CA3138498A1 - Conjugues anticorps-medicament et leur utilisation en therapie - Google Patents

Conjugues anticorps-medicament et leur utilisation en therapie Download PDF

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Abstract

L'invention concerne des conjugués cytotoxiques et des conjugués anticorps- médicament, et leur utilisation en thérapie, notamment pour traiter les cancers HER2+.

Description

DESCRIPTION
Titre de l'invention : conjugués anticorps-médicament et leur utilisation en thérapie Domaine Technique [0001] La présente invention concerne des conjugués cytotoxiques utiles comprenant une tête d'accroche, un bras de liaison, un espaceur et un agent cytotoxique.
[0002] La présente invention concerne également des nouveaux conjugués anticorps-médicaments comprenant un anticorps dirigé contre l'antigène HER2 (human epidermal growth factor receptor 2) couplé à un médicament cytotoxique et leur utilisation comme médicament, notamment en thérapie anti-cancéreuse.
Technique antérieure
[0003] Un conjugué anticorps-médicament (en anglais Antibody Drug Conjugate ou ADC ) constitue un moyen de délivrance sélective d'un médicament cytotoxique. Le conjugué anticorps-médicament permet donc de combiner la spécificité du ciblage par les anticorps avec de nouvelles fonctions effectrices puissantes par les agents qui leur sont conjugués.
[0004] La structure générale d'un conjugué anticorps-médicament est celle de la formule (II). La partie liant l'anticorps et le médicament est appelée bras de liaison ou linker. Il peut être greffé sur l'anticorps via l'une au moins des huit cystéines formant les 4 ponts disulfures inter-chaînes. Le nombre de molécules de médicaments cytotoxiques greffées sur l'anticorps détermine un ratio appelé
Drug-to-Antibody Ratio (DAR).
[0005] Après fixation sur son antigène cible, l'anticorps est intemalisé dans la cellule par endocytose médiée par des récepteurs. Les vésicules fusionnent avec des lysosomes où le médicament cytotoxique est libéré de l'anticorps via différents mécanismes. Le médicament cytotoxique actif agit ensuite directement sur la cellule en induisant sa mort et parfois sur les cellules cancéreuses voisines par transport ou diffusion dans l'environnement. L'anticorps est donc principalement utilisé comme vecteur et apporte le médicament cytotoxique dans la cellule.
[0006] Les anticorps anti-HER2 ont déjà été conjugués à des médicaments cytotoxiques, dont la Monomethyl auristatin E (MMAE). Un conjugué cytotoxique portant la MMAE a été développé sous le nom de vedotin . Ce médicament cytotoxique a été utilisé avec divers anticorps monoclonaux pour la préparation de conjugués anticorps-médicament. On peut par exemple citer le brentuximab-vedotin ou le Glembaturnumab-vedotin.
[0007] La MMAE a été conjuguée au Trastuzumab comme décrit dans le document Bryant et al., Mol. Pharmaceutics, 2015, 12 (6), pp 1872-1879). Néanmoins, l'efficacité du Trastuzumab-MMAE décrit dans ce document n'est pas satisfaisante, notamment pour espérer traiter efficacement les cancers HER2+.
Ceci peut être dû au faible DAR.
[0008] Il existe donc un besoin de développer des conjugués anti-HER2-médicament cytotoxique plus efficaces et plus stables.
Résumé de l'invention
[0009] Un premier objet de l'invention concerne un conjugué cytotoxique de formule (I) suivante :
________________________________________ , ._ __ Tête Bras de ,, Médicament Espaceur r¨

d'accroche : liaison cytotoxique _______________________________________________________________________________ __________________________________ h dans laquelle :
la tête d'accroche est représentée par l'une quelconque des deux formules suivantes :
X.\

x N '3 '-= 0 H i s \ el X ,.===-µ,. e- 'µ . N .-t¨C F-12 -0,' i 0 --......--- -,õ--- --.).,---x .....
N
Ce H
Il rn ;I`
..,` --- . .

H µ
et , le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes :

H
ez H

A
0' NH2 ou -µ)C7rm H
0 =
l'espaceur est représenté par la formule suivante :

fq Fi =
X est Br, Cl, I ou F;
m est un entier allant de 1 à 10, de préférence égal à 4 ou 5.
[0010] Un second objet de l'invention concerne un conjugué anticorps-médicament de formule (Il) suivante :
a5 Tête aras de ¨
Eseaceur Mèdecameretl f (raccroche e.son cytotoxeque (Il) dans laquelle :
A est un anticorps ou un fragment d'anticorps anti-HER2 ;
la tête d'accroche est représentée par l'une quelconque des deux formules suivantes :

õ
e N

H
N

\ e."
kCH2)t -rek H et le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes :

H
Nõse Nr .
O
HN
cf 'NH2 ou e' H
,N 1é
, `N `9 H
=
l'espaceur est représenté par la formule suivante :

FI =
m est un entier allant de 1 à 10, de préférence égal à 4 ou 5;
n est un entier allant de 1 à 4.
[0011] Un troisième objet de l'invention concerne une composition comprenant un ou plusieurs conjugué(s) anticorps-médicament selon l'invention.
[0012] Un quatrième objet de l'invention concerne un conjugué anticorps-médicament selon l'invention ou une composition selon l'invention, pour utilisation comme médicament.
[0013] Un cinquième objet de l'invention concerne un conjugué anticorps-médicament selon l'invention ou une composition selon l'invention, pour utilisation dans le traitement d'un cancer HER2-E.
[0014] Un sixième objet de l'invention concerne un procédé de préparation d'un 5 conjugué cytotoxique selon l'invention comprenant une étape qui consiste à
coupler une tête d'accroche de formule :
X
X
X
fr4riH 0 Ns. I
N(CH2 X )( NiitCH2)-( 0 'OH ou H m OH
avec un composé de formule Bras de Médicament Espaceur liaison cytotoxique dans laquelle :
le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes :

H
1-121X1r 0 f-H N

ou AIL
H2N- Nµ-r O

l'espaceur est représenté par la formule suivante :

0-eily eeCN
H
X est Br, Cl, I ou F;
m est un entier allant de 1 à 10, de préférence égal à 4 ou 5.
[0015] De préférence, le procédé de préparation d'un conjugué cytotoxique selon l'invention comprend une étape qui consiste à coupler l'acide 6-(2,6-bis(bromométhyppyridin-4-yl)amidohexanoTque ou l'acide 6-((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amino)-6-oxohexandique avec le valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE ou un sel de ce composé.
[0016] Un septième objet de l'invention concerne un procédé de préparation d'un conjugué anticorps-médicament selon l'invention comprenant les étapes suivantes :
(i) préparer un conjugué cytotoxique selon le procédé de l'invention, et (ii) faire réagir le conjugué cytotoxique obtenu à l'étape (i) avec un anticorps anti-HER2 ou un fragment d'anticorps anti-HER2.
[0017] De préférence, le procédé de préparation d'un conjugué anticorps-médicament selon l'invention comprend une étape qui consiste à faire réagir du 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amido-N-hexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE ou du 6-((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amino)-6-oxohexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE avec un anticorps anti HER-2 ou un fragment d'anticorps anti-HER2.
Description détaillée
[0018] Définitions
[0019] Le terme conjugué cytotoxique désigne un conjugué qui comprend un médicament cytotoxique.
[0020] Le terme c< médicament cytotoxique désigne toute molécule naturelle ou de synthèse, capable d'inhiber ou d'empêcher la fonction des cellules. On entend par cytotoxique , la propriété pour un agent chimique ou biologique, d'altérer des cellules, éventuellement jusqu'à les détruire.
s [0021] Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le médicament cytotoxique est choisi parmi tout composé ayant obtenu une AMM et qui est utilisé en thérapie anti-cancéreuse ou anti-inflammatoire, toute molécule en cours d'évaluation clinique en thérapie anti-cancéreuse ou anti-inflammatoire. Le médicament cytotoxique sera choisi par exemple parmi le paclitaxel (Taxole) ou 1.43 le docetaxel (Taxotère0) ou l'un de ses dérivés, le topotecan, le bortezomib, la daunorubicine, les analogues de daunorubicine, la vincristine, la mitomycine C, l'acide rétinoïque, le méthotrexate, l'ilomédine, l'aspirine, un IMIDs, le lénalidomide, le pomalidomide.
[0022] Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le médicament 15 cytotoxique est sélectionné dans le groupe constitué de la duocarmycine et ses analogues, les dolastatines, la combretastatine et ses analogues, la calichéamicine, la N-acétyl-y-calichéamycine (CMC), un dérivé de calichéamycine, la maytansine et ses analogues, tel qu'un dérivé de type maytansino-ide, par exemple le DM1 et le DM4, les auristatines et leurs dérivés, 20 tels que l'auristatine E, l'auristatine EB (AEB), l'auristatine EFP
(AEFP), la monométhyle auristatine E (MMAE), la monométhyle auristatine F (MMAF), la tubulysine, le disorazole, les epothilones, l'echinomycine, l'estramustine, la cemadotine, l'eleutherobine, la methopterine, l'actinomycine, la mitomycin A, la camptothécine, un dérivé de la camptothécine, le SN38, le TK1, l'amanitine, une 25 pyrrolobenzodiazépine, un dimère de pyrrolobenzodiazépine, une pyrrolopyridodiazépine, un dimère de pyrrolopyridodiazépine, un intercalant de l'ADN, un inhibiteur d'histone deacetylase, ou un inhibiteur de tyrosine kinase.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le médicament M
est sélectionné parmi l'exotoxine de pseudomonas (PE), la deBouganin, la Bouganin, 30 la toxine diphtérique (DT) et la ricine.
[0023] Dans un mode de réalisation particulier, le médicament cytotoxique est choisi parmi méthotrexate, IMIDs, duocarmycin, combretastatine, calichéamicine, monométhyle auristatine E (MMAE), monométhyle auristatine F (MMAF), maytansine, DM1, DM4, SN38, amanitine, pyrrolobenzodiazepine, dimère de pyrrolobenzodiazepine, pyrrolopyridodiazepine, dimère de pyrrolopyridodiazepine, un inhibiteur de l'histone déacétylase, un inhibiteur de tyrosine kinase, et ricine, de préférence MMAE, représenté par la formule suivante :

H µs õN N dõN seok O., 'Nil deeit*
µ.
tµ
[0024] Le terme anticorps , également appelé immunoglobuline désigne un hétérotétramère constitué de deux chaînes lourdes d'environ 50-70 kDa chacune (dites les chaînes H pour Heavy) et de deux chaînes légères d'environ 25 kDa chacune (dites les chaînes L pour Light), liées entre elles par des ponts disulfures intra et intercaténaires. Chaque chaîne est constituée, en position N-terminale, d'une région ou domaine variable, dit VL pour la chaîne légère, VH
pour la chaîne lourde, et en position C-terminale, d'une région constante, constituée d'un seul domaine dit CL pour la chaîne légère et de trois ou quatre domaines nommés CH1, CH2, 0H3, 0H4, pour la chaîne lourde.
[0025] Par anticorps chimérique , on entend un anticorps dont les séquences des régions variables des chaînes légères et des chaînes lourdes appartiennent à
une espèce différente de celle des séquences de régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes. Aux fins de l'invention, les séquences des régions variables des chaînes lourdes et légères sont préférentiellement d'origine murine tandis que les séquences des régions constantes des chaînes lourdes et légères appartiennent à une espèce non-murine. A cet égard, pour les régions constantes, toutes les espèces de mammifères non-murins sont susceptibles d'être utilisées, et en particulier l'homme, le singe, les suidés, les bovidés, les équidés, les félidés, les canidés ou encore les oiseaux, cette liste n'étant pas exhaustive. De façon préférée, les anticorps chimériques selon l'invention contiennent des séquences de régions constantes des chaînes lourdes et légères d'origine humaine et les séquences de régions variables des chaînes lourdes et légères d'origine murine.
s [0026] Par anticorps humanisé , on entend un anticorps dont tout ou partie des séquences des régions impliquées dans la reconnaissance de l'antigène (les régions hypervariables ou CDR : Complementarity Determining Région) et parfois certains acides aminés des régions FR (régions Framework) sont d'origine non-humaine tandis que les séquences des régions constantes et des 1.0 régions variables non-impliquées dans la reconnaissance de l'antigène sont d'origine humaine.
[0027] Par anticorps humain , on entend un anticorps contenant uniquement des séquences humaines, aussi bien pour les régions variables et constantes des chaînes légères que pour les régions variables et constantes des chaînes 15 lourdes.
[0028] On entend par fragment d'anticorps , toute partie d'une immunoglobuline obtenue par digestion enzymatique ou obtenue par bioproduction comprenant au moins un pont disulfure, par exemple Fab, Fab', F(ab)'2, Fab'-SH, scFv-Fc ou Fc.
[0029] La digestion enzymatique des immunoglobulines par la papaïne génère deux 20 fragments identiques, qu'on appelle les fragments Fab (Fragment antigen binding), et un fragment Fc (Fragment cristallisable). La digestion enzymatique des immunoglobulines par la pepsine génère un fragment F(ab1)2 et un fragment Fc scindé en plusieurs peptides. F(ab1)2 est formé de deux fragments Fab' liés par des ponts disulfures intercaténaires. Les parties Fab sont constituées des 25 régions variables et des domaines CH1 et CL. Le fragment Fab' est constitué de la région Fab et d'une région charnière. Fab'-SH fait référence à un fragment Fab' dans lequel le résidu cystéine de la région charnière porte un groupe thiol libre.
Le scFv (single chain Fragment variable) est un fragment issu de l'ingénierie des protéines qui est constitué uniquement des domaines variables VH et VL. La 30 structure est stabilisée par un court bras peptidique flexible, appelé linker, qui est placé entre les deux domaines. Le fragment scFv peut être lié à un fragment Fe pour donner un scFv-Fc.

