatographie flash (SiO2 dichlorométhane/méthanol, 95:5) pour donner (3) (1,56 g ; 49%) sous la forme d'un solide beige.
[0087] RMN 'H (300 MHz.
DMSO) h 7,81 (s; 2H2.4) ; 7.55- 7,32(m ; 5H911) ; 5,60 (t ; J= 5,9 Hz ; ; 5,40 (s ; 2117) ; 4,59 (d ; J= 5,9 Hz ; 4E1,4,6).
[0088] RMN '1C (75 MHz, DMSO) h 165,0 (106) ; 162,8 (2C1,5) ; 138,0 (1C3) ; 135,7 (1C8) ; 128.6 (2C10,12) ; 128,4 (1C11) 128.3 (2C9.13) ; 117,0 (2C2,4) 66,9 (1C7) ; 63.9 (2C14.16).
[0089] SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C15H15N04 [M] : 273,1001 ; observée 273.1001.
[0090] Préparation de l'acide 2,6-bis(hydroxyméthypisonicotinique (4)
[0091] [Chem.15] (4)
[0092] Le 2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinate de benzyle (3) (1,33 g ; 4,867 mmol ; 1,0 eq) a été dissous dans le méthanol (50 mL) et la solution a été dégazée avec de l'argon pendant 15 min Du palladium sur charbon 10% wt (133 mg) a été ajouté et le milieu réactionnel a été agité à température ambiante sous atmosphère d'hydrogène pendant 2 h.
Le milieu réactionnel a été filtré sur dicalitc (rinçage méthanol).
Le filtrat a été concentré sous pression réduite pour donner (4) (849 mg ; 95%) sous la forme d'un solide beige.
[0093] RMN 'H (300 MHz, DMSO) ô 7.78 (s ; 2H2,4); 5,54 (s large ; 2E411) ; 4,59 (s ; 4H8,10 ).
[0094] RMN11C (75 MHz.
DMSO) ô 166,7 (106) ; 162.5 (2C1) ; 139,4 (1C2) ; 117,3 (2C24) ; 64,0 (2.10).
[0095] SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C419N04[M] : 183,0532 ; observée 183,0526.
[0096] Préparation du 6-((2,6-bis(hydroxyméthyl)pyridin-4-yl)amidohexanoate de méthyle (5)
[0097] [Chem.16] (5)
[0098] L'acide 2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinique (4) (50 mg ; 0,273 mmol ; 1 eq) a été dissous dans le N,N-diméthylformamide anhydre (3,0 mL), la solution a été refroidie à 0°C, puis le HATU (156 mg ; 0,410 mmol ; 1,5 eq) et la 2,6-lutidine (147,0 FiL ; 1,260 mmol ; 4,7 eq) ont été ajoutés.
La solution d'activation a été agitée à 0°C 21 pendant 15 min puis le 6-aminohexanoate de méthyle (59 mg ; 0,322 mmol ; 1,2 eq) a été ajouté.
Les parois du ballon ont été rincées avec 2 mL de N,N-dirnéthylforrnamide anhydre et le milieu réactionnel a été agité à température ambiante pendant 15 h.
Le mélange réactionnel a été dilué dans l'acétate d'éthyle, lavé à trois reprises avec une solution saturée de chlorure de sodium, séché sur sulfate de magnésium, filtré et concentré sous pression réduite.
Le produit a été purifié par chromatographie flash (dichlorométhane/méthanol, 90:10) pour donner (5) (76 mg ; 91%) sous la forme d'un solide blanc cassé.
[0099] RMNIH (300 MHz, DMSO) t 8,79 (t ; J= 5,6 Hz ; 1F17) ; 7,71 (s ; 2112,4 ; 5,50(t ; = 5,8 Hz ; 2H1618) ; 4,57 (d ; J= 5,8 Hz ; 4H1,17) ; 3,57 (s ; 3H14) ; 3,25 (m ; 2H8) ; 2,30 (t ; J= 7,4 Hz ; 2H12); 1,62 - 1,45 (m ; 4H911); 1,37 - 1,21 (m ; 2E110).
[0100] RMNI3C (75 MHz, DMSO) h 173,3 (1C13) ; 165,1 (106) ; 161,8 (21,3) ; 142,9 (1C3) ; 115,8 (2C24 64,1 (2C13,17) ; 51,2 (1C14) ; 38,5 sous le DMSO (1C8) ; 312 (1C12) ; 28,6 (1C9) ; 25,9 (1C1,) ; 24,2 (1C10).
