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TECHNISCHES GEBIET
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Diese
Erfindung betrifft die Verwendung von Valin als einzige Aminosäure für die Herstellung
einer therapeutischen Zubereitung zur Leberregeneration. Um genauer
zu sein, betrifft die Erfindung Valin enthaltende Zubereitungen,
die Hepatocyten in Fällen
wie nach dem Entfernen der Leber zum Beispiel aufgrund einer Hepatopathie,
Hepatitis oder einer Zirrhose regenerieren können.
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HINTERGRUND DES GEBIETES
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Von
einigen Faktoren und Arzneistoffen ist bekannt, dass sie eine Hepatocyten
regenerierende Wirkung aufweisen. Zum Beispiel beschreibt das Archive
of Pathology, 16, 226–231
(1993), dass, wenn nach einer partiellen Hepatektomie kontinuierlich
Nahrung verabreicht wurde, die 1 Gew.-% eines getrockneten Schilddrüsenpulvers
enthielt, das Gewicht der Leber nach dem siebten Tag der partiellen
Hepatektomie signifikant über
die Kontrolle anstieg.
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Das
Journal of Biological Chemistry, 247, 1757–1766 (1972) berichtet, dass
ein flüssiges
Gemisch von Triiodthyronin (T3), gemischten Aminosäuren in
Lösung,
Glucagon und Heparin eine Synthese von DNA in der Leber verursacht.
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Darüber hinaus
wurde 24 Stunden nach einer 70%-igen partiellen Hepatektomie aus
Rattenseren ein Wachstumsfaktor für Primärkulturen von Hepatocyten in
vollentwickelten Ratten gereinigt und als HGF (Hepatocyten-Wachstumsfaktor)
oder Hepatotropin bezeichnet, wie in Biochemical and Biophysical
Research Communications, 122, 1450–1459 (1984) beschrieben.
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Insulin
und Glucagon sind ebenfalls wichtige Faktoren für die Leberregeneration, wie
in Advances in Enzyme Regulation, 13, 281–293 (1975) beschrieben, und
seitdem Okita et al. in Gastroenterologia Japan, 14, 453 (1979) über die
Anwendung einer Insulin-Glucagon-Therapie bei ausbrechender Hepatitis
berichteten, wurden diese in Japan in klinischen Fällen häufig angewendet.
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Es
wurde berichtet, dass die verzweigtkettigen Aminosäuren Valin,
Isoleucin und Leucin die Fähigkeit besitzen,
Leberenzephalopathie und septische Enzephalopathie zu lindern oder
Proteine während
des Eingriffs zu schonen, und Hepatoamin (eingetragenes Warenzeichen),
Hepan (eingetragenes Warenzeichen), Aminoleban (eingetragenes Warenzeichen),
Amiparen (eingetragenes Warenzeichen), Amizet (eingetragenes Warenzeichen)
und Aminic (eingetragenes Warenzeichen) sind als Aminosäuren in
Lösung
kommerziell erhältlich.
Es ist jedoch völlig
unbekannt, dass Valin eine Hepatocyten regenerierende Wirkung besitzt.
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In
den letzten Jahren wurde der Hepatocyten-Wachstumsfaktor (HGF) aus
Ratten und Menschen gereinigt, gefolgt durch eine erfolgreiche Clonierung
der cDNA, und im Hinblick auf seine Fähigkeit zur Proliferation von
primären
kultivierten Hepatocyten ebenso wie auf die Ergebnisse einer erhöhten HGF-Blutaktivität bei Hepatopathie
und einer induzierten Expression von HGF-mRNA wird erwartet, dass
eine klinische Anwendung von HGF in der Zukunft stattfinden wird,
aber bis heute ist das nicht kommerziell genutzt worden.
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Die
einzige Behandlung, von der gegenwärtig in Japan angenommen wird,
dass sie eine Leber regenerierende Wirkung ausübt, ist die Glucagon-Insulin-Therapie (GI-Therapie).
Die Wirksamkeit dieser Therapie ist jedoch bisher in Europa und
in den Vereinigten Staaten von Amerika nicht anerkannt worden.
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JP 61186320 offenbart eine
Aminosäurezubereitung,
die unter anderem L-Valin
zur Leberregeneration umfasst.
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DE-A
33 02 008 A betrifft Zusammensetzungen zur Leberregeneration, die
unter anderem L-Valin umfassen.
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Nippon
Geka Gakkai Zasshi, Bd. 87, Nr. 1, 1986, S. 49–60 offenbart die Verwendung
von unter anderem Valin zur Leberregeneration.
