DE69531302T2

DE69531302T2 - Zellsystem mit einer spezifischen wechselwirkung von peptid-bindenden paaren

Info

Publication number: DE69531302T2
Application number: DE69531302T
Authority: DE
Inventors: H. Kathleen YOUNG; A. Bradley OZENBERGER
Original assignee: Wyeth Holdings LLC; Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth Holdings LLC; Wyeth LLC
Priority date: 1994-06-14
Filing date: 1995-05-31
Publication date: 2004-04-22
Anticipated expiration: 2015-06-01
Also published as: SI9520073B; WO1995034646A1; GEP20022619B; AU2606695A; EP0765389B1; LT97004A; US6284519B1; EP0765389A1; IL114118A0; PT765389E; LV11906A; DE69531302D1; US6251602B1; RU2208646C2; ZA954892B; ATE245189T1; NZ287372A; AU706173B2; LT4230B; US5989808A

Description

Bereich der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Zellen, welche heterologe Fusionsproteine exprimieren, und Verfahren zum Screenen für Verbindungen mit Peptidbindungswirksamkeit; wobei die Verfahren die neuartigen Zellen dieser Erfindung einsetzen.
Hintergrund der Erfindung
Die spezifische Bindung eines Paares von Peptiden aneinander löst eine beträchtliche Anzahl an Funktionen in einer lebenden Zelle aus. Zum Beispiel dient die spezifische Bindung eines Ligands an einen Oberflächenrezeptor als Auslöser für zelluläre Responses auf viele äußere Signale. In Säugetieren reagieren Zellen auf eine große Vielfalt an zirkulierenden Peptidhormonen, häufig durch einzelne Transmembrandomänenrezeptoren. Es ist bestimmt anerkannt, dass die Zytokinrezeptor-Überfamilie die unterschiedlichen Aspekte zellulärer Funktion und physiologische Responses veranschaulichen. Kürzliche Untersuchungen von Zytokinrezeptorfunktion haben differierende Ligand-Rezeptorprotein-Stöchiometrien enthüllt, einschließlich sowohl 2-Protein (Ligand/Rezeptor) (Cunningham et al., 1991; Staten et al., 1993), als auch 3-Protein (Ligand/Rezeptor/Rezeptor oder Ligand/Rezeptor/Transducer) Interaktionen (Young, 1992; Taga und Kishimoto, 1992; Mui und Miyajima, 1994). Die Kompliziertheiten solcher Proteinassoziationen sind unter Verwendung von häufig arbeitsaufwendigen in vitro Verfahren untersucht worden (Fuh et al., 1992; 1993; Davis et al., 1993), da genetisch verformbare Expressionssysteme nicht verfügbar gewesen sind. Die vorliegende Erfindung richtet sich auf neuartige, modifizierte Wirtsysteme, welche für solche Proteinuntersuchungen verwendet werden können, wobei die neuartigen Systeme außerdem deutlich weniger arbeitsaufwendig sind.
Systeme, von denen kürzlich nach Stand der Technik berichtet wurde, betreffen ein „2-Hybrid"-System, wie durch Fields und Song, 1989 und auch Chein et al., 1991 diskutiert. Das „2-Hybrid"-System bezieht unterschiedliche Interaktionen zwischen den trennbaren DNA-Bindungs- und Aktivierungsdomänen des transkriptionalen Aktivators von Hefe, Gal4 ein. Heterologe Proteine werden als Hybridproteine exprimiert, welche an eine der Hälften von Gal4 fusioniert sind (siehe 1; Fields und Song, 1989; Chein et al., 1991 zur Diskussion des 2-Hybrid-System). Die pro duktive Interaktion der heterologen Proteine bringt die beiden Hälften des Gal4-Proteins in unmittelbare Nähe, was Expression eines bewertbaren Reportergens aktiviert. Bis jetzt sind solche 2-Hybrid-Systeme als brauchbar zum Bestimmen offenbart worden, ob eine erste gegebene Testpeptidsequenz eine Bindungsaktivität für die bekannte Sequenz eines zweiten Peptids hat; wobei die Affinität des Testpeptids für das bekannte Peptid unbekannt ist. Studien, welche solch ein System verwenden, sind darauf gerichtet worden, intrazelluläre Proteine wie Transkriptionsfaktoren und Kinase-Zielproteininteraktionen zu analysieren (Yang et al., 1992; Durfee et al., 1993; Li et al., 1994).
Die modifizierten Zellen dieser Erfindung und neuartigen Verfahren, welche diese Zellen einschließen, sehen einen signifikanten Fortschritt für die Untersuchung und Entdeckung von Peptid-Nachbildungen vor, einschließlich Ligand-Nachbildungen und Rezeptor-Nachbildungen. Zu diesem Zeitpunkt hat niemand ein effizientes und spezifisches Screeningsystem zum Erforschen dieser Bereiche entwickelt. Durch Einsetzen eines Peptidbindungspaares in die Zelle, für welches die Bindungsaffinität bekannt ist, erlaubt die vorliegende Erfindung die Erforschung von Peptidbindungspaaren, wie einem Ligand und Rezeptor, wobei die Peptide durch extrazelluläre Interaktionen binden. Die vorliegende Erfindung erzeugt exponentielle Vorteile für die Entdeckung von Verbindungen, welche als Liganden für spezifische Rezeptoren oder Transducer interagieren können. Potentielle Liganden schließen ein, aber sind nicht begrenzt auf Säugetierhormone, wobei der Rezeptor ein verwandtes extrazelluläres Ligand-Bindungspeptid ist. Ferner beschreibt die vorliegende Erfindung die Verwendung von Zellsystemen, welche multiple, heterologe Proteine exprimieren, einschließlich der zwei heterologen Fusionsproteine, um die spezifische und umkehrbare Bindung des Ligands und Rezeptors zu begründen. Die spezifische Interaktion der oben beschriebenen Bindung wird leicht durch eine messbare Veränderung im zellulären Phenotyp nachgewiesen, z. B. Wachstum an selektivem Medium.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft modifizierte Wirtszellen zur Expression von heterologen Fusionsproteinen. Die neuartigen modifizierten Wirtszellen umfassen:

a) eine Gensequenz, welche für ein heterologes Fusionsprotein kodiert; wobei besagtes Fusionsprotein ein erstes Peptid von einem Peptidbindungspaar oder ein Segment von besagtem ersten Peptid umfasst, welches entweder mit einer DNA-Bindungsdomäne oder ihrer entsprechenden Transkriptions-Aktivierungsdomäne eines transkriptionalen Aktivierungsproteins verbunden ist;
b) eine Gensequenz, welches für ein heterologes Fusionsprotein kodiert, wobei besagtes Fusionsprotein ein zweites Peptid des Peptidbindungspaares in (a) oder ein Segment von besagtem zweiten Peptid umfasst, welches entweder an eine DNA-Bindungsdomäne oder ihre entsprechende Transkriptions-Aktivierungsdomäne fusioniert ist, je nachdem, welche nicht in (a) eingesetzt ist;
c) ein Reportergen, welches operativ mit dem transkriptionalen Aktivierungsprotein assoziiert ist, oder ein Teil davon;
d) gegebenenfalls eine Deletion oder Mutation in der chromosomalen DNA der Wirtszelle für das transkriptionale Aktivierungsprotein, falls in der Wirtszelle vorhanden; wobei besagte Wirtszelle in der Lage ist, mindestens zwei heterologe Fusionsproteine und mindestens ein Reportergen zu exprimieren, und wobei die Peptide des Peptidbindungspaares durch extrazelluläre Aktivität in ihrer natürlichen Umgebung miteinander interagieren.

Diese modifizierten Wirtszellen der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um die Interaktion einer Testprobe mit einem ausgewählten Peptid eines Peptidbindungspaares zu bestimmen, z. B. kann die Zelle verwendet werden, um die Interaktion einer Testprobe mit ausgewähltem Ligand oder Rezeptor zu bestimmen.
Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft neuartige modifizierte Zellen und Screening-Verfahren, welche die Interaktion einer Testprobe mit einem gewählten Peptid und Rezeptor durch eine erkennbare Veränderung im Phenotyp anzeigen. Diese Zelle weist die Veränderung im Phenotyp nur in Gegenwart von Testverbindung mit Bindungsaffinität für ein Peptid des Peptidbindungspaares auf, z. B. Bindungsaffinität für einen Ligand oder seinen Rezeptor.
Ein dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft neuartige Zellen und Screening-Verfahren, welche es erlauben zu be stimmen, an welches Peptid eines Peptidbindungspaares eine Testprobe bindet.
Ein vierter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft neuartige Zellen, welche drei oder mehr heterologe Bestandteile für die Untersuchung von Multiprotein-Assoziierungen höherer Ordnung zwischen drei oder mehreren Peptiden exprimieren (z. B. wie die Untersuchung von Ligand-abhängiger Dimerisation).
Definierte Begriffe:
Der Begriff Peptidbindungspaar betrifft jedes Paar von Peptiden mit einer bekannten Bindungsaffinität, für welche die DNA-Sequenz bekannt ist oder abgeleitet werden kann. Die Peptide des Peptidbindungspaares müssen bevorzugte Bindung für einander über jedem Bestandteil der modifizierten Zelle aufweisen.
Der Begriff Peptid, wie in der obigen Zusammenfassung und hierin verwendet, meint jedes Peptid, Polypeptid oder Protein, sofern nicht anders angegeben. Wie oben erwähnt können die Peptide eines Peptidbindungspaares ein Ligand und sein entsprechender Rezeptor oder ein Ligand und jedes Peptid mit einer bekannten Bindungsaffinität für den Ligand sein.
Heterolog, wie in der obigen Zusammenfassung und hierin verwendet, meint Peptide, welche (1) nicht durch die natürlich auftretende Wirtszelle exprimiert werden oder (2) durch die modifizierte Wirtszelle durch ein anderes Expressionsverfahren exprimiert werden, als das Expressionsverfahren, durch welches die Wirtszelle normalerweise das Peptid exprimieren würde.
Sofern nicht anders spezifiziert, umfasst der Begriff Rezeptor, wie hierin verwendet, die Begriffe Rezeptor_r, löslicher Rezeptor, Transducer und Bindungsprotein. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist der eingesetzte Rezeptor ein Rezeptor oder löslicher Rezeptor, wobei Rezeptor eher bevorzugt wird.
