JP2003532425A

JP2003532425A - 細菌性カルボキシペプチダーゼｃｐｇ２変種と遺伝子指令酵素プロドラッグ療法におけるその使用

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Publication number: JP2003532425A
Application number: JP2001582549A
Authority: JP
Inventors: スプリンガー，キャロライン，ジョイ; マライス，リチャード，マルコルム; スプーナー，ロバート
Original assignee: Cancer Research Technology Ltd
Current assignee: Cancer Research Technology Ltd
Priority date: 2000-05-08
Filing date: 2001-05-04
Publication date: 2003-11-05
Also published as: GB0011060D0; WO2001085960A1; AU2001252415A1; US20040014187A1; CA2409679A1; EP1280921A1; NZ522753A

Abstract

(57)【要約】本発明は、遺伝子指令酵素プロドラッグ療法、特に腫瘍を含む疾患の治療に使用するための細菌性カルボキシペプチダーゼに関する。具体的には、本発明は、触媒活性が上昇した修飾した細菌性カルボキシペプチダーゼに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、遺伝子指令酵素プロドラッグ療法（gene directed enzyme prodrug therapy, GDEPT）と、腫瘍を含む疾患の治療におけるその使用に関する。

【０００２】発明の背景遺伝子指令酵素プロドラッグ療法（GDEPT）およびウイルス指令酵素プロドラ
ッグ療法（VDEPT（Huberら、1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 8302-8306）は
、固形腫瘍への毒性代謝物のデリバリーを増加させることを目的とする、自殺遺
伝子治療アプローチである。これは、現在の癌の治療法に伴う主要な問題の１つ
（すなわち、消化管内層や骨髄のような正常組織への有害な副作用を引き起こす
、特異性の欠如）を克服することを目的とする。用語「GDEPT」は、ウイルスお
よび非ウイルスデリバリーシステムを含むように使用される。

【０００３】第１段階で、外来のプロドラッグ活性化酵素をコードする遺伝子が、腫瘍限定
発現を確実にするように、腫瘍細胞に送られる。適切なプロドラッグの以後の全
身性投与は、腫瘍部位でのみ毒性代謝物を生成させ、従って腫瘍を選択的に死滅
させる。活性化酵素の腫瘍特異的発現を確実にする多くの方法が提唱されており
、裸のDNA（Vileら (1993) Cancer Res. 53; 3806-3864）、標的化リポソーム（
Nabeら (1994) Hum. Gene. Ther. 5, 57-77）、ウイルス（Hughesら (1995) Can
cer Res. 55: 3339-3345）の注入、および転写制御（Hughesら (1995) Cancer R
es. 55: 3339-3345; Idoら (1995) Cancer Res. 55, 3105-3109; Trinhら (1995
) Cancer Res. 55, 4808-4812; Niculescu-Duvazら (1998) Bioconjugate Chemi
stry, 9, 4-22）がある。

【０００４】我々のGDEPTシステム（WO 96/40238）は、シュードモナス（Pseudomonas）RS1
6株からの酵素カルボキシペプチダーゼG2（CPG2）の使用に焦点を当てる。CPG2
は、4-([2-クロロエチル][2-メシルオキシエチル]アミノ)ベンゾイル-L-グルタ
ミン酸（CMDA）のような安息香酸マスタードプロドラッグを活性化して、L-グル
タミン酸と強力細胞障害剤であるDNAアルキル化剤 4-([2-クロロエチル][2-メソ
キシエチル]アミノ)安息香酸を放出させる（Springerら (1990) J. Med. Chem.
33, 677-681; Du Frain ら (1979) Envir. Mutagenesis. 1, 283-289; Freiら (
1988) Cancer Res. 48, 6427-6423; Teicherら (1988) Cancer Chemotherapy an
d Pharmacology 1988. 21: 292-298）。CPG2は、他の酵素／プロドラッグ組合せ
に対して多くの利点を有する。他のシステムと異なり、さらに細胞性酵素により
修飾する必要無く、毒性薬物代謝物が直接プロドラッグから放出され、こうして
薬剤耐性が誘導される可能性を低下させる。さらに、活性化薬剤は、周期循環し
ている細胞と非周期循環細胞の両方に対して毒性であり、これは化学療法剤にと
って明確な利点である。

【０００５】 CPG2の別の利点は、プロドラッグを活性化するのに補助基質を必要とせず、従
って活性のために細胞因子に依存しないことである。CPG2は、通常細菌の周辺質
に存在し、ホモダイマーとして活性である（Sherwoodら (1985) Eur. Biochem.
148, 447-453）。このタンパク質のＸ線結晶構造は、各ホモダイマーが、ダイマ
ー界面により分離された２つの明瞭な触媒性ドメインを含む、ダンベル様構造を
形成することを明らかにしている（Rowsellら (1997) Structure, 5, 337-347）
。同じモノマーのN末端（アミノ酸22〜213）とC末端（アミノ酸326〜415）の会
合が、各触媒性ドメインを作成する。ダイマー化ドメインは、折り畳まれれて４
つの鎖の逆方向のβシ−トになる触媒性ドメインの２つの部分の間の、110アミ
ノ酸（残基214〜325）挿入体からなり、１つの側に２つのαヘリックスが隣接す
る。ダイマー界面は、ヘリックスの間の疎水性相互作用と、互いのモノマーから
のβシートの間の水素結合により安定化されて、ダイマーを介して連続的βシー
トを形成する。この単純な構造は、CPG2を非常に多様なものとし、活性酵素CPG2
は、哺乳動物細胞内で発現され、かつその外表面に固定される（Maraisら (1996
) Cancer Res. 56, 4735-4742; Maraisら (1997) Nature Biotech. (1997) 15,
1373-1377）。

【０００６】細胞の外表面への固定は、哺乳動物分泌シグナルをCPG2のN末端に、および受
容体チロシンキナーゼ膜貫通ドメインをそのC末端に融合させて、膜アンカーと
して作用させることにより行われる。すなわちCPG2は、ゴルジ／小胞体を通過し
て原形質膜の外側に挿入され、この型のCPG2は表面固定CPG2（stCPG2）と呼ばれ
る。しかしstCPG2は、３つのアスパラギン残基が不適切にグリコシル化（N222、
N264、N272）され、これが酵素活性の低下を引き起こした。これらの残基をグル
タミンに変異させてグリコシル化を防ぐことにより、一部の活性が回復された（
stCPG2(Q)3）。

【０００７】発明の概要本発明は、酵素活性の改善を引き起こすこれらのアスパラギン残基のさらなる
変異に関する。

【０００８】これらの残基の変異は、264位のアスパラギン（N264）がダイマー安定性の維
持に重要なアミノ酸であり、222位と272位のアスパラギン（N222とN272）のアス
パラギンの変異は、ダイマー安定性に対する作用はより小さいことを証明した。

【０００９】 CPG2*(Q)3中の264位のグルタミンを、セリン、スレオニンまたはアラニンで置
換して、ダイマー安定性と酵素活性を調べた。セリン（CPG2*(QSQ)）置換により
ダイマー安定性が改善され、一方スレオニン（CPG2*(QTQ)）またはアラニン（CP
G2*(QAQ)）では、ダイマー安定性は回復しなかった。

【００１０】 CPG2*(QSQ)は、CPG2*(Q)3のほとんど２倍の活性があるが、MTXに対するその見
かけの親和性は、ほとんど6倍低下した（表１）。さらに、CPG2*(QTQ)ダイマー
安定性は改善されなかったが、その触媒活性は約2.5倍上昇したが、CPG2*(Q)3と
比較して、その基質に対する見かけの親和性は低下した（Kmも約12倍上昇した）
。

【００１１】本発明は、細菌性カルボキシペプチダーゼを提供し、これは、天然形態で１つ
以上のアスパラギン残基を含有し、哺乳動物細胞中での発現の時にモチーフの一
部であるこの残基がN連結グリコシル化を受け、一方少なくとも１つのAsn残基部
位がセリンに改変され、カルボキシペプチダーゼ活性を保持している。

【００１２】好適な細菌性カルボキシペプチダーゼは、天然形態で３つのAsn残基、N末端か
らC末端方向に番号を付けたAsn(1)；Asn(2)；Asn(3)を含有し、哺乳動物細胞中
での発現の時にモチーフの一部であるこれらの残基は、N連結グリコシル化を受
け、ここでAsn(2)がセリンに改変されている。

【００１３】酵素からプロドラッグへの変換速度が、未変化非グリコシル化酵素のそれと実
質的に同じなら、以下のようにAsn(2)の他の改変も可能である。例えば、別の実
施形態においてAsn(2)はスレオニンに改変している。

【００１４】好ましくはAsn(1)とAsn(3)はまた、アスパラギン以外のアミノ酸に改変され、
Asn(1)および／またはAsn(2)がグルタミンに改変されることが好適である。

【００１５】好適な実施形態において本発明は、残基Asn(1)とAsn(3)がそれぞれグルタミン
に改変され、Asn(2)がセリンに改変されている、細菌性カルボキシペプチダーゼ
CPG2を提供する。

