SI9520073A - Novi celični sistemi, ki imajo specifično interakcijo peptidnih veznih parov - Google Patents
Novi celični sistemi, ki imajo specifično interakcijo peptidnih veznih parov Download PDFInfo
- Publication number
- SI9520073A SI9520073A SI9520073A SI9520073A SI9520073A SI 9520073 A SI9520073 A SI 9520073A SI 9520073 A SI9520073 A SI 9520073A SI 9520073 A SI9520073 A SI 9520073A SI 9520073 A SI9520073 A SI 9520073A
- Authority
- SI
- Slovenia
- Prior art keywords
- host cell
- peptide
- modified host
- protein
- receptor
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 192
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 123
- 230000003993 interaction Effects 0.000 title claims description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 136
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 89
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 76
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 76
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 claims abstract description 70
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 46
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 claims abstract description 29
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 142
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 101
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 101
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 70
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 44
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims description 40
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 39
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 claims description 38
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 28
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 27
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 27
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 26
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 26
- 102100024819 Prolactin Human genes 0.000 claims description 21
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 claims description 21
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 claims description 19
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 claims description 18
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 18
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 17
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 claims description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 13
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 9
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 7
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 7
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 claims description 6
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 claims description 4
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 claims description 4
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 claims description 4
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 claims description 4
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 claims description 4
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 claims description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 4
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 claims description 4
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 4
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 claims description 3
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 claims description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 3
- 101000608765 Homo sapiens Galectin-4 Proteins 0.000 claims description 3
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 claims description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 claims description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 3
- 108010045747 interleukin 3 receptor-like molecule Proteins 0.000 claims description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 3
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 claims description 2
- 102100021809 Chorionic somatomammotropin hormone 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 101000799969 Escherichia coli (strain K12) Alpha-2-macroglobulin Proteins 0.000 claims description 2
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 claims description 2
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 claims description 2
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 claims description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims description 2
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 claims description 2
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 claims description 2
- 108010013990 Guanylate Cyclase-Coupled Receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 102000017178 Guanylate Cyclase-Coupled Receptors Human genes 0.000 claims description 2
- 108010068250 Herpes Simplex Virus Protein Vmw65 Proteins 0.000 claims description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 2
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 claims description 2
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 2
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 claims description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims description 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 2
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 claims description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004140 Oncostatin M Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000630 Oncostatin M Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 claims description 2
- 108010003044 Placental Lactogen Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000381 Placental Lactogen Substances 0.000 claims description 2
- 101150005828 SWI5 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102100037505 Secretin Human genes 0.000 claims description 2
- 108010086019 Secretin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000003800 Selectins Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000184 Selectins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 claims description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims description 2
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 claims description 2
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 claims description 2
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 claims description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 claims description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 2
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 claims description 2
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 claims description 2
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 claims description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 2
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 claims description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 claims description 2
- 229940096397 interleukin-8 Drugs 0.000 claims description 2
- XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N interleukin-8 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N 0.000 claims description 2
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 claims description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 claims description 2
- 230000002956 necrotizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 claims description 2
- AAEVYOVXGOFMJO-UHFFFAOYSA-N prometryn Chemical compound CSC1=NC(NC(C)C)=NC(NC(C)C)=N1 AAEVYOVXGOFMJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960002101 secretin Drugs 0.000 claims description 2
- OWMZNFCDEHGFEP-NFBCVYDUSA-N secretin human Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(N)=O)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 OWMZNFCDEHGFEP-NFBCVYDUSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- 108010050014 systemin Proteins 0.000 claims description 2
- HOWHQWFXSLOJEF-MGZLOUMQSA-N systemin Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1N(C(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)C(C)C)CCC1 HOWHQWFXSLOJEF-MGZLOUMQSA-N 0.000 claims description 2
- 229960000874 thyrotropin Drugs 0.000 claims description 2
- 230000001748 thyrotropin Effects 0.000 claims description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 claims description 2
- 230000002227 vasoactive effect Effects 0.000 claims description 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 claims 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 claims 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 claims 1
- 101800004866 G protein-coupled receptor ligand Proteins 0.000 claims 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims 1
- DYUQAZSOFZSPHD-UHFFFAOYSA-N Phenylpropanol Chemical compound CCC(O)C1=CC=CC=C1 DYUQAZSOFZSPHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 102000015215 Stem Cell Factor Human genes 0.000 claims 1
- 108010039445 Stem Cell Factor Proteins 0.000 claims 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 claims 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 claims 1
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 claims 1
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 claims 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 claims 1
- 102000014187 peptide receptors Human genes 0.000 claims 1
- 108010011903 peptide receptors Proteins 0.000 claims 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 19
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 34
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 31
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 19
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 18
- 108010002519 Prolactin Receptors Proteins 0.000 description 18
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 16
- 102100029000 Prolactin receptor Human genes 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 8
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 8
- 101100353517 Caenorhabditis elegans pas-2 gene Proteins 0.000 description 7
- 101100250396 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) RPL28 gene Proteins 0.000 description 7
- 101100527649 Wickerhamomyces ciferrii (strain ATCC 14091 / BCRC 22168 / CBS 111 / JCM 3599 / NBRC 0793 / NRRL Y-1031 F-60-10) RPL44 gene Proteins 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 5
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 5
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 4
- 101100246753 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) pyrF gene Proteins 0.000 description 4
- 230000010799 Receptor Interactions Effects 0.000 description 4
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 4
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 description 4
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 description 4
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 4
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 4
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 3
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100030981 Beta-alanine-activating enzyme Human genes 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 2
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 2
- 101000773364 Homo sapiens Beta-alanine-activating enzyme Proteins 0.000 description 2
- 108020005497 Nuclear hormone receptor Proteins 0.000 description 2
- 102000007399 Nuclear hormone receptor Human genes 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000000956 alloy Substances 0.000 description 2
- 229910045601 alloy Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 108020004017 nuclear receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000001175 peptic effect Effects 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- SEHFUALWMUWDKS-UHFFFAOYSA-N 5-fluoroorotic acid Chemical compound OC(=O)C=1NC(=O)NC(=O)C=1F SEHFUALWMUWDKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KLSJWNVTNUYHDU-UHFFFAOYSA-N Amitrole Chemical compound NC1=NC=NN1 KLSJWNVTNUYHDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150008604 CAN1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100327917 Caenorhabditis elegans chup-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100245267 Caenorhabditis elegans pas-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010061765 Chromosomal mutation Diseases 0.000 description 1
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N Ecdysone Natural products O=C1[C@H]2[C@@](C)([C@@H]3C([C@@]4(O)[C@@](C)([C@H]([C@H]([C@@H](O)CCC(O)(C)C)C)CC4)CC3)=C1)C[C@H](O)[C@H](O)C2 UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 1
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000010682 Fusion Protein Interactions Effects 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 101001075374 Homo sapiens Gamma-glutamyl hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 101000664737 Homo sapiens Somatotropin Proteins 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 108010031794 IGF Type 1 Receptor Proteins 0.000 description 1
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100036721 Insulin receptor Human genes 0.000 description 1
- 102100039688 Insulin-like growth factor 1 receptor Human genes 0.000 description 1
- 102000001617 Interferon Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010054267 Interferon Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100037792 Interleukin-6 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100032352 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 108091008606 PDGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 description 1
- 102000011653 Platelet-Derived Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 229940123573 Protein synthesis inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101100448397 Rattus norvegicus Ghr gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004278 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000873 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 108010041388 Ribonucleotide Reductases Proteins 0.000 description 1
- 102000000505 Ribonucleotide Reductases Human genes 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108010085012 Steroid Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000007451 Steroid Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N alpha-Ecdysone Natural products C1C(O)C(O)CC2(C)C(CCC3(C(C(C(O)CCC(C)(C)O)C)CCC33O)C)C3=CC(=O)C21 UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003098 androgen Substances 0.000 description 1
- 229940030486 androgens Drugs 0.000 description 1
- 239000003430 antimalarial agent Substances 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 108010005905 delta-hGHR Proteins 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N ecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@H]([C@H](O)CCC(C)(C)O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000000913 erythropoietic effect Effects 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 210000004349 growth plate Anatomy 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 108040006858 interleukin-6 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000008606 intracellular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 101150047627 pgk gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000000007 protein synthesis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 1
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Mobile Radio Communication Systems (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Izum se nanaša na nove gostiteljske celice, ki izražajo heterologne zlite beljakovine in na presejalne postopke za testne vzorce, ki imajo peptidne vezne aktivnosti; kjer modificirana gostiteljska celica vsebuje: (a) gensko sekvenco, ki kodira heterologno fuzijsko beljakovino; omenjena fuzijska beljakovina pa vsebuje prvi peptid peptidnega veznega para, ali segment omenjenega prvega peptida, ki je združen bodisi z veznim področjem DNA ali njegovim ustreznim transkripcijskim aktivacijskim področjem transkripcijske aktivacijske beljakovine; (b) gensko sekvenco, ki kodira heterologno fuzijsko beljakovino, omenjena fuzijska beljakovina pa vsebuje drugi peptid peptidnega veznega para v (a), ali njegov segment, ki je zlit bodisi z veznim področjem DNA ali z njegovim ustreznim transkripcijskim aktivacijskim področjem, katerimkoli, ki ni uporabljen v (a); (c) reporterski gen, ki je operativno združen z transkripcijsko aktivacijsko beljakovino, ali z njenim delom; (d) opcijsko, izbris ali mutacijo v kromosomski DNA gostiteljske celice za transkripcijsko aktivacijsko beljakovino, če je navzoča v izbrani gostiteljski celici.ŕ
Description
NOVI CELIČNI SISTEMI, KI IMAJO SPECIFIČNO INTERAKCIJO PEPTIDNIH VEZNIH PAROV
POLJE IZUMA
Predloženi izum se nanaša na nove celice, ki izražajo heterologne fuzijske beljakovine in na presejalne postopke za spojine, ki imajo peptidne vezne aktivnosti; kjer postopki uporabljajo nove celice v smislu tega izuma.
STROKOVNO OZADJE
Specifična vezava para peptidov drugega z drugim sproži veliko število funkcij v živi celici. Na primer, specifična vezava nekega liganda na površinski receptor služi kot sprožilec za celične odzive na mnoge zunanje signale. Pri sesalcih se celice odzivajo na veliko različnih peptidnih hormonov v obtoku, pogosto preko posameznih transmembranskih področnih receptorjev. Z gotovostjo je ugotovljeno, da receptorska superdružina citokinov obrazloži razne vidike celičnih funkcij in fizioloških odzivov. Novejše preiskave receptorskih funkcij citokinov so odkrile različne stehiometrije ligand-receptor beljakovin, ki vključujejo tako 2-beljakovinske (ligand/receptor) (Cunnigham in ostali, 1991; Staten in ostali, 1993) kot 3-beljakovinske (ligand/receptor/receptor ali ligand/receptor/transducer) interakcije (Young, 1992; Taga and Kishimoto, 1992; Mui and Miyajima, 1994). Zapletenost takih beljakovinskih združb so raziskovali z uporabo in vitro metod, mnogokrat mučnih (Fuh in ostali, 1992; 1993; Davis in ostali, 1993), ker niso bili dostopni genetično prilagodljivi izrazni sistemi. Predloženi izum je usmerjen k novim modificiranim gostiteljskim sistemom, ki jih lahko uporabimo za proučevanje takih beljakovin, ki pa so vendarle znatno manj težavni.
-2Nedavno so poročali o sistemih iz te stroke, ki se nanašajo na 2-hibridni sistem, kot o njih govorijo Fields in Song, 1989 in tudi Chein in ostali, 1991. 2-hibridni sistemi zajemajo diferencialne interakcije med ločljivimi veznimi in aktivacijskimi področij DNA transkripcijskega aktivatorja kvasovk, Gal4. Heterologne beljakovine se izražajo kot hibridne beljakovine zlite z obema polovicama Gal4 (glej Sl. 1; Fields in Song, 1989; Chein in ostali, 1991 za razpravo o 2-hibridnem sistemu). Produktivna interakcija heterolognih beljakovin privede obe polovici beljakovine Gal4 v tesno bližino, aktivirajoč izražanje označijivega reporterskega gena. Do tega datuma, so take 2-hibridne sisteme razglasili kot koristne za ugotavljanje, ali ima prva dana testna peptidna sekvenca vezne aktivnosti za znano sekvenco drugega peptida; pri tem ni znana afiniteta testnega peptida do znanega peptida. Študij z uporabo takega sistema je bil usmerjen k analizi intracelularnih beljakovin kot prepisovalni faktorji in kinazne- tarčne beljakovinske interakcije (Yang in ostali, 1992; Durfee in ostali, 1993; Li in ostali, 1994).