Rezeptor_r, wie hierin verwendet, meint Plasmamembranproteine, die spezifische Moleküle binden, wie Wachstumsfaktoren, Hormone oder Neurotransmitter, und dann ein Signal ins Zellinnere senden, das eine Zelle veranlasst, auf eine spezifische Weise zu reagieren. Dies schließt einzelne Transmembranproteine ein.
Löslicher Rezeptor meint die nicht-transmembrane Form eines Rezeptors, welcher in der Lage ist, an Ligand zu binden. Dies sind Rezeptoren, welche entweder durch Proteolyse oder durch alternativ gespleißte mRNA freigesetzt werden.
Bindungsprotein meint Proteine, die Bindungsaffinität für spezifischen Ligand zeigen. Bindungsproteine können von getrennten und unterschiedlichen Genen produziert werden. Für einen gegebenen Ligand sind die Bindungsproteine, die von spezifischen Genen produziert werden, verschieden von der Ligand-Bindungsdomäne des Rezeptors oder seines löslichen Rezeptors.
Transducer mein ein Molekül, dass die Umwandlung von einer Art Signal in ein anderes erlaubt und das Molekül wird als Transducer für ein oder mehrere Peptide eines Peptidbindungspaares leicht erkannt, z. B. ein Transducer für eine Ligand/Rezeptorgruppe.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1. ist ein schematisches Diagramm einer Zelle, welche von getrennten Plasmiden zwei heterologe Fusionsproteine exprimiert (wobei eines der an die Aktivierungsdomäne eines transkriptionalen Aktivierungsproteins fusionierter Ligand ist und das andere Fusionsprotein ein an die DNA-Bindungsdomäne des transkriptionalen Aktivierungsproteins fusionierter Rezeptor ist). Die Figur zeigt die Expression der zwei Fusionsproteine und die Bindung des Ligands und Rezeptors, welche die Bindungsdomäne und Aktivierungsdomäne zusammenbringt, wobei das transkriptionale Aktivierungsprotein rekonstituiert wird. Sobald das transkriptionale Aktivierungsprotein rekonstituiert und durch die DNA-Bindungsdomäne an der Upstream Activation Sequences (UAS) Stelle verankert ist, wird die Transkription des Reportergens (HIS3) begonnen.
2. enthält Photographien von Schalen, welche die Ergebnisse der Wachstumsversuche zeigen, welche in Beispiel 1 für die Stämme CY722, CY723, CY724 und CY781 an nicht-selektivem Medium und selektivem Medium, Photographien A bzw. B, durchgeführt wurden.
3. ist ein schematisches Diagramm eines Dimermodells, in welchem der Ligand an ein duales Rezeptorsystem bindet. Das schematische Diagramm stellt eine Zelle dar, welches Proteine von drei getrennten Plasmiden exprimiert. Zwei heterologe Fusionsproteine (wobei ein Fusionsprotein ein erster Rezeptor ist, welcher an die Aktivierungsdomäne eines transkriptionalen Aktivierungsproteins fusioniert ist und das andere Fusionsprotein ein zweiter Rezeptor ist, welcher an die DNA-Bindungsdomäne des transkriptionalen Aktivierungsproteins fusioniert ist) werden exprimiert und freier Ligand (also Ligand, welcher an keine der zwei Domänen des transkriptionalen Aktivierungsproteins fusioniert ist) wird von einem dritten Plasmid exprimiert. Die Figur zeigt die Expression der zwei Fusionsproteine und die Bindung des freien Ligand und zwei Rezeptorfusionen, welche die Bindungsdomäne und Aktivierungsdomäne zusammenbringen und somit das transkriptionale Aktivierungsprotein rekonstituieren. Sobald das transkriptionierte Aktivierungsprotein rekonstituiert und durch die DNA-Bindungsdomäne an der Upstream Activation Sequences (UAS) Stelle verankert ist, wird die Transkription des Reportergens (HIS3) begonnen.
4. ist eine Photographie der Wachstumsschale, welche für die Stämme CY846 und CY847 von Beispiel 3 erhalten wird, welche Ligand-abhängige Stimulation von Rezeptordimerisation zeigt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Zelle dieser Erfindung setzt eine Wirtszelle ein. Eine effektive Wirtszelle zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung erfordert lediglich, dass sie genetisch definiert ist, um die passende Expression von heterologen Fusionsproteinen, Reporter(n) und andere gewünschte genetische Manipulationen auszuführen. Die Wirtszelle kann jede eukariontische Zelle, vertebrat oder nicht-vertebrat sein. Die Wirtszelle kann eine Säugetierzelle sein. In bevorzugteren Ausführungsformen ist die Wirtszelle eine Hefezelle. In alternativ bevorzugten Ausführungsformen ist die Hefezelle Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe oder Pichia pastoris.
Die Wirtszelle setzt mindestens zwei Gene zum getrennten Exprimieren der zwei heterologen Fusionsproteine ein. Eines dieser Fusionsproteine umfasst ein erstes Peptid eines Peptidbindungspaares, oder Segment von besagtem ersten Peptid, welches an entweder eine DNA-Bindungsdomäne oder seine entsprechende transkriptionale Aktivierungsdomäne eines transkriptionalen Aktivierungsproteins gebunden ist. Ein zweites Fusionsprotein um fasst das zweite Peptid des Peptidbindungspaares oder ein Segment davon. Das zweite Peptid wird an entweder eine DNA-Bindungsdomäne oder seine entsprechende transkriptionale Aktivierungsdomäne fusioniert, je nachdem welche nicht in dem ersten heterologen Fusionsprotein eingesetzt wird. Die Wirkung der Bindung zwischen den Peptiden der Peptidbindungspaare wird durch die Verwendung eines Reportergens überwacht, welches mit dem transkriptionalen Aktivierungsprotein, welches in den zwei Fusionsproteinen eingesetzt wird, operativ assoziiert ist.
Das transkriptionale Aktivierungsprotein kann stark variieren, solange die DNA-Bindungsdomänen und die Aktivierungsdomänen bekannt sind oder durch verfügbare wissenschaftliche Verfahren abgeleitet werden können. Das transkriptionale Aktivierungsprotein kann jedes Protein mit zwei Komponenten sein, einer DNA-Bindungskomponente und einer Aktivierungskomponente, wobei das transkriptionale Aktivierungsprotein eine saure Alpha-Helix für die Aktivierung von Transkription enthält. Vorzugsweise wird das transkriptionale Aktivierungsprotein ausgewählt aus Gal4, Gen4, Hap1, Adrl, Swi5, Ste12, Mcml, Yapl, Ace1, Pprl, Arg81, Lac9, Qa1F, VP16, LexA, Nicht-Säugetier-Nuklearrezeptoren (z. B. Ecdysone) oder Säugetier-Nuklearrezeptoren (z. B. Östrogen, Androgene, Glukokortikoide, Mineralokortikoide, Retinolsäure und Progesteron; siehe ebenfalls Picard et al., 1990). Vorzugsweise ist das transkriptionale Aktivierungsprotein ein Hefeprotein und bevorzugter wird das transkriptionale Hefeprotein ausgewählt aus Gal4, Gcn4, lac9 oder Adrl. Es wird angemerkt, dass jedes DNA-Bindungsprotein verwendet werden kann, welches mit einer Aktivierungsdomäne funktioniert. Ein DNA-Bindungsprotein kann für die DNA-Bindungsdomäne eines transkriptionalen Aktivierungsproteins substituiert werden, falls die Erkennungssequenzen, welche mit dem Reportergen operativ assoziiert sind, entsprechend konstruiert sind. Veranschaulichende Nicht-Hefe DNA-Bindungsproteine sind Säugetier-Steroidrezeptoren und bakterielle LexA (siehe Wilson et al., 1990).
Das Reportergen wird allgemein ausgewählt, damit die Bindung der Domänen des transkriptionalen Aktivierungsproteins durch gut bekannte und unkomplizierte Techniken überwacht werden kann. Vorzugsweise wird das Reportergen basierend auf den Kosten, Leichtigkeit der Aktivitätsmessung und niedrigem Hintergrund ge wählt (also die Aktivität kann bei relativ geringen Expressionsgraden des Reportergens aufgrund eines hohen Signal zu Hindergrund Verhältnisses und/oder einer relativ niedrigen oder keiner nicht-herbeigeführten Aktivität bestimmt werden). Das Reportergen kann jeder Reporter sein, für welchen seine Wirksamkeit durch erhältliche Mittel nachgewiesen werden kann. Veranschaulichend für Reporter, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind Reportergene, ausgewählt aus der Gruppe von:

a) lacZ, Luciferase-Gen, grün fluoreszierendem Proteingen, CAT
b) Genen zum Komplementieren von Auxotrophien, wie HIS, URA, LEU, ARG, MET, ADE, LYS, TRP.
c) Genen zum Verleihen von antibiotischer Resistenz, wie neo^r, KAN,
d) Genen zum Verleihen von Empfindlichkeit gegenüber einer Chemikalie, wie CYH2, CAN1 (Canavin-Resittenz). In vielen Ausführungsformen kann es für das Reportergen zweckdienlich sein, Wachstum zu verhindern (CYH2). Vorzugsweise wird die Aktivität des Reportergens durch kolorimetrische oder fluoreszierende Verfahren und/oder durch Messen des Wachstums der Hefezelle angezeigt.

Wie vorher angemerkt, ist das in der modifizierten Zelle eingesetzte Peptid ein Peptid eines Peptidbindungspaares, für welches die DNA-Sequenz bekannt ist, als auch die Sequenz des zweiten Peptids des Bindungspaares. Die Peptide können auch Peptide eines Peptidbindungskomplexes sein, welcher zwei oder mehr Peptide enthält, welche aneinander binden, um den Bindungskomplex zu bilden. Die Peptide des Peptidbindungspaares können ein spezifischer Ligand und ein entsprechender Rezeptor oder alle anderen Peptide sein, welche bevorzugt aneinander binden, wie Untereinheiten eines Enzyms.