【００１６】好適な細菌性カルボキシペプチダーゼは、配列番号２に示す配列を有するシュ
ードモナス（Pseudomonas）カルボキシペプチダーゼCPG2であり、ここでAsn(1)
は222位にあり、Asn(2)は264位にあり、そしてAsn(3)は272位にある。Asn264が
セリンに改変されていることが好ましい。Asn222とAsn272は、アスパラギン以外
のアミノ酸、好ましくはグルタミンに改変されてよい。好適な組合せにおいて、
Asn222はグルタミンに改変され、Asn264はセリンに改変され、Asn272はグルタミ
ンに改変されている。

【００１７】別の実施形態において、Asn264はスレオニンに改変される。Asn222とAsn272は
アスパラギン以外のアミノ酸、好ましくはグルタミンに改変されてよい。好適な
組合せにおいて、Asn222はグルタミンに改変され、Asn264はセリンに改変され、
Asn272はグルタミンに改変されている。

【００１８】本発明はさらに、場合によりカルボキシペプチダーゼを哺乳動物細胞の表面に
ターゲティングすることができるシグナル配列を含む、細菌性カルボキシペプチ
ダーゼをコードする核酸配列を含むベクターを提供する。シグナル配列は、膜貫
通受容体キナーゼのシグナルペプチドであることが好ましい。

【００１９】別の態様において本発明は、 (a) 少なくとも１つのAsnがセリンに改変された、細菌性カルボキシペプチダ
ーゼを発現することができるベクター；および (b) 該酵素により活性薬物に変換され得るプロドラッグ、を含む、互いに関連して使用するための２成分系を提供する。

【００２０】細菌性カルボキシペプチダーゼは、サイトゾル中に存在するか、または細胞の
表面をターゲットとしてもよい。好適な実施形態において、カルボキシペプチダ
ーゼは、細胞の表面で発現される。

【００２１】本発明の２成分系で使用するのに好適な酵素は、上記した通りである。

【００２２】本発明はまた、患者の治療法、治療の必要な患者の腫瘍の治療法における改変
細菌性カルボキシペプチダーゼCPG2もしくは２成分系の使用、または腫瘍の治療
のための薬剤の製造における該カルボキシペプチダーゼCPG2または該カルボキシ
ペプチダーゼをコードするベクターを提供する。

【００２３】本発明はさらに、アミド結合を介して-NH-CH(CO₂H) (Z)部分が結合した化合物
から、該部分を除去する方法であって、該化合物に本明細書に記載の酵素を接触
させて、該部分を除去することを特徴とする方法を提供する。

【００２４】配列リストの説明配列番号１と２は、シュードモナス（Pseudomonas）からのカルボキシペプチ
ダーゼCPG2の核酸配列とアミノ酸配列を示す。

【００２５】配列番号３〜６は、添付の実施例で説明される改変CPG2遺伝子配列を作成する
ために使用した合成オリゴヌクレオチドを示す。

【００２６】詳細な説明 A. 酵素系好適な酵素は、配列番号２に示す配列を有するカルボキシペプチダーゼCPG2（
WO88/07378に開示されている）である。しかしながら他のカルボキシペプチダー
ゼを使用してもよい。真核細胞中で発現される時、この酵素は、一次アミノ酸配
列がAsn-Xaa-Ser/Thr（ここで、Xaaは任意のアミノ酸残基である）であるモチー
フにおいて、ゴルジ体および小胞体中でN連結グリコシル化を受ける。このため
、非グリコシル化形態の酵素と比較して活性が低下する。

【００２７】 CPG2中にそのようなモチーフが３つあり、Asn222、Asn264、およびAsn272に位
置する。これらの部位を改変すると、活性が改善されることがある。部位の少な
くとも１つが（好ましくはAsn264）がセリンに改変されることが好ましい。これ
らの部位の好適な改変は、Asn222とAsn272がグルタミンに、Asn264がセリンに改
変される場合である。生じるQSQモチーフは、高い触媒活性と低いK_mを有する。
あるいは、Asn264をスレオニンに改変してもよい。この結果、触媒活性が上昇し
、K_mが高くなる。本明細書の別の部分に記載されているように、例えば高濃度の
プロドラッグ条件下では、高いK_mは不利ではないことがあり得る。

【００２８】プロドラッグを、変化していない非グリコシル化酵素と実質的に同程度の触媒
活性を有する活性薬物に変換する能力を、酵素が保持するような改変である限り
、モチーフに他の改変を施すことも可能である。この内容において「実質的に同
程度」とは、10倍、５倍、２倍、1.5倍、または1.25倍小さい程度から、２倍、
５倍、または10倍大きい程度までである。プロドラッグから活性薬物への変換率
が実質的に同程度なら、例えばAsn264を、セリンまたはスレオニン以外の残基に
変化させてもよい。

【００２９】他の細菌性カルボキシペプチダーゼ酵素、例えば緑膿菌（Pseudomonas aerugi
nosa）、シュードモナス・カパシア（Pseudomonas cepacia）、シュードモナス
・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・プチダ（Pse
udomonas putida）、シュードモナス・シリンガエ（Pseudomonas syringae）、
シュードモナス・サバスタノイ（Pseudomonas savastanoi）等の他のシュードモ
ナス属種からのCPG2酵素も用いることができる。これらの酵素は、その天然形態
で、３つのアスパラギン残基、Asn(1)、Asn(2)、Asn(3)（N末端からC末端方向に
番号を付けた）を含有し、それらの残基は哺乳動物細胞中での発現の時にN連結
グリコシル化を受けるモチーフの一部である。そのような酵素において、Asn(1)
、Asn(2)、およびAsn(3)は、Asn222、Asn264およびAsn272と相同な位置に存在す
るが、その位置の番号付けは異なってもよい。しかしこれらの酵素のAsn(1)、As
n(2)、およびAsn(3)は、例えば、配列アライメントを使用して、配列を配列番号
２に示す配列と比較し、それによって配列番号２のAsn222、Asn264およびAsn272
に対応するAsn残基を同定することにより、当業者により容易に同定される。

【００３０】シュードモナス（Pseudomonas）の他の種由来のCPG2酵素は、慣用されるクロ
ーニング法により得られる。例えばシュードモナス属（Pseudomonas）種からのc
DNAのライブラリーを作製し、中〜高ストリンジェントな条件下で、配列番号２
の配列の全体または一部に対してプローブされる。

【００３１】例えば、Sambrookらの方法（後述）に従って、ハイブリダイゼーション溶液［
５×SSC（ここで「SSC」＝0.15M 塩化ナトリウム；0.15M クエン酸ナトリウム；
pH7）、５×デンハルツ試薬、0.5〜1.0％ SDS、100μg/ml変性し断片化したサケ
精子DNA、0.05％ピロリン酸ナトリウム、および50％までのホルムアミドを含む
］を使用して、ハイブリダイゼーションを行えばよい。ハイブリダイゼーション
は、37〜42℃で少なくとも６時間にわたり行う。ハイブリダイゼーション後、以
下のようにしてフィルターを洗浄する：(1) ２×SSCおよび１％ SDS中で室温で
５分間；(2) ２×SSCおよび0.1％ SDS中で室温で15分間；(3)１×SSCおよび１％ SDS中で37℃で30分間〜１時間；(4) １×SSCおよび１％ SDS中で42〜65℃で２
時間、30分毎に溶液を交換する。

【００３２】陽性と同定されるクローンを調べて、配列番号２に示す配列の同族体をコード
するオープンリーディングフレームを同定してもよい。当業者には理解されるよ
うに、２つ以上のクローンを組合せて、完全長のオープンリーディングフレーム
を完成することが必要かもしれない。次にクローンを異種発現系（例えば、細菌
または酵母中）で発現させ、タンパク質を当該分野で公知の技術により精製して
もよい。

【００３３】本発明の変異が適用される適当な酵素には、配列番号２に示す配列の変異体、
変種、誘導体または対立遺伝子であるカルボキシペプチダーゼ酵素がある。変種
、対立遺伝子、誘導体または変異体であるカルボキシペプチダーゼ酵素は、１つ
以上のアミノ酸の付加、置換、欠失および挿入が１つ以上、例えば１〜20、例え
ば１〜10、例えば１、２、３、４、５または６〜10の置換、欠失または挿入、が
存在する点で、配列番号２に示す配列とは異なるアミノ酸を有しているものであ
り得る。好適なそのようなカルボキシペプチダーゼは、１つ以上の以下の性質を有する
。配列番号２に示す配列を有するポリペプチドと反応性の抗体との免疫学的交差
反応性；配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドとエピトープを共
有する（例えば、２つのポリペプチドの間の免疫学的交差反応性により測定する
）；配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して産生させた抗
体により阻害される生物活性；安息香酸マスタードプロドラッグからL-グルタミ
ン酸を放出する能力。配列の改変は、カルボキシペプチダーゼ酵素の性質ならび
に／または、活性および／もしくは安定性のレベルを変化させることがありうる
。