Nove modificirane celice v smislu izuma in nove metode za vključitev teh celic prinašajo pomemben napredek pri študiju in odkrivanju peptidne mimikrije, vključno z mimikrijo ligandov in mimikrijo receptorjev. Trenotno še nihče ni razvil učinkovitega in specifičnega presejalnega sistema za raziskavo teh področij. Z uporabo peptičnega veznega para, za katerega je znana vezna afiniteta, v celici, predloženi izum omogoča proučevanje peptičnih veznih parov, kot sta ligand in receptor, kjer se peptidi vežejo preko izvenceličnih interakcij. Predloženi izum ustvarja eksponencialne prednosti za odkrivanje spojin, ki lahko delujejo kot ligandi za specifične receptorje ali transducerje. Potencialni ligandi vključujejo, vendar pa niso vezani na to, sesalske hormone, kjer so receptorji sorodni izvencelični peptid, ki veže
-3ligande. Poleg tega, predloženi izum opisuje uporabo celičnega sistema, ki izraža mnogokratne heterologne beljakovine, vključno z dvema heterolognima fuzijskima beljakovinama, za določevanje specifične in povratne vezave liganda in receptorja. Specifično interakcijo zgoraj opisane vezave lahko brez težav detektiramo z merljivo spremembo v celičnem fenotipu, na primer rast na selektivnem mediju.
POVZETEK IZUMA
En vidik predloženega izuma se nanaša na nove modificirane gostiteljske celice za izražanje heterolognih fuzijskih beljakovin. Nove modificirane gostiteljske celice obsegajo:
a) gensko sekvenco za kodiranje heterologne fuzijske beljakovine; omenjeno fuzijsko beljakovino, obsegajočo prvi peptid peptidnega veznega para, ali segment omenjenega prvega peptida, ki je vezan bodisi na vezno področje DNA ali na njegovo ustrezno transkripcijsko aktivacijsko področje transkripcijske aktivacijske beljakovine.
b) gensko sekvenco, ki kodira heterologno fuzijsko beljakovino, omenjena fuzijska beljakovina pa vsebuje drugi peptid peptidnega veznega para v (a), ali segment omenjenega drugega peptida, zlitega bodisi z veznim področjem DNA ali z njegovim ustreznim transkripcijskim področjem, katerimkoli, ki ni bil uporabljen v (a) ;
c) reporterski gen, ki je operativno združen z transkripcijskim aktivacijskim proteinom, ali z njegovim delom;
d) opcijsko, izbris ali mutacijo v kromosomski DNA v gostiteljski celici kvasovke za transkripcjsko aktivacijsko beljakovino, če je navzoča v gostiteljski celici.
Te nove modificirane gostiteljske celice predloženega izuma se lahko uporabljajo za ugotavljanje interakcije testnega vzorca z
-4izbranim peptidom peptidnega veznega para; na primer, celica se lahko uporablja za ugotavljanje interakcije testnega vzorca z izbranim ligandom ali receptorjem.
Drugi vidik predloženega izuma se nanaša na nove modificirane celice in na presejalne metode, ki prikazujejo interakcijo testnega vzorca z izbranim peptidom in receptorjem z razpoznavno spremembo v fenotipu. Celica kaže spremembo v fenotipu samo v navzočnosti testne spojine, ki ima vezno afiniteto za peptid ali peptidni vezni par, na primer, vezno afiniteto za ligand ali njegov receptor.
Tretji vidik predloženega izuma se nanaša na nove celice in presejalne postopke, ki omogočajo razpoznati, na kateri peptid ali peptidni vezni par se veže testni vzorec.
Četrti vidik predloženega izuma se nanaša na nove celice, ki izražajo tri ali več heterolognih komponent za proučevanje multi-beljakovinskih združitev višjega reda med tremi ali več peptidi (na primer, tako kot proučevanje dimerizacije odvisne od liganda).
Definirani izrazi:
Izraz peptidni vezni par se nanaša na katerikoli peptidni par z znano vezno afiniteto, za katerega je znana sekvenca DNA, ali pa jo lahko izpeljemo. Peptidi peptidnega veznega para morajo pokazati vzajemno preferencialno vezavo po katerikoli komponenti modificirane celice.
Izraz peptid, kot se uporablja v gornjem povzetku in tu, pomeni katerikoli peptid, polipeptid ali beljakovino, če drugače ni določeno. Kot je bilo omenjeno zgoraj, peptida peptidnega veznega
-5para sta lahko ligand in njegov ustrezni receptor, ali ligand in katerikoli peptid z znano vezno afiniteto za ligand.
Heterologni, kot se uporablja v gornjem povzetku in tu, pomeni peptide, ki (1) se ne izražajo v naravno nastopajočih gostiteljskih celicah ali (2), se izražajo v modificiranih gostiteljskih celicah po metodi izražanja drugačni od metode izražanja, s katero bi gostiteljska celica normalno izrazila peptid.
Če ni specificirano drugače, izraz receptor, kot se uporablja tukaj, zajema izraze receptor, topni receptor, transducer in vezno beljakovino. Pri prednostnem uresničevanju izuma je uporabljeni receptor receptor ali topni receptor, ki mu dajemo prednost.
Receptor, kot ga uporabljamo tukaj, pomeni plazemske membranske beljakovine, ki vežejo specifične molekule, kot faktorje rasti, hormone ali nevrotransmiterje, ki prenašajo signale v notranjost celic, kar povzroča, da se celica odzove na specifičen način. To vključuje posamezne transmembranske beljakovine.
Topni receptor pomeni netransmembransko obliko receptorja, ki ima sposobnost vezanja liganda. To so receptorji, ki jih izloča celica bodisi s proteolizo ali alternativno zvito mRNA.
Vezna beljakovina pomeni beljakovine, ki kažejo vezno afiniteto do specifičnega liganda. Vezne beljakovine lahko proizvajajo ločeni in razločni geni. Za dani ligand, se vezne beljakovine, ki jih proizvajamo iz specifičnih genov, razlikujejo od ligandnega veznega področja receptorja ali njegovega topnega receptorja.
Transducer pomeni molekulo, ki omogoča konverzijo enega signalnega načina v drugega, molekula pa je brez težav spoznana kot
-6transducer za enega ali več peptidov peptidnega veznega para, na primer transducer za skupino ligand/receptor.
KRATEK OPIS RISB
Slika 1 je shematski diagram celice, ki izraža iz dveh ločenih plazmidov dve heterologni zliti beljakovini (ena je ligand zlit z aktivacijskim področjem transkripcijske aktivacijske beljakovine, druga zlita beljakovina pa je receptor zlit z veznim področjem DNA transkripcijske aktivacijske beljakovine). Slika prikazuje izražanje obeh zlitih beljakovin in vezavo liganda in receptorja, ki privede skupaj vezno področje in aktivacijsko področje, obnavljajoč transkripcijsko aktivacijsko beljakovino. Ko je prepisovalna aktivacijska beljakovina obnovljena in zasidrana prek veznega področja DNA na položaj Upstream aktivacijske sekvence (UAS), se začne prepisovanje reporterskega gena (HIS3).
Slika 2 vsebuje fotografije plošč, ki prikazujejo rezultate rastnih eksperimentov vodenih v vzorcu 1 za verige CY722, CY723, CY724, in CY781 na neselektivnem mediju in na selektivnem mediju, to so fotografije A oziroma B.
Slika 3 je shematski diagram dimernega modela, v katerem se ligand veže na dvojni receptorski sistem. Shematski diagram prikazuje celico, ki izraža beljakovine iz treh ločenih plazmidov. Dve heterologni zliti beljakovini (prva zlita beljakovina je prvi receptor zlit z aktivacijskim področjem transkripcijske aktivacijske beljakovine, druga zlita beljakovina pa je drugi receptor zlit z DNA-veznim področjem transkripcijske aktivacijske beljakovine) sta izraženi in prosti ligand (to je ligand, ki ni zlit z nobeno od dveh področij transkripcijske aktivacijske beljakovine) se izraža iz tretjega plazmida. Slika prikazuje izražanje obeh zlitih beljakovin in vezavo prostega liganda in dva
-7receptorska zlitja, ki privedeta skupaj vezno področje in aktivacijsko področje, obnavljajoč transkripcijsko aktivacijsko beljakovino. Ko je transkripcijska aktivacijska beljakovina obnovljena in zasidrana prek DNA-veznega področja na položaj Upstream aktivacijske sekvence (UAS), se začne prepisovanje reporterskega gena (HIS3).
Slika 4 je fotografija plošče rasti, dobljena za verige CY846 in CY847 iz vzorca 3, ki prikazuje stimulacijo receptorske dimerizacije v odvisnosti od liganda.
DETAJLNI OPIS IZUMA
Modificirana celica v smislu tega izuma uporablja gostiteljsko celico. Učinkovita gostiteljska celica za uporabo v predloženem izumu enostavno zahteva, da je genetsko definirana, da bi lahko gradila primerno izražanje heterolognih zlitih beljakovin, reporterja(jev) in katerokoli drugo želeno genetsko manipulacijo. Gostiteljska celica je lahko katerakoli evkariotska celica, vretenčarska ali nevretenčarska. Gostiteljska celica je lahko sesalska kot tudi amfibijska, na primer jajčna celica Ksenopusa. Prednostno je, da je gostiteljska celica glivična celica, na primer Aspergilla ali Neuropora. V prednostnih izvedbah je gostiteljska celica celica kvasovk. V alternativnih prednostnih izvedbah je celica kvasovke Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe ali Pichia pastoris.
Modificirana celica uporablja vsaj dva gena za ločeno izražanje dveh heterolognih fuzijskih beljakovin. Ena izmed teh fuzijskih beljakovin obsega prvi peptid peptidnega veznega para, ali segment omenjenega prvega peptida, ki je združen bodisi z DNA-veznim
-8področjem ali njegovim ustreznim transkripcijskim aktivacijskim področjem transkripcijske aktivacijske beljakovine. Druga fuzijska beljakovina obsega drugi peptid peptidnega veznega para ali njegov segment. Drugi peptid je zlit bodisi z veznim področjem DNA ali njegovim ustreznim transkripcijskim aktivacijskim področjem, od katerih nobeden ni uporabljen v prvi heterologni fuzijski beljakovini. Aktivnost vezave med peptidi peptidnega veznega para kontroliramo z uporabo reporterskega gena, ki je operativno združen s transkripcijsko aktivacijsko beljakovino uporabljeno v dveh fuzijskih beljakovinah.
Transkripcijska aktivacijska beljakovina se lahko toliko časa močno spreminja, dokler so znana vezna področja DNA in aktivacijska področja, ali pa jih lahko izpeljemo s pomočjo razpoložljivih znanstvenih metod. Transkripcijska aktivacijska beljakovina je lahko katerakoli beljakovina, ki ima dve komponenti, DNA-vezno komponento in aktivacijsko komponento, kjer transkripcijska aktivacijska beljakovina vsebuje kislinski alfa heliks za aktivacijo prepisovanja. Prednostno je, da izberemo prepisovalno aktivacijsko beljakovino iz Gal4, Gcn4, Hapl, Adrl, Swi5, Stel2, Mcml, Yapl, Acel, Pprl, Arg81, Lac9, QalF, VP16, LexA, nesesalskih jedrskih receptorjev (na primer ekdison) ali sesalskih jedrskih receptorjev (na primer estrogen, androgeni, glukokortikoidi, mineralo-kortikoidi, retinojska kislina in progesteron; glej tudi Picard in ostali, 1990). Prednostno je, da je transkripcijska aktivacijska beljakovina beljakovina kvasovk, še bolj prednostno pa je, da izberemo transkripcijsko beljakovino kvasovk izmed Gal4, Gcn4 ali Adrl. Pripominjamo, da lahko uporabimo katerokoli vezno beljakovino DNA, ki deluje z aktivacijskim področjem. Vezno beljakovino DNA lahko zamenjamo za DNA-vezno področje transkripcijske aktivacijske beljakovine, če so ustrezno zgrajene razpoznavne sekvence, ki so operativno združene
-9z reporterskim genom. Ilustrativni za DNA-vezne beljakovine nekvasovk so receptorji sesalskih steroidov in bakterijelni LexA (glej Wilson in ostali, 1996).
Na splošno izberemo reporterski gen tako, da lahko kontroliramo vezavo področij transkripcijske aktivacijske beljakovine s pomočjo znanih in naprednih tehnik. Prednostno je, da izberemo reporterski gen glede na njegovo ceno, na enostavnost merjenja njegove aktivnosti in nizko ozadje (to je, aktivnost lahko določimo pri sorazmerno nizkih nivojih izražanja reporterskega gena zaradi visokega razmerja signala proti ozadju in/ali nizke ali nobene inducirane aktivnosti). Reporter je lahko katerikoli reporter, za katerega lahko merimo aktivnost s pomočjo katerihkoli razpoložljivih sredstev. Ilustrativni za reporterje, ki jih lahko uporabimo v predloženem izumu, so reporterski geni, izbrani iz naslednjih skupin:
a) lacZ, gen luciferaze, beljakovinski zeleno fluorescenčni gen, CAT
b) geni, ki komplementirajo aukstrofije, kot HIS, URA, LEU, ARG, MET, ADE, LYS, TRP.
c) geni, ki podelijo antibiotično odpornost, kot neo, KAN,
d) geni, ki podelijo občutljivost na kemikalije, kot CYH2, CAN1 (odpornost na kanavin). V mnogih izvedbah je lahko primerno za reporterski gen, da preprečuje rast (CYH2). Prednostno je, da določimo aktivnost reporterskega gena s kolorimetričnimi ali fluorescenčnimi metodami in/ali z merjenjem rasti kvasne celice.