[0030] Le terme HER2 désigne le Human Epidermal growth factor Receptor 2 , qui est une protéine membranaire de la famille des récepteurs du facteur de croissance épidermique humain. HER2 est aussi appelé fréquemment ErbB2 .
s [0031] Le terme cancer HER2+ ou cancer HER2 positif désigne un cancer impliquant une activation exacerbée de HER2. En particulier, le terme cancer HER2+ désigne tout cas de cancer pour lequel des cellules cancéreuses présentent une dérégulation du gène HER2. De préférence, dans le cadre de la présente invention, le cancer HER2+ est choisi parmi le cancer du sein, le cancer 10 du tractus génital féminin, tel que le cancer de l'endomètre, le cancer de l'utérus ou le cancer de l'ovaire, le cancer de la vessie, le cancer de l'anus, le cancer colorectal en particulier le carcinome séreux papillaire utérin, le cancer du poumon, en particulier le cancer du poumon qui n'est pas à petites cellules, le cancer du foie, le cancer du rein, le cancer gastro-oesophagien, le cancer de l'estomac, le cancer du pancréas et le cancer gastrique. Dans un mode de réalisation préféré, le cancer HER2+ est choisi parmi le cancer du sein HER2+, le cancer de l'ovaire HER2+, le cancer de la vessie HER2+, le cancer colorectal HER2+, le carcinome séreux papillaire utérin HER2+ et un cancer gastrique HER2+, de préférence le cancer du sein HER2+.
[0032] Par purifié et isolé , on entend, en se référant à un anticorps selon l'invention, que l'anticorps est présent en l'absence substantielle d'autres macromolécules biologiques du même type. Le terme "purifié" tel qu'utilisé ici signifie de préférence au moins 75% en poids, plus préférablement au moins 85% en poids, encore plus préférablement au moins 95% en poids, et le plus préférablement au moins 98% en poids d'anticorps, par rapport à l'ensemble des macromolécules présentes.
[0033] Le terme pharmaceutiquement acceptable signifie approuvé par une agence réglementaire fédérale ou d'État ou énuméré dans la pharmacopée américaine ou européenne, ou dans une autre pharmacopée généralement reconnue, destiné à être utilisé chez les animaux et chez l'homme. Une composition pharmaceutique désigne une composition comprenant un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Par exemple, un véhicule pharmaceutiquement acceptable peut être un diluant, un adjuvant, un excipient ou un véhicule avec lequel ragent thérapeutique est administré. Ces véhicules peuvent être des liquides stériles, tels que l'eau et des huiles, y compris ceux d'origine pétrolière, animale, végétale ou synthétique, tels que l'huile d'arachide, l'huile de soja, l'huile minérale, l'huile de sésame, etc. L'eau est un véhicule préféré lorsque la composition pharmaceutique est administrée par voie intraveineuse. Des solutions salines et des solutions aqueuses de dextrose et de glycérol peuvent également être utilisées comme véhicules liquides, en particulier pour les solutions injectables. Les excipients pharmaceutiquement acceptables comprennent l'amidon, le glucose, le lactose, le saccharose, le stéarate de 1.0 sodium, le monostéarate de glycérol, le talc, le chlorure de sodium, le lait écrémé
en poudre, le glycérol, le propylène glycol, l'eau, l'éthanol et similaires.
Lorsque la composition pharmaceutique est adaptée à une administration orale, les comprimés ou les gélules peuvent être préparés par des moyens classiques avec des excipients pharmaceutiquement acceptables tels que des agents liants (par exemple de l'amidon de mais prégélatinisé, de la polyvinylpyrrolidone ou de l'hydroxypropyl méthylcellulose); des charges (par exemple du lactose, de la cellulose microcristalline ou de l'hydrogénophosphate de calcium); des lubrifiants (par exemple, stéarate de magnésium, talc ou silice); des délitants (par exemple l'amidon de pomme de terre ou le glycolate d'amidon sodique); ou des agents mouillants (par exemple, le laurylsulfate de sodium). Les comprimés peuvent être enrobés par des procédés bien connus dans l'état de la technique. Les préparations liquides pour administration orale peuvent prendre la forme, par exemple, de solutions, de sirops ou de suspensions, ou peuvent être présentées sous forme de produit sec à reconstituer avec de l'eau ou un autre véhicule approprié avant utilisation. De telles préparations liquides peuvent être préparées par des moyens classiques avec des véhicules pharmaceutiquement acceptables tels que des agents de suspension (par exemple un sirop de sorbitol, des dérivés de la cellulose ou des graisses comestibles hydrogénées); des agents émulsifiants (par exemple, la lécithine ou l'acacia); véhicules non aqueux (par exemple huile d'amande, esters huileux, alcool éthylique ou huiles végétales fractionnées); et des conservateurs (par exemple des p-hydroxybenzoates de méthyle ou de propyle ou de l'acide sorbique). Les compositions pharmaceutiques peuvent également contenir des sels tampons, des aromatisants, des colorants et des édulcorants, selon le cas. La composition selon l'invention est de préférence une composition pharmaceutique.
[0034] Le terme traiter ou traitement englobe tout effet bénéfique ou souhaitable sur les symptômes d'une pathologie ou d'un état pathologique, et peut même inclure une réduction minimale d'un ou plusieurs marqueurs mesurables de la pathologie ou de l'état pathologique. Le traitement peut par exemple impliquer soit la réduction ou l'amélioration des symptômes de la pathologie ou de l'état pathologique, soit le retardement de la progression de la maladie ou de l'état pathologique. Le terme traitement ne signifie pas 1.0 nécessairement l'éradication complète ou la guérison de la pathologie, ni des symptômes associés.
[0035] Conjuaué cytotoxique [0036] L'invention concerne_un conjugué cytotoxique de formule (I) suivante :
Tête _S. Bras de Médicament liaison Espaceur ¨ cytotoxique d'accroche dans laquelle :
la tête d'accroche est représentée par l'une quelconque des deux formules X N,, X

H / \

X
X
I \ NCH2T;Sev, rir õ
e. e'ee suivantes : 0 et H
le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes :

H
o HN
e H
Otc 2 ou H

l'espaceur est représenté par la formule suivante :

õ ,=?
-µ` -0' --y .µ
H =
X est Br, Cl, I ou F, avantageusement Br;
m est un entier allant de 1 à 10, avantageusement allant de 2 à 7, de 3 à 6, avantageusement égal à 4 ou 5.
[0037] Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le conjugué
cytotoxique répond à l'une quelconque des deux formules (la) suivantes :
%i-j- 4%
C) 1 C.# f H t,? r- 4 .
.õ 0, 0 ?.4 =
D .f?.
-lIN
t.
Aem et et 't4}4, OU
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I
0 0 creel"" yr ô , q e ' e 0 , ,i;
, , d'Nel I
0 k OH , --4.
(S.
<Y'. '""Ntle t =.).
[0038] Conjugué anticorps-médicament L'invention concerne également un conjugué anticorps-médicament de formule s (Il) suivante :
.. ___________________________________________________________________________ .,., _ 0 . _____________________________________________________ , .
Tête 3 Bras de .,..õ, Médicament Espace -ur 'i d catche liaison cytotoxktue ________________________________________________________ .. . ____________ ...in dans laquelle :
A est un anticorps ou un fragment d'anticorps anti-HER2 ;
la tête d'accroche est représenté par l'une quelconque des deux formules suivantes :
.." =,,, , N e---- 0 H i / t-1--N ,--1/2k- , N -4.--Cil ge f\-,õ---- ''''\,;,,----- --...,;1.--= k 2 / Ns, E i lm Sbeee "se Ile: eje:%%t 0 gisc.,..,"):%.%%.=%%. ,.... uit(i%

2t, .
H
ou , le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes :

N N, H
.,,--HN
ou H
N NNt H

l'espaceur est représenté par la formule suivante :

e'"µ""=, o .2 H

m est un entier allant de 1 à 10, avantageusement allant de 2 à 7, de 3 à 6, avantageusement égal à 4 ou 5;
n est un entier allant de 1 à 4.
[0039] L'anticorps ou le fragment d'anticorps anti-HER2 selon l'invention peut être 10 d'origine mammifère (ex. humain ou de souris), humanisé ou chimérique. Il s'agit de préférence d'un anticorps monoclonal produit de manière recombinante par des cellules génétiquement modifiées selon des techniques largement décrites dans l'art antérieur.
[0040] Lorsque A est un anticorps anti-HER2, il s'agit de préférence d'une IgG
15 humaine, par exemple Igal , IgG2, Ig03 ou IgG4. Dans un mode de réalisation particulier, A est le trastuzumab.
[0041] Trastuzumab est un anticorps anti-HER2 humanisé de type IgG1 de séquence SEQ ID NO : 1 pour la chaine légère et SEQ ID NO :2 pour la chaine lourde. Trastuzurnab est notamment commercialisé par la société Roche sous le nom Herceptine.
[0042] Dans un mode de réalisation particulier, le conjugué anticorps-médicament de l'invention a l'une quelconque des deux formules suivantes :
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µ
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f el [0043] Dans un mode de réalisation particulier, le conjugué anticorps-médicament de l'invention a l'une quelconque des deux formules (11a) suivantes :
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[0044] Le conjugué anticorps-médicament de formule (I la) est identifié dans les exemples sous la référence McSAF-pyridine ou c< McSAF-pyridine rétroamide respectivement [0045] Avantageusement, le conjugué anticorps-médicament selon l'invention est s purifié (ou isolé) en mettant en oeuvre des techniques de purification connues, telle que la purification sur colonne de chromatographie et / ou d'affinité.
[0046] Lorsque n est égal à 1, le conjugué anticorps-médicament est communément appelé DAR1 . Lorsque n est égal à 2, le conjugué anticorps-médicament est communément appelé DAR2 . Lorsque n est égal à 3, le conjugué anticorps-1.43 médicament est communément appelé DAR3 . Lorsque n est égal à 4, le conjugué anticorps-médicament est communément appelé DAR4 .
[0047] Dans un mode de réalisation particulier, le conjugué anticorps-médicament présente une ou plusieurs fonctions effectrices médiées par la partie Fc atténuée.
De préférence, la ou les fonctions effectrices médiées par la partie Fc est/sont 15 choisies parmi l'ADCC (Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) et la CDC
(Complement-dependent cytotoxicity). L'Homme du métier n'aura aucune difficulté à atténuer une ou plusieurs fonctions effectrices médiées par la partie Fc au regard de l'enseignement de l'art antérieur, par exemple en mutant la partie Fc. De nombreuses mutations sont connues pour diminuer les fonctions 20 effectrices médiées par la partie Fc. Il peut s'agir par exemple d'une mutation visant à déglycosyler la partie Fc, notamment à supprimer la glycosylation au niveau de l'asparagine 297.
[0048] Dans un mode de réalisation particulier, le conjugué anticorps-médicament est déglycosylé au niveau de la partie Fc, par exemple le conjugué anticorps-25 médicament ne porte plus de glycosylation au niveau de l'asparagine 297.
[0049] Composition [0050] L'invention concerne également une composition comprenant un ou plusieurs conjugué(s) anticorps-médicament de formule (II) tel que défini ci-dessus. Il peut 30 s'agir d'une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs conjugué(s) anticorps-médicament de formule (II) tel que défini ci-dessus et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
[0051] La composition selon l'invention a la caractéristique d'être particulièrement homogène, ce qui peut se traduire par une meilleure stabilité, une meilleure s efficacité et/ou une diminution des effets secondaires de la composition, par rapport à une composition qui n'est pas homogène.
[0052] Avantageusement, lorsque A est un anticorps, par exemple trastuzumab, la composition selon l'invention se caractérise par les caractéristiques suivantes :
a) au moins 50%, de préférence au moins 55%, au moins 60%, au moins 65%, 1.0 par exemple au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4 ;
b) le Drug-to-Antibody Ratio moyen (DAR moyen) est compris entre 3,5 et 4,5, de 15 préférence compris entre 3,8 et 4,2, entre 3,9 et 4,1% entre 3,9 et 4,0, par exemple égal à 4,0 0,2, 4,0 0,1, par exemple égal à 3,93 0,01. Le DAR
moyen est généralement déterminé par la méthode HIC (Hydrophobic Interaction Chromatography) ou par spectrométrie de masse native. La méthode HIC et la méthode de spectrométrie de masse native sont largement décrites dans la 20 littérature. Il peut être cité par exemple la référence [1] pour la méthode HIC et la référence [2] pour la méthode de spectrométrie de masse native ;
c) au moins 95%, par exemple au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% des conjugués anticorps-médicament sont présents sous forme de monomère. Le pourcentage de monomère est généralement déterminé par la 25 méthode SEC (Size Exclusion Chromatography). La méthode SEC est largement décrite dans la littérature, par exemple dans la référence [3] ;
d) un ou plusieurs des ratios de n définis ci-après ; ou e) une combinaison de deux, trois ou quatre caractéristiques choisies parmi a), b), c) et d).
30 [0053] Lorsque A est un anticorps, la composition selon l'invention peut comprendre des DARO, c'est-à-dire des anticorps sans conjugué cytotoxique. De préférence, moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1%, moins de 0,5%, moins de 0,4%, moins de 0,2%, moins de 0,1% de DARO, par exemple environ 0% de DARO. Le pourcentage de DARO peut être déterminé par la méthode HIC (Hydrophobie Interaction Chromatography) ou par spectrométrie de masse native.
[0054] La composition selon l'invention peut également comprendre des DAR5, s c'est-à-dire des conjugués anticorps-médicament ayant 5 conjugués cytotoxiques. De préférence moins de 25%, moins de 20%, moins de 15%, moins de 10%, moins de 9%, moins de 8%, moins de 7%, moins de 6%, moins de 5%
de DAR5. La présence de DAR5 dans des compositions de conjugués anticorps-médicament est largement décrite dans la littérature, néanmoins la structure lo exacte des DAR5 est peu étudiée. Ainsi, le DAR moyen est calculé en tenant compte de l'ensemble des DARs présents dans la composition, c'est-à-dire les DARO, les DAR1 (i.e. n=1), les DAR2 (i.e. n=2), les DAR3 (i.e. n=3), les DAR4 (i.e. n=4), les DAR5, etc. De préférence, lorsque A est un anticorps, la composition selon l'invention comprend moins de 1% de DAR supérieur à DAR5, 15 par exemple DAR6, DAR7, etc. De préférence, la composition selon l'invention ne comprend pas de DAR supérieur à DAR5, par exemple DAR6, DAR7, etc. Les pourcentages de DAR5 et plus peuvent être déterminés par la méthode HIC
(Hydrophobie Interaction Chromatography) ou par spectrométrie de masse native.
20 [0055] Lorsque A est un anticorps, par exemple trastuzumab, la composition selon l'invention peut se caractériser par des ratios de n ci-après :
- moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1%, moins de 0,75%, moins de 0,5%, moins de 0,25%, moins de 0,1%, par exemple environ 0,1% ou environ 0% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont 25 un n égal à 1, - moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1%, moins de 0,75%, moins de 0,5%, moins de 0,25%, moins de 0,1%, par exemple environ 0,5% ou environ 0% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 2, 30 - moins de 20%, moins de 15%, moins de 10%, moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1%, par exemple environ 8% ou environ 10% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 3, et - au moins 50%, au moins 55%, au moins 60%, au moins 65%, par exemple au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99%, par exemple environ 80% ou environ 70% 5% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4_ 5 [0056] Lorsque A est un anticorps, par exemple trastuzumab, la composition selon l'invention peut également se caractériser par des ratios de n ci-après :
- entre 0% et 5%, entre 0% et 2%, entre 0% et 1%, entre 0% et 0,75%, entre 0%
et 0,5%, entre 0% et 0,25%, entre 0% et 0,1% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 1, 1.43 - entre 0% et 5%, entre 0% et 2%, entre 0% et 1%, entre 0% et 0,75%, entre 0%
et 0,5%, entre 0% et 0,25%, entre 0% et 0,1% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 2, - entre 0% et 5%, entre 5% et 15%, entre 8% et 12%, entre 8% et 9%, entre 9%
et 11 /0 des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à
3, 15 et - entre 50 et 75%, entre 65% et 70%, entre 70% et 85%, entre 75% et 80%, par exemple au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4.
20 [0057] Les ratios de n peuvent être déterminés par la méthode HIC
(Hydrophobie Interaction Chromatography) ou par spectrométrie de masse native.
[0058] Dans un premier mode de réalisation particulier, lorsque A est un anticorps, par exemple trastuzumab, la composition selon l'invention peut se caractériser par des ratios de n déterminés par la méthode HIC (Hydrophobie Interaction Chromatography) ci-après :
- moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1%, moins de 0,75%, moins de 0,5%, moins de 0,25%, par exemple environ 0,1% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 1, - moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1%, moins de 0,75%, par exemple environ 0,5% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 2, - moins de 20%, moins de 15%, moins de 10%, moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1%, par exemple environ 10% des
21 conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 3, et / ou - au moins 50%, au moins 55%, au moins 60%, au moins 65%, par exemple au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99%, par exemple environ 70% 5% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4.
[0059] Ainsi, lorsque A est un anticorps, par exemple trastuzumab, la composition selon l'invention peut également se caractériser par des ratios de n déterminés par la méthode HIC (Hydrophobic Interaction Chromatography) ci-après :
1.43 - entre 0% et 5%, entre 0% et 2%, entre 0% et 1%, entre 0% et 0,75%, entre 0%
et 0,5%, entre 0% et 0,25% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 1, - entre 0% et 5%, entre 0% et 2%, entre 0% et 113/0, entre 0% et 0,75% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 2, - entre 0% et 5%, entre 5% et 15%, entre 8% et 12%,entre 9% et 11% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 3, et - entre 50 et 75%, entre 65% et 70%, entre 70% et 85%, entre 75% et 80%, par exemple au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4.
[0060] Dans un deuxième mode de réalisation particulier, lorsque A est un anticorps, par exemple trastuzumab, la composition selon l'invention peut se caractériser par des ratios de n déterminés par spectrométrie de masse native ci-après :
- moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1%, moins de 0,75%, moins de 0,5%, moins de 0,25%, moins de 0,1%, par exemple environ 0,1% ou environ 0% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 1, - moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1%, moins de 0,75%, moins de 0,5%, moins de 0,25%, moins de 0,1%, par exemple environ 0,5% ou environ 0% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 2, - moins de 20%, moins de 15%, moins de 10%, moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1%, par exemple environ 8% des
22 conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 3, et / ou - au moins 50%, au moins 55%, au moins 60%, au moins 65%, par exemple au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99%, par exemple environ 80% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4.
[0061] Ainsi, lorsque A est un anticorps, par exemple trastuzumab, la composition selon l'invention peut également se caractériser par des ratios de n déterminés par spectrométrie de masse native ci-après :
1.43 - entre 0% et 5%, entre 0% et 2%, entre 0% et 1%, entre 0% et 0,75%, entre 0%
et 0,5%, entre 0% et 0,25%, entre 0% et 0,1% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 1, - entre 0% et 5%, entre 0% et 2%, entre 0% et 113/0, entre 0% et 0,75%, entre 0%
et 0,5%, entre 0% et 0,25%, entre 0% et 0,1% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 2, - entre 0% et 5%, entre 5% et 15%, entre 8% et 12%, entre 8% et 9% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 3, et - entre 50 et 75%, entre 65% et 70%, entre 70% et 85%, entre 75% et 80%, par exemple au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% des conjugués anticorps-médicament de la composition ont un n égal à 4.
[0062] Dans un mode de réalisation très particulier, la composition selon l'invention présente le profil HIC de la Figure 1 ou le profil HIC de la Figure 19, ou le profil de spectrométrie de masse native de la Figure 5 ou le profil de spectrométrie de masse native de la Figure 21.
[0063] Utilisation thérapeutique [0064] L'invention concerne également un conjugué anticorps-médicament de formule (il) selon l'invention ou une composition comprenant un conjugué
anticorps-médicament de formule (II) selon l'invention pour utilisation comme médicament, par exemple pour utilisation dans le traitement d'un cancer HER2+, tel que le cancer du sein HER2+.
23 [0065] Le conjugué anticorps-médicament ou la composition selon l'invention est de préférence formulé pour une administration parentérale, par exemple une administration intravasculaire (intraveineuse ou intra-artérielle), intrapéritonéale ou intramusculaire. Le terme administré par voie parentérale , tel qu'utilisé ici, désigne des modes d'administration autres que l'administration entérale et topique, généralement par injection, et comprend, sans limitation, l'administration intravasculaire, intraveineuse, intramusculaire, intra-artérielle, intrathapsale, intracapsulaire, intraorbitaire, intratumorale, intracardiaque, intradermique, intra-péritonéale, par injection, perfusion transtrachéale, sous-cutanée, infra-1.0 articulaire, sous-capsulaire, sous-arachnoïdienne, intraspinale et intrasternale.
L'administration par voie intraveineuse est préférée dans le cadre de la présente invention, par exemple par perfusion intraveineuse.
[0066] La dose de conjugué anticorps-médicament administrée à un sujet qui en a besoin variera en fonction de plusieurs facteurs, y compris, sans limitation, la voie d'administration, le type et la gravité de la pathologie traitée, l'état du patient, la corpulence du patient, l'âge du patient, etc. L'Homme du métier peut facilement déterminer, sur la base de ses connaissances dans ce domaine, la plage posologique requise en fonction de ces facteurs et d'autres. La dose appropriée peut également être déterminée avec des modèles animaux ou avec des essais cliniques. Par exemple, les doses typiques de conjugué anticorps-médicament peuvent être de 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg ou plus. L'administration peut se faire en une seule fois ou, plus généralement, en plusieurs fois. Le schéma d'administration peut comprendre une dose de charge initiale puis des doses d'entretien, par exemple hebdomadaires, toutes les 2 semaines, toutes les trois semaines, tous les mois, ou plus. La durée de traitement peut varier selon la pathologie traitée et le sujet.
[0067] Le conjugué anticorps-médicament ou la composition selon l'invention peut être utilisé en monothérapie ou en association avec des médicaments dont l'intérêt thérapeutique est reconnu dans la pathologie considérée. Il peut s'agir par exemple du paclitaxel, du docétaxel, de la doxorubicine, du cyclophosphamide, d'un inhibiteur de l'aromatase tel que l'anastrozole, ou d'un anticorps utilisé en immunothérapie anti-cancéreuse tel qu'un anti-PD1.
24 [0068] La description concerne également une méthode de traitement d'un cancer HER2+ chez un sujet comprenant l'administration au sujet d'une quantité
thérapeutique efficace d'un conjugué anticorps-médicament de formule (Il) selon l'invention ou d'une composition comprenant un conjugué anticorps-médicament de formule (Il) selon l'invention.
[0069] Procédé de préparation [0070] La description concerne également un procédé de préparation d'un conjugué
cytotoxique selon l'invention.
[0071] La description concerne également un procédé de préparation anticorps-de formule (Il) tel que défini ci-dessus, dans lequel on fait réagir un conjugué cytotoxique de formule (I) tel que défini ci-dessus avec un anticorps ou un fragment d'anticorps anti-HER2.
[0072] Un autre objet de l'invention concerne un procédé de préparation d'un conjugué cytotoxique selon l'invention comprenant une étape qui consiste à
coupler une tête d'accroche de formule :
X
X
x 0 ou CH2)( X