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Cesko-Slovenska
Gastroenterologie a Vyzina, Bd. 39, Nr. 3, 1985, S. 161–168 offenbart
Aminosäurelösungen,
ergänzt
mit verzweigtkettigen Aminosäuren.
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OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
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Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen Arzneistoff bereitzustellen,
der sicher ist und der eine starke Leber regenerierende Wirkung
bei Lebererkrankungen, was verschiedene Schweregrade der Hepatopathie
einschließt,
ausübt.
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Um
diese Aufgabe zu erfüllen,
wurden intravenös überversorgten
Ratten verschiedene Konzentrationen von Valin verabreicht. Die Auswirkungen
von Valin auf das Gewicht der Leber und die histopathologischen Erkenntnisse
wurden genau analysiert. Als Ergebnis fanden die Erfinder heraus,
dass Valin eine eindeutige Leberregeneration verursachte, was zu
der Vollendung der vorliegenden Erfindung führte.
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Das
in der Erfindung zu verwendende Valin kann kommerziell erhältlich sein
oder synthetisierte Produkte und jegliche Art von Valin können unabhängig von
ihrem Herstellungsverfahren eingesetzt werden. Darüber hinaus
ist jede der D-, L- und DL-Formen
von Valin verwendbar.
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BESTE DURCHFÜHRUNGSART
DER ERFINDUNG
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Wenn
diese erfundene Wirkung von Valin als therapeutisches Mittel zur
Leberregeneration verwendet werden soll, ist es im Allgemeinen bevorzugt,
eine intravenöse
Verabreichung durchzuführen,
aber andere Verabreichungswege wie eine orale und parenterale sind
ebenfalls möglich.
Valin als einzige Aminosäure
kann einzeln als Zubereitung verwendet werden, in der es der einzige
Bestandteil ist, aber vorzugsweise wird es entweder in Kombination
mit einer Zubereitung für
eine Infusion wie ein Hochkalorien-Arzneistoff für eine Infusion oder als Zusatz
zu einer Zubereitung für
eine Infusion verwendet.
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Mögliche Dosierungsformen
für die
Verabreichung schließen
Flüssigkeiten,
Suspensionen, Emulsionen, Tabletten, Kapseln, Granulat, subtilisiertes
Granulat, Stoffteilchen, Pulver und Zäpfchen ein. Um diese Dosierungsformen
herzustellen, werden vorzugsweise pharmazeutisch verträgliche,
flüssige
oder feste, geeignete Hilfsmittel zugegeben, veranschaulicht durch
Excipienten, Füllmittel,
Streckmittel, Lösungsmittel,
Emulgatoren, Gleitmittel, Geruchsverbesserer, Aromastoffe, Färbemittel
und Puffersubstanzen.
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Das
erfindungsgemäße therapeutische
Mittel zur Leberregeneration ist bei Patienten anwendbar, deren
Leber zum Beispiel aufgrund von Hepatitis, Zirrhose und Leberkrebs
entfernt worden ist, und die Dosis seiner Verabreichung hängt von
dem Geschlecht, dem Körperbau,
der Konstitution, dem Alter und den Symptomen des Patienten ab,
ebenso wie von der zu verwendenden Dosierungsform; die Valinkonzentration
wird geeigneterweise ausgewählt
aus dem Bereich von 0,5–5%,
wenn das Medikament als Zubereitung für eine Aminosäureinfusion über periphere
oder zentrale Venen verabreicht werden soll, aus dem Bereich von
1,0–10,0% für den Fall,
dass eine Ampulle einer Zubereitung für eine Infusion zugegeben werden
soll, und aus dem Bereich von 5,0–100% im Fall von Suspensionen,
Emulsionen, Tabletten, Kapseln, Granulat, subtilisiertem Granulat,
Stoffteilchen, Pulvern, Zäpfchen
und anderen Dosierungsformen für
eine orale Verabreichung oder einer Verabreichung über die
Eingeweide.
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Es
sollte angemerkt werden, dass der Prozentsatz der Valinkonzentration
in der Erfindung „Gew./Vol.-%" bedeutet, wenn das
Valin in flüssiger
Form vorliegt, und „Gew./Gew.-%", wenn das Valin
in fester Form vorliegt.
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BEISPIELE
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Die
folgenden Beispiele werden zur weiteren Darstellung der vorliegenden
Erfindung bereitgestellt.