[0101] SMHR(ESI) : nz/z calculée pour C,5112'N20, [M+H]+: 311,1601.
[0102] Préparation du 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amidohexanoate de méthyle (6)
[0103] [Chem.17] (h)
[0104] Le 6((2,6-bis(hydroxyméthyl)pyridin-4-yl)amidohexanoate de méthyle (5) (55 me ; 0,177 mmol ; 1 eq) a été mis en suspension dans l'acétonitrile anhydre (105 mL) puis le tribromure de phosphore (50 pL ; 0,532 mmol : 30 eq) a été ajouté goutte à goutte.
Le milieu réactionnel a été agité à 45 °C pendant 2 h.
La solution a été refroidie à 0°C, neutralisée avec de l'eau (10 mL) et extraite à l'acétate d'éthyle (3x15 mL) Les phases organiques combinées ont été lavées avec une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite.
Le produit a été purifié par chromatographie flash (Si02, cyclohexane/acétate d'éthyle 60:40) pour donner (6) (57 mg ; 74%) sous la forme d'un solide blanc.
[0105] RMN 1H (300 MHz; DMSO) 8,83(t, J= 5,6 Hz ;11-17) ; 7,84(s ; 2H34) ; 4,74(s ; 4H1,16); 3,57 (s, 3H14) ; 3,31 -3.20 (m ; 214,) ; 2,31 (t ; J= 7,4 Hz; 2H1) ; 1,64- 1,45 (ni ; 41-12)n) ; 1,39- 1,22 (m, 2-1-110).
[0106] RMNI,C (75 MHz, DMSO) h 173,3 (1C13) ; 163,8 (106) ; 157,5 (2C15) ; 144,2 (1C3 ) ; 120,8 (2C2,4) ; 51,2 (1C14 ; 38,9 sous le DMSO (1C8) ; 34,1 (2C15,16) ; 33,2 (IC12) ; 28,5 (1C9) ; 25,9 (1C11) ; 24,2 (1C10).
[0107] SMHR(ESI) : nz/z calculée pour C151-EuBr2N203[M-FH] : 436,9820.
[0108] Préparation de l'acide 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amidohexanoïque (7)
[0109] [Chcm.18] Br (7)
[0110] Le 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amidohexanoate de méthyle (6) (57 mg ; 0,131 mmol ; 1,0 eq) a été dissous dans le tétrahydrofurane (4 mL) et une solution d'hydroxyde de lithium hydraté (8 mg ; 0,327 mmol ; 2,5 eq) dans l'eau (4 niL) a été ajoutée doucement.
Le milieu réactionnel a été agité à température ambiante pendant 8,5 h.
Le tétrahydrofuranc a été évaporé sous pression réduite et le résidu aqueux a été traité avec une solution aqueuse d'acide chlorhydrique IN et extrait avec de l'acétate d'éthyle (3x10 niL).
Les phases organiques rassemblées ont été lavées avec une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite.
Le produit a été purifié par chromatographie flash (dichlorométhane/méthanol, 90:10) pour donner (7) (44 mg ; 80%) sous la forme d'un solide blanc.
[0111] RMN 'H (300 MHz ; DMSO) h 12,00 (s ; 11-1,4) ; 8,83 (t ; J = 5,5 Hz ; 1H7) ; 7,84 (s ; 2H24); 4,74(s ; 4H15.47) ; 3,31 -3,21 (ni ; 211) ; 2,21 (t ; J= 7,3 Hz; 21-112) ; 1,60 - 1,46 (ni ; ; 1,39- 1,25 (m ; 2H10).
[0112] RMN ' 'C. (75 MHz; CDC1.2) h 174,4 (1C13) ; 163,8 (106) ; 157,5 (2C,4 ; 144,1 (1C:) ; 120,8 (2C24) ; 39,0 sous le DMSO (1C) ; 34,1 (2C6) ; 33,6 (1C12) ; 28,6 (1C9) ; 26,0 (1C11) ; 24.2(1C10).
[0113] SMHR (ESI) : m/z calculée pour C141-11913r2N20:1M-FH]: 420,9757 ; observée 420,9752.
[0114] Préparation de 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amido- N - hexanamide-valine-citrulline- p -aminobenzoyle carbamate de MMAE (8)
[0115] [Chem.9] 23 (8)
[0116] Sous atmosphère inerte, dans l'obscurité et en conditions anhydres, l'acide 642,6- bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amidohexanoïque (7) (13,2 mg ; 0,0313 mmol ; 2,28 eq) a été dissous dans l'acétonitrile anhydre (1,2 mp puis la N -éthoxy - carhony1-2-éthoxy -1,2-dihydroquinolinc (EEDQ) (21,2 mg ; 0,0857 mmol ; 6,25 eq) a été ajouté.