N "fitCH2X0 OH
H
m OH
avec un composé de formule Bras de Médicament Espaceur liaison I cytotoxique 4=====================================================
dans laquelle :
le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes :

H
H N
Ki Li l'il 12 ou ________________________________________________ 0 H
H2 N )th l'espaceur est représenté par la formule suivante :

selS i. C) H
X est Br, Cl, I ou F;
m est un entier allant de 1 à 10, de préférence égal à 4 ou 5.
[0073] La tête d'accroche est décrite plus en détail dans la partie conjugué

cytotoxique et conjugué anticorps-médicament ci-dessus, à la différence que la tête d'accroche mise en oeuvre dans le procédé comprend une fonction 10 acide carboxylique terminale_ [0074] Le bras de liaison est décrit plus en détail dans la partie conjugué
cytotoxique et conjugué anticorps-médicament ci-dessus, à la différence que le bras de liaison mise en oeuvre dans le procédé comprend une fonction amine terminale.
15 [0075] L'espaceur est décrit plus en détail dans la partie conjugué cytotoxique et conjugué anticorps-médicament ci-dessus.

[0076] Le médicament cytotoxique est décrit plus en détail dans la partie conjugué
cytotoxique et conjugué anticorps-médicament ci-dessus.
[0077] Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation d'un conjugué cytotoxique selon l'invention comprend une étape qui consiste à
s coupler de l'acide 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amidohexandique (référence (7) dans l'exemple 1A) ou de l'acide 6-((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amino)-6-oxohexanoique (référence (16) dans l'exemple 1B) avec le valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE ou un sel de ce composé. Dans ce mode de réalisation particulier, le procédé de préparation d'un conjugué
143 cytotoxique selon l'invention permet d'obtenir du 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amido-N-hexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE
(référence (8) dans l'exemple 1A) ou du 6-((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amino)-6-oxohexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE (référence (17) dans l'exemple 1B), respectivement.
15 [0078] Un autre objet de l'invention concerne un procédé de préparation d'un conjugué anticorps-médicament selon l'invention comprenant les étapes suivantes :
(i) préparer un conjugué cytotoxique selon le procédé de l'invention, et (ii) faire réagir le conjugué cytotoxique obtenu à l'étape (i) avec un anticorps anti-20 HER2 ou un fragment d'anticorps anti-HER2.
[0079] L'anticorps anti-HER2 est décrit plus en détail dans la partie conjugué
cytotoxique et conjugué anticorps-médicament ci-dessus.
[0080] Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation d'un conjugué anticorps-médicament selon l'invention comprend une étape qui
25 consiste à faire réagir du 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)annido-N-hexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE (référence (8) dans l'exemple 1A) ou du 6-((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amino)-6-oxohexanamide-valine-citrulline-p-anninobenzoyle carbamate de MMAE
(référence (17) dans l'exemple 1B) avec un anticorps anti-HER2 ou un fragment 30 d'anticorps anti-HER2.

Brève description des figures [0082] [Fig. 1] représente le profil HIC (Hydrophobic Interaction Chromatography) d'une composition de conjugué anticorps-médicament McSAF-pyridine selon l'invention. La figure montre que la composition est enrichie en DAR4, avec s environ 69% de DAR4.
[0083] [Fig. 2] représente une analyse SEC (Size Exclusion Chromatography) d'une composition de conjugué anticorps-médicament McSAF-pyridine selon l'invention. La figure montre que la composition est extrêmement homogène, avec plus de 99% de monomère.
3.0 [0084] [Fig. 3] représente la répartition des DAR de 14 bioconjugaisons indépendantes à l'échelle 1 mg. Cela démontre la grande reproductibilité de la bioconjugaison pour obtenir le conjugué anticorps-médicament McSAF-pyridine.
[0085] [Fig. 4] représente la répartition des DAR de différentes bioconjugaisons à
différentes échelles (échelles 1 mg, 2,5 mg et 5 mg). Cela démontre la grande 15 reproductibilité de la bioconjugaison pour l'obtention du conjugué
anticorps-médicament McSAF-pyridine indépendamment de l'échelle.
[0086] [Fig. 5] représente la répartition des DAR d'une bioconjugaison représentative pour l'obtention du conjugué anticorps-médicament McSAF-pyridine par analyse de spectrométrie de masse native. La figure démontre la nature chimique du 20 conjugué et montre que la composition est enrichie en DAR4, avec environ 80%
de DAR4.
[0087] [Fig. 6] représente la reconnaissance de l'antigène HER2 par McSAF-pyridine, T-DM1 et trastuzumab.
[0088] [Fig. 7] représente la cytotoxicité in vitro de McSAF-pyridine sur des cellules 25 exprimant HER2, ou des cellules n'exprimant pas HER2, par rapport à T-DM1 et MMAE seul.
[0089] [Fig. 8] représente la quantité de de MMAE libérée dans le plasma humain par LC-MS/MS, en comparant McSAF-pyridine avec un ADC préparé avec une chimie de couplage maléimide (McSAF-maléimide1). Cette figure reflète la 30 stabilité du conjugué anticorps-médicament McSAF-pyridine.

[0090] [Fig. 9] représente l'évolution du DAR moyen en solution à 37 oc de McSAF-pyridine par rapport à un ADC préparé avec une chimie de couplage maléimide (McSAF-maléimide1). Cette figure reflète la stabilité du conjugué anticorps-médicament McSAF-pyridine.
s [0091] [Fig. 10] représente l'évolution du DAR moyen en solution en présence de HSA (Human Serum Albumin) à 37 C de McSAF-pyridinepar rapport à un ADC
préparé avec une chimie de couplage maléimide (McSAF-maléimide1). Cette figure reflète la stabilité du conjugué anticorps-médicament McSAF-pyridine.
[0092] [Fig. 111 représente l'évolution du DAR moyen en solution à 40 C
pendant 28 jours de McSAF-pyridine, par rapport à un ADC préparé avec une chimie de couplage maléimide (McSAF-maléimide1) mesurée par la méthode HIC. Cette figure reflète la stabilité du conjugué anticorps-médicament McSAF-pyridine.
[0093] [Fig. 121 représente l'évolution du pourcentage de DAR4 en solution à

pendant 28 jours de McSAF-pyridine, par rapport à un ADC préparé avec une chimie de couplage maléimide (McSAF-maléimide1) mesurée par la méthode HIC. Cette figure reflète la stabilité du conjugué anticorps-médicament McSAF-pyridine.
[0094] [Fig. 131 représente l'évolution du pourcentage de monomère en solution à 40 C pendant 28 jours de McSAF-pyridine, par rapporta un ADC préparé avec une chimie de couplage maléimide (McSAF-maléimide1) mesurée par la méthode SEC.
[0095] [Fig. 141 représente l'évolution du volume tumoral de souris traitées avec 5 mg/kg de McSAF-pyridine, 5 mg/kg de T-DM1 ou un véhicule sans ADC.
[0096] [Fig. 15] représente la distribution des volumes tumoraux de l'ensemble des souris traitées avec 5 mg/kg de McSAF-pyridine, 5 mg/kg de T-DM1 ou d'un véhicule sans ADC au jour 70. Cette figure reflète l'homogénéité de la réponse anti-tumorale au conjugué anticorps-médicament à 5 mg/kg.
[0097] [Fig. 161 représente l'évolution du volume tumoral de souris traitées avec 1 mg/kg de McSAF-pyridine, 1 mg/kg de T-DM1 ou un véhicule sans ADC.
[0098] [Fig. 171 représente la distribution des volumes tumoraux de l'ensemble des souris traitées avec 1 mg/kg de McSAF-pyridine, 1 mg/kg de T-DM1 ou d'un véhicule sans ADC au jour 70. Cette figure reflète les différentes réponses anti-tumorales au conjugué anticorps-médicament et au T-DM1 à 1 mg/kg.
[0099] [Fig. 18] représente le profil de spectrométrie de masse dénaturante du conjugué McSAF-pyridine. La figure montre la présence d'espèce complètement s reconstruite et conjuguée (LHHL DAR4).
[0100] [Fig. 19] représente le profil HIC (Hydrophobie Interaction Chromatography) d'une composition de conjugué anticorps-médicament McSAF-pyridine rétroamide selon l'invention. La figure montre que la composition est enrichie en DAR4, avec environ 68% de DA14.
3.0 [0101] [Fig. 20] représente le profil de spectrométrie de masse dénaturante du conjugué McSAF-pyridine rétroamide. La figure montre la présence d'espèce complètement reconstruite et conjuguée (LHHL DAR4).
[0102] [Fig. 211 représente la répartition des DAR d'une bioconjugaison représentative pour l'obtention du conjugué anticorps-médicament McSAF-15 pyridine rétroamide par analyse de spectrométrie de masse native. La figure démontre la nature chimique du conjugué et montre que la composition est enrichie en DAR4, avec environ 75% de DAR4.
[0103] [Fig. 22] représente la répartition des DAR de 5 bioconjugaisons indépendantes à l'échelle 250 g. Cela démontre la grande reproductibilité de la 20 bioconjugaison pour obtenir le conjugué anticorps-médicament McSAF-pyridine rétroamide.