Einer der signifikanten Vorteile dieser Erfindung ist die Entdeckung, dass die Zelle, welche die DNA-Bindung und Aktivierungsdomänen eines transkriptionalen Proteins einsetzt, verwendet werden kann, um die Bindung von Peptiden eines Peptidbin-dungspaares zu überwachen, welche durch extrazelluläre Interaktion binden. Gewiss können, falls gewünscht, Peptide, welche durch intrazelluläre Interaktion binden, auch in jeder der neuartigen modifizierten Zellen und Verfahren dieser Erfindung eingesetzt werden. Das Peptid kann von einer Säugetierzelle oder Nicht-Säugetrierzelle sein. Eine der wichtigsten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betrifft die Anwendung der neuartigen, modifizierten Zellen und entsprechender Screening-Verfahren dieser Erfindung zum Untersuchen zahlreicher Säugetierpeptid-Interaktionen. Die Säugetierpeptide schließen Säugetier-Ligand/Rezeptor-Interaktionen ein, wie Hormon/Rezeptor-Interaktionen.
Veranschaulichend für Peptidhormone, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind Peptide, ausgewählt aus, aber nicht beschränkt auf eine der folgenden Gruppen: (a) die Gruppe bestehend aus Zytokinen, Interleukinen, hämatopoietischen Wachstumsfaktoren, Insulin, Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren, Wachstumshormon, Prolaktin, Interferonen und Wachstumsfaktoren; (b) Liganden für G-Protein gekoppelte Rezeptoren; (c) Liganden für Nicht-Vertebraten-Rezeptoren; (d) Liganden für Guanylylcyclase-Rezeptoren; (e) Liganden für Tyrosinphosphatase-Rezeptoren.
In einer alternativen Ausführungsform ist das Peptid ein Wachstumsfaktor, ausgewählt aus epidermalem GF, Nerven-GF, Leukämie-Hemmungsfaktor, Fibroblast-GF, von Plättchen hergeleitetem GF, vaskulär-endothelialem GF, Tumornekrosefaktor, Onkostatin M, ziliar-neurotrophem Faktor, Erythropoietin, Steel-Faktor, Plazenta-Lactogen und transformierendem GFβ.
In verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen ist das Peptidhormon ein Ligand für einen G-Protein gekoppelten Rezeptor, wie ein Wachstumshormonabgabefaktor, Sekretin, vasoaktives Inhibitorprotein, Glucagon, Thyrotropin, Interleukin-8, Luteinisierungshormon (LH) und Follikelstimulationshormon (FSH).
In zusätzlichen alternativen Ausführungsformen ist das eingesetzte Peptid ein Nicht-Vertebraten-Peptid, wie jene, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pflanzen-Systemin und Insekten-Differentiationspeptiden. Jedoch wird in bevorzugten Ausführungsformen das Peptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Säugetierpeptiden und bevorzugterweise Säugetierpeptidhormonen.
Es wird ebenfalls angemerkt, dass spezifische Typen von Rezeptoren ebenfalls ein Peptid eines Peptidbindungspaares oder Peptidbindungskomplexes sein können. Veranschaulichend für verschiedene Rezeptoren sind jene, welche aus einer der folgenden Gruppen ausgewählt werden: (a) ein Zelladhäsionsmolekül; (b) ein immun-modulatorisches, Antigen-Erkennungs- oder Präsentationsmolekül oder andere verwandte Peptide. Veranschaulichend für Zelladhäsionsmoleküle sind ICAM, VCAM, ECAM, Fibronektin, Integrin, Selektin und Fibrinogen. Veranschaulichend für immun-modulatorische, Antigen-Erkennungs- oder Präsentationsmoleküle sind T-Zellen-Rezeptorkomplex, B-Zellen-Rezeptorkomplex, Fc-Rezeptoren, Haupt-Histokompatibilitätskomplex I, Haupt-Histokompatibilitätskomplex II, CD4, CD8, CD27, CD30, MAC-Komplex.
Es wird ebenfalls angemerkt, dass spezifische Transducertypen ebenfalls als Peptid eines Peptidbindungspaares oder Peptidbindungskomplexes verwendet werden können. Die eingesetzten Transducer-Proteine können jedes Transducer-Protein sein, welches mindestens eines der Peptide des Peptidbindungspaares oder Peptidbindungskomplexes bindet. Transducer-Proteine schließen gp130, kh97, AIC2A, AIC2B ein.
Mindestens eines der heterologen Fusionsproteine kann durch Transformation einer Hefezelle mit einem autonom-replizierenden Plasmid exprimiert werden, welches in der Lage ist, das Fusionsprotein zu exprimieren; oder vorzugsweise werden die heterologen Fusionsproteine durch Transformation einer Hefezelle mit einem autonom-replizierenden Plasmid exprimiert, welches in der Lage ist, das Fusionsprotein zu exprimieren, obwohl sie durch chromosomale Modifikation exprimiert werden können.
Wie angemerkt sind die Screening-Verfahren dieser Erfindung bestimmt, um die Fähigkeit einer Testprobe nachzuweisen, die Bindung eines Peptidbindungspaares zu beeinflussen, z. B. Ligand-Rezeptor-Interaktion. Grundsätzlich umfasst das Verfahren Bestimmten der Aktivität des Reportergens bei Zugeben einer Testprobe zu einer modifizierten Wirtszelle der vorliegenden Erfindung unter Bedingungen, welche geeignet sind, um die Aktivität in der Gegenwart einer Probe nachzuweisen, oder unter einer Bedingung, für welche die modifizierte Wirtszelle solche Aktivität nur in Gegenwart einer Probe mit Bindungsinteraktion mit dem Peptidbindungspaares exhibiert. Vorzugsweise wird die Aktivität des Reportergens durch Messen einer Veränderung im gewählten Phenotyp bestimmt, welche mit der Aktivität des Reportergens direkt korreliert.
Die neuartigen modifizierten Zellen dieser Erfindung werden in verschiedenen Screening-Modellen zum Bestimmen der Bindungsfähigkeit einer Testprobe leicht angewendet. Die Testprobe kann ein Peptid sein, welches vorzugsweise etwa zwei Aminosäuren in der Länge oder eine chemische Nicht-Peptid Verbindung ist. Die Nicht-Peptid Testprobe schließt Verbindungen, Komplexe und Salze, als auch natürliche Produktproben ein, wie Pflanzenextrakte und Materialien, welche aus Fermentationsbrühen erhalten werden. Die modifizierten Wirtszellen werden unter geeigneten Bedingungen für das Wachstum kultiviert, um die Interaktion einer Testprobe auf die Bindungsinteraktion des Peptidbindungspaares zu untersuchen. Die modifizierten Wirtszellen werden in ein Wachstumsmedium platziert, welches vorzugsweise Agar enthält, wobei die Testprobe auf die Oberfläche des Wachstumsmediums aufgetragen wird. Das Wachstumsmedium ist vorzugsweise ein herkömmliches flüssiges Medium aus Wachstumsreagenzien und Wasser, wie synthetisches Hefemedium (YSM, erhältlich von BIO101) (siehe auch Rose et al., Methods in Yeast Genetics, 1990).
Eine der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung richtet sich auf eine Wirtszelle und ein Screening-Verfahren, welches die Interaktion einer Testverbindung mit einem gewählten Peptidbindungspaar durch eine erkennbare Veränderung im Phenotyp anzeigt. Diese modifizierte Wirtszelle exhibiert die Veränderung im Phenotyp nur in Gegenwart von Testverbindung mit Bindungsaffinität für eines der Peptide des Peptidbindungspaares. Diese Wirtszelle wird hierein als ein „Rescue"-System bezeichnet. Normalerweise wird eine Zellresponse exhibiert, wenn die zwei Domänen des transkriptionalen Aktivitätsproteins interagieren. In einem Restcue-System findet eine positive Indikation von Veränderung im Phenotyp jedoch nicht statt, wenn die zwei Domänen des transkriptionalen Aktivierungsproteins interagieren. Eine positive Indikation von Veränderung in dem Phenotyp findet nur statt, wenn eine Testprobe die Interaktion der zwei Domänen des transkriptionalen Aktivierungsproteins unterbricht. In einem Rescue-System ist eine modifizierte Wirtszelle in der Lage, mindestens zwei heterologe Fusionsproteine zu exprimieren. Ferner umfasst die Wirtzellle: ein Reportergen, welches mit dem transkriptionalen Aktivierungsprotein operativ assoziiert ist; wobei besagtes Reportergen die Exhibierung eines spezifischen Phenotyps an einem selektiven Medium aufgrund der Expression des transkriptionalen Aktivierungsproteins oder eines Teils davon verhindert. Eine Mutation in der chromosomalen DNA der Wirtszelle erlaubt die Umkehrung des nachweisbaren Phenotyps am selektiven Medium in Abwesenheit von Expression des Reportergens. Falls erforderlich gibt es eine Deletion oder Mutation in der chromosomalen DNA der Wirtszelle für ein transkriptionales Aktivierungsprotein, damit transkriptionale Aktivierung nur bei produktiver Interaktion des gewählten Bindungspaares auftritt. Nur wenn eine Testprobe die Interaktion der zwei Domänen des transkriptionalen Aktivierungsproteins unterbricht, wird die modifizierte Zelle wachsen oder überleben, oder einen anderen gewählten Phenotyp exhibieren. Vorzugsweise entspricht der Phenotyp dem Wachstum der Zelle.