【００３４】配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸配列変種、対立遺伝子、誘導体また
は変異体であるポリペプチドは、記載の配列と約35％以上の配列同一性、約40％
以上、約50％以上、約60％以上、約70％以上、約80％以上、約90％以上、または
約95％以上の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む。その配列は、対応する
図に示すアミノ酸配列と約60％以上の類似性、約70％以上の類似性、約80％以上
の類似性、または約90％以上の類似性を共有するものでありうる。アミノ酸類似
性は一般に、Altschulら、(1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10の、前記のアルゴ
リズムGAP（Genetics Computer Group、マジソン、ウィスコンシン州）、または
TBLASTNプログラムにを参照して定義される。使用されるパラメータは、以下の
デフォルトパラメータである。すなわち、ヌクレオチド配列について、ギャッ
プ重み付け(Gap Weight) 50, 長さ重み付け(Length Weight) 3, 平均マッチ(Ave
rage Match) 10.000, 平均ミスマッチ(Average Mismatch) 0.000; ペプチド配列
について、ギャップ重み付け(Gap Weight) 8, 長さ重み付け(Length Weight) 2
, 平均マッチ(Average Match) 2.912, 平均ミスマッチ(Average Mismatch) -2.0
03。ペプチド類似性スコアは、BLOSUM62マトリックスから取る。また有用なもの
として、Altschulら、(1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10の、TBLASTNプログラ
ム、またはウィスコンシンパッケージ、バージョン８（1994年９月）の一部であ
るBestFit（Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsi
n, USA, Wisconsin 53711）である。配列比較は、FASTAとFASTPを使用して行わ
れる（PearsonとLipman, 1988. Methods in Enzymology 183: 63-98を参照）。
パラメータは好ましくは、以下のようなデフォルトマトリックスを使用して設定
される：ギャップオープン(Gaopen)（ギャップ中の第１残基に対するペナルティ
）：タンパク質について-12／DNAについて-16；ギャップイクス(Gapext)（ギャ
ップ中の追加の残基に対するペナルティ）：タンパク質について-2／DNAについ
て-4；KTUP単語長：タンパク質について2／DNAについて6。

【００３５】配列比較は、本明細書に記載の該当配列の完全長に対して行われるか、または
さらに好ましくは、約20、25、30、33、40、50、67、133、167、200、233、267
、300、333、またはそれ以上のアミノ酸もしくはヌクレオチドトリプレットの連
続的配列にわたって、場合により対応するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列
と比較して、行われる。

【００３６】本発明の酵素は、プロドラッグを、実質的に触媒活性を有する活性薬物に変換
する能力を保持する限り、末端切断、置換、欠失または挿入によりさらに改変さ
れてよい。例えば酵素をコードする核酸配列を本明細書に記載の種々の他のシグ
ナル配列に連結したベクターを作製するのに必要な操作の結果として、N末端お
よび／またはC末端配列中に小さい末端切断があってもよい。改変酵素の活性は
、実施例に記載のようなモデル系で測定することができる。

【００３７】さらなる態様において本発明は、そのような改変した細菌性カルボキシペプチ
ダーゼをコードする核酸、またはそのような核酸を含むベクターを提供する。そ
のベクターは、好ましくは、該核酸が、宿主細胞と適合性のあるプロモーターに
機能できる形で結合している発現ベクターである。従って本発明はまた、本発明
の発現ベクターを含有する宿主細胞を提供する。宿主細胞は、細菌（例えば、大
腸菌）、昆虫、酵母または哺乳動物（例えば、ハムスターまたはヒト）のもので
もよい。

【００３８】本発明の宿主細胞は、上記で定義した本発明のカルボキシペプチダーゼ酵素の
作製方法、すなわち宿主細胞を、該酵素またはその断片が発現される条件下で培
養し、実質的に単離された形態で酵素を回収することを含む方法で、使用される
。酵素は融合タンパク質として発現してもよい。

【００３９】B. ベクター系本発明のベクターは、VDEPTまたはGDEPT治療法で使用される任意のDNAまたはR
NAでありうる。

【００４０】適当なベクター系の例としては、モロニーマウス白血病ウイルスに基づくベク
ターがある（Ram, Zら, Cancer Research (1993) 53: 83-88; DaltonおよびTrie
sman, Cell (1992) 68: 597-612）。これらのベクターは、β−グロビン最小プ
ロモーターの上流をクローン化したマウス白血病ウイルス（MLV）エンハンサー
を含有する。開始ATGまでのβ−グロビン 5'非翻訳領域が、クローン化タンパク
質の効率的な翻訳を指令するように提供される。開始ATGは、NcoI制限部位にま
たがっており、従ってタンパク質コード配列をベクター中にクローン化するのに
使用することができる。このベクターは、クローニングを促進するポリリンカー
、これに続くβ−グロビン 5'非翻訳領域とポリアデニル化部位を、さらに含有
する。MLVエンハンサーは強力なエンハンサーであり、多くのマウスおよびヒト
細胞において活性があるため、これが特に有用である。

【００４１】適当なウイルスベクターは、レトロウイルスに基づくものをさらに含有する。
そのようなベクターは、当該分野で広く入手できる。Huberら（Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA (1991) 88, 8039）は、肝癌細胞、乳房細胞、大腸細胞または皮膚
細胞の形質転換のための、両種性レトロウイルスの使用を報告する。Culverら（
Science (1992) 256: 1550-1552）はまた、GDEPTにおけるレトロウイルスベクタ
ーの使用を記載する。そのようなベクターまたはそのようなベクターに由来する
ベクターもまた使用される。ベクターを本発明での使用に適するものにするため
に、他のレトロウイルスを使用してもよい。そのようなレトロウイルスにはラウ
ス肉腫ウイルス（RSV）がある。そのようなウイルスからのプロモーターは、MLV
について上記したものと同様の方法で、ベクター中で使用される。

【００４２】 Englehardら（Nature Genetics (1993) 4: 27-34）は、嚢胞性線維症膜貫通伝
導産物（CFTR）の細胞内へのデリバリーにおける、アデノウイルスベースのベク
ターの使用を記載しており、そのようなアデノウイルスベースのベクターも使用
することができる。アデノウイルスプロモーターと他の制御配列を使用するベク
ターは、本発明の系を細胞（特に肺の細胞）にデリバリーするのに使用され、従
って肺癌の治療に有用である。

【００４３】C. 他のベクター成分本発明の系において本発明の酵素は、哺乳動物細胞の表面に酵素を指向させる
シグナル配列に連結してもよい。酵素が、この指向を行う内因性シグナルを持っ
ていないなら、これは必要であろう。酵素がそのようなシグナル配列を持ってい
ても、本発明のシグナル配列が所望または適切である場合は、置換することがで
きる。適当なシグナル配列には、細胞表面での酵素の発現を指令する能力を保持
する、c-erbB2（HER2/neu）シグナル配列またはその変種のような膜貫通受容体
キナーゼ中で見いだされるものを含む。c-erbB2シグナル配列は、Coussensら (1
985) Science 230: 1132-1139を参照することにより得ることができる。

【００４４】シグナル配列の変種は、分子生物学で公知の標準的方法（例えば、シグナル配
列を含有するベクターの部位特異的突然変異誘発）を使用して作製することがで
きる。

【００４５】さらに適したシグナル配列には、von Heijne (1985) J. Mol. Biol. 184: 99-
105に記載のようなものがある。

【００４６】本発明の酵素は、細胞の表面で発現される。この場合、酵素がプロドラッグと
相互作用するように、酵素を細胞の外に露出させるように発現されるが、適当な
原形質膜アンカーにより原形質膜に結合したままとなる。適当なアンカーは、ベ
クターにより発現されるポリペプチドアンカーであろう。例えば、酵素は、該酵
素を細胞の膜中に固定する膜貫通領域である配列に連結してもよい。そのような
膜貫通領域は、膜貫通受容体キナーゼ（例えば、c-erbB2、EGF受容体およびCSF-
1受容体）から得ることができる。c-erbB2膜貫通領域は、後述の実施例で記載さ
れる。酵素の活性部分が細胞の外およびその表面に位置するように、酵素を細胞
の膜中に固定する能力を保持する限りは、そのような膜貫通領域の変種もまた、
使用される。他のアンカー（例えば、ペプチドグリカンアンカー）としては脂質
アンカーがあり、これを使用することもできる。

【００４７】膜貫通領域由来のようなアンカーは、適当な分子生物学技術により、酵素遺伝
子のオープンリーディングフレームに結合される。タンパク質が発現されるとき
、酵素アンカー融合タンパク質が作製されるとき、該タンパク質は結合したアン
カーを有するであろう。次いでアンカーは、膜中に埋め込まれ、酵素をそこに保
持する。

【００４８】必要な場合シグナル配列および／または膜貫通領域をともに有する酵素をコー
ドするベクターは、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術を使用して作製される。
酵素をコードする配列、シグナル配列および膜貫通領域は、合成または組換え核
酸配列を一緒にスプライシングするか、または部位特異的突然変異誘発のような
技術により既存の配列を改変することにより構築される。標準的組換えＤＮＡ技
術についての詳細は、Sambrookら(1989), コールド・スプリング・ハーバー、に
よる「Molecular Cloning」を参照されたい。

【００４９】D. プロモーター酵素は、ベクターがターゲティングされる細胞中で発現可能なプロモーターを
使用して、ベクター中から発現される。プロモーターは、酵素をコードする配列
およびその関連配列に機能できる形で連結する。例えばプロモーターは、c-erbB
2プロモーターでもよい。c-erbB2プロト癌遺伝子（Hudsonら(1990) J. Biol. Ch
em. 265: 4389-4393）は、低レベルかつ組織限定的に、乳房組織中で発現される
。しかしいくつかの腫瘍状態では、このタンパク質の発現は、転写活性の上昇の
ために増強する。この顕著な例は、乳房組織（腫瘍の約30％）、卵巣（約20％）
、および膵臓腫瘍（約50〜75％）である。転写または翻訳の増大のためにc-erbB
2の発現が上昇している腫瘍において、細胞特異的にタンパク質の発現を指令す
るのに、c-erbB2プロモーターを使用してもよい。