Exemples [01051Exemple 1A : synthèse d'un conjugué cytotoxique selon l'invention (pyridine) [0106] Schéma réactionnel général o o 1Es c;
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ettet,1/4.45õce, QrE-teir 1 t 0 ------------------------------------------ ---k, t .." 1 el 4.. el;
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à=_ e---N-J ' , =:tp..,, ) (N. 1 is e 4 0-z-e [0107] (a) Bn0H, S0Cl2, DCM, 18h, 75 C; (b) APS, Me0H, no, H2504, 1h, 50 C;
(c) H2, Pd/C, Me0H, 2h, TA; (d) HATU, 2,6-lutidine, DMF, H2N-(CI-12)5-COOMe, 15h, 0 C, puis TA; (e) PBEe, MeCN, 2h, 45 C; (f) Li0H, THF, 1-b0, 8,5h, TA;
(g) 10 EEDQ, DIPEA, DMF, MeCN, H2N-VCPABC-MMAE, 2h20, 25 C.
[0108] Schéma réactionnel détaillé
[0109] Préparation de l'isonicotinate de benzyle (2) io 0 0 8 Ile õ
13 r.
3 6 i 2 -Nb 4 1 _r :3 I1 Ne¨ 5 (2) 15 [0110] L'acide isonicotinique (1) (5,00 g ; 40,614 mmol ; 1,0 eq) a été solubilisé
dans le chlorure de thionyle (15 mL ; 206,77 mmol ; 5,1 eq) et chauffé à
reflux pendant la nuit. Après retour à température ambiante, l'excès de chlorure de thionyle a été éliminé par évaporation sous pression réduite, puis le résidu obtenu a été dissous dans le dichlorométhane anhydre (55 mL). L'alcool benzylique a été additionné (4,2 mL ;40,614 mmol :1,0 eq) et le mélange a été
agité à reflux pendant 10 h. Après retour à température ambiante, le milieu réactionnel a été neutralisé avec une solution saturée d'hydrogénocarbonate de sodium et extrait avec du dichlorométhane (3x100 mL). Les phases organiques ont été rassemblées, lavées avec une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite. Le produit obtenu a été purifié par chromatographie flash (SiO2, cyclohexane/acétate d'éthyle 50:50) pour donner (2) (6,97 g ; 80%) sous la forme d'une huile incolore.
[0111] RMN 1H (300 MHz, DMSO) 68,80 (dd ; J= 6,1 ; 1,6 Hz ; 2H1,5), 7,86 (dd ;
J=
6,1 ; 1,6 Hz, 2H2,4), 7,56 - 7,29 (m ; 5H9_13), 5,39 (s ; 2H7).
[0112] RMN13C (75 MHz, DMSO) 6165,0 (1C8) ; 151,3 (2C1,5) ; 137,2 (1C3) ;
136,1 (1C8) ; 129,0 (2G10,12) ; 128,8 (1C11) ; 128,6 (2G9,13) ; 123,0 (2C2,4) ; 67,4 (1G7).
[0113] SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour CisHiiNO2 [M] : 213,0790 ;
observée 213,0796.
[0114] Préparation de 2,6-bis(hydroxyméthypisonicotinate de benzyle (3) irjksõ..m.H.= 12 '1" 7 13 Ho I ama. 5 oti 17 I N
14 16 (3) [0115]L'isonicotinate de benzyle (2) (2,48 g ; 11,630 mmol ;1,0 eq) a été
solubilisé dans le méthanol (43 mL), agité à 50 Cet de l'acide sulfurique concentré (320 pl_ ; 6,016 nnnnol ; 0,52 eq) a été ajouté. Une solution de persulfate d'ammonium (26,500 g ; 116,000 mmol ; 10,0 eq) dans l'eau (43 mL) a été ajoutée en deux étapes : un premier ajout rapide de 30 gouttes, une suspension blanche se forme, puis en goutte à goutte rapide pendant 5 min. La réaction s'emballe jusqu'à 75 oc, puis la solution jaune obtenue a été agitée à

50 C pendant 1 h supplémentaire. Après retour à terrpérature ambiante, le méthanol a été évaporé sous pression réduite. 50 mL d'acétate d'éthyle ont été

ajoutés et le milieu a été neutralisé par ajout d'une solution saturée d'hydrogénocarbonate de sodium. La phase aqueuse a été extraite avec de l'acétate d'éthyle (3x100 mL) et les phases organiques rassemblées ont été
lavées par une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium, puis concentrées sous pression réduite. Le brut a été purifié par chromatographie flash (SiO2, dichlorométhane/méthanol, 95:5) pour donner (3) (1,56 g ; 49%) sous la forme d'un solide beige.
[0116] RMN 1H (300 MHz, DMSO) 6 7,81 (s; 2H2,4) ; 7,55 -7,32 (m ; 5H9-13) ;
5,60 (t ; J= 5$ Hz ; 2H15,17) ; 5,40 (s ; 2H7) ; 4,59 (d ; J= 5,9 Hz ; 4H-1416).
[0117] RMN13C (75 MHz, DMSO) 6165,0 (106) ; 162,8 (2C1,5) ; 138,0 (1C3) ;
135,7 (108) ; 128,6 (2010,12) ; 128,4 (1C11) ; 128,3 (2C9,13) ; 117,0 (202,4 ; 66,9 (1C7) ;
63,9 (2014,16).
[0118] SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C15H15N04 [M] : 273,1001 ;
observée 273,1001.
[0119] Préparation de l'acide 2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinique (4) C
)L3 de 5 N
8 10 (4) [0120] Le 2,6-bis(hydroxyméthypisonicotinate de benzyle (3) (1,33 g ; 4,867 MMOI ; 1,0 eq) a été dissous dans le méthanol (50 mL) et la solution a été
dégazée avec de l'argon pendant 15 min. Du palladium sur charbon 10% wt (133 mg) a été ajouté et le milieu réactionnel a été agité à température ambiante sous atmosphère d'hydrogène pendant 2 h. Le milieu réactionnel a été filtré sur dicalite (rinçage méthanol). Le filtrat a été concentré sous pression réduite pour donner (4) (849 mg ; 95%) sous la forme d'un solide beige.
[0121] RMN1H (300 MHz, DMSO) 57,78 (s ; 2H2,4) ; 5,54 (s large ; 2H9,11) ;
4,59 (s;
41-18,10).

[0122] RMN13C (75 MHz, DMSO) 5 166,7 (1GÃ); 162,5 (2C1,5) ; 139,4 (1 C3) ;
117,3 (2C2,4) ; 64,0 (2C8,10)-[0123] SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C8H9N04[M] : 183,0532 ;
observée 183,0526.
10124] Préparation du 6-((2,6-bis(hydroxyméthyl)pyridin-4-yl)amidohexanoate de méthyle (5) --) e 0 0 /1 +esteteLestiLeit%

riy:Li e 8 10 12 ta 9 I
2 ......% 4 14 l 5 es>
i N 17 OH OH
le i 8 (5) [0125] L'acide 2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinique (4) (50 mg ; 0,273 mmol ;

eq) a été dissous dans le N,N-diméthylformamide anhydre (3,0 mL), la solution a 10 été refroidie à 0 C, puis le HATU (156 mg ; 0,410 mmol ; 1,5 eq) et la 2,6-lutidine (147,0 pl_; 1,260 mmol ; 4,7 eq) ont été ajoutés. La solution d'activation a été
agitée à 0 C pendant 15 min puis le 6-anninohexanoae de méthyle (59 mg;
0,322 mmol ;1,2 eq) a été ajouté. Les parois du ballon ont été rincées avec 2 mL
de N,N-diméthylformamide anhydre et le milieu réactionnel a été agité à
15 température ambiante pendant 15 h. Le mélange réactionnel a été dilué
dans l'acétate d'éthyle, lavé à trois reprises avec une solution saturée de chlorure de sodium, séché sur sulfate de magnésium, filtré et concentré sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash (dichlorométhane/méthanol, 90:10) pour donner (5) (76 mg ; 91%) sous la forme d'un solide blanc cassé.
[0126] RMN1H (300 MHz, DMSO) 58,79 (t; J= 5,6 Hz ; 1H7) ; 7,71 (s ; 2H24) ;
5,50 (t ; J= 5,8 Hz ; 2H16,18) ; 4,57 (d ; J= 5,8 Hz ; 4H15,17) ; 3,57 (s ; 3H14 ;
3,25 (m;
2H8) ; 2,30 (t; J= 7,4 Hz ; 2H12) ; 1,62 - 1,45 (m ;4H911) ; 1,37 - 1,21 (m ;
2H10).
[0127] Rmr113c (75 MHz, DMSO) 6173,3 (1C13) ; 165,1 (105) ; 161,8 (21,5) ;
142,9 (10e) ; 115,8 (202,4 ; 64,1 (2015,14 ; 51,2 (1014 ; 38,5 sous le DMSO (1C8) ;
33,2 (1C12) ; 28,6 (1C9) ; 25,9 (1C11) ; 24,2 (1C10).

[0128] SMHR(ESI) : masse neutre calculée pour C15H22N205[M] : 310,1529 ;
observée 310,1526.
[0129] Préparation du 6-(2,6-bis(bromométhyppyridin-4-yDamidohexanoate de méthyle (6) H
0 N.41 13,e 14 r y).1/41 3 6 8 10 12 µ1#
2 ss% 4 i l 5 15 i N 18 Br Br (6) [0130] Le 6((2,6-bis(hydroxyméthyl)pyridin-4-yflamidohexanoate de méthyle (5) (55 mg ; 0,177 mmol ; 1 eq) a été mis en suspension dans l'acétonitrile anhydre (10,5 mL) puis le tribromure de phosphore (50 pl_ ; 0,532 mmol ; 3,0 eq) a été

ajouté goutte à goutte. Le milieu réactionnel a été agité à 45 C pendant 2 h.
La na solution a été refroidie à 0 C, neutralisée avec de l'eau (10 mL) et extraite à
l'acétate d'éthyle (3x15 mL). Les phases organiques combinées ont été lavées avec une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash (SiO2, cyclohexane/acétate d'éthyle 60:40) pour donner (6) (57 mg ; 74%) sous la forme d'un solide blanc.
[0131] RMN 1H (300 MHz ; DMSO) 68,83 (t, J= 5,6 Hz ;1H7) ; 7,84 (s ; 2H24) ;
4,74 (s ; 4H15,18) ; 3,57 (s, 3H14) ; 3,31 - 3,20 (m ; 2H8) ; 2,31 (t ; J = 7,4 Hz ; 2H12) ;
1,64 - 1,45 (m ; 4H9111) ; 1,39- 1,22 (m, 2H13).
[0132] RMN13C (75 MHz, DMSO) 6173,3 (1C13) ; 163,8 (106) ; 157,5 (2C1,5) ;
144,2 (1 C3) ; 120,8 (2C2,4) ; 51,2 (1C14) ; 38,9 sous le DMSO (1C8) :34,1 (2C15116) ; 33,2 (1C12) ; 28,5 (1C8) :25,9 (1C11) ; 24,2 (1C10).
[0133] SMHR(ESI) : masse neutre calculée pour C15H2oBr2N203[M] :433,9841 ;
observée 433,9832.

[0134] Préparation de l'acide 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amidohexanoïque (7) 0 ki s,):Lisi repcil 13 OH 14 15 1 Nee 16 Br Br (7) [0135] Le 6-(2,6-bis(bromométhyppyridin-4-y0amidohexanoate de méthyle (6) 5 (57 mg ; 0,131 nnnnol ; 1,0 eq) a été dissous dans le tétrahydrofurane (4 mL) et une solution d'hydroxyde de lithium hydraté (8 mg ; 0,327 mmol ; 2,5 eq) dans l'eau (4 mL) a été ajoutée doucement. Le milieu réactionnel a été agité à
température ambiante pendant 8,5 h. Le tétrahydrofurane a été évaporé sous pression réduite et le résidu aqueux a été traité avec une solution aqueuse 10 d'acide chlorhydrique 1N et extrait avec de l'acétate d'éthyle (3x10 mL). Les phases organiques rassemblées ont été lavées avec une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash (dichlorométhane/méthanol, 90:10) pour donner (7) (44 mg ; 80%) sous la forme 15 d'un solide blanc.
[0136] RMN iH (300 MHz ; DMSO) 612,00 (s; 1H14 ; 8,83 (t; J= 5,5 Hz ; 1H7) ;
7,84 (s ; 2H2,4) ; 4,74 (s ; 4H15117) ; 3,31 - 3,21 (m ; 2H8) ; 2,21 (t ; J=
7,3 Hz;
2H12) ; 1,60 - 1,46 (m ; 4119,11) ; 1,39- 1,25 (m ; 2H10).
[0137] RMN 13C (75 MHz ; DMSO) 6174,4 (1C13) ; 163,8 (106) ; 157,5 (2C1,5) ;
144,1 20 (1C3) ; 120,8 (2C2,4) ; 39,0 sous le DMSO (1C8) ; 34,1 (2C-15,16) ;
33,6 (1C12) ;
28,6 (1C9) ; 26,0 (1C1-1) ; 24,2 (1C10).
[0138] SMHR (ESI) : tn/z calculée pour C14H19Br2N203[M+H] : 420,9757 ;
observée 420,9752.