Sobald ein Screeningverfahren, wie oben diskutiert, verwendet wird, um zu bestimmten, ob eine Testprobe mit der in Abwesenheit einer Testprobe beobachteten Peptidbindung interagiert oder diese eher unterbricht, wird ein sekundärer Screen eingesetzt, um die spezifische Bindungsaffinität der Testprobe zu bestimmen, also an welches Peptid des Peptidbindungspaares die Testprobe bindet. Die sekundären Screens setzten die neuartigen Zellen dieser Erfindung ein, wobei Zellen adaptiert sind, um einen Phenotyp oder phenotypische Veränderung nur in Gegenwart einer Testprobe zu exhibieren, welche ein Peptid des Peptidbindungspaares bindet. Eines der bevorzugten Verfahren zum Bestimmen der spezifischen Bindungsmerkmale der Testprobe bezieht Einsetzen von Zellen ein, welche eine effektive (relativ hohe) Kopiezahl von jedem Fusionsprotein enthalten, welches eines der Peptide enthält. Eine effektive Kopiezahl ist jede Kopiezahl, welche ausreichend ist, um Bestimmung der spezifischen Bindung der Testverbindung zu ermöglichen. Vorzugsweise ist die Gen-Kopiezahl mindestens etwa 5 und reicht vorzugsweise von etwa 5 bis etwa 50, wobei die höheren Kopiezahlen am meisten bevorzugt werden. Das andere Fusionsprotein wird bei einer relativ niedrigen (1 bis etwa 2 Kopien pro Zelle) durch entweder Integration in ein Zellchromosom oder durch Nutzen chromosomaler zentrometrischer Sequenzen am Expressionsplasmid gehalten. Falls eine hohe Kopiezahl eines ersten Peptids in einer Zelle dieser Erfindung verwendet wird, wird die Zelle empfindlicher gegenüber der Gegenwart der Testprobe sein, welche das zweite Peptid des Peptidbindungspaares bindet, da die beschränkende Menge des zweiten Peptids den Grad der Aktivität des Reportergens bestimmt (also die beobachtete Veränderung im Phenotyp). Umgekehrt, falls eine hohe Kopiezahl eines Gens, welches für das zweite Peptid eines Peptidbindungspaares kodiert, verwendet wird, wird die Zelle empfindlicher gegenüber der Gegenwart einer Testprobe sein, welche das erste Peptid bindet, da die einschränkende Menge des zweiten Peptids den Grad der Aktivierung des Reportergens bestimmt (also die beobachtete Veränderung im Phenotyp). Ein direkter Vergleich von Wirkungen einer Testverbindung auf die Phenotypen der zwei Stämme (Rezeptor>>>Ligand versus Ligand>>>Rezeptor) zeigt die spezifische Proteininteraktion der Verbindung. Wie supra diskutiert, werden die Gene, welche die Peptide exprimieren, als auch das Rezeptorgen vorzugsweise durch Transformation der Hefezelle mit einem autonom-replizierenden Plasmid exprimiert.
Eine zusätzliche Wirtszelle dieser Erfindung richtet sich auf Zellen, welche verwendet werden können, um Peptid Liganden zu untersuchen, welche duale Rezeptoren oder einen Rezeptor und einen Transducer zur Aktivierung oder Transmission eines Signals von der Bindung von multiplen Peptidbindungskomponenten, also drei oder mehr Peptidbindungskomponenten einsetzen.
Rezeptordimerisation ist ein kritischer erster Schritt zur Signaltransduktion für bestimmte Klassen von Rezeptoren. Dimere Rezeptorstrukturen können aus identischen Rezeptoreinheiten zusammengesetzt sein (Beispiele: Insulinrezeptoren, IGF-I Rezeptoren, PDGF-Rezeptoren, Kinase-inerter Domänerezeptor (KDR) oder Kolonie stimulierende Faktoren (CSF)-I Rezeptor) oder nicht-identischen Rezeptoreinheiten (Beispiel: IL-6R + gp130; Insulin-IGF-I Hybridrezeptor; LIF + gp130; CNTF + gp130; verschiedene Interferon-Rezeptoren).
Die Komponenten einer modifizierten Wirtszelle zum Überwachen der Bindungsaktivität eines Peptids mit „dualem Rezeptor"-System sind wie folgt: Die Gensequenz (a) ist eine Gensequenz, welche für ein heterologes Fusionsprotein kodiert; wobei besagtes Fusionsprotein ein Peptid eines multiplen Peptidbindungskom plexes oder Segment von besagtem Peptid umfasst, welches an entweder eine DNA-Bindungsdomäne oder seine entsprechende transkriptionale Aktivierungsdomäne eines transkriptionalen Aktivierungsproteins gebunden ist; und die Gensequenz (b) ist eine Gensequenz, welche für ein heterologes Fusionsprotein kodiert; wobei besagtes Fusionsprotein ein zweites Peptid von besagtem multiplen Peptidbindungskomplex oder ein Segment von besagtem Rezeptor umfasst, welches entweder an eine DNA-Bindungsdomäne oder seine entsprechende transkriptionale Aktivierungsdomäne fusioniert ist, je nachdem, welche nicht in (a) eingesetzt ist. Die modifizierte Wirtszelle zum Untersuchen eines multiplen Peptidbindungskomplexes, wie ein duales Rezeptorsystem, umfasst ebenfalls ein paseendes Reportergen und chromosomale Mutationen für spezifische Analyse der Peptid (Ligand/Rezeptor) Interaktion, wie infra diskutiert. Man kann ein drittes Peptid exprimieren (z. B. einen Ligand), um eine Kontrolle für Vergleichs- oder Wettbewerbstests einzurichten.
Wie oben angemerkt, kann man für die Untersuchung von multiplen Bindungspeptidkomplexen, als Proteine höherer Ordnung, welche drei oder mehr Peptide enthalten, tatsächlich die modifizierten Wirtszellen der vorliegenden Erfindung verwenden, um drei oder mehr Peptide zu exprimieren. Im Fall eines Tripeptidbindungskomplexes können zwei der Peptide an die zwei Komponenten des transkriptionalen Aktivierungsproteins fusioniert werden. Zum Beispiel kann man zur Untersuchung der Interaktion eines Ligands, welcher durch Rezeptordimerisation interagiert, die Rezeptoren als Fusionsproteine exprimieren, wobei der Ligand als Nicht-Fusionsprotein exprimiert wird. Dieses Wirtszellensystem kann auch beim Untersuchen von Multiprotein-Enzymkomplexen angewendet werden. Für jeden Multipeptidbindungskomplex kann man neuartige Peptide identifizieren, welche mit dem Komplex durch Exprimieren neuartiger Proteine aus willkürlichen, komplementären DNA-Sequenzen (z. B. einer cDNA Bibliothek) interagieren, welche an eine der Domänen eines transkriptionalen Aktivierungsproteins fusioniert sind. In solch einem System wird eines der bekannten Peptide des Peptidbindungskomplexes an die andere Domäne des transkriptionalen Aktivierungsproteins gebunden, während andere Einheiten des Peptidbindungskomplexes als Nicht-Fusionspeptide exprimiert werden. Es wird ferner vermerkt, dass die Anzahl an Peptiden, welche durch die modifizierte Wirtszelle exprimiert werden, nur durch die erhältlichen Nachweismittel und die Kapazität der Wirtszelle eingeschränkt sein sollten.
Die Screeningverfahren können genutzt werden, um Verbindungen zu identifizieren, welche mit jedem Peptidbindungspaar, also jedem Rezeptor und/oder Ligand interagieren. Auch kann dieses modifizierte Zellsystem mit einem Reportergen, um einen Screen zu erzeugen, auf jede Protein-Protein Interaktion angewendet werden, um neuartige Verbindungen zu entdecken, die diese Interaktion unterbrechen. Als spezifische Beispiele: a) in Krebsen einbezogene Proteinkinasen können in das System insertiert werden, um schnell für neuartige Verbindungen zu screenen, welche die Kinase-Ziel-Interaktion blockieren, und somit als einzigartige Krebstherapeutika dienen können; b) virale Mantelproteine, wie humane Immunschwächevirus-Glykoproteine und entsprechende Zelloberflächen-Rezeptorproteine wie CD₄ können in das System insertiert werden, um schnell nach Verbindungen zu screenen, die diese Interaktion unterbrechen und als Antivirusmittel dienen können; c) die zwei Untereinheiten für das Plasmodium-Ribonukleotid-Reduktaseenzym können in dem System exprimiert werden, um nach Verbindungen zu screenen, welche diese spezifische Proteinassoziation verhindern und somit als neuartige Antimalariawirkstoffe dienen können.
Die folgenden Beispiele werden vorgesehen, um verschiedene Aspekte der vorliegenden Erfindung weiter zu veranschaulichen. Sie sind nicht als die Erfindungen einschränkend anzusehen.
Beispiel 1: Spezifische und umkehrbare Ligand-Rezeptor-Interaktion
Gene, welche für Fusionsproteine kodieren, werden durch Klonen von Wachstumshormon (GH) und Wachstumshormonrezeptor (GHR) cDNA Sequenzen in Plasmide erzeugt, welche die Kodierungsregion für die Domänen von Gal4 enthalten. DNA-bindende Domänen (Gal4) Fusionen werden in pAS2 konstruiert, was in Wade Harper et al. beschrieben wird. Genaktivierungsdomänen (Gal4) Fusionen werden in pACT-II konstruiert, welches mit pACT identisch ist (beschrieben in Durfee et al., 1993), außer mit einer Modifizierung der Polylinker-Region. In die Bgl II Stelle wird die folgende Sequenz zugegeben: Bgl II – Hemagglutinin-Epitop – NdeI – NcoI – SmaI – BamHI – EcoRI – XhoI – Bgl II, wie von der Polylinkersequenz von pAS2 adaptiert (Wade Harper et al., 1993). Die cDNA, welche für das reife Peptid für Schweine-GH kodiert, wird unter Verwendung von Polymerasekettenreaktion (PCR)-Standardtechniken erzeugt (siehe Finney, 1993).
Oligonucleotide, welche an einem ABI Oligosynthesizer hergestellt werden, werden gemäß der veröffentlichten cDNA-Sequenz für Schweine-GH entworfen (siehe Su und El-Gewely, 1988). Ein 30 Base 5' Oligonucleotid enthält eine NcoI-Stelle (5'-CATGCCATGGRGGCCTTCCCAGCCATGCCC 3') und ein 27 Base 3' Oligonucleotid enthält eine BamHI-Stelle (5'-CGGGATCCGCAACTAGAAGGCACAGCT-3'). Die GH cDNA wird unter Verwendung einer Schweine-Hypophysen Lambda gt11 Bibliothek als Matrizenquelle erzeugt. Ein 540 bp Fragment wird erhalten, in pCR II Vektor (Invitrogen Corp.) ligiert, Rekombinanten werden durch Restriktionsenzymdigerierung bestätigt und die DNA wie in Maniatus et al., 1982 beschrieben hergestellt. Die cDNA Sequenz wird durch Farb-Deoxy-Terminatorreaktion unter Verwendung von Reagenzien und Protokollen von Perkin-Elmer Cetus Corp. und einem ABI 373A automatisierten Sequenzer bestätigt. Die GH cDNA wird durch NcoI und BamHI Stellen direkt in pACT-II kloniert. Die cDNA, welche für die extrazelluläre Domäne des GHR kodiert, wird unter Verwendung von PCR-Standardverfahren erzeugt. Ein 33 Base 5' Oligonucleotid, welches eine NcoI Stelle enthält (5'-CATGCCATGGAGATGTTTCCTGGAAGTGGGGCT-3') und ein 39 Base 3' Oligonucleotid, welches ein Terminationscodon enthält, gefolgt von einer NcoI Stelle (5'-CATGCCATGGCCTACCGGAAATCTTCTTCACATGCTGCC-3'), werden verwendet, um ein 742 bp Fragment zu erzeugen, welches für Aminosäuren 1-247 von dem Ratten-GHR kodiert (Baumbach et al., 1989). Die GHR cDNA wird wie vorhergehend oben beschrieben in pCRII Vektor kloniert und dann in die NcoI Stelle des pAS2 Vektors subkloniert. DNA von endgültigen Rekombinantvektoren wird durch das Lithiumacetatverfahren (Rose et al., 1990) in Heffestamm/-stämme transformiert.