【００５０】 c-erbB2プロモーターを有する正常細胞のトランスフェクションでは、もたら
す酵素発現が限定され、そのためプロドラッグの活性化が制限されることから、
本発明のGDEPT系とともにc-erbB2プロモーターを使用して、そのような腫瘍を標
的化することにより、GDEPTの特異性が増大する。

【００５１】一般に、ベクターからの発現の腫瘍特異性を継続的に確保するのに、-213の領
域のようなプロモーターの何れかの領域が必要であること、一方特異性を大きく
喪失することなくプロモーターの他の領域を改変または欠失することができるこ
とは、当業者に理解されるであろう。すなわち、ヒトc-erbB2と実質的に同程度
に転写制御される改変プロモーターが、好ましい。そのようなプロモーター候補
の制御の程度は、当業者が、例えばHollywoodおよびHurstに記載のような方法に
従って、CATアッセイを使用して、試験し評価することができる。

【００５２】「機能できる形で結合している」とは、プロモーターから転写が開始される上
で適切な位置および配向となるように、同じ核酸分子の一部として結合している
ことを意味する。プロモーターに機能できる形で結合しているDNAは、プロモー
ターの「転写開始制御下」にある。すなわち、プロモーターとコード配列の間に
、プロモーターもコード配列ももともと有しない、5'非コード配列のようなエレ
メントがあってもよい。そのような配列は、プロモーターによるコード配列の正
しい制御を妨害しないなら、ベクター中に含めることができる。

【００５３】他の適当なプロモーターには、哺乳動物レトロウイルスまたはDNAウイルスプ
ロモーターのようなウイルスプロモーターがある。適当なプロモーターには、上
記のベクターで使用されるもの、例えばMLV、CMV、RSVおよびアデノウイルスプ
ロモーターがある。好適なアデノウイルスプロモーターは、早期遺伝子プロモー
ターである。強力な哺乳動物プロモーターも適している。そのようなプロモータ
ーの例は、EF-1αプロモーターであり、MizushimaおよびNagata (1990) Nucleic Acids Res. 19: 5322を参照して得ることができる。実質的に同様の転写活性を
保持するそのようなプロモーターの変種もまた使用できる。

【００５４】E. プロドラッグ本発明の系で使用されるプロドラッグは、CPG2カルボキシペプチダーゼがプロ
ドラッグを活性薬物に変換できるように、その酵素に適合するように選択される
。好ましくは、治療される患者に対するプロドラッグの毒性は、患者に対して活
性薬物より少なくとも１桁低い毒性であろう。好ましくは活性薬物は、プロドラ
ッグより、数桁、例えば２、３または４桁またはそれ以上の毒性を示すであろう
。ナイトロジェンマスタードプロドラッグが好適である。他の適当なプロドラッ
グには、WO96/03515に記載のようなものがある。

【００５５】ナイトロジェンマスタードプロドラッグは、式： M-Ar-CONH-R （式中、Arは、場合により置換された環の芳香環系であり、R-NHはα−アミノ酸
R-NH₂またはオリゴペプチドR-NH₂の残基であり、少なくとも１つのカルボン酸基
を含有するものであり、Mはナイトロジェンマスタード基である）の化合物を含
む。

【００５６】アミノ酸R-NHの残基は好ましくは、グルタミン酸の残基である。酵素カルボキ
シペプチダーゼG2は、上記種類の化合物からグルタミン酸残基を除去することが
でき、グルタミン酸残基の除去により、活性ナイトロジェンマスタード薬物が生
成されることが、WO88/07378に開示されている。

【００５７】すなわち本発明で使用されるナイトロジェンマスタードプロドラッグは、WO94
/02450の一般式Iのプロドラッグおよびその塩、特に式(I)：

【化１】

【００５８】［式中、R¹とR²はそれぞれ独立に、塩素、臭素、ヨウ素、OSO₂Me、OSO₂フェニル
である（ここで、フェニルは、C_1-4アルキル、ハロゲン、-CNまたはNO₂から独立
に選択される１、２、３、４または５つの置換基によって場合により置換される
）； R^1aとR^2aはそれぞれ独立に、水素、C_1-4アルキルまたはC_1-4ハロアルキルであ
る； R³とR⁴はそれぞれ独立に、水素、C_1-4アルキルまたはC_1-4ハロアルキルである
； nは０〜４の整数である；各R⁵は独立に、水素、場合により１つの２重結合または１つの３重結合を含有
するC_1-4アルキル、C_1-4アルコキシ、ハロゲン、シアノ、ハロアルキル（例えば
、-CF₃）-NH2、-CONR⁷R⁸（ここで、R⁷とR⁸は独立に水素、C_1-6アルキルまたはC₃ _-6 シクロアルキルである）であるか、または２つの隣接したR⁵基が一緒に、 a) 場合により１つの２重結合を有するC4アルキレン； b) C3アルキレン；もしくは c) それぞれC_1-4アルキル、C_1-4アルコキシ、ハロゲン、シアノまたはニトロ
よりなる群から選択される１、２、３または４つの置換基でそれぞれ場合により
置換された、-CH=CH-CH=CH-、-CH-CH-CH2-、もしくは-CH2-CH=CH- である； Xは、基-C(O)-、-O-C(O)-、-NH-C(O)-または-CH₂-C(O)-である；そして Zは、-CH₂-T-C(O)-OR⁶基である（ここで、Tは、CH₂、-O-、-S-、-(SO)-、また
は-(SO2)-であり、かつR⁶は、水素、C_1-6アルキル、C_3-6シクロアルキルアミノ
、モノ−、ジ−C_1-6アルキルアミノまたはモノもしくはジC_3-6シクロアルキルア
ミノであり、ただしR⁶は水素であり、Tは-CH₂-である］のプロドラッグ；および式(I)の化合物の生理学的に許容される誘導体（塩を含
む）である。

【００５９】ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素を含む。基R^1aとR^2aに好適な
ものは、メチルおよび水素、特に水素である。基R³とR⁴に好適なものは、水素、
メチルおよびトリフルオロメチル、特に水素である。基R¹とR²に好適なものは、
I、Br、Cl、OSO₂MeおよびOSO₂フェニルである（ここで、フェニルは、2位および
／または4位の１つまたは２つの置換基で置換される）。I、ClおよびOSO₂Meが、
特に好ましい。

【００６０】 nが１〜４の整数であるとき、R⁵に好適なものは、フッ素、塩素、メチル-CONH₂ 、およびシアノである。好ましくはnは０、１または２である。nが１または２
であるとき、R⁵は環の３位および／または５位のフッ素であることが好ましい。
基Xは好ましくは、-C(O)-、-O-C(O)-または-NH-C(O)-である。Zは好ましくは、
基-CH₂CH₂-COOHである。

【００６１】好適な具体的な化合物には以下がある： N-4-[(2-クロロエチル)(2-メシルオキシエチル)アミノ]ベンゾイル-L-グルタ
ミン酸（以後「CMDA」と呼ぶ）およびその塩； N-(4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]-3-フルオロフェニルカルバモイル)-L-グ
ルタミン酸およびその塩； N-(4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]フェニルカルバモイル)-L-グルタミン酸
およびその塩； N-(4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]フェノキシカルボニル)-L-グルタミン酸
およびその塩； N-(4-[ビス(2-ヨードエチル)アミノ]フェノキシカルボニル)-L-グルタミン酸
（以後「プロドラッグ２」と呼ぶ）およびその塩； N-(3,5-ジフルオロ-4-[ビス(2-ヨードエチル)アミノ]フェノキシカルボニル)-
L-グルタミン酸およびその塩； N-(3,5-ジフルオロ-4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]ベンゾイル)-L-グルタミ
ン酸およびその塩； N-(3,5-ジフルオロ-4-[ビス(2-ブロモエチル)アミノ]ベンゾイル)-L-グルタミ
ン酸およびその塩； N-(2,3,5-トリフルオロ-4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]ベンゾイル)-L-グル
タミン酸およびその塩； N-(2,3,5-トリフルオロ-4-[ビス(2-ブロモエチル)アミノ]ベンゾイル)-L-グル
タミン酸およびその塩； N-(2,3,5-トリフルオロ-4-[ビス(2-ヨードエチル)アミノ]ベンゾイル)-L-グル
タミン酸およびその塩； N-(3,5-ジフルオロ-4-[ビス(2-ブロモプロピル)アミノ]ベンゾイル)-L-グルタ
ミン酸およびその塩； N-(3-トリフルオロメチル-4-[ビス(2-ブロモエチル)アミノ]ベンゾイル)-L-グ
ルタミン酸およびその塩。

【００６２】本発明の目的の化合物の具体的なサブグループは、R¹〜R⁴、R⁵、XもしくはWに
ついて上記の特定のまたは一般的な定義の任意の１つを採用し、単独に、または
R¹〜R⁴、R⁵、XもしくはWについて他の特定のまたは一般的な定義と組合せて、採
用することにより得られる。