Kot smo predhodno omenili, je peptid, ki ga uporabljamo v modificirani celici, peptid peptidnega veznega para, za katerega poznamo tako sekvenco DNA kot tudi sekvenco drugega peptida veznega para. Peptidi so lahko tudi peptidi peptidnega veznega kompleksa, ki vsebujejo dva ali več peptidov, ki drug drugega vežejo in tvorijo vezni kompleks. Peptida peptidnega veznega para
-10sta lahko specifični ligand in ustrezni receptor ali katerikoli drugi peptidi, ki se preferencialno vežejo drug na drugega, kot podenote nekega encima.
Ena od pomembnih prednosti tega izuma je odkritje, da lahko uporabimo modificirane celice, ki uporabljajo DNA-vezno in aktivacijsko področje transkripcijske beljakovine, za kontrolo vezave peptidov peptidnega veznega para, ki vežejo s pomočjo izvencelične interakcije. Vsekakor pa, če želimo, lahko uporabimo tudi peptide, ki vežejo s pomočjo intracelularne interakcije, v katerikoli od novih modificiranih celic in postopkih v smislu izuma. Peptidi so lahko iz celic sesalcev ali iz celic nesesalcev. Ena od najvažnejših izvedb v smislu predloženega izuma se nanaša na aplikacijo novih modificiranih celic in ustreznih presejalnih metod v smislu izuma za proučevanje številnih interakcij sesalskih peptidov. Sesalski peptidi vključujejo interakcije sesalskih ligand/receptorjev, kot interakcije hormon/receptor. Ilustrativni za peptidne hormone, ki jih lahko uporabimo v predloženem izumu, so peptidi, ki jih izberemo, vendar pa nas to ne omejuje, iz ene od naslednjih skupin: (a) skupina, ki jo sestavljajo citokini, interleukini, hematopoetski faktorji rasti, inzulin, faktorji rasti podobni inzulinu, hormoni rasti, prolaktin, interferoni in faktorji rasti; (b) ligandi za receptorje združene z G-proteinom; (c) ligandi za nevretenčarske receptorje; (d) ligandi za guanilil ciklazne receptorje; (e) ligandi za tirozin fosfatazne receptorje.
V alternativnih izvedbah je peptid faktor rasti, ki je izbran iz epidermne GF, GF živcev, faktorjev za inhibicijo leukemije, fibroblasta GF, GF izvirajoče iz krvnih ploščic, vaskularne endotelialne GF, tumornega nekrotizirajočega faktorja, onkostatina M, ciliarnega nevrotrofičnega faktorja, eritropoetina, Steel faktorja, laktogena placente in transformirajoče GF β.
-11V raznih prednostnih izvedbah je peptidni hormon ligand za z G-proteinom združeni receptor, kot faktor, ki izloča hormon rasti, sekretin, vazoaktivni inhibitorski peptid, glukagon, tirotropin, interleukin-8, luteinizirajoči hormon (LH) in hormon, ki stimulira folikel (FSH).
V dodatnih alternativnih izvedbah je uporabljeni peptid nevretenčarski peptid, kot tisti izbrani iz skupine, ki jo sestavljajo rastlinski sistemin in razločevalni peptidi žuželk. Vendar, v prednostnih izvedbah izberemo peptid iz skupine sestoječe iz sesalskih peptidov, in še bolje, iz sesalskih peptidnih hormonov.
Opomnili smo tudi, da so specifične vrste receptorjev peptidi peptidnega veznega para ali peptidnega veznega kompleksa. Ilustrativni za razne receptorje so tisti, ki so izbrani iz ene od naslednjih skupin: (a) celična adhezijska molekula; (b) imunomodulatoma, antigensko razpoznavna ali demonstracijska molekula ali drugi sorodni peptidi. Ilustrativni za celične adhezijeske molekule so ICAM, VCAM, ECAM, fibronektin, integrin, selektin in fibrinogen. Ilustrativni za imunomodulatorno, antigensko razpoznavno ali demonstracijsko molekulo so T celični receptorski kompleks, B celični receptorski kompleks, Fc receptorji, kompleks I z večjo histokompatibilnostjo, kompleks II z večjo histokompatibilnostjo, CD4, CD8, CD27, CD30, MAC kompleks.
Pripominjamo tudi, da lahko uporabljamo tudi specifične vrste transducerjev, kot peptide peptidnega veznega para ali peptidnega veznega kompleksa. Uporabljeni transducerski protein je lahko katerikoli protein, ki veže vsaj enega od peptidov peptidnega veznega para ali peptidnega veznega kompleksa. Transducerske beljakovine vključujejo gp 130, kh97, AIC2A, AIC2B.
-12Prednostno, heterologne zlite beljakovine se izražajo s spremembo celice kvasovke z neodvisno-replicirajočim plazmidom, ki je sposoben izražanja fuzijske beljakovine, čeprav se lahko slednje izražajo s kromosomsko modifikacijo.
Kot smo zapisali, so presejalni postopki v smislu izuma načrtovani tako, da ugotavljajo, ali je testni vzorec sposoben vplivati na vezavo peptidnega veznega para, na primer na interakcijo liganda z receptorjem. V osnovi, metoda obsega določevanje aktivnosti reporterskega gena pri dodajanju testnega vzorca modificirani gostiteljski celici predloženega izuma pod pogoji, ki so primerni za določevanje aktivnosti v prisotnosti vzorca ali pod pogoji, pri katerih modificirana gostiteljska celica pokaže tako aktivnost samo v prisotnosti vzorca, ki ima vezno interakcijo s peptidnim veznim parom. Prednostno, aktivnost reporterskega gena določimo z merjenjem spremembe v izbranem fenotipu, ki je v direktnem sorazmerju z aktivnostjo reporterja.
Nove modificirane celice v smislu izuma se z lahkoto uporabljajo v raznih presejalnih postopkih za določevanje vezne aktivnosti nekega testnega vzorca. Testni vzorec je lahko peptid, ki ima, prednostno, dolžino dveh aminokislin, ali kemijska spojina, ki ni peptid. Nepeptidni testni vzorec vsebuje spojine, komplekse in soli, kot tudi vzorce naravnih produktov, kot rastlinski ekstrakti in materiali, dobljeni iz fermentacijskih brozg. Modificirane gostiteljske celice gojimo v primernih rastnih pogojih za proučevanje interakcije testnega vzorca z vezno interakcijo peptidnega veznega para. Modificirane gostiteljske celice vnesemo v rastno okolje, ki prednostno vsebuje agar, tako da položimo testni vzorec na površino rastnega medija. Rastno okolje je, prednostno, konvencionalni tekoči medij rastnih reagentov in vode, kot kvasni sintetični medij (YSM, ki ga dobimo iz BIO101) (glej tudi Rose in ostali, Metode v genetiki kvasovk, 1990).
-13Ena od izvedb predloženega izuma je usmerjena k novi modificirani gostiteljski celici in presejalnemu postopku, ki prikaže interakcijo testnega vzorca z izbranim peptidnim veznim parom s pomočjo razpoznavne spremembe v fenotipu. Taka modificirana gostiteljska celica pokaže spremembo v fenotipu samo v prisotnosti testne spojine, ki ima vezno afiniteto do enega od peptidov peptidnega veznega para. Tako gostiteljsko celico navajamo tu kot rešilni sistem. Normalno se pokaže celični odziv, ko medsebojno delujeta oba področja transkripcijske aktivacijske beljakovine. Vendar, v rešilnem sistemu ni pozitivne indikacije spremembe v fenotipu, ko medsebojno delujeta oba področja transkripcijske aktivacijske beljakovine. Pozitivna indikacija spremembe v fenotipu nastane samo v primeru, da testni vzorec prekine interakcijo dveh področij transkripcijske aktivacijske beljakovine. V rešilnem sistemu je modificirana gostiteljska celica sposobna izraziti vsaj dve heterologni fuzijski beljakovini. Poleg tega, gostiteljska celica vsebuje: reporterski gen operativno združen z transkripcijskim aktivacijskim proteinom; kjer omenjeni reporterski gen preprečuje ekshibicijo specifičnega fenotipa na selektivni medij zaradi izražanja transkripcijskega aktivacijskega proteina, ali njegovega dela. Mutacija v kromosomski DNA gostiteljske celice omogoča popolno spremembo določljivega fenotipa, na selektivnem mediju, v odsotnosti izražanja reporterskega gena. Če je potrebno, obstaja izbris ali mutacija v kromosomski DNA gostiteljske celice za transkripcijski aktivacijski protein, tako da se transkripcijska aktivacija dogaja samo na produktivni interakciji izbranega veznega para. Samo če testni vzorec prekine interakcijo dveh področij transkripcijske aktivacijske beljakovine, bo modificirana celica rasla ali preživela ali prikazala drug izbrani fenotip. Prednostno, fenotip ustreza rasti celice.
-14Ko uporabimo presejalni postopek, kot smo razpravljali zgoraj, za ugotavljanje, ali testni vzorec medsebojno deluje z, ali raje pretrga, vezavo peptida opaženo v odsotnosti testnega vzorca, uporabimo drugo presejanje za ugotavljanje specifične vezne afinitete testnega vzorca, to je, na kateri peptid peptidnega veznega para se veže testni vzorec. Sekundarna sita uporabljajo nove celice tega izuma, kjer so celice prilagojene za prikaz fenotipa, ali spremembo v fenotipu, samo v navzočnosti testnega vzorca, ki veže enega od peptidov peptidnega veznega para. Eden od prednostnih postopkov za določevanje specifičnih veznih značilnosti testnega vzorca obsega uporabo celic, ki vsebujejo učinkovito (sorazmerno visoko) število kopij enega od obeh fuzijskih proteinov, ki vsebuje enega od peptidov. Učinkovito število kopij je katerokoli zadostno število kopij, ki omogoča določevanje specifične vezave testnega vzorca. Prednostno je število kopij genov vsaj okoli 5, prednostno pa sega od okoli 5 do okoli 50, pri čemer so višja števila kopij najbolj zaželena. Drugi fuzijski protein se zadržuje pri sorazmernem nizkem (1 do 2 kopij na celico) bodisi z intergracijo v celični kromosom ali z uporabo kromosomske centromerne sekvence na ekspresijskem plazmidu. Če uporabljamo visoko število kopij prvega peptida v celici v smislu izuma, bo celica bolj občutljiva na prisotnost testnega vzorca, ki veže drugi peptid peptidnega veznega para, ker omejujoča količina drugega peptida določa stopnjo aktivnosti reporterskega gena (to je, opaženo spremembo v fenotipu). Obratno, če uporabimo visoko število kopij gena, ki kodira drugi peptid peptidnega veznega para, bo celica bolj občutljiva na prisotnost testnega vzorca, ki veže prvi peptid, ker omejujoča količina drugega peptida določa stopnjo aktivnosti reporterskega gena (to je, opaženo spremembo v fenotipu). Direktna primerjava učinkov testnega vzorca na fenotipe obeh vrst (receptor >>>> ligand proti ligand receptor) pokaže na specifično proteinsko interakcijo spojine. Kot smo obravnavali
-15zgoraj, se geni, ki izražajo peptide, kot tudi reporterski geni izražajo prednostno s pomočjo transformacije celice kvasovk z neodvisno replicirajočim plazmidom.
Dodatna modificirana gostiteljska celica v smislu izuma je usmerjena k celicam, ki jih lahko uporabimo za proučevanje peptidnih ligandov, ki uporabljajo dvojne receptorje ali en receptor in en transducer za aktivacijo ali transmisijo signala iz vezave mnogokratnih peptidnih veznih komponent, to je, tri ali več peptidnih veznih komponent.
Receptorska dimerizacija je prvi kritični korak za transdukcijo signala za nekatere razrede receptorjev. Dimerne receptorske strukture so lahko sestavljene iz enakih receptorskih enot (primeri: inzulinski receptor, IGF-I receptor, PDGF receptor, insertni področni receptor kinaze (KDR), ali faktor stimuliranja kolonije (CSF)-I receptor), ali neenake receptorske enote (primeri: IL-6R + gpl30; inzulin-IGF-I hibridni receptor; LIF + gpl30; CNTF + gpl30; razni interferonski receptorji).
Sestavine modificirane gostiteljske celice za kontrolo vezne aktivnosti peptida, ki ima dvojni receptorski sistem so naslednje: genska sekvenca (a) je genska sekvenca, ki kodira heterologno fuzijsko beljakovino; omenjena fuzijska beljakovina vsebuje en peptid mnogokratnega peptidnega veznega kompleksa, ali segment omenjenega peptida, ki je združen z bodisi veznim področjem DNA ali njegovim ustreznim transkripcijskim aktivacijskim področjem transkripcijske aktivacijske beljakovine; in genska sekvenca (b) je genska sekvenca, ki kodira heterologno fuzijsko beljakovino; omenjena fuzijska beljakovina vsebuje drugi peptid omenjenega mnogokratnega peptidnega veznega kompleksa, ali segment omenjenega receptorja, ki je zlit z bodisi DNA-veznim
-16področjem ali z njegovim ustreznim transkripcijskim aktivacijskim področjem, katerimkoli, ki ni bil uporabljen v (a). Modificirana gostiteljska celica za proučevanje mnogokratnega peptidnega veznega kompleksa, kot dvojni receptorski sistem, vsebuje tudi primeren reporterski gen in kromosomske mutacije za specifično analizo peptidne ligand/receptor interakcije, kot je bilo dalje obravnavano. Lahko izrazimo tretji peptid (na primer ligand) za vpeljavo kontrole za primerjalno ali konkurenčno testiranje.