[0139] Préparation de 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yDamido-N-hexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE (8) af-a 1;1 jk.
OtekNR

;r-akeeõ..1 O
,N H

14 fi\ JÇNve-e`'\ PL) 1/2nr-te,µ 0 (8) [0140] Sous atmosphère inerte, dans l'obscurité et en conditions anhydres, l'acide 6-(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amidohexanoïque (7) (13,2 mg ; 0,0313 mmol ; 2,28 eq) a été dissous dans l'acétonitrile anhydre (1,2 mL) puis la N-éthoxycarbony1-2-éthoxy-1,2-dihydroquinoline (EEDQ) (21,2 mg ; 0,0857 mmol;
6,25 eq) a été ajouté. Le milieu d'activation a été agité à 25 C pendant 1 h 20.
Une solution de sel d'acide trifluoroacétique de valine-citrulline- p-aminobenzoyle carbamate de MMAE (17,0 mg ; 0,0137 mmol ; 1,0 eq), solubilisé dans du N,N-diméthylformamide anhydre (300 L) en présence de N,N-diisopropyléthylamine (9,4 pl_ ; 0,0537 nnnnol ; 3,92 eq), a été ajoutée au milieu d'activation. Le milieu réactionnel obtenu a été agité à 25 C pendant 1 h.Le mélange a été dilué par avec du N,N-diméthylformamide et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 22,1 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nnn à 25 C ; colonne Waters XBridgeTM C-18 ; 5 tin (250 mm x 19,00 mm) ;
élution réalisée avec 0,1 % d'acide trifluoroacétique (en volume) dans l'eau (solvant A), et de l'acétonitrile (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 32 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mUmin) pour donner (8) (18,2 mg ; 87%) sous la forme d'un solide blanc.
[0141] RMN 1H (300 MHz, DMSO) ô (ppm) 10,04 - 9,95 (m ; 1H) ; 8,94 - 8,79 (m;
1H) ; 8,20 - 8,06 (m ; 2H) ; 7,98 - 7,87 (m ; 1H) ; 7,84 (s ; 2H) ; 7,81 (s ;
1H) ;

7,70 - 7,61 (m ; 1H); 7,58 (d ; J = 8,2 Hz ; 2H) ; 7,38 - 7,11 (m ; 6H) ; 6,07 - 5,92 (m ; 1H) ; 5,47 - 5,37 (m ; 1H) ; 5,15 - 4,96 (m ; 1H) ; 4,73 (s ;4H) ; 4,54 -4,29 (m ; 2H) ; 4,32 - 4,12 (m ; 1H) ; 4,05 - 3,92 (m ; 1H) ; 3,30 - 3,08 (m ; 9H) ; 3,06 - 2,93 (m ; 2H) ; 2,91 - 2,77 (m ; 2H) ; 2,24 - 2,05 (m ; 2H) ; 2,21 -2,11 (m ;3H) ; 2,02 - 1,88 (ni ; 1H) ; 1,60 - 1,44 (m ; 5H) ; 1,36 - 1,13 (m ; 4H) ; 1,08 -0,93 (m ; 6H) ; 0,93 -0,67 (m ; 28H).
[0142] SMHR (ESI) : nez calculée pour C72H111Br2N12014 [M+H] : 1525,6704;
observée 1525,6700_ lo 101431 Exemple 1B : synthèse d'un conjugué cytotoxique selon l'invention (pyridine rétroamide) [0144] Schéma réactionnel général OR
t H c H AOR
Ne' DMS TBDMS c NHR=
-I
DMS
OMS
R = Bn, 3 L
R = Bn, 9 L FC =Cbz, 11 b cl R = H, 10 Ft =1-1, 12 19112 H =MLOR ' Helk-gLOR"
A e _ 4 4 f A

I
I
OTBDMS OTBDMS
OTBDM S OTBDMS
OH OH Br Or 12 R" = Me, 13 Rn = Me, 14 :R- = Me, 15 h R" =H, 16 -HH){4.4111-011 A A
OAN'e H 0 iye ï; a i = HA...g% 1.41aN *
r ....AN N-õer = Yin H YYNI i . ...õ ..
Br Br N
tri 16 Br Br H2N-e%

[0145] (a) TBDMSOTf, 2,6-lutidine, DCM, 19h, 0 C puis TA; (b) H2, Pd/C, Me0H, ACCbEt, 5h, TA; (c) chloroformate d'éthyle, triéthylamine, THF, 1 h 15, -10 C, NaN3, H20, 1 h 45, 0 C, Bn0H, toluène, 18 h, 90 C; (d) H, Pd/C, Me0H, 16 h, TA; (e) CICO-(CH2)4-COOMe, triéthylamine, 21 h, 0 C, puis TA; (f) TFA 17h, 30 C; (g) PB6, MeCN, 2 h, 45 C; (h) Li0H,1-h0, THF, 3 h, TA; (i) TFA.H2N-VCPABC-MMAE, IIDQ, DIPEA, DMF, MeCN, 1 h 20,25 C.
[0146] Schéma réactionnel détaillé
[0147] Préparation du 2,6-bis(((tert-butyldirnéthylsily1)oxy)méthyl)isonicotinate de benzyle (9) Si >L

I 5 2k e Ndo' / \ 14 21 /i \ 25 16 15 22 23 (9) [0148] Le 2,6-bis(hydroxyméthypisonicotinate de benzyle (3) (1,56 g ; 5,708 10 mmol ; 1,0 eq) a été dissous dans le dichlorométhane anhydre (12 mL), la 2,6-lutidine (3,6 mL ; 28,542 mmol ; 5,0 eq) a été ajoutée et la solution a été
refroidie à 0 C. Le trifluorométhanesulfonate de tert-butyldinnéthylsilyle (5,5 mL ;
23,974 mmol ; 4,2 eq) a été ajouté goutte à goutte en 10 min, puis le milieu réactionnel a été agité sous argon à température ambiante (20 C)pendant 19 h. Le milieu a 15 été refroidit à 0 C puis neutralisé par ajout d'ure solution saturée d'hydrogénocarbonate de sodium. La phase aqueuse a été extraite avec du dichlorométhane (3x100 mL) et les phases organiques rassemblées ont été
lavées par une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium, filtrées, puis concentrées sous pression réduite. Le brut a été
purifié
20 par chromatographie flash (SiO2, cyclohexane/acétate d'éthyle, 90:10) pour donner (9) (2,50 g ; 87%) sous la forme d'un solide beige.
[0149] RMN 1H (300 MHz, DMSO) O 7,83 (s ; 2H2,4) ; 7,50 ¨ 7,36 (m, 5H9.13) ;
5,38 (s ; 2H7) ; 4,79 (s ; 4H14.21) :0,90 (s ; 18H-18-20,25-27) ; 0,09 (s ; 121-116.15,22.23).

[0150] Préparation de l'acide 2,6-bisifitert-butyldiméthylsily0oxy)méthyDisonicotinique (10) >L
2 e'=%. 4 ..0Lee6 5 01k20 %
12 Si i N S 19 / \ 8 15 /l\
9 16 17 (10) [0151] Le 2,6-bis(((tert-butyldiméthylsilynoxy)méthyl)lsonicotinate de benzyle s (9) (2,50 g ; 4,982 mmol ; 1,0 eq) a été dissous dans 60 nnL d'un mélange méthanol/acétate d'éthyle (5:1) et la solution a été dégazée avec de l'argon pendant 15 min. Du palladium sur charbon 10% wt (250 mg, 10 % m/m) a été
ajouté et le milieu réactionnel a été agité à température ambiante (20 C) sous atmosphère d'hydrogène pendant 5 h. Le milieu réactionnel a été filtré sur dicalite lo (rinçage méthanol). Le filtrat a été concentré sous pression réduite pour donner (10) (1,93 g ; 94%) sous la forme d'un solide blanc.
[0152] RMN 1H (300 MHz, DMSO) 67,78 (s ; 21-124 ; 4,78 (s ; 4H5,15), 0,92 (s ;

14,19-21) ; 0,1 0 (s ; 1 2E19,10,16,14-[0153] Préparation du (2,6-bisffltert-butyldiméthylsilynoxy)méthyl)pyridin-4-yl)carbamate de benzyle (11) 14 8 itut.

12 *910 2 eee 3 4 11 I 1 =%.

16 ('N? 22 23 \ e0 0%' 17 -Si Si- 24 44% .....ele..5 %.

20 27 (11) [0154] L'acide 2,6-bis(((tert-butyldiméthylsily0oxy)méthylpsonicotinique (10) (519,4 mg ; 1,262 mmol ; 1,0 eq) a été dissous dans le tétrahydrofurane anhydre (4 mL). La solution a été refroidie à -10 C. La tiléthylamine (227,0 pl_;
1,637 mmol ; 1,3 eq) puis le chloroformiate d'éthyle (180,7 pl_ ; 1,890 mmol ; 1,5 eq) ont été ajoutés sous agitation. Le milieu réactionnel a été agité sous argon à -10 C
pendant 1 h 15. Puis une solution d'azoture de sodium (139,8 mg :2,142 mmol;
5 1,7 eq) dans l'eau (300 pL) a été ajoutée. Le milieu réactionnel a été agité à 0 C
pendant 1 h 45. Les sels de triéthylamine ont été filtrés, puis le filtrat a été
concentré sous pression réduite (température maximum du bain à 40 C, vide maximum 100 mbar). Le résidu a ensuite été repris dans 10 mL d'eau et le produit a été extrait avec de l'acétate d'éthyle (3x10 mL). Les phases organiques lo combinées ont été lavées avec une solution de chlorure de sodium saturée, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite. Pour donner l'azoture d'acyle sous forme d'une huile jaune. Il a été solubilisé
dans du toluène (14 mL), puis l'alcool benzylique (522 pl_ ; 5,044 nnnnol ; 4,0 eq) a été
ajouté. Le milieu réactionnel a été agité à 90 C pendant 18 h. Le toluène a été
15 évaporé sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash (Si02, cyclohexane/acétate d'éthyle 90:10) pour donner (11) (535,6 mg ; 82%) sous la forme d'une huile jaune.
[0155] RMN 1H (300 MHz, CDCI3) O 7,50 ¨ 7,32 (m ; 71-1214,10-14 ; 6,85 (s;
1H6) ; 5,23 (s ; 2H8) ; 4,75 (s ; 4H15,22) ; 0,96 (s ; 18H19-21,26-23) ; 0,12 (s ;
12H16,17123,24).
20 [0156] Préparation du 2,6-bis tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyppyridin-amine (12) 2 eee 4 In I
8 7 tm 14 ni 5 15 \ 0% /
Sial 9 Si 16 +0 .e1;1%7%%

12 19 (12) [0157] Le (2,6-bis tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)pyridin-4-yl)carbamate de benzyle (11) (528,6 mg ; 1,020 mmol ; 1,0 eq) a été dissous dans du méthanol (30 mL). La solution a été dégazée avec de l'argon pendant 15 min. Puis du palladium sur charbon 10% wt (57,4 mg, 10% m/m) a été ajouté. La milieu réactionnel a été agité sous atmosphère d'hydrogène à température ambiante (20 C) pendant 16 h_ Le palladium sur charbon a éë filtré sur dicalite (rinçage méthanol) puis le filtrat a été concentré sous pression réduite. Le produit a été
obtenu sous forme salifiée (azote de la pyridine). Il a été repris dans de l'eau (160 mL), puis une solution d'hydroxyde de sodium à 10% dans l'eau a été
ajoutée à 0 C jusqu'à l'obtention d'un pH de 9. Leproduit a ensuite été
extrait avec du dichlorométhane (5x50 mL). Les phases organiques combinées ont été
1.0 lavées avec une solution de chlorure de sodium saturée, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite pour donner (12) (312,2 mg ;
80%) sous la forme d'une huile jaune.
[0158] RMN 1H (300 MHz; DMSO) 66,44 (s ; 2H24 ; 6,04 (s ; 2H6) :4,47 (s ;
4H7,14) ; 0,91 (s ; 18H11-i3,18-20) ; 0,07 (s ; 12H8,9,15;16).
[0159] Préparation du 6((2,6-bisa(tert-butyldiméthylsilynoxy)méthyl)pyridin-4-yDamino)-6-oxohexanoate de méthyle (13) CI
0..,.13 2 ........ 4 ee \ .0 0,e1 16 ¨Si Si¨ 23 steel:L.7 (13) [0160] Le 2,6-bis(((tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)pyridin-4-amine (12) (146,7 mg ; 0,383 mmol ; 1,0 eq) a été dissous dans du dichlorométhane anhydre (2,8 mL). La solution a été refroidie à 0 C et la trié-hylamine (106,7 pl_ ; 0,765 mmol;
2,0 eq) puis le chlorure d'adipoylate de méthyle (59,7 pL ; 0,383 mmol, 1,0 eq) ont été ajoutés goutte à goutte. Le milieu réactionnel a été agité à
température ambiante (20 C) pendant 15 h 30. Du dichlorométhare anhydre (1 mL) a ensuite été ajouté au milieu réactionnel ainsi que du chlorure d'adipoylate de méthyle (26,8 pl_ :0,172 mmol ;0,5 eq). Le milieu réactionnel a été agité à
température ambiante (20 C) pendant 1 h 30. Puis du dichloromÉthane anhydre (1 mL) a été
ajouté au milieu réactionnel ainsi que du chlorure d'adipoylate de méthyle (59,7 pl_ ; 0,383 mmol ; 1,0 eq) et de la triétylamine (26,7 pl_ ; 0,191 mmol ; 0,5 eq). Le milieu réactionnel a été agité à température ambiante (20 C) pendant 4 h. La réaction a été arrêtée par l'ajout d'une solution d'hydrogénocarbonate de sodium saturée (3 mL) à 0 C et extraite avec du dichlorontthane (3x10 mL). Les phases organiques combinées ont été séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie lo flash (SiO2, cyclohexane/acétate d'éthyle, 50:50) pour donner (13) (144,0 mg;
72%) sous la forme d'une huile incolore.
[0161] RMN 1H (300 MHz, DMSO) 610,25 (s; 1H6) ; 7,58 (s ; 2H214) ; 4,63 (s;
4H14,21) ; 3,58 (s ; 3H13) ; 2,41 ¨2,28 (m ; 4H8,11) ; 1,62 ¨ 1,51 (m ;
4H9,10) ; 0,92 (s, 181-118-20,2s-27) ; 0,09 (s ; 12H15,16,22,23)=
[0162] Préparation du 6-((2,6-bis(hydroxyméthyl)pyridin-4-yl)amino)-6-oxohexanoate de méthyle (14) 9 11 1 e..t 6 HN 7 .....,13 refi 10 se OH OH

(14) [0163] Le 64(2,6-bis tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyppyridin-4-yDamino)-6-oxohexanoate de méthyle (13) (136,9 mg ; 0,261 mmol ; 1,0 eq) a été solubilisé
dans l'acide trifluoroacétique (3 mL). Le milieu réactionnel a été agité à 30 oc pendant 17 h. L'acide trifluoroacétique a été évaporé sous pression réduite.
Le résidu a été repris dans de l'acétate d'éthyle (10 mL) et une solution d'hydrogénocarbonate de sodium saturée (10 mL) a été ajoutée. L'émulsion a été
agitée vigoureusement. Le produit a été extrait avec de l'acétate d'éthyle (5x10 mL). Les phases organiques combinées ont été séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash (SiO2, dichlorométhane/méthanol, 80:20) pour donner (14) (72,2 mg ; 93%) sous la forme d'une huile incolore.
[0164] RMN 1H (300 MHz, DMSO) 610,24 (s; 1H6) ;7,57 (s ; 2112,4) ; 5,37 (t; J=
5,8 Hz ; 2111817) ; 4,45 (d ; J= 5,8 Hz ; 4H14,16) ; 3,58 (s ; 3H13) ; 2,40 -2,29 (m ;
s 4H8111) ; 1,72- 1,45 (m ; 4H9,10).
[0165] Préparation du 64(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)amino)-6-oxohexanoate de méthyle (15) 6 HN 7 1 %13 ...,.... 4 0 .er Br Br (15) [0166] Le 6((2,6-bis(hydroxyméthyppyridin-4-yDarnino)-6-oxohexanoate de méthyle (14) (93,5 mg ; 0,316 mmol ; 1,0 eq) a été dissous dans de l'acétonitrile anhydre (6 mL) puis du tribromure de phosphore (90 pl_ ; 0,958 mmol ; 3,0 eq) a été ajouté lentement. Le milieu réactionnel a été agité à 45 C pendant 2 h.
La solution a été refroidie à 0 C, neutralisée avec ch l'eau (5 mL) et extraite à
l'acétate d'éthyle (3x10 mL). Les phases organiques combinées ont été lavées avec une solution de chlorure de sodium saturée, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite. Le produit a été obtenu sous forme salifié (azote de la pyridine). Il a été repris dans de l'eau, puis une solution d'hydroxyde de sodium à 10% dans l'eau a été ajoutée à 0 C jusqu'à
l'obtention d'un pH de 9. Le produit a ensuite été extrait avec du dichlorométhane (3x20 mL). Les phases organiques combinées ont été lavées avec une solution de chlorure de sodium saturée, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite_ Le produit a été purifié par chromatographie flash (Si02, dichlorométhane/méthanol, 90:10) pour donner (15) (80,8 mg ; 62%) sous la forme d'un solide légèrement rose.
[0167] RMN 1H (300 MHz, CDCI3) 57,87 (s ; 1H6) ; 7,64 (s ; 2H2,4) ; 4,49 (s ;
4H14,-15) ; 3,71 (s ; 3H13) ; 2,53 - 2,32 (m ; 41-18,11) ; 1,84- 1,66 (m ; 4H6,10).