【００６３】誘導体プロドラッグの生理学的に許容される誘導体には、塩、アミド、エステル、お
よびエステルの塩がある。エステルには、エステル基の非カルボニル残基が、直
鎖または分岐鎖のC_1-6アルキル（メチル、n-プロピル、n-ブチル、またはt-ブチ
ル）；またはC_3-6環状アルキル（例えば、シクロヘキシル）から選択される、カ
ルボン酸エステルがある。塩には、例えば適当な塩基から得られる生理学的に許
容される塩基塩、例えば、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）塩、アルカリ土
類金属（例えば、マグネシウム）塩、アンモニウムおよびNR₄''（ここでR''はC₁ _-4 アルキルである）塩がある。他の塩は、酸付加塩（塩酸塩および酢酸塩を含む
）がある。アミドには、非置換およびモノ−およびジ−置換誘導体がある。

【００６４】F. 本発明の適用本発明の系は、ヒトまたは動物の身体の治療法で使用することができる。従っ
て、この２成分系は、場合によっては２つの製品の使用のための説明書とともに
キットの形態で２つの製品（酵素または微生物＋プロドラッグ）として提供され
る。２成分は患者の近傍に別々に提供され、一緒にしてそのような患者に連続的
に投与してもよい。

【００６５】本発明の治療には、治療の必要な患者に本発明の系を投与することを含む、新
生物細胞の増殖を治療する方法が含まれる。また、細菌、ウイルスまたは寄生体
のヒトまたは動物の身体への感染により疾患状態である細胞を治療するのに、本
発明を使用することもできる。ウイルスの後期プロモーターは多くの場合、感染
の初期に産生されるウイルスタンパク質に依存する。感染細胞の表面で発現され
るウイルスコートタンパク質は、遺伝子を細胞に向けるための標的として使用す
ることができる。次にウイルスの後期プロモーターを使用して、GDEPT酵素の発
現を指令する場合、感染された細胞（特に、しばらく感染されていた細胞）はタ
ンパク質を発現するであろう。これは、感染細胞を死滅させるのに十分であろう
。寄生体については、寄生体プロモーターおよび寄生体表面タンパク質を使用し
て、発現を指令し、それぞれ寄生体に感染させることができる。

【００６６】細菌については、具体的なプロモーターは規定するのが容易であろうが、おそ
らくすべての送達系を変化させて細菌性ウイルスを使用する必要があるであろう
。

【００６７】治療におけるベクターの使用については、例えばRamら（前述）に記載のよう
に、ベクターは通常ウイルス粒子中にパッケージングされ、粒子は腫瘍部位に送
達されるであろう。ウイルス粒子は、抗体、そのフラグメント（１本鎖を含む）
、または腫瘍のターゲティングを増強するための腫瘍指向性リガンドを含むよう
に改変してもよい。あるいはベクターは、リポソーム中にパッケージングされう
る。リポソームを、特定の腫瘍にターゲティングさせることができる。これは、
腫瘍指向性抗体をリポソームに結合させることにより達成できる。ウイルス粒子
もまた、リポソーム中に取り込まれうる。粒子は、医師の処置で、好適な手段に
より腫瘍に送達することができる。好ましくはウイルス粒子は、腫瘍細胞に選択
的に感染することができる。「選択的に感染する」とは、ウイルス粒子が主に腫
瘍細胞に感染し、感染される非腫瘍細胞の比率が、治療される疾患の性質により
、プロドラッグの投与による非腫瘍細胞への傷害が許容できる程度に低いような
ものであることを意味する。最終的にこれは、医師により決定されるだろう。

【００６８】１つの好適な投与経路は、無菌溶液中の粒子の注射である。プロドラッグを単
独で投与することも可能であるが、医薬製剤として提供することが好ましい。製
剤は、１つ以上のその許容される担体および場合によっては他の治療成分ととも
に、プロドラッグを含む。担体は、製剤の他の成分と適合性があり、その受容者
に対して有害でないという意味において「許容される」ものでなければならず、
例えばリポソームである。好適なリポソームとしては、例えば正に荷電した脂質
（N[1-(2,3-ジオレイルオキシ）プロピル]-N,N,N-トリエチルアンモニウム（DOT
MA）を含むもの、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）を含む
もの、および3β[N-(n',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル]コレステロー
ル（DC-Chol）を含むものが挙げられる。

【００６９】例えばパッケージング細胞系から単離されたウイルスもまた、局所灌流または
直接的腫瘍内投与、または体腔への直接注射（腔内投与）、例えば腹膜内注射に
より投与されうる。

【００７０】また、筋細胞は裸の(naked)DNAを取り込み、こうして肉腫を、裸のDNAが肉腫
内に直接注射される本発明のベクター系を使用して治療することができる。

【００７１】非経口または筋肉内投与に適した製剤には、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、
殺菌性抗生物質、および製剤を目的の受容者の血液と等張にする溶質を含有しう
る水性および非水性無菌注射液；ならびに懸濁剤および増粘剤を含む水性および
非水性の無菌懸濁液、ならびに化合物を血液成分または１つ以上の臓器にターゲ
ティングするように設計されたリポソームまたは他の微粒子系が含まれる。製剤
は、単位用量または複数回用量容器、例えば密封アンプルおよびバイアルで提供
され、使用の直前に、注射のために無菌液体担体（例えば水）を添加することだ
けが必要である凍結乾燥状態で保存されうる。注射溶液および懸濁液は、前記し
た無菌粉末、顆粒および錠剤から即座に調製されうる。

【００７２】上記の具体的に言及した成分以外に、製剤は、問題の製剤のタイプと関係のあ
る当技術分野において通常の他の物質を含有してもよいことは、理解されるべき
である。可能な製剤のうち、無菌の発熱性物質を含まない水性および非水性溶液
が好ましい。

【００７３】用量は、連続的に、例えば毎日、１週間毎に、１ヶ月毎に、または患者の特定
の必要性に応じて投与されうる。好ましい投与経路は、経口送達および注射、一
般的には非経口または筋肉内注射または腫瘍内注射である。

【００７４】本発明の系の使用において、プロドラッグは通常、酵素をコードするベクター
の投与後に投与されるだろう。一般的には、ベクターは患者に投与され、次にト
ランスフェクションされたかまたは感染された（ウイルスベクターの場合）細胞
によるベクターの取り込みが、例えばターゲティングされた組織の生検サンプル
の回収と分析によりモニタリングされるだろう。

【００７５】もちろん正確な投与法は、個々の患者について個々の医師が決定する必要があ
り、これは、同様にプロドラッグおよびプロドラッグから放出される細胞傷害性
物質の正確な性質により制御されるが、いくつかの一般的指針を示すことができ
る。このタイプの化学療法は、通常プロドラッグと改変ウイルスの非経口投与を
含み、静脈内経路による投与が多くの場合最も実用的であることが見出される。
神経膠芽細胞腫では、経路は多くの場合腫瘍内である。プロドラッグの一般的な
投与範囲は、患者１日当たり約１〜150mg/kgの範囲であり、これは単一用量また
は複数回用量で投与されうる。好ましくは投与範囲は、患者１日当たり約10〜75
mg/kg、例えば約10〜40mg/kgであろう。患者の状態および医師の裁量のような他
の要因に従って、他の用量も使用することができる。

【００７６】本発明の系を使用して治療されうる腫瘍は、GDEPTまたはVDEPT系で治療可能な
または治療されるいずれの腫瘍をも含み、従って特定の１つのクラスの腫瘍に限
定されない。特に適切な腫瘍型としては、乳癌、結腸直腸腫瘍、卵巣腫瘍、なら
びに膵臓腫瘍、黒色腫、神経膠芽細胞腫、肝癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、筋
肉腫瘍および前立腺腫瘍が挙げられる。

【００７７】あるいは本発明の系または酵素は、細菌送達系とともに使用されうる。例えば
WO 96/40238は、遺伝子が遺伝子操作された腫瘍特異的微生物により腫瘍細胞に
送達される方法を記載する。細菌のサルモネラ（Salmonella）種、マイコバクテ
リウム・アビウム（Mycobacterim avium）、または原生動物リーシュマニア・ア
マゾネンシス（Leishmania amazonensis）は、それぞれが、非癌細胞に対して腫
瘍細胞への付着および浸透に対する自然の選択性を示すため、送達系として使用
するのに好ましい微生物である。プロドラッグ変換酵素は、これらの細菌中で発
現され、腫瘍にターゲティングさせることができる。本発明の改変CPG2は、その
ような細菌系で発現され、従って腫瘍細胞にターゲティングさせることができる
。

【００７８】本発明の系はまた、例えば感染疾患、および細胞集団の根絶を必要とする任意
の他の症状を治療するのに使用されうる。

【００７９】腫瘍の治療に関する場合、治療は、患者に及ぼす腫瘍の作用を緩和するための
医師が取る任意の手段を含むことは理解されるであろう。すなわち腫瘍の完全な
寛解は望ましい目標であるが、また有効な治療法には、腫瘍の部分的寛解を達成
し、ならびに転移を含む腫瘍の増殖速度を遅らせることができる任意の手段が含
まれるだろう。そのような手段は、生活の質を延長および／または増強し、疾患
の症状を緩和するのに有効となりうる。