Ein Hefewirt (Y190), welcher ein UAS_GAL-HIS Reportergen enthält, wird gemäß dem in Wade Harper et al., 1993 beschriebenen Verfahren hergestellt. Der Genotyp von Stamm Y190 ist MATa leu2-3,112 ura3-52 trpl-901 his3d200 ade2-101 gal4 gal80 URA3::GAL-lacZ LYS2::GAL-HIS3 cyh^r. Stamm Y190 wird mit beiden Fusionskon strukten oder mit einem einzelnen Fusionskonstrukt plus dem opponierenden Vektor transformiert, welcher keine heterologen Sequenzen enthält. Von allen Stämmen wird befunden, dass sie gleiches Wachstum an nicht-selektivem Medium aufweisen (2A). Diese Stämme werden dann bezüglich Wachstum an selektivem Medium getestet (also einem Wachstumsmedium, welchem eine Aminosäure fehlt, welche durch Aktivierung des Reportergens synthetisiert wird). Nur der Stamm, der beide Hybridproteine enthält (CY722), ist in der Lage zu wachsen, während die Stämme, welche entweder die Ligand- oder Rezeptorfusion alleine enthalten, nicht wachsen (CY724, bzw. CY723; 2B). Zwei unabhängige Proben von jedem Stamm werden auf synthetisches Medium gestrichen, welches 2% Glucose, Hefe-Stickstoff-Base, Ammoniumsulfat, 0,1 mM Adenin und 60 mM 3-Aminotriazol (Schale B) enthält, oder auf das gleiche Medium, ergänzt durch Histidin (Schale A). Schale A wird bei 30°C für drei Tage inkubiert; Schale B für fünf Tage. Diese Ergebnisse zeigen, dass GH und GHR die Gal4-abhängige Aktivierung des Reportergens in einer Interaktion vermitteln können, welche auf Ligand-Rezeptor-Bindung hindeutet.
Beispiel 1A: Konkurrieren von exprimiertem freien Ligand (GH) in Gegenwart von GH und GHR Fusionsproteinen
Um die scheinbare Bindung von GH an seinen Rezeptor in der fremden Umgebung eines Hefenukleus zu bestätigen, wird das System modifiziert, um eine dritte Plasmid-vermittelnde Expression von „freiem" Ligand zuzugeben, um zu zeigen, dass das GH-Peptid mit dem GH-Gal4 Fusionsprotein konkurriert, was die in Beispiel 1 gezeigte 2-Hybrid Interaktion umkehrt. Der Mutterstamm Y190 (Wade Harper et al., 1993) wird an einem Medium wachsen gelassen, welches 5-Flur-orotsäure enthält, um Derivate zu selektieren, die das URA3 Gen spontan verlieren (siehe Rose et al., 1990). Der sich ergebende Stamm mit der Bezeichnung CY770 wird für alle Versuche zum Untersuchen der Wirkungen von Protein genutzt, welches gleichzeitig vom dritten Komponenten (also dem dritten Plasmid) exprimiert wird. Die cDNA, welche für GH kodiert, wird durch PCR-Verfahren unter Verwendung eines 38 Base 5' Oligonucleotids, welches eine EcoRI Stelle enthält (5'-CCGAATTCAAAATGGCCTTCCCAGCCATGCCCTTGTCC-3') und eines 26 Base 3' Oligonucleotids, welches eine HindIII Stelle enthält (5'CCAAGCTTCAACTAGAAGGCACAGCT-3') zum nachfolgenden Subklonieren in den Vektor pCUP erzeugt. pCUP ist ein induzierbarer Hefe-Expressionsvektor, abgeleitet von pRS316 (Hill et al., 1986). Kurz: dieser Vektor wird durch Insertieren des 3' Endes des Hefe PGK Gens (von pPGK; Kang et al., 1990) in die pRS316 Klonierungsregion als ein BamHI-SalI Fragment konstruiert, um als transkriptionaler Terminator zu dienen. Zu diesem Plasmid wird die CUP1 Promoterregion (Butt et al., 1984) durch PCR als SacI-EcoRI Frament amplifiziert und in entsprechende Stellen des Plasmids insertiert, um pCUP zu erzeugen. Das GH Expressionsplasmid (GH-pCUP) wird dann mit den GH und GHR Fusionskonstrukten in Stamm CY770 co-transformiert, um CY781 zu erzeugen. Gleichzeitige Expression von freiem GH mit den GH und GHR Fusionsproteinen (CY781) wird gezeigt, um GH-GHR-abhängiges Zellwachstum an selektivem Medium zu blockieren (2B). Dieser Versuch typisiert einen Wettbewerbstest in vivo und zeigt die Umkehrbarkeit der beobachteten Ligand-Rezeptor-Interaktion.
Beispiel 1B: Bindung von Peptidhormon Prolaktin (PRL) und seinem Rezeptor
Um diese Technologie auszuweiten und für gültig zu erklären, wurde ein ähnliches System unter Verwendung des Peptidhormons Prolaktin (PRL) und seines Rezeptors entwickelt. Prolaktin ist strukturell mit GH verwandt und der Prolaktinrezeptor (PRLR) ist ebenfalls ein Mitglied der Zytokinrezeptoren Überfamilie. Anders als humanes GH bindet sub-Primates GH den PRLR nicht leicht (Young und Bazer, 1989); noch bindet PRL leicht den GHR (Leung et al., 1987). Reifes Schweine-PRL wird als Fusion an die GAL4 Aktivierungsdomäne erzeugt. Oligonucleotide werden zu Schweine-PRL (erhalten aus Genbank X14068) entworfen und verwendet, um das reife Schweine-PRL Proteinhormon aus einer Schweine-Hypophysen Lamgda gt11 Bibliothek unter Verwendung von PCR-Standardverfahren zu erzeugen. Ein 31 Base 5' Oligonucleotid schließt eine EcoRI Stelle ein (5'-CGGAATTCTGCCCATCTGCCCCA-GCGGGCCT-3') ein und entspricht Sequenzen, welche für Aminosäuren 1-7 kodieren. Ein 30 Base 3' Oligonucleotid enthält eine EcoRI Stelle (5'-GAATTCACGTGGGCTTAGCAGTTGCTGTCG-3') und entspricht einer Region von cDNA 3' zum endogenen Terminationscodon. Ein 600 bp Fragment wird erhalten, in pCR II Vektor ligiert und durch Restriktions enzymdigerierung und Sequenzanalyse bestätigt. Die PRL cDNA wird durch die EcoRI Stelle in pACT-II kloniert.
Die extrazelluläre Domäne des Schweine PRL Rezeptors (PRLR) wird als Fusion an GRL4 DNA Bindungsdomäne erzeugt. Oligonucleotide werden basierend auf der Sequenz der Maus PRLR entworfen (Davis und Linzer, 1989). Ein 31 Base 5' Oligonucleotid enthält eine SmaI Stelle (5'-TCCCCCGGGGATGTCATCTGCACTTGCTTAC-3'), während das 31 Base 3' Oligonucleotid ein Terminationscodon enthält, gefolgt von einer SalI Stelle (5'TCCGTCGACGGTCTTTCAAGGTGAAGTCATT-3'). Diese Oligonucleotide flankieren die extrazelluläre Domäne des PRLR, welche für Aminosäuren 1-229 kodiert. Eine Schweine-Hypophyse Lambda gt11 Bibliothek wird als Matrizenquelle verwendet. Unter Verwendung von PCR-Standardverfahren wird ein 687 bp Fragment erzeugt, in pCRII ligiert und die Nucleotidsequenz wird bestätigt. Die PRLR cDNA wird durch die SmaI und SalI Restriktionsstellen in den pAS2 Vektor kloniert.
Stamm Y190 wurde mit den PRL oder PRLR Fusionsexpressionsplasmiden entweder alleine (CY727, bzw. CY728) oder zusammen (CY726) transformiert. Zellen, welche sowohl die PRL, als auch die PRLR-Fusionen exgrimieren, sind in der Lage, an selektivem Medium zu wachsen, während die Stämme, welche entweder die Ligand- oder Rezeptorfusion alleine enthalten, dies nicht können. Diese Erebnisse spiegeln jene wieder, welche im GH-GHR-System in den Beispielen oben erhalten wurden und begründen den allgemeinen Nutzen des 2-Hybrid-Systems zur Untersuchung von Ligandbindung an Mitglieder dieser Rezeptor-Überfamilie.