Le milieu d'activation a été agité à 25°C pendant 1 h 20.
Une solution de sel d'acide trifluoroacétique de valine-citrulline- p-arninobenzoyle carbamate de MMAE (17,0 mg ; 0,0137 mmol 1.0 eq), solubilisé dans du N,N-diméthylformamide anhydre (300 pL) en présence de N,N-diisopropyléthylanaine (9,4 pL ; 0,0537 mmol ; 3,92 eq), a été ajoutée au milieu d'activation.
Le milieu réactionnel obtenu a été agité à 25°C pendant 1 h.
Le mélange a été dilué par 2 avec du N,N-diméthylfonnamide et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative = 22,1 mm; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBndgeTM C-18 ; 5 pm (250 min x 19 00 mm) ; élution réalisée avec 0,1 % d'acide trifluoroacétique (en volume) dans l'eau (solvant A), et de l'acétonitrile (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 32 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner (8) (18,2 mg ; 87%) sous la forme d'un solide blanc.
[0117] RMN 'H (300 MHz, DMSO) à (ppm) 10,04 - 9,95 (m ; 1H) ; 8,94 - 8,79 (m ; 1H) ; 8,20 - 8,06 (m ; 2H) ; 7,98 - 7,87 (m ; 1H) ; 7,84 (s ; 2H) ; 7,81 (s ; 1H) ; 7,70 - 7,61 (m ; 1H); 7,58 (d ; J= 8,2 Hz ; 2H) ; 7,38 - 7,11 (m ; 6H) ; 6,07 - 5,92 (m ; 1H) ; 5,47 -5,37 (m ; 1H) ; 5,15 - 4,96 (m ; 1H) ; 4,73 (s ; 4H) ; 4,54 - 4,29 (m ; 2H) ; 4,32 - 4,12 (m ; 1H) ; 4,05 - 3,92 (m ; 1H) ; 3,30 - 3,08 (m ; 9H) ; 3,06 - 2,93 (m ; 2H) ; 2,91 -2,77 (m ; 2H) ; 2,24 - 2,05 (m ; 2H) ; 2,21 - 2,11 (m ; 3H) ; 2,02- 1,88 (m ; 1H) ; 1,60- 1,44 (m ; 5H) ; 1,36- 1,13 (m ; 4H) ; 1,08 - 0,93 (m ; 6H) ; 0,93 - 0,67 (m ; 28H). 24
[0118] SMHR (EST) : nez calculée pour C72H111Br2N12014 [M-F14]-: 1525,6704; observée 1525,6700.
[0119] Exemple 2 : synthèse d'un conjugué anticorps-médicament selon l'invention
[0120] Code du produit synthétisé: McSAF-pyridine (correspondant à la formule (lia), également appelé ci-après « conjugué anticorps-médicament selon l'invention » ou de manière générale « ADC »).
[0121] Anticorps utilisé : trastuzumab.
[0122] Préparation des solutions
[0123] Tampon de bioconjugaison : Tampon salin 1X, par exemple phosphate, borate, acetate, glycine, tris(hydroxymethyl)aminomethanc, 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinecthanesulfonic acid dans une plage de pH comprise entre 6 et 9, avec une concentration finale en NaCI comprise entre 50 et 300 mM et une concentration finale en EDTA comprise entre 0,1 et 10 mM.
[0124] Trastuzumab à une concentration comprise entre 1 et 10 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison.
[0125] Réducteur : Solution d'un réducteur choisi parmi le dithiotréitol, le p- mercaptoéthanol, l'hydre:chlorure de tris(2-carboxyéthyl)phosphinc, la tris(hydroxypropryl)phosphinc à une concentration comprise entre 0,1 et 10 mM dans le tampon de bioconjugaison.
[0126] Solution de linker : conjugué cytotoxique (8) à une concentration comprise entre 0,1 et 10 mM dans un mélange de solvants organiques choisis parmi le diméthylsulfoxide, le N,N-diméthylformamide, le méthanol, le tétrahydrofurane, Factéonitrile, le N,N - diméthylacétamide, le dioxane.