【００８０】本発明を、以下の実施例を参照して詳細に説明する。

【００８１】実施例材料と方法 (1) 変異体の調製それぞれサイトゾルCPG2*、３つのアスパラギンからグルタミンへの変異を有
するサイトゾルCPG2*、および同じ３つの変異を有する表面固定(tethered)stCPG
2(Q)3をコードするプラスミド、pMCEFcpg2*、pMCEFcpg2(Q)3およびpMCEFstcpg2(
Q)3が、記載されている（Maraisら (1996) Cancer Res. 56, 4735-4742; Marais
ら (1997) Nature Biotech. 15, 1373-1377）。

【００８２】以下のように、BsmFI認識部位が、pEFcpg2(Q)3中のCPG2アミノ酸S274を発現す
るコドンの下流に挿入された。CPG2遺伝子の5'末端とオリゴヌクレオチド1を認
識するプライマーおよびCPG2遺伝子の3'末端とオリゴヌクレオチド2を認識する
プライマーを使用して作製した２つのPCR断片を、断片を混合し、フランキング5
'および3'プライマーを使用して増幅することにより、融合させた。この融合体
からの内部SphI-SalI断片を使用して、pEFcpg2*(Q)3中の対応する領域を置換し
、CPG2*(Q)3コード配列がBsmFI配列GGGACの導入により中断されたプラスミドを
作製した。同様の方策を使用し、しかしオリゴヌクレオチド1と2をオリゴヌクレ
オチド3と4で置換して、さらなるBsmFI認識部位をこのプラスミドに導入した。
これにより、CPG2*コード配列が、S274をコードするコドンの下流でBsmFI配列GG
GACで中断され、N264をコードするコドンの上流で反対の配向であるBsmFI配列GT
CCCで中断されたプラスミドが作製された。

【００８３】オリゴヌクレオチド１：CGCCAAGGCCGGCCAAGTCTCGGGGACAACATCATCCCCGCC （配列番号３）オリゴヌクレオチド２：GGCGGGGATGATGTTGTCCCCGAGACTTGGCCGGCCTTGGCG （配列番号４）オリゴヌクレオチド３：AAGAAACCTGCGCTTCGTCCCCAATGGACCATCGCC （配列番号５）オリゴヌクレオチド４：GGCGATGGTCCATTGGGGACGAAGCGCAGGTTCTT （配列番号６）

【００８４】２つのBsmFI部位を含有する遺伝子を、c-erbB2シグナルペプチドに融合し、２
つのBsmFI部位を含有するc-erbB2-CPG2(Q)3 融合遺伝子をpUC18(BsmFI部位を持
たない)にlacプロモーターの転写制御下でサブクローニングした。BsmFIで切断
後、このプラスミドの大きな断片を、欠けている部分を置換し特定の部位の改変
を可能にするハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドのセットに連結した。形質
転換後、改変アミノ酸をコードするCPG2遺伝子をDNA配列決定により同定し、コ
ードした酵素の活性を、良好なCPG2基質であるMTXを分解する馴らし増殖培地の
能力を試験してスクリーニングした。改変遺伝子をさらにサブクローニングして
、哺乳動物細胞における一過性発現のための、Ef1-a転写制御下でCPG2*およびst
CPG2変異体をコードするプラスミドを作製した。

【００８５】 (2) stCPG2(Q)3を構成的に発現する細胞系の作製すべての哺乳動物細胞系を、10％ウシ胎児血清を補足したダルベッコ改変イー
グル培地（DMEM/FCS）で維持した。この試験のために、ヒト結腸直腸癌細胞系Wi
Dr（Noguchiら (1979) In Vitro. 15, 401-408 およびヒト卵巣癌細胞系SK-OV-3
（Hillら (1987) 39, 219-225）およびA2780（Louieら (1985) Cancer Res. 45,
2110-2115）を、別々にプラスミドpMCEFstcpg2(Q)3（Maraisら (1997) Nature
Biotech. 15, 1373-1377）でトランスフェクションし、限界希釈によりG418耐性
コロニーを選択した。界面活性剤可溶性抽出物を、良好なカルボキシペプチダー
ゼG2基質であるメトトレキセートとインキュベートした。320nmの吸光度の変化
速度を測定して、MTXを分解でき、従ってstCPG2(Q)3を発現すると考えられるコ
ロニーを同定した。CPG2に特異的なウサギポリクローナル血清（Maraisら (1996
) Cancer Res. 56, 4735-4742; Maraisら (1997) Nature Biotech. 15, 1373-13
77）を使用して、これらの界面活性剤可溶性抽出物を免疫ブロッティングして、
stCPG2(Q)3の発現を確認した。β−ガラクトシダーゼまたはCPG2*を構成的に発
現する細胞系が記載されている（Maraisら (1996) Cancer Res. 56, 4735-4742;
Maraisら (1997) Nature Biotech. 15, 1373-1377）。

【００８６】 (3) 酵素動力学試験 COS-7細胞を一過性発現のために使用して、多量のCPG2*、CPG2*(Q)3およびstC
PG2(Q)3酵素を含有する界面活性剤可溶性抽出物を、酵素動力学試験のために得
た。界面活性剤可溶性細胞抽出物および酵素動力学解析は、すでに記載されてい
る（Maraisら (1996) Cancer Res. 56, 4735-4742; Maraisら (1997) Nature Bi
otech. 15, 1373-1377）。界面活性剤可溶性抽出物中のCPG2タンパク質のレベル
を、昆虫細胞中で発現された精製CPG2で標準化したPhosphorImagerを使用して、
定量免疫タンパク質ブロッティング法により測定した。すべての場合で、１アッ
セイ当たり50ngのCPG2*、および内部で発現される細胞表面で固定された変異体
の等量を使用して、CPG2由来タンパク質の動力学パラメータを測定した。50ngの
CPG2*タンパク質を含有するCOS/CPG2*調製物の比活性を100％として割り当てた
。

【００８７】 (4) 細胞死と細胞傷害性アッセイの動力学細胞集団の50％を死滅させるのに必要なCMDAへの暴露時間を決定するために、
細胞系を３×10⁵ 細胞／ウェルで６ウェル組織培養プレートにプレーティングし
て、コンフルエンスまで増殖させた。組織培養培地を、２mM CMDA（WiDrとSK-OV
-3細胞系について）または１mM CMDA（A2780細胞系について）を含有する１mlの
DMEM/FCSで置換した。これらの濃度は、lacZを発現する対照細胞系にとっては毒
性ではない。0.5、１、２、４、８、12および16時間の暴露後、細胞をトリプシ
ン処理し、約３％を再度プレーティングした。さらに４日間増殖させた後、細胞
生存を、［³Ｈ］チミジン取り込みにより測定した（0.4μCi／ml、６時間）。

【００８８】細胞傷害性とバイスタンダー（bystander）細胞傷害性アッセイを、既に記載
したように行った（Maraisら (1996) Cancer Res. 56, 4735-4742）。細胞傷害
性アッセイについて簡単に説明すると、細胞をコンフルエンスまで増殖させ、DM
EM/FCS中の増加する量のCMDAを使用して、１回１時間で２回処理し、次に直ちに
18時間処理した。細胞をトリプシン処理し、約３％を再度プレーティングして、
さらに４日間増殖させ、[³Ｈ］チミジン取り込みを使用して生存を推定した。バ
イスタンダーアッセイにおいては、stCPG2(Q)3を発現する細胞とβ−ガラクトシ
ダーゼを発現する同じ系統の細胞の混合物を、WiDrとSK-OV-3細胞については２m
M CMDAおよびA2780細胞については１mM CMDAを使用して、単一濃度のCMDAで同じ
２段階処理プロトコールで処理した。これらの条件下で、stCPG2(Q)3発現細胞の
不在下で試験すると、CMDAのこれらの濃度はバイスタンダー受容体細胞系を死滅
させない。

【００８９】 (5) CMDAの合成 CMDAプロドラッグを既に記載したように合成した（Springerら (1993) 18, 21
2-215）。

【００９０】実施例１：表面固定したCPG2の特性評価本発明者らはまず、グリコシル化を阻止したアスパラギンからグルタミンへの
変異が、なぜCPG2酵素活性を低下させたかを調べた。CPG2の結晶構造を調べて、
本発明者らは、すべての３つのアミノ酸がCPG2のダイマー化ドメイン内にあるこ
とを観察し、これは、活性の喪失がダイマー安定性への影響によるものであるこ
とを示唆している。これを試験するために、CPG2*を一過性にCOS細胞中で発現さ
せ、ダイマーの安定性を非還元SDS-ポリアクリルアミドゲルで測定した。CPG2ダ
イマーは高度に安定であり、このゲル系で、CPG2*ダイマーは、見かけの分子量
約80,000で移動した（図1A、レーン２）。サンプルを加熱してダイマーを不安定
化させた後、ゲルにローディングすると、モノマーが見かけの分子量約42,000で
移動した（図1A、レーン５）。これに対して、CPG2*により形成したダイマー（
ここで、N222、N264、およびN272のすべてはグルタミンで置換されていた（CPG2
*(Q)3））は不安定であり、サンプルを加熱しなかった場合でさえもモノマーと
して移動した（図1A、レーン３、６）。次に本発明者らは、各位置を独立に試験
した。このゲル系でCPG2*(N222L)とCPG2*(N272)は両方とも安定なダイマーを形
成したが、CPG2*(N264L)はモノマーとして移動した（図1B、レーン２、３、４）
。このことは、N264がダイマー安定性の維持に重要なアミノ酸であることを示唆
している。これは、ダイマー化界面内のその位置に一致する。各N264残基の側鎖
は、この界面内に埋まっていて、反対の鎖との相互作用を形成するが、N222とN2
72は表面にあり、同様の相互作用を形成せず、その結果、その変異はダイマー安
定性への重大な影響がほとんどない。