Beispiel 1C: Zusätzliche Bestätigung von Ligand-Rezeptor-Spezifität für das neuartige Hefe-Wirtszellensystem
Es werden zusätzliche Stämme entwickelt, um Ligand-Rezeptor-Spezifität zu bewerten. URA minus Stämme, welche GH und GHR Fusionsproteine exprimieren, werden mit pCUP oder PRL-pCUP transformiert; während Stämme, welche PRL und PRLR Fusionsproteine exprimieren, mit pCUP oder PRL-pCUP transformiert werden. Kurz: PRL-pCUP wird auf eine Weise konstruiert, welche der oben für GH-pCUP beschriebenen ähnlich ist. Die PRL cDNA wird durch PCR unter Verwendung eines 33 Base 5' Oligonucleotids mit einer Eco-RI Stelle (5'-GAATTCAAAATGCTGCCCATCTGCCCCAGCGGG-3') und dem 3' Oligonucleotid in Beispiel 1B erzeugt. Das sich ergebende Fragment wird durch die EcoRI-Stelle in pCUP eingeführt. Wie in den obigen Beispielen gezeigt, wächst ein Stamm, welcher die GH und GHR Fusionen ohne Wettbewerber exprimiert, an selektivem Medium und dieses Wachstum wird mit Co-Expression von freiem GH beseitigt. Der Prolaktin-Versuch produziert ähnliche Ergebnisse, welche die Spezifität der Ligand-Rezeptor-Bindung in der Hefezelle bestätigen. Ein Stamm, welcher PRL und PRLR Fusionen trägt (CY787), kann auf selektivem Medium wachsen, und dieses Wachstum wird durch Expression von freiem PRL aufgehoben (CY786; Tabelle 1).
Um Selektivität des GHR zu testen, wird ein Stamm, welcher die GH und GHR Fusionen enthält, mit PRL-pCUP transformiert. Dieser Stamm wächst an selektivem Medium (CY785; Tabelle 1). Diese Daten zeigen an, dass überschüssige GH (CY751) Bindung effizient mit GH-Bindung an seinen Rezeptor in diesem System konkurrieren kann, aber nicht das verwandte PRL-Peptid (CY755). Die Ergebnisse der obigen Versuche, welche drei heterologe Proteine exprimieren, veranschaulichen die Spezifität der Ligand-Rezeptor-Interaktion(en) im System dieser Erfindung.
TABELLE 1. Stammliste und Biotestergebnisse
Alle Hefestämme werden von Stamm Y190 (Wade Harper et al., 1993) abgeleitet. Der Genotyp ist MATa gal4 gal80 his3 trp1-901 ade2-101 ura3-52 leu2-3,112 URA3::GAL-lacZ LYS2::GAL-HIS3 cyh. Stämme mit Nummernbezeichungen gleich oder größer als 770 haben das URA3::GAL-lacZ Gen nicht. Ein Querstrich zeigt an, dass ein Stamm das bezeichnete Plasmid nicht enthält.
AD-Fusionen sind pACT Derivate; GH oder PRL, fusioniert an die Gal4 Aktivierungsdomäne.
BD-Fusionen sind pAS2 Derivate; extrazelluläre Domänen von GH oder PRL Rezeptoren, fusioniert an die DNA Bindungsdomäne von Gal4.
pCUP bezeichnet Peptide, welche von dem pCUP Plasmid exprimiert werden.
Zusammenfassung der Biotestergebnisse. Jeder Stamm wird auf selektivem Medium für 3 bis 5 Tage bei 30°C wachsen gelassen, dann bezüglich Zellwachstum, angezeigt durch ein Plus, bewertet.
Beispiel 2: Screen für Verbindungen, welche Ligand-Rezeptor-Interkation unterbrechen
Plasmide mit niedriger Kopiezahl, welche GHR- oder GH-Gal4 Fusionsproteine (pOZ153 bzw. pOZ152) exprimieren, werden konstruiert, um Expression dieser Proteine zu verringern. Zusätzlich wird ein neuartiges Reportergen konstruiert, das Zellproliferation an selektivem Medium verhindert, falls die Expression nicht aufgehoben wird. Um das GHR-Fusionsexpressionsplasmid zu konstruieren, wird ein SacI-BamHI Restriktionsfragment, welches einen Hefe-konstitutiven Promoter und GAL4 Sequenzen enthält, von pAS1 isoliert (Durfee et al., 1993) und in pUN30 (Elledge und Davis, 1988) kloniert. Die extrazelluläre Domäne von GHR wird dann durch Ligation als NcoI Fragment wie in Beispiel 1 beschrieben an GAL4 fusioniert, um pOZ153 zu erzeugen. Um das GH Fusionsexpressionskonstrukt zu konstruieren, wird die gesamte GH-Gal4 Region mit Promoter und Terminatorsequenzen von dem in Beispiel 1 beschriebenen Plasmid als PvuI-SalI Fragment isoliert. Dieses DNA-Segment wird in pUN100 (Elledge und Davis, 1988) kloniert, was pOZ152 erzeugt. Ein Reportergen wird durch Isolieren der Hefe CYH2 Kodierungsregion und operatives Binden an einen GAL Promoter in einem Hefe-Expressionsplasmid konstruiert. Kurz: die Gal1 Promoterregion wird in YEp352 (Hill et al., 1986) als 685 bp EcoRI-BamHI Fragment insertiert. CYH2 Sequenzen werden durch PCR unter Verwendung von Oligonucleotid-Primeren (5'-GGATCCAATCAAGAATGCCTTCCAGAT-3' und 5'-GCATGCGTCATAGAAATAATACAG-3') und pAS2 als Matrize amplifiziert. Das PCR-Produkt wird mit BamHI plus SphI digeriert und in die entsprechenden Stellen in dem YEp352-GAL Vektor kloniert. Diese Plasmide werden in Hefestamm CY770 transformiert, welcher eine Mutation an dem chromosomalen cyh2 Gen trägt, was den Stamm gegenüber dem Proteinsynthesehemmer Cycloheximid resistent macht. Die Gegenwart aller drei Plasmide ist notwendig, um Cycloheximid-Empfindlichkeit (cyh•) zu verleihen).
Der Stamm (CY857), welche die Ligand und Rezeptor Fusionsplasmide plus das Reporterplasmid enthält, bildet die Basis für einen einfachen primären Screen für Verbindungen, die die Bindung von GH an seinen Rezeptor unterbrechen. Stamm CY857 wird in Standardhefewachstumsmedium eingebettet, welches 10,0 μg/ml Cycloheximid enthält. Aufgrund der Ligand/Rezeptor-Interaktion, welche Expression des CYH2-Reportergens antreibt, ist der Stamm cyh• und somit nicht in der Lage zu wachsen. Chemische Verbindungen werden auf dieses Testmedium platziert. Verbindungen, welche GH-GHR-Bindung beeinträchtigen, werden durch das Wachstum der Zellen identifiziert, welche die Verbindung umgeben, weil in Abwesenheit von CYH2-Expression die Zellen resistent Cycloheximid werden, welches in dem Medium vorhandenem ist.
Sekundärer Screen, um Probenziel zu bestimmen
Unterbrechung der Ligand-Rezeptor-Bindung in diesem Test kann die Folge von Umsetzung der Verbindung mit entweder der Rezeptor- oder Ligand-Fusionskomponente sein. Das spezifische Ziel der neuartigen Verbindung wird durch einen einfachen sekundären Test unter Nutzung von Stämmen bestimmt, welche eines der Fusionsproteine überexprimieren. Stamm CY858 exprimiert die GHR-GAL4 Fusion in großem Überschuss, weil das Konstrukt innerhalb der Zelle bei hoher Kopiezahl (pOZ149) gehalten wird, während die GH-Fusion (pOZ152) bei Graden gehalten wird, welche ähnlich dem Basisstamm (CY857) sind. Umgekehrt exprimiert Stamm CY859 die GH-GAL4-Fusion in großem Überschuss, weil dieses Konstrukt innerhalb der Zellen bei hoher Kopiezahl (pKY14) gehalten wird, während die GHR-Fusion (pOZ153) bei Graden gehalten wird, welche ähnlich dem Basisstamm (CY857) ist. Verbindungen, welche Wachstum im primären Screen unter Verwendung von CY857 retten (GH- und GHR-Fusionen, exprimiert in Plasmiden mit niedrigen Kopiezahlen), werden dann auf gleiche Weise unter Verwendung von CY858 (GHR>>GH) oder CY859 (GH>>GHR) als Teststämme getestet. Zum Beispiel, wenn Ligand-Rezeptor-Bindung durch eine Verbindung gehemmt wird, welche sich mit dem GHR umsetzt, wird der sekundäre Screen eine nachweisbare Veränderung beim gemessenen Phenotyp zeigen. Sekundäres Testen der sich ergebenden Verbindung an Stamm CY858, welcher die GHR-Fusion überexprimiert, produziert ein geringeres Wachstum in Gegenwart der Verbindung, als sie für CY859 beobachtet wurde. Diese nachweisbare Veränderung im gemessenen Phenotyp tritt auf, weil der Überschuss an GHR die Verbindung titriert und dadurch CYH2-Expression erhöht und Zellwachstum hemmt. CY859 erzeugt eine nachweisbare Veränderung ähnlich CY857, weil das GHR-Fusionsprotein einschränkend ist. Eine Verbindung, welche mit der Ligandfusion interagiert, zeigt die umgekehrte Veränderung beim gemessenen Phenotyp in diesem sekundären Test.
Beispiel 3: Demonstration von Ligand-abhängiger Rezeptor-Dimerisation
Multiple Proteininteraktionen (zum Beispiel Ligand-Rezeptor-Rezeptor) werden mit dem ausgeweiteten System untersucht, welches ein drittes Protein exprimiert, unter Verwendung des folgenden Schemas.
Eine Einheit des Rezeptordimers wird als Fusionsprotein mit entweder der Gal 4 DNA Bindung oder Aktivierungsdomäne erzeugt. Die andere Einheit des Rezeptordimers wird als Fusionsprotein mit entsprechender Gal DNA Bindung oder Aktivierungsdomäne erzeugt, je nachdem, welches für die erste Fusion nicht verwendet wird. Das Gen, welches für den Ligand kodiert, wird von dem dritten Plasmid exprimiert und wird als freier (nicht-Fusions) Ligand produziert. Interaktion der Fusionsproteine tritt nur in Gegenwart von Ligand auf (siehe 3).