Kot je bilo omenjeno zgoraj, za proučevanje mnogokratnih peptidnih veznih kompleksov, to so beljakovine višjega reda, ki vsebujejo tri ali več peptidov, se lahko dejansko poslužujemo modificirane celice predloženega izuma za izražanje treh ali več peptidov. V primeru tripeptidnega veznega kompleksa lahko zlijemo kateregakoli od dveh peptidov z dvema komponentama transkripcijske aktivacijske beljakovine. Na primer, za proučevanje interakcije liganda, ki je aktiven prek receptorske dimerizacije, lahko izražamo receptorje kot zlite proteine, pri čemer je ligand izražen kot nefuzijski protein. Tak sistem gostiteljske celice lahko uporabimo tudi za proučevanje večproteinskih encimskih kompleksov. Za vsak večpeptidni vezni kompleks lahko identificiramo nove peptide, ki vzajemno delujejo s kompleksom, tako da izražajo nove proteine iz slučajnih komplementarnih sekvenc DNA (na primer cDNA knjižnice), ki so zlite z enim od področij transkripcijske aktivacijske beljakovine. V takem sistemu je eden od znanih peptidov peptidnega veznega kompleksa zlit z drugim področjem transkripcijske aktivacijske beljakovine, medtem ko so druge enote peptidnega veznega kompleksa izražene kot nefuzijski peptidi. Nadalje pripominjamo, da naj bi bilo število peptidov, ki jih izraža gostiteljska celica omejeno samo glede na razpoložljiva sredstva detekcije in na zmogljivost gostiteljske celice.
-17Novi presejalni postopki se lahko uporabljajo za identifikacijo spojin, ki medsebojno delujejo s katerimkoli peptidnim veznim parom, na primer, katerimkoli receptorjem in/ali ligandom. Poleg tega, ta modificirani celični sistem z reporterskim genom za tvorbo sita lahko uporabimo za vsako medsebojno delovanje proteina s proteinom, da bi odkrili nove spojine, ki prekinejo to interakcijo. Kot specifični primeri: a) proteinske kinaze vpletene v raku lahko vnesemo v sistem za hitro prešejanje novih spojin, ki blokirajo kinazno-tarčno interakcijo in bi tako lahko služile kot edinstvena terapija za rak; b) proteini virusne ovojnice, kot glikoproteini človeškega virusa imunske pomanjkljivosti in ustrezni proteini receptorske površinske celice, kot CD4, se lahko vnesejo v sistem za hitro presejanje spojin, ki prekinejo to interakcijo in lahko služijo kot protivirusni agensi; c) dve podenoti za plazmodijski ribonukleotidni reduktazni encim se lahko izražajo v sistemu za presejanje spojin, ki preprečujejo to specifično proteinsko združbo in tako lahko služijo kot novi protimalarijski agensi.
Naslednje primere navajamo v nadaljnjo ilustracijo raznih vidikov predloženega izuma. Ne smemo jih pa tolmačiti kot omejujoče za izum.
Primer 1: Specifična in povratna interakcija ligand-receptor
Fuzijske proteine, ki kodirajo gene, proizvajamo s kloniranjem rastnega hormona (GH) in receptorskih (GHR) cDNA- sekvenc rastnega hormona v plazmide, ki vsebujejo kodirno področje za področja Gal4. Zlitja (Gal4) DNA-veznega področja se naredijo v pAS2, kar je opisano v Wade Harper in ostalih. Zlitja genskih aktivacijskih področij (Gal4) se naredijo v pACT-II, kar je enako pACT (opisano v Durfee in ostalih, 1993) razen z modifikacijo polilinkerskega
-18področja. Naslednja sekvenca se doda v Bgl II položaj: Bgl II hemaglutinin epitop - Ndel - Ncol - Smal - BamHI - EcoRI - Xhol Bgl II, kot je prirejeno iz polilinkerske sekvence pAS2 (Wade Harper in ostali, 1993). cDNA-kodiranje starejših peptidov za prašičji GH izvajamo z uporabo tehnike standardne verižne reakcije s polimerazo (PCR) (glej Finney, 1993).
Oligonukleotide preparirane na ABI oligosintetizerju načrtujemo v skladu s publicirano sekvenco cDNA za prašičji GH (glej Su in El-Gewely, 1988). 30 bazni 5' oligonukleotid poseduje Ncol položaj (5 '-CATGCCATGGAGGCCTTCCCAGCCATGCCC 3') in 27 bazni 3'oligonukleotid poseduje BamHI - mesto (5' CGGATCCGCAACTAGAAGGCACAGCT -3'). GH cDNA proizvedemo z uporabo knjižnice prašičje hipofize lambda gtll kot vira matrice. Dobimo fragment 540 bp vezan v vektor pCR II (Invitrogen Corp.), rekombinante potrjuje cepitev z restrikcijskim encimom, in DNA proizvedemo kot opisano v Maniatusu in ostalih, 1982. cDNA-sekvenco potrjuje barvna deoksi- terminalna reakcija, ki uporablja reagente in zapisnike Perkin-Elmer Cetus korporacije in avtomatizirani sekvenčnik ABI 373A. GH DNA direktno kloniramo v pACT-II preko položajev Ncol in BamHI. cDNA, ki kodira izvencelično področje GHR, proizvajamo z uporabo standardnih postopkov PCR. Za proizvodnjo fragmenta 742 bp za kodiranje aminokislin 1-247 podganjega GHR (Baumbach in ostali, 1989) uporabljamo 33 bazni 5' oligonukleotid, ki vsebuje položaj Ncol (5'- CATGCCATGGAGATGTTTCCTGGAAGTGGGGCT-3') in 39 bazni 3'-oligonukleotid, ki vsebuje terminatorski kodon, ki mu sledi Ncol- mesto (5'-CATGCCATGGCCTACCGGAAATCTTCTTCACATGCTGCC-3 ' ) . To GHR cDNA kloniramo v pCRII vektor, kot predhodno opisano zgoraj, in nato subkloniramo v Ncol-mesto vektorja pAS2. DNA končnih rekombinantnih vektorjev spremenimo v verige kvasovk s pomočjo postopka litijevega acetata (Rose in ostali, 1990).
-19Gostitelja iz kvasovk (Υ190), ki vsebuje reporterski gen UASgal - HIS, pripravimo v skladu s postopkom opisanim v Wade Harper in ostali, 1993. Genotip verige Υ190 je MATa leu2-3, 112 ura3-52 trpl-901 his3d200 ade2-101 gal4 gal80 URA3:;GAL-lacZ LYS2::GAL-HIS3 cyhr. Verigo Υ190 transformiramo z obema fuzijskima konstruktoma ali z enim samim fuzijskim konstruktom plus nasprotni vektor, ki ne vsebuje heterolognih sekvenc. Za vse verige je bilo ugotovljeno, da pokažejo enako rast v neselektivnem okolju (Slika 2A). Te verige nato preskusimo na rast v selektivnem okolju (to je, rastno okolje, ki mu manjka aminokislina, ki jo sintetiziramo z aktivacijo reporterskega gena). Samo veriga, ki vsebuje oba hibridna proteina (CY722), je sposobna za rast, medtem ko verige, ki vsebujejo bodisi samo ligandno ali receptorsko zlitje, ne rastejo (CY724 oziroma CY723; Slika 2B). Dva neodvisna vzorca vsake verige izravnamo na sintetičnem mediju, ki vsebuje 2% glukoze, dušično bazo kvasovk, amonijev sulfat, 0,1 mM adenina in 60 mM 3-amino-triazola (plošča B) ali na istem mediju z dodatkom histidina (plošča A). Ploščo A postavimo v inkubator pri 30° C za tri dni; ploščo B pa za pet dni. Ti rezultati pokažejo, da GH in GHR lahko posredujeta pri aktivaciji reporterskega gena odvisni od Gal4 v interakciji, ki je vzpodbudna za vezavo ligand-receptor.
Primer IA: Konkurenčni izraženi prosti ligand (GH) v navzočnosti fuzijskih GH in GHR-proteinov.
Da bi utemeljili navidezno vezavo GH z njegovim receptorjem v tujem okolju jedra kvasovke, modificiramo sistem z dodatkom tretjega plazmida, ki posreduje pri izražanju prostega liganda, da bi pokazal, da peptid GH konkurira s fuzijskim proteinom GH-Gal4, pri čemer obrne 2-hibridno interakcijo prikazano na primeru 1. Starševsko verigo Υ190 (Wade Harper in ostali, 1993) gojimo na mediju, ki vsebuje 5-fluoro-orotično kislino za
-20selekcijo derivatov, ki spontano izgubijo gene URA3 (glej Rose in ostali, 1990). Rezultirajočo verigo, označeno s CY770, uporabljamo za vse eksperimente, ki preiskujejo učinke proteina konkurenčno izraženega iz tretje komponente ( to je tretji plazmid). cDNA, ki kodira GH, proizvajamo s postopkom PCR z uporabo 38 baznega 5' oligonukleotida, ki vsebuje položaj EcoRI (5' -CCGAATTCAAAATGGCCTTCCCAGCCATGCCCTTGTCC-3') in 26 bazni 3' oligonukleotid, ki vsebuje mesto Hindlll (5'CCAAGCTTCAACTAGAAGGCACAGCT-3') za sledeče subkloniranje v vektor pCUP. pCUP je inducibilni ekspresijski vektor kvasovke, ki izhaja iz pRS316 (Hill in ostali, 1986). Na kratko, vektor zgradimo z insercijo 3' konca PGK-gena kvasovke (iz pPGK: Kang in ostali, 1990) v pRS316regijo za kloniranje kot fragment BamHI-Sall, ki služi kot transkripcijski terminator. V zvezi s tem plazmidom, PCR razširi področje CUP1 promotorja (Butt in ostali,1984) kot fragment SacI-EcoRI in ga vgradi v ustrezne položaje plazmida, da tvori pCUP. GH-ekspresijski plazmid (GH-pCUP) nato so-trans formiramo s fuzijskimi konstrukti GH in GHR v verigo CY770 za tvorbo CY781. Konkurenčno izražanje prostega GH s fuzijskimi proteini GH in GHR (CY781) se izkaže z blokiranjem od GH-GHR odvisne celične rasti na selektivnem mediju (Slika 2B). Ta poskus tipizira konkurenčni poskus in vivo in dokazuje povratnost opazovane interakcije ligand-receptor.
Primer IB: Vezava peptidnega hormona prolaktina (PRL) in njegov receptor
Da bi razširili in potrdili to tehnologijo, smo razvili podobni sistem z uporabo peptidnega hormona prolaktina (PRL) in njegovega receptorja. Prolaktin je strukturno soroden GH in prolaktinov receptor (PRLR) je tudi član receptorske superdružine citokinov. V nasprotju z človeškim GH, GH sub-primatov ne veže PRLR brez
-21težav (Young and Bazer, 1989); PRL ne veže z lahkoto niti GHR-a (Leung in ostali, 1987). Zreli prašičji PRL se tvori s fuzijo z aktivacijskim področjem GaL4. Oligonukleotidi so določeni za prašičji PRL (dobljen od Genbank Χ14068) in jih uporabljamo za proizvodnjo zrelega prašičjega PRL proteinskega hormona iz knjižnice prašičje hipofize lambda gtll z uporabo standardnih postopkov PCR. 31 bazni 5' oligonukleotid ima mesto EcoRI (5'-CGGAATTCTGCCCATCTGCCCCAGCGGGCCT-3') in ustreza sekvencam, ki kodirajo aminokisline 1-7. 30 bazni 3' oligonukleotid vsebuje mesto EcoRI (5'-GAATTCACGTGGGCTTAGCAGTTGCTGTCG-3') in ustreza področju cDNA 3' k endogenemu končnemu kodonu. Dobimo fragment 600 bp, ki je vezan v vektor pCR II in je potrjen s cepitvijo z restrikcijskim encimom in sekvenčno analizo. Preko mesta EcoRI kloniramo PRL cDNA v pACT-II.
Izvencelično področje prašičjega (PRL) receptorja (PRLR) proizvajamo z zlitjem z GAL4-DNA-veznim področjem. Oligonukleotide načrtujemo na osnovi mišje sekvence PRLR (Davis and Linzer, 1989). 31 bazni 5Oligonukleotid vsebuje mesto Smal (5'-TCCCCCGGGGATGTCATCTGCACTTGCTTAC-3'), medtem ko 31 bazni 3' oligonukleotid vsebuje končni kodon, ki mu sledi mesto Sall (5'-TCCGTCGACGGTCTTTCAAGGTGAAGTCATT-3'). Ti oligonukleotidi se nahajajo ob boku izvenceličnega področja PRLR in kodirajo aminokisline 1-229. Uporabljamo knjižnico prašičje hipofize lambda gtll kot vir matrice. Z uporabo standardnega postopka PCR proizvajamo fragment 687 bp vezan v pCRII in potrdimo nukleotidno sekvenco. PRLR cDNA kloniramo v pAS2 vektor preko restrikcijskih mest Smal in Sall.