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Beispiel 1
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Wirkung von erhöhtem Valin
auf die Leberregeneration in zu 70% hepatektomisierten Ratten
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Acht
bis neun Wochen alte männliche
Donryu-Ratten mit einem Gewicht von etwa 250 g (5–7 Tiere pro
Gruppe), die mit Äther
narkotisiert wurden, während
ein Katheter eingeführt
wurde und in einer zentralen Vene verblieb, erhielten eine Bauchhöhleneröffnung und
ihnen wurden etwa 70% der Leber entfernt, um zu 70% hepatektomisierte
Modellratten herzustellen. Der Katheter wurde durch einen subkutanen
Tunnel geführt, um
beide Blattknochen zu überspannen,
mit einem Gurt ausgestattet und über
eine Schutzspule mit einem Drehteil verbunden. Die Ratten wurden
in einen metabolischen Käfig überführt, an
die Infusion durch eine Behandlung mit einer Ringer-Laktat-Injektionslösung (LACTEC,
eingetragenes Warenzeichen von Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.)
gewöhnt
und ihnen wurde kontinuierlich für
3 oder 5 Tage eine Hochkalorie-Flüssigkeit zur Infusion (siehe
nachstehend) in einer Menge von 220 kcal/kg/Tag verabreicht, wie
für Nicht-Protein-Kolonien berechnet,
wobei die durch eine Pumpe getriebene Verabreichungsgeschwindigkeit
auf 250 ml/kg/Tag gesetzt wurde: einer 100%- Gruppe (Kontrollgruppe) wurde eine Hochkalorie-Flüssigkeit
zur Infusion verabreicht, die aus einer komplexen 10%-igen Aminosäure-Zubereitung
(MORIPRON, eingetragenes Warenzeichen von Morishita Roussel Co.,
Ltd.), ergänzt
mit Glucose, Elektrolyten, Spurenmetallen und Vitaminen (Valinkonzentration
= 2,25 g/l), bestand; einer 0%-Gruppe wurde die gleiche Flüssigkeit
wie der Kontrolle verabreicht, außer dass sie kein Valin enthielt
(Valinkonzentration = 0 g/l); einer 200%-Gruppe wurde die gleiche
Flüssigkeit
wie der Kontrolle verabreicht, außer dass sie eine zusätzliche
Menge an L-Valin enthielt (Japanese Pharmacopeia) (Valinkonzentration
= 4,50 g/l); und einer 400%-Gruppe wurde die gleiche Flüssigkeit
wie der Kontrolle verabreicht, außer dass sie ebenfalls eine
zusätzliche
Menge an L-Valin enthielt (Japanese Pharmacopeia) (Valinkonzentration
= 9,00 g/l).
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Am
Ende jeder Infusion wurde das Körpergewicht
jedes Tieres gemessen. Nach dem Ausbluten aus der abdominalen Aorta
unter Narkose mit Äther
wurde die Leber entfernt und gewogen. Anschließend wurde eine Probe der Leber
für eine
histopathologische Untersuchung genommen. Das Verhältnis des
Gewichtes der Leber zum Körpergewicht
wurde auf der Basis der Ergebnisse der Messung der Leber- und Körpergewichte bestimmt.
Darüber
hinaus wurde die Leber mit Formalin fixiert und einer Hematoxylin-Eosin-Doppelfärbung unterzogen,
um Proben für
histopathologische Tests herzustellen. Die Ergebnisse der Messungen
wurden durch Mittelwert ± Standardabweichung
(SD) dargestellt und statistisch durch den Student-T-Test ausgewertet,
in dem ein Ergebnis von p < 0,05
als „signifikant
unterschiedlich" angesehen
wurde. Die Daten hinsichtlich des Lebergewichtes und des Verhältnisses
von Leber- zu Körpergewicht
sind in Tabelle 1 dargestellt.
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Nach
der 3-tägigen
Verabreichung betrug das Lebergewicht in der Kontrollgruppe 5,6 ± 0,3 g,
wohingegen die 200%-Gruppe einen Wert von 6,8 ± 0,3 g und die 400%-Gruppe einen Wert
von 7,5 ± 0,3
g ergab, womit beide signifikant (p < 0,01) höher waren; nach der 5-tägigen Verabreichung
zeigte die Kontrollgruppe einen Wert von 6,1 ± 0,3 g, wohingegen die 200%-Gruppe
einen Wert von 7,6 ± 0,3
g und die 400%-Gruppe einen
Wert von 8,6 ± 0,3
g ergab, womit beide signifikant (p < 0,01) höher waren.