Die Interaktion von vaskulärem, endothelialen Zellwachstumsfaktor (VEGF) mit der Ligandbindungsdomäne von seinem verwandten Rezeptor (KDR, Kinase-Insert-Domäne enthaltender Rezeptor) wird als ein Beispiel für dieses System beschrieben. KDR ist ein Tyrosinkinase-Rezeptor und für Dimerbildung (1 Ligand – 2 Rezeptoren) wird nahe gelegt, dass es für Hormon-induzierte Rezeptorfunktion wichtig ist. Die cDNA, welche für die Liganddomäne von KDR kodiert (Terman et al., 1991) wird als ein Nco I – BamHI Fragment isoliert und in sowohl die pACT-II, als auch pAS2 Vektoren kloniert. Die cDNA, welche für das reife Protein für VEGF kodiert, wird unter Verwendung von PCR-Standardtechniken erzeugt. Oligonucleotide werden von veröffentlichen Sequenzen entworfen (siehe Tischer et al., 1991). Ein 34 Base 5' Oligonucleotid, welches eine EcoRI Stelle enthält (5'-CGGAATTCGAAGTATGGCACCCATGGCAGAAGGA-3') und ein 28 Base 3' Oligonucleotid, welches eine EcoRI Stelle enthält (5'-CGGAATTCGGATCCTCATTCATTCATCA-3') werden verwendet, um ein 450 bp Fragment zu erzeugen, welches für das reife Protein kodiert, und in die EcoRI Stelle von pCUP kloniert. DNA des endgültigen Rekombinantvektors wird durch das Lithiumacetatverfahren in Hefe transformiert, um passende Stämme zu erzeugen.
Der Hefewirtsstamm (CY770) wird mit KDR-pACT-II, KDR-pAS2 und VEGF-pCUP transformiert, um Stamm CY846 zu erzeugen; oder mit beiden Rezeptorfusionen und pCUP transformiert, um Stamm CY847 zu erzeugen. Zusätzlich werden beide KDR-pACT-II und KDR-pAS2 zusammen (CY845) oder getrennt (CY843 oder CY844) oder VEGF-pCUP allein (CY841) als Kontrollstämme transformiert. Die Stämme werden bezüglich Wachstum an selektivem Medium getestet. Der Stamm (CY846), der den VEGF-Ligand plus die zwei Rezeptor-Fusionsproteine exprimiert, weist wesentliches Wachstum an selektivem Medium im Vergleich zu dem Stamm CY847 auf, welcher den VEGF-Ligand nicht exprimiert (siehe 4). Diese Ergebnisse zeigen, dass die effektiven Zellen dieser Erfindung verwendet werden können, um Ligand-abhängige Dimerisation des Rezeptors zu untersuchen.
Beispiel 4: Screen für Verbindungen, die als Liganden in einem Dimerrezeptorsystem fungieren
Dimerisation (Oligomerisation) von Rezeptoreinheiten ist häufig ein wichtiger erster Schritt bei der Aktivierung von Rezeptoren, wie jene für die Wachstumsfaktoren, Zytokine und den supra beschriebenen. Das in Beispiel 3 beschriebene neuartige Zellsystem kann auf die Entdeckung von neuartigen Verbindungen angewendet werden, welche Rezeptordimerisation fördern (oder blockieren). Solche neuartigen interagierenden Verbindungen können als wirksame therapeutische Wirkstoffe für Pathologien in Verbindung mit diesen Rezeptoren dienen.
Plasmide, welche den/die Dimerrezeptoreinheit(en) exprimieren, sind Fusionsproteine, welche wie in Beispiel 3 diskutiert erzeugt werden. Der Stamm (CY845), welcher die KDR-pACT-II und KDR-pAS2 Fusionen enthält, dient als Beispiel für einen einfachen primären Screen für Rezeptoren, welche eine dimere Struktur aufweisen. Stamm CY845 ist in synthetischem Agar-Medium ohne Histidin eingebettet (Rose et al., 1990). Die Testverbindungen werden oben auf dieses Testmedium aufgetragen. Chemische Verbindungen, welche Interaktion der zwei Rezeptorfusionen (in Abwesenheit von Ligand) herbeiführen, ergeben die Wiederherstel-lung des endogenen transkriptionalen Aktivators, welcher an ein Reportergen gebunden ist, wie HIS3. Die Wiederherstellung wird durch Wachstum von Zellen identifiziert, welche die Verbindung umgeben.
Oben als Verweis angeführte Veröffentlichungen:
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Claims

Hefe- oder Säugetier-Wirtszelle, welche umfasst: a) eine Gensequenz, welche für ein heterologes Fusionsprotein kodiert; wobei besagtes Fusionsprotein ein erstes Peptid von einem Peptidbindungspaar oder ein Segment von besagtem ersten Peptid umfasst, welches entweder mit einer DNA-Bindungsdomäne oder ihrer entsprechenden Transkriptions-Aktivierungsdomäne verbunden ist; b) eine Gensequenz, welche für ein heterologes Fusionsprotein kodiert, wobei besagtes Fusionsprotein ein zweites Peptid des Peptidbindungspaares in (a) oder ein Segment davon umfasst, welches entweder mit einer DNA-Bindungsdomäne oder ihrer entsprechenden Transkriptions-Aktivierungsdomäne verbunden ist, je nachdem, welche nicht in (a) eingesetzt ist; c) ein Reportergen, oder ein Teil davon, welches operativ mit dem Transkriptions-Aktivierungsprotein assoziiert ist; d) gegebenenfalls eine Deletion oder Mutation in der chromosomalen DNA der Wirtszelle für das Transkriptions-Aktivierungsprotein, falls in der gewählten Wirtszelle vorhanden; wobei besagte Wirtszelle in der Lage ist, mindestens zwei heterologe Fusionsproteine und mindestens ein Reportergen zu exprimieren, und wobei die Peptide des Peptidbindungspaares durch extrazelluläre Aktivität in ihrer natürlichen Umgebung miteinander interagieren.
Wirtszelle nach Anspruch 1, wobei besagte Hefezelle ausgewählt wird aus Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe oder Pichia pastoris.
Wirtszelle nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Peptidbindungspaar ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Säugetierpeptiden.
Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Peptidbindungspaar ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Nicht-Säugetierpeptiden.
Wirtszelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Peptidbindungspaar ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Liganden und einem entsprechenden Rezeptor.
Wirtszelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein Peptid des Peptidbindungspaares ein Hormon ist.
Wirtszelle nach Anspruch 6, wobei ein Peptid des Peptidbindungspaares ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Säugetierpeptid-Hormonen.
Wirtszelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei besagtes Transkriptions-Aktivierungsprotein ausgewählt wird aus (a) Ga14, Gcn4, Hap1, Adr1, Swi5, Ste12, Mcm1, Yap1, Ace1, Ppr1, Arg81, Lac9, Qa1F, VP16, LexA oder (b) Säugetiernuklearrezeptoren.
Wirtszelle nach Anspruch 8, wobei besagtes Transkriptions-Aktivierungsprotein ein Hefe-Transkriptions-Aktivierungsprotein ist.
Wirtszelle nach Anspruch 9, wobei besagtes Transkriptions-Aktivierungshefeprotein GAL4, Gcn4, Adr1 oder lac9 ist.
Wirtszelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Reportergen ausgewählt wird aus der Gruppe von: a) lacZ, Luciferase-Gen, grün fluoreszierendem Proteingen, Chloramphenicol-Acetyltransferase; b) Genen zum Komplementieren von Auxotrophien c) Genen zum Verleihen von antibiotischer Resistenz; und d) Genen zum Verleihen von Empfindlichkeit gegenüber einer Chemikalie.
Wirtszelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mindestens eines der heterologen fusionierten Proteine durch Transformation einer Hefezelle mit einem autonom-replizierenden Plasmid exprimiert wird, welches in der Lage ist, besagtes Fusionsprotein zu exprimieren.
Wirtszelle nach Anspruch 12, wobei die heterologen fusionierten Proteine durch Transformation einer Hefezelle mit einem autonom-replizierenden Plasmid exprimiert werden, welches in der Lage ist, besagtes Fusionsprotein zu exprimieren.
Wirtszelle nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, wobei mindestens ein Peptid des Peptidbindungspaares ausgewählt wird aus einer der folgenden Gruppen: (a) der Gruppe bestehend aus Cytokinen, Interleukinen, hämatopoietischen Wachstumsfaktoren, Insulin, Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren, Wachstumshormon, Prolaktin, Interferonen und Wachstumsfaktoren; (b) Liganden für G-Protein gekoppelte Rezeptoren; (c) Liganden für Nicht-Vertebraten-Rezeptoren; (d) Liganden für Guanylylcyclase-Rezeptoren; (e) Liganden für Tyrosinphosphatase-Rezeptoren;
Wirtszelle nach Anspruch 14, wobei das Peptid ein Wachstumsfaktor ist, ausgewählt aus epidermalem GF, Nerven-GF, Leukämie-Hemmungsfaktor, Fibroblast-GF, von Plättchen hergeleitetem GF, vaskulär-endothelialem GF, Tumornekrosefaktor, Onkostatin M, ziliar-neurotrophem Faktor, Erythropoietin, Steel-Faktor, Plazenta-Lactogen und TGF.
Wirtszelle nach Anspruch 15, wobei mindestens ein Peptid des Peptidbindungspaares ein Transducer ist.
Wirtszelle nach Anspruch 16, wobei der Transducer ausgewählt wird aus der Gruppe der Transducer-Proteine gp130, kh97, AIC2A und AIC2B.
Wirtszelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mindestens ein Peptid des Peptidbindungspaares ein Rezeptor ist, ausgewählt aus einer der folgenden Gruppen: (a) ein Zelladhäsionsmolekül; und (b) ein immun-modulatorisches, Antigen-Erkennungs- oder Präsentationsmolekül.
Wirtszelle nach Anspruch 18, wobei der Rezeptor ein Zelladhäsionsmolekül ist, ausgewählt aus ICAM, VCAM, ECAM, Fibronektin, Integrin, Selektin und Fibrinogen.
Wirtszelle nach Anspruch 19, wobei der Rezeptor ein immunmodulatorisches, Antigen-Erkennungs- oder Präsentationsmolekül ist, ausgewählt aus dem T-Zellen Rezeptorkomplex, B-Zellen-Rezeptorkomplex, Fc-Rezeptoren, Haupt-Histokompatibilitätskomplex 1, Haupt-Histokompatibilitätskomplex 2, CD4, CD8, CD27, CD30, MAC-Komplex.
Wirtszelle nach Anspruch 14, wobei ein Peptid des Peptidbindungspaares ein Ligand für G-Protein gekoppelte Rezeptoren ist.