[0168] Préparation de l'acide 61(2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-ynamino)-6-oxohexandique (16) 6 HN4L.,õ=/0.9 11OH 13 2 a3/44% 4 14 11 tee 15 Br Br (16) [0169] Le 6-((2,6-bis(bromométhyppyridin-4-yl)amino)-6-oxohexanoate de 5 méthyle (15) (35,2 mg ; 0,083 mmol ; 1,0 eq) a été dissous dans le tétrahydrofurane (2,2 mL) et une solution d'hydroxyde de lithium hydraté (8,7 mg ; 0,208 mmol ; 2,5 eq) dans l'eau (2,1 mL) a été ajoutée. Le milieu réactionnel a été agité à température ambiante (20 C) pendant 3h. Le milieu réactionnel a été
acidifié à 0 C avec une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 0,1 N puis extrait avec de l'acétate d'éthyle (3x20 mL). Les phases organiques rassemblées ont été lavées avec une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite pour donner (16) (33,4 mg;
99%) sous la forme d'un solide cristallin blanc.
[0170] RMN 1H (300 MHz, DMSO) 512,06 (s; 1H13) ; 10,46 (s ; 1H5) ; 7,66 (s ;
2E12,4 ; 4,63 (s ; 4H14115) ; 2,39 ¨2,33 (m ; 2H8) ; 2,26 ¨ 2,20 (m ; 2H11) ; 1,67¨
1,45 (m ; 4H9,10).
[0171] Préparation de 6-((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yflamino)-6-oxohexanamide-valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE (17) o,_,1NH2 (NH
.kiL4Fil HNLe.,,,,....rNH =,,w_ db, H
0 g H 0 te 0 I

r r o (17) [0172] Sous atmosphère inerte, dans l'obscurité et en conditions anhydres, l'acide 6-((276-bis(bromométhyl)pyridin-4-yDamino)-6-oxohexanoïque (16) (3,1 mg;
7,60 mol :1,8 eq) a été dissous dans l'acétonitrile anhydre (110 L) puis le 1,2-dihydro-2-isobutoxy-1-quinoline carboxylate d'isobutyle (IIDQ) (2,28 I_ ;
7,68 5 mol ; 1,8 eq) a été ajouté. Le milieu d'activation a été agité à 25 C pendant 30 min. Une solution de sel d'acide trifluoroacétique de valine-citrulline-p-aminobenzoyle carbamate de MMAE (5,3 mg ; 4,28 mol ; 1,0 eq), solubilisé
dans du N,N-diméthylformamide anhydre (200 L) en présence de N,N-diisopropyléthylamine (2,98 L ; 17,11 mol ; 4,0 eq) préalablement agitée à
1.0 température ambiante (20 C) pendant 30 min, a étéajoutée au milieu d'activation. Le milieu réactionnel obtenu a été agité à 25 C pendant 1 h 20.
Le mélange a été dilué par 2 avec de l'acétonitrile et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (tR = 23,5 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection 15 UV à 254 nm à 25 oc ; colonne Waters XBridgeTM C-18; 5 m (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% d'acide trifluoroacétique (en volume) dans l'eau (solvant A), et de l'acétonitrile (solvant B) ; gradient 30 à 60% de B sur 26 min puis de 60 /0 à 100% de B sur 2 min et 100% de B sur 3 min à 17,1 mUmin) pour donner (17) (2,7 mg ; 42%) sous la forme d'un lyophilisat blanc.
20 [0173] RMN 1H (300 MHz, CDCI3) : O 7,97 (s; 1H) ; 7,58 - 7,41 (m ; 1H) ;
7,40 -7,29 (m ; 5H) ; 5,42 - 5,14 (m ; 1H) ; 5,00 - 4,85 (m ; 2H) ; 4,76 - 4,64 (m ;
1H) ;
4,63 - 4,45 (m ; 5H) ; 4,23 -4,01 (m ; 1H) ; 4,02 - 3,72 (m ; 2H) ; 3,60 -3,43 (m ; 3H) ; 3,43 - 3,35 (m ;3H) ; 3,34 - 3,25 (m ;4H) ; 3,23 - 3,08 (m ;4H) ; 3,07 -2,97 (m ; 3H) ; 2,95 - 2,81 (m ;3H) ; 2,62 - 2,29 (m ;6H) ; 1,84 - 1,40 (m ;21H) 25 ; 1,35 - 1,11 (rin ; 6H) ; 1,10 - 0,92 (m ; 17H) ; 0,93 - 0,69 (m ;
16H) ; 0,71 -0,53 (m ; 3H).
[0174] SMHR (ESI) : m/z calculée pour C71l-l109Br2N12014 [M+H] : 1511,6547 ;
observée 1511,6557.
30 101751 Exemple 2A : synthèse d'un conjugué anticorps-médicament selon l'invention (pyridine) 10176] Code du produit synthétisé: McSAF-pyridine (correspondant à la formule (11a), également appelé ci-après conjugué anticorps-médicament selon l'invention ou de manière générale ADC ).
[0177] Anticorps utilisé : trastuzumab.
[0178] Préparation des solutions [0179] Tampon de bioconjugaison : Tampon salin 1X, par exemple phosphate, borate, acétate, glycine, tris(hydroxymethyl)aminonnethane, acide 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic dans une plage de pH comprise entre 6 et 9, avec une concentration finale en NaCl comprise entre 50 et 300 mM et une concentration finale en EDTA comprise entre 0,1 et 10 mM. Par exemple, tampon phosphate 1X à un pH de 8,3, avec une concentration finale en NaC1 à 180 mM
et une concentration finale en EDTA de 1 mM.
[0180] Trastuzumab à une concentration comprise entre 1 et 10 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, par exemple 5 mg/mL.
[0181] Réducteur : Solution d'un réducteur choisi parmi le dithiotréitol, le p-mercaptoét hanol, l'hydrochlorure de tris(2-carboxyéthyl)phosphine, la tris(hydroxypropryl)phosphine à une concentration comprise entre 0,1 et 10 mM
dans le tampon de bioconjugaison. Par exemple, une solution à 1 mM
d'hydrochlorure de tris(2-carboxyéthyl)phosphine dans le tampon de bioconjugaison.
[0182] Solution de linker : conjugué cytotoxique (8) à une concentration comprise entre 0,1 et 10 mM dans un mélange de solvants organiques choisis parmi le diméthylsulfoxide, le N,N-diméthylformamide, le méthanol, le tétrahydrofurane, l'actéonitrile, le N,N-diméthylacétamide, le dioxane. Par exemple, une solution à
1 mM dans un mélange de solvants organiques composé de 20% de NIV-diméthylformamide et 80% de méthanol.
[0183] Réaction de bioconjugaison [0184] Sous atmosphère inerte, au trastuzumab dans le tampon bioconjugaison (2,5 mg ; 1 éq) a été ajouté le réducteur (4 à 100 éq, par exemple 8 éq) et le milieu réactionnel a été incubé entre 15 et 40 C, par exemple 37 C, pendant 0,25 à

h, par exemple 2 h, puis la solution de linker (4 à 100 éq, par exemple 12 éq) a été ajoutée sous atmosphère inerte et le milieu réactionnel a été agité entre 15 et 40 C, par exemple 37 oc, pendant 0,5 à 15 h, par temple 2,5 h. Cette réaction a été dupliquée, en parallèle, autant de fois que nécessaire pour obtenir la quantité d'ADC final souhaitée, te. cinq fois.
[0185] Purification de l'A DC
[0186] Le mélange réactionnel a été purifié sur PD-10 (GE Healthcare) avec du tampon PBS Gibco pH 7,4 le nombre de fois nécessaire pour éliminer les réactifs chimiques résiduels, i.e. purifié 2 fois.
[0187] Résultat [0188] Les étapes décrites ci-dessus ont permis d'obtenir 7,43 mg de McSAF-pyridine (57%).
10189] Exemple 2B : synthèse d'un conjugué anticorps-médicament selon l'invention (pyridine rétroamide) [0190] Code du produit synthétisé : McSAF-pyridine rétroamide (correspondant à
la formule (11a), également appelé ci-après conjugué anticorps-médicament selon l'invention ou de manière générale ADC ).
[019-11Anticorps utilisé : trastuzumab.
[0192] Préparation des solutions [0193] Tampon de bioconjugaison : Tampon borate 1X à un pH de 8,3, avec une concentration finale en NaClà 25 mM et une concentration finale en EDTA de 1 mM.
[0194] Trastuzumab à une concentration de 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison.
[0195] Réducteur : Solution d'hydrochlorure de tris(2-carboxyéthyl)phosphine à
une concentration de 1 mM dans le tampon de bioconjugaison.
[0196] Solution de linker : conjugué cytotoxique (17) à une concentration de 2 mM
dans un mélange de solvants organiques composé de 70% de N,N-diméthylformamide et 30% de méthanol.

[0197] Réaction de bioconjuoaison [0198] La solution de trastuzumab dans le tampon bioconjugaison (0,25 mg ; 1 éq) a été placée sous argon. Le réducteur (8 éq) a ensuite été ajouté et le milieu réactionnel a été incubé à 37 C pendant 2 h. Puisla solution de linker (17 éq) a s été ajoutée sous argon et le milieu réactionnel a été agité à 37 C
pendant 2 h 30.
[0199] Exemple 3A : analyses du conjugué anticorps-médicament (McSAF-pyridine) le [0200] Analyse HIC (Hydrophobie Interaction ChromatooraphY) [0201] Matériel et méthode [0202] L'ADC McSAF-pyridine a été dilué à 1 mg/mL avec du PBS pH 7,4 avant d'être filtré sur 0,22 m. 50 g de produits ont été injectés sur une colonne MAbPac HIC-Butyl, 5 m, 4,6 x 100 mm (ThermoScientific), connectée à une 15 chaine HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d'un PDA (e2998) réglé
pour une détection à 280 nm. L'ADC McSAF-pyridine a été élué à un débit de 1 mL/min par un gradient depuis 100% de tampon A (1,5 M sulfate d'ammonium, 50 mM
phosphate de sodium monobasique, 5% isopropanol (v/v), pH 7,0) jusqu'à 20%
de tampon B (50 mM phosphate de sodium monobasique, 20% isopropanol (v/v), 20 pH 7,0) en 2 minutes puis jusqu'à 85% de tampon B en 30 minutes puis ce gradient a été maintenu pendant 1 min. La température a été maintenue à 25 C
tout au long de la séparation.
[0203] Les résultats sont présentés à la Figure 1 et dans le Tableau 1 ci-dessous.
[0204] [Table 1]
McSAF-pyridine DAR 0 DAR 1 DAR 2 DAR 3 DAR 4 DAR 5 Temps de 6,1 9,73 12,59 17,2 20,61 25,56 rétention (min) Aire (%) 2,85 0,1 0,57 10,93 68,51 17,04 DAR moyen 3,93 [0205] Analyse SEC (Size Exclusion Chromatoaraphy) [0206] Matériel et méthode [0207] L'ADC McSAF-pyridine a été dilué à 1 mg/mL avec du PBS pH 7,4 avant d'être filtré sur 0,22 m. 50 g de produits ont été injectés sur une colonne AdvanceBio SEC 2.7 m, 7,8 x 300 mm (Agilent Technologies), connectée à une chaine HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d'un PDA (2998) réglé pour une détection à 280 nm, d'un détecteur MALLS Wyatt (miniDawnTM) et d'un détecteur d'indice de réfraction Wyatt (Optilab T-rEX). L'ADC McSAF-pyridine été élué à

un débit de 1 mIJmin par un isocratique de tampon C (1 mM phosphate de sodium monobasique, 155 mM de chlorure de sodium, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 3 mM d'azoture de sodium, pH 7,0) en 24 minutes. La température a été maintenue à 25 C tout au long dela séparation.
[0208] Les résultats sont présentés à la Figure 2 et dans le Tableau 2 ci-dessous.
[0209] [Table 2]
Agrégats McSAF-pyridine Oligomères Monomères solubles Temps de rétention 3,73 6,46 7,27 (min) Aire (%) 0,03 0,83 99,14 102101 Reproductibilité
[0211] Les résultats de reproductibilité sont présentés à la Figures 3 (reproductibilité
sur 14 bioconjugaisons indépendantes (échelle 1 mg de trastuzumab engagé), analyse par HIC) et à la Figure 4 (reproductibilité sur différentes échelles, analyse HIC).
[0212] Conclusion : la bioconjugaison est parfaitement reproductible sur une même échelle et sur différentes échelles.
[0213] Analyse MS native (native Mass Spectrometry) [0214] Matériel et méthode L'analyse spectrométrique de masse a été réalisée sur un spectromètre de masse Vion IMS Qtof couplé à un système Acquity UPLC H-Class de Waters (Wilmslow, UK). Avant l'analyse MS, les échantillons (20 ug) ont été dessalés sur une colonne de dessalage BEH SEC 2,1 x 150 mm 300 Å par un gradient isocratique (50 mM
5 d'acétate d'ammonium, pH 6,5) à 40 L/min. Une vanne de dérivation a été
programmée pour permettre au solvant d'entrer dans le spectromètre entre 6,5 et 9,5 min seulement. Les données MS ont été acquises en mode positif avec une source ESI sur une gamme rn/z de 500 à 8000 à 1 Hz et analysées en utilisant le logiciel UNI FI 1.9 et l'algorithme MaxEnt pour la déconvolution.
1.13 [0215] Les résultats sont présentés à la Figure 5 et dans le Tableau 3 ci-dessous.
[0216] [Table 3]
McSAF-pyridine DAR 0 DAR 1 DAR 2 DAR 3 DAR 4 DAR 5 MW (Da)1 n.o.2 nØ2 ___________________________________________________________________ n.o.2 152165 153535 154903 Aire (%) 0 0 0 8,20 79,57 12,23 DAR moyen 4,04 [0217] 1 : masse moléculaire de la glycoforme GOF/GOF
[0218] 2 : non observé
GOFIGOF
111$
euto soirs 4* 4 $
[0219]
15 [0220] Analyse HRMS dénaturante (denaturing Hight Resolution Mass Spectrometry) [0221] L'analyse spectrométrique de masse de l'AOC McSAF-pyridine a été
réalisée sur un spectromètre de masse Bruker maXis couplé à un système Dionex Ultimate 3000 RSLC. Avant l'analyse MS, les échantillons (5 g) ont été
dessalés sur une colonne de dessalage MassPREP (2,1x10 mm, Waters), chauffés à 80 C