[0127] Réaction de bioconjugaison
[0128] Sous atmosphère inerte, au trastuzumab dans le tampon bioconjugaison (2,5 mg ; 1 éq) a été ajouté le réducteur (4 à 100 éq) et le milieu réactionnel puis le tout a été incubé entre 15 et 40 °C pendant 0,25 à 3 h puis la solution de linker (4 à 100 éq) a été ajoutée sous atmosphère inerte et le milieu réactionnel a été agité entre 15 et 40 °C pendant 0,5 à 15 h.
Cette réaction a été dupliquée, en parallèle, autant de fois que nécessaire pour obtenir la quantité d'ADC final souhaitée, Le. cinq fois.
[0129] Purification de l'ADC
[0130] Le mélange réactionnel a été purifié sur PD-10 (GE Healthcare) avec du tampon PBS Gibco pH 7,4 le nombre de fois nécessaire pour éliminer les réactifs chimiques résiduels, i.e. purifié 2 fois.
[0131] Résultat
[0132] Les étapes décrites ci-dessus ont permis d'obtenir 7,43 mg de McSAF-pyridine (57%).
[0133] Exemple 3 : analyses du conjugué anticorps-médicament (McSAF-pyridine)
[0134] Analyse HIC (Hydrophobie Interaction Chromatography)
[0135] Matériel et méthode
[0136] L'ADC McSAF-pyridine a été dilué à 1 rng/rnL avec du PBS pH 7,4 avant d'être filtré sur 0,22 pm. 50 pg de produits ont été injectés sur une colonne MAbPac HICButyl, 5 pm, 4,6 x 100 mm (ThermoScientific), connectée à une chainc HPLC Waters Alliance (c2695) équipée d'un PDA (02998) réglé pour une détection à 280 nm.
L'ADC McSAF-pyridine a été élué à un débit de 1 mL/min par un gradient depuis 100% de tampon A (1,5 M sulfate d'ammonium, 50 mM phosphate de sodium monobasique, 5% isopropanol ('Iv). pH 7,0) jusqu'à 20% de tampon B (50 mM phosphate de sodium monobasique, 20% isopropanol (v/v), pH 7,0) en 2 minutes puis jusqu'à 85% de tampon B cn 30 minutes puis ce gradient a été maintenu pendant 1 min.
La température a été maintenue à 25 °C tout au long de la séparation.
[0137] Les résultats sont présentés à la Figure 1 et dans le Tableau 1 ci-dessous.
[0138] [Tableaux 1] MeSAF-pyridine DAR 0 DAR 1 DAR 2 DAR 3 DAR 4 DAR 5 Temps de rétention (mM) 6.1 9.73 12.59 17.2 20,61 25,56 Aire (%) 2.85 0.1 0.57 10.93 68,51 17,04 DAR moyen 3,93
[0139] Analyse SEC (Size Exclusion Chromatokraphy)
[0140] Matériel et méthode
[0141] L'ADC McSAF-pyiidine a été dilué à 1 mg/mL avec du PBS pH 7,4 avant d'être filtré sur 0,22 Rm. 50 lig de produits ont été injectés sur une colonne AdvanceBio SEC 2.7 rn, 7,8 x 300 mm (Agilent Technologies), connectée à une chaine HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d'un PDA (2998) réglé pour une détection à 280 nm, d'un détecteur MALLS Wyatt (rniniDawnTM) et d'un détecteur d'indice de réfraction Wyatt (Optilab0 T-rEX).
L'ADC McSAF-pyridine été élué à un débit de 1 mumin par un isocratique de tampon C (1 m1VI phosphate de sodium monobasique, 155 mM de chlorure de sodium, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 3 mM d'azoture de sodium, pH 7,0) en 24 minutes.
La température a été maintenue à 25 °C tout au long de la séparation.
[0142] Les résultats sont présentés à la Figure 2 et dans le Tableau 2 ci-dessous.
[0143] 26 [Tablcaux2] McSAF-pyridine Agrégats solubles Oligomères Monomères Temps de rétention (min) 3,73 6,46 7,27 Aire (%) 0,03 0,83 99,14
[0144] Reproductibilité
[0145] Les résultats de reproductibilité sont présentés à la Figures 3 (reproductibilité sur 14 bioconjugaisons indépendantes (échelle 1 mg de trastuzumab engagé), analyse par HIC) et à la Figure 4 (reproductibilité sur différentes échelles, analyse HIC).
[0146] Conclusion : la bioconjugaison est parfaitement reproductible sur une même échelle et sur différentes échelles.
[0147] Exemple 4 : évaluation in vitro du conjugué anticorps-médicament (McSAF-p yridine)
[0148] Liaison à l'antigène HER-2 : reconnaissance de l'antigène HER2 sur une lignée positive (BT-474) et une lignée négative (MCF-7), comparaison avec un conjugué Trastuzumab-Médicament cytotoxique de référence décrit dans l'art antérieur, appelé trastuzumab emtansine (ci-après « T-DM1 »).