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Nach
der 3-tägigen
Verabreichung betrug in der Kontrollgruppe das Verhältnis von
Leber- zu Körpergewicht
2,3 ± 0,2%,
wohingegen die 200%-Gruppe einen Wert von 2,6 ± 0,2% ergab, welcher signifikant
(p < 0,05) höher war,
und die 400%-Gruppe einen Wert von 2,9 ± 0,1% ergab, welcher ebenfalls
signifikant (p < 0,01)
höher war;
nach der 5-tägigen
Verabreichung zeigte die Kontrollgruppe einen Wert von 2,3 ± 0,1%,
wohingegen die 200%-Gruppe einen Wert von 2,9 ± 0,2% und die 400%-Gruppe einen Wert
von 3,1 ± 0,1%
ergab, womit beide signifikant (p < 0,01)
höher waren.
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Bei
der histopathologischen Untersuchung der Leber war in der 0%-Gruppe
die Ausweitung des Glycogenfeldes und die Bildung von Vakuolen in
Hepatocyten signifikant; keiner der Fälle in den anderen Gruppen wies
jedoch irgendwelche erkennbaren Abnormalitäten auf und alle von ihnen
zeigten ein normales morphologisches Bild.
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Beispiel 2
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Wirkung von Valin auf
das Wachstum von Pro-Fettzellen
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Pro-Fettzellen,
die von der Haut von weiblichen C3H-Mäusen stammten, wurden verwendet,
um die Wirkung von Valin auf das Zellwachstum zu untersuchen. Die
Pro-Fettzellen wurden in Flachbodenplatten mit 96 Vertiefungen in
einer Konzentration von 1 × 104 Zellen/Vertiefung oder 2,5 × 104 Zellen/Vertiefung kultiviert, wobei die
Valinkonzentration mit 80 mg/l, 160 mg/l oder 320 mg/l variiert
wurde. Nach der Impulsmarkierung mit 3H-Thymidin
wurde die Thymidinaufnahme mit einem Szintillationszähler gemessen.
Das Kulturmedium war RPMI 1640. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2
gezeigt.
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Wie
aus Tabelle 2 ersichtlich, erhöht
sich die Thymidinaufnahme mit steigender Valinkonzentration.
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Beispiel 3
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Wirkung von Valin auf
das Wachstum von primären
kultivierten Hepatocyten
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Acht
bis neun Wochen alte männliche
Donryu-Ratten mit einem Gewicht von etwa 250 g wurde unter Narkose
mit Äther
durch die Bauchdecke aufgeschnitten, um 70% der Leber zu entfernen.
Drei Tage später wurde
die Leber der betäubten
Ratten mit Collagen durchgespült
und die freigesetzten Hepatocyten wurden gewonnen. Die Hepatocyten
wurden auf collagenbeschichteten Flachbodenplatten mit 92 Vertiefungen
in einer Konzentration von 2 × 104 Zellen/Vertiefung angeimpft. Die Valinkonzentration
wurde auf 50 mg/l, 100 mg/l oder 200 mg/l gesetzt und nach einer
36-stündigen
Kultivierung wurde mit 3H-Thymidin impulsmarkiert
und die Thymidinaufnahme wurde mit einem Szintillationszähler gemessen.
Das Kulturmedium war Williams-Medium E, welches mit 10% FCS, 10–6 M
Dexamethason und 10–7 M Insulin ergänzt wurde.
Die Daten hinsichtlich der Thymidinaufnahme sind in Tabelle 3 gezeigt.
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Wie
aus Tabelle 3 ersichtlich, erhöht
sich die Thymidinaufnahme der primär kultivierten Hepatocyten mit
steigender Valinkonzentration, was die Wirksamkeit von Valin auf
das Wachstum von kultivierten Hepatocyten zeigt.
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INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
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Das
erfindungsgemäße therapeutische
Mittel zur Leberregeneration ist bei einer Hepatopathie bei Hepatitis,
Fettleber und durch Arzneistoffe induzierten Leberstörungen wirksam,
indem es die Leberregeneration fördert
und die normalen Leberfunktionen wiederherstellt. Es kann auch eine
frühe Leberregeneration
induzieren, um dadurch eine schnelle postoperative Genesung von
Patienten zu erreichen, die zum Beispiel aufgrund von Gallenblasenkrebs,
Leberkrebs und metastasierendem Leberkrebs hepatektomisiert wurden.
Diese Wirkungen des therapeutischen Mittels werden weiter verstärkt, wenn
es in Kombination mit Hochkalorie-Flüssigkeiten für Infusionen
verwendet wird, und sogar bei hepatektomisierten Patienten, die
an chronischer Hepatitis oder Zirrhose leiden, erreicht das Mittel
eine schnelle Leberregeneration, um dadurch sichere Operationen
und eine schnelle postoperative Genesung zu ermöglichen.