Verigo Υ190 smo pretvorili s fuzijskim ekspresijskimi plazmidi PRL ali PRLR bodisi samo (CY727 oziroma CY728) ali skupaj (CY726). Celice, ki izražajo oba PRL in PRLR-zlitja so sposobne rasti na
-22selektivnem gojišču, verige, ki vsebujejo bodisi fuzijski ligand ali receptor pa tega ne zmorejo. Ti rezultati zrcalijo tiste, ki smo jih opazovali v sistemu GH-GHR v zgornjih primerih ter ugotavljajo splošno uporabnost 2-hibridnega sistema za preiskavo vezave liganda na člane te receptorske superdružine.
Primer 1C: Dodatna potrditev ligandno-receptorske specifičnosti novega celičnega sistema kvasovk
Razvili smo dodatne verige za oceno ligandno-receptorske specifičnosti. URA minus verige, ki izražajo fuzijske proteine GH in GHR, pretvorimo s pCUP ali PRL-pCUP; verige, ki izražajo fuzijske proteine PRL in PRLR pa pretvorimo s pCUP ali PRL-pCUP. Na kratko, PRL-pCUP zgradimo v obliki podobni tisti, ki smo jo opisali za GH-pCUP. PRL cDNA proizvedemo s PCR z uporabo 33 baznega 5' oligonukleotida z mestom EcoRI (5'-GAATTCAAAATGCTGCCCATCTGCCCCAGCGGG-3') in 3' oligonukleotida iz primera IB. Rezultirajoči fragment vnesemo v pCUP preko EcoRI mesta. Kot smo pokazali v gornjih primerih, veriga, ki izraža fuzijske proteine GH in GHR brez nobenega konkurenta raste na selektivnem mediju in to rast ukinemo s soizražanjem prostega GH. Preskus s prolaktinom proizvede podobne rezultatef, ki potrjujejo specifičnost vezave ligand-receptor v celici kvasovke. Veriga, ki nosi zlitja PRL in PRLR (CY787) lahko raste na selektivnem mediju, to rast pa ukinja izražanje prostega PRL (CY786; Tabela 1).
Za preskus selektivnosti GHR, verigo, ki vsebuje GH in GHR zlitja, pretvorimo s PRL-pCUP. Ta veriga raste na selektivnem mediju (CY785; tabela 1). Ti podatki pokažejo, da vezavi GH na njegov receptor v tem sistemu lahko učinkovito konkurira vezava prebitnega GH (CY751), ne pa sorodni peptid PRL (CY755). Rezultati gornjih preskusov, ki izražajo tri heterologne proteine,
-23ponazarjajo specifičnost interakcije(ij) ligand-receptor v sistemu v smislu tega izuma.
Tabela 1: Seznam verig in rezultati biopreskusov
| Oznaka | AD zlitje | BD zlitje | pCUP | Rast |
| CY700 | - | - | - | 0 |
| CY722 | GH | GHR | - | + |
| CY723 | vektor | GHR | - | 0 |
| CY724 | GH | vektor | - | 0 |
| CY726 | PRL | PRLR | - | + |
| CY770 | - | - | - | 0 |
| CY781 | GH | GHR | GH | 0 |
| CY784 | GH | GHR | vektor | + |
| CY785 | GH | GHR | PRL | + |
| CY786 | PRL | PRLR | PRL | 0 |
| CY787 | PRL | PRLR | vektor | + |
| Vse verige | kvasovk so | dobljene iz | verig Υ190 | (Wade Harper in |
| ostali, 1993). Genotip | je MATa ga!4 | gal80 his3 | trpl-901 ade2-101 |
ura3-52 leu2-3,112 URA3::GAL-lacZ LYS2::GAL-HIS3 cyh. Verige z isto številčno oznako ali z večjo od 770 nimajo URA3::GAL-lacZ gena. Pomišljaj pomeni, da veriga ne vsebuje označenega plazmida. AD zlitja so pACT izpeljanke; GH ali PRL so zlite z aktivacijskim področjem Gal4.
BD zlitja so derivati pAS2; izvencelična področja receptorjev GH ali PRL so zlite z DNA-veznim področjem Gal4. pCUP pomeni peptid izražen iz plazmida pCUP.
Izvleček iz rezultatov biopreskusov. Vsaka veriga je zrasla na selektivnem mediju v času 3 do 5 dni pri 30 C, nato smo beležili
-24celično rast, ki je označena s plusom.
Primer 2: Prešejanje za spojine , ki prekinejo interakcijo ligand-receptor
Plazmidi z nizkim številom kopij, ki izražajo fuzijske proteine GHR- ali GH-Gal4 (pOZ153 in, oziroma, pOZ152) so zgrajeni za zmanjšanje izražanja teh proteinov. Poleg tega smo zgradili novi reporterski gen, ki preprečuje razmnoževanje celic v selektivnem okolju, razen če ni prekinjeno izražanje. Za izgradnjo fuzijskega ekspresijskega plazmida GHR, izoliramo restrikcijski fragment SacI-BamHI, ki vsebuje kot sestavino promotor in sekvence GAL4 iz pASl (Durfee in ostali, 1993) in ga kloniramo v pUN30 (Elledge and Davis,1988). Izvencelično področje GHR-a nato zlijemo z GAL4 z vezavo kot fragment Ncol, kot je opisano v primeru 1, da bi se tvoril pOZ153. Da bi zgradili GH-fuzijski ekspresijski konstrukt, izoliramo celotno področje GH-Gal4 s? promotorskimi in končnimi sekvencami iz plazmida opisanega v primeru 1 kot fragment Pvul-Sall. Ta segment DNA kloniramo v pUNIOO (Elledge in Davis, 1988), tako da se tvori pOZ152. Reporterski gen zgradimo tako, da izoliramo kodirno področje kvasovke CYH2 in ga operativno povežemo z promotorjem GAL v ekspresijskem plazmidu kvasovke. Na kratko, promotorsko področje GALI vstavimo v YEp352 (Hill in ostali, 1986) kot fragment EcoRI-BamHI. PCR poveča sekvence CYH2 s pomočjo začetnih oligonukleotidov (5'-GGATCCAATCAAGAATGCCTTCCAGAT-3' in 5'-GCATGCGTCATAGAAATAATACAG-3') in pAS2 kot matrico. PCR-pridelke cepimo z BamHI plus Sphl in kloniramo v ustrezna mesta v vektorju YEp352-GAL. Ti plazmidi se pretvorijo v verige kvasovk CY770, ki nosijo mutacijo pri kromosomskem genu cyh2, pri čemer naredijo verigo odporno na inhibitor proteinske sinteze cikloheksimid. Prisotnost vseh treh plazmidov je potrebna za podelitev občutljivosti (cyh) na cikloheksimid.
-25Veriga (CY857), ki vsebuje fuzijske plazmide liganda in receptorja in plazmid reporterja, tvori osnovo za enostavno primarno sito za spojine, ki prekinejo vezavo GH z njegovim receptorjem. Verigo CY857 vložimo v standardno rastno okolje kvasovke, ki vsebuje 10.0 ^g/ml cikloheksimida. Zaradi interakcije ligand/receptor, ki vodi izražanje reporterskega gena CYH2, je veriga cyh in tako nezmožna rasti. Na to testno okolje položimo kemične spojine. Spojine, ki škodijo vezavi GH-GHR, identificiramo po rasti celic okoli spojine, ker v odsotnosti izražanja CYH2 postanejo celice odporne na cikloheksimid, ki je prisoten v mediju.
Sekundarno presejanje za določevanje tarče vzorca
Prekinitev vezave ligand-receptor v tem preskusu je lahko rezultat reakcije spojine bodisi s fuzijsko komponento receptorja ali liganda. Specifično tarčo nove spojine določimo z enostavnim sekundarnim preskusom, ki uporablja verige, ki presežno izražajo eno od fuzijskih beljakovin. Veriga CY858 izraža zlitje GHR-GAL4 v velikem presežku, ker se konstrukt zadržuje znotraj celice pri visokem številu kopij (pOZ149), GH-zlitje (pOZ152) pa zadržimo na ravni podobni osnovni verigi (CY857). Obratno, veriga CY859 izraža zlitje GH-GAL4 v velikem presežku, ker se ta konstrukt zadržuje znotraj celice pri visokem številu kopij (pKY14), medtem ko zadržujemo zlitje GHR (pOZ153) na ravni podobni osnovni verigi (CY857). Spojine, ki rešujejo rast v primarnem presejanju z uporabo CY857 (zlitja GH in GHR so izražena na plazmidih nizkih števil kopij) nato preskušamo na isti način z uporabo CY858 (GHR^GH) ali CY859 (GH^>>GHR) kot testne verige. Na primer, če vezavo ligand-receptor inhibira spojina, ki reagira z GHR, bo sekundarno presejanje pokazalo določljivo spremembo v merjenem fenotipu. Sekundarno testiranje rešilne spojine na verigi CY858, ki presežno izraža zlitje GHR, povzroča manjšo rast v prisotnosti
-26spojine kot tisto, ki smo jo opazili pri CY859. Določljiva sprememba v merjenem fenotipu se dogaja, ker presežna količina GHR titrira spojino, pri čemer se poveča izražanje CYH2 in inhibira celična rast. CY859 povzroča podobno spremembo kot CY857, ker je fuzijski protein GHR omejevalen. Spojina, ki vzajemno deluje z zlitjem liganda, pokaže v tem sekundarnem preskusu obratno spremembo v merjenem fenotipu.
Primer 3: Prikaz dimerizacije receptorja v odvisnosti od liganda
Mnogokratno proteinsko interakcijo (na primer, ligand-receptor-receptor) raziskujemo z razširjenim sistemom, ki izraža tretji protein z uporabo naslednje sheme.
Eno enoto dimera receptorja proizvedemo kot fuzijsko beljakovino z bodisi Gal4 DNA - veznim ali aktivacijskim področjem. Drugo enoto dimera receptorja proizvedemo kot fuzijsko beljakovino z Gal DNA-ustreznim veznim ali aktivacijskim področjem, katerimkoli, ki ni bil uporabljen pri prvem zlitju. Gen, ki kodira ligand, se izraža iz tretjega plazmida in ga proizvedemo kot prosti (nefuzijski) ligand. Interakcija fuzijskih beljakovin se dogaja samo v prisotnosti liganda (glej Sliko 3).
Interakcijo faktorja rasti vaskularnih endotelialnih celic (VEGF) z veznim področjem liganda njegovega sorodnega receptorja (KDR, receptor, ki vsebuje insertno področje kinaze) opisujemo tu kot primer za ta sistem. KDR je tirozinski kinazni receptor in predlagamo oblikovanje dimera (1 ligand - 2 receptorja) kot pomembnega za receptorsko funkcijo, ki jo inducira hormon. cDNA, ki kodira področje liganda KDR-a (Terman in ostali, 1991) izoliramo kot fragment Nco I - BamHI in ga kloniramo v oba vektorja pACT-II in pAS2. cDNA, ki kodira zrelo beljakovino za
-27VEGF, proizvedemo z uporabo standardnih tehnik PCR. Oligonukleotide konstruiramo iz publiciranih sekvenc (glej Tischer in ostali, 1991). Uporabljamo 34 bazni 5' oligonukleotid, ki vsebuje mesto EcoRI (5' -CGGAATTCGAAGTATGGCACCCATGGCAGAAGGA-3 ' ) in 28 bazni 3' oligonukleotid, ki vsebuje mesto EcoRI (5 '-CGGAATTCGGATCCTCATTCATTCATCA-3 ' ) za proizvodnjo fragmenta 450 bp, ki kodira zreli protein in ga kloniramo v EcoRI-mesto pCUP-a. DNA končnih rekombinantnih vektorjev pretvorimo v kvasovke s postopkom litijevega acetata, da bi proizvedli primerne verige.
Gostiteljsko verigo kvasovk (CY770) transformiramo s KDR-pACT-II, KDR-pAS2 in VEGF-pCUP za proizvodnjo verige CY846; ali pa jo transfrmiramo z obema receptorskima zlitjema in pCUP za proizvodnjo verige CY847. Poleg tega, oba KDR-pACT-II in KDR-pAS2 transformiramo skupaj (CY845) ali ločeno (CY843 ali CY844) ali samo VEGF-pCUP (CY841) kot kontrolne verige. Verige testiramo na rast na selektivnem mediju. Veriga (CY846), ki izraža ligand VEGF in dve receptorski fuzijski beljakovini, pokaže obilno rast na selektivnem mediju v primerjavi z verigo CY847, ki ne izraža liganda VEGF (glej Sliko 4). Ti rezultati kažejo, da učinkovite celice v smislu izuma lahko uporabljamo za proučevanje dimerizacije receptorja v odvisnosti od liganda.
Primer 4: Presejanje za spojine, ki delujejo kot ligandi v dimernem receptorskem sistemu.
Dimerizacija (oligodimerizacija) receptorskih enot je pogosto prvi pomemben korak pri aktivaciji receptorjev, kot so receptorji za rastne faktorje, citokini in tisti opisani zgoraj. Novi celični sistem, ki smo ga opisali v primeru 3, lahko uporabimo za odkrivanje novih spojin, ki promovirajo (ali zaustavijo) dimerizacijo receptorja. Take nove vzajemno delujoče spojine bi
-28lahko služile kot učinkoviti terapevtski agensi za patologije v zvezi s temi receptorji.