[0149] Matériel et méthode
[0150] Les cellules ont été obtenues de l'ATCC (BT-474 et MCF-7).
Un aliquote de cellules congelées a été décongelé rapidement dans un bain d'eau à 37°C et lavé deux fois avec du milieu de culture (F12/DMEM supplémenté avec 8% de SVF, 100 pg/mL de penicillin G de sodium, 100 pg/mL de streptomycin de sulfate) et déposé dans une Basque de culture cellulaire de 150 cm2 à une densité d'au moins 10 000 cellules/cm2.
Les cellules ont été maintenues à 37°C dans une atmosphère humide avec 5% de CG, pendant au moins une semaine.
[0151] Ensuite, les cellules ont été collectées et 100 000 à 500 000 cellules dans 80 pL ont été incubées avec 20 pL d'ADCs (McSAF-pyridine ou T-DM1) pendant 0,5 - 1 h à 4°C à des concentrations d'ADCs allant de 0,1 à 20 pg/mL (8 concentrations - 0,1 ; 0,5 ; 1; 2,5 ; 5 ; 10; 15 ; 20 pe/mL) ou avec un anticorps ciblant HER2 (trastuzumab, contrôle positif) aux mêmes concentrations.
Les cellules ont été lavées trois fois avec du tampon de marquage (PBS 1X-EDTA 2mM-BSA 0.5%) à 0°C et incubées avec un anticorps secondaire (100 pL au 1/100e, F(abi),-chèvre anti-IgG humaine Fc-PE, Life Technologies, # 1-110104) pendant 0,5 - 1 h à 4°C.
Après incubation avec les anticorps secondaires les cellules ont été lavées deux fois avec du tampon de marquage à 0°C.
[0152] Après lavage, les cellules ont été centrifugées et resuspendues dans 100 - 500 pL de 27 tampon de coloration à 0°C avant analyse par cytométric en flux.
L'émission de fluorescence moyenne relative (MEI) des sondes utilisées a été déterminée pour chaque échantillon sur une cytomètre en flux et analysée par un logiciel comme FCS Express 5 Flow Cytomctry (De Novo Software).
[0153] Résultats
[0154] Les résultats, présentés à la Figure 5, montrent que la reconnaissance de HER2 par McSAF-pyridine est similaire à la reconnaissance de HER2 par l'anticorps natif (trastuzumab) et T-DM1, et dépendante de la présence de HER2.
[0155] Cytotoxicité (MTS assay) : effet cytotoxique de McSAF-pyridine sur une lignée positive et une lignée négative comparé à T-DM1.
[0156] Matériel et méthode
[0157] Les cellules ont été obtenues de l'ATCC (BT-474 et MCF-7).
Un aliquote de cellules congelées a été décongelé rapidement dans un bain d'eau à 37°C et lavé deux fois avec du milieu de culture (F12/DMEM supplémenté avec 8% de SVF, 100 pg/mL de Lglutamine, 100 p.g/mL de pcnicillin Ode sodium, 100 pg/mL de streptomycin de sulfate) et déposé dans une flasque de culture cellulaire de 150 cm2 à une densité d'au moins 10 000 cellules/cm2.
Les cellules ont été maintenues à 37°C dans une atmosphère humide avec 5% de CO2 pendant au moins une semaine.
[0158] Ensuite, les cellules ont été collectées et déposées dans des plaques 96-puits à des densités entre 1,25 et 2,5.10 cellules par puit pour les essais de cytotoxicité.
Les cellules ont été incubées 48 h à 37 °C avant l'addition des ADCs testées et du véhicule (PBS).
Les pourcentages de DMSO n'ont jamais excédé 0,5%.
Les ADCs testés ont été ajoutés aux concentrations finales suivantes : 225 ; 75 ; 25 ; 8,33 ; 2,78 ; 0,926 ; 0,309 ; 0,103 ; 0,034 ; 0,011 nM ; et incubés pendant 72 h (+/- 2 h).
[0159] La viabilité cellulaire a été déterminée au dépôt des cellules (D-2), avant l'ajout des ADCs testés (DO) et 72 h après l'ajout des composés testés (D3) en mesurant la quantité d'ATP cellulaire en utilisant le kit CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega) selon les recommandations d'utilisation du fournisseur.
L'activité luciférase a été mesurée sur un luminomètre (PerkinElmer® EnVisionTM).