Wirtszelle nach Anspruch 21, wobei der Ligand für G-Protein gekoppelte Rezeptoren ausgewählt wird aus Wachstumshormonabgabefaktor, Sekretin, vasoaktivem Inhibitorpeptid, Glucagon, Interleukin-8, Luteinisierungshormon (LH), Follikelstimulationshormon (FSH) und Thyrotropin.
Wirtszelle nach Anspruch 14, wobei das Nicht-Vertebraten- Peptid ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Pflanzen-Systemin und Insekten-Differentiationspeptiden.
Verfahren zum Nachweisen der Fähigkeit einer Testprobe, die Bindungsinteraktion eines Peptidbindungspaares zu beeinflussen, welches Verfahren umfasst: Bestimmen der Aktivität des Reportergens nach Zugeben einer Testprobe zur Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 23 unter Bedingungen, welche geeignet sind, besagte Aktivität in Gegenwart von besagter Probe nachzuweisen oder unter einer Bedingung, für welche die Wirtszelle besagte Aktivität nur in Gegenwart einer Probe mit Bindungsinteraktion eines Peptidbindungspaares aufweist.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Wirksamkeit des Reportergens durch Messen eines ausgewählten Phenotyps bestimmt wird, welcher von der Aktivität des Reporters abhängt.
Wirtszelle nach Anspruch 1, wobei das Reportergen (c) operativ mit einem Transkriptions-Aktivierungs-Hefeprotein assoziiert wird, wobei besagtes Reportergen auf einem selektiven Medium die Exhibition eines nachweisbaren Phenotyps in Gegenwart von Expression des Transkriptions-Aktivierungs-Hefeproteins oder eines Teils davon verhindert; und wobei die Wirtszelle ferner umfasst: (e) gegebenenfalls eine Deletion oder Mutation in der chromosomalen DNA der Wirtszelle; welche Exhibition des gewählten Phenotyps auf dem gewählten Medium in Abwesenheit von Expression des Reportergens von Plasmid (c) ermöglicht, falls es für das Reportergen (c) notwendig ist, dass es die einzige Quelle gemessener Aktivität ist.
Verfahren zum Nachweisen der Fähigkeit einer Testprobe, die Interaktion eines Peptidbindungspaares zu beeinflussen, welches Verfahren umfasst: Beobachten einer Veränderung im gemessenen Phenotyp eines Wirts nach einem der Ansprüche 1 bis 23 nach Zugeben einer Testprobe zu besagter Wirtszelle; wobei besagte Zelle unter Bedingungen kultiviert wird, welche geeignet sind, einen gewählten Phenotyp in Gegenwart einer Testprobe nachzuweisen, oder unter einer Bedingung kultiviert wird, für welche die besagte Zelle den Phenotyp nur in Gegenwart einer Testprobe mit Interaktion mit dem Peptidbindungspaar exhibiert.
Verfahren zum Bestimmen, ob eine Testprobe Interaktion mit einem Peptid eines Peptidbindungspaares exhibiert; wobei besagtes Verfahren umfasst: (a) Zugeben einer Testprobe zu einer Hefe- oder Säugetier-Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23 und Vergleichen der Exhibition eines gewählten Phenotyps in Gegenwart oder Abwesenheit der Testprobe; wobei besagte Wirtszelle adaptiert ist, um eine Veränderung im Phenotyp nur in Gegenwart einer Testprobe zu exhibieren, welche an nur ein Peptid des Peptidbindungspaares bindet.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei besagtes Verfahren eine Wirtszelle einsetzt, welche umfasst: a) eine Gensequenz, welche für ein heterologes Fusionsprotein exprimiert, wobei besagtes Fusionsprotein ein erstes Peptid von einem Peptidbindungspaar oder Segment von besagtem ersten Peptid umfasst, welches entweder mit einer DNA-Bindungsdomäne oder ihrer entsprechenden Transkriptions-Aktivierungsdomäne verbunden ist; wobei das Gen, welches für besagtes erstes Peptid kodiert, in einer wirksamen Kopie-Anzahl vorhanden ist; b) eine Gensequenz, welche für ein heterologes Fusionsprotein kodiert, wobei besagtes Fusionsprotein ein zweites Peptid des Peptidbindungspaares in (a) oder ein Segment von besagtem zweiten Peptid umfasst, welches entweder mit einer DNA-Bindungsdomäne oder ihrer entsprechenden Transkriptions-Aktivierungsdomäne verbunden ist, welche nicht in (a) eingesetzt wird; c) Reportergen, oder ein Teil davon, welches operativ mit dem Transkriptions-Aktivierungs-Hefeprotein assoziiert ist; d) eine Deletion oder Mutation in der chromosomalen DNA der Hefe-Wirtszelle für das Transkriptions-Aktivierungsprotein.
verfahren nach Anspruch 29, wobei mindestens eines der heterologen fusionierten Proteine durch Transformation der Wirtszelle mit einem autonom-replizierenden Plasmid exprimiert wird, welches in der Lage ist, besagtes Fusionsprotein zu exprimieren.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Reportergen durch Transformation der Wirtszelle mit einem Plasmid exprimiert wird, welches in der Lage ist, besagtes Reportergen zu exprimieren.
Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei die Gensequenz (a) eine Gensequenz ist, welche für ein heterologes Fusionsprotein kodiert; wobei besagtes Fusionsprotein eines von zwei Rezeptormolekülen für ein Peptid, oder Segment von besagtem Rezeptor umfasst, welches entweder mit einer DNA-Bindungsdomäne oder ihrer entsprechenden Transkriptions-Aktivierungsdomäne von einem Transkriptions-Aktivierungsprotein verbunden ist; und die Gensequenz (b) eine Gensequenz ist, welche für ein heterologes Fusionsprotein kodiert; wobei besagtes Fusionsprotein den anderen Rezeptor für das Peptid, oder ein Segment von besagtem Rezeptor umfasst, welcher entweder mit einer DNA-Bindungsdomäne oder ihrer entsprechenden Transkriptions-Aktivierungsdomäne verbunden ist, je nachdem welche nicht in (a) eingesetzt ist.
Wirtszelle nach Anspruch 32, worin das Gen in (a) für ein heterologes Fusionsprotein kodiert; wobei besagtes Fusionsprotein einen Transducer für ein Peptid oder Segment von besagtem Transducer umfasst, welcher entweder mit einer DNA-Bindungsdomäne oder ihrer entsprechenden Transkriptions-Aktivierungsdomäne von einem Transkriptions-Aktivierungsprotein verbunden ist.
Wirtszelle nach Anspruch 33, wobei das Transducer-Protein ausgewählt wird aus gp130, KH97, AIC2A und AIC2B.
Verfahren zum Nachweisen der Fähigkeit einer Testprobe, als Ligand für einen Rezeptor zu fungieren, welches umfasst: Bestimmen des Aktivitätsgrades des Reportergens der Wirtszelle nach Anspruch 33 nach Zugeben einer Testprobe zu besagter Zelle unter Bedingungen, welche für besagte Aktivität geeignet sind.
Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei die Gensequenz (a) eine Gensequenz ist, welche für ein heterologes Fusionsprotein kodiert, wobei besagtes Fusionsprotein ein Peptid von einem multiplen Peptidbindungskomplex oder Segment von besagtem Peptid umfasst, welches entweder mit einer DNA-Bindungsdomäne oder ihrer entsprechenden Transkriptions-Aktivierungsdomäne von einem Transkriptions-Aktivierungsprotein verbunden ist; und die Gensequenz (b) eine Gensequenz ist, welche für ein heterologes Fusionsprotein kodiert; wobei besagtes Fusionsprotein ein zweites Peptid von besagtem multiplen Peptidbindungskomplex, oder ein Segment von besagtem Rezeptor umfasst, welches entweder mit einer DNA-Bindungsdomäne oder ihrer entsprechenden Transkriptions-Aktivierungsdomäne verbunden ist, welche nicht in (a) eingesetzt ist.
Verfahren zum Nachweisen der Fähigkeit einer Testprobe, als eine Peptidkomponente eines multiplen Peptidbindungskomplexes zu fungieren; wobei besagtes Verfahren umfasst: Bestimmen des Aktivitätsgrades des Reportergens der Wirtszelle nach Anspruch 36 nach Zugeben einer Testprobe zu besagter Zelle unter Bedingungen, welche geeignet sind, besagte Aktivität nachzuweisen.
Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei die Gensequenz (a) eine Gensequenz ist, welche für eine heterologes Fusionsprotein kodiert; wobei besagtes Fusionsprotein ein Peptid von einem multiplen Peptidbindungskomplex oder Segment von besagtem Peptid umfasst, welches entweder mit einer DNA-Bindungsdomäne oder ihrer entsprechenden Transkriptions-Aktivierungsdomäne von einem Transkriptions-Aktivierungsprotein verbunden ist; und die Gensequenz (b) eine Gensequenz ist, welche für ein heterologes Fusionsprotein kodiert; wobei besagtes Fusionsprotein ein zweites Peptid von besagtem multiplen Peptidbindungskomplex, oder ein Segment von besagtem Rezeptor umfasst, welches entweder mit einer DNA-Bindungsdomäne oder ihrer entsprechenden Transkriptions-Aktivierungsdomäne verbunden ist, welche nicht in (a) eingesetzt ist; wobei besagte Wirtszelle ferner als (e) mindestens eine Gensequenz umfasst, welche für ein Peptid kodiert; wobei besagter Wirtin der Lage ist, besagte Peptide zu exprimieren.
Wirtszelle nach Anspruch 38, wobei mindestens eine der Komponenten (a), (b) oder (e) eine Gensequenz ist, welche einer komplementären DNA-Bibliothek entspricht.
Wirtszelle nach Anspruch 39, worin Bestandteil (b) eine Gensequenz ist, welche einer komplementären DNA-Bibliothek entspricht.
Verfahren zum Bestimmen der Fähigkeit eines zufälligen Proteins, als Bestandteil eines multiplen Peptidbindungskomplexes zu fungieren, wobei besagtes Verfahren umfasst: Bestimmen des Aktivitätsgrades des Reportergens der Wirtszelle nach Anspruch 40 nach Expression des zufälligen Proteins aus der DNA-Bibliothek unter Bedingungen, welche geeignet sind, besagte Aktivität nachzuweisen.