【００９１】グルタミン側鎖は、アスパラギン側鎖よりかなり大きいため、アスパラギンを
置換するためのグルタミンは、立体的に最も好ましくない。従って、この変異は
、ダイマー界面のある程度のひずみを引き起こすであろうから、本発明者らは、
同様の側鎖を有するアミノ酸による置換が、ダイマー安定性と酵素活性の改善を
引き起こすか否かを試験した。CPG2*(Q)3中の264位のグルタミンを、セリン、ス
レオニンまたはアラニンで置換し、ダイマー安定性と酵素活性を調べた。ダイマ
ー安定性は、スレオニン（CPG2*(QTQ)）またはアラニン（CPG2*(QAQ)）置換でも
改善されず、一方セリン（CPG2*(QSQ)）置換は、弱いダイマー安定性を回復した
（図1C、レーン４、５、６）。ダイマー安定性のこの回復は、酵素活性に複雑な
影響を有した。CPG2*(QSQ)はCPG2*(Q)3のほとんど２倍の活性であるが、MTXに対
するその見かけの親和性は、ほとんど６倍低下した（表１）。さらに、CPG2*(QT
Q)ダイマー安定性は改善されなかったが、その触媒活性はCPG2*(Q)3と比較して
約2.5倍上昇し、しかしそのKmはまた、約12倍上昇した。CPG2*(QAQ)は本質的に
不活性であった。

【００９２】次に本発明者らは、これらの変異が、いかにstCPG2に影響を与えるかを調べた
。CPG2*と同様に、スレオニン（stCPG2(QTQ)）とアラニン（stCPG2(QAQ)）置換
タンパク質は安定なダイマーを形成しなかったが、一方、セリン置換タンパク質
（stCPG2(QSQ)）では、弱いダイマーが見られた（図1C、レーン８、９、10）。
実際stCPG2(QSQ)は、stCPG2(Q)3に匹敵する動力学的性質を有する。興味深いこ
とに、ダイマー安定性は改善しないにもかかわらず、表面に固定することは、ア
ラニン置換タンパク質の活性の実質的な回復を可能にした。従ってCPG2*(QAQ)は
不活性であったが、stCPG2(QAQ)は高い酵素活性（CPG2*の38％）と69μMのMTXに
対するKmを有した。すべての４つのstCPG2変異体は、45〜69μM MTXの範囲のKm
値と、CPG2*の触媒活性の29〜40％の触媒活性を有した。CPG2*(Q)3の低いKmでさ
え、表面固定法により54μMに上昇した。

【００９３】まとめると、これらのデータは、タンパク質がサイトゾル中で発現される時、
N264置換は、CPG2ダイマー安定性、酵素活性および基質親和性に影響を与えるこ
とを示す。

【００９４】 Q₂₂₂とQ₂₇₂の背景で、スレオニン266（T₂₆₆）でも変異を行った。このスレオ
ニン残基のほとんど改変により、酵素活性は非常に低くなったかまたは不活性な
酵素となり、T₂₆₆からV₂₆₆への改変は、活性を55％とし、Kmを90μmにした。

【００９５】実施例２：表面で固定されたCPG2は哺乳動物細胞をCMDAに感作するこれらの試験を行うために、本発明者らは、stCPG2(Q)3の安定な発現のために
、WiDr（ヒト結腸直腸腺癌）、SK-OV-3、およびA2780（両方ともヒト卵巣腫瘍系
）細胞を操作した。stCPG2(Q)3の存在は、免疫タンパク質ブロッティング（デー
タは示していない）により証明し、これらのクローン中の酵素活性のレベルは、
MTXを基質として使用して測定した（表２）。各系について、２つまたは３つの
クローンを調べた。SK-OV-3クローンは、最も低いCPG2活性（0.016と0.023U/mg
タンパク質）を示し、次にA2780クローン（0.06と0.067U/mg）であり、WiDrクロ
ーンは、最も高いレベルのCPG2活性（0.177と0.226U/mg）を示した（表２）。

【００９６】これらの分離株のすべては、プロドラッグCMDAに対してβ−ガラクトシダーゼ
（β-gal）を発現する親細胞よりも感受性であった。A2780クローンは、約15〜2
1μM CMDAの範囲のIC₅₀値を有し最も感受性であり、β-gal発現細胞（IC₅₀ 2150
μM、表２）と比較して>100倍の感受性の上昇であった。stCPG2(Q)3を発現するW
iDr細胞は、100〜150μMの範囲のIC₅₀値を有し、β-gal発現WiDr細胞（IC₅₀＞32
00、表２）より22〜32倍高い感受性であった。最後に、stCPG2(Q)3を発現するSK
-OV-3クローンは、200〜550μMのIC₅₀値を有し、β-gal発現対照と比較して７〜
20倍の感受性の上昇であった（表２）。これらのデータは、すべての３つの細胞
系を、stCPG2(Q)3の発現によりCMDAに対して感受性に強いることができるが、酵
素活性のレベルは、感受性の指標として使用することができないことを示してい
る。すなわちWiDrクローンは、A2780クローンより約３倍高い酵素活性を示した
が、A2780クローンは、CMDAに対してWiDrクローンより５〜10倍高い感受性であ
った（表１、２）。同様に、WiDrクローンは、SK-OV-3クローンより約10倍高い
酵素活性を示したが、WiDrクローンは、CMDAに対してSK-OV-3クローンよりわず
かに1.5〜5.5倍高い感受性であった（表１、２）。

【００９７】これらのstCPG2(Q)3発現クローンにおけるCPG2活性のレベルは、以前本発明者
らが、CPG2*発現クローンについて示したものより一貫して低かったが、CMDAに
対する感受性は同様のレベルが見られた。例えば、本発明者らの以前の試験では
CPG2*を発現するA2780クローンは、0.964U/mgのCPG2を含有し（Maraisら (1996)
Cancer Res. 56, 4735-4742）、本試験からのstCPG2(Q)3発現クローンより約15
倍高い酵素活性（表２）を有したが、CPG2*クローンは、23.2μM（参照）のCMDA
に対するIC₅₀を有し、stCPG2(Q)3クローンについてここに報告した15〜21μM値
と同様であった（表２）。同様に、CPG2*を発現するWiDrクローンは、0.787U/mg
（Maraisら (1996) Cancer Res. 56, 4735-4742）のCPG2酵素活性を有し、stCPG
2(Q)3クローンより約3.5〜4.5倍高いCPG2活性を有した（表２）が、その277μM
のIC₅₀は、CPG2*発現物(expressers)について報告されたIC₅₀値（100／147μM）
より、実際わずかに高かった。最後に、CPG2*を発現するSK-OV-3クローンは、1.
013U/mgのCPG2を含有し、これはstCPG2(Q)3クローンより約44〜63倍高い酵素活
性であった（表２）が、258μMのCMDAに対するIC₅₀は、stCPG2(Q)3クローンで見
られた酵素活性の範囲内（216〜544μM、表２）であった。

【００９８】実施例の要約 MDA MB 361細胞におけるCPG2(Q)3の表面への固定は、一部はグリコシル化を防
ぐ変異が酵素活性を低下させるため、酵素活性を低下させた（Maraisら (1997)
Biotechnology 15, 1373-1377）。グリコシル化残基（N222、N264およびN272）
は、すべてダイマー化ドメイン内にあるので、本発明者らは、これらの変異がダ
イマー安定性に影響を与えるかどうかを調べたく、ダイマー安定性において重要
な役割を果たすアミノ酸としてN264を同定した。CPG2*(Q)3中のこの位置でグル
タミン以外のアミノ酸を置換することによりダイマー安定性を回復しようとする
本発明者らの試みは、混在した結果を与えた。セリンへの変異は、ダイマー安定
性を回復し、酵素活性を２倍にしたが、Kmはわずかに減少した。これに対して、
スレオニンで置換しても、ダイマーは安定化せず、アラニンで置換すると、実質
的に不活性な酵素が得られた。

【００９９】本発明者らは、表面固定法が、N264変異に誘導される有害作用の多くを克服す
るらしいことに、興味を抱いた。すなわち、N222とN272がグルタミンで置換され
たが、264位がグルタミン、アラニン、セリンまたはスレオニンで置換されたサ
イトゾルCPG2*タンパク質のKm値は、約10μm〜125μmの範囲内であった（CPG2*(
QAQ)については測定不能であった）。対応する表面固定酵素は、49〜69μmのよ
り狭い範囲のKm値を有した。同様に、サイトゾルタンパク質は、触媒値がCPG2*
の活性の78〜32％（CPG2*(QAQ)については測定不能であった）であったが、表面
固定タンパク質は、CPG2*の活性の29〜40％の範囲の活性を有した。すなわち264
位の変異は、膜固定タンパク質より可溶性のサイトゾル酵素の酵素活性に、より
有意な影響を与えた。