[0160] Chaque concentration de composé a été réalisée en tripliqua et deux expériences in- dépendantes ont été conduites.
[0161] Résultats
[0162] Les résultats, présentés à la Figure 6, montrent un effet cytotoxique supérieur du McSAF-pyridine pal- rapport au T-DM1 et dépendant de la présence de HER2.
[0163] Exemple 5 : stabilité de la bioconjugaison
[0164] Stabilité plasmatique : quantification par LC-MS/MS de la quantité de MMAE libérée après incubation dans du plasma humain à 37°C.
Comparaison entre McSAFpyridine et un ADC produit avec une tête d'accroche maléhnide (une seule liaison) = 28 McSAF-maléimidel de formule : [Chem. 9]
[0165] Matériel et méthode
[0166] Courbe de cal ibration MMAE
[0167] A 25 jiL d'échantillons (standard MMAE-d ou gamme de concentration MMAE) ont été ajoutés 25 [TL de RP424 (H20+0,1% FA) puis le mélange a été agité. 75 tL d'une solution de standard « MMAE-d8 » à 0,04 ug/mL ont été ajoutés avant d'agiter pendant 30 secondes.
Le mélange a été centrifugé à 20 000 g à 4°C pendant 10 minutes.
Le surnageant a été prélevé et transféré dans des flacons en polypropylène.
Une nouvelle centrifugation a été réalisée à 2500 g à 4°C pendant 5 min avant injection en LC-MS/MS.
Les échantillons ont été injectés sur une colonne Acquity BEH UPLC C18, 50 x 2.1 mm, 1.7 [lm connectée à une chaine LC-20AD et LC-20ADXR (Shimadzu) couplée à un détecteur de masse Shimadzu (8060) avec une source ESI+.
L'élution a été réalisée par gradient de 75% de tampon D (acétate d'ammonium 10 mM) dans 25% de tampon E (acétonitrile) à 5% de tampon D dans 95% de tampon E sur 5 minutes suivi d'une augmentation jusqu'à 75% de tampon D dans 25% de tampon E sur 5,1 minutes.
Les résultats ont été traités avec le logiciel Labsolution 6.60.
[0168] Incubation en plasma humain
[0169] Les échantillons ont été incubés en plasma humain stérile EDTA-2K (BioIVT) à une concentration initiale de 100 pg/mL 3 échantillons ont été collectés juste après avoir agité le mélange (TO) puis après 6 h, 12 h, 24h, 48 h et 96 h d'incubation à 37 T.
Les échantillons ont été conservés à -80°C avant leur analyse LC-MS/MS comme décrit ci-dessus.
[0170] Résultats 101711 Les résultats, présentés à la Figure 7, montrent que McSAF-pyridine libère moins de MMAE dans le plasma par rapport à McSAF-maléimidel.
McSAF-pyridine est donc plus stable que McSAF-maléimidel dans des conditions physiologiques.
101721 Stabilité à 37°C en présence ou non de HSA (Albumine sérique humaine) 101731 Matériel et méthode 101741 La concentration de McSAF-pyridine et de McSAF-maléimidel, dans un tampon PBS (1 mM de phosphate de sodium monobasique, 3 mM de phosphate de sodium 29 dibasique, 155 mM dc chlorure de sodium, 1 mM d'azoture de sodium, pH 7,4), a été ajustée à 2 mg/mL.
Douze (12) échantillons dc 20 mL de McSAF-pyridine et de McSAF-maléimidel ont été déposés dans douze flacons en polyproprylène (fishcr scicntific, 0,6 mL) puis 20 pL de tampon PBS (1 mM de phosphate de sodium monobasique, 3 mM de phosphate dc sodium dibasique, 155 mM de chlorure de sodium, 1 mM d'azoture de sodium, pH 7,4) ou 20 1iL d'une solution de HSA à 20 mg/mL dans le tampon PBS (1 mM de phosphate de sodium monobasique, 3 mM de phosphate dc sodium dibasiquc, 155 mM de chlorure de sodium, 1 mM d'azoture de sodium, pH 7,4) a été ajouté à chaque flacon.
Après agitation, chacun des 12 flacons est centrifugé 30 secondes à 5000 g avant incubation à 37°C dans un incubateur (VWR INCU-line IL23).
Les flacons ont été retirés trois par trois de l'incubateur conservés à -80°C après 1 minutes (TO), 24h, 48 h et 120 h.