en utilisant une solution aqueuse d'acide formique à 0,1% comme solvant A et une solution à 0,1% d'acide formique dans l'acétonitrile comme solvant B à 500 pLimin. Après 1 min, un gradient linéaire de 5 à 90% de B en 1,5 min a été
appliqué. Les données MS ont été acquises en mode positif avec une source ESI
sur une gamme rn/z de 900 à 5000 à 1Hz et analysées en utilisant le logiciel DataAnalysis 4_4 (Bruker) et l'algorithme MaxEnt pour la déconvolution. Le DAR
par espèce a été déterminé à l'aide de l'intensité des pics observés.
[0222] Les résultats sont présentés à la Figure 18 et dans le Tableau 4 ci-dessous.
JTable 41 LHHL LHH HH
Intensité (%) MM (Da)1 Intensité (.%) 1 MM
(Da)1 Intensité (io) 1 MM (Da)1 DAR 0 n.o.2 n.o. ___________________________ n.o.
DAR 1 n.o.2 ___________________________ n.o.2 DAR 2 n.o.2 ___________________________ n.o.2 DAR 3 n.o.2 n.o.2 100 ____________________ 1 105295 1 130089 n.o.

11Ø n.o.2 _____________ DAR moyen 4,14 4,00 3,00 LH L
Intensité (%) 1 MM (Da)1 Intensité (cY0) MM (Da)1 DAR 0 n.o.

DAR 1 n.o.2 _________________________________________________ DAR 2 100 j 76765 DAR 3 n.o.
DAR 4 n.o.2 DAR 5 n.o.2 _________________________________________________ DAR moyen 2500 0,00 [0223] L'espèce H n'a pas été observée.
3.0 [0224] 1 : masse moléculaire de la glycoforme GOF/GOF
[0225] 2 : non observé

GOF/GOF
s mit to fe ans =
alt iit [0226]
[0227] Exemple 3B : analyses du conjugué anticorps-médicament (McSAF-pyridine rétroamide) s [0228] Analyse HIC (Hydrophobic Interaction Chromatoaraphy) [0229] Matériel et méthode [0230] L'ADC McSAF-pyridine rétroamide a été analysé en mettant en oeuvre le protocole décrit à l'Exemple 3A.
[0231] Les résultats sont présentés à la Figure 19 et dans le Tableau 5 ci-dessous.
[0232] [Table 5]
McSAF-pyridine rétroamide Temps de 6,39 nØ1 12,37 17,22 20,73 25,46 30,42 rétention (min) Aire (%) 0,98 n.o.1 1,36 7,05 67,74 21,97 0,89 DAR moyen 4,10 [0233] 1 : non observé
[0234] Analyse HRMS dénaturante (dénaturina Hiaht Resolution Mass Spectrometry) [0235] L'ADC McSAF-pyridine rétroamide a été analysé en mettant en oeuvre le protocole décrit à l'Exemple 3A.
[0236] Les résultats sont présentés à la Figure 20 et dans le Tableau 6 ci-dessous.
[0237] [Table 6]

LHHL
LH
Intensité (%) MM (Da)1 Intensité (/o) I MM (Da)1 Intensité (%) MM (Da)1 DAR 0 n.o. n.o.

n.o.2 DAR 1 n.o.2 DAR 2 n.o.2 100 I 76737 n.o.2 .. DAR 3 no2 n.o.
n.o.2 _______ DAR 4 87 153473 n.o.2 n.o.2 DAR 5 13 154849 n.o.2 ___________________________________ n.o.2 DAR moyen 4,13 2,00 0,00 [0238] Les espèces LHH, HH et H n'ont pas été observées.
[0239] 1 : masse moléculaire de la glycoforme GOF/GOF
[0240] 2 : non observé
GOF/GOF
= * =
el! 0 =.*.*
=
4 IR 4 *
[0241]
[0242] Analyse MS native (native Mass Spectrometry) [0243] Matériel et méthode [0244] L'analyse spectrométrique de masse a été réalisée comme décrit à
l'Exemple 3A.
[0245] Les résultats sont présentés à la Figure 21 et dans le Tableau 7 ci-dessous.
la [0246] [Table 7]
McSAF-pyridine rétroamide MW (Da) n.o.3 n.o.3 n.o.3 _________________________________________________ 1522401 1534782 1548412 Aire(%) 0 0 0 4,8 74,5 20,7 DAR moyen 4,16 [0247] 1 : masse moléculaire de la glycof orme GOF/G1F

GOF/GI F
11.0 tvi é es e é

[0248] 2 : masse moléculaire de la glycoforme GOF/GOF

* et ei et. e A
*
[0249] 3 : non observé
[02501 Reproductibilité
Les résultats de reproductibilité sont présentés à la Figures 22 (reproductibilité sur 5 bioconjugaisons indépendantes (échelle 250 pg de trastuzumab engagé), analyse par HIC).
[02511Exemple 4 : évaluation in vitro du conjugué anticorps-médicament (McSAF-pyridine) [0252] Liaison à l'antigène HER-2 : reconnaissance de l'antigène HER2 sur une lignée positive (BT-474) et une lignée négative (MCF-7), comparaison avec un conjugué Trastuzumab-Médicament cytotoxique de référence décrit dans l'art antérieur, appelé trastuzumab emtansine (ci-après T-DM1 ).
[0253] Matériel et méthode [0254] Les cellules ont été obtenues de l'ATCC (BT-474 et MCF-7). Un aliquote de cellules congelées a été décongelé rapidement dans un bain d'eau à 37 C et lavé deux fois avec du milieu de culture (F12/DMEM supplémenté avec 8% de SVF, 100 pg/mL de penicillin G de sodium, 100 pg/mL de streptomycin de sulfate) et déposé dans une flasque de culture cellulaire de 150 cm2 à une densité d'au moins 10 000 cellules/cm2. Les cellules ont été maintenues à 37 C

dans une atmosphère humide avec 5% de CO2 pendant au moins une semaine.
[0255] Ensuite, les cellules ont été collectées et 100 000 à 500 000 cellules dans 80 pl_ ont été incubées avec 20 pl_ d'ADCs (McSAF-pyridine ou T-DM1) pendant 0,5 s ¨1 h à 4 C à des concentrations d'ADCs allant de Q1 à 20 g/mL (8 concentrations ¨ 0,1 ; 0,5 ; 1 ; 2,5 ; 5 ; 10 ; 15 ; 20 pg/mL) ou avec un anticorps ciblant HER2 (trastuzumab, contrôle positif) aux mêmes concentrations. Les cellules ont été lavées trois fois avec du tampon de marquage (PBS 1X-EDTA
2nnM¨BSA 0.5%) à 0 C et incubées avec un anticorps condaire (100 pl_ au 10 1/100ème, F(abb-chèvre anti-IgG humaine Fc-PE, Life Technologies, #
H10104) pendant 0,5 ¨ 1 h à 4 C. Après incubation avec lesanticorps secondaires, les cellules ont été lavées deux fois avec du tampon de marquage à 0 C.
[0256] Après lavage, les cellules ont été centrifugées et resuspendues dans 100 ¨
500 prl_ de tampon de coloration à 0 C avant analysepar cytométrie en flux.
15 L'émission de fluorescence moyenne relative (MFI) des sondes utilisées a été
déterminée pour chaque échantillon sur une cytomètre en flux et analysée par un logiciel comme FCS Express 5 Flow Cytometry (De Novo Software).
[0257] Résultats [0258] Les résultats, présentés à la Figure 6, montrent que la reconnaissance de 20 HER2 par McSAF-pyridine est similaire à la reconnaissance de HER2 par l'anticorps natif (trastuzumab) et T-DM1, et dépendante de la présence de HER2.
[0259] Cytotoxicité (MTS assay) : effet cytotoxique de McSAF-pyridine sur une lignée positive et une lignée négative comparé à T-DM1.
25 [0260] Matériel et méthode [0261] Les cellules ont été obtenues de l'ATCC (BT-474 et MCF-7). Un aliquote de cellules congelées a été décongelé rapidement dans un bain d'eau à 37 C et lavé deux fois avec du milieu de culture (F12/DMEM supplémenté avec 8% de SVF, 100 pig/mL de L-glutamine, 100 g/mL de penicillin G de sodium, 100 30 mg/mL de streptomycin de sulfate) et déposé dans une flasque de culture cellulaire de 150 cm2 à une densité d'au moins 10 000 cellules/cm2. Les cellules ont été maintenues à 37 C dans une atmosphère humicb avec 5% de CO2 pendant au moins une semaine.
[0262] Ensuite, les cellules ont été collectées et déposées dans des plaques 96-puits à des densités entre 1,25 et 2,5.103 cellules par puit pour les essais de s cytotoxicité. Les cellules ont été incubées 48 h à 37 oc avant l'addition des ADCs testées et du véhicule (PBS). Les pourcentages de DMSO n'ont jamais excédé
0,5%. Les ADCs testés ont été ajoutés aux concentrations finales suivantes :
225 ; 75 ; 25 ; 8,33 ; 2,78 ; 0,926 ; 0,309 ; 0,103 ; 0,034 ; 0,011 nM ; et incubés pendant 72 h (-F1- 2 h).
1.0 [0263] La viabilité cellulaire a été déterminée au dépôt des cellules (D-2), avant l'ajout des ADCs testés (DO) et 72 h après l'ajout des composés testés (D3) en mesurant la quantité d'ATP cellulaire en utilisant le kit CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) selon les recommandations d'utilisation du fournisseur. L'activité luciférase a été mesurée sur un luminomètre 15 (PerkinElmer EnVisionTM).
[0264] Chaque concentration de composé a été réalisée en tripliqua et deux expériences indépendantes ont été conduites.
102651 Résultats [0266] Les résultats, présentés à la Figure 7, montrent un effet cytotoxique supérieur 20 du McSAF-pyridine par rapport au T-DM1 et dépendant de la présence de HER2.
102671Exemple 5 : stabilité de la bioconjugaison [0268] Stabilité plasmatique : quantification par LC-MS/MS de la quantité de MMAE
libérée après incubation dans du plasma humain à 37 C. Comparaison entre 25 McSAF-pyridine et un ADC produit avec une tête d'accroche maléimide (une seule liaison) = McSAF-maléimide1 de formule :
N I
t.
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, \ ,L
G
=:, "2 e0/,1 [02691 Matériel et méthode [0270] Courbe de calibration MMAE
[0271] A 25 pL d'échantillons (standard MMAE-d8 ou gamme de concentration MMAE) ont été ajoutés 25 pL de RP424 (H20+0,1% FA) puis le mélange a été
agité. 75 pL d'une solution de standard MMAE-d8 à 0,04 pg/mL ont été
ajoutés avant d'agiter pendant 30 secondes. Le mélange a été centrifugé à 20 000 g à 4 C pendant 10 minutes. Le surnageant a étéprélevé et transféré dans des flacons en polypropylène. Une nouvelle centrifugation a été réalisée à
2500 g à 4 C pendant 5 min avant injection en LC-MS/MS. L'Es échantillons ont été
injectés sur une colonne Acquity BEH UPLC C18, 50 x 2.1 mm, 1.7 pm connectée à une chaine LC-20AD et LC-20ADXR (Shimadzu) couplée à un détecteur de masse Shimadzu (8060) avec une source ESI+. L'élution a été
réalisée par gradient de 75% de tampon D (acétate d'ammonium 10 mM) dans 25% de tampon E (acétonitrile) à 5% de tampon D dans 95% de tampon E sur 5 minutes suivi d'une augmentation jusqu'à 75% de tampon D dans 25% de tampon E sur 5,1 minutes. Les résultats ont été traités avec le logiciel Labsolution 6.60.
[0272] Incubation en plasma humain [0273] Les échantillons ont été incubés en plasma humain stérile EDTA-2K
(BiolVT) à une concentration initiale de 100 pg/mL. 3 échantillons ont été collectés juste après avoir agité le mélange (TO) puis après 6 h, 12 h, 24 h, 48 h et 96 h d'incubation à 37 C. Les échantillons ont été con rvés à -80 C avant leur analyse LC-MS/MS comme décrit ci-dessus.
[02741 Résultats [0275] Les résultats, présentés à la Figure 8, montrent que McSAF-pyridine libère moins de MMAE dans le plasma par rapport à McSAF-maléimide1. McSAF-pyridine est donc plus stable que McSAF-maléimide1 dans des conditions physiologiques.
s [0276] Stabilité à 37 C en présence ou non de HSA (Albumine sérique humaine) [0277] Matériel et méthode [0278] La concentration de McSAF-pyridine et de McSAF-maléimide1, dans un tampon PBS (1 mM de phosphate de sodium monobasique, 3 mM de phosphate 143 de sodium dibasique, 155 mM de chlorure de sodium, 1 mM
d'azoture de sodium, pH 7,4), a été ajustée à 2 mg/mL. Douze (12) échantillons de 20 L de McSAF-pyridine et de McSAF-maléimide1 ont été déposés dans douze flacons en polyproprylène (fisher scientific, 0,6 mL) puis 20 pL de tampon PBS (1 mM
de phosphate de sodium monobasique, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 15 155 mM de chlorure de sodium, 1 mM d'azoture de sodium, pH
7,4) ou 20 pL
d'une solution de HSA à 20 mg/mL dans le tampon PBS (1 mM de phosphate de sodium monobasique, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 155 mM de chlorure de sodium, 1 mM d'azoture de sodium, pH 7,4) a été ajouté à chaque flacon. Après agitation, chacun des 12 flacons est centrifugé 30 secondes à