Plazmide, ki izražajo dimerno receptorsko enoto(e) kot fuzijske beljakovine, proizvajamo kot je bilo obravnavano v primeru 3. Veriga (CY845), ki vsebuje zlitja KDR-pACT-II in KDR-pAS2 služi za primer enostavnega primarnega sita za receptorje, ki kažejo dimerno strukturo. Verigo CY845 vložimo v medij sintetičnega agarja, ki mu primanjkuje histidin (Rose in ostali, 1990). Testne spojine položimo na vrh testnega medija. Rezultat kemičnih spojin, ki povzročijo interakcijo dveh receptorskih zlitij (v odsotnosti liganda) je obnovitev endogenega transkripcijskega aktivatorja, ki ga vodimo k reporterskemu genu kot HIS3. Obnovitev identificiramo s pomočjo celic, ki zrastejo okoli spojine.
Zgoraj referirane publikacije:
Baumbach WR, Horner D. in JS Logan. (1989) The growth hormons binding protein in rat serum is an alternatively spliced form of the rat growth hormone receptor. Genes & Devel. 3:1199-1205.
Butt TR, Sternberg EJ, Gorman JA, Clark P, Hamer D, Rosenberg M in ST Crooke. (1984) Copper metallothionein of yeast, structure of the gene and regulation of expression. Proč. Natn. Acad. Sci., USA 81:3332-3336.
Chein, C-T., Bartel, PL., Sternglanz R. and S. Fields (1991) The two hybrid system: A method to identify and clone genes for proteins that interact with a protein of interest. Proč. Natl. Acad. Sci., USA 88:9578-9582.
Cunnigham BC, Ultsch M, De Vos AM, Mulkerrin MG, Clauser KR and JA
-29Wells. (1991) Dimerization of the extracellular domain of the human growth hormone receptor by a single hormone molecule. Science 254: 821-825.
Davis J and DIH Linzer. (1989) Expression of multiple form of prolactin receptor in the mouse liver. Mol. Endocrinol. 3:674-680.
Davis S, Aldrich TH, Stahl N, Pan L, Taga T, Kishimoto T, Ip NY and G Yancopoulos. (1993) LIFR and gp 130 as heterodimerizing signal transducers of the tripartate CNTF receptor. Science 260: 1805-1808.
Durfee T., Becherer K., Chen P-L., Yeh, S-H., Yang Y., Kilburn AE., Lee W-H. and SJ Elledge. (1993) The retinoblastoma protein associated with the protein phosphatase type 1 catalytic subunit. Genes and Devel. 7: 555-569.
Elledge SJ and RW Davis. (1988) A family of versatile centrometric vectors designed for use in the sectering-shuffle mutagenesis assay in Saccharomyces cerevisiae. Gene 70: 303-312.
Fiels S and 0. Song. (1989) A novel genetic system to detect protein-protein interactionsa. Nature 340:245-246.
Finny M. (1992) Tha polymerase chain reaction. In Current Protocols in Molecular biology. Chapter 15 Eds (FM Ausubel, R. Brent, RE Kingston, DD Moore, JG Seidman, J Smith and K. Struhl) John Wiley & Sons, NY.
Fuh G., Cunningham BC, Fukunaga R, Nagata S, Goeddel DV and JA Wells. (1992) Rational design of potent antagonists to the human
-30growth hormone receptor. Science 256:1677-1680.
Fuh G, Colosi P, Wood WI and JA Wells. (1993) Mechanism - based design of prolactin receptor antagonists. J. Biol. Chem. 8:5376-5381.
Hill JE, Myers AM, Koerner TJ and A Tzagoloff. (1986) Yeast / E. Coli shuttle vectors with multiple unique restriction sites. Yeast 2:163-167.
Kang Y-S, Kane J, Kur jan J, Stadel JM and DJ Tipper. ( 1990) Effects pf expression of mammalian G and Hybrid mammalian-yeast G proteins on the yeast pheromone response signal transduction pathway. Mol. Celi. Biol. 10:2582-2590.
Kondo M, Takeshita T, Ishii N, Nakamura M, Watenabe S, Arai K-i and K Sugamura. (1993) Sharing of the interleukin-2 (IL-2) receptor shain between receptors for IL-2 and IL-4. Science 262:1874-1877.
Leung DW, Spencer SA, Cachianes G, Hammonds G, Collins C, Henzel WJ, Barnard R, Waters MJ and WI Wood. (1987) Growth hormone receptor and serum binding protein: purification, cloning and expression. Nature 330:537-543.
Li, JJ and I. Herskowitz (1993) Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system. Science 262:1870-1874.
Maniatus T, Fritsch EF and J Sambrook. (1982) Molecular cloning.
Cold Spring Harbor Laboratory Press.
-31Mui A and A Miyajima (1994) Cytokine receptors and signal transduction. In: Progress in Growth Factor Research, pp 15 - 35. Pergamon Press. NY
Noguchi M, Nakamura Y, Russel SM, Zeigler SF, Tsang M, Cao X and WJ Leonard. (1993) Interleukin-2 receptor chain: A functional component of the interleukin-7 receptor. Science 262:1877-1880.
Picard D, Schena M and KR Yamamoto. (1990) An inducible expression vector for both fission and budding yeast. Gene 86:257-261.
Rose MD, Winston F, and P Hieter. ( 1990) Methods in yeast genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press
Staten NR, Byatt JC and GG Krivi. (1993) Ligand specific dimerization of the extracellular domain of the bovine growth hormone receptor. J. Biol. Chem, 268:18467-18473.
Su T-Z and MR El-Gewely . (1988) A multisite- directed mutagenesis using T7 DNA polymerase: application for reconstructing a mammalian gene. Gene 69:81-89.
Taga T and T Kishimoto (1993) Cytokine receptors and signal transduction. FASEB J. 7:3387-3396.
Taga T, Hibi M. Matsuda T, Hirano T and T. Kishimoto. (1993) IL-6-induced homodimerization of gpl30 and associated activation of a tyrosine kinase. Science 260:1808-1810.
Terman BI, Dougher-Vermanzen M, Carrion ME, Dimitrov D. Armellina DC, Gospodarowicz D and P. Bohlen (1992) Identification of the KDR tyrosine kinase as a receptor for vascular endothelial celi growth factor. Biochem. Biophys. Res. Comm. 187:1579.1586
-32Terman BI, Carrion ME, Kovach E., Rasmussen BA, Eddy RL and Shaws B. (1991). Idnetification of a new endothelial celi growth factor receptor tyrosine kinase. Oncogene 6:1677-1683.
Tischer E, Mitchell R, Hartman T, Silva T. Gospodarowicz D, Fiddes JC, and JA Abraham. (1991) The human gene for vascular endothelial growth factor. Multiple protein forms are encoded through alternative exon splicing. J. Biol. Chem. 266:11947-11954.
Yang X, Hubbard JA, and M Carlson (1992) A protein kinase substrate identified by the two-hybrid system. Science 257:31-33.
Young KH and FW Bazer (1989) Porcine endometrial prolactin receptors detected by homologous radioreceptor assay. Mol. and Celi. Endocrinol. 64:145-154.
Young PR (1992) Protein hormones and their receptors. Curr. Opin. Biotech. 3:408-421.
Wade Harper J, Adami GR, Wei N, Keyomarsk K and SJ Elledge. (1993) The p21 Cdk-interaction protein Cipi is a potent inhibitor of Gl Cyclin-dependent kinases. Celi 75:805-816.
Wilson TE, Fahrner TJ, Johnston M and J Milbrandt. (1991) Identification of the DNA binding site for NGFI-B by genetic selection in yeast. Science 252:1296-1300.
Claims (41)
- PATENTNI ZAHTEVKI1. Modificirana gostiteljska celica, ki vsebuje:a) gensko sekvenco, ki kodira heterologno fuzijsko beljakovino; omenjena fuzijska beljakovina vsebuje prvi peptid peptidnega veznega para, ali segment omenjenega prvega peptida, ki je združen bodisi z veznim področjem DNA ali z njegovim ustreznim transkripcijskim aktivacijskim področjem transkripcijske aktivacijske beljakovine;b) gensko sekvenco, ki kodira heterologno fuzijsko beljakovino, omenjena fuzijska beljakovina pa vsebuje drugi peptid peptidnega veznega para v (a), ali njegov segment, ki je zlit bodisi z veznim področjem DNA ali z njegovim ustreznim transkripcijskim aktivacijskim področjem, katerimkoli, ki ni bil uporabljen v (a);c) reporterski gen, ki je operativno združen s transkripcijsko aktivacijsko beljakovino, ali z njenim delom;d) opcijsko, izbris ali mutacijo v kromosomski DNA gostiteljske celice za transkripcijsko aktivacijsko beljakovino, če je navzoča v izbrani gostiteljski celici; kjer je modificirani gostitelj sposoben izražanja vsaj dveh heterolognih fuzijskih beljakovin in vsaj enega reporterskega gena.
- 2. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 1, kjer je omenjena gostiteljska celica evkariotska celica.
- 3. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 1, kjer je omenjena gostiteljska celica sesalska ali amfibijska celica.-344. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 1, kjer je gostiteljska celica celica glive.
- 5. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 4, kjer je omenjena gostiteljska celica glive Aspergilla ali Neuropora.
- 6. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 4, kjer je omenjena celica glive celica kvasovke.
- 7. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 6, kjer je omenjena celica kvasovke izbrana iz Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomices pombe ali Pichia pastoris.
- 8. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 1, kjer peptidi peptidnega veznega para vzajemno delujejo drug z drugim prek izvenceličnih aktivnosti v svojem naravnem okolju.
- 9. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 1, kjer peptidi peptidnega veznega para vzajemno delujejo drug z drugim prek intracelularne aktivnosti v svojem naravnem okolju.
- 10. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 1, kjer je peptidni vezni par izbran iz skupine, ki sestoji iz sesalskih peptidov.
- 11. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 1, kjer je peptidni vezni par izbran iz skupine, ki sestoji iz nesesalskih peptidov.-3512. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 1, kjer je peptidni vezni par izbran iz skupine, ki sestoji iz ligandov in ustreznega receptorja.
- 13. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 1, kjer je en peptid peptidnega veznega para hormon.
- 14. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 13, kjer je eden od peptidov peptidnega veznega para izbran iz skupine, ki sestoji iz sesalskih peptidnih hormonov.
- 15. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 1, kjer je omenjena transkripcijska aktivacijska beljakovina izbrana iz (a) Gal4, Gcn4, Hapl, Adrl, Swi5, Stel2, Mcml, Yapl, Acel, Pprl, Arg81, Lac9, QalF, VP16, LexA ali (b) sesalskih receptorjev jedra.
- 16. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 15, kjer je omenjena transkripcijska aktivacijska beljakovina transkripcijska aktivacijska beljakovina kvasovke.
- 17. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 16, kjer je omenjena transkripcijska aktivacijska beljakovina kvasovke GAL4 ali lac9.
- 18. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 1, kjer je reporterski gen izbran iz skupine:a) lacZ, gena luciferaze, zeleno fluorescenčnega beljakovinskega gena, kloron fenicol acetil transferaze;b) genov, ki komplementirajo aukstrofijec) genov, ki podelijo odpornost na antibiotike; ind) genov, ki podelijo občutljivost na kemikalije-3619. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 1, kjer se vsaj ena od heterolognih zlitih beljakovin izraža s pretvorbo celice kvasovke z autonomno replicirajočim plazmidom, ki je zmožen izražanja omenjene zlite beljakovine.
- 20. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 19, kjer so heterologne zlite beljakovine izražene prek transformacije celice kvasovke z autonomno replicirajočim plazmidom, ki je zmožen izražanja omenjene zlite beljakovine.
- 21. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 19, kjer je vsaj en peptid peptidnega veznega para izbran iz ene od naslednjih skupin:(a) iz skupine, ki sestoji iz citokinov, interleukinov, hematopoetičnih rastnih faktorjev, inzulina, rastnih faktorjev podobnih inzulinu, rastnega hormona, prolaktina, interferonov, in rastnih faktorjev;(b) ligandov za z G-proteinom povezane receptorje (c) ligandov za nevretenčarske receptorje;(d) ligandov za guanilil ciklazne receptorje;(e) ligandov za tirozin-fosfatazne receptorje;
- 22. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 21, kjer je peptid rastni faktor izbran iz epidermnih GF, živčnih GF, faktorjev za inhibicijo leukemije, fibroblasta GF, GF, ki izvira iz krvnih ploščic, vaskularnega endotelialnega GF, tumor nekrotizirajočega faktorja, onkostatina M, ciliarnega nevrotrofičnega faktorja, eritropoetina, Steel faktorja, laktogena placente in TGF.
- 23. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 21, kjer je vsaj eden od peptidov peptidnega veznega para transducer.-3724. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 23, kjer je transducer izbran iz skupine transducerskih proteinov gpl30, kh97, AIC2A in AIC2B.