[0175] Après dilution par un facteur 2 avec du tampon PBS (1 mM dc phosphate dc sodium monobasique, 3 mM dc phosphate de sodium dibasiquc, 155 mM de chlorure de sodium, 1 mM d'azoture de sodium, pH 7,4), le contenu de chacun des 12 flacons est filtré sur 0,22 pm et analysé par HIC.
Pour McSAF-pyridine, 50 pg de produits ont été injectés sur une colonne MAbPac HIC-Butyl, 5 mm, 4.6 x 100 mm (ThermoScientific), connectée à une chainc HPLC Waters Alliance (02695) équipée d'un PDA (c2998) réglé pour une détection à 280 nm.
Les échantillons ont été élues à un débit de 1 mL/ min par un gradient depuis 100% de tampon A (1,5 M sulfate d'ammonium, 50 mM phosphate de sodium monobasique. 5% isopropanol (v/v). pH 7,0) jusqu'à 100% de tampon B (50 mM phosphate de sodium monobasique, 20% isopropanol (v/v), pH 7,0) en 50 minutes.
La température a été maintenue à 25°C tout au long de la séparation.
[0176] Pour McSAF-maléimidel, 50 mg de produits ont été injectés sur une colonne TSKgel Butyl NPR, 2,5 pm. 4.6 x 100 mm (Tosoh), connectée à une chaine HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d'un PDA (e2998) réglé pour une détection à 280 nm.
Les échantillons ont été élués à un débit de 0,6 mL/min par un gradient depuis 100% de tampon A (1.5 M sulfate d'ammonium, 50 mM phosphate de sodium monobasique. pH 7.0) jusqu'à 20% de tampon B (50 mM phosphate de sodium monobasique, 20% isopropanol (v/v). pH 7,0) en 60 minutes puis ce gradient a été maintenu pendant 6 min.
La température a été maintenue à 30 °C tout au long de la séparation.
[0177] Résultats
[0178] Le suivi de l'évolution du DAR moyen par la méthode HIC après incubation à 37°C est présenté à la Figure 8.
Les résultats montrent une parfaite stabilité à 37°C de McSAF-pyridine, ce qui n'est pas le cas pour McSAF-maléimidel.
Cela s'explique par la stabilité accrue du conjugué anticorps-médicament selon l'invention.
[0179] Le suivi de l'évolution du DAR moyen par la méthode HIC après incubation avec un excès de HSA à 37 °C est présenté à la Figure 9.
Les résultats montrent une parfaite stabilité en présence de HSA de McSAF-pyridine, ce qui n'est pas le cas pour McSAFmaléimidel.
Cela s'explique par la stabilité accrue du conjugué anticorps-médicament selon l'invention.
[0180] Exemule 6 : évaluation in vivo du conjugué anticorps-médicament ( McSAF- pyridine)
[0181] Matériel et méthode
[0182] Toutes les expériences ont été conduites dans un environnement conforme aux re- commandations des autorités françaises (Agrément N° B 21 231 011 EA) et de la FELASA.
L'étude de survie a été réalisée sur un modèle de xénogreffe BT-474.
Une suspension de cellules tumorales a été implantée en sous-cutanée dans des souris immunodéprimées BALB/c nudc (Charles River) 24 à 72 h après une irradiation complète avec une source y (2 Gy, 60Co, BioMep, Brctenières, France).
Après prise du greffon tumoral, les souris ont été randomisées en groupes (N=8) une fois le volume moyen ayant atteint 150-200 me.
Les ADCs (McSAF-pyridine ou la reference T-DM1) ont été administrés aux jours 1 et 26 par voie intraveineuse (IV, bolus) dans la veine caudale des souris à 1 ou 5 mg/kg.
Le volume tumoral en fonction du temps a été calculé deux fois par semaine en utilisant la formule suivante : (Longueur x épaisseur2)/2.
Les animaux ont été euthanasies quand les volumes tumoraux ont atteint 10% de leur poids, soit approximativement 2000 me.
[0183] Résultats
[0184] Les résultats de l'administration d'une dose de 5 mg/kg sont présentés à la Figure 10 et à la Figure 11.
Les résultats de l'administration d'une dose de 1 mg/kg sont présentés à la Figure 12 et à la Figure 13.
Les résultats montrent qu'aux deux doses, 1 et 5 mg/kg, McSAF-pyridine est plus efficace que T-DMI.
A 5 mg/kg de McSAFpyridine, une régression tumorale complète et durable a été observée avec 8 souris guéries sur 8 souris traitées.
[0185] Une analyse complémentaire de type immunohistochimie (11-1C) sur les souris, à la fin de l'étude, a été réalisée.