【０１００】グリコシル化とこれを防ぐために行った変異に関連する問題にもかかわらず、
CPG2は、表面固定アプローチの理想的な酵素である。これは通常、細胞周辺腔に
分泌され、活性のためにサイトゾル因子を必要としないため、グリコシル化が防
止された場合、これは活性な表面固定型で発現させることができる。さらに、CP
G2は、薬物を直接放出するため、CMDAから毒性部分を作製するのに追加の代謝工
程を必要とせず、また薬物は親油性であるため、これは、能動輸送の必要無くす
べての細胞に入ることができて細胞死を仲介することができる。

【０１０１】表面固定タンパク質の１つの潜在的な不都合は、内部で発現されたタンパク質
と比較して、基質に対するKmが一般的により高いことであった。すなわち、CPG2
*(Q)3はKm値が７〜10μmであり、一方すべての表面固定タンパク質は、４〜６倍
高いKm値を有した。しかし過剰のプロドラッグの存在下では、プロドラッグに対
する親和性の低下（高いKm）は、あまり重要ではないかもしれない。ADEPT試験
では、患者の血清で約３mMのピークCMDA濃度が測定され、非常に高濃度のプロド
ラッグを達成することができることを示している。

【０１０２】最終的に、表面固定タンパク質は活性が高く、触媒値は野生型タンパク質の40
％であったが、それでも本発明者らは、対応するCPG2*発現細胞と比較すると、4
0％より有意に低い、stCPG2(Q)3発現クローン中のCPG2酵素活性の濃度を一貫し
て観察した。これはSK-OV-3細胞で最も明らかであり、stCPG2(Q)3発現クローン
は、対応するCPG2*発現細胞のCPG2活性のわずか２％を示しただけであったが、
同様の細胞傷害性とバイスタンダー作用を与えた。差が最も小さかったWiDr細胞
でさえも、stCPG2(Q)3クローンは、CPG2*発現細胞の活性の10％を示したのみで
あった。このことは、stCPG2(Q)3タンパク質が、CPG2*で達成できるような高レ
ベルで発現することはできないかまたは蓄積できないことを示唆する。

【０１０３】

【表１】

【０１０４】

【表２】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、CPG2ダイマー安定性を追跡するゲル電気泳動を示す。 (A) は、β-gal、CPG2* またはstCPG2(Q)3を一過性に発現するCOS細胞の界面
活性剤可溶性抽出物を、４℃で非還元条件下で、あらかじめ加熱してまたは加熱
せずに、電気泳動したものを示す。ダイマー(d) とモノマー(m) の泳動の位置は
、分子量マーカー（×10^-3）の位置のように示される（矢頭）。 (B) は、Aと同じ条件で電気泳動した、CPG2*と、NからLへの置換を有する３つ
のCPG2*変種を一過性に発現するCOS細胞の界面活性剤可溶性抽出物を示す。 (C) は、Aのように電気泳動した、CPG2*と置換CPG2変種、およびstCPG2*(Q)3
とstCPG2変種を一過性に発現するCOS細胞の非加熱抽出物を示す。

【図２】図２は、CMDA処理の経時変化を示す。WiDr細胞(A) 、または20％WiDR
アクチベーター細胞を含有するβ-galを発現するWiDR細胞の混合物(B) 、および
SK-OV-3細胞(C)、または20％ SK-OV-3 アクチベーター細胞を含有するβ-gal
を発現するSK-OV-3 細胞の混合物(D) を、記載の時間CMDAで処理した。アクチベ
ーター細胞は、CPG2* （白丸）またはstCPG2(Q)3（黒丸）を発現した。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １２１ 43/00 １２１１２３１２３Ｃ１２Ｎ 9/52 Ｃ１２Ｎ 9/52 Ｃ１２Ｒ 1:38 //(Ｃ１２Ｎ 9/52 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:38） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者マライス，リチャード，マルコルムイギリス国エスダブリュ３６ジェイビーグレーターロンドン，ロンドン，フルハムロード 237，インスティテュートオブキャンサーリサーチ (72)発明者スプーナー，ロバートイギリス国シーヴイ４７エーエルワーウィックシャー，コヴェントリー，ユニバーシティーオブワーウィック，バイオロジカルサイエンシズ，モレキュラーセルバイオロジーＦターム(参考） 4B024 AA01 BA14 CA04 CA07 DA02 DA05 DA06 DA11 DA12 EA02 EA04 FA02 FA18 HA17 4B050 CC03 CC05 DD02 LL01 LL05 4C084 AA01 AA02 AA07 AA13 AA16 BA01 CA04 DC08 MA05 MA17 MA23 MA24 MA41 MA55 MA65 MA66 NA15 ZB262 ZC752 4C087 AA01 BC83 MA17 MA23 MA24 MA41 MA55 MA65 MA66 NA15 ZB26 ZC75 4C206 AA01 FA29 MA01 MA05 MA37 MA43 MA44 MA61 MA75 MA85 MA86 NA15 ZB26 ZC75

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】天然形態で、１つ以上のアスパラギン残基を含有し、哺乳動
物細胞中での発現の時にモチーフの一部である前記残基がN連結グリコシル化を
受ける、細菌性カルボキシペプチダーゼ酵素であって、少なくとも１つのアスパ
ラギン残基がセリンに改変され、かつ酵素はカルボキシペプチダーゼ活性を保持
している酵素。
【請求項２】請求項１の細菌性カルボキシペプチダーゼ酵素であって、天
然形態で３つのアスパラギン残基、N末端からC末端方向に番号を付けたAsn(1)、
Asn(2)、およびAsn(3)を含有し、哺乳動物細胞中での発現の時にモチーフの一部
であるこの残基がN連結グリコシル化を受け、Asn(2)がセリンに改変されている
、酵素。
【請求項３】 Asn(1)とAsn(3)がグルタミンに改変されている、請求項２の
細菌性カルボキシペプチダーゼ酵素。
【請求項４】細菌性カルボキシペプチダーゼCPG2である、請求項１から３
のいずれか１項の細菌性カルボキシペプチダーゼ酵素。
【請求項５】天然形態がシュードモナス（Pseudomonas）から得られる、
請求項４の細菌性カルボキシペプチダーゼ酵素。
【請求項６】請求項１から５のいずれか１項に従って改変されている、配
列番号２に示すアミノ酸配列を有する細菌性カルボキシペプチダーゼ酵素CPG2。
【請求項７】 Asn264がセリンに改変されている、請求項６記載の細菌性カ
ルボキシペプチダーゼ酵素。
【請求項８】 Asn264がスレオニンに改変されている、請求項７記載の細菌
性カルボキシペプチダーゼ酵素。
【請求項９】 Asn264とAsn272がグルタミンに改変されている、請求項７ま
たは８記載の細菌性カルボキシペプチダーゼ酵素。
【請求項１０】請求項１から９のいずれか１項に従って改変されている、
配列番号２に示す酵素の変異体、変種、相同体、またはアレルである細菌性カル
ボキシペプチダーゼ。
【請求項１１】請求項１から１０のいずれか１項のカルボキシペプチダー
ゼをコードする核酸配列を含むベクター。
【請求項１２】哺乳動物細胞の表面にカルボキシペプチダーゼの発現を指
令することができるシグナル配列をさらに含む、請求項１１記載のベクター。
【請求項１３】シグナル配列が、膜貫通受容体キナーゼのシグナルペプチ
ドである、請求項１２のベクター。
【請求項１４】 (a) 請求項１から１０のいずれか１項記載の酵素を発現す
ることができるベクター；および (b) 該酵素により活性薬物に変換され得るプロドラッグ、を含む、互いに関連して使用するための２成分系。
【請求項１５】プロドラッグが、ナイトロジェンマスタードプロドラッグ
である、請求項１４の系。
【請求項１６】ベクターは、哺乳動物細胞の表面にカルボキシペプチダー
ゼをターゲティングすることができるシグナルペプチドを含む、請求項１４また
は１５記載の系。
【請求項１７】シグナル配列は膜貫通受容体キナーゼのシグナルペプチド
である、請求項１６記載の系。
【請求項１８】ベクターが、組織限定的に発現され得るプロモーターを含
む、請求項１４から１７のいずれか１項記載の系。
【請求項１９】プロモーターがc-erbB2プロモーターである、請求項１８
記載の系。
【請求項２０】 (a) 請求項１から１０のいずれか１項記載の酵素を発現す
ることができるベクターを含む、腫瘍特異的微生物；および (b) 該酵素により活性薬物に変換され得るプロドラッグ、を含む、互いに関連して使用するための２成分系。
【請求項２１】ヒトまたは動物の体の治療法で使用するための、請求項１
４から２０のいずれか１項記載の系、または請求項１から１３のいずれか１項記
載のカルボキシペプチダーゼ。
【請求項２２】アミド結合を介して-NH-CH(CO₂H) (Z)部分が結合した化合
物から、該部分を除去する方法であって、該化合物に請求項１から１４のいずれ
か１項記載の酵素を接触させて該部分を除去することを特徴とする方法。