- 25. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 1, kjer je vsaj eden od peptidov peptidnega veznega para receptor, ki je izbran iz ene od naslednjih skupin:(a) iz celične adhezijske molekule; in (b) iz imunomodulatorne, antigenske razpoznavne ali demonstracijske molekule.
- 26. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 25, kjer je receptor celična adhezijska molekula izbrana iz ICAM, VCAM, ECAM, fibronektina, integrina, selektina in fibrinogena.
- 27. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 25, kjer je receptor imunomodulatorna, antigenska razpoznavna ali demonstracijska molekula izbrana iz kompleksa T celičnih receptorjev, kompleksa B celičnih receptorjev, receptorjev Fc, kompleksa 1 z večjo histokompatibilnostjo, kompleksa 2 z večjo histokompatibilnostjo, CD4, CD8, CD27, CD30, kompleksa MAC.
- 28. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 21, kjer je eden od peptidov peptidnega veznega para ligand za z G-proteinom združene receptorje.
- 29. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 28, kjer je ligand za z G-proteinom združene receptorje izbran iz faktorja, ki izloča rastni hormon, sekretina, vazoaktivnega inhibitornega peptida, glukagona, interleukina-8, luteinizirajočega hormona (LH), stimulirajočega hormona folikla (FSH) in tirotropina.-3830. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 11, kjer so nevretenčarski peptidi izbrani iz skupine, ki sestoji iz rastlinskega sistemina in diferencijacijskih peptidov žuželk.
- 31. Postopek za detekcijo sposobnosti testnega vzorca, da vpliva na vezno interakcijo peptidnega veznega para; omenjeni postopek obsega:določevanje aktivnosti reporterskega gena pri dodatku testnega vzorca modificirani gostiteljski celici v skladu z zahtevkom 1, pod pogoji, ki so primerni za detekcijo omenjene aktivnosti v prisotnosti omenjenega vzorca ali pod pogoji, pri katerih modificirana gostiteljska celica pokaže omenjene aktivnosti samo v prisotnosti vzorca, ki ima vezno interakcijo peptidnega veznega para.
- 32. Postopek v skladu z zahtevkom 31, kjer se aktivnost reporterskega gena določa z merjenjem izbranega fenotipa, ki je odvisen od aktivnosti reporterja.
- 33. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 1, kjer je reporterski gen (c) operativno združen z transkripcijsko aktivacijsko beljakovino kvasovke; kjer omenjeni reporterski gen v selektivnem okolju preprečuje prikazovanje določljivega fenotipa v prisotnosti izražanja transkripcijske aktivacijske beljakovine kvasovke ali njenega dela; in kjer je gostiteljska celica dalje označena s tem, da obsega:(e) opcijsko, izbris ali mutacijo v kromosomski DNA gostiteljske celice, kar dopušča prikazovanje izbranega fenotipa na izbranem mediju v odsotnosti izražanja reporterskega gena plazmida (c), če je potrebno, da je za reporterski gen (c) edini vir merjene aktivnosti.-3934. Postopek za detekcijo sposobnosti testnega vzorca za vplivanje na interakcijo peptidnega veznega para; omenjeni postopek obsega:opazovanje spremembe v merjenem fenotipu modificiranega gostitelja v skladu z zahtevkom 33 pri dodatku testnega vzorca omenjeni modificirani gostiteljski celici; omenjena celica pa je gojena pod pogoji, ki so primerni za detekcijo izbranega fenotipa v prisotnosti testnega vzorca ali pa gojena pod pogoji, zaradi katerih omenjena celica kaže fenotip samo v prisotnosti testnega vzorca, ki ima interakcijo s peptidnim veznim parom.
- 35. Postopek za ugotavljanje ali testni vzorec pokaže interakcijo s peptidom peptidnega veznega para; omenjeni postopek obsega:(a) dodajanje testnega vzorca modificirani gostiteljski celici in primerjava prikazovanja izbranega fenotipa v prisotnosti in odsotnosti testnega vzorca;kjer je omenjena modificirana gostiteljska celica prilagojena za prikazovanje spremembe v fenotipu samo v prisotnosti testnega vzorca, ki se veže samo z enim peptidom peptidnega veznega para.
- 36. Postopek v skladu z zahtevkom 35, kjer omenjeni postopek uporablja modificirano gostiteljsko celico, ki vsebuje:a) gensko sekvenco, ki kodira heterologno fuzijsko beljakovino; omenjena fuzijska beljakovina pa vsebuje prvi peptid peptidnega veznega para, ali segment omenjenega prvega peptida, ki je združen bodisi z veznim področjem DNA ali z njegovim ustreznim transkripcijskim aktivacijskim področjem transkripcijske aktivacijske beljakovine; kjer je gen, ki kodira omenjeni prvi-40peptid, navzoč v učinkovitem številu kopij.b) gensko sekvenco, ki kodira heterologno fuzijsko beljakovino, omenjena fuzijska beljakovina pa vsebuje drugi peptid peptidnega veznega para v (a), ali segment omenjenega drugega peptida, ki je zlit z bodisi veznim področjem DNA ali z njegovim ustreznim transkripcijskim aktivacijskim področjem, katerimkoli, ki ni uporabljen v (a);c) reporterski gen, ki je operativno združen z transkripcijsko aktivacijsko beljakovino kvasovke, ali z njenim delom.d) izbris ali mutacijo v kromosomski DNA gostiteljske celice kvasovke za transkripcijsko aktivacijsko beljakovino.
- 37. Postopek v skladu z zahtevkom 36, kjer se vsaj ena od heterolognih zlitih beljakovin izraža s transformacijo modificirane gostiteljske celice z avtonomno-replicirajočim plazmidom, ki je zmožen izražanja omenjene fuzijske beljakovine.
- 38. Postopek v skladu z zahtevkom 36, kjer se reporterski gen izraža s transformacijo modificirane gostiteljske celice s plazmidom, ki je zmožen izražanja omenjenega reporterskega gena.
- 39. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 1, kjer je genska sekvenca (a) genska sekvenca, ki kodira heterologno fuzijsko beljakovino; omenjena fuzijska beljakovina pa vsebuje eno ali dve receptorski molekuli za peptid, ali segment omenjenega receptorja, ki je vezan bodisi na vezno področje DNA ali njegovo ustrezano transkripcijsko aktivacijsko področje transkripcijske aktivacijske beljakovine; in genska sekvenca (b), ki je genska sekvenca, ki kodira heterologno fuzijsko beljakovino; omenjena fuzijska beljakovina pa vsebuje drugi receptor za peptid, ali del-41omenjenega receptorja, ki je zlit bodisi z veznim področjem DNA ali njegovim ustreznim transkripcijskim aktivacijskim področjem, s katerimkoli, ki ni uporabljen v (a); ,
- 40. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 39, kjer gen v (a) kodira heterologno fuzijsko beljakovino; omenjena fuzijska beljakovina pa vsebuje transducer za peptid, ali del omenjenega transducerja, ki je združen bodisi z veznim področjem DNA ali njegovim ustreznim transkripcijskim aktivacijskim področjem transkripcijske aktivacijske beljakovine.
- 41. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 40, kjer je protein transducerja izbran iz pgl30, KH97, AIC2A in AIC2B.
- 42. Postopek za detekcijo zmožnosti testnega vzorca za delovanje kot ligand za receptor, ki obsega:ugotavljanje stopnje aktivnosti reporterskega gena modificirane gostiteljske celice v skladu z zahtevkom 40 pri dodatku testnega vzorca omenjeni celici pod pogoji, ki so primerni za omenjeno delovanje.
- 43. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 1, kjer je genska sekvenca (a) genska sekvenca, ki kodira heterologno fuzijsko beljakovino; omenjena fuzijska beljakovina pa vsebuje en peptid mnogokratnega peptidnega veznega kompleksa, ali segment omenjenega peptida, ki je združen bodisi z veznim področjem DNA ali njegovim ustreznim transkripcijskim aktivacijskim področjem transkripcijske aktivacijske beljakovine; in genska sekvenca (b),ki je genska sekvenca, ki kodira heterologno fuzijsko beljakovino; omenjena fuzijska beljakovina pa vsebuje drugi peptid omenjenega mnogokratnega peptidnega veznega kompleksa, ali segment-42omenjenega receptorja, ki je zlit bodisi z veznim področjem DNA ali z njegovim ustreznim transkripcijskim aktivacijskim področjem, s katerimkoli, ki ni uporabljen v (a).
- 44. Postopek za detekcijo zmožnosti testnega vzorca, da deluje kot peptidna sestavina mnogokratnega peptidnega veznega kompleksa; omenjeni postopek, ki obsega:ugotavljanje stopnje aktivnosti reporterskega gena modificirane gostiteljske celice v skladu z zahtevkom 43 pri dodatku testnega vzorca omenjeni celici pod pogoji, ki so primerni za detekcijo omenjene aktivnosti.
- 45. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 1, kjer je genska sekvenca (a) genska sekvenca, ki kodira heterologno fuzijsko beljakovino; omenjena fuzijska beljakovina pa vsebuje en peptid mnogokratnega peptidnega veznega kompleksa, ali segment omenjenega peptida, ki je združen bodisi z veznim področjem DNA ali z njegovim ustreznim transkripcijskim aktivacijskim področjem transkripcijske aktivacijske beljakovine; in gensko sekvenco (b), ki je genska sekvenca, ki kodira heterologno fuzijsko beljakovino; omenjena fuzijska beljakovina pa vsebuje drugi peptid omenjenega mnogokratnega peptidnega veznega kompleksa, ali segment omenjenega receptorja, ki je zlit bodisi z veznim področjem DNA ali z njegovim ustreznim transkripcijskim aktivacijskim področjem, s katerimkoli, ki ni uporabljen v (a);kjer omenjena gostiteljska celica dalje vsebuje kot (e) vsaj eno gensko sekvenco, ki kodira peptid; kjer je omenjeni gostitelj zmožen izražanja omenjenih peptidov.
- 46. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 45, kjer je vsaj ena od komponent (a), (b) ali (e) genska sekvenca, ki ustreza komplementarni DNA-knjižnici.-4347. Modificirana gostiteljska celica v skladu z zahtevkom 46, kjer je (b) genska sekvenca, ki ustreza komplementarni DNA-knjižnici.