Elle a permis de confirmer la complète éradication des cellules HER2+ dans la zone correspondant à la xénogreffe pour l'ADC McSAFpyridine, pour toutes les souris traitées à 5 mg/kg, confirmant ainsi la régression tumorale complète.
31 [Revendication I]

Claims (1)

  1. REVENDICATIONSConjugué cytotoxique de formule (I) suivante : [Chem. I] Tète croche Espaceur dans laquelle : la tête d'accroche est représentée par la formule suivante : [Chem. 2] X le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes : [Chem. 3] OU HN 0 [Chem. 4] l'espaceur est représenté par la formule suivante : 'Chem. SI 31 [Revendication 2] [Revendication 3] [Revendication 4] X est Br, Cl, I ou F ; m est un entier allant de 1 à 10. Conjugué cytotoxique selon la revendication I, dans lequel X est Br et m est égal à 5. Conjugué cytotoxique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel le médicament cytotoxique est choisi parmi méthotrexate, IMIDs, duocarmycin, combretastatine, calicheamicine, monométhylauristatine E (MMAE), monométhylauristatine F (MMAF), maytansine, DM1, DM4, SN38, amanitine, pyn-olobenzodiazepine, dimère de pyrrolobenzodiazepine, pyn-olopyridodiazepine, dimère de pyn-olopyridodiazepine, un inhibiteur de l'histone deacetylase, un inhibiteur de tyorsine kinase, et ricine, de préférence MMAE. Conjugué cytotoxique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 de formule (Ta) suivante : [Chem. 9] [Revendication 5] Conjugué anticorps-médicament dc formule (H) suivante : [Chem. 6] Médicament e..-ytatc>dque dans laquelle : A est un anticorps ou un fragment d'anticorps anti-HER2 ; 33 la tête d'accroche est représentée par la formule suivante : [Chem. 7] le bras de liaison est un bras de liaison clivable représenté par la formule suivante : 'Chem. 31 ou [Chem. 4] l'espaceur est représenté par la formule suivante : 'Chem. SI X est Br, Cl, I ou F ; 34 [Revendication 6] [Revendication 7] [Revendication 8] [Revendication 9] [Revendication 101 [Revendication 111 [Revendication 121 [Revendication 131 [Revendication 14] m est un entier allant de 1 à 10 ; n est un entier allant dc 1 à 4. Conjugué anticorps-médicament selon la revendication 5, dans lequel X est Br et ni est égal à 5. Conjugué anticorps-médicament selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6, dans lequel le médicament cytotoxique est choisi parmi méthotrexate. IMIDs, duocarmycin, combretastatinc, calicheamicine, monométhylauristatine E (MMAE), monométhylauristatinc F (MMAF), maytansinc, DM1, DM4, SN38, amanitinc, pyrrolobenzodiazepine, dimère de pyrrolobenzodiazcpine, pyrrolopyridodiazepine, dimère de pyrrolopyridodiazepine, un inhibiteur de l'histone deacetylasc, un inhibiteur de tyorsinc kinase, et ricinc, de préférence MMAE. Conjugué anticorps-médicament selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, dans lequel A est Trastuzumab. Conjugué anticorps-médicament selon l'une quelconque des revendications 5 à 8 de formule (Ha) suivante : [Chcm. 11] Composition comprenant un ou plusieurs conjugué(s) anticorps-médicament selon l'une quelconque des revendications 5 à 9. Composition selon la revendication 10, dans laquelle au moins 50%, de préférence au moins 65%, des conjugués anticorps-médicament ont un n égal à 4. Composition selon l'une quelconque des revendications 10 ou 11, dans laquelle A est un anticorps et. le Drug-to-Antibody Ratio moyen (DAR moyen) est compris entre 3,5 et 4,5, de préférence compris entre 3,8 et 4,2, par exemple égal à 4±0,1. Composition selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, comprenant en outre du paclitaxel, du docétaxel, de la doxorubicine, du cyclophosphamide, un inhibiteur de faromatase tel que l'anastrozole et / ou un anticorps utilisé en immunothérapie anti-cancéreuse tel qu'un anti-PD1. Conjugué anticorps-médicament selon l'une quelconque des reven- 35 [Revendication 15] dications 5 à 9 ou composition selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, pour utilisation comme médicament. Conjugué anticorps-médicament selon l'une quelconque des revendications 5 à 9 ou composition selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, pour utilisation dans le traitement d'un cancer HER2+, dc préférence le cancer du sein HER2+.
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