20 g avant incubation à 37 C dans un incubateur (VWR NCU-line IL23). Les flacons ont été retirés trois par trois de l'incubateur conservés à -80 C après 1 minutes (TO), 24 h, 48 h et 120 h.
[0279] Après dilution par un facteur 2 avec du tampon PBS (1 mM de phosphate de sodium monobasique, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 155 mM de 25 chlorure de sodium, 1 mM d'azoture de sodium, pH 7,4), le contenu de chacun des 12 flacons est filtré sur 0,22 pm et analysé par HIC. Pour McSAF-pyridine, g de produits ont été injectés sur une colonne MAbPac HIC-Butyl, 5 pm, 4.6 x 100 mm (ThermoScientific), connectée à une chaine HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d'un PDA (e2998) réglé pour une détection à 280 nm. Les 30 échantillons ont été élués à un débit de 1 mL/min par un gradient depuis 100%
de tampon A (1,5 M sulfate d'ammonium, 50 mM phosphate de sodium monobasique, 5% isopropanol (v/v), pH 7,0) jusqu'à 100% de tampon B (50 mM

phosphate de sodium monobasique, 20% isopropanol (v/v), pH 7,0) en 50 minutes. La température a été maintenue à 25 C toutau long de la séparation.
[0280] Pour McSAF-maléimide1, 50 g de produits ont été injectés sur une colonne TSKgel Butyl NPR, 2,5 pm, 4,6 x 100 mm (Tosoh), connectée à une chaine s HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d'un PDA (e2998) réglé pour une détection à 280 nm. Les échantillons ont été élués à un débit de 0,6 mUmin par un gradient depuis 100% de tampon A (1,5 M sulfate d'ammonium, 50 mM
phosphate de sodium monobasique, pH 7,0) jusqu'à 20% de tampon B (50 mM
phosphate de sodium monobasique, 20% isopropanol (v/v), pH 7,0) en 60 1+3 minutes puis ce gradient a été maintenu pendant 6 min_ La température a été
maintenue à 30 C tout au long de la séparation.
102811 Résultats [0282] Le suivi de l'évolution du DAR moyen par la méthode HIC après incubation à
37 C est présenté à la Figure 9. Les résultats mottent une parfaite stabilité
à 37 15 C de McSAF-pyridine, ce qui n'est pas le cas pourMcSAF-maléimide1.
Cela s'explique par la stabilité accrue du conjugué anticorps-médicament selon l'invention.
[0283] Le suivi de l'évolution du DAR moyen par la méthode HIC après incubation avec un excès de HSA à 37 C est présenté à la Figue 10. Les résultats 20 montrent une parfaite stabilité en présence de HSA de McSAF-pyridine, ce qui n'est pas le cas pour McSAF-maléimide1. Cela s'explique par la stabilité
accrue du conjugué anticorps-médicament selon l'invention.
[0284] Stabilité à 40 C
[0285] Matériel et méthode 25 [0286] La concentration de McSAF-pyridine et McSAF-maléimide1, dans un tampon PBS (1 mM de phosphate de sodium monobasique, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 155 mM de chlorure de sodium, pH 7,4), a été ajustée à 1 mg/mL. Six (6) échantillons de 150 pl_ de McSAF-pyridine et de McSAF-maléimide1, ont été déposés dans six flacons en polyproprylène (Eppendorf 30 Protein LoBind, 0,5 mL). Après agitation, les échantillons ont été
incubés dans un incubateur (VWR INCU-line IL23) à 40 C. Les flacons ont été retirés trois par trois de l'incubateur, centrifugé 2 minutes à 5000 g et conservés à -80 C
après 1 minutes et 4 semaines.
[0287] Le contenu de chacun des 6 flacons a été filtré sur 0,22 wri et analysé
par HIC et SEC.
5 [0288] HIC
[0289] L'ADC McSAF-pyridine a été analysé en mettant en oeuvre le protocole décrit à l'Exemple 3A.
[0290] Pour McSAF-maléimide1, 50 g de produits ont été injectés sur une colonne TSKgel Butyl NPR, 2,5 "lm, 4,6 x 100 mm (Tosoh), connectée à une chaine 143 HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d'un PDA (e2998) réglé pour une détection à 280 nm. Les échantillons ont été élués à un débit de 0,6 mUmin par un gradient depuis 100% de tampon A (1,5 M sulfate d'ammonium, 50 mM
phosphate de sodium monobasique, pH 7,0) jusqu'à 80% de tampon B (50 mM
phosphate de sodium monobasique, 20% isopropanol (v/v), pH 7,0) dans le 15 tampon A en 45 minutes puis ce gradient a été maintenu pendant 6 min.
La température a été maintenue à 30 C tout au long dela séparation.
[0291] SEC
[0292] 50 pg de produits ont été injectés sur une colonne AdvanceBio SEC 2.7 rn, 7,8 x 300 mm (Agilent Technologies), connectée à une chaine HPLC Waters 20 Alliance (e2695) équipée d'un PDA (2998) réglé pour une détection à
280 nm.
Les ADCs ont été élué à un débit de 1 mUmin par un isocratique de tampon C (1 mM phosphate de sodium monobasique, 155 mM de chlorure de sodium, 3 mM
de phosphate de sodium dibasique, 3 mM d'azoture de sodium, pH 7,4) en 24 minutes. La température a été maintenue à 25 C tot.t au long de la séparation.
25 [0293] Résultats [0294] Le suivi de l'évolution du DAR moyen par la méthode HIC après incubation à
40 C pendant 28 jours est présenté à la Figure 11(N=3). Les résultats montrent que le DAR moyen de McSAF-maléimide1 varie de 4,00 (à tO) à 2,61 (à t28) attestant d'un manque de stabilité dans les conditions stressantes simulées alors 30 que celui de McSAF-pyridine varie peu (3,93 (à tO) à 3,98 (à t28)) démontrant sa stabilité améliorée par rapport à McSAF-maléimide1 utilisant la technologie maléimide.
[0295] Le suivi de l'évolution du pourcentage de DAR4 par la méthode HIC après incubation à 40 C pendant 28 jours est présenté àla Figure 12 (N=3). Les s résultats montrent que le pourcentage de DAR4 diminue au cours du temps pour McSAF-maléimide1 (30 % à tO contre 20% à t28) alors que celui de McSAF-pyridine varie peu (67% à tO contre 63% à t28). Cela démontre la stabilité
accrue et la meilleure conservation du pourcentage de DAR4 de McSAF-pyridine par rapport à McSAF-nnaléimide1 utilisant la technologie maléinnide.
1.0 [0296] Le suivi de l'évolution du pourcentage de monomère par la méthode SEC
après incubation à 40 C pendant 28 jours est présenté à la Figure 13 (N=3).
Les résultats montrent que le pourcentage de monomère diminue de la même manière pour McSAF-maléimide1 (77% à t28) et pour McSAF-pyridine (80% à
t28).
102971Exemple 6 : évaluation in vivo du conjugué anticorps-médicament (McSAF-pyridine) [0298] Matériel et méthode [0299] Toutes les expériences ont été conduites dans un environnement conforme aux recommandations des autorités françaises (Agrément N B 21 231 011 EA) et de la FELASA_ L'étude de survie a été réalisée sur un modèle de xénogreffe BT-474. Une suspension de cellules tumorales a été implantée en sous-cutanée dans des souris immunodéprimées BALB/c nude (Charles River) 24 à 72 h après une irradiation complète avec une source y (2 Gy, 60Co, BioMep, Bretenières, France). Après prise du greffon tumoral, les souris ont été randomisées en groupes (N=8) une fois le volume moyen ayant atteint 150-200 mm3. Les ADCs (McSAF-pyridine ou la référence T-DM1) ont été administrés aux jours 1 et 26 par voie intraveineuse (IV, bolus) dans la veine caudale des souris à 1 ou 5 mg/kg. Le volume tumoral en fonction du temps a été calculé deux fois par semaine en utilisant la formule suivante : (Longueur x épaisseur2)/2. Les animaux ont été euthanasiés quand les volumes tumoraux ont atteint 10% de leur poids, soit approximativement 2000 mm3.

103001 Résultats [0301] Les résultats de l'administration d'une dose de 5 mg/kg sont présentés à la Figure 14 et à la Figure 15. Les résultats de l'administration d'une dose de 1 mg/kg sont présentés à la Figure 16 et à la Figure 17. Les résultats montrent s qu'aux deux doses, 1 et 5 mg/kg, McSAF-pyridine est plus efficace que T-DM1. A
mg/kg de McSAF-pyridine, une régression tumorale complète et durable a été
observée avec 8 souris guéries sur 8 souris traitées.
[0302] Une analyse complémentaire de type immunohistochimie (IHC) sur les souris, à la fin de l'étude, a été réalisée. Elle a permis de confirmer la complète éradication des cellules HER2+ dans la zone correspondant à la xénogreffe pour l'ADC McSAF-pyridine, pour toutes les souris traitées à 5 mg/kg, confirmant ainsi la régression tumorale complète.

Listage de séquences Numéro de séquence Type de séquences Séquence en acides aminés SEQ ID NO: 1 Chaîne légère de DIQMTQSPSSLSASVG DR VTITCRASQ
trastuzumab DVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFL
YSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPE
D FATYYCQQ H YTTP PTFGQGTKVE I KR
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL
N N FYPREAKVQW KVDN ALQSGNSQ ES
VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH
KVYACEVTHOGLSSPVTKSFNFIGEC
SEQ ID NO :2 Chaîne lourde de EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG
trastuzumab FN I KDTY IHWVRQAPG KG LEWVAR I
YP
TNGYTRYADSVKGR FT ISADTSKNTAY
LQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYA
MDYWG QGTLVTVSSASTKG PSVFP LA
PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV
SWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLS
SVVTVPSSSLGTOTYIC N VN H KPSNTK
VD KKVE PKSCD KTHTC PPCPAPELLGG
PSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVD
VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP
R EEQYNSTYRVVSV LTVLHQ DW LNG K
EYKCKVSNKALPAP I EKTISKAKGQ P R E
PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF
YPS D IAV EW ESNGQ PEN NYKTTPPVLD
SDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSC
SVMH EALH N H YTQKS LS LSPG K

Références citées sous le format [numéro de référence] :
1. Fekete, S. et al., il Pharm. Biomed. Anal., 130, 3-18, 2016 2. Barran, P. et aL, EuPA Open Proteomics, 11, 23-27, 2016 3. Goyon, A et al., ,./. Chromatogr. B, 1065-1066, 35-43, 2017

Claims

REVENDICATIONS
[Revendication 11 Coniuuué cvtotoxique de formule (I) suivante :
dans laquelle :
la tête d'accroche est représentée par l'une quelconque des deux formules suivantes :
le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes :
l'espaceur est représenté par la formule suivante :
X est Br, Cl, I ou F ;
m est un entier allant de 1 à 10.
[Revendication 2] Conjugué cytotoxique selon la revendication 1, dans lequel X est Br et m est égal à 4 ou 5.
[Revendication 3] Conjugué cytotoxique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel le médicament cytotoxique est choisi parmi méthotrexate, IMIDs, duocarmycin, combretastatine, calicheamicine, nnonométhylauristatine E (MMAE), monométhylauristatine F (MMAF), maytansine, DM1, DM4, SN38, amanitine, pyrrolobenzodiazepine, dimère de pyn-olobenzodiazepine, pyrrolopyridocliazepine, dimère de pyrrolopyridodiazepine, un inhibiteur de l'histone deacetylase, un inhibiteur de tyrosine kinase, et ricine, de préférence MMAE.
[Revendication 4] Conjugué cytotoxique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 de formule (la) suivante :
OU

[Revendication 5] Conjugué anticorps-médicament de formule (II) suivante :
dans laquelle :
A est un anticorps ou un fragment d'anticorps anti-HER2 ;
la tête d'accroche est représentée par l'une quelconque des deux formules suivantes :
le bras de liaison est un bras de liaison clivable représenté par la formule suivante :

l'espaceur est représenté par la formule suivante :
, X est Br, Cl, I ou F ;
m est un entier allant de 1 à 10 ;
n est un entier allant de 1 à 4.
[Revendication 6] Conjugué anticorps-médicament selon la revendication 5, dans lequel X est Br et m est égal à 4 ou 5.
[Revendication 7] Conjugué anticorps-médicament selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6, dans lequel le médicament cytotoxique est choisi parmi méthotrexate, IMIDs, cluocarmycin, combretastatine, calicheamicine, monométhylauristatine E (MMAE), monométhylaurisbtine F (MMAF), maytansine, DM1, DM4, SN38, amanitine, pyrrolobenzodiazepine, dimère de pyrrolobenzodiazepine, pyn-olopyriciodiazepine, dimère de pyrrolopyridodiazepine, un inhibiteur de l'histone deacetylase, un inhibiteur de tyrosine kinase, et ricine, de préférence MMAE.

[Revendication 8] Conjugué anticorps-médicament selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, dans lequel A est Trastuzumab.
[Revendication 9] Conjugué anticorps-médicament selon l'une quelconque des revendications 5 à 8 de formule (11a) suivante :
[Revendication 10] Composition comprenant un ou plusieurs conjugué(s) anticorps-médicament selon l'une quelconque des revendications 5 à 9.
[Revendication 11] Composition selon la revendication 10, dans laquelle au moins 50%, de préférence au moins 65%, des conjugués anticorps-médicament ont un n égal à 4.
[Revendication 12] Composition selon l'une quelconque des revendications ou 11, dans laquelle A est un anticorps et le Drug-to-Antibody Ratio moyen (DAR moyen) est compris entre 3,5 et 4,5, de préférence compris entre 3,8 et 412, par exemple égal à 4,0 0,2.
[Revendication 13] Composition selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, comprenant en outre du paclitaxel, du docétaxel, de la doxorubicine, du cyclophosphamide, un inhibiteur de l'aromatase tel que l'anastrozole et /
ou un anticorps utilisé en immunothérapie anti-cancéreuse tel qu'un anti-PD1.

[Revendication 14] Conjugué anticorps-médicament selon l'une quelconque des revendications 4 à 9 ou composition selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, pour utilisation comme médicament [Revendication 15] Conjugué anticorps-médicament selon l'une quelconque des revendications 4 à 9 ou composition selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, pour utilisation dans le traitement d'un cancer HER2+, de préférence le cancer du sein HER2+.
[Revendication 16] Procédé de préparation d'un conjugué
cytotoxique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, comprenant une étape qui consiste à coupler une tête d'accroche de formule :
avec un composé de formule dans laquelle :
le bras de liaison est un bras de liaison clivable choisi parmi les formules suivantes :
l'espaceur est représenté par la formule suivante :
x estl3r, Cl, I ou F ;
m est un entier allant de 1 à 10, de préférence égal à 4 ou 5.
[Revendication 17] Procédé de préparation d'un conjugué anticorps-médicament selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, comprenant les étapes suivantes :
(i) préparer un conjugué cytotoxique selon le procédé de la revendication 16, et (ii) faire réagir le conjugué cytotoxique obtenu à l'étape (i) avec un anticorps anti-HER2 ou un fragment d'anticorps anti-HER2.
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