- 48. Postopek za določevanje zmožnosti slučajnega proteina za delovanje kot sestavina mnogokratnega peptidnega veznega kompleksa; omenjeni postopek obsega:določevanje stopnje aktivnosti reporterskega gena modificirane gostiteljske celice v skladu z zahtevkom 47 pri izražanju slučajnega proteina iz DNA-knjižnice pod pogoji, ki so primerni za detekcijo te aktivnosti.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/259,609 US5989808A (en) | 1994-06-14 | 1994-06-14 | Identification of compounds affecting specific interaction of peptide binding pairs |
| PCT/US1995/006895 WO1995034646A1 (en) | 1994-06-14 | 1995-05-31 | Novel cell systems having specific interaction of peptide binding pairs |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SI9520073A true SI9520073A (sl) | 1998-02-28 |
| SI9520073B SI9520073B (sl) | 2004-06-30 |
Family
ID=22985626
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SI9520073A SI9520073B (sl) | 1994-06-14 | 1995-05-31 | Novi celični sistemi, ki imajo specifično interakcijo peptidnih veznih parov |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5989808A (sl) |
| EP (1) | EP0765389B1 (sl) |
| AT (1) | ATE245189T1 (sl) |
| AU (1) | AU706173B2 (sl) |
| CA (1) | CA2195083A1 (sl) |
| DE (1) | DE69531302T2 (sl) |
| DK (1) | DK0765389T3 (sl) |
| ES (1) | ES2202366T3 (sl) |
| GE (1) | GEP20022619B (sl) |
| IL (1) | IL114118A0 (sl) |
| LT (1) | LT4230B (sl) |
| LV (1) | LV11906B (sl) |
| NZ (1) | NZ287372A (sl) |
| PT (1) | PT765389E (sl) |
| RU (1) | RU2208646C2 (sl) |
| SI (1) | SI9520073B (sl) |
| WO (1) | WO1995034646A1 (sl) |
| ZA (1) | ZA954892B (sl) |
Families Citing this family (44)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7226761B2 (en) * | 1992-11-05 | 2007-06-05 | Danisco Sweeteners Oy | Manufacture of five-carbon sugars and sugar alcohols |
| US6972193B1 (en) * | 1993-02-12 | 2005-12-06 | Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University | Regulated transcription of targeted genes and other biological events |
| US6891021B2 (en) | 1993-02-12 | 2005-05-10 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Regulated apoptosis |
| US6770446B1 (en) * | 1994-06-14 | 2004-08-03 | Wyeth | Cell systems having specific interaction of peptide binding pairs |
| US5610015A (en) * | 1995-03-23 | 1997-03-11 | Wisconsin Alumni Research Foundation | System to detect protein-RNA interactions |
| DE69636866D1 (en) * | 1995-04-11 | 2007-03-15 | Gen Hospital Corp | Reverse "two-hybrid"-systeme |
| US5837844A (en) * | 1995-06-07 | 1998-11-17 | Biogen, Inc. | CAIP-like gene family |
| US6423824B1 (en) | 1995-06-07 | 2002-07-23 | Biogen, Inc. | CAIP-like gene family |
| US6171800B1 (en) | 1995-06-07 | 2001-01-09 | Biogen, Inc. | Method of making and binding CAIP polypeptides |
| DE29724617U1 (de) * | 1996-04-26 | 2002-06-13 | Massachusetts Inst Technology | Drei-Hybrid-Kit zur Molekülauswahl |
| DE69715621T2 (de) * | 1996-04-26 | 2003-05-22 | Massachusetts Inst Technology | Drei hybriden screening test |
| US6696251B1 (en) | 1996-05-31 | 2004-02-24 | Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Yeast cell surface display of proteins and uses thereof |
| AU6342696A (en) * | 1996-06-27 | 1998-01-14 | Biogen, Inc. | The caip-like gene family |
| FR2761697B1 (fr) * | 1997-04-03 | 1999-05-28 | Inst Nat Sante Rech Med | Methodes de detection d'interactions entre plusieurs proteines |
| DE19715683C2 (de) * | 1997-04-15 | 1999-11-11 | Max Planck Gesellschaft | Neue Reportervektoren für One-Hybrid und Two-Hybrid Systeme |
| US7005295B1 (en) | 1997-04-16 | 2006-02-28 | Wyeth | β-amyloid peptide-binding proteins and polynucleotides encoding the same |
| US6787319B2 (en) | 1997-04-16 | 2004-09-07 | American Home Products Corp. | β-amyloid peptide-binding proteins and polynucleotides encoding the same |
| AU6969998A (en) | 1997-04-25 | 1998-11-24 | American Home Products Corporation | Neuronal mort1 isoforms |
| US6479653B1 (en) | 1997-08-26 | 2002-11-12 | Ariad Gene Therapeutics, Inc. | Compositions and method for regulation of transcription |
| JP4296608B2 (ja) * | 1997-08-27 | 2009-07-15 | 田辺三菱製薬株式会社 | Ｐｐａｒのアゴニスト及びアンタゴニストのスクリーニング方法 |
| EP1149920A1 (en) * | 1997-10-15 | 2001-10-31 | Diversa, Inc. | Screening for novel compounds which regulate biological interactions |
| EP1029076A4 (en) * | 1997-10-15 | 2002-03-06 | Diversa Inc | SCREENING FOR NEW CONNECTIONS THAT REGULATE BIOLOGICAL INTERACTIONS |
| US6261842B1 (en) | 1997-10-23 | 2001-07-17 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Microorganism genomics, compositions and methods related thereto |
| CA2309763A1 (en) * | 1997-11-14 | 1999-05-27 | Roche Diagnostics Corporation | Variable region fusion peptides that form effector complexes in the presence of antigen |
| CA2317816C (en) | 1998-01-09 | 2009-02-17 | Tvw Telethon Institute For Child Health Research | Peptide detection method |
| EP0974649A1 (en) * | 1998-06-22 | 2000-01-26 | Universität Zürich | Screening system |
| US7166475B2 (en) | 1999-02-26 | 2007-01-23 | Cyclacel Ltd. | Compositions and methods for monitoring the modification state of a pair of polypeptides |
| GB9907687D0 (en) * | 1999-04-01 | 1999-05-26 | Kudos Pharm Ltd | Assays methods and means |
| JP2002541863A (ja) | 1999-04-21 | 2002-12-10 | ワイス | Ｎ−型イオンチャンネル不活性化のモジュレーターを同定する方法 |
| BR0110214A (pt) * | 2000-04-24 | 2003-01-21 | Wyeth Corp | Célula de levedura e métodos de detecção da interação de um primeiro peptìdio com um segundo peptìdio de um par de ligação de peptìdios, de determinação da interação de uma amostra de teste com um primeiro ou um segundo peptìdios de um par de ligação de peptìdios e de detecção simultânea da interação de dois pares de ligação de peptìdios diferentes |
| CN1564869A (zh) | 2000-08-25 | 2005-01-12 | 巴斯福种植科学有限公司 | 编码新型异戊二烯基蛋白酶的植物多核苷酸 |
| WO2002046400A2 (en) * | 2000-12-08 | 2002-06-13 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Mutated class ii major histocompatibility proteins |
| EP1534819B1 (en) | 2002-08-21 | 2009-12-09 | Revivicor, Inc. | Porcine animals lacking any expression of functional alpha 1,3 galactosyltransferase |
| US9453251B2 (en) | 2002-10-08 | 2016-09-27 | Pfenex Inc. | Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens |
| US7285269B2 (en) | 2002-12-02 | 2007-10-23 | Amgen Fremont, Inc. | Antibodies directed to tumor necrosis factor |
| WO2005049804A2 (en) * | 2003-11-17 | 2005-06-02 | Georgia Tech Research Corporation | Engineering enzymes through genetic selection |
| EP1544307A1 (en) * | 2003-12-18 | 2005-06-22 | AXXAM S.r.l. | LAC9 chimeric receptor and uses thereof |
| EP2412816B1 (en) | 2004-07-26 | 2014-12-03 | Pfenex Inc. | Process for improved protein expression by strain engineering |
| EP3138403A1 (en) | 2005-08-09 | 2017-03-08 | Revivicor, Inc. | Transgenic ungulates expressing ctla4-ig and uses thereof |
| CN101365945A (zh) * | 2006-02-07 | 2009-02-11 | 惠氏公司 | 用于鉴别调节诺里蛋白、诺里蛋白模拟物的药剂的物质和方法以及由此鉴别出的药剂 |
| US9580719B2 (en) | 2007-04-27 | 2017-02-28 | Pfenex, Inc. | Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins |
| MX2009011523A (es) | 2007-04-27 | 2009-11-09 | Dow Global Technologies Inc | Metodo para clasificar rapidamente huespedes microbianos para identificar ciertas cepas con rendimiento y/o calidad mejorados en la expresion de proteinas heterologas. |
| CN101131363B (zh) * | 2007-09-30 | 2010-12-01 | 南京大学 | 一种基于酵母三杂交的小分子化合物检测方法 |
| CA2980316A1 (en) | 2015-03-24 | 2016-09-29 | Osiris Therapeutics, Inc. | Compositions comprising meniscal tissues and uses thereof |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5283173A (en) * | 1990-01-24 | 1994-02-01 | The Research Foundation Of State University Of New York | System to detect protein-protein interactions |
| US5322801A (en) * | 1990-04-19 | 1994-06-21 | The General Hospital Corporation | Protein partner screening assays and uses thereof |
| JP3537141B2 (ja) * | 1992-10-30 | 2004-06-14 | ザ ゼネラル ホスピタル コーポレーション | 新種蛋白質分離のための相互作用を用いる補捉システム |
| US5512473A (en) * | 1993-01-29 | 1996-04-30 | Brent; Roger | Max-interacting proteins and related molecules and methods |
| US5582995A (en) * | 1993-06-11 | 1996-12-10 | The General Hospital Corporation | Methods of screening for compounds which inhibit the direct binding of Ras to Raf |
| CA2180271A1 (en) * | 1993-12-30 | 1995-07-06 | Ronald M. Evans | Novel uses for gal4-receptor constructs |
| ES2146749T3 (es) * | 1994-01-21 | 2000-08-16 | Icos Corp | Materiales y metodos en relacion con proteinas que interaccionan con la caseina quinasa i. |
| US5525490A (en) * | 1994-03-29 | 1996-06-11 | Onyx Pharmaceuticals, Inc. | Reverse two-hybrid method |
| US5691147A (en) * | 1994-06-02 | 1997-11-25 | Mitotix, Inc. | CDK4 binding assay |
-
1994
- 1994-06-14 US US08/259,609 patent/US5989808A/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-05-31 ES ES95920689T patent/ES2202366T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-31 RU RU97100776/13A patent/RU2208646C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-05-31 NZ NZ287372A patent/NZ287372A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-05-31 GE GEAP19953531A patent/GEP20022619B/en unknown
- 1995-05-31 DE DE69531302T patent/DE69531302T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-31 AT AT95920689T patent/ATE245189T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-05-31 CA CA002195083A patent/CA2195083A1/en not_active Abandoned
- 1995-05-31 WO PCT/US1995/006895 patent/WO1995034646A1/en active IP Right Grant
- 1995-05-31 AU AU26066/95A patent/AU706173B2/en not_active Ceased
- 1995-05-31 EP EP95920689A patent/EP0765389B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-31 SI SI9520073A patent/SI9520073B/sl not_active IP Right Cessation
- 1995-05-31 PT PT95920689T patent/PT765389E/pt unknown
- 1995-05-31 DK DK95920689T patent/DK0765389T3/da active
- 1995-06-12 IL IL11411895A patent/IL114118A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1995-06-13 ZA ZA954892A patent/ZA954892B/xx unknown
-
1997
- 1997-01-13 LT LT97-004A patent/LT4230B/lt not_active IP Right Cessation
- 1997-02-14 LV LVP-97-04A patent/LV11906B/en unknown
-
1999
- 1999-03-08 US US09/263,944 patent/US6251602B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-06 US US09/305,483 patent/US6284519B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2202366T3 (es) | 2004-04-01 |
| DE69531302D1 (de) | 2003-08-21 |
| IL114118A0 (en) | 1995-10-31 |
| EP0765389B1 (en) | 2003-07-16 |
| LV11906B (en) | 1998-06-20 |
| RU2208646C2 (ru) | 2003-07-20 |
| LT97004A (en) | 1997-07-25 |
| DE69531302T2 (de) | 2004-04-22 |
| SI9520073B (sl) | 2004-06-30 |
| AU706173B2 (en) | 1999-06-10 |
| US6284519B1 (en) | 2001-09-04 |
| GEP20022619B (en) | 2002-01-25 |
| LV11906A (lv) | 1997-12-20 |
| US6251602B1 (en) | 2001-06-26 |
| NZ287372A (en) | 1997-11-24 |
| PT765389E (pt) | 2003-11-28 |
| ZA954892B (en) | 1996-01-30 |
| CA2195083A1 (en) | 1995-12-21 |
| WO1995034646A1 (en) | 1995-12-21 |
| AU2606695A (en) | 1996-01-05 |
| US5989808A (en) | 1999-11-23 |
| EP0765389A1 (en) | 1997-04-02 |
| ATE245189T1 (de) | 2003-08-15 |
| LT4230B (en) | 1997-10-27 |
| DK0765389T3 (da) | 2003-10-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SI9520073A (sl) | Novi celični sistemi, ki imajo specifično interakcijo peptidnih veznih parov | |
| Young | Yeast two-hybrid: so many interactions,(in) so little time… | |
| EP0371820B1 (en) | Novel receptors: their identification, characterization, preparation and use | |
| Bergers et al. | Transcriptional activation of the fra-1 gene by AP-1 is mediated by regulatory sequences in the first intron | |
| Galsgaard et al. | Identification of a growth hormone-responsive STAT5-binding element in the rat insulin 1 gene. | |
| US7319009B2 (en) | Methods and compositions for identifying receptor effectors | |
| US20010026926A1 (en) | Methods and compositions for identifying receptor effectors | |
| Ozenberger et al. | Functional interaction of ligands and receptors of the hematopoietic superfamily in yeast. | |
| EP0862614A1 (en) | Yeast receptor and g-protein fusion protein | |
| EP0752477A2 (en) | Expression vectors that produce steroid receptors, steroid receptor chimera, screening assays for steroid receptors and clinical assays using synthesized receptors and receptor vectors | |
| EP1347052B1 (en) | A method for screening compouneds using the guanosine triphosphate (gtp) binding protein-coupled receptor protein, bg37 | |
| US6673540B1 (en) | Cell systems having specific interaction of peptide binding pairs | |
| Uppaluri et al. | Genetic dissection of thyroid hormone receptor β: identification of mutations that separate hormone binding and transcriptional activation | |
| Kaisaki et al. | Localization of tub and uncoupling proteins (Ucp) 2 and 3 to a region of rat chromosome 1 linked to glucose intolerance and adiposity in the Goto-Kakizaki (GK) type 2 diabetic rat | |
| US7250263B2 (en) | Methods and compositions for identifying receptor effectors | |
| WO2001081548A1 (en) | Novel cell systems having specific interaction of peptide binding pairs | |
| JPH08510643A (ja) | インターロイキン‐５受容体を介した細胞シグナル伝達経路に対する変調作用を有する物質のスクリーニング法 | |
| Yamaguchi et al. | Functional analysis of aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator interactions with aryl hydrocarbon receptor in the yeast two-hybrid system | |
| US20030009022A1 (en) | Methods and compositions for identifying receptor effectors | |
| AU2003260308B2 (en) | Method for identifying substances | |
| Ozenberger et al. | Investigation of Ligand/Receptor Interactions and the Formation of Tertiary Complexes | |
| Richter et al. | Neuropeptide Hormone Rece Ptors: Strategies for Identification | |
| Eisenmann | Genetic and molecular analysis of mutations in spt15, the gene encoding the yeast TATA-binding factor TFIID | |
| Cormack | The TATA-binding protein: a mutational analysis | |
| PAUSCH et al. | HETEROLOGOUS G PROTEIN-COUPLED RECEPTORS EXPRESSED IN SACCHAROMYCES CEREVISIAE: METHODS FOR GENETIC ANALYSIS AND |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF | Valid on the event date | ||
| KO00 | Lapse of patent |
Effective date: 20120104 |